Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика межвидовых гибридов мышь-норка, продуцентов иммуноглобулина американской норки или его цепей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика межвидовых гибридов мышь-норка, продуцентов иммуноглобулина американской норки или его цепей"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

УШМЦЕВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

УДК 575.222.7:576.382.-53.-316.7:591Л58Л

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОМ МЫШЬ-НОРКА, ПРОДУЦЕНТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА АМЕРИКАНСКОЙ НОРКИ ИЛИ ЕГО ЦЕПЕЙ

03.00Л5 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кавдидата биологических наук

На правах рукописи

Новосибирск - 1991

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР г. Новосибирск

Научные руководители - доктор биологических наук, профессор

[ О.К.Баранов, Институт цитологии и ге-

нетики СО АН СССР,

кавдидат медицинских наук, старший научный сотрудник Н.Л.Галахарь, Институт цитологии и генетики СО АН СССР

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший

научный сотрудник С.Н.Родин, Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

кавдидат биологических наук, доцент Л.В.Высоцкая, Новосибирский государственный университет

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова АН СССР

Защита диссертации состоится "26 " аЛЛСс-О/пд 199£? г. на

' заседании специализированного совета по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П. 01) в Институте цитологии и генетики СО АН СССР в конференц-зале Института по адресу: 630090 г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО АН СССР.

Автореферат разослан " 40 " ^Ш^^Хи^ 19а? г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук """" А.Д.Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тс;;;.'. Открытие и развитие гнбридомной техники как метода получешя мококяональкых антител стало одгsm из крупных достижений современной биологии, оказавшим значительное влияние на ресение целого комплекса наушггх и прикладных проблей биологии и медицины. Наиболее изучены в настоящее время гибридомы шь-шш, продуценты моноклоналышх антител ш-сяной природы. Потребность в моноклоналышх антителах я иммуноглобулинах другой видовой принадлеаюсти сткиулировала развитие исследований, направленных на создание межвидовых гибридом (james, Bell, 1987; Srikunaran st al., 1937; Gebauer, Lindl, 1989). Один кз способов ях конструирования - 'слияние ыиеломкых меток шим и иммунных В-липфоцятов етвотного другого вида. Ыезшидовые гибридомы и продукты их секреции необходимы при изучении видоспецкфяческих антигенных маркеров, классов и подклассов иммуноглобулинов ( ig ), для секвенировакия ДНК генома хивотных исследуеиого вида, ввделекия и-FHK при прове-денки генно-ннкенерных работ (Черепахин, Рохлин, 1937; Ураков И др., 1990; Galfre, Ullstein, 1982; Dreher et al., 1933; Peyev et ai., IS86). Исследования организации и механизмов экспрессии генов мультигенного семейства ig вивотных разных видов значительно углубят кали знания о функционировании генома эукариот. При работе с меявидовыми гибридомаш возникает целый ряд проблем, еще не наиедаях своего решения. Как правило, они обусловлены генетической отдаленностью партнеров по гибридизации. К ним модно отнести малую эффективность слияния, трудности клонирования, низкий уровень lg -секреторной активности клеток,'их нестабильность и связанную с ней утрату синтеза Ig (Huaan hybridomas..., 1985). Центральной проблемой, несомненно, остается получение стабильных линий межвидовых гибридом, длительное время секретируицих lg.

Цель и задачи исследования. С целью получить межвидовые гибридомы мышь-норка, продуценты lg американской норки / последовательно решались следующие задачи:

I. Проведение гибридизация миеломных клеток мыши с В-лим-фоцитами американской норки и получение гибридом мышь-норка,

севрзетруЕЕрп:' норочий 1з-

2. Вцделенае из первичных гибридом клонаяькшс линий, ха-раотеристаиа продукта и:: секреции, уровня синтеза нории и проведает© сараологпческого анализа клеток.

3. йссявдованяэ популяцян клеток клонов гибридоиы кыеь--шрза о нестабильной сенрецпей

4. Получение Е&честаешшх к кодкчестве!ших характеристик содарзашд зфоыосоаного катеряала пор:;:: в каркотипе клеток раЗЖЧНЫХ ГйбрйДОИЕК лнпий.

Научная новизна. Епервио удалось сконструировать габрлдо-щзь-иорза, синтезируете ь-цзш: американской норки. Подучена ет $унЕцдокальс:з п кариологпческие характеристики. Исследование нестабильных по продукция Ig клонов гибридомы

показало недостаточность трех этапов клокярозания, обычно нспользуе^иж в гибрздоаной технологии для выделения стабильных линяй ыеквядових гибридом.

Впервые проводоно изучение содержания хромосомного иате-ряала донора в паряотппе клеток иггвидовых гибридои с помощью гибрпдазахрш 1п зИт. Получены новые данные, демонстрируйте, ото помино элкншацян большинства неишяных хромосом происходи г значительное преобразование кариотнпа гибридоыных клеток, затрагивавшее хромосомы обоих партнеров по гибридизации.

Впервые пря продолжительной культивировании стабильных лнняЕ иедвздознх гкбрядоа а25наругиля значительное увеличение 45!ела клеток с экзогенной (донорской) ДНК, интегрфованнэй в хромосомы тш.

Практическая ценность. Дополнена отечественная коллекция клеточных культур - продуцентов 1% . Клетки двух линий гибри-домы инаь-иорна, секрекзрусзге IgG п ь-цепя американской норки, депонировали во Всесоюзной коллекции клеточннх культур (Институт цитологии АН СССР, Ленинград).

Гкбридсми мнзь-норка могут бить пспользоЕанн как источник особо чистых и стандартных 1$ норки для получения соответствующих антисывороток, необходшых для кшуногенетической я селекционной работы с американской норкой, основным видом пушных зверей в промышленном звероводстве СССР. Клетки гибридом мшь-норка - биологическая модель для изучения иэханизмов экспрессии генов Ig норки, установления их структуры и органи-

зацга, локализация последовательностей и ф-лтороз, участвуа-Е&х в рогуляцйя трэкскрзпцпп. Otst ¡шторески для срагпэтаЕьно-го анализа аташяя геиотппяческой срзды из эаспрзссяэ сак собственных гонов ig гибридов, так я траясфзцароваашх s них генов.

Пояучогашо в кастояцез яссладовакза диске об особенностях работы с кзгхщозед! гпбрядсззаяз, о иехаияаыаг сограяа-няя экзогенной ДНК в гсиоаа кясток-рв^шкяяоз я стабкляза^ цяи экспрессия чуазродгаах годов» а «асткосгк кэукоглобулк-новых, являзтся суг,оствSKîEa ввяадоц в развятпэ гибрздоакоЗ технология. Огп бшлш кэ только дая получения вцсоаопродув-тквкзх ялоиов кеззцдовнх гпбрвдоа, прежде всего гибрэдом ксть-пеяовок, но а дяа создавая других игаоэ тракс£:зцаров£Я-ibix эуэгарнотпчвсккх клеток.

¿дробапяа .работа. Еаторззаы дяссвртасрш. бшгя представлены на □ Всесоюзной симпозиуме по га^кунобпотазнологш (Таллинн, 1937), на кокфзрешЕга "Цргазнвкпв достжекпй бзогехко-логни в народном хозяйство™ (Уфа, 1987), ва У Всесовзной гсг.-уюверситотеяой по::$зре:п?тт: "Еяологая плотеп" (Тбшшся,1537), ка Всосоззвой кокфврзгари "йовиа наяравявкзя в баотехиогогзз" (Пущно, 1£Ш), ка кокфэрвйЕрн ыолодих учдеак Kt&îT GO Ш СССР (Новосибирск, IS8S), на Ш аколв-сетгккаро по генетаяе п селекцяп вявотных (Еяйск, 1989).

Дублапашв. По катвряалсм диссертация опублнвовево 8 научных работ и получено одно авторспоэ свидетельство.

Структура ш ofega ..-работа. Диссертация состоит пз згодетая, трзх глав, рэздолешшх на параграф, заклвчзкяя,, ввзо-дов п списка цртпрушоА литература (215 пазвакяй, нз которых 169 пнострзн-щх). Обс^й объсц работы 132 страницы, вклвчал 5 таблиц и 21 рясунон.

ЦАТЕРШ И МЕТОДЫ

Культуры клеток. В качестве клеток-рзп^пиентов при слиянии использовали клетки ыиаиной зделоыной линии irso, полученной из лаборатория культур клеток Института вирусологии км. Д.И.Ивановского АНН СССР (г.Москва). Линия HSO дефектна по г®- , ну гуанннфосфорибозилтрансферразы, НАТ-чувствительна, 8-аза-

гуагкн устойчива, не продуцирует Ig ь-ыей.

В-ли1!фоцнти американской норки (Mus te la vison) получали из селезенки, извлеченной стерильно на 4 день после антигенной стимуляция. Норка была многократно икыуназирована алло-генньЕД норочькы igG в полном адьюваите Фрейада по принятой схеме (Беляев и др., 1984).

В 7

Гибридизация клеток. Слияние 10 спленоцлтов норки с 10

клеток N30 мши в логарифмической фазе роста проводили с помочь» 50% раствора полиэтиленгликоля (Мол.вес 1500, "Serva") по общепринятой методике (Köhler, Mistela, 1975). Клетки культивировали з среда hbji 1640 с 10-15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глутаыина, I мЫ пирувата, 20 uM HEPES, 50 мкг/мл гентамицина, НАТ-добавками при +37°С в атиосфере 6% COg.

Клонирование клеток. Гибридомы клонировали методом предельных разведений. В качестве фндера использовали спленоци-ты и макрофаги безтямусных мшзй balb/c bu/hu (Галахарь и др., IS88).

Тестирование lg норки. Ig норки в супернатантах гибридоы-них клеток определяли непрямым иыыуноферментиьп.! анализом (ИФА) ка нитроцеллюлозе по методу (Ring et ai., 1985). В качестве первых антител использовали кроличьи анти-igO норки, вторых - козьи акти-lg кролика, ыеченне пероксидазой хрена. Количественную оценку Ig норяи в пробах производили по разведениям препаратов IgG или L-цепей lg норки известной концентрации. Чувствительность метода составляла 10-20 нг/мл. Для более точного измерения количества lg норки использовали ИФА на микроплатах по схеме "сэндвич" (Gaiakhar et el., 1988). Чувства-, тельность этого метода - 3-5 нг/мл. Продукты секреции гибридом характеризовали в ИФА с кроличьими антителами к Н- или Ь-цепям lg норки.

Определение 1д-сскретирувстх клеток. Клетки гибридош мышь-норка или мкелош мыши NSO (контроль) в ростовой среде вносили в чайку Петря с нитроцеллюлоз нш фильтром на дне (^50 ЫМ, размер пор 0,2 ШСМ, "Schleicher &. Schuell "), Через 3 дня фильтры откываля от клеток в растворе 0,1 И NaHCO^. ' ig, секретировакный клетками и адсорбировавшийся в порах фильтров, выявляли в непрямом ИФА. После окрашивания фильтры иссле-

довали под микроскопом и фотографировали.

Иммуноблотинг. SDS-электрофорез в I5Í полиалриламиднон геле проводили по методу Лэммля (Laemnli, 1970). Пробы кипятили 2 мин. на водяной бане в буфере с 10% SDS и I% 2-мер-каптоэтанола. Электроперенос белков на нитроцеллюлоз ней фильтр осуществляли по методу (Gershoni, Palade, 1983), затем проявляли в икмуноферментном анализе.

Препараты метафазных хромосом клеток ESO и гибридом готовили стандартным способом (Макгрегор, -Варли, 1986), окрашивали в красителе Гимза. Хромосомы типировали по методу (Levan et ai., 1964). Повреждение хромосом регистрировали как описано (Бочков и др., 1972).

Дифференциальное окрашивание хромосом на G-диски проводили по методу Сибрайт (Seatright, X97D-

Гибридизацию in situ метафазных хромосом клеток гибридом с %-меченой суммарной ДНК норки выполняли как описано (Еар-poid et al., 1984). ДНК норки метили по методу "рассеянной" затравки (Hodson, Flak, 1987). Удельная активность препаратов была 2-4-I07 имп./(мин«мкг). Препараты покрывали водным раствором эмульсии типа М, экспонировали 2-5 дней при +4°С. Радиоавтографы проявляли стандартным способом (Макгрегор, Варли, 1986), окрашивали в красителе Гимза. Для контроля использовали препараты хромосом клеток шеломы мыши uso я препараты норочьих хромосом линии mv - Работа выполнена совместно с Л.Д.Матяхиной (ИЦиГ).

Блот-гибридизаиию ДНК клеток гибридом, культур фиброблас-тов американской норки (линия MV) и мыши (линия А9), обработанных рестриктазой EeoBI , осуществляли по методу (Southern, 1975) в модификации (KhlebcxJarova et al., 1990). В качестве зонда использовали фрагмент к-ДИК гена ь-цепи Ig норки, содержавшем только С-область гена (Хлебодарова и др., 1990). Этот фрагмент размером 400 п.н. ввдехяли из гибридной плазми-ды plGL -21 и метили ^Р по методу "рассеянной" затравки (Hodson, Flak, 1967). Гибридна* пяазмцда plGL -21 любезно предоставлена А.Н.Наякшиньм (ИЦиГ). Удельная активность препарата была 1*10® имп./(мин.мкг). Работа проведена совместно | с Т.М.Хяебодаровой (ИЦиГ).

Статистическую обработку результатов провели по критерию

Стьидента (Рокицхий, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЕДЕНИЕ I. Получение ыезвидовых гибридом ыышь-норка

На 8-ой день после слияния рост гибридомных клеток мышь--норяа наблгдаля в 72 лунках из 188 засеянных. Число колоний достигало иногда 5-6 на лунку, но в подавляющего большнстве лунки содерзалн 1-2 колонии. Частота слияния при этом составила 1,5хЮ~®. Подобный низкий выход гибридомных клонов после гибридизации полно считать характерные "для межвидовых гибридов, полученных на основе клеток еивотных, генетически значительно удаленных друг от друга (Jahn et ai., 1989). По данная первых скрмнпнгов 20 лунок из 72 тестированных содержали в культуральной среде Ig норки, в основном, в пределах 0,1-0,3 шсг/ыл/10 .ил/24 ч. При последувщгх анализах в б случаях наблюдали утрату lg-секреторной активности клеток.

Первичные гибридош клонировали на 35-й день после гибри-дк'загçra. При получении линии 10 (таблица I) обнаружили низкую Таблица I. Результаты клонирования клеток линии 10 . гибридош мыиь-норна

Клонлрова-нпя Частота рассева Количество лунок Количество гибри -домных клонов Эффективность кло-нообразо-вания, %

засеянных с ростом клонов с секрецией ig и норли

Второе I кл./лун. 560 2 I 2 0,4

Третье I кл./лун. 176 21 5 *ТГ 30 17,1

Четвертое 0,5 кл/лун 79 7 5 8 20,3

В числителе - количество лунок с клеткаки, секретировавшими норки, в зналенателе - общее число тестированных лунок с ростом клонов.

эффективность клонообралования, особенно на втором этапе клонирования, когда впервые использовали жесткие условия рассева клеток (I кл./лун.). От второго к четвертому она увеличилась с 0,4% до 20,3%. Концентрация норки в пробах варьировала в пределах 1-4 мкг/ыл/10 кл./24ч,По данным ИФА, все клоны ли-

нии 10, полученные в третьем и четвертом клонированиях, сек-ретировали ь-цепя ig норки. Аналогичшш образом били получены линии 2, 3, 7, 12, 26 и 40 гибридоьщ шаь-норка. Из клокя-ровали 5-6 раз э течение 8-9 месяцев после слкяняя. Эффективность клонообрздоЕак:я у этих линяй была аналогична таковой у клеток линии 10 и на последних этапах клонирований не превышала 30-40?. Все неклокировашшэ первичные гкбрядони ккзь--норка к концу второго месяца после слияния утратили способность синтезировать Ig.

2. Стабильность гибридом шзь-норяа

В процессе пассагей в некоторых клонах линии 10 гкбрядо-мы мшь-норка после третьего клонирования наблвдаля морфологическую гетерогенность клеток и снижение удеагьной концентрации ь-цепей Ig норки с 1-2 мкг/мл до 0,3 нкг/ыл/Ю^ пл./24 ч (р <0,05). На нитроцеллюлоз ной фильтре, использованной в качестве подложки для 5*10^ клеток одного из этих юхонов, выя-вилл 183 пятен. Дате если предположить, что одно пятно появилось как результат продукции Ig не одной, а нескольких клеток, ясно, что не все взятые в аналкз клетки образовали пятна. По всей вероятности, большинство клеток в популхцяп клона I не синтезировали ig норки. Появление несекретирущах ig клонов линии 10 после четвертого этапа клонярованая подтвердило предположение о гетерогенности исходных популяций гнбри-домных клеток, полученных после третьего клонирования. Таким образом, наш результаты показали, что трех этапов клонирования, обычно используемых в гкбрядоаной технология, недостаточно для наделения линий габридомы мызь-норка, стабильно сек-ретирующих норочий Ig . Увеличение количества неактивных в функциональном отношении клеток в популяции цезвидовшс гибриден является неприятным прогностическим признаком и указывает на необходимость срочного реклонирования с последующим контролем за динамикой секреции ig выделенными клонами.

Наркологический анализ клеток клона I линии 10 гибрядомы I мышь-норка и родительской линии мыши nso провели параллельно с исследованиями на нитроцеллюлозных фильтрах. Число хромосом в гибридомных клетках в среднем в 2 раза превышало характер-

нов для клеток линии изо (таблица 2). В кариотипе клеток наблвдали не только акроцентрические хромосомы, но и 1-2 субтелоцентрические. Гибридомные клетки, помимо хромосом, характерных для линии кэо, содержали от I до 5 мета- и суб-иетацентричвских хромосом. Известно, что в кариотипе американской норки (2 п =30) находится единственная пара акро-центрнческих хромосом, остальные тринадцать пар аутосом представлены мета- и субметацентрическими хромосомами. Однако выявленные нами в гибридомных клетках неаяроцентрические хромосомы было трудно со всей достоверностью признать но-рочьими, поскольку после гибридизации кариотип мышиных мие-ломных клеток может значительно видоизменяться с появлением как мета-, так и субыетацентрических хромосом мышиного происхождения (Волгарева, 1985; 1986; Сорокина и др., 1986). При просмотре б-окрашенных хромосом гибридомных клеток (п=14) наблвдали, в основном, одиночные фрагменты хромосом, которые могли быть отнесены к норочьим, поскольку имели светлоокрашенные центромерные районы, в отличие от мышиных с б-позитивными центромерными блоками (Графодатский, Рад-жаблк, 1989). Целых неперестроенных хромосом норки в клетках этой линии почти не встречали. В двух клетках наблвдали измененную 4 хромосому норки, на которой локализован ген Х-1|-цепн10 норки (Хлебодарова и др., 1990). Некоторые мета- и субметацентрические хромосомы в клетках гибридомы были мышиными, поскольку их центромерные районы интенсивно в-окрашивались. Метод б-окрашивания не позволил окончательно ни идентифицировать хромосомный материал норки, ни сделать выводы о его количестве и локализации в гибридомных клетках. Тем не менее, на основании проведенного изучения препаратов в-сегментированных хромосом можно предположить, что популяционная гетерогенность клеток исследованного клона I линии 10 гибридомы мышь-норка по функциональному признаку (секреция 1®) является, наиболее вероятно, результатом I продолжающегося процесса утраты хромосом норки из кариотипа I гибридомных клеток, в том числе и хромосом с генами Ig.

Таблица 2. Кариологичесние характеристики клеток различных линий гибридоны мышь-норка и ыиеломы мыши №0

Линии Число проанализированных клеток Число хромосом в клетках Доля клеток с модальным числом хромосом, % Доля клеток со структурными аберрациями хромосом,

■ пределы варьирования модальное

jjso 100 36-113 58-60 58,0 1,0

10 100 60-170 95-105 55,0 7,0

(клон I)

2 90 66-170 100-110 55,6 3,3

3 100 45-92 60-64 60,0 2,0

7 112 62-150 100-106 53,6 -

12 100 63-186 95-105 56,0 -

26 115 30-203 - - — 1,7

26» 100 76-137 103-109 56,0 2,0

40 по 30-214 - - 2,7

40* 100 55-143 94-108 58,0 1,0

Клетки линий 2, 3, 7, 12, 26 и 40 анализировали на 20-25 и s 42-45 пассажах после размораживания.

3. Сравнительная характеристика линий гибридомы мышь-норка

Исследования клеток шести линий гибридомы мышь-норка после года хранения в жидком азоте показали, что многократные клонирования клеток линий 2, 3 и 7 не гарантировали получения стабильных продуцентов норки. В отличие от них клетки линий 12, 26 и 40, столь ае многократно клонированные, продуцировали но-рочий Xg на одном и том же уровне в течение 3-6 месяцев культивирования после размораживания без дополнительных реклониро-ваний. Наши данные подтверждают мнение английских исследователей (Оаиге еъ а1., 1980) о возможности получить стабильно сек-ретирующие 15 варианты во всех случаях при работе с межвидовыми гибридомами. Причем такие характеристики, как количество генераций и кратность клонирований, необходимые для вццеления ста-

бпдышх гибридомных линий, будут индивидуальны в каждом отдельном случае. Уровень ^-секреторной активности клеток варьировал от 1,0 икг/ил для линии 40 до 0,04 мкг/мл/Ю^ кл./24 ч для линии 12 (таблица 3) и был типичен для межвидовых гкбридои (ВауЪоиЗЛ, ТоказЫ, 19В8; Иазку, Ееаа1пе, 1989). По результатам И$А н нммуноблотинга клетки линии 12 синтезировали линий 26 и 40 - Ь-цепи корки.

криологический анализ метафазных пластинок клеток линкй 2, 3, 7, 12, 26 и 40 гибридоиы мшь-норка на 20-25 пассатах после размораживания показал, что модальные числа хромосом клеток линий 2, 7 и 12 примерно в 2 раза превышали характерное для клеток родительской линии N30 (таблица 2). Модальный класс лкнии 3 был близок к таковому лкняи N30. В линиях 26 к 40 только пра повторном анализе на 42-45 пассатах были выявлены модальные классы, близкие к наблюдаемш ранее для линий 2, 7,10 и 12. В клетках всех гибридомных линий помимо акро-центрических хромосом выявляли 2-3 цетацентрические крупного к среднего размера, иногда субметацентрнческне хромосомы. Субтелоцентрических хромосом, маркеров клеток линии вэо, в гибридоиных клетках не обнаружили. Наши данные согласуются с результатами наблюдений некоторых исследователей тетра-гексаплоядных наборов мышиных хромосом в клетках межвидовых гибридом других типов (ТЬоирзоп et а1., 1986; Беп et а1., 1986). Возможно, гибрядомы, случайно подвергшиеся полиплоиди-зацин, в дальнейшем имеют некоторые селективные преимущества для роста в культуре клеток. В раде работ (Бахтин, 1980; Кузьмина, 1983; СЪеп, 1975; Вгеюегтапя, 1979) высказано предположение, что подобные процессы достаточно распространены в популяциях клеток с генетическими дефектами, что характерно для межвидовых гибридов соматических клеток, и являются средством достижения эволюционной стабильности клеточных линий. С помощью кариологического анализа нам так и не удалось определить достоверно норочьи хромосомы в клетках линий 12, 26 и 40, хотя их стабильная ^-секреторная активность указывала на присутствие генетического материала донора в гибридомах. Таким образом, изученные нами линии гибридомы мышь-норка по исследованным характеристикам близки к межвидовым гибридомам других известных типов, прежде всего к гибридомам мьшь-кро-

ЛНК (îarnush et al., 1980, 1981; Kuo et al., 1985).

4. Норочай хромосомный материал в клетках линяй гябрядоиы мышь-норка

Хромосомный материал норки в клетках гибридомных линий 2, 3, 7, 12, 26 и 40, фиксированных на 20-25 и 42-45 (для дниай 26 и 40) пассазах, идентифицировали с помощью гибридизация in situ. В использованных условиях %-неченая суммарная ДНК норки не гибридизовалась с хромосомами из клеток родительской линии мыши NSO тогда как хромосомы из фябробластов американской норки (линияlîv) интенсивно метились. Результаты гибридизации представлены s таблице 3. В клетках линий гибридом« мшь-норка каблодали, как отдельны® хромосомы корки, имевшие центромеры, так я фрагменты корочьей ДНК, встроешше в хромосомы мыли.

Предполагают, что сохранение хромосомного материала аи-вотиого-доиора в каряотипе клеток меавидовых гибридом является предпосылкой для стабильной продукции lg(Teng et al., 1985; Brodeur et al., 1987). Выявлена прямая корреляция иек-ду утратой синтеза ig и элиминацией немьшкых хромосом из клеток гибридом (Koropatnick et al., 1988). Аналогично этии данный мы обнаружили небольшое число клеток с ДНК норки в не-секретируюцих Ig линиях 2 и 3 гибридскы мшь-норка, в то время как в линиях-продуцентах 12, 26 и 40 такие клетки составили более половины всех исследованных (рясЛ). Однако изучение метафазных пластинок линии 7, также утратившей синтез Ig норки, показало, что по своим характеристикам (числу клеток с ДНК норки и количеству хромосомного материала норки в'клетках) она близка к линия 40, наиболее активному продуценту норочьего Ig. Следовательно, утрата синтеза ig мояет не сопровождаться значительной элиминацией хромосомного материала донора из кариотипа гибридомных клеток по сравнению с линиями, секретируюпрши ig. Установить, какие хромосомы норки сохранились, в гибридомных клетках, не удалось. Линии-продуценты отличались меяду собой по содержанию ДНК норки в клетках.Ес-ли в линии 40 почти половина клеток имела от 3 до 9 норочьих хромосом, то в кариотипе клеток линий 12 и 26 больше 2 хромо-

Таблица 3. Хромосомный материал норки в клетках линий межвидовой гибридомы мышь-норка, выявленный гибридизацией in situ с %-меченой суммарной ДНК норки

Линии Продует секреции 4) О Л * - ч> Ж ® S о Тж в» S >г а Число проанализированных клеток Доля клеток с ДНК но^ки, Процент клеток с определенным числом^мест включения метки"™ от общего числа клеток с ДНК норки Доля клеток с встроенной 2?ь«Г % Процент клеток с определенным числом хромосом мыши с интегрированной ДНК норки от общего числа клеток с ДНК норки

I 2 3 и больше

I 2 3 и больше

2 _ 93 29,03 81,5 11,1 7,4 14,8 14,8 _

3 - - 102 8,8 100,0 - - 88,9 88,9 - -

7 - - 162 75,3 33,6 27,1 39,3 36,1 27,9 7,4 0,8

12 IgG 0,04 115 67<8 70,5 26,9 2,6 16,7 15,4 1,3 -

26 1-цепи 0,1 170 51,1 62,0 28,3 9,7 14,1 12,0 2,1 -

25* L-цепи 0,1 147 84,4 62,1 29,03 8,87 46,8 42,7 3,2 0,8

40 L-цепи 1.0 136 77,2 31,4 20,0 48,6 14,2 9,5 3,8 0,9

40* L-цепи 1,0 120 97,5 14,5 17,1 68,4 42,7 35,8 5,9 0,9

Клетки всех линий анализировали на 20-25 и *42-45 пассажах после размораживания, I» - в мкг/мл/10° кл/24 ч.

>ео{- местами включения метки считали как отдельные хромосомы норки, так и фрагменты ДНК норки, интегрированные в хромосомы мыши,

10вве- от общего числа клеток с ДНК норки.

Idu •л1 но 70 60 ьо

40

JO

А

26 26" 40 40" 12

Рис.1. Доля клеток, содержавших ДНК норки, в линиях межвидовой гибридомы мышь-корка (р 0,001, заштриховано р< 0,05). По вертикали - число клеток, %; по горизонтали - обозначения линий гябридомы мшь-норка, анализированных на 20-25 и *{42-45 пассажах культивирования после размораживания.

сом норки наблюдали редко. В линиях 2, 3, 12 и 26 клетки-содержали, в основном, одиночные или хромосомы норки или фрагменты норочьей ДНК, транслированные в хромосомы мыши. По результатам проведенного анализа можно заключать, что характерных особенностей распределения норочьей ДНК в клетках гибридом мышь-норка, секретировавшх Ig норки или утративших его синтез, нам наблюдать не удалось. Количество корочьего хромосомного материала в клетках также варьировало не только у разных линий гибридомы мышь-норка, но а в пределах одной клеточной линии. Поскольку в ряде работ по межвидовым гибридомам (Levy et al., 1978; Tucker et al., 1984; Grcsvalcacp et al., 1987) показана широкая изменчивость числа хромосом и их идентичности в клетках, мояко предположить, что меягслеточ-нал вариабельность хромосом донора - явление, распространенное среди гибридом, свидетельствующее о нестабильности их хромосомного аппарата.

Как уже отмечалось, клетки всех гибридомных линий, помимо хромосом норки, содержали фрагменты ДНК норки, встроенные в

хройоссшы мыши (рис.2). Места локализации интегрированной норочьей ДНК различались деке в клетках одной гибридомной линии. Фрагменты ДОК норак располагались и в прицентромер-ных областях мьшных .акроцентрических хромосом, к в интер-каллрной их части, но в большинстве случаев были сосредоточены в районах телоыеркых концов акроцентрических хромосом, занимая разные по площади участки. В длительно культивируемых линиях 26 и 40 гибридомы мышь-норка при повторном анализе на 42-45 пассазшх in vitro наблодалй значительный рос? числа клеток с транслокациями ДНК норки в хромосомы мази (рис.2). В лиши 3 в немногочисленных клетках с ДНК

1

г 7 23 26* « 40* 12

Рис.2. Доля клеток с фрагментами ДНК корки, интегрированными в хромосомы »апи, от общего числа клеток с ДНК норки в линиях меквкдовой гибридомы кышь-норка (р<0,05). Обозначения, как на рис.1.

норки она сохранилась преимущественно в составе мышиных хромосом (таблица 3). Наши данные согласуются с результатами работ (Dreher et al„, 1993; Ben et al., 1935; Hirata, Su-gewara, IS87), в которых идентифицировали встроенные последовательности экзогенной ДОК в клетках межвидовых гибридом, не обнаружив предварительно хроиосои донора. Вероятно, этот путь сохранения чужеродной ДНК в геноме клеток-реэдти-ентов предпочтительнее.

При анализе радиоавтографов хромосом клеток линий гибридомы мшь-норка выяснилось, что многие мета- и субиетацект-рические хромосомы, подобные таковым в кариотипе американской норки, являлись мышиными. В клетках лиши hso таких хро-

носом не наблюдали. В то se время отличающиеся по длине идентифицированные хромосомы норки часто принадлежали к ак-роцентрическому типу. Гекы Н- и L-цепей ig локализованы на разных хромосомах у всех изученных видов животных (Ellison, Hood, IS33). Однако большинство клеток линии 12, продуцента igG норки, содержали не более одной норочьей хромосомы (таблица 3). Вероятно, в клетках этой линии могли суцзст-вовать минорные сайты инсерций ДНК норки в мшиных хромосомах, не давшие определяемого сигнала в гибридизации in situ. Совокупность полученных результатов свидетельствует о существенных перестройках как норочьих, так и мышиных хромосом в гибридомах мышь-норна. Трудности в идентификации измененных хромосом донора и реципиента также бши отмечены в ряде других работ по межвидовым гибридсмам (Hirata et al., IS87; Grnnow et al., 1988). Тает;.! образом, иояно предположить, что в клетках иеавидових гибридом имеет место не только элиминация большинства хромосом донора, но и дестабилизация всего кариотипа полученных клеток, проявляющаяся в повышенной изменчивости хромосом.

5. Определение гена ъ -цепи Ig норки в клетках линий гибридомы мкиь-норка

Результаты гибридизации ДНК из клеток линий ?, 26 и 40 гибридомы мшь-норка с константной частью гена Я-ь -цепи ig норки показали, что Я-ген присутствовал в клетках линяй 26 и 40, продуцентах L -цепей Ig норки, и отсутствовал з клетках линии 7, утратившей синтез Ig норки. Набор рвстрикцион-ных фрагментов, характерный для гибридом (16, 5,5, 4,8 и 1,8 кь), отличался от спектра ЕсоЭ1 фрагментов для фибробла-стов норки линии isv (19, 16, 5,5 и 4,8 къ). Наблюдаемые изменения, вероятно, связаны с тканеепецифическтда отличиями строения гена ь-цепи ig в фибробластах и клетках межвидовых гибридом, где этот ген функционально активен. Согласно результатам наших исследований и данным литературы (Galfre et al., 1980; Gardner et al., 1985; Uchiyama et al., 1987), именно утрата иммуноглобулиновых генов, а не регуляторныа процессы (Baison et al., 1982), является основной причиной нестабильной ig -секреторной активности клеток межвидовых

гибридом.

вывода

I. Впервые получены линии межвидовой гибридомы мышь-норка, продуценты ь-цепей Ig американской норки. Изучение функциональных (секреция Ig), культуральных, цитогенетических характеристик выявило их сходство с межвидовыми гибридомами других известных типов.

Z. В основе нестабильной Ig-секреторной активности клеток некоторых многократноклонированных линий гибридомы мыхь--норка ле;глт постоянно возникающая популяционная гетерогенность гибридомных клеток по этому признаку, основанная, вероятно, на продолжающейся утрате хромосом норки, в том числе и с генами Ig .

3. С помощью гибридизации in situ с %-мечзной суммарной ДНК норки наблюдали меж- и внутрилинейную вариабельность по числу клеток с ДНК норки и количеству норочьего хромосомного материала в клетках гибридом мьшь-норка. Характерных особенностей его распределения в кариотипе клеток гибридом,синтезировавших Ig норки или утративших его секрецию, не обнаружили .

4. Выявлено значительное преобразование кариотипа клеток гибридом мышь-норка, на что указывали множественные участки интеграции ДНК норки в хромосомы мьши и появление хромосом, не характерных для норочьих и мышиных родительских клеток.

5. Наблюдали увеличение числа клеток с фрагментами хромосом норки, встроенными в хромосомы мыши, в линиях гибридомы мышь-норка, длительное время размножавшихся in vitro. Предполагается, что этот путь сохранения чужеродной ДКК в кариотипе клеток-реципиентов, вероятно, предпочтителен.

6.С помощью блот-гибридизации ДНК клеток гибридомных линий с константной частью гена \-ь -цепи ig норки установлено, что синтез норочьих ъ -цепей ig в клетках лиши 7 отсутствовал из-за утраты ими Х-гена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Уфшцева Е.Г., Галахарь Н.Л. Межвидовые гибридомы, продуценты моноклонального иммуноглобулина //Научно-прак-

тическад конференция "Применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве". Тезисы докладов. Уфа, 1987. - С.30-31.

2. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л. криологический анализ клеток клона межвидовой гибридош щгшь-норка //Труды У Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки". ■ Тбилиси, 1987. - С.844-846.

3. Галахарь Н.Л., Уфимцева Е.Г., Дьяченко G.H., Матяхи-на Л.Д, Экспрессия легких цепей иммуноглобулина норки в межвидовых гибридомах мышь-норка //Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". Тезисы докладов. Пущино,

1988. - С.40.

4. Галахарь Н.Л., Дьяченко С.Н., Уфимцева Е.Г., Таранин A.B., Баранов O.K. Штамм культивируемых гибридных клеток животных Ииз buscuius х Muatela vison - продуцент монокло-нальных иммуноглобулинов класса ige норки. Авторское свидетельство № I52II772. Откр.изобр., 1989, Бол. Ш 42.

5. Уфимцева Е.Г., Матяхина Л.Д., Дьяченко С.Н., Галахарь Н.Л. Использование межвидовых гибридом шзшь-норна для изучения экспрессии иммуноглобулиновых^генов норки /В сб."Цито~ генетика и биотехнология". Ленинград, 1989. - C.I35-I4I.

6. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л. Межвидовые гибридош. Деп. в ВИНИТИ 28.07.89, » 4935-В89. - 29 с.

7. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л. Определение кммуногло-булин-секретирующих клеток гибридом в непрямой иммуноферлен-тном анализе на нитроцеллюлозе. Деп. в ВИНИТИ 17.11.89,

№ 6847-В89. - 7 с.

8. Уфимцева Е.Г., Галахарь Н.Л., Матяхина Л.Д., Дьяченко С.Н., Хлебодарова Т.М. Межвидовая гибридома и исследование экспрессии гена l -цепи иммуноглобулина норки //Ш школа-семинар генетиков и селекционеров. Тезисы докладов. Бийск,

1989. - Известия СО АН СССР. Серия - биологические науки. -1989. - № 2.-C.I3.

Подписано к печати 6.06.91 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. I. Уч.-изд. л. 0,7. Тираж 120 экз. Заказ 131.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО АН СССР 630090, Новосибирск, проспект академика М.А.Лаврентьева, 10