Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность Candida albicans в системах с буккальными эпителиоцитами

Махрова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность Candida albicans в системах с буккальными эпителиоцитами
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность Candida albicans в системах с буккальными эпителиоцитами"

На правах рукописи

МАХРОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАКТОРЫ И УСЛОВИЯ, ВЛИЯЮЩИЕ НА АДГЕЗИВНУЮ АКТИВНОСТЬ CANDIDA ALBICANS B СИСТЕМАХ С БУККАЛЬНЫМИ ЭПИТЕЛИОЦИТАМИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия Министерства Здравоохранения Российской Федерации». Научный руководитель: Член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Министерства Здравоохранения Российской Федерации»

Защита диссертации состоится «18 » мая 2004 года в «_» часов на заседании диссертационного ученого совета Д 208.117.03 Государственного образовательного учреждения «Челябинская государственная медицинская академия Министерства Здравоохранения Российской Федерации», по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Государственного образовательного учреждения «Челябинская государственная медицинская академия Министерства Здравоохранения Российской Федерации». Автореферат разослан

Маянский Андрей Николаевич

Зурочка Александр Владимирович Туйгунов Марсель Маратович

ЛиврК12

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Последние годы ознаменовались заметным повышением интереса к эпителию слизистых оболочек. Это связано с признанием координирующей позиции мукозального эпителия в реакциях, обеспечивающих при взимодействии механизмов врожденного (неспецифического) и специфического иммунитета инициацию и стабилизацию воспалительных процессов слизистых оболочек в ответ на стимулирующие воздействия как эндогенной (цитокины и пр.) так и экзогенной природы, в частности в системе с микроорганизмами (Маянский А.Н., 2003; Хаитов М.Р., 2002; Domachowske J.B. et al., 2001; Godaly G. et al., 2001; Mattoli S., 2001; Mills P.R. et al., 1999; Walter M.J. et al., 2001). Отсюда, несомненный интерес вызывает изучение взаимоотношений между эпителиоцитами и такими патогенами как кандиды, поскольку кандидоз является результатом нарушения баланса между механизмами клиренса в системе мукозального эпителия и, условиями, обеспечивающими активное размножение и персистенцию грибов на слизистых оболочках. Актуальность данной темы сопряжена еще и с тем, что в настоящее время отмечается рост кандидозных оппортунистических инфекций среди населения, при этом основным патогеном является Candida albicans (Лесовой B.C. и др., 2003; Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В. 2001; Cannon R.D., 1999).

Адгезия С. albicans на эпителиоцитах является первым и обязательным этапом развития кандидоза. При этом, на реализацию адгезивного потенциала в системе "кандиды - эпителиоциты " могут оказывать влияние многие факторы, как со стороны кандид, так и со стороны организма хозяина. К последним, в частности, принадлежат секреторные продукты ротовой полости (антитела и другие гуморальные факторы, в том числе продуцируемые эпителиальными клетками) (Lee К.К. et al., 1996; Rodier M.H. et al., 2003).

Известно, что выход кандид за пределы очага первичной колонизации сопровождается выраженным воспалительным процессом, в развитие которого активно вовлечены фагоциты (Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001). При этом, одним из главных эффекторов воспалительной реакции

щие в системе опсонической кооперации с антителами и комплементом (Challa-combe S.J., 1994). Участие нейтрофильных продуктов во взаимоотношениях кандид с эпителиоцитами остается неизвестным.

Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета и воспалительной реакции в антикандидозной защите, механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на адгезию кандид изучены недостаточно. Кроме того, существуют противоречивые данные о роли нормальной микрофлоры в реализации адгезивного потенциала в системе «С. albi-саш-буккальные эпителиоциты» (Hogan D.A., Kolter R., 2002; Nair R.G., Sama-ranayakeL.P.,1996).

В связи с вышеизложенным, модель искусственной колонизации С. albicans на буккальных эпителиоцитах является простым и удобным способом оценки адгезивного потенциала кандид, позволяет оценить воздействие различных факторов мукозального иммунитета на адгезивные реакции в системе «макроорганизм-микроорганизм».

Цель исследования

Целью настоящего исследования было определение факторов, способных влиять на адгезию в системе «С. albicans- буккальные эпителиоциты».

Задачи исследования

1. Отработать стандартную тест-систему для изучения механизмов адгезии кандид на буккальном эпителии.

2. Изучить значение метаболической и цитоскелетной активности клеток в реализации адгезивного потенциала в системе «С. albicans- буккальные эпителиоциты».

3. Изучить влияние бактериальных метаболитов на адгезивные свойства Calbicans.

4. Определить адгезивную активность С. albicans в условиях взаимодействия с сывороточными факторами и нейтрофилами.

5. Изучить механизмы антиадгезивной активности секрета ротовой полости в системе «С. albicans - буккальные эпителиоциты».

6. Сравнить адгезивную активность Calbicans в реакциях с буккальными эпителиоцитами взрослых- и детей и влияние на нее нормальной микрофлоры.

Научная новизна исследования

Установлено, что буккальные эпителиоциты играют активную роль во взаимоотношениях с кандидами. Адгезия С. albicans зависит от метаболизма, синтеза белка и реакций в цитоскелетной системе буккальных клеток. Определен вклад различных компонентов мукозального иммунитета (специфические и неспецифические факторы) и сывороточных продуктов (антитела, комплемент и другие неспецифические факторы) в реализации адгезивного потенциала в системе «С. alb/cans—буккальные эпителиоциты». Определено влияние нейтрофильных компонентов и микробных метаболитов различных штаммов S. aureus и 5'. epidcrmidis на реализацию адгезивного потенциала С. albicans. Исследована зависимость между степенью контаминации буккального эпителия нормальной микрофлорой у взрослых и детей и способностью C.albicans колонизировать буккальные эпителиоциты. Изучено влияние пептидогликано-полисахаридного комплекса Согупе-bacterium diphtheria на взаимодействие кандид с буккальными клетками.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Отработана стандартная тест-система для изучения кандидозной адгезии, что дает возможность целенаправленного изучения различных факторов, влияющих на адгезивный процесс. Создана коллекция бактериальных штаммов с известными параметрами адгезии на буккальных эпителиоцитах здоровых доноров. Определены факторы (компоненты ротовой жидкости, сыворотки, физические воздействия) способные влиять на адгезию в системе «С. albicans- буккальные эпите-лиоциты». Данные об антиадгезивных свойствах изученных компонентах могут использоваться при выборе адекватной стратегии для борьбы с кандидозами в медицинской практике. Изменение адгезивной активности кандид, в частности ее снижение под действием ингибирующих факторов, позволит вносить коррективы в комплексное лечение кандидозов. Информация о влиянии бактериальных метаболитов и нормальной микрофлоры буккального эпителия у взрослых и детей на адгезивные реакции С. albicans в системах с буккальными эпителиоцитами позволяет дополнить сведения о механизмах взаимооотношения кандид с оральным микро-биоцинозом в норме и при патологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Буккальные клетки занимают активную позицию во взаимоотношениях с кандидами. Об этом говорит снижение адгезии С. albicans при торможении мета-болитной и цитоскелетной деятельности буккальных эпителиоцитов.

2. Продукты метаболизма S. aureus оказывают негативное влияние на адгезию С. albicans, вызывая необратимое торможение их взаимодействия с буккаль-ными клетками.

3. Нормальные антитела вносят существенный вклад в антиадгезивный эффект сыворотки и слюны при взаимодействии С. albicans с буккальным эпителием.

4. В сыворотке и слюне содержатся температурозависимые факторы, вызывающие необратимые изменения адгезинов С. albicans.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на Первом Съезде Микологов России «Современная микология в России» (Москва, 2002), на VIII сессии молодых ученых (г. Дзержинск, 2003), на Первом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003), на IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2003), на научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), на Втором Всероссийском Конгрессе по Медицинской Микологии (Москва, 2004). По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертационной работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения и выводов. Текст изложен на 132 страницах машинописного текста, работа иллюстрирована 31 рисунком и 31 таблицей. Указатель литературы содержит 207 источников, из них 164 зарубежных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования В работе использовали штаммы из коллекций кафедры микробиологии и иммунологии Нижегородской государственной медицинской академии (S. aureus 86M,

S.aureus 66M, S.aureus 7H, S.aureus 1971, S.epidermidis 51-1, S.epidermidis 310-2, S.epidermidis 178), НИИ гигиены и профпатологии МЗ РФ (С. albicans 601). Свеже-выделенные штаммы С. albicans получали из НИИ детской гастоэнтерологии.

Исследованы более 1000 препаратов буккального эпителия, слюна и сыворотка 415 доноров и нейтрофилы 16 доноров. Проведено 59 экспериментов с использованием метода люминол-опосредованной хемилюминесценции нейтрофилов.

Культуру С. albicans во всех экспериментах получали в дрожжевой фазе на агаре Сабуро (НИИ по изготовлению питательных сред, г. Махачкала) (24 часа, 37°С). Посевы смывали, отмывали десятикратным объемом забуференного физиологического раствора (ЗФР), удаляли клеточные агрегаты центрифугированием (40 g, 2 мин) и ресуспендировали, в зависимости от эксперимента, в ЗФР в концентрации 107 - 109 клеток/мл. Концентрацию кандид определяли методом спектрофото-метрии при Х.=540 нм.

Получение буккальных эпителиоцитов осуществляли от здоровых, не курящих доноров 18-20 лет, утром, натощак, с внутренней поверхности щеки, дважды отмывали ЗФР (40g ,5 мин) и готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл.

Оценку адгезии в системе «Calbicans- буккальные эпителиоциты» проводили следующим образом: равные объемы (по 0,5 мл) взвеси эпителиоцитов и кандид инкубировали в течение 30 мин при 37°С в растворе Хенкса без фенолового красного, встряхивая каждые 5 мин. Эпителиоциты трехкратно отмывали ЗФР от не прикрепившихся кандид (40g, 5 мин). Из осадка клеток готовили мазок, который после фиксации этанол-эфирной смесью окрашивали 0,25% раствором азура А. Определяли индекс адгезии, т.е. среднее количество кандид в пересчете на один эпителиоцит (учитывали 100 клеток)

Анализ прочности адгезивных контактов оценивали согласно А.Н. Маян-скому с соавт.(2001): наслаивали эпителиоциты с прикрепившимися кандидами (1 мл) на фиколл-верографин с плотностью 1,077г/см2 (2мл) и центрифугировали при 1000g, 10 мин. Из отмытого клеточного осадка (прошедшие сквозь градиент эпите-лиоциты) делали мазок (опыт), подсчитывали количество адгезированных кандид на 100 эпителиоцитов в опытном и контрольном мазках. Результат (процент проч-ноадгезированных кандид) определяли по формуле:

количество адгезированных кандид в пересчете на один эпителиоцит до центрифугирования через фиколл - ве

рографин; X опыт - количество адгезированных кандид в пересчете на один эпите-лиоцит после центрифугирования через фиколл-верографин.

Влияние метаболической активности буккальных эпителиоцитов на адгезию кайл ил определяли путем совместного инкубирования смеси эпителиоцитов и кандид при температуре 37°С и 4°С. Гликолиз подавляли при помощи фторида натрия («Sigma", США). Для этого буккальные эпителиоциты преинкубировали с фторидом натрия - 200мМ, 15мин, 37°С. Синтез белка буккальных эпителиоцитов ингибировали циклогексимидом («Sigma", США) - 16 мкг/мл, 30 мин, 37°С.

Влияние активности элементов цитоскелета на адгезию кандид изучали с использованием колхицина ("Sigma", США) для ингибирования активности микротрубочек (Wunder D. et al., 2003) и раствора цитохалазина В для подавления активности микрофиламентов ("Sigma", США) в концентрации 1 мкг/мл в 3<DP(Simon L., 2001). Буккальные эпителиоциты обрабатывали колхицином или цитохалази-ном В (37° С, ЗОмин) и затем инкубировали с кандидами.

Влияние продуктов метаболизма стафилококка на адгезию кандид оценивали после совместного инкубирования в течение 1 часа при 37°С в равных объемах (по 2 мл) С. albicans 601 (107 кл/мл) с супернатантами стафилококковых культур, предварительно полученных на среде ДМЕМ (ГУЛ ИПВЭ, Москва) (24 часа, 37°С) и отделенных от бактериальных клеток центрифугированием при 1000g в течение 15 минут. В контрольных пробах кандиды инкубировали в ДМЕМ с рН, соответствующей экспериментальным пробам. Кандиды отмывали трижды ЗФР от среды и метаболитов, удаляли клеточные агрегаты цетрифугированием (40g, 2 мин) и доводили до концентрации 107 кл/мл. Жизнеспособность культур С. albi-cans после обработки метаболитами стафилококка определяли следующим образом. Готовили серию разведений (от 10"4 до 10'7) из инкубационной смеси кандид с супернатантами стафилококков. Из каждого разведения делали высев (по 0,05 мл) на агар Сабуро (ННПЦ ГИЛ, Оболенск) по методу Дригальского. В контроле использовали суспензию интактных кандид в аналогичных разведениях. После инкубации (24 ч, 37°С), подсчитывали количество КОЕ/мл в опытных и контрольных образцах.

Изучение влияния метаболитов S.aureus на адгезивный потенциал бук-кал ьных эпителиоцитов проводили обрабатывая последние супернатантами стафилококка (60 мин, 37°С). Контроль жизнеспособности буккальных эпителиоцитов до и после эксперимента определяли трипановым тестом. Эпителиоциты (интактные и обработанные бактериальными метаболитами) трижды отмывали ЗФР, инкубировали с интактными кандидами и определяли индекс адгезии по методу, описанному выше.

Полиморфноядерные лейкоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования через градиент фиколл-верографина согласно рекомендациям И.С. Подосиновикова и др. (1981) с последующим лизисом эритроцитов ледяным раствором хлорида аммония.

Экстракцию нейтрофилов проводили 0,1% тритоном Х-100 (22°С, 20мин), экстракт стандартизовали по миелопероксидазной активности (МПО) (Suzuki К. et al., 1983) Уровень активности МПО оценивали следующим образом: низкий до 0,1; средний 0,1-0,5; высокий > 0,5; в наших опытах использовали экстракты с высоким (0,8-0,9) уровнем МПО.

Влияние экстракта нейтрофилов на адгезию кандид изучали следующим образом: 0,5 мл тритонового экстракта нейтрофилов инкубировали с осадком С. albicans 601 (0,5 мл, ЮЛкл/мл). После инкубации в течение 30 мин при 37°С клетки кандид отмывали и проверяли на адгезивную активность в системе с буккаль-ными клетками.

Влияние секрета ротовой полости (слюны) на адгезию кандид изучали, используя пул слюны, полученный от 5-7 здоровых доноров 18-25 лет. Слюну собирали утром натощак и осветляли центрифугированием (4000g, 60 мин, 4°С). Осадок C.albicans 601 (107 кл) и слюну (0,5 мл) смешивали и инкубировали 30 мин при 37°С или 4°С. В контроле вместо слюны использовали ЗФР. После отмывания десятикратным объемом кандиды доводили до концентрации 107 кл/мл и использовали для изучения адгезивных реакций с буккальными клетками (см. выше). Для удаления антител слюну истощали микробной взвесью в течение 30 мин при 4°С (для исключения возможного участия комплемента (Маянский А.Н. с соавт., 1980)); контроль полноты истощения проводили в реакции энзиммеченных анти-

тел (РЭМА). Минимальная истощающая концентрация кандид была подобрана в серии предварительных опытов; она составляла 109 клеток на 0,5 мл слюны. Истощенную слюну использовали для изучения влияния на адгезию кандид.

Оценку влияния муцина (Type I-S, «Sigma», США 1мг/мл) на адгезию в системе проводили аналогично экспериментам со слюной.

Влияние сыворотки крови на адгезию кандид изучали с использованием свежего пула сыворотки от 10-15 доноров, добавляя его в объеме 0,5 мл к осадку кандид (107 клеток) инкубировали при 37°С, 30 мин, отмывали десятикратным объемом ЗФР и после инкубации с буккальными эпителиоцитами оценивали результат. Удаление сывороточных антител проводили микробной взвесью под контролем РЭМА в режиме, исключающем активацию комплемента. Для этого 0,5 мл сыворотки инкубировали 30 мин при 4°С с центрифугатом микробных клеток (109 клеток) и после центрифугирования (4000g, 20 мин) использовали в опытах.

Изучение влияния комплемента на адгезивные реакции кандид проводили с истощенной сывороткой, добавляя ингибиторы, полностью выключавшие комплемент (0,01 М этилендиаминтетраацетат (ЭДТА)) или влиявшие на его классический путь (0,01 М MgCl2—0,01 М этиленгликольтетраацетат (ЭГТА)). Об активности комплемента в истощенной сыворотке судили по опсонической активности в отношении зимозана (люминолзависимая хемилюминесценция (ХЛ) нейтрофилов). Измерение ХЛ проводили на жидкостно-стинцилляционном счетчике «Бета-2».

Удаление нековаленто-связанных компонентов проводили после инкубации кандид (107 кл/мл) с исследуемыми субстратами и отмывания десятикратным объемом ЗФР, путем смешивания в равных объемах кандид (0,5 мл) с 0,1% водным раствором додецилсульфата натрия (ДЦС) (Kozel T. R, 1987), затем отмывали и ресуспендировали в ЗФР. Контролем служили интактные кандиды, обработанные ДЦС. Для удаления несвязанных компонентов с поверхности эпителиоцитов (106 кл/мл) использовали аналогичный режим обработки.

Антитела к С. alb/cans определяли в коммерческом иммуноглобулине («ИМБИО», Н.Новгород), нормальной сыворотке и секрете ротовой полости человека. Все опыты проведены с конъюгированными анти-IgG,- IgA и -IgM антитела-

ми (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород). Использовали разведения конъюгатов в диапозоне от 1:100 до 1:300 в ЗФР-Т, результат оценивали по люми-нолзависимой хемилюминесценции на жидкостно-стинцилляционном счетчике «Бета-2» (Астафьев ДГ, 1987).

Данные, обработанные методами вариационной статистики, выражали в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М± m). Достоверность различий оценивали при помощи непараметрических критериев Вилкоксона, Ван дер Вардена. При проведении множественных сравнений вводили поправку Бонферро-ни. Результаты исследования обрабатывались на ПЭВМ с использованием пакета прикладных программ «STADIA 6.3».

Результаты и обсуждение

Показатели адгезии у взрослых (11,8±0,91), существенно не отличались от показателей адгезии у детей 6-8 лет (15,7±0,92) по сравнению с нормальной микрофлорой буккального эпителия, которая была в три раза выше в детском возрасте (14,3±0,99 у взрослых и 42,9±2,45 у детей (р>0,05)). Эти данные подтверждают возрастные различия естественной колонизации буккальных клеток (Vaahtonieni

L.H.,1992; Cox F., 1983). Они не затрагивают их чувствительности к искусственному заселению чужой микрофлорой, в частности грибами, экологически эктопич-ными для данного биотопа. Отсутствие корреляций между уровнем естественной и искусственной колонизации в обеих возрастных категориях свидетельствует о том, что состояние нормальной микрофлоры не влияет на адгезивные взаимоотношения в системе C.albicans- буккальные эпителиоциты.

Влияние метаболической и цитоскелетной • активности буккальных эпителиоцитов на адгезию C.albicans. В серии опытов нами прослежено влияние метаболической активности буккальных эпителиоцитов на адгезию кандид. Опыты проводили с выключенным метаболизмом буккальных клеток (4°С), с блокадой их энергетического обмена (подавление гликолиза фторидом натрия) и синтеза белка (циклогексимид), при выключении реакций цитоскелета (опыты с колхицином и цитохалазином В). Полученные данные говорят о значении активной деятельности эпителиальных клеток в адгезивных реакциях С. albicans. Об этом свидетельствуют наши эксперименты, демонстрирующие изменение показателя адгезии на холоду, при торможении гликолиза и подавлении синтеза белка. При 4°С наблюдалось снижение прикрепления - кандид на буккальных эпителиоцитах во всех сериях экспериментов в 2,0±0,3 раза (р=0,0001), по сравнению с выраженностью адгезивных реакций при 37°С. Преинкубация буккальных эпителиоцитов с фторидом натрия приводила к снижению показателей адгезии кандид в 2,14±0,11 раза (р=0,0001), обработка буккального эпителия циклогексимидом (16мкг/мл) приводила к снижению адгезивной активности кандид до уровня 36,63±1,9%; обработка самих кандид до уровня 42,1±5,2%.

Обработка колхицином буккальных клеток приводит к снижению адгезивной активности живых кандид при последующей совместной инкубации до уровня 60,3±2,2% (р=0,0019) и до уровня 85,8+2,8% (р=0,0019) при инкубации с убитыми кандидами.

Обработка цитохалазином В буккальных клеток приводит к снижению адгезивной активности живых кандид при последующей совместной инкубации до уровня 57,9±2,9% и до уровня 90,7 ±4,5% при инкубации с убитыми кандидами

(р=0,001). Таким образом, опыты с ингибиторами цитоскелета позволили установить, что одной из точек приложения активного метаболизма буккальных клеток являются реакции в системах микрофиламентов и микротрубочек.

В целом, адгезия кандид на буккальных клетках складывается из двух механизмов. Один из них не зависит от уровня метаболической и цитоскелетной активности эпителиоцитов и отвечает примерно за половину реакции. Можно думать, что это пассивный механизм, который не связан с рецепторами кандид, а определяется гидрофобными, вандервальсовыми и электростатическими взаимодействиями. Второй механизм является результатом метаболически активных клеток. Это совокупность реакций, отвечающих за взаимоотношения живых клеток, которые лучше всего проявляются в физиологичных условиях.

Влияние препарата «Кодивак» на адгезивную активность C.albicans.

При выяснении природы адгезивных рецепторов буккальных клеток нас заинтересовал вопрос об участии в этом процессе так называемых Toll-рецепторов эпите-лиоциов. Известно, что различные Toll-молекулы связывают бактериальные липопо-лисахариды, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты, липопротеины, гликолипиды, флагеллин, ДНК, фунгальные маннаны, вирусные белки и суперантигены (Underbill D.M., Ozinscy A., 2002). Для многих го Toll-рецепторов характерен структурный консерватизм, предполагающий общность рекогносцировочных реакций.

О возможном значении Toll-рецепторов во взаимодействии кандид с бук-кальными клетками судили по способности пептидополисахаридного комплекса С. diphtheriae (который предположительно мог связываться с TLR-2 и тем самым блокировать их) тормозить адгезию кандид. Препарат «кодивак» (любезно предоставлен Е.А. Шмелевой, Московский НИИЭМ им. Габричевского) в концентрации 3 мг/мл смешивали в равных объемах с буккальными клетками и после инкубации (30 мин, 37°С) проверяли их адгезивную активность с кандидами. Результаты не выявили какого-либо эффекта, что можно расценить как отсутствие влияния поверхностных TLR-структур буккальных клеток на адгезивные реакции кандид. Дальнейшие исследования должны подтвердить это в опытах с более специфичными реагентами, такими как моноклональные антитела против различных типов TLR.

Влияние продуктов стафилококков на адгезивные реакции в системе «Galbicans — буккальные эпителиоциты» Кандидоз часто протекает как смешанная инфекция (Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В., 2001). Поэтому определенное значение имеет информация о влиянии на адгезивные контакты с кандидами продуктов жизнедеятельности других микроорганизмов, которые являются облигат-ными или факультативными представителями нормальной микрофлоры человека (Bagg J., Silverwood R.W., 1986; Holmes A.R. et al., 1995; Holmes A.R. et al., 1996). Нами изучено влияние на взаимоотношения кандид с буккальными клетками метаболитов золотистого и эпидермального стафилококка, которые могут подключаться к процессу на этапах мукозального и кожного кандидозов.

Метаболиты S. aureus оказывали негативное влияние на взаимодействие кандид с буккальными эпителиоцитами. При инкубации (60 мин, 37°С) С. albicans с супернатантами суточных культур стафилококка таким действием обладали все четыре штамма золотистого стафилококка. Максимальное снижение адгезии (в 2,59 ± 0,07 раз) наблюдалось для штамма 86М. Эффект был необратимым (обработка 0,1% раствором додецилсульфата натрия не возвращала адгезивной активности С. albicans) и предположительно объяснялся ферментативным действием секреторных продуктов золотистого стафилококка на адгезины кандид. Об этом говорило ослабление на 20-30 % адгезивной активности кандид при их обработке проназой (бактериальной протеазой) (Fluka, Швейцария). Обработка буккальных клеток метаболитами S. aureus не влияла на жизнеспособность и адгезию кандид.

В тех же условиях S. epidermidis был не активен. Это подтверждает особенности метаболитного профиля золотистого и эпидермального стафилококков (Акатов Ф.К., Зуева B.C., 1983; Маянская И.В. и соавт., 1987), определяющие их разные способности вмешиваться в инфекционные процессы, инициируемые другими микроорганизмами, в частности в адгезивные реакции кандид.

Влияние продуктов нейтрофилов на взаимодействие С. albicans с эпителиальными клетками Развитие кандидоза сопряжено с острым воспалением, главным эффектором которого служат нейтрофилы (Vazquez-Torres A., Balish E., 1997). Их продукты содержат ферменты, активные формы кислорода и катионные

белки, оказывающие разнообразные эффекты на ткани хозяина и их взаимоотношения с микроорганизмами (МаянскийА.Н., Маянский Д.Н., 1989; Murav*ev RA. et al., 2003). В литературе отсутствуют данные о влиянии нейтрофильных продуктов на реакции кандид в системах с эпителиоцитами. Между тем это может иметь большое значение в эволюции кандидозного процесса, в частности при оральном кандидозе. В связи с этим нами изучено влияние экстракта нейтрофилов на адгезивную активность C.albicansB реакциях с буккальными клетками.

Экстракт, полученный путем обработки нейтрофилов 0,1% тритоном Х-100 и стандартизованный по миелопероксидазе, инкубировали (0,5 мл, 30 мин, 37° С) с осадком С. albicans (107 клеток) и после отмывания оценивали способность кандид к адгезивным реакциям с буккальными клетками. Обработка экстрактом нейтро-филов (концентрация клеток 30 х 106 кл/мл) вызывала пороговое повышение уровня адгезии кандид до 136,5±8,0% (р=0,05).

Одновременно тем же экстрактом нейтрофилов обрабатывали СЗЬ-сефадекс G50, Fine (Pharmacia, Швеция), полученный путем опсонизации пулом сывороток здоровых доноров (Плескова С.Н., Маянский А.Н., 2000). Нейтрофильные экстракты вызывали дозозависимое снижение показателей СЗЬ-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса - от 29,9±1,6% (концентрация экстрагируемых нейтрофилов 13,5*106/мл) до 9,7±0,2% (30-106/мл).

Таким образом, экстракт нейтрофилов, который содержит протеолитические ферменты, действующие на опсонический комплекс альтернативного каскада комплемента, не оказывает ингибирующего эффекта на адгезивную активность кандид в системе с буккальными клетками. Более того, продукты нейтрофилов вызывали усиление (на уровне достоверности) адгезии кандид, которое могло быть результатом изменения конформационной структуры адгезинов. Это говорит о том, что ад-гезины кандид были нечувствительны к нейтральным протеазам, входящим в состав гранул нейтрофилов. Это отличается от данных, полученных в опытах с золотистым стафилококком и проназой, где наблюдалось достоверное ослабление адгезивной активности кандид.

Влияние сывороточных факторов на адгезивную активность С. albicans в реакциях с буккальными эпителиоцитами Воспаление является обязательным атрибутом кандидоза (Сергеев А. Ю., Сергеев Ю.В, 2001). Поэтому сывороточный экссудат, представляя неотъемлемый компонент кандидозного процесса, может существенно влиять на его развитие, включая адгезивные реакции кандид в системах с эпителием. Гуморальные факторы, принимающие участие в воспалении, включают антитела, комплемент и другие элементы, способствующие или препятствующие реакции. Это определило круг задач, связанных с изучением влияния гуморальных факторов сыворотки и слюны на адгезию кандид в реакциях с буккальным эпителием.

При отработке методики определения влияния противокандидозных антител, мы ориентировались на хемилюминесцентный метод иммуноферментного анализа (Д.Г. Астафьев, 1987). Для гашения неспецифических реакций было решено использовать 0,05 % раствор твина-2 с 2 % альбумином и желатином, однако сделать этого не удалось из-за взаимодействия кандид, прежде всего с желатином, которое препятствует проявлению их серологической и адгезивной активности. Эффект желатина носит обратимый характер и может быть ликвидирован обработкой кандид 0,1 % раствором ДДС. Это дополняет данные литературы о том, что кандиды способны связывать разнообразные сывороточные и тканевые факторы, включая коллаген (желатин является продуктом денатурации коллагена) (Murav'ev RA, et al., 2003). Результаты наших опытов говорят о том, что такое связывание влияет на иммунологические и адгезивные параметры кандид в реакциях с нормальными антителами. Учитывая эти данные, все дальнейшие эксперименты с сывороткой и слюной проводили в солевой среде с добавлением 0,05 % твина-2 без белковых ингибиторов.

Полученные данные подтвердили то, что у практически здоровых людей имеются антикандидозные антитела, которые улавливаются иммуноферментой реакцией. Показатели для IgG-антител (соотношение опыт/контроль) составили 2,55 ± 0,5 (140 899±7239 / 55 223±2714), значения для IgA-антител были примерно такими же - 2,9 ± 0,7 (238 698±7239 / 79 578±5097), содержание IgM-антител было

меньше 1,9 ± 0,4 (91 227±789 / 46 844±368). Специфичность результатов была доказана опытами с сывороткой, истощенной 30 минут при 37°С, и в условиях, исключающих активацию комплемента (4°С, 30 мин) (Маянский А.Н., с соавт.1982). После истощения в каждом из этих режимов показатели со всеми конъюгатами (анти-IgG, -IgA, -IgM) были на уровне негативного контроля (р = 0,135).

Пул сыворотки вызывал снижение адгезии кандид в 2,7-4,5 раз (3,6 ± 0,18). После обработки кандид сывороткой, истощенной (4°С, 30 мин) микробной взвесью С. albicans, наблюдали снижение антиадгезивного эффекта в 1,6-2,4 раз (2,0 ± 0,1; р < 0,05). Это говорит о том, что антитела вносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, отвечая примерно за 22 % антиадгезивного эффекта.

Около 78% антиадгезивного эффекта приходилось на факторы, не имеющие отношения к антителам. Для изучения природы этих факторов проводили предварительную обработку кандид при 3 7в Си4°С сывороткой, истощенной по антителам. После их отмывания сравнивали активность в адгезивных реакциях с бук-кальными клетками относительно опыта с торможением адгезии цельной (неистощенной) сывороткой. При 4°С антиадгезивный эффект истощенной сыворотки был минимальным - 12,3 ± 1,4 %, против 55,8 ± 2,2 % при 37°С (р =0,002). Для цельной сыворотки те же показатели были гораздо выше: 54,6 ± 2,7 % (4°С) и 73,5 ± 1,4 % (37°С) (р <0,005). Обработка 0,1 % ДЦС не восстанавливала исходного адгезивного уровня С. alb/cans. Это говорило о том, что в сыворотке содержатся факторы, действие которых на кандиды проявляется, во-первых, только при 37°С и, во-вторых, не экранировано нековалентно связанными молекулами.

Можно было думать, что такой эффект оказывают факторы системы комплемента (С4Ь, СЗЬ), которые в процессе активации подвергаются ковалентному связыванию с объектами. Для изучения влияния комплемента проведены опыты с пулами сыворотки, истощенной кандидами (4°С, 30 мин). Активность комплемента в истощенных сыворотках подтверждена опытами с опсонизацией зимозана в люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов человека. Для исключения влияния классического или альтернативного каскадов комплемента в инкуба-

ционную смесь добавляли 0,01 М ЭДТА (этилендиаминтетраацетата) или сочетание 0,01 М MgCl -ЭГТА (этиленгликольтетраацетата). Установлено, что комплемент не влиял на адгезивную активность кандид. Можно было думать, что темпе-ратурозависимые компоненты сыворотки, оказывающие антиадгезивное действие, относятся к другим факторам (ферментам?!), которые влияют на поверхностные компоненты кандид и структурно модифицируют адгезины последних.

Влияние секрета ротовой полости на адгезивные реакции в системе С. albicans-буккалшые эпителиоциты Известно, что адгезия С. albicans на буквальных эпителиоцитах зависит от факторов слюны (Johansson I et al., 2000; San Millan et al., 2000; Tanida Т., Okamoto Т., 2003). Слюна способна препятствовать адгезии микроорганизмов на эпителии, но механизмы этого эффекта изучены недостаточно (Cannon RD , Chaffin W.L., 1995; Maza J.L. et al., 2002). Так как секрет ротовой полости представляет собой многокомпонентную систему, можно ожидать, что антиадгезивным действием будут обладать различные компоненты слюны, в частности антитела (Hagewald S. et al., 2002; Lee K.K. et al., 1996; Lin A.L. et al., 1999; Moragues M.D. et al., 2003; Rodier MR et al., 2003), муцины (Almstahl A. et al., 2001; Liu В et al., 2000; Wozniak К L. et al, 2002), катионные белки (Fitgerald D H. et al., 2003; Rus-sien A.L. et al., 2003; Yanying Xu et al., 1999). Кроме того, в слюне содержится большое количество ферментов (Quinn M.O. et al., 1994; Woods D.E. et al., 1981), способных модифицировать адгезивный аппарат кандид и других микроорганизмов.

Нами исследовано влияние нормальной слюны и ее отдельных факторов (специфических и неспецифических) на показатели адгезивных взаимодействий между С. albicans и буккальными клетками. Цельная слюна здоровых взрослых доноров вызывала снижение адгезии кандид в среднем в 3,1 + 0,29 раз; остаточный уровень адгезивной активности составлял 36,0 + 3,05 %. Это говорило о том, что адгезия кандид включает два компонента, один из которых блокируется слюной, а другой не подвержен ее влиянию. Данное обстоятельство согласуется с информацией о неоднородности адгезивного субстрата кандид. В нем участвуют многие поверхностные антигены, которые, учитывая представительство С. albicans в нормальной микрофлоре, должны индуцировать образование антител. Можно было

рассчитывать на их участие в антиадгезивных реакциях, в частности в системе с буккальными клетками.

Действительно, методом иммуноферментного анализа в слюне нормальных доноров были найдены антикандидозные антитела. Максимальные показатели наблюдались для IgG-антител (соотношение опыт/контроль - 12,6 +1,2). Значения для IgA-антител были примерно такими же, но из-за более высоких цифр в контроле показатели оказались ниже (4,0 +1,3). Содержание IgM-ашшел было меньше - 3,3 + 0,9.

После обработки кандид слюной, предварительно истощенной по антикан-дидозным антителам, наблюдали снижение адгезивного эффекта в 1,6 ± 0,2 раз (р < 0,05) (цельная слюна вызывала снижение адгезии кандид в 3,1 + 0,29 раз). Это говорит о том, что антитела сносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, отвечая за 40 % антиадгезивного эффекта.

В серии экспериментов кандиды предварительно обрабатывали при 4°С истощенной слюной и затем изучали их адгезивную активность при добавлении бук-кальных клеток. Параллельно такую же операцию проводили с цельной слюной. Антиадгезивный эффект при 4°С был минимальным - 9,1 ± 0,01 против 23,4 ± 3,4 при 37°С (р < 0,05). В отличие от этого для цельной слюны снижение показателей было недостоверным (р > 0,05). Обработка 0,1 % ДЦС не приводила к восстановлению исходного адгезивного уровня кандид.

Это говорило о том, что, подобно сыворотке крови, в слюне имеются факторы, действие которых на кандиды проявляется, во-первых, только при 37°С и, во-вторых, не экранируется нековалентно связанными молекулами.

эпителий, что не совпадает с нашими данными о 0,1 % ДДС-устойчивости антиадгезивного эффекта истощенной слюны. Полученные данные говорят о том, что температурозависимые антиадгезины, присутствовавшие в «безантительной» слюне, не имеют отношения к муцину. Предположительно речь идет о факторах ферментной природы, способных вызывать структурные изменения поверхностных компонентов кандид.

Выводы

1. Определены условия и режим для изучения адгезивных и антиадгезивных реакций С. albicans в системе с буккальными эпителиоцитами человека. Установлено отсутствие существенных различий между адгезией кандид на взрослых и детских (6-8 лет) эпителиальных клетках, несмотря на то, что детские эпителиоци-ты отличались значительно более высоким уровнем естественной колонизации.

2. Адгезия в системе «С albicans- буккальные клетки» зависит от метаболической активности эпителиоцитов, синтеза белка, реакций микротрубочек и микрофиламентов.

3. Пептидогликан - полисахаридный комплекс Corynebacterium diphtheria (ко-дивак) не оказывал влияния на взаимодействия кандид с буккальными клетками. Это можно расценить как отсутствие влияния поверхностных гомологичных типов толльпо-добных рецепторов буккальных эпителиоцитов на адгезивные реакции С. albicans.

4. Адгезия кандид на буккальных эпителиоцитах находится под негативным контролем продуктов микробного метаболизма. Обработка С. albicans 601 (но не буккалъных клеток) супернатантами культур S. aurcus сопровождалась необратимым снижением показателей адгезии; продукты S. cpidermidis были неактивны.

5. Экстракты нейтрофилов, обладающие способностью разрушать СЗЬ -опсонины, лишены антиадгезивной активности в реакциях между кандидами и эпителиальными клетками.

6. Нормальная сыворотка крови человека обладает двумя группами факторов, тормозящих взаимодействие кандид с буккальными клетками. К первой из них относятся антитела, с которыми связано около 22 % антиадгезивного эффекта (по отношению к С. albicans 601). Другая часть представлена температурозависи-

мыми факторами, вызывающими структурные изменения в поверхностных адгези-нах кандид. Данные факторы не связаны с комплементом.

7. В слюне здоровых взрослых доноров обнаружены антитела против С. albicans. Основная часть антител слюны представлена иммуноглобулинами Ig G; меньшее количество приходится на иммуноглобулины Ig А и Ig M.

8. Антитела слюны играют значительную роль (40%) в антиадгезивном эффекте слюны против адгезии кандид на буккальном эпителии; 60 % антиадгезивного действия имеет неспецифическую основу, т.е. не связано с активностью антител. Установлено, что, кроме муцина, в неспецифическом антиадгезивном эффекте участвуют температурозависимые факторы слюны, которые вызывают необратимые изменения адгезинов кандид.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Махрова Т.В. Адгезивные реакции Candida albicans в условиях кондиционирования метаболической активности эпителиоцитов / Т.В.Махрова, М.И.Заславская, А.Н.Маянский // «Успехи медицинской микологии»: Тезисы докладов Первого Всероссийского Конгресса по Медицинской Микологии. -Москва. -2002г. - С.58-59.

2. Зеленова Е.Г. Кандиды: экология, морфо-функциональные особенности и факторы патогенности / Е.Г. Зеленова, М.И.Заславская, Т.В.Махрова // «Нижегородский медицинский журнал». - № 1. - 2002г. - С.73-84.

3. Маянский А.Н. Феномен избирательного ослабления колонизационной (адгезивной) резистентности в системе «Candida albicans-буккальные эпителиоциты» / А.Н.Маянский, Е.В.Салина, М.А.Абаджиди, В.И.Ашкинази, М.И.Заславская, Т.В.Махрова // «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии». - №

4.-2002г.-С. 17-20.

4. Махрова Т.В. Штаммовая характеристика Candida albicans в адгезивных реакциях с буккальными эпителиоцитами / Т.В.Махрова, М.И.Заславская // Тезисы докладов I съезда микологов России. - Москва. - 2002г. - С.368.

5. Абаджиди М.А. Буккальные эпителиоциты как инструмент клинико-лабораторных исследований / М.А.Абаджиди, И.В.Маянская, М.И.Заславская,

А.Н.Маянский, Т.В.Махрова // «Нижегородский Медицинский Журнал». -№ 3-4. -2003г.-С. 105-110.

6. Махрова Т.В. Влияние бактериальных метаболитов на адгезивные реакции Candida albicans / Т.В. Махрова // Сборник материалов IV международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке». - Москва. -2003г.-С.414-415.

7. Махрова Т.В. Антиадгезивный эффект слюны в системе «Calbicans - буккаль-ные (щечные) эпителиоциты» / Т.В.Махрова, М.И.Заславская, А.Н. Маянский // Материалы VI научно-практической конференции по медицинской микологии (VI Кашкин-ские чтения). «Проблемы медицинской микологии». - № 2. - Т.5 - 2003 г. - С.44-45.

8. Махрова Т.В. Влияние TLR- рецепторов на адгезивные реакции в системе «Calbicans - буккальные эпителиоциты» / Т.В.Махрова, А.Н. Маянский, Е.А.Шмелева, М.И. Заславская // Материалы научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии». - Уфа. - 2004г. - С.252-253.

9. Заславская М.И. Влияние реактивности клеточного цитоскелета на адгезивные реакции в системе «буккальные эпителиоциты - Candida albicans» / Заславская М.И., Маянский АН // Материалы Второго Всероссийского Конгресса по Медицинской Микологии, III том сборника «Успехи медицинской микологии». - Москва. - 2004 г. - С.61-62.

10. Строгова Ю.Ю. Влияние нормальной микрофлоры буккального эпителия взрослых и детей на адгезивные реакции Candida albicans в системах in vitro / Ю.Ю. Строгова, Т.В.Махрова, А.С. Поляшова, М.И. Заславская // «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»: Материалы Ш конференции молодых ученых России с международным участием. - Москва. - С. 167-168.

Список сокращений АПАК - альтернативный путь активации комплемента ДЦС - додецилсульфат натрия

ЗФР - забуференный физиологический раствор (рН 7,2-7,4) ХЛ - хемилюминесценция

На правахрукописи

МАХРОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАКТОРЫ И УСЛОВИЯ, ВЛИЯЮЩИЕ НА АДГЕЗИВНУЮ АКТИВНОСТЬ CANDIDA ALB/CANS B СИСТЕМАХ С БУККАЛЬНЫМИ ЭПИТЕЛИОЦИТАМИ

03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2004

Лицензия ПД № 18-0150 от 08 февраля 2002 г. Формат 60 х 90/16. Объем 1,25 усл.печ.л. Тираж 90 экз. Заказ №48. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе RISO RP 3500ЕР ООО «Стимул-СТ» 603155, г. Н. Новгород, ул.Трудовая,6

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Махрова, Татьяна Владимировна

Введение.

Глава 1 .Обзор литературы

1.1. Кандиды: экология, морфо-функциональные особенности и факторы патогенности.

2.1. Реактивность буккальных эпителиоцитов.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

Глава 3. Собственные исследования

1. Общая характеристика адгезивной активности Candida albicans

1.1. Стандартизация тест-системы.

1.2. Сравнение спектра адгезивных реакций С. albicans, полученных из разных экологических ниш (свежевыделенные штаммы).

1.3. Сравнение адгезивной,активности музейных и свежевыделенных штаммов C.albicans.

1.4. Выбор времени инкубации буккальных эпителиоцитов с

C.albicans.

1.5. Сравнение адгезивной активности живых и убитых С. albicans

1.6. Оценка прочности адгезивных контактов между C.albicans и буккальными эпителиоцитами.

1.7. Показатели естественной и искусственной колонизации буккального эпителия у взрослых и детей.

2. Изучение метаболической и цитоскелетной активности буккальных эпителиоцитов.

2.1. Влияние температуры на адгезивную активность C.albicans.

2.2. Влияние блокады гликолиза.

2.3. Влияние колхицина и цитохалазина В.

2.3.1. Влияние колхицина.

2.3.2. Влияние цитохалазина В.

2.3.3. Влияние обработки С. albicans колхицином и цитохалазином В.

2.4. Влияние циклогексимида (ингибитор синтеза белка).

3. Влияние препарата «Кодивак» на адгезивную активность С. albicans.

4. Влияние продуктов стафилококков на адгезивные реакции в системе «C.albicans - буккальные эпителиоциты».

4.1. S aureus.

4.1.1. Влияние смеси метаболитов S. aureus на адгезивную активность С. albicans.

4.1.2. Влияние метаболитов различных штаммов S. aureus на адгезивную активность С. albicans.

4.2. Изучение механизма снижения адгезивных свойств С. albicans золотистым стафилококком.

4.3. S.epidermidis.

4.4. Влияние метаболитов стафилококков на адгезивный потенциал буккальных эпителиоцитов.

5. Влияние продуктов нейтрофилов на взаимодействие С. albicans с эпителиальными клетками.

6. Влияние сывороточных факторов на адгезивную активность C.albicans

6.1. Стандартизация тест-системы.

6.2. Влияние антител.

6.3.Антиадгезивные факторы, не имеющие отношения к антителам.

6.4. Влияние комплемента на адгезивную активность С. albicans.

7. Влияние секрета ротовой полости на адгезивные реакции в системе С. albicans - буккальные эпителиоциты

7.1. Цельная слюна.

7.2. Значение антител.

7.3. Влияние муцина на адгезивную активность С. albicans в системе с буккальными эпителиоцитами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность Candida albicans в системах с буккальными эпителиоцитами"

Отсюда, несомненный интерес вызывает изучение взаимоотношений между эпителиоцитами и такими патогенами как кандиды, поскольку полагают, что кандидоз является результатом нарушения баланса между механизмами клиренса в системе мукозального эпителия и, условиями, обеспечивающими активное размножение и персистенцию грибов на слизистых оболочках [39]. Актуальность данной темы сопряжена еще и с тем, что в настоящее время отмечается рост кандидозных оппортунистических инфекций [20] среди населения, при этом основным патогеном является Candida albicans [39, 59].

Адгезия С. albicans на эпителиоцитах является первым и обязательным этапом развития кандидоза. При этом, на реализацию адгезивного потенциала в системе "кандиды - эпителиоциты " могут оказывать влияние многие факторы, как со стороны кандид, так и со стороны организма хозяина. К последним, в частности, принадлежат секреторные продукты ротовой полости (антитела, гуморальные факторы, продуцируемые эпителиальными клетками).

Известно, что выход кандид за пределы очага первичной колонизации сопровождается выраженным воспалительным процессом, в развитие которого активно вовлечены фагоциты [39]. При этом одним из главных эффекторов воспалительной реакции, обеспечивающих защиту против кандидозной инвазии, служат нейтрофилы, действующие в системе опсонической кооперации с антителами и комплементом [6, 63]. Участие нейтрофильных продуктов во взаимоотношениях кандид с эпителиоцитами остается неизвестным.

Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета, и воспалительной реакции в антикандидозной защите, механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на адгезию кандид изучены недостаточно. Кроме того, существуют противоречивые данные о роли нормальной микрофлоры в реализации адгезивного потенциала в системе «Candida я/£/с<т$-буккальные эпителиоциты» [94, 131].

В связи с вышеизложенным модель искусственной колонизации С. albicans на буккальных эпителиоцитах является простым и удобным способом оценки адгезивного потенциала кандид, позволяющим оценить воздействие различных факторов мукозального иммунитета на адгезивные реакции в системе «макроорганизм - микроорганизм».

Цель исследования: Целью настоящего исследования является определение факторов, способных влиять на адгезию в системе «Candida albicans — буккальные эпителиоциты».

Задачи исследования

1. Отработать стандартную тест-систему для изучения механизмов адгезии кандид на буккальном эпителии.

2. Изучить значение метаболической и цитоскелетной активности клеток в реализации адгезивного потенциала в системе «кандиды - бук-кальные эпителиоциты».

3. Изучить влияние бактериальных метаболитов на адгезивные свойства С. albicans.

6. Изучить адгезивные реакции C.albicans в системах с буккальны-ми эпителиоцитами взрослых и детей.

Научная новизна исследования

Установлено, что буккальные эпителиоциты играют активную роль во взаимоотношениях с кандидами. Адгезия С. albicans зависит от метаболизма, синтеза белка и реакций в цитоскелетной системе буккальных клеток. Определен вклад различных компонентов мукозального иммунитета (специфические и неспецифические факторы) и сывороточных продуктов (антитела, комплемент и другие неспецифические факторы) в реализации адгезивного потенциала в системе «С. albicans—буккальные эпителиоциты». Определено влияние нейтрофильных компонентов и микробных метаболитов различных штаммов S. aureus и S. epidermidis на реализацию адгезивного потенциала С. albicans. Исследована зависимость между степенью контаминации буккального эпителия нормальной микрофлорой у взрослых и детей и способностью С. albicans колонизировать буккальные эпителиоциты. Изучено влияние пептидогликано-полисахаридного комплекса Corynebacterium diphtheria на взаимодействие кандид с буккальными клетками.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Отработана стандартная тест-система для изучения кандидозной адгезии, что дает возможность целенаправленного изучения различных факторов, влияющих на адгезию, как со стороны кандид, так и со стороны буккального эпителия. Создана коллекция бактериальных штаммов с известными параметрами адгезии на буккальных эпителиоцитах здоровых доноров. Определены факторы (компоненты ротовой жидкости, сыворотки, физические воздействия) способные влиять на адгезию в системе «С. albicans — буккальные эпителиоциты». Данные об антиадгезивных свойствах изученных компонентов могут использоваться при выборе адекватной стратегии для борьбы с кандидозами в медицинской практике. Изменение адгезивной активности кандид, в частности ее снижение, под действием ингибирующих факторов, позволит вносить коррективы в комплексное лечение кандидозов. Информация о влиянии бактериальных метаболитов и нормальной микрофлоры буккального эпителия у взрослых и детей на адгезивные реакции С. albicans в системах с буккальными эпителиоцитами позволяет дополнить сведения о механизмах взаимоотношения кандид с оральным микробиоцино-зом как в норме, так и при патологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Буккальные клетки занимают активную позицию во взаимоотношениях с кандидами. Об этом говорит снижение адгезии С. albicans при торможении метаболитной и цитоскелетной деятельности буккальных эпителиоцитов.

2. Продукты метаболизма S. aureus оказывают негативное влияние на адгезию С. albicans, вызывая необратимое торможение их взаимодействия с бук-кальными клетками.

Список сокращений

АПАК — альтернативный путь активации комплемента ДДС - додецилсульфат натрия

ЗФР - забуференный физиологический раствор (рН 7,2-7,4)

ЗФР-Т - забуференный физиологический раствор с добавлением 0,05 % твина-2

ПМЛ - полиморфноядерные лейкоциты XJI — хемилюминесценция

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Махрова, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. Определены условия и режим для изучения адгезивных и антиадгезивных реакций С. albicans в системе с буккальными эпителиоцитами человека. Установлено отсутствие существенных различий между адгезией кандид на взрослых и детских (6-8 лет) эпителиальных клетках, несмотря на то, что детские эпителиоциты отличались значительно более высоким уровнем естественной колонизации.

2. Адгезия в системе «С. albicans — буккальные клетки» зависит от метаболической активности эпителиоцитов, синтеза белка, реакций микротрубочек и микрофиламентов.

3. Пептидогликан-полисахаридный комплекс Corynebacterium diphtheria (кодивак) не оказывал влияния на взаимодействие кандид с буккальными клетками. Это можно расценить как отсутствие влияния поверхностных гомологичных типов толльподобных рецепторов буккальных эпителиоцитов на адгезивные реакции С. albicans.

4. Адгезия кандид на буккальных эпителиоцитах находится под негативным контролем продуктов микробного метаболизма. Обработка С. albicans 601 (но не буккальных клеток) супернатантами культур S. aureus сопровождалась необратимым снижением показателей адгезии; продукты S. epidermidis были неактивны.

5. Экстракты нейтрофилов, обладающие способностью разрушать СЗЬ-опсонины, были лишены антиадгезивной активности в реакциях между кандидами и эпителиальными клетками.

7. В слюне здоровых взрослых доноров обнаружены антитела против С. albicans. Основная часть антител представлена иммуноглобулинами IgG; меньшее количество приходится на иммуноглобулины IgA и IgM.

8. Антитела слюны играют значительную роль (40%) в антиадгезивном эффекте слюны против адгезии кандид на буккальном эпителии; 60 % антиадгезивного действия имеет неспецифическую основу, т.е. не связано с активностью антител. Установлено, что, кроме муцина, в неспецифическом антиадгезивном эффекте участвуют температурозависи-мые факторы слюны, которые вызывают необратимые изменения адге-зинов кандид.

Ill

Заключение

Последнее время несомненный интерес вызывает изучение взаимоотношений между эпителиоцитами и такими патогенами как кандиды, поскольку полагают, что кандидоз является результатом нарушения баланса между механизмами клиренса в системе мукозального эпителия и, условиями, обеспечивающими активное размножение и персистенцию грибов на слизистых оболочках [3, 39]. Актуальность данной темы сопряжена еще и с тем, что в настоящее время отмечается рост кандидозных оппортунистических инфекций [20, 39] среди населения, при этом основным патогеном является Candida albicans [59].

Известно, что выход кандид за пределы очага первичной колонизации сопровождается выраженным воспалительным процессом, в развитие которого активно вовлечены фагоциты [39]. При этом одним из главных эффекторов воспалительной реакции, обеспечивающих защиту против кандидозной инвазии, служат нейтрофилы, действующие в системе опсонической кооперации с антителами и комплементом [63]. Участие нейтрофильных продуктов во взаимоотношениях кандид с эпителиоцитами остается неизвестным.

Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета, и воспалительной реакции в антикандидозной защите, механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на адгезию кандид изучены недостаточно. Кроме того, существуют противоречивые данные о роли нормальной микрофлоры в реализации адгезивного потенциала в системе «Candida albicans-буккальные эпителиоциты» [94, 131].

В связи с вышеизложенным, предложенная в данной работе модель искусственной колонизации С. albicans на буккальных эпителиоцитах является простым и удобным способом оценки адгезивного потенциала кандид, позволяющим оценить воздействие различных факторов мукозального иммунитета на адгезивные реакции в системе «макроорганизм - микроорганизм» [49].

Целыо настоящего исследования является определение факторов, способных влиять на адгезию в системе «.Candida albicans — буккальные эпи-телиоциты».

Нашей первой задачей было исследование вопроса о режиме, в котором следует изучать адгезивные реакции кандид в системах с буккальными клетками. Проведенные исследования позволили установить масштаб штаммовых различий С. albicans в адгезивных взаимоотношениях с буккальными эпителиоцитами человека. Он был достаточно велик для музейных культур (от 6,1 до 30 кандид на одну эпителиальную клетку) и в меньшей степени проявлялся для штаммов, только что выделенных из разных источников (8,5-13,6). Был выбран штамм (С. albicans 601) для проведения дальнейших исследований, который отличался средними, но наиболее постоянными показателями адгезии. Установлен оптимальный режим экспериментов (37°С, 30 мин), в условиях которого результаты не зависели от жизнеспособности кандид, не давали вторичного ореола адгезии (за счет коадгезии кандид, не успевших связаться с клетками-мишенями на первом этапе опыта) и обеспечивали прочность связывания (по оригинальному верографин-фиколловому тесту) 60,8 ± 9,0 % . Показатели адгезии у взрослых существенно не отличались от показателей адгезии у детей 6-8 лет по сравнению с нормальной микрофлорой буккального эпителия, которая была в три раза выше в детском возрасте. Эти данные подтверждают возрастные различия естественной колонизации буккальных клеток [67, 183]. Они не затрагивают их чувствительности к искусственному заселению чужой микрофлорой, в частности грибами, экологически эктопич-нымн для данного биотопа. Отсутствие корреляций между уровнем между уровнем естественной и искусственной колонизации в обеих возрастных категориях свидетельствует о том, что состояние нормальной микрофлоры не влияет на адгезивные взаимоотношения в системе «С. albicans -буккальные эпителиоциты».

Последние годы ознаменовались заметным повышением интереса к нетрадиционным функциям мукозального эпителия (эпителия слизистых оболочек). Это связано с признанием его координирующей позиции в реакциях, стыкующих механизмы врожденного (неспецифического) и специфического иммунитета. Мукозальные эпителиоциты обладают значительным эффекторным потенциалом в реакциях воспаления и иммунитета, реализуя его в ответ на стимулирующие воздействия экзогенной (микроорганизмы, аллергены, поллютанты) и эндогенной (цитокины и др.) природы [25, 40, 74, 113, 120, 124, 126, 189]. Оказалось, что мукозальные эпителиоциты обладают значительным эффекторным потенциалом, реализуя его в ответ на стимулирующие воздействия экзогенной (микроорганизмы, аллергены, поллютанты) и эндогенной (цитокины и др.) природы [142, 168, 192].

Недавно появились сообщения, в которых говориться о том, что адгезия микроорганизмов влияет на реактивность клеток хозяина, приводя к перестройке в системе регуляции генов, в частности генов, отвечающих за синтез цитокинов [72]. Такого рода контактная болезнетворность имеет большое значение для патогенности бактерий и грибов, определяя продукцию факторов, детерминирующих патологический процесс. Нам известны работы, в которых приводятся данные о влиянии адгезии С. albicans на транскрипционные реакции эпителиоцитов, включая реакции в системе NF-кВ, одного из центральных регуляторов внутриклеточного гомеостаза [100].

В серии опытов нами прослежено влияние метаболической активности буккальных эпителиоцитов на адгезию кандид. Опыты проводили с выключенным метаболизмом буккальных клеток (4°С), с блокадой их энергетического обмена (подавление гликолиза фторидом натрия) и синтеза белка циклогексимид), при выключении реакций цитоскелета (опыты с колхицином и цитохалазином В). Полученные данные говорят о значении активной деятельности эпителиальных клеток в адгезивных реакциях С. albicans. Об этом свидетельствуют наши эксперименты, демонстрирующие снижение прикрепления кандид на холоду, при торможении гликолиза и подавлении синтеза белка. Опыты с ингибиторами цитоскелета позволили установить, что одной из точек приложения активного метаболизма буккальных клеток являются реакции в системах микрофиламентов и микротрубочек.

В целом, адгезия кандид на буккальных клетках складывается из двух механизмов. Один из них не зависит от уровня метаболической и цитоске-летной активности эпителиоцитов и отвечает примерно за половину реакции. Можно думать, что это пассивный механизм, который не связан с рецепторами кандид, а определяется гидрофобными, вандервальсовыми и электростатическими взаимодействиями. Второй механизм является результатом метаболически активных клеток. Это совокупность реакций, отвечающих за взаимоотношения живых клеток, которые лучше всего проявляются в физиологичных условиях.

При выяснении природы адгезивных рецепторов буккальных клеток нас заинтересовал вопрос об участии в этом процессе так называемых Toll-рецепторов эпителиоцитов. Известно, что различные То11-молекулы связывают бактериальные липополисахариды, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты, липопротеины, гликолипиды, флагеллин, ДНК, фунгальные манна-ны, вирусные белки и суперантигены [182]. Для многих из То11-рецепторов характерен структурный консерватизм, предполагающий общность рекогносцировочных реакций [92, 182, 185].

Первое сообщение о То11-подобных рецепторах человека (TLR-4) сделано в 1997 г. [123], но уже ясно, что они играют важную роль в гомеостазе, обеспечивая эстафетную стыковку врожденного и адаптивного (специфического) иммунитета. Суть TLR-зависимой рекогносцировки сводится к сканированию стимулов, исходящих от разнородных агентов, на основе распознавания их наиболее общих (консервативных) структур — рекогносцировочных образов, отсюда англ. pattern recognition receptors [92, 133]. Рекогносцировочный плюрализм TLR связан и с тем, что, кроме непосредственных контактов с агонистами, они выступают в роли корецепторов, транслируя или усиливая импульсы с других лигандсвязывающих структур [88, 178]. Будучи привилегией макрофагов, нейтрофилов и дендроцитов [92], TLR экспресси-руются и другими клетками, в том числе мукозальными эпителиоцитами [83, 88, 103]. В литературе имеются единичные сведения в пользу участия TLR-2 и TLR-4 клеток HeLa в качестве стартового сигнала, воспринимающего адгезивные контакты от С. albicans, транслируя их на генетический аппарат клетки путем эстафетной стимуляции NF-кВ и р38 (Deva et al., 2003).

О возможном значении То11-рецепторов во взаимодействии кандид с буккальными клетками судили по способности пептидополисахаридно-го комплекса С. diphtheriae (который предположительно мог связываться с TLR-2 и тем самым блокировать их), тормозить адгезию кандид. Препарат «кодивак» (любезно предоставлен Е.А.Шмелевой, Московский НИИЭМ им. Габричевского) в концентрации 3 мг/мл смешивали в равных объемах с буккальными клетками, и после инкубации (30 мин, 37°С) проверяли их адгезивную активность с кандидами. Результаты не выявили какого-либо эффекта, что можно расценить как отсутствие влияния поверхностных TLR-структур буккальных клеток на адгезивные реакции кандид. Дальнейшие исследования должны подтвердить это в опытах с более специфичными реагентами, такими как моноклональные антитела против различных типов TLR.

Кандидоз часто протекает как смешанная инфекция [39]. Поэтому определенное значение имеет информация о влиянии на адгезивные контакты с кандидами продуктов жизнедеятельности других микроорганизмов, которые являются облигатными или факультативными представителями нормальной микрофлоры человека [47, 96, 97, 105]. Нами изучено влияние на взаимоотношения кандид с буккальными клетками метаболитов золотистого и эпи-дермального стафилококка, которые могут подключаться к процессу на этапах мукозалыюго и кожного кандидозов.

Метаболиты S. aureus оказывали негативное влияние на взаимодействие кандид с буккальными эпителиоцитами. При инкубации (60 мин, 37°С) С. albicans с супернатантами суточных культур стафилококка таким действием обладали все четыре штамма золотистого стафилококка. Максимальное снижение адгезии (в 2,59 ± 0,07 раз) наблюдалось под действием метаболитов штамма 86М. Эффект был необратимым (обработка 0,1% раствором до-децилсульфата натрия не возвращала исходной адгезивной активности С. albicans) и предположительно объяснялся ферментативным действием секреторных продуктов золотистого стафилококка на адгезины кандид. Об этом говорило ослабление на 20-30 % адгезивной активности кандид при их обработке проназой (бактериальной протеазой) (Fluka, Швейцария). Обработка буккальных клеток метаболитами S. aureus не влияла на жизнеспособность и адгезию кандид.

В тех же условиях S. epidermidis был не активен. Это подтверждает особенности метаболитного профиля золотистого и эпидермального стафилококков [2, 24, 27], определяющие их разные способности вмешиваться в инфекционные процессы, инициируемые другими микроорганизмами, в частности в адгезивные реакции кандид.

Развитие кандидоза сопряжено с острым воспалением, главным эффектором которого служат нейтрофилы [63, 187]. Их продукты содержат ферменты, активные формы кислорода и катионные белки, оказывающие разнообразные эффекты на ткани хозяина и их взаимоотношения с микроорганизмами [28, 130]. В литературе отсутствуют данные о влиянии нейтрофильных продуктов на реакции кандид в системах с эпителиоцитами. Между тем это может иметь большое значение в эволюции кандидозного процесса, в частности при оральном кандидозе. В связи с этим нами изучено влияние экстракта нейтрофилов на адгезивную активность C.albicans в реакциях с бук-кальными клетками.

Экстракт (0,5 мл), полученный путем обработки нейтрофилов 0,1% тритоном Х-100 и стандартизованный по миелопероксидазе, инкубировали (30 мин, 37°С) с осадком С. albicans (107 клеток) и после отмывания оценивали способность кандид к адгезивным реакциям с буквальными клетками. Обработка экстрактом нейтрофилов (концентрация клеток ЗОхО6 кл/мл) вызывала пороговое повышение уровня адгезии кандид — 136,5±8,0% (р=0,05).

Одновременно тем же экстрактом нейтрофилов обрабатывали СЗЬ-сефадекс G50, Fine (Pharmacia, Швеция), полученный путем опсонизации пулом сывороток здоровых доноров [33]. Нейтрофильные экстракты вызывали дозозависимое снижение показателей СЗЬ-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса — от 29,9±1,6% (концентрация экстрагируемых нейтрофилов 13,5х106/мл) до 9,7±0,2% (30х106/мл)

Таким образом, экстракт нейтрофилов, который содержит протеоли-тические ферменты, действующие на опсонический комплекс альтернативного каскада комплемента, не оказывает ингибирующего эффекта на адгезивную активность кандид в системе с буккальными клетками. Более того, продукты нейтрофилов вызывали усиление (на уровне достоверности) адгезии кандид, которое могло быть результатом изменения конформацион-ной структуры адгезинов. Это говорит о том, что адгезины кандид были нечувствительны к нейтральным протеазам, входящим в состав гранул нейтрофилов. Это отличается от данных, полученных в опытах с золотистым стафилококком и проназой, где наблюдалось достоверное ослабление адгезивной активности кандид.

Воспаление является обязательным атрибутом кандидоза [39]. Поэтому сывороточный экссудат, представляя неотъемлемый компонент кандидозного процесса, может существенно влиять на его развитие, включая адгезивные реакции кандид в системах с эпителием.

Гуморальные факторы, принимающие участие в воспалении, включают антитела, комплемент и другие элементы, способствующие или препятствующие реакции. Это определило круг задач, связанных с изучением влияния гуморальных факторов сыворотки и слюны на адгезию кандид в реакциях с буккальным эпителием.

Во-первых, требовалось отработать методику определения проти-вокандидозных антител. Мы ориентировались на хемилюминесцентный метод иммуноферментного анализа, который был успешно внедрен в практику исследований Д.Г. Астафьевым [4]. Для гашения неспецифических реакций было решено использовать 2 % растворы альбумина и желатина на 0,05 % растворе твина-2. Однако оказалось, что этого делать нельзя из-за взаимодействия кандид, прежде всего с желатином, которое препятствует проявлению их серологической и адгезивной активности. Эффект желатина носит обратимый характер и может быть ликвидирован обработкой кандид 0,1 % раствором ДДС. Это дополняет данные литературы о том, что кандиды способны связывать разнообразные сывороточные и тканевые факторы, включая коллаген (желатин является продуктом денатурации коллагена) [130]. Результаты наших опытов говорят о том, что такое связывание влияет на иммунологические и адгезивные параметры кандид в реакциях с нормальными антителами. Учитывая эти данные, все дальнейшие эксперименты с сывороткой и слюной проводили в солевой среде с добавлением 0,05 % твина-2 без белковых ингибиторов.

Полученные данные подтвердили то, что у практически здоровых людей имеются антикандидозные антитела, которые улавливаются иммуноферментой реакцией. Показатели для ^в-антител (соотношение опыт/контроль) составили 2,55 ± 0,5 (140 899±7239 / 55 223±2714), значения для ^А-антител были примерно такими же - 2,9 ± 0,7 (238 698±7239 / 79 578±5097), содержание ^М-антител было меньше 1,9 ± 0,4 (91 227±789 46 844±368). Специфичность результатов была доказана опытами с сывороткой, истощенной в течение 30 минут при 37°С, и в условиях, исключающих активацию комплемента (4°С, 30 мин) [28]. После обработки в каждом из этих режимов показатели со всеми конъюгатами (анти-IgG, -IgA, -IgM) были на уровне негативного контроля (р = 0,135).

Пул сыворотки вызывал снижение адгезии кандид в 2,7-4,5 раз (3,6 ± 0,18). После обработки кандид сывороткой, истощенной (4°С, 30 мин) микробной взвесью С. albicans, наблюдали менее выраженное снижение адгезивного эффекта (2,0 ± 0,1; р < 0,05). Это говорит о том, что антитела вносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, отвечая примерно за 22 % антиадгезивного эффекта.

Для изучения природы факторов, не имеющих отношения к антителам, проводили предварительную обработку кандид при 37°С и 4°С сывороткой, истощенной по антителам. После их отмывания сравнивали активность в адгезивных реакциях с буккальными клетками относительно опыта с торможением адгезии цельной (неистощенной) сывороткой. При 4°С антиадгезивный эффект истощенной сыворотки был минимальным — 12,3 ± 1,4 %, против 55,8 ± 2,2 % при 37°С (р =0,002). Для цельной сыворотки те же показатели были гораздо выше: 54,6 ± 2,7 % (4°С) и 73,5 ±1,4 % (37°С) (р <0,005). Обработка 0,1 % ДДС не устраняла антиадгезивный эффект истощенной сыворотки. Это говорило о том, что в сыворотке содержатся факторы, действие которых на кандиды проявляется, во-первых, только при 37°С и, во-вторых, не экранировано нековалентно связанными молекулами.

Можно было думать, что такой эффект оказывают факторы системы комплемента, которые (С4Ь, СЗЬ) в процессе активации подвергаются ковалентному связыванию с объектами. Для изучения влияния комплемента проведены опыты с пулами сыворотки, истощенной кандидами (4°С, 30 мин). Активность комплемента в истощенных сыворотках подтверждена опытами с опсонизацией зимозана в люминолзависимой хеми-люминесценции нейтрофилов человека.

Установлено, что комплемент не влиял на адгезивную активность кандид. Можно было думать, что температурозависимые компоненты сыворотки, оказывающие антиадгезивное действие, относятся к другим факторам (ферментам?!), структурно модифицирующим адгезины кандид.

Известно, что адгезия С. albicans на буккальных эпителиоцитах зависит от факторов слюны [101, 155, 175]. Слюна способна препятствовать адгезии микроорганизмов на эпителии, но механизмы этого эффекта изучены недостаточно [58, 121]. Так как секрет ротовой полости представляет собой многокомпонентную систему, можно ожидать, что антиадгезивным действием будут обладать различные компоненты слюны, в частности, антитела [81, 91, 110, 112, 129, 150], муцины [45, 71, 114, 201], катионные белки [78, 84, 152, 203, 204, 206]. В слюне содержится большое количество ферментов [144, 200], способных модифицировать адгезивный аппарат кандид и других микроорганизмов.

Цельная слюна здоровых взрослых доноров вызывала снижение адгезии кандид в 3,1 ± 0,29 раз; остаточный уровень адгезивной активности составлял 36,0 ± 3,05 %. Это говорило о том, что адгезия кандид включает два компонента, один из которых блокируется слюной, а другой не подвержен ее влиянию. Данное обстоятельство согласуется с информацией о неоднородности адгезивного субстрата кандид. В нем участвуют многие поверхностные антигены, которые, учитывая представительство С. albicans в нормальной микрофлоре, должны индуцировать образование саливарных антител. Можно было рассчитывать на их участие в антиадгезивных реакциях, в частности в системе с буккальными клетками.

Действительно, методом иммуноферментного анализа в слюне нормальных доноров были найдены антикандидозные антитела. Максимальные показатели наблюдались для IgG-антител (соотношение опыт/контроль — 12,6 ±1,2). Значения для IgA-антител были примерно такими же, но из-за более высоких цифр в контроле показатели опыт/контроль оказались ниже (4,0 ± 1,3). Содержание IgM-антител было в 3,3 ± 0,9 меньше, чем IgG.

После обработки кандид слюной, предварительно истощенной по анти-кандидозным антителам, наблюдали снижение адгезивного эффекта в 1,6 ± 0,2 раз (р < 0,05), после обработки цельной слюной в 3,1 ± 0,29 раза. Это говорит о том, что антитела сносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, отвечая за 40 % антиадгезивного эффекта.

В серии экспериментов кандиды предварительно обрабатывали при 4°С истощенной слюной и затем изучали их адгезивную активность при добавлении буккальных клеток. Параллельно такую же операцию проводили с цельной слюной. Антиадгезивный эффект при 4°С был минимальным - 9,1 ± 0,01% против 23,4 ± 3,4% при 37°С (р < 0,05). В отличие от этого для цельной слюны снижение показателей было недостоверным (р > 0,05). Обработка 0,1% раствором ДДС не приводила к восстановлению исходного адгезивного уровня.

Для выяснения природы этих факторов были проведены опыты с муцином (бычий, Sigma, США), рассматривая его как обязательный компонент слюны, который отвечает за часть ее антиадгезивного эффекта [71]. Обработка муцином (1 мг/мл, 37°С, 30 мин) снижала адгезивную активность кандид независимо от того, какой компонент системы предварительно преипкубиро-вался с муцином - буккальный эпителий (снижение адгезии до 49,7 ± 2,4 %) или кандиды (48,7 ± 5,3%) (р=0,4561). Обработка 0,1 % раствором ДДС вела к частичному восстановлению исходного адгезивного уровня. Это позволяет говорить об экранирующем (нековалентном) эффекте муцина в системе кандиды - буккальный эпителий, что не совпадает с нашими данными о 0,1 % ДЦС-устойчивости антиадгезивного эффекта истощенной слюны. Полученные данные говорят о том, что температурозависимые антиадгезины, присутствовавшие в «безантительной» слюне, не имеют отношения к муцину. Предположительно речь идет о факторах ферментной природы, способных вызывать структурные изменения поверхностных компонентов кандид.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Махрова, Татьяна Владимировна, Челябинск

1. Абаджиди, М.А. Состояние естественной колонизации буккальных эпителиоцитов у детей, часто болеющих острыми респираторными инфекциями / М.А. Абаджиди // Нижегородский мед. журн. 2000. - № З.-С. 16-18.

2. Акатов, Ф.К. Стафилококки/ Ф.К. Акатов, B.C. Зуева. М.: Медицина, 1983.-256 с.

3. Антоньев, A.A. Кандидоз кожи и слизистых оболочек / A.A. Антоньев, J1.A. Бульвахтер, J1.K. Глазкова, И.И. Ильин. М: Медицина, 1985.-155с.

4. Астафьев, Д.Г. Иммунологическая характеристика антител человека к пептидогликану золотистого стафилококка: Дис. канд. мед. наук: 14.00.36/Д.Г. Астафьев.-Горький, 1987.-271с.

5. Банченко, Г.В. Оценка уровня дифференцировки клеток эпителия в отпечатках с разных участков слизистой оболочки полости рта здоровых людей / Г.В. Банченко, О.Г. Акопян, A.A. Агаджанян, И.А. Быкова // Стоматология. 1997.- № 1 - С.12-14.

6. Бурова, С.А. Клинические разновидности и лечение кандидоза / С.А. Бурова, Г.В. Воинова // Вест. дерматол.-1997.- № 4.- С. 24-28.

7. Быков, B.JI. Динамика инвазивного роста Candida albicans в тканях хозяина / B.JI. Быков // Вест, дерматол. венерол.- 1990. -№ 4.- С. 25-28.

8. Быков, B.JI. Функциональная морфология эпителиального барьера слизистой оболочки полости рта / B.J1. Быков // Стоматология. — 1997. — № 3. С. 12-16.

9. Быков, B.JI., Величко Е.В. Экспериментальное изучение влияния кор-тикостероидных препаратов на адгезию грибов рода Candida к эпите-лиоцитам слизистых оболочек / B.JI. Быков, Е.В. Величко // Ж. микро-биол. -1988. № 8. - С. 115-118.

10. Ю.Быков, В.Jl. Изменения адгезии грибов Candida к эпителию в течение менструального цикла / B.JI. Быков, З.О. Караев, Е.В. Величко // Ж.микробиол. 1987. - № 8. - С. 13-15.

11. П.Быкова, И.А. Цитологическая характеристика отпечатков слизистой оболочки полости рта с применением индекса дифференцировки клеток / И.А. Быкова, A.A. Агаджанян, Г.В. Банченко // Лаб.дело.- 1987. -№ 1.- С. 33-35.

12. Величко, Е.В. Условия и факторы адгезии грибов Candida к эпителио-цитам слизистых оболочек / Е.В. Величко // Гинекология -2003. Т. 5, № 5. - С. 20-22.

13. Гемонов, В.В. Защитные свойства поверхностных слоев эпителия слизистой оболочки полости рта / В.В. Гемонов, М.Л. Могильный // Стоматология. 1996.- № 3.- С. 4-6.

14. К вопросу о биологической активности Candida albicans. Микотиче-ская инфекция и сенсибилизация: Сб. науч. труд. / Отв. ред. З.О. Караев, Т.Н. Лебедева.- Ленинград 1982. С. 14-17.

15. Кашкин, К.П. Белки системы комплемента: свойства и биологическая активность / К.П. Кашкин, Л.Н. Дмитриева // Клин. лаб. диагн.- 2000.-№7. -С. 25-32.

16. Ланкина, М.В. Микрофлора зева человека как показатель определения резистентности организма / М.В. Ланкина // Ж. микробиол. —2002. -№ З.-С. 97-99.

17. Лебедева, Ю.В. Реактивность нейтрофилов в системах с пептидоглика-нами различных видов стафилококка / Ю.В. Лебедева, Д.Г. Астафьев, А.Н. Маянский // Журн. микробиол. 1989. - № 6.- С.57-61.

18. Лесовой, B.C. Кандидоз ротовой полости (обзор) / B.C. Лесовой, A.B. Липницкий, О.М. Окчурова // Проблемы медицинской микологии.-2003.-Т.5,№ 1.-С. 21-24.

19. Лукиных, Л.М. Значение колонизационной резистентности и местного иммунитета полости рта при кариесе зубов / Л.М. Лукиных, Е.Г. Зеле-нова // Нижегородский мед. журн.- 1999. № 4.- С. 23-27.

20. Маянский, А.Н. Дисбактериоз: иллюзии и реальность / А.Н. Маянский // Педиатрия. -2000.-№ 4. -С. 80-88.

21. Маянский, А.Н. Естественная колонизация буккального эпителия у детей с аллергическими заболеваниями / А.Н. Маянский, М.А.Абаджиди, И.В.Маянская, А.П. Разживнн // Российский педиатр, журн. 1999. -№ 3. - С. 47-49.

22. Маянский, А.Н. Взаимоотношения между естественной колонизацией и ^ адгезией бактерий к буккалыюму эпителию у человека / А.Н. Маянский, О.Н. Воробьева, Э.Ф. Малышева и др. // Журн. микробиол.-1987.-№2. -С. 18-20.

23. Маянский, А.Н. Цитокины и медиаторные функции уроэпнтелия в воспалительных реакциях мочевыводящей системы / А.Н. Маянский // Цитокины и воспаление. 2003. -т.2. -№4. -С. 3-10.

24. Маянский, А.Н. Естественная колонизация буккального эпителия у больных с пародонтитом / А.Н.Маянский, Л.П. Пичугина, Э.Ф. Малышева // Нижегородский, мед. журн. 1991. -№ З.-С. 20-22.

25. Маянский, А.Н. Медицинские аспекты микробной экологии / А.Н. Маянский, А.П. Разживнн, Э.Ф. Малышева М.: Москва, 1991. -180с.

26. Маянский, А.Н. Опсоническая функция альтернативного пути активации комплемента: способ определения и клиническая характеристика /

27. А.Н. Маянский, М.С. Куравская, О.И. Пикуза // Иммунология. -1982.-№ З.-С. 84-87.

28. Маянский, А.Н. Адгезивные реакции в системе «буккальные эпителио-циты-Candida albicans» у детей с бронхиальной астмой и гастродуоде-нитом / А.Н. Маянский, Е.В.Салина, М.А. Абаджиди // Педиатрия.-2002.-№ З.-С. 41-43.

29. Мюллер,Э. Микология /Э. Мюллер, В. Лёффлер.- М.: Мир, 1995.- 343 с.

30. Пикуза, О.И. Естественная колонизация буккального эпителия у новорожденных детей / О.И. Пикуза, Ф.И. Сигбатуллина, А.Н. Маянский // Педиатрия.- 1993. -№ 4. -С. 5-9.

31. Пикуза,О.И.Характеристика колонизационной резистентности микрофлоры ротовой полости при применении препарата томицид/О.И. Пикуза, И.Г. Шошина, В.Б.Гервазиева//Педиатрия.- 1999.-№3.-С.101-104.

32. Плескова, С.Н. Принципы стандартизации оценки функциональной активности АПАК/ С.Н. Плескова, А.Н. Маянский // Иммунология.-2000.-№4.-С. 61-62.

33. Подосинников, И.С. Метод определения хемотаксической активности лейкоцитов / И.С. Подосинников, Л.Г. Нилова, И.В. Бабиченко // Лаб. дело.- 1981.- №8.- С. 468-470.

34. Прилепская, В.Н. Вагинальный кандидоз / В.Н. Прилепская, A.C. Ан-кирская, Г.Р. Байрамова М.:Медицина,1997.- 40 с.

35. Реброва, Р.Н. Грибы рода Candida при заболеваниях негрибковой этиологии / Р.Н. Реброва М.: Медицина, 1989. -128 с.

36. Рыжавский, Б.Я. Изменения буккального эпителия при некоторых заболеваниях у детей / Б.Я. Рыжавский, Г.Н. Холодок // Клин. лаб. диагностика. -1995.-№ 2. -С. 39-40.

37. Самсыгина, Г. А. Кандидоз новорожденных и детей раннего возраста. Дифлюкан в лечении и профилактике кандидоза / Г. А. Самсыгина, Г.Н. Буслаева, М.А. Корнюшин . М.: 1996; 40 с.

38. Сергеев, А. Ю. Кандидоз / А. Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев. М: Триада -X. 2001.- 472с.

39. Хаитов, М.Р. Острые респираторные вирусные инфекции и бронхиальная астма. Клеточные и молекулярные аспекты проблемы / М.Р. Хаитов // Ж. микробиол. 2002.-№ 4.-С. 84-93.

40. Хусаинова, И.С. Оценка цитологических показателей буккального эпителия для диагностики функционального состояния человека / И.С. Ху-саинова, ИЛО. Варулева, Н.А. Кожина // Клин. лаб. диагн.-1997.- № 3.-С. 10-12.

41. Ahmer, O.R.The effect of cigarette smoke on adherence of respiratory pathogens to buccal epithelial cells / O.R. Ahmer, S.D.Essery, A.T.Saadi // FEMS Immunol Med Microbiol. 1999. - Vol. 23.-P.27-36.

42. Almstahl, A. Lactoferrin, amylase and mucin MUC5B and their relation to the oral microflora in hyposalivation of different origins /A.Almstahl, M. Wikstrom, J.Groenink // Oral Microbiol Immunol.-2001 .-Vol.6.-P.345-52.

43. Arendorf, T.M. Oral candidal polulations in health and disease / T.M. Arendorf, D.M. Walker // Br. Dent. J. 1979, № 147. -P. 267-272.

44. Bagg, J. Coagglutination reactions between Candida albicans and oral bacte-ria/J.Bagg, R.Silverwood //J.Med. Microbiol. -1986. -Vol.22, №.2.-P.65-69.

45. Bailey, A. Adherence of Candida albicans to human buccal epithelial cells: host-induced protein synthesis and signaling events / A. Bailey, E. Wadsworth, R. Calderone // Infect. Immun. -1995.-Vol. 63, № 2.-P.569-72.

46. Barembaum, S. Effect of Chitosan and Sodium Alginate on the adherence of autochthonous C. Albicans to oral epithelial cells (in vitro)/ S.Barem-baum, C.Virga, A. Bojanich // Med Oral. -2003.-Vol. 8, № 3.-P. 188-96.

47. Bendel, C.M. Distinct mechanisms of epithelial adhesion for Candida albicans and Candida tropicalis / C.M. Bendel, M.K. Hostetter // J.Clin. Invest. -1993. -Vol. 92. -P. 1840-1849.

48. Bergen, M.S. Switching at the cellular level in the white-opaque transition of Candida albicans / M.S. Bergen, E.Voss, D.R. Soil // J. Gen. Microbiol. -I990.-Vol. 136, № 10.-P. 1925-1936.

49. Biasoli, M.S. Adherence of Candida strains isolated from the human gastrointestinal tract/ M.S. Biasoli, M.E. Tosello, H.M. Magaro // Mycoses. -2002.-Vol. 45, №11-12.-P.465-9.

50. Bosch, J.A. Stress as a determinant of saliva-mediated adherence and coad-herence of oral and nonoral microorganisms/ J.A. Bosch, M. Turkenburg, K. Nazmi // Psychosom Med. -2003. -Vol. 65, № 4.-P. 604-12.

51. Braude, A. Candida, Infectious diseases and Medical Microbiology. 2nd ed. -1986.-P. 571.

52. Busscher, Y.S. Adhesion to silicone rubber of yeast and bacteria isolated from voice prostheses: influence of salivary conditioning films / Y.S. Busscher, G.G. Geertsema-Doornbusch, H.C. van der Mei // J. Biomed. Mat. Res. -1997.-Vol. 34.-P. 201-209.

53. Calderone, R.A. Adherence and receptor relationship of Candida albicans/ R.A. Calderone, P. Braun // Microbiol. Rev. -1991.-Vol. 55.-P. 1-20.

54. Calderone, R.A. Yeast adhesion in the pathogenesis of endocarditis due to Candida albicans: studies with adherence-negative mutants / R.A. Calderone, R.L. Cihlar, D.D. Lee// J.Infect. Dis. -1985. -Vol. 152, № 4.-P. 710-5.

55. Cannon, R.D. Oral Candida: clearance, colonization, or candidiasis? / R.D.Cannon, A.R. Holmes, A.B. Mason et al. // J. Dent. Res.- 1995. Vol. 74, №.5.- P.l 152-1161.

56. Cannon, R.D. Oral colonization by Candida albicans / R.D. Cannon, W.L. Chaffin. // Crit. Rev. Oral. Biol.-1999. -Vol. 10, № 3.- P.359-383.

57. Carol, A. Anti-fungal therapy at the HAART of viral therapy/ A.Carol, Munro and Bernhard Hu be. // Trends in Microbiology-2002, № 4.

58. Cassone, A. Cell wall of Candida albicans: its functions and its impact on the host / A. Cassone // Curr. Top. Med. Mycol. -1989, № 3. -P.248-314.

59. Chaffin, W.Z. Cell wall and secreted proteins of Candida albicans: identification, function and expression / W.Z. Chaffin, J.Z. Lopez-Ribot, M. Casanova // Mocrobiol. Mol. Biol. Rev.- 1998, № 62.-P. 130-180.

60. Challacombe, S.J. Immunologic aspects of oral candidiasis/ S.J.Challacombe // Oral. Surg. Oral. Med.Oral. Pathol. -1994. -Vol. 78. № 2. -P.202-210.

61. Cheng, S. Identification of Candida albicans genes induced during thrush offers insight into pathogenesis / S. Cheng, C.J. Clancy, M.A. Checkley // Mol. Microbiol. -2003. -Vol. 48, № 5.-P. 1275-88.

62. Cole, G.T. The role of gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis: from the laboratory to the bedside/ G.T. Cole, A.A. Halawa, E.J. Anaissie // Clin Infect Dis. -1996.-Vol. 22.-P. 73-88.

63. Colgan, S.P. Lipid mediators in epithelial cell-cell interactions / S.P. Colgan //Cell Mol Life Sci. 2002. -Vol. 59.- P. 754-760.

64. Cox, F. Adherence of Candida albicans to buccal epithelial cells in children and adults/ F. Cox // J. Lab. Clin. Med. 1983. - Vol. 102. - P.960-972.

65. Cox, F. Candida albicans adherence in newborn infants/ F. Cox // J. Med. Vet. Mycol. 1986.-Vol. 24.-P. 121-125.

66. Darwazeh, A.M. Systemic fluconazole therapy and in vitro adhesion of Candida albicans to human buccal epithelial cells / A.M. Darwazeh, P.J. Lamey, M.A. Lewis// J. Oral Pathol. Med. 1991. - Vol.20. - P. 17-19.

67. Diamond, R.D. Interaction of phagocytic cells with Candida and other opportunistic fungi/ R.D.Diamond//Arch. Med. Res.-1993.-Vol. 24.-P.361-369.

68. Domachowske, J.B. Gene expression in epithelial cells in response to pneu-movirus infection / J.B. Domachowske, C.A. Bonville, H.F.Rosenberg // Respir Res. 2001. - Vol.2. - P.225-9.

69. Domer, J.E. Separation of immunomodulatory effects of mannan from Candida albicans into stimulatory and suppressive components/ J.E. Domer, P.W. Stashak, K. Elkins // Cell. Immunol. -1986.-Vol.101, № 2.-P. 403-414.

70. Drago, L. Candida albicans cellular internalization: a new pathogenic factor? / L. Drago, B. Mombelli, E. De Vecchi// Int J Antimicrob Agents. -2000.-Vol. 16, №4.-P. 545-7.

71. Edgerton, M. Salivary histatin 5 and its similarities to the other antimicrobial proteins in human saliva / M. Edgerton, S.E. Koshlukova // Adv Dent Res. -2000.-Vol. 14. -P. 16-21.

72. Edvvards, J.E. Cell extracts of Candida albicans block adherence of the organisms to endothelial cell/ J.E. Edwards, C.L. Mayer, S.D. Filler // Infect. Immun. -1992. -Vol. 60. -P. 3087-3091.

73. Ellmerich, S. Production of cytokines by monocytes, epithelial and endothelial cells activated by Streptococcus bovis / S. Ellmerich, N. Djouder, M. Scholler // Cytokine. 2000. -Vol. 12. -P.26-31.

74. Epstein, J.B. Effects of specific antibodies on the interaction between the fungus Candida albicans and human oral mucosa / J.B. Epstein, L.H. Ki-mura, T.W. Menard // Arch Oral Biol.- 1982.-Vol. 27, № 6.-P.469-74.

75. Farmer, I. Expression of adhesion and activation molecules in human buccal spithelial cell lines and normal human buccal epithelium in situ /1. Farmer, J. Freysdottir, A. Dalghous//J.Oral. Pathol. Med.-2001.-Vol.30.-P.l 13-120.

76. Fichorova, R.N. Response to Neisseria gonororhoeae by cervicovaginal epithelial cells occours in the absence of toll-like receptor 4-mediated signaling/ R.N. Fichorova, A.O. Cronin, E.Lien //J.immunol.- 2002.-Vol. 235-243.

77. Fitzgerald,D.H. Susceptibility of Candida dubliniensis to salivary histatin 3 / D.H. Fitzgerald, D.C. Coleman, B.C. O'Connell // Antimicrob Agents Chemother. -2003. -Vol. 47, № 1. -P. 70-6.

78. Garner, R.E. Characterization of Candida albicans mannan-induced, man-nan-specific delayed hypersensitivity suppressor cells/ R.E. Garner, A.M. Childress, L.G.Human//Infect. Immun. -1990.-Vol.58, № 8.-P. 2613- 2620.

79. Gilmore, B.J. An iC3b receptor on Candida albicans: structure, function, and correlates for pathogenicity/ B.J. Gilmore, E.M. Retsinas, J.S. Lorenz // J. Infec. Dis. -1988.-Vol. 157, № 1.-P.38-46.

80. Godaly, G. Neutrophil recruitment, chemokine receptors, and resistance to mucosal infection / G. Godaly, G. Bergsten, L.Hang // J.Leukos Biol. -2001.-Vol. 69.-P. 899-906.

81. Gokdal, I. Candida colonization on the surface of orthodontic brackets and the adhesion of these strains to buccal epithelial cells/ I. Gokdal, A. Kal-kanci, G. Pacal // Mikrobiyol Bui. 2002,-Vol. 36, № l.-P. 65-9.

82. Gustafson, K.S. Molecular mimicry in Candida albicans/ K.S. Gustafson, G. M. Vercellotti, C.M. Bendel // J. Clin Invest. -1991.-Vol. 87.-P. 1896-1902.

83. Hagewald, S. Salivary IgA subclasses and bacteria-reactive IgA in patients with aggressive periodontitis / S. Hagewald, J.P. Bernimoulin, E. Kottgen, // J. Periodontal Res.- 2002.-Vol. 37, № 5.-P. 333-9.

84. Hallman, M. Toll-like receptors as sensors of pathogens / S. Hagewald, J.P. Bernimoulin, E. Kottgen // Pediat. Res. 2001. - Vol. 50. - P.315-321.

85. Henderson, B. Commensal communism and the oral cavity / B. Henderson, M. Wilson // Dent Res. -1998.-Vol. 77, № 9.-P. 1674-83.

86. Hogan, D.A. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors/ D.A. Hogan, R. Kolter // Science.- 2002.- Vol. 21, №. 296(5576).- P. 2229-2232.

87. Holgate, S.T. The bronchial epithelium as a key regulator of airway inflammation and remodeling in asthma/ S.T. Holgate, P.M. Lackie, D.E. Davies // Clin. Exp. Allergy. 1999. - Vol. 29 (suppl. 2). - P. 90-95.

88. Holmes, A.R. Interactions of Candida albicans with bacteria and salivary molecules in oral biofilms/ A.R. Holmes, R.D. Cannon, H.F. Jenkinson //J. Ind. Microbiol. 1995. -Vol.15, № 3-P.208-213.

89. Holmes, A.R. Candida albicans binding to the oral bacterium Streptococcus gordonii involves multiple adhesin-receptor interactions / A.R. Holmes, R. McNab, HJenkinson.// Infect. Immun.- 1996. -Vol.64.- No.l l-P.4680-4685.

90. Hostetter, M.K. Adhesins and ligands involved in the interaction of Candida spp. with epithelial and endothelial surfaces / M.K. Hostetter // Clin. Microbiol Rev. -1994.-Vol. 7.-P. 29-42.

91. Jacob, H. S. Complement-induced granulocyte aggregation/ H.S.Jacob, P.R. Craddock, D.E. Hammerschmidt // N. Engl. J. Med.-1980.- Vol.302, №14.-P.769-794.

92. Jouault, T. Candida albicans phospholipomannan is sensed through toll-like receptors/ T. Jouault, S. Ibata-Ombetta, O. Takeuchi // J Infect Dis. -2003.-Vol.188, № l.-P. 165-72.

93. Johansson, I. Adhesion of Candida albicans, but not Candida krusei, to salivaru statherin and mimicking host molecules/ I. Johansson, P. Bratt, D.I. Hay // Oral Microbiol. Immunol. -2000.-Vol. 15, № 2.-P.112-8.

94. Kagnoff, M.F. Epithelial cells as sensors for microbial infection/ M.F. Kagnoff, L. Eckmann // J.Clin. Ivest. 1997. -Vol.100. -P.6-10.

95. Kawahara, T. Helicobacter pylori lipopolysaccharide from tupe I, but not tupe II strains, stimulates apoptosis of cultured gastric mucosal cells/ T. Kawahara, Y. Kuwano, S. Teshima-Kondo // J. Med. Invest. -2001. Vol. 48.- P. 167-174.

96. Ken Haunes. Virulence in Candida species/ Ken Haunes // Trends in Microbiology. -2001.-Vol. 12, № 9. -P.591-6.

97. Klotz, S.A. Adherence of Candida albicans to immobilized extracellular matrix proteins is mediated by calcium-dependent surface glycoproteins / S.A. Klotz, M.J. Rutten, R.L. Smith// Microb Pathog. -1993.-Vol. 14, №2.-P. 133-47.

98. Kolganova, T.V. Effects of asparaginase and polyphenol oxidase on adhesive characteristics of microorganisms / T.V. Kolganova, A.V.Er-molaev, R.J. Doyle // Bull. Exp. Biol. Med.-2002.-Vol. 133, № 1 .-P. 58-61.

99. Kozel, T. R. Activation and binding of C3 by Candida albicans / T. R. Kozel, R. R. Brown, G. S. Pfrommer // Infect. Immun. -1987. Vol. 55. -P. 1890-1894.

100. Kozel, T. R. Distinct characteristics of initiation of the classical and alternative complement pathways by Candida albicans / T. R. Kozel., L. C. Weinhold, D. M. Lupan // Infect. Immun. -1996. -Vol. 64. -P. 3360-3368.

101. Kraehenbuhl, J.P. Transepithelial transport and mucosal defence II: secretion of IgA/ J.P. Kraehenbuhl, M.R. Neutra //Trends Cell Biol. -1992. -Vol.2, №6. -P. 170-4.

102. Lin, A.L. Further characterization of human salivary anticandidal activities in a human immunodeficiency virus-positive cohort by use of mi-croassays/ A.L. Lin, Q. Shi, D.A. Johnson // Clin. Diagn. Lab. Immunol.1999. -Vol. 6, №6. -P. 851-5.

103. Lindholm, C. Mucosal vaccination increases endothelial expression of mucosal addressin cell adhesion molecule 1 in the human gastrointestinal tract/ C. Lindholm, A. Naylor, E.L. Johansson // Infect. Immun. -2004. -Vol.72, №2. -P. 1004-9.

104. Liu, B. The recombinant N-terminal region of human salivary mucin MG2 (MUC7) contains a binding domain for oral Streptococci and exhibits candidacidal activity/ B. Liu, S.A. Rayment, C. Gyurko // Biochem J.2000. -Vol. 345, № 3.-P. 557-64.

105. Magee, P.T. Genome Mapping and Gene Discovery in Candida albicans / P.T. Magee, Stewart Scherer.// ASM News. -1998. -Vol. 64, № 9. -P. 505-511.

106. Malighetti, V. Candida albicans: the relationship between morphotypes and in-vitro adhesivity to the oral mucosa cells of HIV-positive and AIDS patients / V. Malighetti, M. Arosio, M.G. Bellotti // Minerva Stoma-tol. -1998. -Vol. 47, № 9. -P. 351-9.

107. Manns, J.M. Production of a hemolytic factors by Candida albicans/ J.M. Manns, D.M. Mosser, H.R.Buckley // Infect Immun. -1994. -Vol. 62,-P. 5154-5156.

108. Marcotte, H. Oral microbial ecology and the role of salivary immunoglobulin A / H. Marcotte, M.C. Lavoie // Microbiol. Mol. Bio.l Rev. -1998.-Vol. 62, №1.-P. 71-109.

109. Mattoli, S. Allergen-induced generation of mediators in the mucosa/ S. Mattoli // Environ Health Perspect. 2001. - Vol. 109. - P. 553-557.

110. Maza, J.L. Candida albicans adherence to resin-composite restorative dental material: influence of whole human saliva / J.L. Maza, N. Elguezabal, C. Prado // Med. Oral. Pathol. Oral. Radiol. Endod. 2002. -Vol. 94, № 5.-P. 589-92.

111. Medzhitov, R. A human gomologue of the Drosofila Toii protein signals activation of adaptive immunitu/ R. Medzhitov, P. Preston-Hurlburt, C.A. Janeway // Nature. -1997. -Vol. 388.-P. 394-397.

112. Meri, T. The yeast Candida albicans binds complement regulators factor H and FHL-1/ T. Meri, A. Hartmann, D. Lenk et al.// Infect. Immun.-2002. -Vol.70, № 9. -P.5185-5192.

113. Millon, L. Longitudinal study of anti-Candida albicans mucosal immunity against aspartic proteinases in HIV-infected patients / L. Millon, C. Drobacheff, R. Piarroux // J Acquir Immune Defic Syndr. 2001. -Vol. 26, № 2.-P. 137-44.

114. Mills, P. R. Airway epithelial cells, cytokines, and pollutants / P. R. Mills, R.J. Davies, J.L. Devalia //Am. J. Resp. Crit. Care Med. 1999. -Vol.160 (5pt2). -P.38-43.

115. Millsap, K.W. Adhesive interactions between voice prosthetic yeast and bacteria on silicone rubber in the absence and presence of saliva/ K.W. Millsap, R. Bos, H.C. van der Mei // Antonie Van Leeuwenhoek. -2001.-Vol. 79, № 3-4.-P. 337-432.

116. Miyakawa, V. Role of specific determinant in mannan of Candida albicans serotype A in adherence to human buccal epithelial cells / V. Miyakawa, T. Kuribayashi, K. Kagaya // Infect. Immun. -1992. -Vol. 60. -P. 2493-2499.

117. Moragues, M.D. A monoclonal antibody directed against a Candida albicans cell wall mannoprotein exerts three anti-C.albicans activities / M.D. Moragues, M.J. Omaetxebarria, N. Elguezabal // Infect Immun. -2003. -Vol. 71, №9. -P. 5273-9.

118. Murav'ev, R.A. Gelatinase granules of the neutrophil granulocytes/ R.A. Murav'ev, V.A. Fomina, V.V. Rogovin // Izv. Akad. Nauk. Ser. Biol. -2003, № 4.-P. 389-94.

119. Nair, R.G. The effect of oral commensal bacteria on candidal adhesion to human buccal epithelial cells in vitro / R.G. Nair, L.P. Samaranayake // J. Med. Microbiol. 1996. - Vol.45. - P. 179-185.

120. Nair, R.G. The effect of oral bacteria on Candida albicans germ-tube formation/ R.G. Nair, S. Anil, L.P. Samaranayake //. APMIS. 2001. - Vol. 109, №2.- P. 147-54.

121. Odds, F.C. Candida species and virulence / F.C. Odds // ASM News. -1994.-Vol. 60. -P. 313-318.

122. Odds, F.S. Candida and candidosis / F.S. Odds. London: Bailliere Tindall, 1988.-165p.

123. Ollert, M.W. Reduction expression of the functionally active complement receptors for iC3b but not C3d on an avirilent mutant of Candida albicans / M.W. Ollert, E. Wadsworth, R. A. Calderone // Infect. Immun.-1990. -Vol. 58, № 4.-P. 909-913.

124. Pawderly, W.G. Molecular epidemiology of recurrent oral candidiasis in human immunodefency virus-positive patients: evidence for two patterns of recurrence / W.G. Pawderly, R. Robinson, E.J. Keath // J. Infect. Dis. -1993.-Vol. 168. -P. 463-466.

125. Pendrak, M.Z. Adherence of Candida albicans to host cells / M.Z. Pendrak, S.A. Klotz // FEMS Microbiology letters. -1995. -Vol. 129. -P.103-114.

126. Pereiro, M. Adherence of Candida albicans strains isolated from AIDS patients. Comparison with pathogenic yeasts isolated from patients without HIV infection / M. Pereiro, A. Losada, S. Toribo // Br. J. Dermatol. -1997. -Vol. 137. -P. 76-80.

127. Piatti, G. Bacterial adherence in smokers and non-smokers / G. Piatti, T. Gazzola, L. Allegra // Pharmocol.Res. 1997. - Vol. 36. - P.481-484.

128. Polito, A.J. Epithelil cells as regulators of airway inflammation/ A.J. Polito, D. Proud//J Allergy Clin Immunol. 1998. -Vol.102. - P.714-718.

129. Ponton, J. Reactivity of Candida albicans germ tubes with salivary secretory IgA / J. Ponton, J. Bikandi, M.D. Moragues // J. Dent. Res. -1996. -Vol. 75.-P. 1979-1985.

130. Quinn, M.O. Increased salivary exoglycosidase activity during critical illness / M.O. Quinn, V.E. Miller, A.R. Dal Nogare // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994. - Vol. 150. - P.179-183.

131. Rangel-Frausto, M. S. An experimental model for study of Candida survival and transmission in human volunteers / M.S. Rangel-Frausto, A.K. Houston, M.J. Bale, // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis. -1994. -Vol. 13.-P. 590-595.

132. Rastogi, D. Host-bacterial interactions in the initiations of inflammation / D. Rastogi, A.G. Rather, A. Prince // Paediatr Respir Rev. 2001. -Vol. 2. - P.245-52.

133. Ray, T.L. Adherence of Candida species to human epidermal corneo-cytes and buccal mucosal cutaneous pathogenicity / T.L. Ray, C.D. Payne // J.Invest. Dermatol. -1984. -Vol. 83. -P. 37-41.

134. Rhee, K.J. Role of commensal bacteria in development of gut-associated lymphoid tissues and preimmune antibody repertoire / K.J. Rhee, P. Sethupathi, A. Driks // J Immunol. -2004. -Vol. 172, № 2. -P. 1118-24.

135. Rico, H. An electron microscopy study of wall expansion during Candida albicans yeast and mycelial growth using concanavalin A-ferritin labelling of mannoproteins / H. Rico, E. Herrero, F. Miragall // Arch. Microbiol. -1991.-Vol. 156. -P. 111-114.

136. Rodier, M.H. Immunoglobulins G could prevent adherence of Candida albicans to polystyrene and extracellular matrix components/ M.H. Rodier, C. Imbert, C. Kauffmann-Lacroix // J. Med. Microbiol. -2003. -Vol. 52. (Pt 5). -P. 373-7.

137. Rouabhia, M. Interleukin-18 and gamma interferon production by oral epithelial cells in response to exposure to Candida albicans or lipopolysac-caride stimulation/ M. Rouabhia, G. Ross, N. Page // Infect Immun. 2002. -Vol. 70. -P.7073-7080.

138. Ruissen, A.L. Internalisation and degradation of histatin 5 by Candida albicans / A.L. Ruissen, J. Groenink, P.Krijtenberg // Biol. Chem. -2003. -Vol. 384,№ l.-P. 183-90.

139. San Millan, R. Effect of salivary secretory IgA on the adhesion of Candida albicans to polystyrene/ R. San Millan, N. Elguezabal, P. Regulez // Microbiology. -2000. -Vol. 146. -P. 2105-12.

140. Schmalz, G. Release of prostaglandin E2, IL-6 and IL-8 from human oral epithelial culture models after exposure to compounds of dental materials/ G. Schmalz, H. Schweiki, K.A.Hiller // Eur.J. Oral Sci. 2000. - Vol. 108. - P.442-448.

141. Schmid, J. Computer-assisted methods for assessing strain relatedness in Candida albicans by fingerprinting with the moderately repetitive sequence Ca3/ J. Schmid, E. Voss, D.R. Soil // J. Clin. Microbiol. -1990. -Vol. 28, №6. -P. 1236-1243.

142. Segal, E. Inhibitors of Candida albicans adhesion to prevent candidiasis / E. Segal // Adv. Exp. Med. Biol.- 1996. -Vol. 408. -P.197-206.

143. Segal, E. Adhesion of Candida albicans to epithlial cells- effect of nikkomycin / E. Segal, S.Gottlieb, Z. Altboum // Mycoses. -1997. -Vol. 40. -P.33-39.

144. Segal, E. Correlative relationship between adherence of Candida albicans to human vaginal epithelial cells in vitro and candidal vaginitis / E. Segal, A. Soroka, A. Schecter// Sabouraudia. -1984. -Vol. 22. -P. 191-200.

145. Sherwood, J. Contact sensing in Candida albicans: a possible aid to epithelial penetration / J. Sherwood, N.A.R. Gow, G.M. Gooday // J. Med. Vet. Mycol. -1992. -Vol. 30. -P.461-469.

146. Simon, L. Is Phagocytosed, Killed, and Processed for Antigen Presentation by Human Dendritic Cells/ L. Simon and H. Angela. // Infect Immun. -2001. -Vol. 69, № 11. -P.6813-22.

147. Smith, J.K. Effect of interferon alpha on HLA-DR expression by human buccal epithelium / J.K. Smith, D.S.Chi, G. Krishnaswamy //Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 1996. -Vol. 44. - P.83-88.

148. Smith, J.K. Oral use ofi nterferon-alpha stimulates ISG-15 transcription and production by human buccal epithelial cells / J.K. Smith, A.A. Sid-diqui, G.A. Krishnaswamy //J. Interferon Cytokine Res. 1999. - Vol. 19. -P.923-928.

149. Soares, R.M. Identification of sialic acids on the cell surface of Candida albicans / R.M. Soares, R.M. de A. Soares, D.S. Alviano // Biochim. Biophys. Acta. -2000, № 2. -P.262-268.

150. Soil, D.R. High-frequency switching in Candida albicans/ D.R. Soli // Clin. Microbiol. Rev. -1992. -Vol. 5, № 2. -P. 183-203.

151. Sricanta, T. The frequency of integrative transformation at phase-specific genes of Candida albicans correlates with their transcriptional state / T. Sricanta, B. Morrow, D.R. Soil // Mol. Gen. Genet. -1995. -Vol. 246, № 3. -P. 342-352.

152. Stadnyk, A.W. Cytokine production by epithelial cells/ A.W. Stadnyk // FASEB J. -1994. Vol. 8. -P.1041-1047.

153. Steele, C. Citocine and chemokine production bu human oral and vaginal epithelial cells in response to Candida albicans / C. Steele, P.L. Fidel // Infect immune. 2002. -Vol. 2. -P.577-83.

154. Sturtevant, J. Candida albicans adhesins: biochemical aspects and virulence / J. Sturtevant, R.Calderone // Rev. Jberoam. Micol. -1997. -Vol. 14. -P.90-97.

155. Sundstrom, P. Adhesion in Candida spp / P. Sundstrom // Cell Microbiol. -2002. -Vol. 8. -P.461-469.

156. Suzuki,K. Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes / K. Suzuki, H. Ota, S. Sasagawa // Anal Biochem. -1983. -Vol. 132, № 2. -P.345-52.

157. Svanborg, C. Cytokine responses during mucosal infections: role in disease pathogenesis and host defence / C. Svanborg, G. Godaly, M. Hed-lund // Curr Opin Microbiol. 1999. - Vol. 2. -P.99-105.

158. Takizawa, H. Airway epithelial cells as regulators of inflammation /

159. H. Takizawa // Int J Mol Med. -1998. -Vol. 1. -P.367-78.

160. Tanida, T. Decreased excretion of antimicrobial proteins and peptides in saliva of patients with oral candidiasis / T. Tanida, T. Okamoto, A.Oka-moto // J Oral Pathol Med. -2003. -Vol. 32, № io. -P. 586-94.

161. Theaker, E.D. The possible influence of the menstrual cycle on the adherence of Candida albicans to human buccal epithelial cells in vitro / E.D. Theaker, D.B. Drucker, A.C. Gibbs // Arch Oral Biol. 1993. - Vol. 38. - P.353-355.

162. Topley and Wilson's. Microbiology and Microbial Infections. Vol. Medical Mycology. 9th ed. 1999 (Online version).

163. Triantafilou, M. Lipopolysaccharide recognition: CD 14, TLRs and the LPS-activation cluster / M. Triantafilou, K. Triantafilou // Trends Immunol. -2002. -Vol. 23. -P. 301-305.

164. Tronchin, G. Fungal cell adhesion molecules in Candida albicans / G. Tronchin, J.P. Bouchara, V. Annaix // Eur. J. Cell. Biol. -1991. -Vol. 7, №1.-P. 23-33.

165. Tsang, C.S. Factors affecting the adherence of Candida albicans to human buccal epithelial cells in human immunodeficiency virus infection/C. S. Tsang, L.P. Samaranayake // J. Dermatol. 1999. - Vol. 141. - P.852-858.

166. Umazume, M. Reduced inhibition of Candida albicans adhesion by saliva from patients receiving oral cancer therapy / M. Umazume, E. Ueta, T. Osaki // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 432-439.

167. Underhill,D.M. Ozinscy A. Toll-lice receptors: key mediators of microbe detection / D.M. Underhill, A. Ozinscy // Curr. Opin. Immunol. -2002. -Vol. 14. -P.103-110.

168. Vasselon, T. Toll-receptors: a central element in innate immune responses/ T. Vasselon, P.A. Detmers // Inf. Immun. -2002. -Vol. 70. -P. 1033-1041.

169. Vazquez, J. A. Nosocomial acquisition of Candida albicans: an epidemiologic study / J.A. Vazquez, V. Sancher, C. Dmuchowski // J. Infect. Dis. -1993.-Vol. 168, №1.-P. 195-201.

170. Vazquez-Torres, A. Macrophages in Resistance to Candidiasis / A. Vazquez-Torres, E. Balish // Microbiol. Mol. Biol. Rev.- 1997.-P. 95-101.

171. Viljoen, B.C. Yeast associated with Chedda and Gouda making/ B.C.Viljoen, T.Greyling // Int.S.Food. Microbiol. -1995. -Vol. 28. -P. 79-88.

172. Vitkov, L. Candida attachment to oral epithelium / L. Vitkov, W.D. Krautgartner, M. Hannig // Oral Microbiol Immunol. -2002. -Vol. 17, № 1. -P.60-64.

173. Voss, A. Investigation of the sequence of colonization and candidemia in nonneutropenic patients / A. Voss, R.J. Hollis, M.A.Pfaller, //J. Clin. Microbiol. -1994. -Vol. 32. -P.975-980.

174. Walter, M.J. Interleukin 12 p40 production by barrier epithelial cells during airway inflammation / M.J. Walter, N. Kajiwara, P. Karanja // J Exp Med. 2001. -Vol. 193. -P.339-351.

175. Watts, H.J. Altered adherence in strains of Candida albicans harbouring null mutations in secreted aspartic proteinase genes / H.J. Watts, F.S. Cheah, B. Hube // FEMS Microbiol Lett. -1998. -Vol. 159, № 1. -P. 129-35.

176. Wehkamp, J. Innate immunity and colonic inflammation: enhanced expression of epithelial alpha-defensins / J. Wehkamp, B. Schwind, K.R. Herrlinger // Dig. Dis. Sci. 2002. - Vol. 47. - P. 1349-1355.

177. Weinmeister, K.D. Buccal cell carbohydrates are altered during critical illness / K.D. Weinmeister, A.R. Dal Nogare // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994. - Vol. 150. - P.131-134.

178. Wellmer, A. Adhesion of clinical Candida albicans isolate to buccal epithelial cells / A. Wellmer // Mycoses. -1999. -Vol. 42, № 1. -P. 43-7.

179. Wellme, A. Adherence on buccal epithelial cells and germ tube formation in the continuous flow culture of clinical Candida albicans isolated / A. Wellmer, H. Berhardt // Mycoses. -1997. -Vol. 40. -P. 363-368.

180. White, T.C. Candida albicans secreted aspartyl proteinases: isoenzyme pattern is determined by cell type, and levels are determined by environmental factors / T.C. White, N. Agabian // J. Bacteriol. -1995. -Vol. 177. -P. 5215-5221.

181. Williams, D.W. Adherence of Candida albicans to oral epithelial cells differentiated by Papanicolaou staining / D.W. Williams, R. Walker, M. Lewis //J. Clin. Pathol. -1999. -Vol.52. P.529-531.

182. Woods, D.E. Role of salivary protease activity in adherence of gramnegative bacilli to mammalian buccal epithelial cells in vivo/ D.E. Woods, D.C.Straus, W.G.Johanson// J. Clin. Invest. 1981. -Vol. 68. -P. 143 5-1440.

183. Wozniak, K.L. Candida-specific antibodies during experimental vaginal candidiasis in mice 1/ K.L. Wozniak, F.L. Jr. Wormley, P.L. Jr. Fidel // Infect Immun. -2002. -Vol. 70, № 10. -P. 5790-9.

184. Wu, S. Effects of systemic fluconazole therapy on in vitro adhesion of Candida albicans to buccal epithelial cells and changes of cell surface proteins of the epithelial cells / S. Wu, N. Guo, Y. Hou //Chin. Med. Sei. J. -1996.-Vol. 11.- P.45-48.

185. Wunder, D. Human salivary histatin 5 fungicidal action does not induce programmed cell death pathways in C. albicans/ D. Wunder, J. Dong, D. Baev// Antimicrob Agents Chemother. -2004. -Vol. 48, № 1. -P. 110-5.

186. Xu, T. Anticandidal activity of major human salivary histatins / T. Xu, S.M.Levitz, R.D.Diamond//Infect Immun.-1991.-Vol. 59, № 8. -P. 2549-54.

187. Yanagita, M. IL-15 up-regulates iNOS expression and NO production by gingival epithelial cells/ M. Yanagita, Y. Shimabucuro, T. Nozaki// Bio-chem Biophys Res Commun. 2002. -Vol. 297. - P.329-34.

188. Yu, Z. Partial characterization of a Candida albicans fimbrial adhesin/ Z. Yu, K.K. Zee, K. Ens // Infect. Immun. -1994. -Vol. 62. -P. 2834-2842.

Информация о работе

Махрова, Татьяна Владимировна
кандидата медицинских наук
Челябинск, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Факторы и условия, влияющие на адгезивную активность Candida albicans в системах с буккальными эпителиоцитами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы