Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноцитохимическое исследование клеток вагинального и буккального эпителия в следах на вещественных доказательствах и его судебно-медицинская оценка

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноцитохимическое исследование клеток вагинального и буккального эпителия в следах на вещественных доказательствах и его судебно-медицинская оценка"

На правах рукописи

ЦЕЛУЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК ВАГИНАЛЬНОГО И БУККАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ В СЛЕДАХ НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ И ЕГО СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ОЦЕНКА

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология 14.00.24 - судебная медицина

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 2 Л5Я 2т

Новосибирск - 2008

/

003456780

Работа выполнена в Новосибирском государственном медицинском университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию и Новосибирском областном бюро судебно-медицинской экспертизы

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Новоселов Владимир Павлович Савченко Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Голубева Ирина Александровна Бураго Юрий Иванович

Ведущая организация: Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава (г. Нижний Новгород)

1

Защита состоится Ф * » I !/14"\ 2008 г. в И

ч. на заседании

диссертационного совета Д. 208Я)62.05 при Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава (630091, г. Новосибирск Красный проспект, 52).

Автореферат разослан ^) » ^ Л1Л (2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор А.В.Волков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. При проведении судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств на современном этапе все более значимым становится использование цитологических методов исследования (Томилин В.В., 2001; Барсегянц Л.О., 2005; Anderson Е„ Beams H.W., 1993; Hertig А.Т., Adams E.S., 1997). Особенно это актуально при проведение судебно-медицинских экспертиз, связанных », половым;: преступлениями, количество которых из года в год не уменьшается (Варшавец Н.П., 2005; Капустин A.B., Исаев А.И.. 2005). В связи с тем, что преступления, связанные с половой неприкосновенностью граждан РФ, относятся к категории особо тяжких, правоохранительные органы, проводя расследование, предъявляют высокие требования к уровню выполнения судебно-медицинских экспертиз (Барсегянц Л.О., 2005; Намаконов А.И., 2005).

При проведение экспертиз в связи с совершенными половыми преступлениями ведущим вопросом является морфологическая дифференциальная диагностика клеток вагинального и буккального эпителия (Загрядская А.П., 2002; Петрова A.C.. 1998; Намаконов А.И., 2005, Blandau R.J., Bergsma D., 2004). Существующие в настоящее время различные подходы при подборе методик для решения этого вопроса имеют высокий процент отрицательных результатов (Антонова С.П., 1997; Петрова A.C., 1999; ГуртОвая C.B., 1999; Загрядская, 2001; Федоровцев А.Л, Королева Е.И., 2003; Balboni G.C., 1999). В условиях очень ограниченного количества цитологического материала на вещественных доказательствах, нередко представленного единичными клетками, результаты судебно-медицинской экспертизы очень часто бывают отрицательными (Гуртовая C.B., 1999; Федоровцев А.Л, Королева Е.И., 2003).

Как следует из представленных данных, современные возможности морфологической дифференциальной диагностики эпителиальных клеток в экспертной практике достаточно ограничены. Именно поэтому использование в судебно-медицинской практике новых методов цитологического исследования, позволяющих повысить качество экспертиз, является актуальным и значимым.

Цель исследования: Оценить возможности и эффективность использования иммуноцитохимического метода при исследовании эпителиальных клеток в пятнах выделений на вещественных доказательствах для выявления и дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия.

Задачи исследования:

1. Оценить возможность использования иммуноцитохимического авидин-биотинового метода с антителами к рецепторам эстрогена и прогестерона для дифференциации клеток вагинального и буккального эпителия.

2. Изучить возможности оптимизации применения авидин-биотинового метода для дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия путем повышения температуры инкубации антител до 37° С.

3. Определить выраженность активности реакций клеток вагинального эпителия в зависимости от периода овариально-менструального цикла при использовании авидин-биотинового метода.

4. Использовать иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод для определения органо-тканевой принадлежности эпителиальных клеток на вещественных доказательствах из практических экспертных наблюдений.

5. Дать экспертную оценку данных иммуноцитохимического исследования клеток в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах при определении органо-тканевой принадлежности клеток эпителиального происхождения.

Научная новизна. В работе впервые использован иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод с целью морфологического дифференцирования клеток буккального и вагинального эпителия. Были определены изменения интенсивности окраски клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла, при этом отмечено повышение активности рецепторного аппарата клеток вагинального эпителия: на эстроген - в фолликулиновую фазу цикла и в период овуляции; на прогестерон - в лютеиновую фазу цикла. Выявлена возможность оптимизации использования авидин-биотинового метода для дифференцирования клеток буккального и вагинального эпителия путем повышения

емпературы инкубации антител к эстрогену и прогестерону до 37° С. Определен птимальный вариант проведения иммуноцитохимического авидин-биотинового метода для окраски цитологических препаратов, приготовленных из пятен на вещественных доказательств, с целью дифференцирования клеток буккального и вагинального эпителия.

Практическая значимость. Впервые использованный иммуноцитохимический метод исследования с авидин-биотиновой системой визуализации для целей судебно-медицинской практики позволил повысить результативность цитологических исследований в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах. Применение в работе судебно-медицинских учреждений иммуноцитохимического авидин-биотинового метода позволит повысить результативность и качество судебно-медицинских экспертиз.

Положения выносимые на защиту:

1. Определены возможности использования и оптимизации иммуноцитохимического авидин-биотинового метода с антителами к рецепторам эстрогена и прогестерона для дифференциации клеток вагинального и буккального эпителия.

2. Эффективность использования авидин-биотинового метода с антителами к рецепторам эстрогена и прогестерона коррелирует с активностью реакций клеток вагинального эпителия в зависимости от конкретного периода овариально-менструалыюго цикла.

3. Высокая эффективность иммуноцитохимического авидин-биотинового метода исследования клеток в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах позволяет увеличить результативность проводимых судебно-медицинских экспертиз и повысить их качество за счет возросшей объективности выводов эксперта.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты, полученные в процессе выполнения настоящего исследования, внедрены в практическую работу судебно-биологических отделений Кемеровского, Новосибирского, Омского, Томского, Иркутского областных, Алтайского и Красноярского краевых бюро

судебно-медицинской экспертизы. Материалы, полученные в процессе выполнения работы, используются в учебном процессе на кафедрах гистологии и эмбриологии Красноярской и Омской государственной медицинской академии, Алтайском и Новосибирском государственном медицинском университете.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на: Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств» (Воронеж, 2007); совместном заседании сотрудников ОГУЗ Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы и коллектива кафедры судебной медицины с курсом факультета повышения квалификации и постдипломной подготовки врачей Новосибирского государственного медицинского университета (2007); научно-практической конференции, посвященной 65-летию образования органов судебно-медицинской экспертизы Вооруженных Сил Российской Федерации (Москва, 2008); юбилейной конференции, посвященной 70-летию кафедры судебной медицины с курсом факультета повышения квалификации и постдипломной подготовки врачей Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2007); ежегодной конференции студентов и молодых ученых Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2007,2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из которых 1 - в ведущем рецензируемом научном журнале. По материалам работы изданы методические рекомендации для врачей «Экспертная оценка результатов иммуноцитохимического (авидин-биотинового) метода при исследовании эпителиальных клеток в пятнах выделений человека».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, четырех глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов (заключения), выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающей 172 источника, в том числе 65 зарубежных. Диссертация содержит 27 микрофотографий, 5 таблиц, 9 диаграмм.

Личное участие автора. Материалы, представленные в диссертации,

проанализированы и обработаны лично автором. Автор принимала

непосредственное участие в приготовление и окраске всех исследованных цитологических препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая работа основана на результатах качественного и количественного морфологического анализа клеток вагинального и буккального эпителия с применением комплекса как общепринятых, так и специальных методов исследования. Проведенное исследование было выполнено на экспериментальном цитологическом материале, а так же на материале практических судебно-медицинских исследований за период 2006-2007 годов. Забор экспертного материала производился в отделении судебно-медицинской экспертизы живых лиц при освидетельствовании потерпевших женщин, а также цитологического материала, поступившего для исследования в судебно-биологическое отделение Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы.

Материал для экспериментальных исследований был получен от 45 женщин фертильного возраста с достаточным гормональным фоном, подтвержденным данными исследования у них гормонов в женской консультации. Забор материала осуществлялся в различные фазы овариально-менструального цикла после полученного у наблюдающихся женщин согласия в женской консультации. Для исследования бралось по нескольку мазков на стерильные стекла с содержимым влагалища и ротовой полости.

Все препараты разделялись на три подгруппы: I - мазки с содержимым влагалища и ротовой полости женщин, находящихся в фолликулиновой фазе овариально-менструального цикла (60 препаратов клеток вагинального и буккального эпителия); II - мазки с содержимым влагалища и ротовой полости женщин, взятые в период овуляции (60 препаратов клеток вагинального и буккального эпителия): Ш - мазки с содержимым влагалища и ротовой полости

женщин, находящихся в лютеиновой фазе овариально-менструального цикла (60 препаратов клеток вагинального и буккального эпителия).

Отдельную группу исследования составил экспертный материал - 27 судебно-медицинских экспертиз, поступивших на исследование в судебно-биологическое отделение Новосибирского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. При выполнении работы в разработку были взяты экспертизы по уголовным делам против половой неприкосновенности с очевидными обстоятельствами дела. Исследовались пятна выделений на вещественных доказательствах (слюны, влагалищного содержимого), мазки и тампоны с содержимым влагалища и ротовой полости женщин фертильного возраста (от 19 до 35 лет), после предварительного сбора у них акушерско-гинекологического анамнеза в процессе судебно-медицинского освидетельствования. Давность изъятия данных вещественных доказательств варьировала от 5 до 28 дней. В работе использовались как стандартный метод окраски препаратов азур-эозином по Романовскому, так и специальный иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод. Кроме того, с целью выявления наиболее оптимальных условий реакций использовались некоторые модификации в окраске препаратов. Всего исследовано 460 цитологических препаратов, 920 объектов исследований.

Микроскопическое исследование препаратов проводилось при различных увеличениях (150, 300, 600 с водной иммерсией, 900 с масляной иммерсией). В ходе проведения работы были применены указанные ниже технические средства и программное обеспечение. При проведении микроскопического исследования использовались микроскопы: биологический «Микромед-1» (окуляр 15х, объективы 10х; 20х; 40х), «Cari Zeiess Axiostar» (окуляр 15х, объективы 10х; 20х; 40х; 90х), цифровая автоматическая камера AxioCam Мгс. В процессе формирования базы данных и оформления полученных результатов использовался программа обработки электронных таблиц Microsoft Excel, программа AxioVision текстовый процессор Microsoft Word. Результаты полученных морфометрических показателей были подвергнуты математической обработке с вычислением статистических показателей. В работе использовалось морфометрическое исследование с

применением тестовых систем в соответствии с рекомендациями Автандилова Г.Г. (1999).

Проводилась сравнительная оценка препаратов клеток буккального и вагинального эпителия окрашенных по авидин-биотиновой методике в зависимости от используемых антител, температуры их инкубации, применяемого для восстановления объема клеточных структур раствора. При оценке препаратов, окрашенных с применением иммуноцитохимического авидин-биотинового метода оценивалось несколько параметров: морфологические особенности характерные для каждого вида клеток: их размеры, характер краев, расположение ядра, ядерно-цитоплазматический индекс, наличие включений в цитоплазму; возможность определения в ядрах клеток промежуточного слоя половой метки; различное окрашивание цитоплазмы клегок в зависимости от их органо-тканевого происхождения; дифференцированное окрашивания ядра и цитоплазмы клеток; различная интенсивность окрашивания цитоплазмы групп клеток и изолированно расположенных клеток; зависимость интенсивности окраски и количества клеток с окрашенной цитоплазмы от температуры инкубации первичных антител, фаз овариально-менструального цикла, среды, используемой для восстановления объема клеточных структур, отсутствие фонового окрашивания препаратов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с вычислением среднего значения признака (М) и средней ошибки величины (т), определением максимального и минимального значения. Оценивалась статистическая значимость различий внутри одной группы на разных этапах наблюдений, а также между двумя сравниваемыми группами на аналогичных этапах наблюдений. Достоверность различия сравниваемых средних значений рассчитывали на основании критерия Стьюдента. Различие считали достоверным при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования с помощью иммуноцитохимического метода с авидин-биотиновой системой визуализации, используя антитела к рецепторам эстрогена и прогестерона, оценивались различия в рецепторном гормональном

статусе клеток ва1 инального и буккального эпителия. Выявленные цитохимические изменения использовались в последующем как основной дифференцирующий признак при определении органо-тканевой принадлежности эпителиальных клеток. При сравнительном микроскопическом исследовании на различных увеличениях клеток буккального эпителия, окрашенных с использованием иммуноцитохимической методики, наблюдали окрашивание цитоплазмы клеток в бледно-голубые или серо-голубые цвета; ядра окрашивались более интенсивно, что было практически идентично окраске препаратов азур-эозином по Романовскому. При микроскопическом исследовании клеток вагинального эпителия на малом увеличении (!50х) во всех препаратах цитоплазма большинства клеток, расположенных как группами, так и изолированно, окрашивалась в характерные коричневые тона: от светло-коричневого до интенсивно коричневого цвета. Среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой на препаратах вагинального эпителия при использовании авидин-биотиновой методики с применением антител рецепторам эстрогена составляло 69 %; с применением антител к рецептора прогестерона - 71 %. Коэффициент интенсивности окрашивания цитоллазмь клеток на единицу площади для буккального эпителия составлял - 0,95 ± 0,012; дл клеток вагинального эпителия, на которые наносились антитела к рецептора эстрогена - 3,14 ± 0,41; для клеток вагинального эпителия, на которые наносилис антитела к рецепторам прогестерона - 3,31 ± 0,39 (таблица 1, диаграмма 1 диаграмма 2).

Таблица 1.Интенсивнось окрашивания клеток вагинального и буккального эпителия при использовании иммуноцитохимической авидин-биотиновой методик

Вид эпителия/вариант антител Коэффициент интенсивности окраски клеток на единицу площади (М ± гп)

Буккальный / антитела к рецепторам эстрогена 0,75 + 0,012

Буккальный /антитела к рецепторам прогестерона 0,69 ± 0,02

Вагинальный/антитела к рецепторам эстрогена 3,14 ±0,41

Вагинальный/антитела к рецепторам прогестерона 3,31 ±0,39

I

Диаграмма 1. Коэффициент интенсивности окрашивания клеток буккального и вагинального эпителия на единицу площади

й буккальн. и заганальн.

прогестерон

эстроген

эстроген прогестер.

Ш буккальн Й5 вагинальн

Диаграмма 2. Среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой в препаратах буккального и вагинального эпителия.

Ядра клеток оставались голубого, серо-голубого цвета, с сохранением хромогеновой субстанции и полового хроматина в ряде клеток промежуточного

слоя. Фонового окрашивания, т.е окрашивания внеклеточного пространства, не отмечалось, что свидетельствовало о правильности проведения реакции.

Полученные на этом этапе данные показали, что в случае применения антител к эсгрогену и прогестерону происходило окрашивание цитоплазмы именно клеток вагинального эпителия, которые обладают гормонозависимыми рецепторами к данным антителам, окрашивания цитоплазмы клеток буккального эпителия в коричневые тона не наблюдалось. Во всех случаях цитоплазма клеток буккального эпителия, так же как и при окраске азур-эозином по Романовскому оставалась серо-голубого цвета.

На следующем этапе, с целью оптимизации применения авидин -биотинового метода для дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия нам представилось целесообразным внести некоторые изменения в параметры проведения реакции. Для этого инкубация на препаратах антител к эстрогену и прогестерону в группе наблюдения протекала в условиях термостата при температуре 37° С. В качестве группы сравнения использовались мазки клеток вагинального и буккального эпителия окрашенные с помощью иммуноцитохимической методики, инкубация антител на которых протекала при температуре 20° С. Среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой на препаратах вагинального эпителия при использовании антител к рецепторам эстрогена при температуре 37° С составляло 81 %\ с применением антител к рецепторам прогестерона - 75 %. При сравнении данных величин с результатами, полученными при температуре 20° С, отмечалось увеличение данного показателя на 12 % для препаратов клеток вагинального эпителия, содержащих антитела к рецепторам эстрогена и на 8% для препаратов содержащих антитела к рецепторам прогестерона. Коэффициент интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток на единицу площади для препаратов клеток вагинального эпителия с антителами к рецепторам эстрогена был на 0,91 больше, чем в группе сравнения, для этих же препаратов с антителами к рецепторам прогестерона - на 0,88 больше, чем в группе сравнения. Увеличилась интенсивность окрашивания цитоплазмы как изолированных, так и групп клеток преимущественно в коричневые или темно-

коричневые тона. При этом было отмечено, что степень окрашивания изолированных клеток была сопоставима с интенсивностью окраски клеток, расположенных группами. Это наблюдалось в препаратах, содержащих антитела как к рецепторам эстрогена, так и прогестерона. Как следует из представленных данных, при проведении реакции при температуре 37° С. близкой к температуре организма человека, увеличивается количество клеточных рецепторов вступивших реакцию «антиген-антитело», что иивышиа эффективность использования методики (диаграмма 3).

а вагин.зстрог. Н вагин.прогест буккальн

Диаграмма 3. Среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой в препаратах буккального и вагинального эпителия при использовании авидин-биотинового метода в условиях инкубации антител при температуре 20 °С и 37 °С.

На следующем этапе исследования была проведена морфологическая оценка интенсивности окрашивания клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла. При сравнительном морфометрическом исследовании было отмечено, что цитоплазма клеток буккального эпителия вне зависимости от фаз овариально-менструального цикла и используемых антител имела бледно-голубой или серо-голубой цвет.

При микроскопии клеток вагинального эпителия отмечалась разница в интенсивности окраски препаратов и количестве окрашенных клеток в зависимости

13

от используемых антител и фаз овариально-менструального цикла. В фолликулиновую фазу более интенсивно окрашивались участки препаратов, на которые наносили антитела к рецепторам эстрогена. Коэффициент интенсивности окраски цитоплазмы на единицу площади на этих участках составил 4,88 ± 1,01. Коэффициент интенсивности окраски цитоплазмы на участках препаратов с антителами к рецепторам прогестерона составил 3,12 ± 0,7. Среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой на препаратах вагинального эпителия с антителами к рецепторам эстрогена составило 62 на аналогичных препаратах с антителами к рецепторам прогестерона-41 %.

При микроскопии клеток вагинального эпителия, взятых в период овуляции препараты, содержащие антитела к эстрогену в данную фазу цикла окрашивались максимально интенсивно. Причем отмечалось увеличение как общего количества клеток с окрашенной цитоплазмой, так и интенсивности их окраски. Коэффициент интенсивности окраски на единицу площади составил 5,44 ± 1,3, среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой 80 %; аналогичные показатели для препаратов клеток вагинального эпителия с антителами к рецепторам прогестерона: интенсивность окраски на единицу площади 3,96 ± 0,9; среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой 62 При сравнительном микроскопическом исследовании III группы препаратов клеток вагинального эпителия взятых в лютеиновую фазу цикла отмечалось следующее: в препаратах, содержащих антитела к рецепторам прогестерона, наблюдалось увеличение количества клеток с окрашенной цитоплазмой, оно было максимальным по сравнению с предыдущими наблюдениями. Интенсивность окраски на единицу площади составляла 5,11 ± 0,8, среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой 74 %. При микроскопии препаратов, на которые наносили антитела к рецепторам эстрогена, наблюдалось некоторое уменьшение количества клеток с окрашенной цитоплазмой. Интенсивность окраски на единицу площади составляла 4,61 ± 0,79; среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой 61 % (диаграмма 4, диаграмма 5).

Диаграмма 4. Коэфициент интенсивности окрашивания клеток вагинального эпителия на единицу площади при использовании иммуноцитохимического авидин-биотинового метода с антителами к рецепторам эстрогена и прогестерона в зависимости от фаз овариально-менструального цикла

1 фаза овуляция 2 фаза

Диаграмма 5. Среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой в препаратах буккального и вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла при использовании авидин-биотииового метода

Таким образом, проведенное исследование позволило выявить зависимость в окрашивании клеток вагинального эпителия от фаз овариально-менструального цикла и используемых антител. Было отмечено максимальное реагирование на антитела к эстрогену в период овуляции, на антитела к прогестерону в лютеиновую фазу овариатьно-менструального цикла.

На следующем этапе авидин-биотиновая методика была апробирована для исследования пятен на вещественных доказательствах в 27 случаях из экспертной практики с целью дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия. Весь исследованный материал был разбит на несколько групп: в 1-й группе объем клеточных структур был восстановлен 15 % раствором уксусной кислоты, традиционно используемым в экспертной практике; во И-й группе препаратов объем клеток вагинального и буккального эпителия был восстановлен физиологическим раствором, а инкубация антител к рецепторам эстрогена и прогестерона протекала при температуре 20° С; в Ш-й группе исследовались клетки вагинального и буккального эпителия объем клеточных структур которых был восстановлен физиологическим раствором, а инкубация антител к рецепторам эстрогена и прогестерона на которых протекала при температуре 37° С.

Во всех группах препараты клеток буккального эпителия составляли группу сравнения.

При микроскопическом исследовании препаратов I группы было отмечено, что ни в одном из наблюдений окрашивание цитоплазмы как клеток вагинального так и буккального эпителия в коричневые тона не наблюдалось.

При микроскопии препаратов II группы, содержащих клетки вагинального эпителия, отмечалось окрашивание цитоплазмы клеток в характерные коричневые тона. Интенсивность окраски на единицу площади составляла в препаратах, содержащих антитела к рецепторам эстрогена - 4,05 ±1,1; среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой - 70 %. Интенсивность окраски на единицу площади в препаратах, содержащих антитела к рецепторам прогестерона, составляла 3,89 ± 0,82: среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой - 60 %. Коэффициент интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток буккального эпителия на единицу площади на препаратах содержащих антитела к рецепторам эстрогена и прогестерона в среднем составлял 0,70 ± 0,02.

При микроскопии препаратов II и III группы окрашивания цитоплазмы клеток буккального эпителия в коричневые тона не наблюдали, коэффициент интенсивности окрашивания составлял 0,59 ± 0,06.

При микроскопии клеток вагинального эпителия наблюдалось увеличение как числа клеток с окрашенной цитоплазмой, так и интенсивность окраски по сравнению со второй группой исследования. Интенсивность окраски на единицу площади составляла в препаратах, содержащих антитела к рецепторам эстрогена -4,94 ± 0,74; среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой - 81 %. Интенсивность окраски на единицу площади в препаратах, содержащих антитела к рецепторам прогестерона, составляла 4 97 + 0.68: среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой - 73 % (диаграмма 6).

ш ваг.эстрог. Е1 вагин, протест, буккальн

1 20 град 4 37 град.

Диаграмма 6. Среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой в препаратах клеток буккального и вагинального эпителия в зависимости от температуры инкубации антител. Объем клеток восстановлен физиологическим раствором.

На основании проведенного исследования можно сделать вывод о том, что 15 % раствор уксусной кислоты, традиционно применяемый в экспертной практике для восстановления объема клеточных структур, оказывает денатурирующее влияние на гормонозависимые рецепторы клеток вагинального эпителия. Вследствие этого при нанесении на препараты антител к рецепторам эстрогена и прогестерона не происходит реакции «антиген-антитело» и выпадения окрашенного продукта реакции. Применение для восстановления объема клеточных структур физиологического раствора, согласно полученным нами наблюдениям, позволяет сохранить гормонозависимые рецепторы клеток. Отмечено увеличение

интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток, в случае инкубации антител протекала при температуре 37° С.

Согласно полученным результатам, можно сделать вывод о том, что применение иммуноцитохимического метода с авидин-биотиновой системой визуализации позволяет проводить морфологическую дифференцированную диагностику клеток буккального и вагинального эпителия. Изменение температуры инкубации первичных антител до 37° С увеличивает количество окрашенных клеток, и тем самым повышает информативность авидин - биотиновой методики при окраске клеток вагинального эпителия. При морфологической оценке клеток вагинального эпителия с использованием авидин-биотинового метода выявлена различная степень активности реакций клеток в зависимости от периода овариально-менструального цикла с повышение активности на антитела к рецепторам прогестерона в лютеиновую фазу цикла и к рецепторам эстрогена в период овуляции.

При исследовании эпителиальных клеток в следах на вещественных доказательствах использование иммуноцитохимической методики становится информативным в случае восстановления объема клеточных структур физиологическим раствором.

Проведенное исследование позволяет говорить о том, что применение авидин-биотинового метода позволяет дифференцировать клетки буккального и вагинального эпителия в зависимости от различного содержания в них специфических гормонозависимых рецепторов. Выявлено денатурирующее влияние раствора уксусной кислоты на гормонозависимые клеточные структуры. Определена оптимизация параметров проведения реакции и возможности использования данного метода окраски на цитологических препаратах.

выводы

1. Использование иммуно-цитохимического авидин-биотинового метода с применением антител к рецепторам эстрогена и прогестерона позволяет проводить морфологическую дифференциальную диагностику клеток буккального и вагинального эпителия в зависимости от разницы в их окраске.

2. Изменение температуры инкубации первичных антител с использовании иммуноцитохимического авидин - биишновогс метода ¡¡а препарата;; вагинального эпителия, при термостатировании 37° С, позволяет увеличить количество клегок имеющих окрашенную цитоплазму для препаратов с антителами к рецепторам эстрогена на 12 с антителами к рецепторам прогестерона на 8 а также повышает коэффициент интенсивности окраски цитоплазмы исследуемых клеток, соответственно, на 0, 91 и 0, 88 условных единиц.

3. Иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод позволяет выявлять изменения количества и интенсивности окраски клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла и применяемых антител, при этом отмечено максимальное реагирование рецепторов вагинальных клеток на антитела к эстрогену в период овуляции, когда среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой составляет 80 %, а коэффициент интенсивности окрашивания - 5,44 ± 1,3, при реагировании антител к прогестерону в лютеиновую фазу овариально-менструального цикла среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой составляет 74 %. а коэффициент интенсивности окрашивания - 5.11 ± 0,8.

4. Восстановление объема клеточных структур при использовании авидин-биотинового метода эффективно проводить с помощью физиологического раствора, при этом среднее значение клеток вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой при использовании антител к рецепторам эстрогена составляет 70 ск. а коэффициент интенсивности окрашивания - 4,05 ±1,1, при использовании антител к рецепторам прогестерона среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой -60 7с, а коэффициент интенсивности окрашивания - 3.89 ± 0,82. Повышение температуры инкубации антител приводит к увеличению среднего значения клеток

вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой на 11 % при использовании антител к рецепторам эстрогена и на 13 % при использовании антител к рецепторам прогестерона, увеличение коэффициента интенсивности окрашивания происходит, соответственно, на 0,9 и 0,3В условных единиц.

5. Применение иммуноцитохимического авидин-биотинового метода в судебно-медицинской практике при исследовании клеток в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах позволяет увеличить результативность проводимых судебно-медицинских экспертиз и повысить их качество за счет возросшей объективности выводов эксперта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При проведении цитологического исследования, особенно в случаях малого количества материала на вещественных доказательствах, наряду с общепринятыми методами окраски и исследования цитологических препаратов клеток вагинального и буккального эпителия целесообразно использовать иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод с последующей морфологической оценкой выраженности реакции клеток.

1. В процессе использования иммуноцитохимического авидин-биотинового метода при морфометрической оценке следует обратить внимание на изменения количества и интенсивности окраски клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла и применяемых антител.

2. Восстановление объема клеточных структур при использовании авидин-биотинового метода необходимо осуществлять, применяя только физиологический раствор.

3. При оценке препаратов, окрашенных с применением иммуноцитохимического авидин-биотинового метода следует обращать внимание на следующие параметры: сохранение всех морфологических особенностей, характерных для клеток определенной органо-тканевой принадлежности; возможность определения в ядрах клеток промежуточного слоя половой метки; дифференцированное окрашивание цитоплазмы и ядер клеток, зависимость

интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток и количества клеток с окрашенной цитоплазмой от их органо-тканевой принадлежности, температуры инкубации, используемых антител и фаз овариально-менструалыюго цикла; а также от используемой для восстановления объема клеток среды.

4. Повышение температуры инкубации антител приводит к увеличению среднего значения клеток вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой на 11 % при использовании антител к рецепторам 3cipoiena и на 13 "о при использований антител к рецепторам прогестерона, увеличение коэффициента интенсивности окрашивания происходит, соответственно, па 0,9 и 0,38 условных единиц.

5. При оценке результатов цитохимического исследования следует ориентироваться на данные о том, что среднее значение клеток вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой при использовании антител к рецепторам эстрогена составляет 70 %, а коэффициент интенсивности окрашивания - 4,05 ±1,1, при использовании антител к рецепторам прогестерона среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой - 60 %. а коэффициент интенсивности окрашивания - 3,89 ±0,82.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Целуева Е. А. Теоретическое обоснование использования метода иммуногистоцитохимии для установления регионального происхождения эпителиальных клеток / Е.А. Целуева, В.П. Новоселов, C.B. Савченко // Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. - Воронеж. 2007. - С. 151-155.

2. Целуева Е. А Использование иммуногисгоцитохимической методики для установления органо-тканевого происхождения эпителиальных клеток / Е.А. Целуева, В.П. Новоселов, C.B. Савченко // Проблемы судебно-медицинской экспертизы в условиях реформирования вооруженных сил и генеральной прокуратуры Российской Федерации: сб. материалов науч.-практ. конф - М„ 2008. -С. 246-248.

3. Целуева Е.А. Теоретическое обоснование использования метода

иммуногистоцитохимии при цитологических исследованиях / Е.А. Целуева, В.П. Новоселов, C.B. Савченко // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. - Красноярск, 2007. - Вып. 12. - С. 69-71.

4. Целуева Е.А. Использование иммуногистоцитохимической методики для установления регионального происхождения эпителиальных клеток / Е.А. Целуева, В.П. Ново .¿лов, C.B. Савченко // Актуальные вопросы судебной медицины и эксперт; ой практики. -Красноярск, 2007. - Вып. 12. - С. 66-68.

5. Целуева Е.А. Использование иммуногистоцитохимической методики для установления регионального происхождения эпителиальных клеток / Целуева Е.А. II Авиценна-2007: материалы ежегод. конкурс-конф. студентов и молодых ученых. -Новосибирск, 2007. - С. 396-397.

6. Целуева Е.А. Использование иммуноцитохимической методики для дифференциальной диагностики клеток буккального и вагинального эпителия / Е.А. Целуева, В.П. Новоселов, C.B. Савченко // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. - Новосибирск-Томск, 2008. - Вып. 13. - С. 96 99.

7. Целуева Е.А. Использование метода иммуногистоцитохимии пр цитологических исследованиях. / Е.А. Целуева, В.П. Новоселов, C.B. Савченко / Сибирский медицинский журнал. - 2008. - № 1. - С. 25-27.

8. Целуева Е.А. Оценка эффективности использовани иммунмистоцитохимического метода для дифференцированного морфологическог исследования эпителиальных клеток в пятнах выделений человека в судебно медицинской практике / Е.А. Целуева // Авиценна-2008: материалы ежего конкурс-конф. студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 2008. - С. 347-348.

9. Целуева Е.А. Экспертная оценка результатов иммуноцитохимическог (авидин-биотинового) метода при исследовании эпителиальных клеток в пятна выделений человека / Судебные медики Сибири // метод, рек. межрегион, ассоц. Томск-Новосибирск, 2008. - 15 с.

Подписано к печати 20.1 ¡.2008 формат - 60x84 1/16, Усл. печ. л. 2

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 962 Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Целуева, Елена Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА ОБ ОПРЕДЕЛЕНИИ ОРГАНО-ТКАНЕВОЙ И РЕГИОНАЛЬНОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ.

1.1. Цитологические исследования в судебно-медицинской практике.

1.2. Структурные особенности эпителиальных клеток.

1.3. Современные возможности при проведении цитологических исследований.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика практического материала исследования.

2.2. Последовательность использования морфологических методов исследования, особенности приготовления, окраски и микроскопического исследования препаратов.

2.3. Морфологическая и морфометрическая оценка данных.

2.4. Средства, используемые для получения и обработки данных.

ГЛАВА 3 ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ С ЦЕЛЬЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ КЛЕТОК ВАГИНАЛЬНОГО И БУККАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ.

3.1. Результаты применения иммуноцитохимического метода с авидин-биотиновой системой визуализации при окраске клеток вагинального и буккального эпителия.

3.2. Применение иммуноцитохимического метода с авидин-биотиновой системой визуализации при окраске клеток вагинального и буккального эпителия в условиях температуры 37°С.

ГЛАВА 4. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА С АВИДИН-БИОТИНОВОЙ СИСТЕМОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ПРИ ОКРАСКЕ КЛЕТОК БУККАЛЬНОГО И ВАГИНАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФАЗ ОВАРИАЛЬНО-МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛА.

ГЛАВА 5. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА С АВИДИН-БИОТИНОВОЙ СИСТЕМОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ДЛЯ ОКРАСКИ КЛЕТОК БУККАЛЬНОГО И ВАГИНАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ СЛЕДОВ НА ВЕЩЕСТЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуноцитохимическое исследование клеток вагинального и буккального эпителия в следах на вещественных доказательствах и его судебно-медицинская оценка"

Актуальность исследования.

При проведении судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств, на современном этапе, все более значимым становится использование цитологических методов исследования (Томилин В.В., 2001; Барсегянц Л.О., 2005; Anderson Е., Beams H.W., 1993; Hertig А.Т., Adams E.S., 1997). Особенно это актуально при проведение судебно-медицинских экспертиз, связанных с половыми преступлениями, количество которых из года в год, не уменьшается (Варшавец Н.П., 2005; Капустин A.B., Исаев А.И., 2005). В связи с тем, что преступления связанные с половой неприкосновенностью граждан РФ относятся к категории особо тяжких, правоохранительные органы проводя расследование предъявляют высокие требования к уровню выполнения судебно-медицинских экспертиз. Это возможно достичь, используя в работе цитологические методики, которые позволяют исследуя минимальное количество объекта получить данные для его всесторонней характеристики (Блувштейн Г.П ., 1999; Гуртовая С.В., 1999; Федоровцев A.JI, Королева Е.И., 2003, Enders А., 2002, Witshi Е., 2005).

Одним из основных вопросов решаемых при проведении цитологических исследований в судебно-медицинской практике является определение органо-тканевой принадлежности клеток на вещественных доказательствах (Загрядская А.П., 2002; Петрова A.C., 1998; Намаконов А.И., 2005, Blandau R.J., Bergsma D., 2004). Уже на протяжении многих лет - это остается одной из сложных, и недостаточно разработанных разделов судебно-медицинской цитологии (Барсегянц Л.О., 2005; Намаконов А.И., 2005). При этом, ведущим вопросом при проведение экспертиз, в связи с совершенными половыми преступлениями, является морфологическая дифференциальная диагностика клеток вагинального и буккального эпителия. Существующие в настоящее время различные подходы при подборе методик для решения этого вопроса имеют высокий процент отрицательных результатов при проведении цитологических исследований

Антонова С.Н., 1997; Петрова A.C., 1999; Гуртовая C.B., 1999; Загрядская, 2001; Федоровцев А.Л, Королева Е.И., 2003; Balboni G.C., 1999). Это наблюдается даже в случаях использования нескольких методов окраски мазков при морфологической оценке клеток вагинального и буккального эпителия с целью их дифференциальной диагностики, так как каждый из методов направлен на выявление только определенных структурных особенностей клеток (Струков А.И., Серов В.В., 1992; Гуртовая C.B., 1999; Федоровцев А.Л, Королева Е.И., 2003; Markee J.E., Blandau R.J., 1984). В условиях очень ограниченного количества цитологического материала на вещественных доказательствах, нередко представленного единичными клетками, результаты судебно-медицинской экспертизы очень часто бывают отрицательными.

Как следует из представленных данных, современные возможности морфологической дифференциальной диагностики эпителиальных клеток в экспертной практике достаточно ограничены. Именно поэтому использование в судебно-медицинской практике новых методов цитологического исследования, позволяющих повысить качество экспертиз, является актуальным и значимым.

Исходя из вышеизложенного была сформулирована цель настоящего исследования:

Оценить возможности и эффективность использования иммуноцитохимического метода для выявления и дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия в пятнах на вещественных доказательствах.

Задачи:

1. Оценить возможность использования иммуноцитохимического авидин-биотинового метода с антителами к рецепторам эстрогена и прогестерона для дифференциации клеток вагинального и буккального эпителия.

2. Изучить возможности оптимизации применения авидин-биотинового метода для дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия путем повышения температуры инкубации антител до 37°С.

3. Определить выраженность активности реакций клеток вагинального эпителия в зависимости от периода овариально-менструального цикла при использовании авидин-биотинового метода.

4. Использовать иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод для определения органо-тканевой принадлежности эпителиальных клеток на вещественных доказательствах из практических экспертных наблюдений.

5. Дать экспертную оценку данных иммуноцитохимического исследования клеток в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах при определении органо-тканевой принадлежности клеток эпителиального происхождения.

Научная новизна.

В работе впервые использован иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод с целью морфологического дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия. Были определены изменения интенсивности окраски клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла. При этом отмечено повышение активности рецепторного аппарата клеток вагинального эпителия: на эстроген в фолликулиновую фазу цикла и в период овуляции; на прогестерон - в лютеиновую фазу цикла. Выявлена возможность оптимизации использования авидин-биотинового метода для дифференцирования клеток буккального и вагинального эпителия путем повышения температуры инкубации антител к эстрогену и прогестерону до 37°С. Определен оптимальный вариант проведения иммуноцитохимического авидин-биотинового метода для окраски цитологических препаратов, приготовленных из пятен на вещественных доказательств, с целью дифференцирования клеток вагинального и буккального эпителия.

Практическая значимость.

Впервые использованный иммуноцитохимический метод исследования с авидин-биотиновой системой визуализации для целей судебно-медицинской практики, позволил повысить результативность цитологических исследований вещественных доказательств. Внедрение в работу судебно-медицинских учреждений иммуноцитохимического авидин-биотинового метода позволило повысить результативность и качество судебно-медицинских экспертиз.

Внедрение результатов исследования в практику:

Результаты, полученные в процессе выполнения настоящего исследования, внедрены в практическую работу судебно-биологических отделений Кемеровского, Новосибирского, Омского, Томского, Иркутского областных, Алтайского и Красноярского краевых бюро судебно-медицинской экспертизы. Материалы, полученные в процессе выполнения работы, используются в учебном процессе на кафедрах гистологии и эмбриологии Красноярской и Омской государственной медицинской академии, Алтайском и Новосибирском государственном медицинском университете.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на:

1) Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств» (Воронеж, 2007).

2) Юбилейной конференции, посвященной 70-ю кафедры судебной медицины с курсом ФПК и ППв Новосибирского медицинского университета (Новосибирск, 2007).

3) Объединенном заседании кафедр гистологии и эмбриологии, а так же судебной медицины с курсом ФПК и ППв Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2008).

4) Научно-практической конференции, посвященной 65-летию образования органов судебно-медицинской экспертизы Вооруженных Сил Российской Федерации (Москва, 2008).

5) Совместном заседании сотрудников ОГУЗ Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы и коллектива кафедры судебной медицины с курсом ФПК и ППв ГУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет (2006, 2007, 2008).

6) Итоговой конференции молодых ученых Новосибирской государственной медицинской академии (Новосибирск, 2007, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из которых 1 — в ведущем рецензируемом научном журнале. По материалам работы изданы методические рекомендации для врачей «Экспертная оценка результатов иммуноцитохимического (авидин-биотинового) метода при исследовании эпителиальных клеток в пятнах выделений человека».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, четырех глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов (заключения), выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, включающей 171 источника, в том числе 65 зарубежных. Диссертация содержит 27 микрофотографий, 5 таблиц, 9 диаграмм.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Целуева, Елена Александровна

ВЫВОДЫ.

1. Использование иммуно-цитохимического авидин-биотинового метода с применением антител к рецепторам эстрогена и прогестерона позволяет проводить морфологическую дифференциальную диагностику клеток буккального и вагинального эпителия в зависимости от разницы в их окраске.

2. Изменение температуры инкубации первичных антител с использовании иммуноцитохимического авидин - биотинового метода на препаратах вагинального эпителия, при термостатировании 37 С, позволяет увеличить количество клеток имеющих окрашенную цитоплазму для препаратов с антителами к рецепторам эстрогена на 12%, с антителами к рецепторам прогестерона на 8%, а так же повышает коэффициент интенсивности окраски цитоплазмы исследуемых клеток, соответственно, на О, 91 и 0, 88 условных единиц.

3. Иммуноцитохимический авидин-биотиновый метод позволяет выявлять изменения количества и интенсивности окраски клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла и применяемых антител, при этом отмечено максимальное реагирование рецепторов вагинальных клеток на антитела к эстрогену в период овуляции, когда среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой составляет 80%, а коэффициент интенсивности окрашивания - 5,44±1,3, при реагировании антител к прогестерону в лютеиновую фазу овариально-менструального цикла среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой составляет 74%, а коэффициент интенсивности окрашивания - 5,11±0,8.

4. Восстановление объема клеточных структур при использовании авидин-биотинового метода эффективно проводить с помощью физиологического раствора, при этом среднее значение клеток вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой при использовании антител к рецепторам эстрогена составляет 70%, а коэффициент интенсивности окрашивания - 4,05±1,1, при использовании антител к рецепторам прогестерона среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой -60%, а коэффициент интенсивности окрашивания — 3,89±0,82. Повышение температуры инкубации антител приводит к увеличению среднего значения клеток вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой на 11% при использовании антител к рецепторам эстрогена и на 13% при использовании антител к рецепторам прогестерона, увеличение коэффициента интенсивности окрашивания происходит, соответственно, на 0,9 и 0,38 условных единиц.

5. Применение иммуноцитохимического авидин-биотинового метода в судебно-медицинской практике при исследовании клеток в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах позволяет увеличить результативность проводимых судебно-медицинских экспертиз и повысить их качество за счет возросшей объективности выводов эксперта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При проведении цитологического исследования, особенно в случаях малого количесва цитологического материала на вещественных доказательствах, наряду с общепринятыми методами окраски и исследования цитологических препаратов клеток вагинального и буккального эпителия целесообразно использовать иммуноцитохимический - авидтин-биотиновый метод с последующей морфологической оценкой выраженности реакции клеток.

1. В процессе использования иммуноцитохимического авидин-биотинового метода при морфометрической оценке следует обратить внимание на изменения количества и интенсивности окраски клеток вагинального эпителия в зависимости от фаз овариально-менструального цикла и применяемых антител.

2. Восстановление объема клеточных структур при использовании авидин-биотинового метода необходимо осуществлять, применяя только физиологический раствор.

3. Повышение температуры инкубации антител приводит к увеличению среднего значения клеток вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой на 11% при использовании антител к рецепторам эстрогена и на 13% при использовании антител к рецепторам прогестерона, увеличение коэффициента интенсивности окрашивания происходит, соответственно, на 0,9 и 0,38 условных единиц.

4. При оценке препаратов, окрашенных с применением иммуноцитохимического, авидин-биотинового метода следует обращать внимание на следующие параметры: сохранение всех морфологических особенностей, характерных для клеток определенной органо-тканевой принадлежности; возможность определения в ядрах клеток промежуточного слоя половой метки; дифференцированное окрашивание цитоплазмы и ядер клеток, зависимость интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток и количества клеток с окрашенной цитоплазмой от их органо-тканевой принадлежности, температуры инкубации, используемых антител и фаз овариально-менструального цикла; а так же от используемой для восстановления объема клеток среды.

5. При оценке результатов цитохимического исследования следует ориентироваться на данные о том, что среднее значение клеток вагинального эпителия с окрашенной цитоплазмой при использовании антител к рецепторам эстрогена составляет 70%, а коэффициент интенсивности окрашивания - 4,05±1,1, при использовании антител к рецепторам прогестерона среднее значение клеток с окрашенной цитоплазмой -60%, а коэффициент интенсивности окрашивания — 3,89±0,82.

6. Соблюдение всех необходимых требований, применяемых при выполнении цитохимических реакций позволит в случаях использования иммуноцитохимического авидин-биотинового метода в судебно-медицинской практике при исследовании клеток в пятнах выделений человека на вещественных доказательствах увеличить результативность проводимых судебно-медицинских экспертиз и повысить их качество за счет возросшей объективности выводов эксперта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Целуева, Елена Александровна, Новосибирск

1. Автандилов Г.Г. Динамика атеросклеротического процесса у человека (Вопросы морфогенеза и патогенеза)-М.: Медицина, 1970-208с.

2. Автандилов Г.Г. Морфометрия в патологии М.:Медицина, 1973-248с.

3. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию.-М.: Медицина., 1980-21 бс.

4. Автандилов Г.Г., Яблучанский Н.И., Губенко В.Г. Системная стереометрия в изучении патологического процесса — М. Медицина. 1981.-192с.

5. Автандилов Г.Г. Проблемы патогенеза и патологоанатомической диагностики болезней в аспектах морфометрии.-М.: Медицина.-19884.-286с.

6. Автандилов Г.Г., Невзоров В.П., Невзорова О.Ф. Системный стереометрический анализ ультраструктур клеток.- Кишинев: Штиинца, 1984.- 168с.

7. Автандилов Г.Г., Сухов Ю.З., Козлова Г.М. Применение микрокомпьютеров в дифференциальной диагностике: Учеб. Пособие. -М.: ЦОЛИУВ, 1987.- 75с.

8. Автоматизация цитологических исследований: Сб.науч.трудов.-Киев: Наукова думка.- 1985.-139с.

9. Акопов В.И. Об уровне знаний основ медицинского права практическими врачами// Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики: материалы VI Всероссийского съезда судебных медиков. Москва -Тюмень, 2005 - С. 25 - 27.

10. Акопов В.И. Об уровне знаний основ медицинского права практическими врачами// Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики:материалы VI Всероссийского съезда судебных медиков. — Москва -Тюмень, 2005 С. 25 - 27.

11. Акопов В.И. Судебная медицина в вопросах и ответах. Ростов-на-Дону, 1998.-С. 446.

12. Алексеев C.B., Гигиена труда./ C.B. Алексеев, В.Р.Усенко М.: Медицина, 1988. - 576с.: ил. С. 42-49.

13. Алексеев Ю.Д. К использованию метода иммунофлюоресценции для определения видовой принадлежности изолированных клеток. — В кН.: Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы. Горький, 2001, с. 181-182.

14. Антонова С.Н. Установление органно-тканевой принадлежности объектов экспертизы цитологическим методом // Мат. 1 Всероссийского съезда судебных медиков.- М., 1991.- С.137-138.

15. Антонова С.Н., Любинская С.И. Судебно-медицинская цитология / В кн. В.Г.Науменко, Н.А.Митяева: Гистологический и цитологический методы исследования в судебной медицине.- М.: Медицина, 2002.- С.226-296.

16. Банашевская Т.И., Беляева Н.Н., Кумпан Н.Б., Панасюк Л.В. Морфофункциональные исследования в гигиене. М.: Медицина.-1984.-160с.

17. Бейли Н. Математика в биологии и медицине: Пер. с англ.-М.: Мир, 1999.- 326с.

18. Библиогр.: БодяжинаВ.И. Хронические неспецифические воспалительные заболевания женских половых органов, М., 1978;

19. БодяжинаВ.И. и др. Диагностика и лечение гинекологических заболеваний в женской консультации, М., 1980; Клиническая онкология, под ред. H.H. Блохина и Б.Е. Петерсона, т. 2, с. 618, М., 1999.

20. Блувштейн Г.П. Эффективные пути сокращения сроков проведения экспертиз/ Г.П. Блувштейн, П.И. Максимов// Первый съезд судебных медиков Латвийской ССР: тезисы докладов. Рига, 1985.- С. 23-24.

21. Вальд А. Последовательный анализ: Пер. с англ. М.: Изд-во иностр. лит. - 1990. - 328 с.

22. Вандер М.Б. Понятие и значение микрочастиц в криминалистике //Правоведение.- 1998.-№2.- С.70-80.

23. Вермель И.Г. Сложные вопросы судебной медицины.СЮИ, 1989. -21-25с.

24. Вещественные доказательства: информационные технологии процессуального доказывания. Под ред В.Я.Колдина. М.Норма.2002. -57-бЗс.

25. Возможности иммуногистохимических методов исследования и их роль в онкоморфологии/Под ред. Г.Б. Ковальского. СПб., 1999.

26. Возможности компьютерной техники в судебной медицине и перспективы их использования/ Ю.И. Пиголкин, А.Х. Аманмурадов,

27. И.Н. Богомолова, Д.В. Богомолов //Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Новосибирск, 2002. вып. 7. -С.37-40.

28. Возрастная гистофизиология. Учебное пособие. Семченко В.В. и соавт. Омск, 2003 г. 65-76с.

29. Волков К.С., Пасечко Н.В. Ультраструктура клеток и тканей. — Тернополь: Укрмедкнига, 1997. -27-32с.

30. Волков К.С. Ультраструктура основных компонентов органов, систем организма. Тернополь: Укрмедкнига, 1999. — 35-39с.

31. Ганина К.П. Цитогенетическая диагностика в онкоморфологии.-Киев: Наукова думка, 1995.- 176 с.

32. Ганина К.П., Ясакова Н.Т. Пространственное расположение полового хроматина в ядре малигнизированной клетки // Структура и функция клеточного ядра.- Новосибирск, 1975.- 155 с.

33. Глизер С.Э. Тест полового хроматина при судебно-медицинском установлении половой принадлежности тканей животного происхождения на орудиях механической травмы: Автореф. дис. . канд. мед. наук.-Горький, 1992.

34. Глизер С.Э., Загрядская А.П., Федоровцева JI.C., Шалаев Н.Г. Использование теста полового хроматина при исследовании объектов судебно-медицинской экспертизы // Вопр. суд.-мед. экспертизы и криминалистики. №3.- Горький, 1998.- С.173-179.

35. Гуртовая C.B. Ошибки при проведении экспертиз вещественных доказательств и пути их устранения // Второй всесоюзный съезд судебных медиков: тезисы докладов. Москва-Минск, 1982. - С. 4546.

36. Гуцол A.A. Практическая морфометрия органов и тканей. -Томск: Изд-во ун-та, 1988. 134с.

37. Добровольский Г. А. Планирование медико-биологического эксперимента. Саратов: Изд-во Саратов. Ун-та, 1994. - 128с.

38. Дайпер Н., Смит Г. Прикладной регрессионный анализ: пер. с англ. М.: Статистика, 1973. - 392 с.

39. Еранов Н.В. Материалы к судебно-медицинскому исследованию некоторых вещественных следов механической травмы на предполагаемом орудии: Автореф. дис. . канд. мед. наук,- Горький, 1991.-22 с.

40. Загрядская А.П., Ревнитская JI.A. Выявление вагинальных клеток в следах-наложениях у подозреваемых в половых преступлениях. -В кн.: Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы живых лиц. М., 1996. С. 102-106

41. Загрядская А.П., Федоровцева JI.C. Выявление ядерного полового хроматина во влагалищных оболочках вырванных волос в зависимости от условий их содержания // Современные вопр. судебной медицины и экспертной практики.- Ижевск, 1970.- С.175-178.

42. Задачи совершенствования судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств/ И.Е.Панов, A.A. Солохин, C.B. Гуртовая (Москва) и др. // Судебно-медицинская экспертиза. М. -1985, №2, С. 25-29.

43. Икрамова Х.З. Алгоритм распознавания и диагностика. -Ташкент: Фан. 2002. - 220с.

44. Иммуноцитохимия и моноклональные антитела в онкогематологии Пинчука, Д.Ф. Глузмана, Кмев, Наук. Думка, 1990 /Под ред. В.П.

45. Исаков В.JI., Дрофа В.А., Матвеев В.В., Сукнов М.М. Метрологические вопросы разработки цитологических анализаторов для онкологической диагностики//Автоматизация цитологических исследований. Киев, 1995. С.45-50.

46. Исаков В.Л., Пинчук В.Г., Исакова Л.М. Современные методы автоматизации цитологических исследований. Киев: Наукова думка, 1998.-216с.

47. Капустин A.B. О морфологических особенностях полового хроматина в ядрах клеток различных тканей человека // Цитология,-1994.- №3.- С.291-298.

48. Капустин A.B. Морфологические половые различия в ядрах клеток и их использование в судебно-медицинской практике: Автореф. дис. . док. мед. наук.- М., 1965.

49. Капустин A.B. Судебно-медицинская диагностика пола по половым различиям в клетках.- М.: Медицина, 1999.- 160 с.

50. Капустин A.B., Исаев А.И. Некоторые актуальные вопросы организации и производства судебно-медицинских экспертиз/ A.B. Капустин, А.И. Исаев// Судебно-медицинская экспертиза. М. -2004,- № 1.-С. 7-10.

51. Колкутин В.В., Зосимов С.М., Пустовалов Л.М. Судебные экспертизы. М. 2001.

52. Кадыров Х.К., Антомонов Ю.Г. Синтез математических моделей биологических и медицинских систем. — Киев: Наукова думка, 1984. -223с.

53. Кисин М.В., Любинская С.И. Определение пола по высохшим пятнам крови // Суд.-мед. эксперт.- 1995.- №1.- С.26-29.

54. КобзеваН.В., Кузнецова М.Н. и Гуркин Ю.А. Гинекология детей и подростков, М., Медицина, 2001ю -32с.

55. Козинец Г.И., Котельников В.М. Автоматизация цитологических исследований в гематологии//Автоматизация цитологических исследований. — Киев, 1985. -С.58-59.

56. Кондратов А.П., Шестопалов Е.В. Основы физического эксперимента и математическая обработка результатов измерений.-М.: Атомиздат, 1997. -200с.

57. Королёва Е.И. Цитологическое исследование некоторых объектов судебно-медицинской экспертизы методом люминесцентной микроскопии: Автореф. дис. . канд. мед. наук.- М., 1983.

58. Косяков К.С. О половом хроматине // Успехи современной биологии.- 1991.- №1.- С.104-114.

59. Лакиза Б.С. Исследование околоядерного и внутриядерного хроматина в клетках белой крови с целью дифференциации полов // Мат. судебных медиков Казахстана.- Алма-Ата, 1998.- С.407-409.

60. Лакиза Б.С., Есипенко Л.Г. Цитологические исследования при экспертизах по поводу половых преступлений. В кН.: Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы живых лиц. М., 2003, с.107-109.

61. Лакин Г.Ф. Биометрия. -М.: Высшая школа, 1968.-284с.

62. Лекции по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии. Н.К.Пугачев, С.Л.Кузнецов. Смоленская мед. акад. и Московская мед. акад. им.Н.И. Сеченова.

63. Леонтюк A.C., Леонтюк Л.А., Сыскало А.И. Информационный анализ в морфологических исследованиях. -Минск: Наука и техника, 1981. -160с.

64. Лысенков А.Н. Математические методы планирования многофакторных медико-биологических экспериментов. — М.: Медицина. 1999. - 343с.

65. Любинская С.И. Диагностика половой принадлежности крови при судебно-медицинском исследовании вещественных доказательств: Автореф. дис. канд. биол. наук.- М., 1999.

66. Луцик О.Д., Иванова А.И., Кабак К.С. Гистология человека. -Львов: Мир, 1993. 52-63с.

67. Максимов Г.К., Синицын А.Н. Статистическое моделирование многомерных систем в медицине. М.: Медицина. - 1993. -144

68. Мардахиашвили Ш.И., Шац В.Я. Проблема полового хроматина в онкологии.- М.: Медицина, 1999.- 224 с.

69. Матова Е.Е. Судебно-медицинская оценка метода установления пола по структуре клеточного ядра (гистохимическое исследование) // Сб. тр. IV Всесоюзной научной конф. судебных медиков.- Рига, 2002.- С.435-438.

70. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./ Под. Ред. С. Херрингтон, Дж. Макги М.: Мир, 1999. - 558 с.

71. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Колесникова Л.В. Статистическое обеспечение оптимального объема выборки в морфологических исследованиях//Арх. Анат. 1981. - №10. — с.91-99.

72. Ольховик В.П. К вопросу об аутофлюоресценции эпителиальных клеток человека. В кН.: Вопросы судебно-медицинской экспертизы и криминалистики. Горький, 2001, с.26-28.

73. Ормерод М.Г., Имре С.Ф. Иммуногистохимия// Световая микроскопия в биологии. Методы/ Под ред. А.Лейси. Перевод с английского. -М.: Мир, 1992 С.148-194.

74. А.В.Пермяков, В.И.Витер, Н.И.Неволин. Судебно-медицинская гистология. Руководство для врачей. Ижевск-Екатеринбург. 2003. — с. 117-124.

75. Петрова A.C. Цитологическая диагностика опухолей и предопухолевых процессов. М.: Медицина, 1985. -296с.

76. Плохинский H.A. Алгоритмы биометрии. -М.: Изд-во МГУ, 1980. 150с.

77. Полак. Дж, Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. перевод с английского / Под ред. Н.Г. Хрущева -М.: Мир, 1987.

78. Преступность и право нарушении. Статистический сборник. М., 1996.

79. Приказ МЗ РСФСР № 35 от 27.02.91 «О дальнейшем развитии и совершенствовании судебно-медицинской экспертизы в РСФСР».

80. Приказ Минздрава РФ от 24 апреля 2003 г. N 161 "Об утверждении Инструкции по организации и производству экспертных исследований в бюро судебно-медицинской экспертизы".

81. Прилепская В.Н. Заболевания шейки матки, влагалища и вульвы. Москва, МЕДпресс, 1999.- 406с.

82. Прокофьева-Бельговская A.A. Хромосомы человека в норме // Основы цитогенетики человека.- М.: Медицина, 1999.- С.64-85

83. Рашевский H. Некоторые медицинские аспекты математической биологии: Пер. с англ. -М.: Медицина, 1996. 243с.

84. Рейблат М.А., Телянер И.Л. Устройство для регистрации «точечного счета»//Арх.пат. 1992. - №7. - с.79-80.

85. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Издание 2-е, дополненное и переработанное./ Под ред. C.B. Петрова и Н.Т. Райхлина. Казань, 2000. - 287 с.

86. Соколов Л.К. Математическое моделирование в медицине. М.: Медицина, 1994. - 175с.

87. Сопнев A.B., Нагорнов М.Н. // Судебно-медицинская экспертиза. М.-2003.-№4.-С. 42-45.

88. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. — М.: Медицина 1995.

89. Талер Т.Л. Анализ судебно-медицинских экспертиз текстильных волокон и элементов животных тканей, выявляемых на орудиях механической травмы и в подногтевом содержимом // Вопр. суд.-мед. экспертизы и криминалистики. №3.- Горький, 1998.- С.207-210.

90. Ташкэ К. Введение в количественную цитологическую морфологию. Бухарест: Изд-во акад. ССР, 1985. - 192с.

91. Теоретическая и математическая биология: Пер с англ. М.: Мир, 1988.-448с.

92. Томилин В.В. Основные проблемы деятельности судебно-медицинской службы Российской Федерации проблемы идентификации в теории и практике судебной медицины // Материалы 4-го Всероссийского съезда судебных медиков.1. Владимир, 1996. С. 3-4.

93. Федеральный закон "О государственной судебно-экспертной деятельности в Российской Федерации" от 31 мая 2001 г. № 73-Ф3.

94. Федоровцев A.JI. Диагностическое и идентификационное значение следов-наложений на орудиях травмы и некоторых других вещественных доказательствах: Дис. . докт. мед. наук.- М., 2003. -236 с.

95. Хохлов В.В. Судебная медицина, Руководство.- Смоленск. -2003.- С. 36.

96. Хэм А., Кормак Д., Гистология: пер. с англ. М.,: Мир, 1983 -126-168с.

97. Чайковский Ю.Б., Дельцова О.И., Геращенко С.Б. Практикум из гистологии, цитологии и эмбриологии. Киев - Ивано-Франковск, 2000. -25-27с.

98. Шабалова И.П. Цитологический атлас. Москва, 2001. 116с.

99. Шац В.Я., Капустин A.B. Судебно-медицинская диагностика пола по половым различиям в клетках // Суд.-мед. эксперт.- 1970.-№1.- С.54.

100. Юсуфов P.M., Кормазова Н.С. Общие принципы гистохимического исследрвания ферментов кераноцитов эпителиальных оболочек волосяных фолликулов и их прикладное значение для судебной медицины //Суд.-мед. эксперт.- 1999, №3. -36с.

101. Anderson Е., Beans H.W. Cytological observation on the fine structure of the guinea pig ovary with special reference to the oogonium,primary oocyte and associated follicle cells, J. Ultrastruct. Res., 3,432 (1990).

102. Austin G.R., Short R.V. (eds). Reproduction in Mammals. Books 1, Cambridge University Press, 1986.

103. Avery G.B., Hunt C.V. The fetal membranes as a barrier to transplantation immunity, Transplantation, 5,444 (1987).

104. Aron C., Ash G., Roos J. Triggering of ovulation by coitus in the rat, Int. Cytol.,20 (1997).

105. Baar J., Oort J. A manual of morphometry in diagnostic pathology. -Berlin, Heidelberd, New York, Tokyo; Springer — Verlag, 2003. 208p.

106. Balboni G.C. Histology of ovary. In: James V.H.T., Serio M. and Giusti G. (eds), Endocrine Function of Human Ovary, ProceeDing of the Serono Symposia, vo. 7, London, Academic Press, 1996.

107. Bartrelmens G.W. Histological studies of the menstruating muous membranes of the human uterus, Contrib. Embriol., 24, 141 (1993).

108. Beer A.E., Billingham R.E. The Immunobiology of Mammalian Reproduction, Englewood Cliffs, N.J. Prentice Hall, 1996.

109. Bertalanffy F/D., Lau C. Mitotic rates, reneval times and cytodynamics of the famel genital tract epithelia in rat, Acta Anat., 54, 39 (1999).

110. Blandau R.J. (ed.). The Biology 3a the Blastocyst, Chicago, Univercity of Chicago Press, 1991.

111. Bowing B.G. Implantation , Ann. N.Y. Acad. Sci., 75, 700 (1999).

112. Boyd J. D., Hamilton W. J. The nintrre cells of the pregnant human uterus, J. Obstet. Gynaecol. Br. Emp., 67 (1999).

113. Boyd J. D. Development of the human placenta in the first three months of gestation, J. Anat., 94, 297 (2000).

114. Boyd J. D. The Human Placenta, Cambrige, England, W. Heifer and Sons, 2002.

115. Bosman F.T., de Goij, M. Rousch. Quality control inimmunocytochemistry: Experiences with the oestrogen receptor assay// J. Clin. Pathol., 1999, Vol.45-P.120-124.

116. Claude P., Goodenough D. A. Fracture face of zonulae occludentes from tight and leaky epithelia, J. Cell Biol., 58, 391 (1973).

117. Cowell C.A., Wilson R. The ovary. Systemic Endocrinology, Hagerstown, Md., Harper and Row, 1993.

118. Crisp T.M., Dessouky D.A., Denys F.R. The fine structure of the human corpus luteum of early pregnancy and during the progrestational phase of the menstrual cycle, am. J. Anat., 127, 37 1990.

119. Davies P., Allison A. S., Cardella C.J. The relation between connective tissue cells and intercellular substances, including basement membranes, Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci., 271, 363 (1985).

120. Daron G. H. The arterial pattern of the tunica mucosa of the uterus in Macacus resus, Am. J. Anat., 58, 349 (1996).

121. Douglas W. H. J., Ripley R.C., Ellis R. A. Enzymatic digestion of desmosomes and hemidesmosomes plaques performed on ultrathin section, j. Cell boil., 44, 211(1990).

122. Edwards R. D., Howe C. W. S., Johnson M.H. (eds.). Immunobiology of Trophoblast, Cambrige, Cambrige University Press, 2004.

123. Enders A. S. Fine structure of anchoring villi of the human placenta in the first three monts of gestation, J. Anat., 94, 297 (1990).

124. Enders A. Observation on the fine structure of lutein cells, J. Cell Biol., 12, 101 (1992).

125. Farguhar M.G., Palade G.E. Junctional complexes in various epithelia, J. Cell Biol., 17,375 (1983).

126. Gilula N.B. Gap junctions and cell communication. In: Brincley B.R. and Porter K.R. (eds). International Cell Biology 1996-1997, New York, Rocfeller University Press, 1997.

127. Gu J. (Td) Analytical Morphology: Theory, Applications and Protocols.-Boston: Bukhauser, 1997. 264p.

128. Hafes E.S.E., Blandau R.J. The Mammalian Oviduct: Comparative Biology and Metodology, Chicago, University of Chicago Press, 1999.

129. Hertig A.T., Adams E.S. Studies on the human oocyte and its follicle, J. Cell. Biol., 34,647 (1997).

130. Hull B.E., Staehelin /IjoOio Functionsl significance of the variations in the geometrical organization of tight junction networks, J.Cell Biol, 68, 688 (1996).

131. Jones R.E. (ed). The Vertabrate ovary, New York, Plenum, 1988.

132. Kawamura A., Jr. (ed.) Fluorescent Antibody Techniques and Their Application, ed. 2, Baltimore, Univercity Park Press, 1987.

133. Keeter J.S., Pappas G.D. Gap junction in embryonic skeletal muscle, Anat. Rec., 175 (2), 355 (1993).

134. Kefalides N.A. Chemicals properties of basement membranes. Intern. Rev. Exp. Pathol., 10, 1 (1981).

135. King B. F., Tibbits F.D. The fine structure of chinchilla placenta, Am. J. Anat., 145,33 (1996).

136. Kirby D. R. S., Wood C. Embryos and antigens, Science J., 3, 56, December (1967).

137. Lentz T., Trincaus J. P. Differentiation of the junctional complex of surface cells, J. Cell Biol., 48, 255 (1991).

138. Loewentis W.R. Permeability of the junctional membrane channel. In: Brincley B.R. and Porter K.R. (eds.) International Cell Biology 19861987, New York, Rocfeller University Press, 1987.

139. Markee B.S. Interaction between hormones and nerve tissue, Sci Am., 235,48, Julay (1996).

140. McNutt N.S., Hershberg R.A., Weinstein R.S. Ultrastructure of intercellular junctions in adult and developing cardiac muscle, Am. J. Cardiol., 25, 169 (2002).

141. McNutt N.S., Hershberg R.A. The ultractructure of the nexus. A correlated thin-section and freeze-cleave study, J. Cell Biol., 26, 47 (2003).

142. Ohno S. Human oogenesis, Cytogenetics, 1, 42 (1992).

143. Overton J. Experimentsl manipulation of desmosome formation, J. Cell Biol., 56, 636 (2003).

144. Paine C. G. Obcervations on placental histology in normal and abnormal pregnancy, J. Obstet. Gynaecol. Br. Emp., 64 (5), 668 (1997)

145. Pappas G.D. Junctions between cells, Hoops. Prac. August, 2001.

146. Pincus G. Control of conception by hormonal steroids, Science, 153, 493 (1996).

147. Pierce G. B., Jr., Midgley A.R., Jr. The origin and function of human syncytiotrophoblastic giant cells, Am. J. Pathol., 43, 153 (1993).

148. Ramsey E.M. Vascular adaptions of the uterus to pregnancy. Ann. N. Y. Acad. Sci., 75, 726 (1999).

149. Rambourg A., Leblond Ck>3k> Staining of basement membraves and associated structures by periodic acid-Shiff and periodic acid -silver methenamine techniques, J. Ultrastruc. Rec., 20, 306 (1987).

150. Revel J. P. Morfological and chemical organization of gap junctions. Papers presented at Ninth International Congress on Electron Microsopy, Toronto, Microscopical Society of Canada, 1988.

151. Richardson G. S. Ovarian physiology. N. Engl. J. Med., 294, May 5, p. 1008; May 12, p. 1064; May 19, p. 1121 and May 26, p. 1183 (1986)

152. Ryan K. J. Peters Z., Kaiser J. Steroid formation by isolated and recombined ovarian granulose and thecal cells, J. Clin. Endocrinol. Metab., 28, 355 (1988).

153. Snyder F.F. Changes in the human oviduct during the menstrual cycle and pregrancy, Bull.Johns Hopkins Hosp., 35,141 (1984).

154. Staechelin L. A., Hull B.E. Junctions between living cells, Sci. Am., 238, 140, May, 1988.

155. Staechelin L. A. Structure and function of intercellular junctions, Int. Rev. Cytol., 39, 191 (2004).

156. Suzuki F., Nagano T. Development of tight junctions in the caput epididymal epithelium of the mouse, Dev. Biol., 63, 321 (2000).

157. Van Diest P.J., van Dam P., Hensen-Logmans S.C. et al. A scoring system for immunohistochemical staining: consensus report of the task forse for basic reaearch of the EORTS-GCCG //J/Clin. Pathol., 2002, Vol. 45-p.l20-124/

158. Van Blerkom J., Motta P. Cellular Basis of Mammalian Reproduction, Baltimor, UrbanandSchwarzenberg, 1988.

159. Weinctein R.S., McNutt N.S. Cell junctions, N. Engl. J. Med., 286, 521 (2003).

160. Yong A. Vascular architecture of the rat uterus, Proc. R. Soc. Edinb., 64,292 (2002).

161. Simmons R.L., Cruse V., McKay D. G. The immunological problem of pregrancy, Am. J. Obstet. Gynecol., 97, 218 (1997).

162. Strenberg L. A. Immunocytochemistry . Foundations of Immunology Series. Englewood Cliffs, Prentice-Hall, 1974.

163. Terzakis J. A. The ultrastructure of normal human first trimester placenta, J. Ultrastruct. Res., 9, 268 (1983).

164. Villee C. A. The placenta and Fetal Membranes, Baltimore, Williams and Wilkins, 1990.

165. Villee D. B. Development of endocrine function in the human placenta and fetus. N, Engl. Med., 281, 473 (1989).