Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование генома американской норки (Mustela vison)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картирование генома американской норки (Mustela vison)"

На правах рукописи УДК 575.116.4:636.934.57.

| МАЛЬЧЕНКО СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА АМЕРИКАНСКОЙ (Миstela vison)

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 1996

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор,

Серов О.Л.,

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Стегний В.Н.,

Институт биологии и биофизики Томского Государственного университета, г. Томск

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Блинов А.Г.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики,

г. Москва

Защита состоится "

1995 г.

на диссертационного совета по

защите V •

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " " ¿2-СсЖ&ЛЛ^

1996 г. <?

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук """ 1 Труздев А.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Значительный прогресс в области картирования геномов млекопитающих в последние два десятилетия достигнут благодаря успешному использованию современного арсенала методов цитологии, молекулярной и клеточной биологии.

Построение подробных геномных карт различных видов млекопитающих создает основу для изучения действия генов в разнообразных биологических процессах: развитии организма, старения, нейрофизиологии, при выяснении природы наследственных болезней, рака, иммунологии, выяснении основ поведения, генетической природы количественных и экономически важных для сельского хозяйства признаков, позволяет изучать закономерности эволюции геномов млекопитающих посредством сравнения сцепления гомологичных генов.

Подходы, использованные при картировании генома человека, применяются также при построении геномных карт других видов млекопитающих. В настоящее время имеются сведения по локализации и сцеплению генов у 28 видов, представителей 8 из 19 отрядов млекопитающих. 12 из изученных видов представлены приматами, 4 вида грызунов (мышь, крыса, китайский и сирийский хомячок), 4 вида хищных (кошка, норка, лисица, собака) и 5 важных для сельского хозяйства вида: корова, свинья, овца, коза, лошадь.

Однако, прогресс в области картирования геномов млекопитающих касается прежде всего человека и мыши -традиционного объекта генетических исследований. У человека в настоящее время картировано около 14000 генов и анонимных последовательностей, что позволило создать генную карту с разрешением в 1 сМ. Построены библиотеки перекрывающихся протяженных клонов (контигов) для 3, 12, 16, 21, 22 и У хромосом человека. У мыши картировано более 4000 маркеров. В меньшей степени картированы другие виды млекопитающих.

Полученные генные карты дали основу для изучения сцепления локусов гомеологичных у разных видов млекопитающих. В результате такого сравнения были выявлены группы генов, сохраняющие синтенные отношения в течение многих миллионов лет эволюции. Данные о консервативных участках геномов

млекопитающих и оценка частоты перестроек в них расширяют наши представления о путях эволюции геномов млекопитающих.

Для более успешного выявления наиболее консервативных синтенных групп генов у млекопитающих, изучения их эволюции и выяснения причин стабильности этих связей О'Брайн с соавторами (O'Brien et al, 1993) был предложен список из 321 маркеров для картирования. Список представлен нуклеотидными последовательностями функциональных генов, распределенных равномерно , через 5-10 сМ по геному человека и мыши. Этим же целям служит расширение списка видов, представителей слабо или вообще не картированных отрядов млекопитающих.

Картирование генома американской норки было начато более 15 лет назад в Институте цитологии и генетики в лаборатории генетических основ онтогенеза совместно с лабораторией цитогенетики животных. Норка является представителем большого таксона куницеобразных (Mustelidae) отряда хищных (Carnivora). В систематическом отношении норка отдалена (далека) от хорошо изученных видов человека и мыши. Норка имеет простой кариотип, состоящий из 14 аутссом X и Y хромосом, которые легко идентифицируются цитогенетически. Кроме того, норка является сельско-хозяйственным видом, с которым ведутся селекционно-генетические исследования и построение генной карты будет иметь значение для ведения селекционных работ.

К началу данного исследования генная карта норки была представлена 65 генами. Хромосомная и региональная локализация генов у норки была определена различными методами: гибридологическим, анализом гибридов соматических клеток норка х китайский хомячок и норка х мышь, генным переносом, анализом спонтанных и индуцированных хромосомных перестроек.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы было увеличение количества картированных генов (тип 1 маркеров) и микросателлитов (маркеров типа 2) у американской норки. Это позволило-бы пронаблюдать за эволюцией синтенных групп генов и консервативных районов у видов, вовлеченных в работы по сравнительному картированию с использованием локусов 1-го типа, а также насытить геномную карту норки высокополиморфными ДНК маркерами - микросателлитами.

Для достижения поставленной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Построить тканеспецифическую кДНК библиотеку из гипофиза норки.

2. Выявить рекомбинантные клоны, содержащие фрагменты кДНК генов гормона роста и пролактина норки, и определить их нуклеотидные последовательности.

3. Провести сравнительный консенсусный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов гормона роста и пролактина у разных представителей позвоночных.

4. Провести анализ различий по длине рестрикционных фрагментов ДНК, выделенной из клеток американской норки и китайского хомячка в Саузерн-блот гибридизации с гомологичными зондами гормона роста, пролактина, -субъединицей легкой цепи иммуноглобулинов и -субъединицей тяжелой цепи иммуноглобулинов, а так же с гетерологичным зондом орнитин транскарбомилазы человека, и провести хромосомную локализацию соответствующих генов норки с помощью панели клонов гибридов соматических клеток американская норка х китайский хомячок.

5. Провести региональную локализацию гена гормона роста с помощью гибридизации in situ.

6. Провести сравнительный анализ некоторых групп сцепления Американской норки с таковыми у других видов млекопитающих.

7. Провести локализацию геномных клонов, содержащих микросателлитные последовательности, с помощью FISH гибридизации в геноме Американской норки.

Научно-практическая значимость.

Работа имеет как теоретическое, так и практическое значение. Создание детальной цитогенетической карты норки важно для-* изучения закономерностей эволюции геномов млекопитающих, выявления наиболее консервативных синтенных групп генов и анализа их сохранения в течение эволюции млекопитающих.

Описанные в работе 34 микросателлита могут быть успешно использованы при построении генетической карты норки, а оставшиеся 10 - как удобные маркеры 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12 и 14 хромосом норки.

Кроме того, полученные результаты имеют практическую значимость для частной генетики норки - объекта пушного звероводства.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были представлены на 5 Российской конференции "Новые методы в биологии" (Пущино, 1992), на 24 конференции по генетике животных (Прага, 1994), на 11 Европейском коллоквиуме по цитогенетике сельскохозяйственных животных (Копенгаген, 1994).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы (199 ссылок). Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25-ю рисунками и содержит 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении формулируются предпосылки и основные задачи исследования.

Глава 1 представлена обзором литературы по построению генетических и физических карт геномов млекопитающих, сравнительному картированию и закономерностям эволюции геномов млекопитающих.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

. Материалом для конструирования тканеспецифичной кДНК библиотеки послужили гипофизы норок, препарированные из мозга сразу после забоя экспериментальных животных в течение 1-2 часов.

Материалом для определения хромосомной локализации генов американской норки послужила панель клонов гибридов соматических клеток норка-китайский хомячок. Для скрининга кДНК библиотеки гипофиза норки был использован гетерологичный зонд кДНК гормона роста быка и синтетический олигонуклеотидный зонд, комплиментарный матричной РНК пролактина человека. В качестве зондов для хромосомной локализации генов с помощью Саузерн-блот анализа были использованы кДНК вН, кДНК Р[?Ц кДНК ЮвС, кДНК ЮКС норки

и кДНК ОТС человека. В качестве зондов для FISH гибридизации были использованы (GT)n позитивные космидные клоны норки.

Методы. В работе были использованы стандартные методы работы по выделению, анализу РНК и ДНК, микробиологической работы, определению нуклеотидной последовательности ДНК, Саузерн-блот, in situ и FISH гибридизации (Sambrook et al., 1989).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей кДНК генов суперсемейства гормона роста проводили с использованием программы пакета филогенетического анализа VOSTORG версии 3.0 (Zharkikh et а!., 1990). Использованные в работе последовательности были извлечены из банков данных EMBL 1992 г. и PIR 1991 г.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Определение нуклеотидной последовательности генов гормона роста и пролактина норки.

Скрининг кДНК библиотеки из гипофиза норки на присутствие последовательности гена гормона роста проводили с помощью GH кДНК быка. Было выявлено 21 рекомбинантных клона, содержащих кДНК гормона роста норки. Рекомбинантный клон pMVGH, содержащий вставку, размером 723 п.н. переклонировали в плазмиду pUCIS и использовали для определения нуклеотидной последовательности и хромосомной локализации гена гормона роста норки.

В результате гибридизации колоний E.coli с синтетическим олигонуклеотидным зондом, комплементарным матричной РНК пролактина человека было выявлено 18 рекомбинантных клонов, содержащих кДНК пролактина норки. Рекомбининтный клон pMVPRL, содержащий вставку размером 714 п.н. использовали для определения нуклеотидной последовательности и хромосомной локализации гена пролактина норки.

Нуклеотидной последовательности кДНК гормона рости

норки

присвоен регистрационный номер х59786 в банке данных EMBL (Nucleotid Sequence Database). Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, длиной 723 п.н. представляет собой полную копию мРНК, кодирующую гормон роста норки, без участка сигнального пептида. Она содержит открытую рамку считывания, размером 615 п.н.

Нуклеотидной последовательности кДНК пролактина норки присвоен регистрационный номер х59785 в банке данных ЕМВ1-. Определенная нуклеотидная последовательность кДНК длиной 714 п.н. представляет собой полную копию мРНК пролактина норки, за исключением 14 Ы-концевых аминокислотных остатка. Последовательность имеет открытую рамку считывания, размером 582 п.н.

Наибольший процент гомологии с аминокислотной последовательностью гормона роста и пролактина норки был выявлен у свиньи (97% и 95% соответственно).

Для 11 видов млекопитающих было проведено попарное выравнивание гормона роста и пролактина внутри одного вида, а затем выравнивание всех 22 последовательностей (Рис. 1).

Пролактин разных видов и гормон роста сохраняют общую интрон-экзонную структуру. Высокая консервативность одних и тех же участков у вН и РЯЦ несмотря на большую давность их дивергенции, явно отражает общие для ЭН и РЯ1. функциональные и структурные ограничения.

Аминокислоты, важные для пространственной структуры белка (цистеин-8-5 связь, пролин - нарушает - и -структуры, глицин - участки поворота, триптофан - самая большая аминокислота), встречаются в обоих белках в сходных позициях. В то же время, различия между консенсусами наблюдаются в аминокислотных позициях, менее важных для вторичной структуры и, возможно, важных для функционирования активных центров (Рис. 2).

2. Хромосомная локализация генов вН, РШ., Ю6С, ЮКС и ОТС американской норки.

Саузерн-блот анализ геномной ДНК, выделенной из культуры клеток Американской норки, китайского хомячка и гибридных клонов панели с кДНК ЭН, кДНК РШ, кДНК ЮЭС, кДНК ЮКС норки, кДНК ОТС человека позволил провести хромосомную локализацию этих генов норки. В Табл. 1 представлены результаты, полученные при анализе 15 клонов гибридов соматических клеток норка-китайский хомячок. Анализ Табл. 1, показывает полную конкордантность между сегрегацией гена ОН с 8-й хромосомой, генов РЯЬ и ЮвС с 10-й хромосомой, гена ЮКС с 11-й хромосомой и гена ОТС с X хромосомой норки.

C>( Boa taurus

G>| Gailu« qallus

CM Homo soplen«

Cn Hustel la vison

CH Hus rausculus

Cil Sus croia

Cil Rattus oorvegicus

Cil Ovls ovia

CJI Cyrpinius carpió

Cil -1 Oncorhynchua keta

Cil-ll Oncorhynchua keta

CJI Or^ochromis mozambique

TRI. Dos tourna

I'RI. R'1 ) I u G gallu«i

TRL Homo tapions

PRL Mu g t eI In vi son

PRL Mns fiuaculiis

PRL Sua ciofa

PRL R.nctos norvffgjcur.

PRL Ovjq ovis

P!»l. CyrpiniuB carpió

PRL I nncorhynchu» keta

PUL II Orcorhynchus krti

PRL Ot»ochcoraiR mozambiqui

Structure oí exonc

Cil Bos Taurus CH Callus gallus Cil llomo sep i ens CH Mustella vison Cil Hus rouscu lus CH Sus crofa Cil Rnttus norvfqicuR ,CH Ovis ovia Cil Cyrpioius corpio CH-1 Oncorhynchua keta CH-II Oncorhynchua keta CH Oreochromis mozombique PRL Bos taurus PRL Callos gallua PRL Homo sapiens PRL Hustella vison PRL Hus mgaculua PRL Sus crofa PRL Rattus norvegicus PRL Ovis ovis PRL Cyrpioius carpió PRL I Oocorhyochua keta PRL II Oocorhynchus keta PRL Oreochromia reozambique Structure of exoni

-.V eu /и eu 90 loo llü

-MMAACPRTSLLLAFALLCLPWTQWGAFPAHSLSGLFANAV LRAQHLHQLAADTFREFCRTTIP-EGQRYS- IQNTQVAFCF SETIPAPTGWEAQQRSDLELLRISLLLIQ

--♦♦P*SWF*P*»IAWTLCLPQCAAAT# ♦♦♦?♦♦«♦♦♦ --♦♦TDS *- + + H**TVS****L*P + +

--------♦♦♦DSQ«PH-»*T»S*- + + + L«-P4EA**L* +

♦ S + *

♦ «44«

♦ P »TSL* ♦ ♦♦S**TfSNRE»'

♦ A*A»

----------harxxlv4«SW*VS»LVN4CR----4SDNQR*4H»*^

----------H»0XXF4-4HPVL»VSCFLS*CA----4 JEHQR 4+NI♦♦

..........H »QXXF4 4HPVL»VSCFLS *CA----4 4ENQR»4HIV*

----------HMSXXV4 4*SV--V*4CVSSQ0----ITDSQR*4SI*4

MDSKCSS0KCSRI.LLL4WSNL*^*QGVVSTPVCrNCPCNC0VS[.RDL HSNRCASl.RGLnJ\VL»VSNTL4TICECV»Sl.PICPICSVHCQVSLCEL MH1KCSPHKCS --LLL4 4VSNL»4 4 0SVArLPlCPCCAARC0VTI.RPl

------------------------------------CAVHCQVSLRDl

NSOGSAOK4CT-I.LL4 4 ISNL* F »QNVQP LP I CS AC - - DCQTSLRELF HnNTGSSQKGSLI.lI.L44VSNl.F4 4KSVASLP!CPSGAVMC0MSLRDL HIISOVSARK4CT-[.I.L«KMSML4F40nvqtlpvcscg--DCOTPLPEL HDSKCSAQKOSRLLLL»WSNL4 ♦ 4 QGVV STPVCPHCPGNCgvS LROL

------------------------------------------VGL DL.

..........................................ICLSDL

............-......-............-......... ICLSDL

1-1.............l.'.'.'.'.llllíl1.

120 130 140 150

SWLGPLQFLSRVFTNSLVFGTSDR-VYERLKD—

4 Y♦A 4 4 SN 4 4 DL *

160

-LEEGILALHRE

- 4 4* 4 4Q4♦♦♦4

-4»*+ÍQT44GR

- 44444Q444+*

-4444*Q444Q4

I«.V4 444*4 44KMlND*40SLL»E4RR0L4K4FPLS--4 S4V44 + *L»»QKM»HD»DG4LL»0»PBQLNK 4FLL0--4-M4V 4♦♦4L4*QKM»HO» 4 LLSO« RRQLNK 4fLLD-- 4

H4VT4 4.»L4 4QRL4S0 4 4SSLQTE4QRQLNK4FLQO--4

FDRAVKVSHY IHDLSSEHFNEFDRRYAgCRGFI THALIIS FDPAVKLSHY IHYLSSEIFNEFDERYAQGRGFITKA4HC FDRA WLSH Y 11INLS SEHFSEFDRR YTHGRGFITKAINS rORAVILSIIY IIIHLSSEHFNEFORRYAIICRCFITKAIUS ORVVtLSIIYIIl4f.YTDHFlEFDKQYVQDnEFMVKVIHD»! FDRAVILSHYIHHLSSEMFNEFDKRYAQGRCFITKAINS FDRVVHI.SH Y1H 4LYTDHFIEFDKQYVQDREFIARAIHO FDRAVKVSHY i HNLS S EMFilETOKR Y AQGKGF ITHALNS ♦ 4ERASELSDRLHSLSTSLTU0LDSHFPPVCRVMMPRPSM

merasqrsdrlhslstsltkdldsiifppmgrvmmprpsm

HERASQRSDKLIlSLSTSLNRDLDSIIFPPMCnvHMPRPSH 4ERAS04SÜKLIISLSTTLTQELDSIÍFPPIGRVIMPRP*M

................M -3....................

170 1B0 190 200

LEDGTPRAGQILKQT---YDRFDTUMRSDDALLKNYGLLS

4 44RS44GP4L4RP4---- + + 4 4 4- JHL»NE 4 *♦ 4 4 4 4-4 4 4 4 44 + 4S 44T4 44F 4 44---- 4S ♦ ♦♦♦4SKN

N 40Y4E^++ + ^ M *0S 4VS♦VD' N 40S4VS + IDI M 40Y4IS♦ID< H TSSL4T»ED< Il TSSLÎT* ED-II TSSLAT* EDi H TSSLST* ED' T SSLAT *ED< H TSSLST^ED P TSSLAT4ED H TSSL4T 4 ED M TSSI.QV 4HD H TSSLQT^KD H TSSLQI*KD II TSSLQÎ*ID

♦FR»4E

RS4H4K+ KS4V4R4 KS4V4K»4H4*FR44E RS4V4K44-S4 + YG4VE ♦ TIMIEV4HSLI4G4LR '♦IIIHED»4HLVVGVLR > 4HHQRDF4 SLIVSI LR

►♦IHHE044HL14RVLR LRVPPEV44HLt4S*V4.

♦IH«EV»4HLI4RVLR ■KVPPEV44HLI4S4VH '♦THHEV4MSLI*G4LR LKVPEDP4 + SLARS 4LL LKV4EH44iSIJ^RS4[.L LKR4EN**ISLARS4LL L4V4E5D»HSLARS»L4

4L»

210 220 230

•C FRKOLHKTETYLRVHKCRRFCEASCAF

4JVQ44SV-4G44G4 ♦44+4444V»S4444

4«4 S♦♦♦♦♦♦♦♦

♦ 4EF< ♦♦ET4 + *ET4 ♦♦EF<

♦ ♦ND«

♦ ♦ND«

♦ ♦N£*

♦ ♦HD'

♦ SSD ♦♦NO

♦ ♦HD'

♦ ♦N04 A4SD A4ND4 A4ND4 A+SD +

S4T4 4GTVS + + + TV+NPNQIT-4-4* A +-----

S+T^XXI-S^* + HVRWANQIS-4 + +S*-----

S+T^XXI-S**+KVRN+NQIS-♦♦♦£♦-----

SR------SL4GGSSLRHQIS-PR4 SE.....

♦YH4VTEVRGMKGAPDA-ILSRAISIEEENRR IH4ASEVQRIKEAPDT-ILWRAVE IEEQNRR ♦YH+VTEVRGMQEAPEA-ILSRAVSIEEQTKR TH4VSEVRGM0EAPD4-ILSRAIEIEEQNRR FQ- 7TGVCGIQEAPEY-ILSRA'EIEEQNKQ Y H -\TEVRCMQEAPDA-I LSRAIE IEEQNKR FQ4.:TCLGGIHEAPDA-IISRA4S IEEQNKR ♦ YH»VTEVRGHKGVPDA-ILSRAIE IEEENRR AL» 4SEASSLAKPERNTIDSKT4E LOENINS LL4 SEAPTLPHPSNG4ISSKIRELOOTSRS LL44 SEAPTLPHPSNG+1SSKIRELODTSRS W4 + SSASTLPHPAQ4SIFNKIQEH0QTSRS

RM4+SV+IRG CL4+Q4NHDDNDSLPLPFE»FYL+H--GENN+RESFR4+A-+ KV4 + NLHTG SQ^+VLSLDDNDS4QLPP+GNYYQ+LGGfCNVRR + 4E»4A- + RV+4NL+IEG SQE+VLSLDDNDS4HLPP4GNTTQ4LGG4GNVRR»4E4+A-+ RT444L»I4A NQ+EAENYPDTDTL0HAP+GNTTQSLGCNES*RQT»E4+A-4

L+4HEM1FGQ VIP+AKETEPYPVWSGLPSLQTR----DE♦+RYSAFYN»LH♦

L+4HERIVGR VHS+HAGNEIYSHSDGLPSLQLA----DE♦SR♦FAFYN»LH♦

L^HELIVSQ VHPE4RENEIYPVWSCLPSLQMA----DEESR^SA +YN4LH +

L++HERIVGQ VHP^VRENEVYSVMSGLPSLQMA----EE4SR^FAFYN»LH+

L^ + VERI ISQ AYPEAKGH. ITFVVSQLPSLQGV----OEESKILSLRHTIR»-

L^+HERIVGQ VIIP4IRENK;YSVWSGLPSLQKA----DE4TR + FAFYN4LH♦

L4++ERIISQ AYPEARGNEIY+VWSQLPSLQGV----DEESRDLAFYNNIR4

L+4MEHIFGQ VIP+AKETI'.PYPVWSCLPSLQTR----DE^ + RHSAFYN^LH4-

♦ GA4LEHVFN------RHLi'TSDNLSSLPFTTN-SLGEDRTSR +V4FHF + LS ♦

CD + LOIKVN------RUGÍ SSQYISSIPFRGG-OLGNOKTSR+I4FHF4HS 4

CD + LDI+VN------RÏ1GPSSQTISSIPFRCG-DLCUDKTSR^ I ♦FHF^HS*

♦RD+LDV+SS- -----KHGSPAQAI♦SLP+RGGTNLGHDRITK>I+FNF+LS+

----)( .5-------A_peptid7.......................-

4H4- + V + 4 + + 44AN

♦♦♦SLDSH4TL RSLMN4TL KSL++N4TL

L4R + SSUD4 + + RLLN

H4R4S4+IDN44R4L

L4R4S++IDN4+RLL+

L*R4S>+IDH4«RLL4

L4R+S++V0NF+K+LR

L + R4S*MDN4 + RLL4

L4R4S++VDN44RFLR

L4R4SS♦ID++4RLLN

♦♦R^S*♦IDSF+R+LR

»♦R4S+*IDSF4R+LR

♦+R+S»+IDSF4R+LR'

L*R4S»+IDSF4R4LR<

11YNNN ♦--♦♦LIHDSN4--♦IIHHNN4--

♦IVTHSN4--QIAKQNU4- . ♦IIYDSH4- • QIVHRNN4-• ♦IIYKNN♦-• ♦ A-RXRPEM.'.' ♦ATKMRPETC ♦ATRHRPETC ♦AAKMQPEHC

.........I

Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей GH и PRL для 11 видов.

Аминокислота, совпадающие с аминокислотой той же позиции в первой последовательности, обозначена плюсом.

44...

1. Common consensus

2. GH

3. Prl.

4. Intron/Exon structure

1 11 21 31 41

--------.........ll..«l..l,..q.•«•««*•«■•»LT*

....................«.«L

[ -1--------It-2------------------------T---

51 61 71 81 91

1. Corrmon consensus »*«»»»**«••«**..»»•»•»•»*«*»«• ».».«»»с»*»*«»»

2. GH »QHm»ui»«»"«FE,"*P«E,"",l»*****FC,S*«I"

■}. Prl. ................E'D«*«"»"—■•"»»CHTSSL'T

4. Intron/Exon struoture -------------11-Э---------------------------

1. Common consensus

2. GH

3. Prl.

4. Intron/Exon structure

1. Common consensus

2. GH

3. Prl.

4. Intron/Exon struoture

1. Common consensus

2. GH

J. Prl.

4. Intron/Exon structure

101 111 121 131 141

QA**»,,"L"L,»**L,*WNDPL"*L»*E»*"***"**I»S

151 161 171 181 191

D-----L..GI*«L»..T.pG.p*».*»..Q...»Yt*r**N**"

---------------ц_5------A_peplidL?---------

201 211 221 231

»•«••L,*C««,D«HK»«»YI.«V«»CR**'*"C«*

*NTf*LI>,-CFKKDfHKeETYI.*V,KCR***E**C**

**F*#L**C*RRDSHKID'*LKeL*CR******•**

-----------------------------------]

Рис. 2. Консервативные аминокислотные позиции для гормона роста (GH), пролактина (PRL) и для общего выравнивания (Common consensus). В нижней строке приведена разметка экзонов для гормона роста человека.

Тжйлям 1. Сегротдм гево* С11, РЯЦ 1СОС, ЮКС, ОТС ж мкгроитешятвых клонов А016. А024 с хромосом»*« вор« ■ слов« гаСрцо! соивтжчеспа остог жмгрвыясш аори-отжЛсгжЙ коючог.

4-

Клоки бН К02-1 -122-1 -п:в-1 +

1.15-1 -

ОТВ-1 _

иоы 4-

Р12М 4-

гам

К1М -

123-1 -

ОПВ-1 _ ГО9М

КМ-1 _ 4-

озм _ + 013М -Двегориятвоетъ % ОН

ры.

юос

ЮКС

ОТС

А016

А024

пи. КЮСЮКСОТС Аа16АС2<

4-4- + + +

ХРОМОСОМЫ

4 5 6

10 II 12 13 14 X

+ + + _ + _ 4- + _ + + 4- +

+ _ - 4- + - - + - - + + - +

* + + _ - »■ + 4- - + - 4- 4-

_ _ - . - - f - + - + 4- +

_ _ + 4- 4- - _ 4- + f -

* + + - * - - 4 + - V 4-

_ f 4- - - + + - - 4- 4-

- _ 4- - 4- - - * - - - 4- 4-

* » - 4- 4- * - - + + f - 4-

_ _ _ - f 4- - t - + - - к

_ _ - - 4- ■ 4- - - - - 4 «.

f * - - - - ■ 4- - * + 4- 4-

_ _ - 4- - - - + + - V

+ + - - - 4- - - - + - - 4

+ - •*• - - + " 4- - - - - 4- f

60 33 53 27 40 87 73 0 33 60 40 47 53 47 53

60 60 40 40 60 53 66 53 33 0 47 27 60 60 33

60 60 40 <10 60 53 66 53 33 0 ¿7 27 60 60 33

53 27 47 47 53 73 47 33 60 47 0 60 ¿0 40 66

47 73 40 53 53 47 73 53 33 33 66 33 53 33 0

53 53 47 Ч 33 66 66 47 53 27 60 0 60 66 33

47 73 40 53 53 47 73 53 33 33 66 33 53 33 0

гё>Шкл аУГп! [И^/ГГИГ! 1Т¥|ЧНШ вгёП^1ДПЗ 2 3 : 4

"ЕГУЛГПП Сд^УЬ» а аа П^-^ТПГ [Ь-^ПШ

5 6 7 8 9

"У ^гпт гу^гт [Ь^Е о^ ¿зй 1В 11 12 13 14

ПГчуГП X

Рис. 3. Субхромосомная локализация гена гормона роста на р- плече 8-й хромосомы норки.

Таблица 2. Хромосомная локализация ипкросателлптпых клопов.

Хромосомная

Клоны локализация

AG16 12 цеп. (ВП)

AGI 2, 4, 8, 7 цен. (ВП)

AG23 12 цен. (BID

AG32 11 цен. (BID

AG63 12 цев. (ВП)

AG64 11 цен. (ВП)

AG71 9 цен. (ВП)

AG70 1, 2, 4, 7, 14 цеп. (ВП)

AG25 Yq (ВП)

AG34 2, S ядрышковый организатор

AG2 4, тел. (НП)

AG4 13р тел. (НП)

AG8 Хр тел. (НП)

AG13 llq mi. (НП)

AG5 11-ql (НП)

AG21 2р пл. (НП)

AG22 7q2.1 (НП)

AG24 Хр тел. (НП)

AG26 4q (НП)

AG27 X цен. (НП)

AG28 iq (НП)

AG30 8р2 (НП)

AG31 10 цен. (НП)

AG35 8q тел. (НП)

AG36 2р (НП)

AG42 Зр тел. (НП)

AG43 2q тел. (НП)

AG45 2q тел. (НП)

AG49 8р (НП)

AG51 9q тел. (НП)

AG52 Sq тел. (НП)

AGS3 5 цеп. (НП)

AG57 llq тел. (НП)

AG58 13p тел. (НП)

AG60 7pl (НП)

AG61 9q тел. (НП)

AG62 9ql.2 (НП)

AG65 llql.2 (НП)

AG66 9, тел. (НП)

AG69 4pl (НП)

AG73 4q (НП)

AG75 8pl (НП)

AG78 2p2 (НП)

AG79 13q пц. (НП)

Сокращения: пен.-центромера, тсл.-тслоысра, пд.-прмцентромера (ВП)-высокоповторяющаяся последовательность, (НП)-ншкоповторяющаяся последовательность.

3. Субхромосомная локализация гена гормона роста

у американской норки

Анализ распределения зерен серебра при гибридизации с 3Н-меченным фрагментом кДНК гормона роста норки показал, что 249 проанализированных клеток норки содержат 620 зерен. 105 зерен ( =84.6; Р<0.001) лежат на 8 хромосоме. 46 из них (43.8%) локализованы в районе 8р25-р23 (Рис. 3). Полученные результаты указывают на достоверную локализацию гена гормона роста норки в районе р25-р23 8-й пары хромосом американской норки.

4. Локализация микросателлитов с помощью

FISH гибридизации на хромосомах норки

79 космидных клонов позитивных по (GT)n мотиву были использованы в качестве зондов для FISH гибридизации. 44 из них дали положительные результаты (Табл. 2). Как видно из Табл. 2, большинство исследованных микросателлитов представлено двумя видами: низкоповторяющиеся последовательности и высокоповторяющиеся последовательности, лежащие в центромерных районах хромосом. Были обнаружены Y-хромосома специфичная высокоповторяющаяся последовательность и высокоповторяющаяся последовательность, специфичная для ядрышкового организатора 2-й и 8-й хромосом норки.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Суммируя данные по анализу сегрегации 5 уникальных генов американской норки в клонах панели гибридов соматических клеток норка-китайский хомячок, можно отметить, что не было обнаружено ни одного клона с дискордантной сегрегацией хромосомы и гена. Это свидетельствует о незначительном количестве перестроек хромосом норки в данном наборе клонов. Учитывая это достоинство панели и тот факт, что в ней имеется не менее 5 гибридных клонов с дискордантной сегрегацией любой пары хромосом норки, можно подтвердить, что используемая панель является эффективным инструментом картирования генома американской норки.

С учетом полученных нами данных, цитогенетическая карта американской норки в настоящее время представлена 72 генами и

44 микросателлитами, маркирующими все аутосомы, X и У хромосомы.

Обращает на себя внимание сохранение у норки синтенных отношений генов, наблюдающихся у большинства видов млекопитающих. Нами были локализованы гены, входящие в две такие группы : 0ТС-С1А-РСК-НРРТ-06Р0 на X хромосоме к А0Н2-СН-ТК1, СА1-К-А1ЛЗОС- Ш-1РН2, НОХ2 на 8-й хромосоме норки.

Локализация гена ЭИ на 8-й хромосоме норки в р25-23 области, позволяет нам провести анализ этого района хромосомы. Ранее полученные и представленные в настоящей работе результаты позволяют предположить порядок генов в коротком плече 8-й хромосомы норки: (сеп-р12-р24АОН2-р23-р25СН-р24ТК1, СА1_К-р24-р25А1-ООС- р2биМРН2, НОХ2-р1ег). Известен следующий порядок гомологичных генов в длинном плече хромосомы 17 человека: (17А1ЛЮС-17Ч21-ч22НОХ2-17Ч22-я246Н-17я23-

25СА1.К,иМРН2-17я23,2-ч25,ЗТК1).

Консервативная группа генов, включающая вН расположена также на 11-й хромосоме мыши, 19-й хромосоме коровы, 12-й хромосоме свиньи, 10-й хромосоме крысы. Описано большое сходство Э-бэндинг рисунков короткого плеча хромосомы 8-й норки и длинного плеча хромосомы 17-й человека, части 11-й хромосомы мыши.. Все эти данные позволяют нам сделать вывод, что эта синтенная группа генов маркирует очень большой консервативный район, сохраняющийся у отдаленных видов млекопитающих.

Локализация гена ОТС на X хромосоме норки еще раз подтвердила гипотезу Оно о консерватизме генного состава X хромосомы млекопитающих (ОИпо, 1967). У всех видов, для которых известна хромосомная локализация генов ОТС-С1_А-РСК-НРРТ-С6Р0, эти гены находятся на X хромосоме. Однако, порядок генов на X хромосоме млекопитающих может быть различным.

Описанные в работе 44 пробы, содержащие микросателлиты маркируют 57 районов хромосом норки (Табл. 2). 10 из них представлены высокоповторяющимися последовательностями, которые нельзя использовать для построения генетической карты норки, но можно использовать как удобные маркеры 1-й, 2-й, 4-й, 6-й, 7-й, 8-й, 9-й, 11-й, 12-й и 14-й хромосом. Кроме того, космидный клон АС34 является первым, описанным у норки, маркером У хромосомы. 34 микросателлита представляют низкоповторяющиеся (уникальные) последовательности и,

возможно, могут быть использованы для маркирования 46 районов хромосом при построении генетической карты норки.

Проведенный в работе консенсусный анализ аминокислотных последовательностей белков суперсемейства гормона роста позволил более подробно проанализировать эволюцию этого типа белков.

Сохранение одинаковой интрон-экзонной структуры у представителей разных видов, возможно, отражает не только эволюционную историю данного семейства белков, но и жесткие функциональные ограничения на интрон-экзонную структуру. Характер наиболее консервативных аминокислотных позиций также служит подтверждением того, что высокая консервативность одних и тех же участков связана с необходимостью поддерживать определенную пространственную структуру белка.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована «ДНК библиотека гипофиза норки. Выявлены рекомбинантные клоны, содержащие фрагмент кДНК, величиной 723 п.н. гормона роста и фрагмент кДНК , величиной 714 п.н. пролактина американской норки.

2. Определена нуклеотидная последовательность «ДНК гормона роста норки (регистрационный номер в ЕМВЬ х59786) и кДНК пролактина норки (регистрационный номер в ЕМВ1_ х59785).

Показано, что выделенный фрагмент кДНК ЭН норки представляет собой полную копию мРНК, кодирующую гормон роста норки, без участка сигнального пептида и содержит открытую рамку считывания размером 573 п.н. Выделенный фрагмент кДНК Р(?1_ норки представляет собой полную копию мРНК пролактина норки, за исключением 14 Ы-концевых аминокислотных остатков и содержит открытую рамку считывания размером 582. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей кДНК гормона роста и пролактина норки и других видов млекопитающих выявил высокую степень гомологии. Обнаружены высоко консервативные аминокислотные позиции, которые участвуют в формировании активных центров гормона роста и пролактина у всех известных на сегодняшний день видов.

3. С помощью Саузерн-блот "анализа ДНК, выделенной из клеток гибридов соматических клеток американская норка-китайский хомячок, определена хромосомная локализация 5 генов; РР!_ и ЮСС на 10 хромосоме, ЮКС на 11 хромосоме, ОТС на X

хромосоме и GH на 8 хромосоме норки. В результате проведенного исследования к настоящему времени на хромосомы американской норки локализовано 72 гена, что расширяет возможности по сравнительному картированию млекопитающих.

4. С помощью гибридизации in situ GH норки был картирован регионально в 8р25-р23.

5. Проведен сравнительный анализ цитогенетической карты американской норки с цитогенетическими картами других видов млекопитающих. Подтвержден консерватизм генного состава X хромосомы норки, а также консерватизм протяженного участка короткого плеча 8-й хромосомы американской норки, гомологичного району длинного плеча 17-й хромосомы человека, 11 хромосоме мыши, 19 хромосоме коровы, 10 хромосоме крысы, 2 хромосомы лисицы.

6. С помощью FISH проведена локализация 79 проб ДНК, содержащих GT динуклеотиды. Показано, что 44 пробы являются хромосомо- и регионо-специфичными маркерами всех хромосом норки. Среди них впервые описанный маркер Y-хромосомы -космидный клон AG25.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Головин С., Мальченко С., Серов О. Синтез, клонирование и нуклеотидная последовательность активного центра ATR американской норки (Mustela vison). // 5-я Всероссийская конференция "Новые методы в биологии." 1992. Май 18-20. Пущино. С.43-44.

2. Мальченко С., Серов О., Головин С. Синтез, клонирование и нуклеотидная последовательность кДНК гормона роста американской норки (Mustela vison). // Сибирский биологический журнал. 1992. С.65-66.

3. Морозов П. Мальченко С., Эволюция суперсемейства гормона роста. // Сибирский биологический журнал. 1993. С.1-20.

4. Malchenko S., Golovin S., Matveeva N., Brusgaard К., Serov O.L. Cloning and nucleotide sequence of Prolactin cDNA from American mink (Mustela vison). // The 24th International Conerence on Animal Genetics. 1994. Prague, Czech Republic. July 23-29.

5. Malchenko S.N., Golovin S.J., Matveeva N.M., Brusgaard K., Serov O.L. Cloning, nucleotide sequence and chromosomal localization of Growth Hormone of American Mink (Mustela vison). //

Proceedings of 11 th European Cclloquim on Cytogenetics of Domestic Animals, Royal Veterinary and Agricultural Uviversity, Copengagen, Denmark. August 2-5. 1994. P. 140-144.

6. Khlebodarova T.M., Malchenko S.N., Matveeva N.M., Pack S.D., Sokolova O.V., Alabiev B.Y., Belousov E.S., Peremislov V.V., Nayakchin A.M., Brusgaard K., Serov O.L. Chromosomal and regional localization of the loci for IGKC, IGGC, ALDB, HOXB, GDT, and PRNP in the American mink [Muste/a vison): comparison with man and mouse. // Mammalian Genome. 1995. V.6, N10, P.705-709.

7. Brusgaard K., Christensen K., Malchenko S.N., Lohi 0. The WWW server HTTP: // 1995. 130.225.41.106./mink. htm

8. Malchenko S., Golovin S., Matveeva N., Bruagaard K., Serov 0. Cloning, nucleotide sequence and chromosomal localization of Growth Hormone from American mink (Muste/a vison): comparison with man, mouse, cattle and pig. // Mammalian Genome. 1996. (in press).

9. Malchenko S., Golovin S., Matveeva N., Bruagaard K., Serov 0. Cloning, nucleotide sequence and chromosomal localization of Prolactin cDNA from American mink (Muste/a vison). // Mammalian Genome, (in press).

10. Christensen K., Brusgaard K., Malchenko S.N., Lohi O., Serov O.L. Chromosomal and subchromosomal localization of 13 cosmide clones from Ametican mink (Muste/a vison). // Mammalian Genome, (in press).