Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика межвидовых гибридом мышь-норка, продуцентов иммуноглобулина американской норки или его цепей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика межвидовых гибридом мышь-норка, продуцентов иммуноглобулина американской норки или его цепей"

-- г, '

■"-"Г/. .

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

ШЭДЕВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

УДК 575.222.7:576.332.-53.-316.7:591Л 58.1

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МЕНВВДОВЫХ ГКБРЦЦОУ КЫШЬ-НОРКА, ПРОДУЦЕНТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА А!ЖРИ-КАНСКОЙ НОРКИ ИЛИ ЕГО ЦЕПЕЙ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1991

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР г. Новосибирск

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор

|0.К.БараноЕ, Институт цитологии и ге-

нетики СО АН СССР,

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Н.Л.Галахарь, Институт цитологии и генетики СО АН СССР

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший

научный сотрудник С.Н.Родин, Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

кандидат биологических наук, доцент Л.В.Высоцкая, Новосибирский государственный университет

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова АН СССР

Защита диссертации состоится "" 1991. г. на

заседании специализированного совета по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П. 01) в Институте цитологии и генетики СО АН СССР в конференц-зале Института по адресу: 630090 г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО АН СССР.

Автореферат разослан 40 " 1992. г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук " А.Д.Груздев

mjîibi»

f, г » .З.я.3 Отдал

лхерШ^Й

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Открытие и развитие гибридсмной техни-

ки как метода получения ыоношюнальных антител стало одним из крупных достижений современной биологии, оказавшим значительное влияние на решение целого комплекса научных и прикладных проблем биологии и медицины. Наиболее изучены в настоящее время гибридоуы ишь-кшь, продуценты моноклональных антител цы-шиной природы. Потребность в моноклональных антителах и икиу-ноглобулинах другой видовой принадлежности стимулировала развитие исследований, направленных на создание меявндовых гибридом (James, Bell, 1987; Srikunaran et al., ОТ; Gebauer, Lindl, 1989). Один из способов их конструирования - слияние миеломных клеток шшт и иммунных В-линфоцитов глпотного другого вида. Мегвидовые гибридомы и продукты их секреции необходимы при изучении видоспецифических антигенных маркеров, классов и подклассов иммуноглобулинов ( lg ), для секвенировакяя ДНК генома етвоткых исследуемого вида, выделешш и-РНК при проведении генно-инаенерных работ (Черепахин, Рохлин, 1987; Ураков и др., 1990; Galfre, Ullstein, 1982; Dreher et al., 1983; reyev et ai., 1985). Исследования организации к механизмов экспрессии генов иультигенного семейства lg кивотных разных видов значительно углубят наги знаки о функционировании генома эукариот. При работе с межвидовыми гибрндсмами возникает целый ряд проблем, eçe не нааедетх своего рспокия. Как правило, они обусловлены генетической отдаленность!» партнеров по гибридизации. К ним могно отнести палую эффективность слияния, трудности клонирования, низкий уровень lg -секреторной активности клеток, их нестабильность и связанную с ней утрату синтеза lg (Hunan hybridoinas..., 1985). Центральной проблемой, несомненно, остается получение стабильных линий мезвидовых гибридом, длительное время секретиругщих lg.

Цель и задачи исследования. С целью получить меявидовые гибридомы мышь-норка, продуценты lg американской норки, последовательно решались следующие задачи:

I. Проведение гибридизации миеломных клеток мыши с В-лиа-фоцитами американской норки и получение гибридом мышь-норка,

сепрэмрукра норочий 15. - ■ - ••

2. Ецдсленпе пз поряичных гибридом плональкых линий, ха-*> ■ рапмрпстика продукта п:; сокреции, уровня синтеза норшГ%' проведение пар о .г огп ч е с к о г о анализа клеток.

3. Исследование популяции клеток клонов гябрпдоыы цыаь--иорза с нестабильной секрецией

4. Получение качественных и количественных характеристик содержания хрсмосоичого материала норкп в карпотипе клеток различных гибрадошез линяй.

Научная новизна. Еперзко удслось сконструировать габридо-кы шаь-норна, с;штеэиругг;;:е ь-цепя 1е американской норки. Получены их фуизцаоиальные и кариологкческие характеристики. Исследование нестабильных по продукции Ig клонов гибридслы ьгшь-нораа показало недостаточность трех этапов клонирования, обычно используемых с гкбридоиной технологии для выделения стабильных линз!55 иашидовше гибридом.

Впервые проведено изучение содержания хромосомного материала донора в парлотппс клеток иеллзидовых гибридом с помола гпбрлдпзацни 1п зК;и. Получены новые данные, демонстрирующие, что пощио эликинацпи большинства неыыяних хром о с он происходят значительное преобразование карпотипа гибридемных клеток, затрагнвагцэе хромосомы обоих партнеров по гибридизации.

Впервые при продолжительно;* культивировании стабильных линяй иеавкдовых гибридои обнаружили значительное увеличение числа плеток с экзогенной (донорской) ДНК, интегрированной в хромосомы 112221.

Практическая ценность. Дополнена отечественная коллекция клеточных культур - продуцентов Iв . Клетки двух линий гибри-доиы ииаь-корг.а, сскреткрусцие 1гО и ь-цепи 1й американской норки, депонированы во Всесоюзной коллекции ¡меточных культур (Институт цитологии АН СССР, Ленинград).

Гкбридомы кыаь-норка иогут быть использованы как источник особо чистых и стандартных 1е норки для получения соответствует^ антисызороток, необходимых для имлуногенетической и селекционной работы с американской норкой, основным бидон пушных зверей в промышленном звероводстве СССР. Клетки гибридом ыыпь-норка - биологическая модель для изучения механизмов экспрессии генов норки, установления их структуры и органи-

зацпи, локализации последоватольностеЯ и басгорэв, у^астзуп-цях з рогудяхря траискртцзя. Ош интересна для срагютодыю-

го анализа влялетя гснотлгсгсесЕой срздц на з^спрзсетэ паз собственны:: генов Ig г::брздом, "ai; я тр^кфзцпрова^гих в i:r.r генов.

Получогггго з KocTor7.ta яссяздозшкя дакк::з об особенностях работы с ккнзкдоесс: гпбрлдо::::™, о иезаиязггаг согрззз-Ш1.1 экзогеикоП J7IK в гоиопз кясгог-ргг^гпсктоз п стабплгаа-vçsx зкспрсссп^ чзсародгж гс-нзв, в тастпосгя :2.-:ут:оглобул~-иоке:, яалпэтея cjTr.ocTDi.nizcJ вгтадс:: в расЕЯтпэ г::бр:*дс:г:о2 тззнолог;:::. С:г: vgzzzz г:э только дал получал ВЕСокопродуа-тквгаг; клопов гпбрлдс::, прегдо всего гпбрлдс:!

ШГЗЬ-ЧСЯОЗОК, КО ÎÎ ДЛЛ СОЗГ.ИЯЗ ДруГСГ ТППОЗ гр0КСф31рр02£Я-г^х эузарлоктаекп: клеток.

¿дообашя работа. 1.л?ор"алц дзееертахра бют прздетазяо-на П Всесоюзно:: екгпозкумэ по к^укобпотегкологпя (Tas-лпвд, 1537), на говфврзкрк "Пргкгаажв досткзвппй 6soson:o-логся в народной хозяйство" (Уфа, 1537), яа У ЕсосогэйоП исл-ушззрскгзтсгоЯ колфзрг'гцпп "Елологпя iisoîsh" (Тбилиси,1537), га Вассогзкой Еог:$зрспцп:з "Новкз направления в блотэгпологзз" (Пугано, IS33), ка вок$эрзгагз( колоди: yneszac I3ÇaT СО ¿H СССР (Новосибирск, I5S3), па Ш сколе-сег-лгаро по генетике п солекцг::: алвокез (I-.'i'c::, 1939).

Рублем"?*! ♦ По цатгряалси дяссоргацяп опубжгсозано 0 ка-y-ïiz™ рабо? и получено одно авторское свпдзтольстбо.

Дяссзртацпя сссто::? пз евсдй-трох глаз, разделзкгпс: ка параграфа, заклзчеют,, зггзо-доб п сппс-а e?ît::pycîoa яатсратурп (215 шэв&клП, кз которых 169 п:остра:ггг:). 06^:4 свътл работ?! 132 страз стцы, вклпчал 5 таблиц п 21 рисунок.

l^tephm и иетоды

Культур"! клеток. В качестве клеток-реципиентов пря слиянии использовали клетки иызиной киеломной линии КЗО, полученной из лаборатории культур клеток Института вирусологии кн. Д.И.Ивановского А!Ш СССР (г.Москва). Линяя NSO дефектна по г»- ( ну гушяифосфорнбозилтрансфврразы, НАТ-чувствительна, 8-аза-

ryaiDiiî устойчива, не продуцирует Ig шдж.

В-лимфоцяты американской норки (Muatela vison) получали из селезенки, извлеченной стерильно на 4 день после антигенной стимуляции. Норка была многократно технизирована алло-генныи норочьки IgG в полном адьюванте Фрейнда по принятой схеме (Беляев и др., 1984).

Гибридизация клеток. Слияние 10® спленоцитов норки с 10^ клеток NSO 1.!ыз1 в логарифмической фазе роста проводили с по-иоцью 50$ раствора полиэтиленгликоля (Мол.вес 1500, "Serva") по общепринятой методике (Kohler, Misteln, 1975). Клетки культивировали в среде RBîl 1640 с 10-15$ эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 liü глуталика, I ¡ál пирувата, 20 uiî HEPES, 50 мкг/ыл гентамицина, НАТ-добавкани при +37°С в атмосфере 6% С0£.

Клонирование клеток. Гибридомы клонировали методом предельных разведений. В качестве фидера использовали спленоци-ты и макрофаги безтимусных ьослей баьв/с nu/nu (Галахарь и др., 1923).

Тестирование норки. Ig норки в супернатантах гибридом-ных клеток определяли непрямым имыуноферчентныа анализом (ИФА) на нитроцеллюлозе по методу (Eing et al., 1985). В качестве первых антител использовали кроличьи анти-lgG корки, Еторых - козьи анти-Ig кролика, меченые перокендазой хрена. Количественную оценку lg норки в пробах производили по разведениям препаратов IgG или L-цепеП lg норки известной концентрации. Чувствительность метода составляла 10-20 нг/мл. Для более точного измерения количества lg норки использовали ИМ на микроплатах по схеме "сэндвич" (Galakhar et ai., 1988). Чувствительность этого метода - 3-5 нг/мл. Продукты секреции гибридом характеризовали в ИФА с кроличьими антителами к Н- или L-цепям lg норки.

Определение ig-секретирукицих клеток. Клетки гибридомы ышь-норка или миелош мьепи NSO (контроль) в ростовой среде вносили в чалку Петри с нитроцеллшозным фильтром на дне (0 50 ма, размер пор 0,2 мкм, "Schleicher & Schuell "). Через 3 дня фильтры отмывали от клеток в растворе ОДЫ NaHCOj. ' lg, секрет-ированный клетками и адсорбировавшийся в порах фильтров, выявляли в непрямом ИМ. После окрашвания фильтры иссле-

довали под микроскопом и фотографировали.

Иммуноблотинг. SDS-электрофорез в 15% полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Пробы кипятили 2 мин. на водяной бане в буфере с 10% SDS и 10% 2-мер-каптоэтанола. Электроперенос белков на нитроцеллюлозней фильтр осуществляли по методу (Gershoni, Pelade, 1983), за*-тем проявляли в иммуноферыентном анализе.

Препараты метафазных хромосом клеток NSO и гибридом готовили стандартным способом (Макгрегор, Варли, 1986), опрашивали в красителе Гимза. Хромосомы типировали по методу (Levan et al., 1964). Повреждение хромосом регистрировали как описано (Бочков и др., 1972).

Дифференциальное окрашивание хромосом на G-диски проводили по методу Сибрайт (Seabright, 1971).

Гибридизацию in 3itu метафазных хромосом клеток гибридом с %-меченой суммарной ДНК норки выполняли как описано (Нар-pold et ai., 1984). ДНК норки метили по методу "рассеянной" затравки (ноазоп, Flak, 1987). Удельная активность препаратов была 2-4-Ю7 имп./(мин*мкг). Препараты покрывали водным раствором эмульсии типа М, экспонировали 2-5 дней при +4°С. Радиоавтографы проявляли стандартным способом (Макгрегор, Варли, 1986), окрашивали в красителе Гимза. Дня контроля использовали препараты хромосом клеток ми ел омы мыли uso я препараты норочъих хромосом линия uv . Работа выполнена совместно с Л.Д.Ыатяхиной (ИЦиГ).

Блот-гибрядизаыию ДНК клеток гибридом, культур фиброблас-тов американской норки (линия MV) и мыли (линяя А9), обработанных рестриктазой EcoBI , осуществляли по методу (southern, 1975) в модификации (Khlebod»rora et al., 1990). В качестве зонда использовали фрагмент к-ДКК гена L-цепи Ig норхи, содержавшем только С-область гена (Хяебодарова я др., 1990). Этот фрагмент размером 400 п.н. выделяли из гибридной плазми-ды plGL -21 и метили ^2р по методу "рассеянной" затравки (Hodson, Fisk, 1967). Гибридная пжазмида plGL -21 любезно предоставлена А.М.Наяквинш (ИЦиГ). Удельная активность препарата была 1«10® имп./(мин>мкг). Работа проведена совместно | с Т.М.Хлебодаровой (ИЦиГ).

Статистическую обработку результатов провели по критерию

Стьсдента (Рокицкий, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЕДЕНИЕ I. Получение межвидовых гибридом мышь-норка

На 8-ой день после слияния рост гибридомных клеток мышь-норка наблэдали в 72 лунках из 189 засеянных. Число колоний достигало иногда 5-6 на лунку, но в подавляющем большинстве лунки содержали 1-2 колонии. Частота слияния при этом составила 1,5хЮ~®. Подобный низкий выход гибридомных клонов после гибридизации ыогно считать характерным для межвидовых гибридом, полученных на основе клеток сивотных, генетически значительно удаленных друг от друга (Jahn et ai., 1989). По дан-hü5 первых скринингов 20 лунок из 72 тестированных содержали в культуральной среде ig норки, в основном, в пределах 0,1-0,3 ыкг/мл/IO кл/24 ч. При последующих анализах в б случаях наблюдали утрату lg-секреторной активности клеток.

Первичные гибридоыы клонировали на 35-й день после гибридизации. При получении линии 10 (таблица I) обнаружили низкую Таблица I. Результаты клонирования клеток линии 10 ■ гибридомы шаь-норпа

Клонирова- Частота Количество лунок Коли- ■ Эффектив-

ния рассева засеянных с ростом клонов с секрецией норки35 чество гибри -домных клонов ность клонообразования, %

Второе I кл./лун. 560 2 I ~7Г 2 0,4

Третье I кл./лун. 176 21 5 30 17,1

Четвертое 0,5 кл/лун 79 7 5 8 20,3

Б 1

В числителе - количество лунок с клетками, секретировавшими норки, в знаменателе - общее число тестированных лунок . с ростом клонов.

эффективность клонообразования, особенно на втором этапе клонирования, когда впервые использовали кесткие условия рассева клеток (I кл./лун.). От второго к четвертому она увеличилась с 0,4$ до 20,3%. Концентрация Те норки в пробах варьировала в пределах 1-4 мкг/мл/Ю кл./24ч.По данным ИФА, все клоны ли-

б

нки 10, полученные в третьем и четвертой клоизрованяях, сегрегировали ъ-цепя норки. Аналогична образом бнди получены линии 2, 3, 7, 12, 26 и 40 гибридомы шпь-норпа. Их клока-ровали 5-6 раз в течете 8-9 месяцев после слияния. Эффективность клонообразовакпя у этих линяй бша аналогична таковой у клеток линии 10 и на последних этапах клонирований из превышала 30-40^. Все неклоняровшяше первичные гкбрядогш 1азь--норка к концу второго месяца после слияния утратили способность синтезировать

2. Стабильность гибридом иызь-норка

В процессе пассагей в некоторых клонах линии 10 гкбрлдо-мы шгпь-норка после третьего клонирования каблсдали морфологическую гетерогенность клеток и сниаеняе удельной концентрации ь-цепей Ig норки с 1-2 мкг/мл до 0,3 мкг/ыл/10^ кл./24 ч (р<0,05). На нитроцеллплознои (|ильтре, использованной в качестве подлодки для 5»10^ клеток одного из этих клоков, выя-вилл 188 пятен. Даго если предположить, что одно пятно появилось как результат продукции 1е не одной, а нескольких клеток, ясно, что не все взятые в анализ клетка образовали пятна. По всей вероятности, большинство клеток в популяция клона I не синтезировали норки. Появление несекретирув^их клонов линии 10 после четвертого этапа клонирования подтвердило предположение о гетерогенности исходных популяций гкбря-домных клеток, полученных после третьего клонирования. Таким образом, наш результаты показали, что трех этапов клонирования, обычно используемых в гибридомной технологии, недостаточно для выделения линий гибридомы иьшь-норка, стабильно сек-ретирупщих норочий 1в .. Увеличение количества неактивных в функциональном отношении клеток в популяции меавидовых гибридом является неприятным прогностическим признаком и указывает на необходимость срочного реклонирования с последукцим контролем за динамикой секреции Iв выделенными клонами.

Кариологический анализ клеток клона I линии 10 гибридомы I мышь-норка и родительской линии мыши N30 провели параллельно с исследованиями на нитроцеллшозных фильтрах. Число хромосом в гибридомных клетках в среднем в 2 раза превышало характер-

нов для клеток линии ИБО (таблица 2). В кариотипе клеток наблюдали не только акроцентрические хромосомы, но и 1-2 субтелоцентрические. Гибридомные клетки, помимо хромосом, характерных для линии ИБО, содержали от I до 5 мета- и суб-иетацентрических хромосом. Известно, что в кариотипе американской норки (2 п =30) находится единственная пара акро-центрических хромосом, остальные тринадцать пар аутосом представлены мата- и субметацентрическими хромосомами. Однако выявленные нами в гибридомных клетках неакроцентрические хромосомы было трудно со всей достоверностью признать но-рочьими, поскольку после гибридизации кариотип мытных мие-ломных клеток может значительно видоизменяться с появлением как мета-, так и субметацентрических хромосом мышиного происхождения (Волгарева, 1985; 1986; Сорокина и др., 1986). При просмотре в-окрашенных хромосом гибридомных клеток (п =14) наблюдали, в основном, одиночные фрагменты хромосом, которые могли быть отнесены к норочьим, поскольку имели светлоокрашенные центромерные районы, в отличие от мышиных с в-позитивными центромерными блоками (Графодатский, Рад-жабли, 1989). Целых неперестроенных хромосом норки в клетках этой линии почти не встречали. В двух клетках наблюдали измененную 4 хромосому норки, на которой локализован ген Х-ь-цепи1й норки (Хлебодарова и др., 1990). Некоторые мета- и субметацентрические хромосомы в клетках гибридомы были мышиными, поскольку их центромерные районы интенсивно с-окрашивались. Метод б-окрашивания не позволил окончательно ни идентифицировать хромосомный материал норки, ни сделать выводы о его количестве и локализации в гибридомных клетках. Тем не менее, на основании проведенного изучения препаратов в-сегментированных хромосом можно предположить, что популяционная гетерогенность клеток исследованного клона I линии 10 гибридомы мышь-норка по функциональному признаку (секреция является, наиболее вероятно, результатом продолжающегося процесса утраты хромосом норки из кариотипа гибридомных клеток, в том числе и хромосом с генами 10.

Таблица 2. Кариологические характеристики клеток различных линий гибридомы мышь-норка и шеломы мыии ИБО

Линии Число проанализированных клеток Число хромосом в клетках Доля клеток с модальным числом хромосом, % Доля клеток со структурными аберрациями хромосом,

пределы варьирования модальное

нэо 100 36-113 58-60 58,0 1,0

10 100 60-170 95-105 55,0 7,0

(клон I)

2 90 66-170 100-110 55,6 3,3

3 100 45-92 60-64 60,0 2,0

7 112 62-150 100-106 53,6 -

12 100 63-186 95-105 56,0 -

26 115 30-203 - - 1,7

26х 100 76-137 103-109 56,0 2,0

40 НО 30-214 - - 2,7

40й 100 55-143 94-108 58,0 1,0

Клетки линий 2, 3, 7, 12, 26 и 40 анализировали на 20-25 и х 42-45 пассажах после размораживания.

3. Сравнительная характеристика линий гибридомы мышь-норка

Исследования клеток шести линий гибридомы мышь-норка после года хранения в жидком азоте показали, что многократные клонирования клеток линий 2, 3 и 7 не гарантировали получения стабильных продуцентов 1й норки. В отличие от них клетки линий 12, 26 и 40, столь же многократно клонированные, продуцировали но-рочий на одном и том же уровне в течение 3-6 месяцев культивирования после размораживания без дополнительных ргклониро-ваниЯ. Наши данные подтверждают мнение английских исследователей (Оа1Гге et а1., 1980) о возможности получить стабильно сек-ретирующие 1й варианты во всех случаях при работе с межвидовыми гибридомами. Причем такие характеристики, как количество генераций и кратность клонирований, необходимые для выделения ста-

бпльных гибридомных линяй, будут индивидуальны в кавдом отдельном случае. Уровень ig-сскреторной активности клеток варьировал от 1,0 икг/мл для линии 40 до 0,04 ыкг/мл/IO® кл./24 ч для лшшп 12 (таблица 3) п был тиш!чен для мешзидовых гибридов (ftaybould, Takashi, 1983; Glasky, Beading, 1939). По результатам КМ и иммуноблотинга клетки линии 12 синтезировали igG, линий 26 и 40 - L-цепи Ig корки.

Кариологнческлй анализ метафазнкх пластинок клеток линий 2, 3, 7, 12, 26 п 40 гпбридоиы мышь-норка на 20-25 пассажах после размораживания показал, что модальные числа хромосом клеток лккий 2, 7 и 12 примерно в 2 раза превышали характерное для клеток родительской линии nso (таблица 2). Модальный класс линии 3 был близок к таковому линии N50. В линиях 26 и 40 только пра повторном анализе на 42-45 пассанах были выявлены модальные классы, близкие к наблюдаемый ранее для линий 2, 7,10 и 12. В клетках всех гибридомных линий помимо акро-центрпческих хромосом выявляли 2-3 метацентрическис крупного и среднего размера, иногда субметацентрические хромосомы. Субтелоцентрическнх хромосом, маркеров клеток линии kso, в гкбрядомкых клетках не обнаружили. Наш данные согласуется с результатам наблюдений некоторых исследователей тетра-гексаплоидных наборов мышиных хромосом в клетках меввидовых гибридом других типов (Thonpson et al., 1986; Ben et el., 1986). Возможно, гкбридомы, случайно подвергшиеся полиплоиди-зации, в дальнейшем имеют некоторые селективные преимущества для роста в культуре клеток. В ряде работ (Бахтин, 1980; Кузьмина, 1983; Chen, 1975; Вгеиегшагш, 1979) высказано предположение, что подобные процессы достаточно распространены в популяциях клеток с генетическими дефектами, что характерно для межвидовых гибридов соматических клеток, и являются средством достижения эволюционной стабильности клеточных линий. С помощью кариологического анализа нам так и не удалось определить достоверно норочьи хромосомы в клетках линий 12, 26 и 40, хотя их стабильная ig-секреторная активность указывала на присутствие генетического материала донора в гибридомах. Таким образом, изученные нами линии гибридомы мышь-норка по исследованным характеристикам близки к межвидовым гибридомам других известных типов, прежде всего к гибридомам мышь-кро-

ЛИК (Yarmush et al., 1980, 1981; Kuo et al., 1985).

4. Норочяй хромосомный материал в клетках линий гибридомы мышь-норка

Хромосомный материал норки в клетках гибридомных линий 2, 3, 7, 12, 26 и 40, фиксированных на 20-25 и 42-45 (длй линяй 26 и 40) пассажах, идентифицировали с помощью гибридизации in situ. В использованных условиях %-меченая суммарная ДОК норки нэ гибрлдизовалась с хромосомами из клеток родительской линии мьпш NSO тогда как хромосомы из фибробластов сме-риканской норки (линия HV) интенсивно метились. Результаты гибридизации представлены в таблица 3. В клетках линий гибридомы ныаь-норка наблюдали, как отдельные хромосомы коркп, имевшие центромеры, так и фрагменты норочьей ДНК, встроенное в хромосомы мыли.

Предполагают, что сохранение хромосомного материала га-вотного-донора в кариотипе клеток межвидовых гибридом является предпосылкой для стабильной продукции lg(Teng et al., 1985; Brodeur et al., I9S7). Выявлена прямая корреляция мта-ду утратой синтеза Ig и элиминацией немшиных хромосом пз клз-ток гибридом (Koropatnick et ai., 1988). Аналогично этим дап-нь'м 1ш обнаружили небольшое число клеток с ДНК порки в не-секретирует^х Ig линиях 2 и 3 гибридомы мышь-норка, з то время как в линиях-продуцентах 12, 26 и 40 такие клетки составили более половины всех исследованных (рлс.1), Однако изучение метафаз!шх пластинок линии 7, такяе утратиЕией синтез Ig норки, показало, что по своим характеристикам (числу клеток с ДНК норки и количеству хромосомного материала норки в клетках) она близка к линии 40, наиболее активному продуценту норочьего Ig. Следовательно, утрата синтеза Ig могсет не соп-рово^даться значительной элиминацией хромосомного матер:ала донора из кариотипа гибридомных клеток по сравнению с линиями, секретирующями Ig. Установить, какие хромосомы норки сохранились в гибридомных клетках, не удалось. Линии-продуценты отличались мепду собой по содержанию ДНК норки в клетках.Если в лиши 40 почти половина клеток имела от 3 до 9 норочьих хромосом, то в кариотипе клеток линий 12 и 25 больше 2 хромо-

Таблица 3. Хромосомный материал норки в клетках линий межвидовой гибридомы мышь-норка, выявленный гибридизацией 1а е11;и с %-меченой суммарной ДНК норки

N>

Линии Продукт секреции § а> и h Число проанализированных меток Доля клеток с ДНК ноцки, Процент клеток с определенным числш^мест включения метюг** от общего числа клеток с ДНК норки Доля клеток с встроенной % Процент клеток с определенным числом хромосом мыши с интегрированной ДНК норки от общего числа клеток с ДНК норки

I 2 3 и больше

I 2 3 и больше

2 93 29,03 81,5 11,1 7,4 14,8 14,8

3 - _ 102 в,8 100,0 - - 88,9 88,9 _ -

7 - 162 75,3 33,6 27,1 39,3 36,1 27,9 7,4 0,8

12 IgG 0,04 115 67,8 70,5 26,9 2,6 16,7 15,4 1,3 -

25 L-цепи 0,1 170 51,1 62,0 28,3 9,7 14,1 12,0 2,1 -

26* L-цепи 0,1 147 84,4 62,1 29,03 8,87 46,8 42,7 3,2 0,8

40 L-цепи 1.0 136 77,2 31,4 20,0 48,6 14,2 9,5 3,8 0,9

40* L-цепи 1.0 120 97,5 14,5 17,1 68,4 42,7 35,8 5,9 0,9

Клетки всех . ж - в мкг/мл/Ii

анализировали на 20-25 и к42-45 пассажах после размораживания,

JB0t- местами включения метки считали как отдельные хромосомы норки, так и фрагменты ДНК норки, интегрированные в хромосомы мыши,

*5ВН|- от общего числа клеток с ДНК норки.

100 90

а

26 26" 40 40" 12

Рис. I. Доля клеток, содерг.ашпих ДНК норки, в линиях межвидовой гибридомы мкиь-норка (р 0,001, заптриховано р< 0,05). По вертикали - число клеток, %; по горизонта-ля - обозначения линий гибридомы мышь-корка, анализированных на 20-25 и к42-45 пасс&^ах культивкрова-нил после размораживания.

сом норки наблюдали редко. В линиях 2, 3, 12 и 26 клетки содержали, в основном, одиночные или хромосомы норки или фрагменты норочьей ДНК, транслоцированные в хромосомы мети. По результатам проведенного анализа молено заклю'глть, что характерных особенностей распределения норочьей ДНК в клетках гибридом мшь-корка, секретировавпмх Ig норки или утратигоих его синтез, нам наблюдать не удалось. Количество норочьего хромосомного материала в клетках также варьировало не только у разных линий гибридомы мышь-норка, но и в пределах одной клеточной линии. Поскольку в ряде работ по медвидовым гнбридомам (Levy et al., 1978; Tucker et al., 1984; Graveltanp et al., 1987) показана пирокая изменчивость члела хромосом и их идентичности в клетках, могло предположить, что межклеточная вариабельность хромосом донора - явление, распространенное среди гибридом, свидетельствующее о нестабильности их хромосомного аппарата.

Как уже отмечалось, клетки всех гибридомных линий, помимо хромосом норки, содержали фрагменты ДНК норки, встроенные в

хромосомы кыши (рис.2). Места локализации интегрированной норочьей ДНК различались даже в клетках одной гибридомной линии. Фрагменты ДНК норгл располагались и в прицентромер-нкх областях мышиных акроцентрических хромосом, к в интер-калярной их части, но в большинстве случаев были сосредоточены в районах теломерных концов акроцентрических хромосом, занимая разные по площади участки. В длительно культивируемых линиях 26 и 40 гибридокы мъшь-норка при повторном анализе на 42-45 пассасах in vitro наблюдали значительный рост числа клеток с транслокацияки ДНК норки в хромосомы шли (рис.2). В линии 3 в немногочисленных клетках с ДНК

I

т

m

2Se

Рис.2. Доля меток с фрагментами ДНК норки, интегркровак-Н!дж в хромосомы ккпк, от общего числа клеток с ДНК норки е линиях межвидовой гибридомы ккпь-норка (р^0,05). Обозначения, как на рис.1.

7

<0 43

норки ока сохранилась преимущественно в составе кьлиньк хромосом (таблица 3). Наш данные согласуются с результатами работ (Dreher et al,, 1983; Eon et fil., 1985; Hiratc, Su-gcwara, 1987), в которых идентифицировали встроенные последовательности экзогенной ДНК в клетках межвидовых гибридом, не обнаружив предварительно хромосом донора. Вероятно, этот путь сохранения чуперодной ДНК в геноме кле т о к-рсципи-ентов предпочтительнее.

При анализе радиоавтографов хромосом клеток линий гибри-дош мышь-норка выяснилось, что многие мета- и субиетацент-рические хромосомы, подобные таковым в кариотипе американской норки, являлись мышиными. В клетках лиши nso таких хро-

иосом ке наблюдали. В то хе время "отличающиеся по длине идентифицированные хромосомы норки часто принадлежали к ак-роцентряческсму типу. Гены Н- и ъ-цепей Ig локализованы на разных хромосомах у всех изученных бидоз гзтвотных (Ellison, Hood, 1933). Однако большинство клеток линии 12, продуцента igG норки, содержали не более одной норочьей хромоссиц (таблица 3). Вероятно, в клетках зтой линии могли суцэст-вовать минорные сайты ипсерций ДНК норки в мшнных хромосомах, не flaDSie определяемого сигнала в гибридизация in situ. Совокупность полученных результатов свидетельствует о cy"s-ственных перестройках как норочьих, так и местных хрсиосом в гибридсмах мнзь-норха. Трудности в идентификации измененных хромосом донора и реципиента такле были отмечены в ряде других работ по межвидовым гибридомгм (Hirata et ai., 1937; gruncu et ai., 1988). Таким образом, mozho предположить, что в клетках иенвидовых гибридом имеет место но только элиминация большинства хромосом донора, но и дестабилизация Есего кариотипа полученных клеток, проявляющаяся з повышенной изменчивости хромосом.

5. Определение гена L-цепи ig норки в клетках линий гибридомы мцзь-норка

Результаты гибридизации ДНК из клеток лилий 7, 26 и 40 гибридемн нкаь-норка с константной частью гена д-Ь -цеп:? ig норки показали, что Я_г,-Н присутствовал з клетках линяй .25 и 40, продуцентах L -цепей Ig норки, и отсутствовал п -тетках линии 7, утратившей синтез Ig норки. Набор рестрикциои-ных фрагментов, характерный для гибридом (16, 5,5, 4,8 и 1,8 къ), отличался от спектра Есо31 фрагментов для фибробла-стов норки линии iiv (19, 16, 5,5 и 4,8 къ). Наблюдаемые изменения, вероятно, связаны с тканеспецнфнчзскн::л отличиями строения гена ь-цепи ig в фибробластах и клетках меззидовых гибридом, где этот ген функционально активен. Согласно результатам наших исследований и данннм литературы (Galfre et al., 1980; Gardner et nl., IS85; Uchiyana et al., I9S7), именно утрата иммунсглобулиновых генов, а не регуляторные процессы (liaison et al., IS82), является основной причиной нестабильной ig -секреторной активности клеток меявидовых

гибридом.

вывода

1. Впервые получены линии межвидовой гибридомы мышь-норка, продуценты L-цепей Ig американской норки. Изучение функциональных (секреция Ig), культуральных, цитогенетических характеристик выявило их сходство с межвидовыми гибридомами других известных типов.

2. В основе нестабильной lg-секреторной активности клеток некоторых многократноклонированных линий гибридомы мышь-норка лежит постоянно возникающая популяционная гетерогенность гибридомных клеток по этому признаку, основанная, вероятно, на продолжающейся утрате хромосом норки, в том числе и с генами ig .

3. С помощью гибридизации in situ с %-меченой суммарной ДМ норки наблюдали меж- и внутрилинейную вариабельность по числу меток с ДНК норки и количеству норочьего хромосомного материала в клетках гибридом мышь-норка. Характерных особенностей его распределения в кариотипе клеток гибридом,синтез ировавтах ig норки или утративших его секрецию, не обнаружили .

4. Выявлено значительное преобразование кариотипа клеток гибридом мьшь-норка, на что указывали множественные участки интеграции ДНК норки в хромосомы мыши и появление хромосом, не характерных, для норочьих и мышиных родительских клеток.

5. Наблюдали увеличение числа клеток с фрагментами хромосом норки, встроенными в хромосомы мыши, в линиях гибридомы мышь-норка, длительное время размножавшихся in vitro. Предполагается, что этот путь сохранения чужеродной ДНК в кариотипе клеток-реципиентов, вероятно, предпочтителен.

6.С помощью блот-гибридизации ДНК клеток гибридомных линий с константной частью гена -цепи ig норки установлено, что синтез норочьих l -цепей ig в клетках линии 7 отсутствовал из-за утраты ими Я.-гена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Уфимцева Е.Г., Галахарь H.JI. Межвидовые гибридомы, продуценты моноклонального иммуноглобулина //Научно-прак-

тическая конференция "Применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве". Тезисы докладов. Уфа, 1987. - С.30-31.

2. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л. Наркологический анализ клеток клона межвидовой гибридомы мышь-норка //Труды У Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки". Тбилиси, 1987. - С.844-846.

3. Галахарь Н.Л., Уфимцева Е.Г., Дьяченко С.Н., Матяхн-на Л.Д. Экспрессия легких цепей иммуноглобулина норки в межвидовых гибридомах мышь-норка //Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Путцико,

1988. - С.40.

4. Галахарь Н.Л., Дьяченко С.Н., Уфго.щева Е.Г., Таранин A.B., Баранов O.K. Штамм культивируемых гибридных клеток животных низ Busculus х Низtela т!зоп - продуцент монокло-нальных иммуноглобулинов класса igG норки. Авторское свидетельство № I52II772. Откр.изобр., IS89, Бал. 3 42.

5. Уфимцева Е.Г., Матяхина Л.Д., Дьяченко G.H., Галахарь Н.Л. Использование межвидовых гибридом мышь-норка для изучения экспрессии иммуноглобулиновых.генов норки /В сб."Цито-генетика и биотехнология". Ленинград, 1989. - C.I35-I4I.

6. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л. Межвидовые гибридомы. Деп. в ВИНИТИ 28.07.89, № 4935-В89. - 29 с.

7. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л. Определение иммуногло-булин-секретируюцих клеток гибридом в непрямом иммуноферден-тном анализе на нитроцеллюлозе. Деп. в ВИНИТИ 17.II.89,

» 6847-В89. - 7 с.

8. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л., Матяхина Л.Д., Дьяченко С.Н., Хлебодарова Т.Н. Межвидовая гибридсма и исследование экспрессии гена L -цепи иммуноглобулина норки //Ш школа-семинар генетиков и селекционеров. Тезисы докладов. Бийск,

1989. - Известия СО АН СССР. Серия - биологические науки. -1989. - № 2.-С.13.