Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие липосом с эритроцитами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие липосом с эритроцитами"

Кб

0с МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ 2 9 И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЭРНАНДЕС-ХИМЕНЕС Елена Изяславовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЛИПОСОМ С ЭРИТРОЦИТАМИ

03.00.02 —Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА, 1995

Работа выполнена в Российском Государственном Медицинском Университете (Москва) и Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, USA).

Научные руководители: академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Ю. А. Владимиров; профессор С. В. Гуи (USA).

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Г. Е. Добрецов;

доктор биологических наук А. С. Капрелъянц.

Ведущая организация: Институт электрохимии им. А. Н. Фрумкина РАН.

Защита состоится » " 'Z/Atf/CCcj*_ 1995 г.

в_часов на заседании Специализированного совета

К 084.14.04 при Российском Государственном Медицинском Университете по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного Медицинского Университета.

Автореферат разослан „. // • UsaJP __ 1995 года.

Ученый секретарь Совета к. м. н„ доцент

И. В. Буромский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Липосомы представляют собой замкнутые везикулы, образованные одной или несколькими двуслойными липидными мембранами в водной среде, и являются удобной моделью для изучения свойств липидных бислоев. В настоящее время открывается перспектива использования липосом в качестве переносчиков лекарственных веществ в организме [Оз^о, 1987].

Липосомы могут взаимодействовать с клетками разными путями, а именно: (1)адсорбироваться на клеточной поверхности; (2)сливаться с плазматической мембраной; (3)"захватываться" клетками (эндоцитоз) и (4)обмениваться липидами с клеточной мембраной. Во многом взаимодействие будет определяться типом клеток и строением их мембраны. Считается, что именно слияние липосомы с мембраной клетки-мишени обеспечивает наиболее эффективное "внедрение" экзогенных веществ, связанных с липосомами, в клетку. Этим, в частности, объясняется большой интерес исследователей к проблеме слияния липосом с клеточными мембранами.

Цель исследования. В настоящей работе рассматривается взаимодействие липосом с эритроцитарной мембраной. До сих пор слить эритроцитарную мембрану с липосоыальной удавалось лишь с помощью капсульных белков некоторых вирусов [1поие е! а1., 1985]. Тем не менее, высокая лизирующая активность этих белков в отношении клеточных мембран ограничивает их применение в экспериментах с живыми клетками. Главная цель нашего исследования - добиться слияния липосом с эритроцитами при условии сохранения клетками жизнеспособности. Однако прежде всего необходимо было разработать методику, с помощью

которой можно было бы проводить количественную и качественную оценку взаимодействия липосом с эритроцитами.

Научная новизна работы. Исследована роль липидов (фосфатидилсерина РЭ, фосфатидилхолина Р С, фосфатидил-этаноламина РЕ, холестерина СИ), входящих в состав липосом, при Са^+-опосредованном взаимодействии липосомальной и эритроцитарной мембран. Установлены зависимости адсорбции и слияния не только от наличия в' липосомах отрицательно заряженного фосфатидилсерина и концентрации ионов кальция в среде, но и от содержания в их мембранах холестерина. Найдено, что в одних и тех же условиях интактные эритроциты взаимодействуют с липосомами менее эффективно, чем их тени, полученные путем гемолиза эритроцитов в гипотонической среде. Показано, что обработка проназой снижает способность эритроцитарной мембраны адсорбировать липосомы в присутствии ионов кальция, а также сливаться с ними.

Обнаружено, что после обработки электрическим импульсом суспензии эритроцитов с липосомами, адсорбированными на клеточной поверхности при помощи полилизина, возможно слияние эритроцитарной и липосомальной мембран. Установлена необходимость набухания эритроцитов, вызванного электрообработкой, для того, чтобы это слияние состоялось. Найдено, что экзогенный гемоглобин способен связываться с поверхностью эритроцитов, предварительно обработанных полилизином. Результатом этого является подавление набухания эритроцитов после электрообработки, а также предотвращение их слияния с липосомами.

Практическая ценность. Отработана методика и предложены рассчетные формулы, позволяющие оценивать адсорбцию липосом на

поверхности клеток и слияние липосомального материала с клеточной мембраной.

Подобран состав липосом, способных сливаться с эритроцитами в присутствии ионов кальция в физиологической концентрации - 1мМ, что открывает перспективу проведения экспериментов in vivo.

Электрический импульс, не приводящий к гемолизу эритроцитов, также может быть, использован в целях слияния липосом с эритроцитами.

Апробация_работы. Основные результаты работы

докладывались на объединенном семинаре отделения биофизики и лаборатории мембран Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, USA, 19-94) ; на семинаре лаборатории биоэлектрохимии мембран Института электрохимии РАН (1995). Работа апробировалась на заседании кафедры биофизики МВФ РГМУ (1995).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 научных работы, названия которых приведены в конце автореферата.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части (результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа состоит из трех глав и изложена на feo страницах, включая у таблицы и ¿8 рисунков. Список литературы содержит ВО ссылок.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Приготовление липосом. Липосомы готовились методом экструзии. Смесь четырех липидов (PS, PC, PE, Ch) и флуоресцентного красителя родамин-фосфатидилэтаноламина Rh-PE (5 моль% во всех экспериментах) в хлороформе подвергалась вакуумному выпариванию на ротационном испарителе. Сухая пленка липидов смывалась буфером и ресуспендировалась. Полученная

суспензия продавливалась через поликарбонатные фильтры с порами определенного диаметра. Средний размер липосом определялся методом лазерного светорассеяния ("NICOM" Particle Size System). Для экспериментов по Са^+ -индуциров энному слиянию готовились липосомы диаметром 80-100нм; в экспериментах по электрослиянию использовались липосомы с бблыпим диаметром - около 200 нм.

А. Са^+-нндуцнрованное взаимодсйствяс липосом с мембраной эритроцита Объект и основные растворы. Эксперименты проводились на кроличьих эритроцитах и их тенях. Основной средой служил изотонический фосфатный буфер (150mM NaCl, 5mM NaP^, рН 7.35).

Приготовление теней эритроцитов. Тени готовились по методу Dodge (1963), согласно которому к отмытым и осажденным эритроцитам добавлялся гипотонический фосфатный буфер (150 тОзт). Отмытые тени ресуспендировали в изотоническом буфере в концентрации 1О10/мл. В отдельных экспериментах тени инкубировали в специальном солевом растворе (125mM NaCl, 5тМ КС1, 3.8тМ CaCl2, 2.5тМ MgCl2, 5тМ TRIS-HC1, рН 7.4) в течение 1 часа при 37°С с целью получения замкнутых теней.

Инкубация и флуоресцентные измерения. Инкубация эритроцитов (или их теней) с липосомами протекала в присутствии ионов кальция ( до 3 мМ ) при температуре 37°С в течение 2-3 часов. В ряде опытов перед инкубацией с липосомами —эритроциты-обрабатывались—проназой—Е—(-1—мг/мл,—30—мин,—37 °С) .

После инкубации с липосомами клетки (или тени) осаждались, содержащий свободные липосомы супернатант удалялся. Если

липосомы инкубировались изначально с эритроцитами, то

непосредственно перед флуоресцентными измерениями из

эритроцитов готовились тени. В итоге полученные тени

ресуспендировали в изотоническом фосфатном буфере и измеряли

интенсивность флуоресценции до и после добавления детергента тритона Х-100 (0.1%). Интенсивность флуоресценции образцов (Хех - 500 шп, Хед - 585 гш) измерялась на спектрофлуориметре "SLM-AMINCO 8000".

Определение ассоциации и слияния липосомального материала с мембраной эритроцита. В работе использовались липосомы, содержащие липидный флуоресцентный краситель в концентрации, при которой происходит тушение флуоресценции. При адсорбции таких липосом на клеточной мембране интенсивность флуоресценции образца не меняется. Однако, как только часть липосомального материала попадает в клеточную мембрану (в результате слияния, полуслияния или липидного обмена), происходит разбавление красителя, результатом чего является увеличение флуоресценции образца. На основе этого была произведена оценка взаимодействия липосом с эритроцитарной мембраной. Общее количество липосомального материала, связанного с одной клеткой, N (моль/клетка), и та его часть, которая слилась с клеточной мембраной ("индекс слияния"), F (%), рассчитывались по следующим формулам:

ХЯ1 -1ь

(1)

----100%

к * 1 (2,

где 1д1 и Ig.it ~ интенсивность флуоресценции клеточно-липосомальной суспензии/ соответственно, до и после добавления детергента; и 1ц- - интенсивность флуоресценции липосо-мальной суспензии, соответственно, до и после добавления детергента; - интенсивность флуоресценции буфера; И -

7

исходное количество липосомального материала, приходящееся на одну клетку во время инкубации (моль/клетка); к - коэффициент тушения липосомальной суспензии:

k - (IiflbJ/di-Ib) (3)

Б. Слияние липосом с эритроцитами, индуцированное электрическим импульсом Объект и основные растворы. В экспериментах использовались человеческие эритроциты. Базовым раствором служил HEPES-буфер (5мМ HEPES, 150мМЯаС1, 300 mOsm, рН 7.4). В специальных экспериментах в буфер добавляли декстран (5 mM HEPES, 142 тМ NaCl, 15 тМ dextran (8.8 kDa); 300 mOsm; рН 7.4). Раствор полилизина в HEPES-буфере (200 цг/мл, 8kDa, Sigma) готовился в силиконовой пробирке перед каждым экспериментом.

Электрослияние.Процедура электрослияния обычно проводится в три этапа: (1) приведение в контакт взаимодействующие мембраны; (2) наложение высоковольтного электрического импульса и (3) инкубация в определенных условиях.

1. Прикрепление липосом к поверхности эритроцитов. Липосомы (PS/PC/Ch/Rh-PE в молярном отношении 10:40:45:5) прикреплялись к несущей отрицательные заряды эритроцитарной мембране с помощью полилизина. С этой целью эритроциты сначала "покрывались" 'положительно заряженным полилизином (20цг/мл): их инкубация протекала при 4°С в течение 15 мин. Обработанные

полилизином-эритроцитьг-инкубировались с липосомами—( 37°—С,

15 мин. ). После удаления супернатанта эритроциты ресуспенди-ровали в 1 мл буфера.

2.Электрообработка. Экспоненциальный импульс (Е-0.1-3 кВ/см, т1/2~°•1~0>5 мс) получгли с помощью высоковольтного импульсного генератора (Model Permeator ЕС-102, Electrocell Inc., NY). Эритроциты с липосомами, прикрепленными к клеточной

поверхности с помощью полилизина, подвергались действию единичного электрического импульса в специальной пластмассовой кювете, в которую помещались два плоскопараллельных золотых электрода с расстоянием между ними 2 мм и объемом 1 мл.

3.Инкубация. После электрообработки эритроциты инкубировались в этой же кювете в течение 30 мин. при 37°С.

Флуоресцентные измерения. Обработанные электрическим импульсом эритроциты лизировапись добавлением дистиллированной воды, их тени промывались и в итоге ресуспендировались в HEPES-буфере. Интенсивность флуоресценции измерялась до и после добавления детергента Triton Х-100 (0.1%) при Хах — 500 nm и Хет — 585 nm на спектрофлуориметре "SLM-AMINCO 8000". Индекс слияния липосомального материала с эритроцитарной мембраной (F,%) рассчитывался по формуле (2).

Определение гемолиза. Гемолиз эритроцитов, подвергшихся электрообработке, определялся по концентрации гемоглобина в супернатанте методом поглощения при 415 нм.

Определение набухания эритроцитов методом гематокрита. 5цл суспензии эритроцитов через определенные промежутки времени набирались в гематокритные капилляры и центрифугировались в специальной центрифуге (Model MB, Internatianal Equipment Co., Boston, MA) при 10,000g в течение 1.5 мин. Затем измерялась высота седиментов, образованных эритроцитами (hи супернатантом (h3). Отношение V-he/hs представляет относительный объем клеток в суспензии. Относительное набухание эритроцитов рассчитывалось как:

S,% - (V/Vq) • 100% (4)

где V и VQ - относительные объемы, соответственно, обработанных и необработанных электрическим импульсом клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ А. Са^+-индуштрованное взаимодействие дипосом с мембраной эритроцита

Роль фосфолипидного состава липосом. Опираясь на полученные данные, мы можем предложить по крайней мере два механизма связывания липосом с тенями. Первый механизм, обусловленный взаимодействием ионов кальция с отрицательно заряженным фосфатидилсерином внешнего слоя липосомальной мембраны, приводит не только к адсорбции (рис.1а), но и к слиянию (рис.1Ь). Нелинейная зависимость индекса слияния Г от содержания РЭ в липосомальных мембранах, имеющая скачок между 5-10 моль% РЭ (рис.1Ь), может быть объяснена перераспределением РБ между внутренним и внешним слоями липидного Оислоя. Известно, что фосфатидилсерин в концентрациях менее 5-7моль% локализуется в основном во внутреннем слое мелких однослойных липосом и появляется во внешнем слое при концентрации приблизительно 10 моль%.

2.0

? 1.0

г 0.5

ю

О

" 0.0

"Г'

л

............г"

.....

.............Г-

-н

■л

5 10 15

-1Р5 I то1%

а).

20

5 10 15 (РБ 1, то!% Ь).

20

Рис.1. Зависимость взаимодействия липосом с тенями эритроцитов от содержания РБ в липосомальных мембранах при разных концентрациях Са^+ в среде. По оси абсцисс: содержание РЭ в мембранах липосом (моль!). По оси ординат:а - ассоциация липосом с тенями N. нмоль/тень Спто1/д1юз1:); Ь - индекс слияния Р (%) . Липосомы ( 10 моль% РЕ, 45 моль» СЬ, 5 моль% №-РЕ, содержание РБ менялось за счет РС ) инкубировались с тенями в течение 3 ч. в отсутствие ( А ) и в присутствии 1мМ (X), 2мМ (•), 3 (В) мМ Са2- .

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

60 u; 40 20 o

0 5 10 15

[PEI md% b).

Рис.2. Зависимость взаимодействия липосом с тенями эритроцитов от содержания РЕ в липосомальных мембранах. По оси абсцисс: содержание РЕ в мембранах липосом (моль%). По оси ординат:а - ассоциация липосом с тенями N, нмоль/тень (nmol/ghoat)¡ Ь - индекс слияния F (%). Липосомы ( 10 моль% PS, 45 моль% Ch, 5 моль% Rh-PE, содержание РЕ менялось за счет РС ) инкубировались с тенями в присутствии 3 ыМ в течение 3 ч.

1.5 г

1.0

0.5

0.0

10 20 30 40 [Ch 1 md% а).

80

60

40

20

50

10

20 "30 40 [Chl mo¡% Ь\

50

Рис.3. Зависимость взаимодейстьия липосом с тенями эритроцитов от содержания СИ в липосомальных мембранах: По оси абсцисс: содержание СЬ в мембранах липосом (моль %). По оси ордиыат:а - ассоциация липосом с тенями И, нмоль/тень (ппю1/дЬоз1); Ь - индекс слияния Г (*). Липосомы ( 10 моль% Р5, 10 моль% РЕ, 5 моль% ЯЬ-РЕ, содержание СЬ менялось за счет РС ) инкубировались о тенями в присутствии 3 мМ Са2+ в течение 3 ч.

Второй механизм, обусловленный взаимодействием ионов кальция с нейтральными фосфолипидами PC и РЕ, приводит лишь к адсорбции липосом на поверхности тени и требует более высокой концентрации ионов кальция в среде (2-3 мМ). О неспецифичности связывания Са2+ с PC и РЕ в данных условиях говорит тот факт, что замена до 15 моль% PC на РЕ практически не сказывается на характере связывания ( рис.2а ) и слияния ( рис.2Ь ) липосомального материала с эритроцитарной мембраной.

Однако оба механизма начинают эффективно "работать" только при содержании холестерина в липосомальных мембранах более 35 моль% (рис.За,Ь). Максимальная адсорбция и слияние достигаются при 45 моль%. Известно, что холестерин в концентрациях порядка 45 моль% сильно изменяет физико-химические свойства фосфолипидных мембран, в частности, способствует доменизации липидов. При концентрации менее 30 моль% холестерин распределен более или менее равномерно. При повышении концентрации холестерин преимущественно локализуется во внутреннем монослое, где цепи упакованы менее плотно, чем в наружном. При концентрации около 50 моль% холестерин начинает формировать "кристаллы" на поверхности липосом, закрывая собой домены фосфолипидов и места связывания с ионами кальция [Phillips, 1990]. Это, по-видимому, приводит

к резкому снижению способности липосом адсорбйроват ься на-

эритроцитарной мембране, а также сливаться с ней.

Роль мембраны эритроцита. Было установлено, что в одних и тех же условиях эритроциты взаимодействуют с липосомами намного слабее, чем их тени. Очевидно, это связано с тем, что мембрана тени эритроцита по своей структуре отличается от мембраны самой клетки.

Тени эритроцитов, приготовленные по методу Dodge (1963), имеют тот же размер, что и сами эритроциты, и не являются инвертированными. Гемолитические поры в тенях закрываются при инкуОации в солевом растворе (125 юМ NaCl, 5 mM KCl, 3.8 тМ СаС12, 2.5 MgCl2, 5 тМ TRIS-HC1, pH 7.4) при 37°С в течение часа. В наших экспериментах замкнутые и незамкнутые тени не отличались в плане взаимодействия с липосомами. Это свидетельствует о том, что подавляющее число липосом вступает во взаимодействие с внешней стороной мембраны тени, а не с внутренней.

Фосфолипиды, формирующие липидный матрикс мембраны нативного эритроцита, ассиметрично распределены между внешним и внутренним слоями липидного бислоя. В частности, весь отрицательно заряженный PS в норме прочно связан электростатическими силами со спектрином с внутренней стороны мембраны. При различных повреждениях цитоскелета, в том числе при гипотоническом шоке, связь между PS и спектрином нарушается, и PS появляется во внешнем слое мембраны [Dressler et al., 1983]. Не исключено, что увеличение адсорбции липосом на поверхности тени по сравнению с адсорбцией на мембране клетки связано, а том числе, и с наличием PS в наружном монослое мембраны тени.

Тем не менее, не имеющая во внешнем, контактном, слое PS, мембрана эритроцита в присутствии ионов кальция способна не только связываться, но и сливаться с PS-содержащими липосомами. Можно предположить, что определенную роль в этом играет гликокаликс, состоящий в основном из несущих отрицательный заряд гликопротеинов. Если эритроциты предварительно обработать пронаэой, которая, действуя на протеиновые участки гликокаликса, изменяет его структуру, то

связывание (и слияние) таких эритроцитов с липосомами значительно ослабеет. То же наблюдается и в' эксперименте с тенями, приготовленными из обработанных проназой эритроцитов.

По-видимому, имеется несколько путей связывания эритроцитарной мембраны с липосомами. Так, возможна связь гликокаликса и липосом посредством ионов Са^+ч При концентрации Са^4" 2-3 мМ возможна связь и с нейтральными фосфолипидами (РС,РЕ) мембраны эритроцита. У теней добавляется еще и связь с РЭ, который появляется во внешнем слое мембраны при разрушении спектриновой сети. В формировании "чувствительных" к слиянию мест не исключено участие и других компонентов клеточной мембраны, например, мембранных белков. Б. Слияние липосом с эритроцитами, индуцированное адпстричесхим юшульсок

Слияние и электрогемолиз. Идея основного эксперимента следующая: эритроциты сначала "покрываются* положительно заряженным полилизином, а затем инкубируются с РБ-содержащими липосомами. После удаления свободных липосом суспензия обрабатывается электрическим импульсом, инкувируется, а затем подвергается стандартному флуоресцентному анализу, в первой серии экспериментов суспензия эритроцитов с адсорбированными на поверхности липосомами в НЕРЕБ-буфере обрабатывалась экспоненциальным единичным электрическим импульсом длительностью О.Змс и амплитудой до 3 кВ/см (рис.4, кривая 1). Было найдено, что индекс слияния Г растет с увеличением силы импульса приблизительно до 0.6 кВ/см, однако затем резко падает и после 1 кВ/см не фиксируется.

Мы предположили, что увеличение слияния при низких амплитудах и его угнетение при высоких амплитудах - это разные по механизмам явления. Эти явления могут являться результатом двух известных в настоящее время эффектов, оказываемых на

X

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 E. kV/cm

100 80 60 40 20 0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 £ kV/cm

Рис.4. Слияние липосом с эритроцитами (Г,%) в зависимости от силы электрического имаульса.

Эритроцита с адсорбированными липосомами обрабатывались электрическим импульсом (Х]_/2~0 • Змс) в НЕРЕБ-Оуфере в отсутствие (1) и в присутствии 15 ыМ декстрана (2) .

Рис.5. Зависимость гемолиза эритроцитов (Н,%) от силы электрического импульса.

Покрытые полилизином эритроциты обрабатывались электрическим

импульсом (т^/2-0.Змс) в НЕРЕЭ-буфере в отсутствие (1) и в присутствии 15мМ декстрана (2).

эритроциты электрическим импульсом, - набухания и гемолиза [Kinosita and Tsong, 1977а,Ь,с].

Электропорация эритроцитов может вызвать их гемолиз. На рис.5 показана зависимость гемолиза от амплитуды электрического импульса. Сравнивая данные, представленные на рис.4 (кривая 1) и рис.5 (кривая 1), мы предположили, что гемолиз и слияние могут коррелировать друг с другом: когда начинается гемолиз, слияние подавляется (при £>0.6-0.8 кВ/см).

Слияние и набухание.- Эритроциты, подвергшиеся электрообработке, набухают. Их коллоидно-осмотический лизис может быть предотвращен, если уравновесить внешнее осмотическое давление с цитоплазматическим. Для этого во внешний раствор нужно добавить крупные молекулы, которые не могут проникать

через электропоры внутрь эритроцита [Kj.no3i.ta апсЗ Тзопд, 1978; Тзопд, 1987; Зегрегзи et а1., 1985]. Как изображено на рис.5 ¡кривая 2), присутствие 15 мМ декстрана в растворе сильно подавляет гемолиз эритроцитов после обработки электрическим импульсом. Более того, флуоресцентные измерения показывают, что если эритроциты с липосомами на поверхности подвергнуть такой же обработке в присутствии 15 мМ декстрана, то индекс слияния крайне низок и не имеет пиковой .зависимости (рис.4, кривая 2).

Сравнивая зависимости слияния (рис.6) и набухания (рис.7) эритроцитов от времени, можно отметить, что в первые 1-2 мин. после импульса ни слияния, ни набухания реально не наблюдается, а своих максимальных значений оба эффекта достигают примерно через 30 мин.

50 40 30 20 »0

0 10 20 30 40,- 50 60 ^ т'л

Рис.6.Зависимость слияния-

эритроцитов (Е, %) с липосомами от времени инкубации после электрообработки.

Эритроциты с адсорбированными липосомами обрабатывались

электрическим импульсом

(О.бкВ/см, 0.25мс) и инкубировались в НЕРЕЗ-вуфере.

10

40

50

20 30 t т'п

Рус - 7 - *зя яигимпг.ть набухания эритроцитов

в НЕРЕЗ-буфере от времени инкубации после электрообработки (О.бкВ/см, 0.25мс).

(1)-набухание эритроцитов, обработанных полилизином; (1а,1Ь,1с)-набухание эритроцитов, обработанных полилизином, а присутствии 50цл гемолизата; (2)-набухание эритроцитов, не обработанных полилизином; (2а)-набухание эритроцитов, не обработанных полилизином, в присутствии 50|хп гемолизата.

Влияние экзогенного гемоглобина на набухание эритроцитов и на их слияние с липосомами. Было установлено (рис.7), что если эритроциты обработать электрическим импульсом, не вызывающим гемолиза, то разницы в набухании покрытых (кривая 1) и непокрытых (кривая 2) полилизином клеток практически нет. Таким образом, полилизин не влияет на способность эритроцитов набухать после действия импульса. Очевидно также, что причина, по которой происходит угнетение набухания и слияния, должна быть связана с гемолизом эритроцитов, который начинается при импульсах, превышающих 0.7-0.8 кВ/см.

Чтобы получить гемолизат, 10^ эритроцитов лизировали в 1 мл дистиллированной воды. 50 цл гемолизата добавляли к обработанным и необработанным полилизином эритроцитам. На рис.7 показано, что: 1) если покрытые полилизином клетки обрабатываются электрическим импульсом в присутствии гемоглобина, то они реально не набухают (кривая 1а); (2) добавление гемоглобина в разное время после импульса останавливает набухание покрытых полилизином клеток (кривые 1Ь и 1с); (3) свободные от полилизина эритроциты одинаково набухают как в отсутствие (кривая 2), так и в присутствии (кривая 2а) гемоглобина.

Флуоресцентные измерения показали, что Юцл гемолизата значительно уменьшают индекс слияния, а 50цл полностью его угнетают. При этом не имеет значения, обработана ли суспензия в присутствии гемоглобина, или гемоглобин добавлен сразу же после импульса. Полученные. данные не могут быть интерпретированы в свете коллоидно-осмотического эффекта, так как концентрация внешнего гемоглобина очень мала (порядка 10~б М) и реально не влияет на осмолярность буфера.

Взаимодействие между полилизином и гемоглобином. К эритроцитам, обработанным полилизином, добавили воду. Через 10 мин. тени осадили, супернатант удалили. После двухкратной отмывки водой бьшо измерено поглощение при Х-415 нм полученной суспензии теней. Измерения показали, что после инкубации в собственном гемолизате тени, приготовленные из обработанных полилизином эритроцитов, поглощают сильнее, чем тени из интактных клеток, взятые в качестве контроля. Это дает основание предположить, что гемоглобин связывается с полилиэином на клеточной поверхности.

Число молекул гемоглобина п^, которые могут расположиться на поверхности эритроцита в один слой, приблизительно составляет 3-10^. Число связавшихся с эритроцитом молекул гемоглобина, паз' можно определить, измерив поглощение при Х-415 нм суспензии теней. Отношение паз к Пщ, показывает, сколько "слоев" формирует связанный полилизином гемоглобин около поверхности эритроцита. Согласно проведенным измерениям и последующим вычислениям, в результате добавления 50 цл гемолизата (в котором содержится столько же гемоглобина, сколько в 5% эритроцитов в образце) вокруг клеточной поверхности образуется по крайней мере 4-5 слоев гемоглобина, что оказывается достаточным для подавления набухания оставшихся целыми клеток и предотвращения их слияния с липосомами.

Механизм слияния эритроцитов с липосомами. Максимальный трансмембранный потенциал который возникает при наложении

внешнего электрического поля Е на "полюсах" равномерно суспедированных клеток сферической формы, определяется как:

Д^т - 1.5-Е-Я

где Я - радиус клетки.

Протеиновые каналы открываются при Д\|»т « 50 мВ, а в липидном матриксе порообразование начинается при Дч>т * 150-400 ыВ [Тзопд, 1992]. Таким образом, при действии электрического импульса силой Е - 0.5 кВ/см на эритроциты радиусом R - 5 рм, трансмембранный потенциал составляет 375 мВ. Этого достаточно, чтобы перфорировать мембрану эритроцита, но не липосомы.

Шанс образования поры в мембране эритроцита непосредственно в месте контакта мал, тем Солее, что липосома не обязательно прилегает к эритроцитарной мембране, а может удерживаться на некотором расстоянии от нее нитями полилизина. Механизм слияния, согласно которому пора в одной мембране (в данном случае это только эритроцитарная мембрана) индуцирует образование поры в прилегающей мембране, маловероятен по той же причине.

В литературе имеются данные о том, что электрический импульс модифицирует поверхность клетки, приводя к перераспределению заряженных компонентов на мембране и дестабилизируя липидный бислой [Sugar et al., 1987]. Кроме этого, электрооОработка приводит к набуханию эритроцита, которое, как оказалось, способствует слиянию. Обнаружилось, что гемоглобин, выходящий из гемолизировавшихся клетЬк и связывающийся с полилизином на поверхности эритроцита, способен предотвращать набухание. Не исключено, что крупные молекулы гемоглобина могут блокировать поры, образующиеся в эритроцитарной мембране в результате электрообработки,- и тем самым препятствовать быстрой диффузии ионов по концентрационному градиенту вглубь клетки. Чем плотнее "гемоглобиновое кольцо" вокруг эритроцита, тем лучше он "защищен" от набухания и последующего слияния с адсорбированными на его' поверхности липосомами. Вполне

вероятно, что молекулы гемоглобина могут препятствовать также и сближению эритроцитарной и липосомальной мембран, необходимому для успешного слияния.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В первой части работы была исследована роль липидов (РБ, РЕ, РС, СЬ), входящих в состав липосомальных мембран, и подобраны условия, при которых липосомы адсорбируются на эритроцитарной мембране и сливаются' с ней. В нашей системе таковыми являются: включение в липосомы не менее 10 моль% РЭ и 45 моль% СЬ, а также присутствие в среде порядка 2 мМ Са2+.

Во второй части работы решался вопрос о возможности использования электрического импульса для слияния липосом с эритроцитами. Было найдено, что обработка электрическим импульсом суспензии эритроцитов с липосомами, адсорбированными на их поверхности с помощью полилизина, в определенных условиях может привести к слиянию. В этом случае роль электрического импульса заключается в том, чтобы вызвать необходимые изменения эритроцитов, в частности, их набухание. Не исключается также, что электрический импульс на время дестабилизирует клеточную мембрану, что увеличивает вероятность слияния. При импульсах длительностью 0.3-0.5 мс и амплитудой, превышающей 0.8 кВ/см, начинается гемолиз эритроцитов. Гемоглобин, выходя в окружающую среду, связывается с полилизином на поверхности клеток и препятствует их набуханию и последующему слиянию с липосомами. Достаточно, чтобы в образце гемолизовались всего 4-5% эритроцитов, и набухание остальных будет полностью подавлено.

Слияние же клеточной и липосомальной мембран путем одновременного разрыва в месте контакта под действием электрического импульса маловероятно. Это вытекает из

полученных экспериментальных результатов и подтверждается литературными данными по электропорации, согласно которым сила импульса, лимитированная выживаемостью клеток, не достаточна для образования пор в мембране липосом.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Определен фосфолипидный состав липосом, при котором они способны не только адсорбироваться, но и сливаться с мембраной эритроцита в присутствии 1-3 мМ Са^+. Он включает в себя: а) не менее 10 моль% отрицательно заряженного РБ; б) 45 моль% холестерина; в) 45 моль% нейтральных фосфолипидов РС и РЕ (при этом РЕ в концентрации до 15 моль% может быть заменен РС без потери липосомами способности связываться и сливаться с эритроцитарной мембарной).

2. Найдено, что в одних и тех же условиях эффективность опосредованной ассоциации липосом с нативными эритроцитами Оолее чем в два раза ниже по сравнению с их тенями, полученными путем гемолиза эритроцитов в гипотонической среде.

3. Установлено, что предварительная обработка эритроцитов проназой приводит к уменьшению адсорбции (примерно в 2 раза) и слияния (приблизительно на 20%) эритроцитарной мембраны с РЯ-содержащиии липосомами в присутствии ионов кальция.

4. Установлено, что электрообработка может привести к слиянию эритроцитов с липосомами, адсорбированными на клеточной поверхности с помощью полилизина. При этом необходимо соблюдение следующего условия: электрический импульс должен быть таким, чтобы вызвать обратимое набухание эритроцитов, т.е. набухание, не приводящее к их гемолизу ( например, Е - 0.5-0.5 кВ/см, т1/2 - 0.3 мс ).

* t

5. Установлена непосредственная связь между набуханием эритроцитов, вызванным электрообработкой, и их слиянием с липосомами.

6. Найдено, что гемоглобин способен связываться с полилизином на поверхности эритроцитов и предотвращать их набухание и слияние с липосомами, адсорбированными на поверхности. Если в результате проведенной электрообработки гемолиэовалось хотя бы 5% эритроцитов в системе, набуханий остальных клеток будет подавлено и их слияние с липосомами предотвращено.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Hernandez-Jimenez E.I., Vladimirov Yu.A., Hui S.W. *Ca2+-induced interaction of acidic liposomes with erythrocyte membrane: I. The role of the liposome phospholipid composition in the interaction with hemolyzed erythrocyte ghosts."// Phys Chem Biol Med, 1995, 2 (2): ЮЪ -№%•

2. Hernandez-Jimenez E.I., Vladimirov Yu.A., Hui S.W. "Ca2+-induced interaction of acidic liposomes with erythrocyte membrane: II. The role of the erythrocyte membrane."// Phys Chem Biol Med 1995, 2 (2) : /09-ЦЬ.

Tup J CO ЦЗЗ

Предприятие «ПАТЕНТ». Москва, Г-59, Бережковская наб., '24