Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка комплексных препаратов для профилактики и диагностики газовой гангрены

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грязнова, Диана Васильевна, Пермь

/

На правах рукописи

ГРЯЗНОВА Диана Васильевна

РАЗРАБОТКА

КОМПЛЕКСНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ДИАГНОСТИКИ ГАЗОВОЙ ГАНГРЕНЫ

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, Ефимова Н.П.

кандидат биологических наук Николаева A.M.

Пермь - 1999

Оглавление

Оглавление.............................................................................................................1

Введение 3

Глава 1. Обзор литературы..................................................................................8

ГЛАВА 2. Материалы и методы............................... .............................................23

2.1. Материалы.....................................................................................23

2.2 Методы..................................... ......................................................26

Глава 3. Разработка унифицированной технологии изготовления гагреноз-ных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения и иммунобиологическая оценка полученных препаратов 31

3.1. Разработка технологии получения анатоксина септикум 32

3.2. Усовершенствование технологии получения анатоксина эдематиенс 43

3.3. Получение анатоксина гистолитикум 46

3.4. Получение тетраанатоксина 47 глава 4. Получение антительных препаратов 51

4.1. Получение иммунной лошадиной сыворотки 52

4.2. Получение иммунных кроличьих сывороток 55

4.3. Выделение Р(аЬ)2-фрагментов очищенных антител кролика

и лошади 56

Глава 5. Разработка иммуноферментных тест-систем для экспрессного

определения гангренозных токсинов-анатоксинов (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум)................................................63

5.1. Конструирование иммуноферментных тест-систем...................63

5.2. Авидин-биотиновый вариант ИФТС для индикации гангренозных токсинов-анатоксинов 68

5.3. Применение ИФА для оценки гангренозных токсинов-анатоксинов в условиях производства 71

5.4. Оценка авидин-биотинового варианта ИФА при экспериментальной газовой гангрене у животных.......................................74

Заключение..........................................................................................................77

Выводы ............................................................................................................... 86

Список литературы..............................................................................................87

список основных сокращений

ЕС - единица связывания МЕ - международная единица

НОММ - номинально отсекаемая молекулярная масса

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФТС - иммуноферментная тест-система

ВМП - высокомолекулярные пептиды

СМП - среднемолекулярные пептиды

НМП - низкомолекулярные пептиды

Введение

Широко распространенные во внешней среде клостридии являются возбудителями различных инфекционных заболеваний человека и животных [25,37, 95, 97, 181, 191 240, 241, 284].

Анаэробная газовая инфекция относится к числу травматических кло-стридиозов и характеризуется высокой степенью летальности [41, 267, 268]. Предрасполагающими к развитию газовой гангрены являются открытые травмы, трудно поддающиеся хирургической обработке (размозженные раны с явлениями ишемии, некроза, наличием инородных тел и загрязнения почвой, огнестрельные раны, открытые переломы и т.п.), а также послеоперационные раны на толстой кишке или на «ишемических конечностях» на фоне облите-рирующего эндартериита [3,70,112,220,221,271].

Газовая гангрена относится в основном к инфекциям военного времени, когда при массовом травматизме создаются благоприятные условия для инфицирования ран. Вместе с тем, анаэробная газовая инфекция не утратила своего значения и в мирное время, особенно в современных условиях, когда наблюдается повышение уровня дорожно-транспортного, производственного, бытового травматизма, а также ранений и ожогов в результате региональных конфликтов и стихийных бедствий [25,87,176,177,205].

В связи с этим проблема диагностики, лечения и предупреждения кло-стридиозов у людей остается актуальной для здравоохранения.

Анаэробная инфекция является полимикробным заболеванием и вызывается С. рег£г^еп8 типа А, С. оеёетайеш типа А, С. Берйсит, С. Ыз1:о1у1:]1С1Ш1, С. БОгс1еШ, С. fallax и др. Причем, большинство исследователей в качестве главных называют только первые четыре вида возбудителей. Флора при анаэробной инфекции чаще всего носит полимикробный характер и представляет различные ассоциации самих возбудителей газовой гангрены или же их сочетание с аэробными микроорганизмами [25, 37.111,113,268 ]. При смешанном характере

инфекции отмечается потенциирующее действие основных возбудителей газовой гангрены [113,115,119,120,192]. Учитывая то, что в этиологии газовой гангрены ведущее место принадлежит в убывающей последовательности 4 видам клостридий (С. регШ^еш, С. оеёетайепБ, С. Берйсит, С. ЫбШ^Исшп), представляется важной проблема создания комплексных препаратов для иммунодиагностики, лечения и предупреждения клостридиозов, вызываемых возбудителями всей этой группы. Решение этой проблемы возможно только при условии получения высокоактивных гангренозных моноанатоксинов, которые можно использовать как для включения в комплексный прививочный препарат (тет-раанатоксин), так и при конструировании иммуноферментных тест-систем, предназначенных для иммунодиагностики газовой гангрены. Цель работы:

Получение гангренозных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения и создание на их основе комплексных препаратов для профилактики и диагностики газовой гангрены. Основные зада чи исследования:

1. Экспериментальная разработка унифицированного способа получения гангренозных анатоксинов (эдематиенс, септикум, гистолитикум) с использованием мембранных методов разделения.

2. Изучение возможности использования полученных анатоксинов в составе комплексного препарата - тетраанатоксина. Оценка иммунобиологических свойств тетраанатоксина.

3. Получение поливалентной противогангренозной сыворотки (противопер-фрингенс, противоэдематиенс, противосептикум, противогистолитикум) с использованием в качестве иммунизирующего препарата - тетраанатоксина.

4. Получение противогангренозных антительных препаратов (перфрингенс, эдематиенс, септику^, гистолитикум) на основе Р(аЬ)г-фрагментов аффин-ноочищенных антител для конструирования иммуноферментных тест-систем (ИФТС).

5. Разработка иммуноферментных тест-систем для экспрессного определения гангренозных токсинов-анатоксинов (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум).

6. Оценка чувствительности и специфичности разработанных тест-систем в условиях производства гангренозных анатоксинов и на модели экспериментальной газовой гангрены у животных.

На учная новизна и практическая ценность:

1. Показана перспективность использования анатоксинов, полученных с использованием мембранных методов разделения в составе комплексного препарата - тетраанатоксина.

2. Впервые получена поливалентная (тетра-) противогангренозная лошадиная сыворотка с высоким содержанием антител (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум).

3. Впервые получены и оценены в условиях производства высокочувствительные ИФТС на основе Р(аЬ)2-фрагментов аффинноочищенных противоган-гренозных антител (перфрингенс, эдематиенс, септикум, гистолитикум).

4. Разработана методика количественного иммуноферментного определения гангренозных токсинов-анатоксинов, обеспечивающая получение результатов, сравнимых с результатами реакции нейтрализации на белых мышах.

5. Впервые для выявления экзоантигенов основных возбудителей анаэробной газовой инфекции предложен быстрый и легко воспроизводимый вариант иммуноферментного анализа, основанный на использовании сэндвич-модификации, усиленной за счет авидин-биотинового взаимодействия. Метод позволяет воспроизводимо выявлять до 0,02 нг антигенов при высокой специфичности иммуноанализа.

6. Показана возможность использования авидин-биотинового варианта ИФА для обнаружения токсинов 4 видов клостридий при экспериментальной газовой гангрене у морских свинок.

7. Разработана унифицированная технология изготовления гангренозных анатоксинов (эдематиенс, септикум, гистолитикум) с использоваанием мембранных методов разделения, обеспечивающая получение монопрепаратов, обладающих высокой удельной и иммуногенной активностью.

8. Оформлена нормативно-техническая документация, утвержденная НТС НПО «Биомед» и прошедшая экспертизу в ГИСК им. Л.А.Тарасевича (экспериментально-производственные регламенты на анатоксин септикум очищенный сорбированный и анатоксин гистолитикум очищенный сорбированный).

9. На основании проведенных исследований разработана технология изготовления иммуноферментных тест-систем для определения экзоантигенов основных возбудителей анаэробной газовой инфекции (С. регМпёепБ типа А, С. оеёетайепБ типа А, С. Берйсшп, С. 1ш1:о1у1:1сит).

10. Оформлена нормативно-техническая документация, утвержденная НТС НПО "Биомед": инструкция по изготовлению и контролю "Тест-система иммуноферментная для выявления экзоантигенов возбудителей анаэробной газовой инфекции (С. регМ^епя типа А, С. оедета^еш типа А, С. зерйсит, С. Ыз1:о1уйсит).»

Положения, выносимые на защиту:

1. Унифицированная технология получения гангренозных анатоксинов с использованием мембранных методов разделения.

2. Гангренозный тетраанатоксин - базовый препарат для осуществления системы иммунопрофилактики и получения антительных препаратов.

3. Технология изготовления ИФТС (сэндвич-вариант и авидин-биотиновая модификация сэндвич-варианта) для выявления экзоантигенов возбудителей анаэробной газовой инфекции (С. регйтг^епБ, С. оеёетаиеш, С. Берй-сит, С. ЬпзиЯуйсит).

4. Методика количественного иммуноферментного определения гангренозных токсинов-анатоксинов, обеспечивающая получение результатов, сопоставимых с результатами реакции нейтрализации на белых мышах.

5. Индикация токсинов 4-х видов клостридий с использованием авидин-биотинового вариант а ИФА для ранней диагностики газовой гангрены.

Глава 1. Обзор литературы

Клостридиозы - болезни людей и животных, вызываемые патогенными клостридиями, до настоящего времени наносят ощутимый ущерб здоровью населения. Перечень клостридиальных инфекций возглавляют ботулизм, столбняк, газовая гангрена.

Патогенные клостридии широко распространены в природе вследствие размножения их вегетативных форм в желудочно-кишечном тракте человека и животных, длительного сохранения спор в почве и обширного рассеивания с экскрементами животных, пылью и предметами хозяйственной деятельности человека [25,113].

К числу видов клостридии, имеющих первостепенное значение в патологии, относятся С. botulinum, С. perfringens, С. tetani, С. oedematiens, С. septicum, С. histolyticum, С. bifermentans, С. fallax, С. chavoei. Основной биологической особенностью патогенных клостридий является способность продуцировать высокоактивные токсины, которые при воздействии на определенные структуры макроорганизма нарушают нормальную функцию последних, обусловливая тем самым развитие специфических и весьма опасных для жизни патологических состояний [25,37,46,51,99,111].

Газовая гангрена (газовая инфекция или анаэробная инфекция) представляет собой грозное инфекционное осложнение травматических повреждений самого различного характера (ранений, ожогов, обморожений и т.д.). Газовая гангрена относится к числу наиболее острых и летальных инфекционных болезней. Без своевременных методов лечения шансы заболевшего на выздоровление невелики [3,21,25,47,229].

Наиболее часто газовая гангрена наблюдается во время войн, а также при особо грандиозных катастрофах мирного времени, сопровождающихся

большим числом тяжелых травм [3,177]. Впервые эта болезнь была четко определена и описана Н.И. Пироговым во время Крымской войны (1853 - 1856).

Данные о заболеваемости газовой гангреной во время второй мировой войны значительно варьируют. Так, в американской армии анаэробная инфекция наблюдалась у 1,8 % раненых, в английской - 0,73 % случаев, в болгарской - 1,7 %, в советской армии - 1-2 % раненых. Летальность при этом составляла в среднем 36 %, а при тяжелых формах анаэробной инфекции достигала 55 - 60 % [3,14,33,216,217].

В мирное время анаэробная инфекция встречается в виде спорадических случаев [20,21, 113,225,231,259]. Наиболее часто она осложняет производственные, бытовые, уличные травмы и ранения сельскохозяйственными орудиями. При этом клостридии достаточно широко представлены в ранах [52,187,189]. При свежих открытых повреждениях они обнаруживаются в 40,1 %, при бытовой травме - в 10 %, при уличной - в 54 %, при железнодорожной - почти в 100 % случаев [3].

В литературе имеются данные о возрастании роли анаэробов в этиологии госпитальной инфекции [12,19,99,172,217]. При нарушении режима асептики, а также вследствие контаминирования помещений операционной и хирургических инструментов через кондиционеры, газовая гангрена является нередким послеоперационным, в том числе послеродовым или постабортным осложнением, сопровождающимся иногда массивным гемолизом [22,99,172,179].

Зарегистрированы случаи анаэробной клостридиальной инфекции при оперативном вмешательстве на желудочно-кишечном тракте, при таких медицинских процедурах, как взятие крови и инъекции лекарственных препаратов [108,129,217].

Вспышка газовой гангрены может развиваться из дремлющих очагов инфекции в рубцах и грануляционной ткани. Рецидив клостридиальной ин-

фекции иногда наступает даже спустя 20 лет после перенесенной инфекции

[3].

Следует отметить, что гамма клостридиальных инфекций не ограничивается только раневыми инфекциями.

В последние два десятилетия выделилась новая клостридиальная болезнь - бактериемия, вызываемая С. регМг^епБ и С. БерЬсит. Летальность при клостридиальном сепсисе достигает 42-45 % [164,224,237].

Сепсис, вызываемый С. Берйсит, рассматривают как одну из госпитальных инфекций, возникающую у пациентов со злокачественными опухолями кишечной локализации или у больных с лейкемией и пациентов с анти-биотико-индуцированным агранулоцитозом. С. Берйсит обусловливает патогенез кишечных поражений ( изъязвления, геморрагии, некроз) в дистальной части подвздошной или слепой кишки, которые в клинической практике именуют нейтропеническим энтероколитом, влекущим бактериемию со смертельным исходом [226,262,279].

Газовая гангрена обусловлена патогенным действием клостридий в основном 4 видов - С. регй^епБ (70 - 80 %), С. оеёетаиеш (21 - 43 %), С. Берйсит (4-18 %), С. ЫэиЯуисит (4-6 %), которые нередко могут быть в ассоциациях друг с другом и, возможно с некоторыми другими микроорганизмами, не имеющими самостоятельного значения [71]. Как правило, это полибактериальная инфекция. Так, по данным М.М. Цехновицера, у больных газовой гангреной только С. регШг^еш обнаруживается в 20 - 77 % случаев, присутствие двух возбудителей - в 23 - 34 % и наличие трех возбудителей - в 13 - 50 % случаев [201]. В исследованиях Н.Д. Свищевой, из 50 случаев анаэробной инфекции в 34 выделен один из трех возбудителей, в 14 - два и в 3-х - три возбудителя инфекции. Кроме того, в ранах всех больных содержались аэробные бактерии [167].

По сообщению А.Н. Львова, случаи анаэробной инфекции с одним видом возбудителя составляют около 20 % заболеваний [110]. Во всех других случаях они вызываются ассоциациями клостридий.

В настоящее время установлено, что основную роль в патогенезе газовой инфекции играет интоксикация, подчиненную - бактериемия, причем интоксикация обусловливает общие проявления заболевания с вовлечением в процесс центральной нервной системы. Для клостридий основных возбудителей анаэробной газовой инфекции (С.регйтп^епз, С.оеёетайепБ, С. зерйсит, С.Ы51:о1у1псит) характерна способность выделять экзотоксины, вызывающие некроз соединительной ткани и мышц. Другое важное свойство токсинов -способность вызывать гемолиз, тромбоз сосудов, поражение миокарда, печени, почек [25,71,99,102,115,224,268].

Изучению антигенной структуры токсинов основных возбудителей газовой гангрены посвящено исключительно большое количество работ [46,51,62,63,64,72,73,89,111,115,133,230,274]. Установлено, что токсины, продуцируемые С. регй^епз, С. оес1етаиеп8, С. Берйсит, С. ЫзЫуйсит, имеют мозаичную структуру и представляет собой смесь белков (табл.1.1).

Таблица 1.1

Токсины и ферменты основных возбудителей газовой гангрены (С. регЛ-н^еш, С.оескта^ет, С. вер^сит, С. {шйЛМсит)

Виды а (3 У 5 8 е к V

СрегАг^еш типа А + - - - - + + + + +

С.оес1етаиеп8 типа А + - + + + - - - - -

С. БерЬюит + + - - - - - - + -

С. ЫбЫШсшп + + + - - - - - - -

Из 6 основных токсинов, продуцируемых С. регйг^еш типа А ц-токсин (гиалуронидаза), у-токсин (ДНК-аза) - ферменты, токсичность которых не установлена, Э-гемолизин обладает летальным действием, а а-токсин

(фосфолипаза С), к-токсин (коллагеназа) и л-токсин (протеиназа) являются ферментами с выраженными токсическими свойствами. Среди всех токсинов, секретируемых С.регйш^епз типа А, наибольшее значение при газовой гангрене имеет а-токсин, обладающий летальным, дермонекротизирующим, ле-цитиназным и гемолитическим действием [25,37,51,63,64,81,83,115,199].

С. оесктаиепБ типа А вырабатывает а-, у-, 5-, г- токсины: а-токсин обладает летальным, некр