Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности биотехнологии липосомальных комплексов БАВ и биостимуляторов на основе природного дальневосточного сырья

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Особенности биотехнологии липосомальных комплексов БАВ и биостимуляторов на основе природного дальневосточного сырья"

РГ6 од

- 3 КПЗ Г.п

На правах рукописи

КАЛЕНИК Татьяна Кузьминична

ОСОБЕННОСТИ БИОТЕХНОЛОГИИ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ БАВ И БИОСТИМУЛЯТОРОВ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНОГО ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО СЫРЬЯ

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва —1997 год

Диссертация выполнена во Владивостокском Государственном медицинском университете.

Научные консультанты:

Член-корр. РАЕН и МСА, заслуженный деятель науки РФ,

_доктор медицинских наук, профессор Мотавкина Н. С.

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Воробьев А. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Г. И. доктор медицинских наук, профессор Афанасьев С. С.

доктор технических наук, профессор Мосичев М. С.

Ведущее учреждение: Центральный научно-исследовательский

Институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова

Защита состоится «_» - 1997 года в--

часов на заседании Диссертационного совета Д.053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д. И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского химико-технологического университета им. Д. И. Менделеева.

Автореферат разослан «-» - 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

И. И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Свойства липосом как искусственных липидных мембраниобразующих конструкций уникальны (Грегориадис Г., Аллисон А., 1983; Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Несытова Н.Ю. с соавт., 1990; Трофимов В.И., Нисневич М.М., 1990; Любешкин АВ., Себякин ЮЛ., 1994; 'лррепз К., 1995; Шетепг J.M. е1 а1., 1996; Перепелкин АИ. с соавт., 1996). Вместе с тем, многие вопросы оптимизации конструирования липосомальных структур не ясны или совсем не изучены. Так, если в последние годы в соответствии с Научной программой "Липосомы в биологии и в медицине" (1989-1995) более или менее решены проблемы технологического характера, связанные с методами создания липосом, их стандартизацией по размерам, способами стерилизации, у ювиями их хранения и стабилизации, то целый ряд вопросов иного характера остается нерешенным. К ним относятся следующие направления: получение физиологически активных липидных носителей из сравнительно дешевого и доступного природного сырья Дальневосточного региона; разработка липосомальных • средств с высокой клеточной проницаемостью, в частности, липосомального интерферона; разработка липосомальной формы амфифильных антибиотиков новых поколений.

Чрезвычайно важными разделами являются также разработки подходов к решению проблемы органоспецифичности липосом и липосомальных комплексов БАВ, целевой доставки лекарственных средств, а также получение новых биологически активных наполнителей липосом разнонаправленного действия.

Именно этим разделам названной научной программы и посвящена настоящая работа.

Целью настоящего диссертационного исследования явились: разработка одного из направлений фундаментального концептуально-теоретического обоснования феномена органотропности искусственных липидных мембранообразующих конструкций - липосом на базе сравнительного анализа особенностей конструктивного метаболизма мембраноерганных липидов и их жирных кислот у основного пользователя липосом - человека и источников органотропных везикулообразователей - органоч и тканей наземных и морских животных, отдельных наземных растений; конструирование оргаксспецифических липосомальных комплексов с различными БАВ лечебно-

профилактического назначения; поиск и разработка способов получения новых БАВ из местного дальневосточного сырья, перспективных для инкапсулирования в липосомы.

Для достижения указанной цели были поставлены и разрешены следующие основные задачи:

—-Изучить-особенности-конструктивного-метаболизма-классов

мембраностроительных фосфоли .идов и их жирных кислот в биомассе внутренних органов животных наземного (мыши, кролики, свиньи) и морского (морской котик, тюлени) происхождения, куриных яиц, отдельных наземных растений (соя), а также основного пользователя лнпосом - человека. Дать их сравнительный паспорт.

- Оценить фундаментальное научное и практическое значение различий между конструктивным метаболизмом органных липидов и жирных кислот основного пользователя липосом - человека - и гомологичных . липосомальных носителей разной природы для понимания сущности феномена органотропности.

- Исследовать в эксперименте на животных возможную взаимосвязь особенностей композиции и архитектоники фосфолипидов модельных мембран с их органотропными свойствами.

- Оптимизировать технологию конструирования липосом и липосомальных носи гелей на основе органотропных и физиологически активных липидов животного и растительного происхождения.

- Разработать технологию приготовления гомологичных мембранных конструкций с БАВ: аккумулмрующих противобактериальные антибиотики (таривид), противовирусные и иммуномодулирующие средства (интерферон).

- Разработать технологию и рецептуру органотропных лечебно-профилактических эмульсионных средств с везикулообразователями нефосфолипидного типа для применения в лечебной косметологии.

- Разработать физико-химическую технологию получения БАВ из природного ДВ сырья наполнителей липосом:

а) пептидов из костного мозга морских млекопитающих, изучить их химический состав, иммуномодулирующие свойства;

б) композитов из крови дальневосточных оленей, изучить их химический состав и гемопоэтическую и радиопротекторную активность;

в) биологически активной фракции из экстрактов биомассы трепанга японского, провести его стандартизацию и биотестирование.

- Провести экспериментальное, доклиническое и клиническое на волонтерах испытание всех биотехнологических объектов.

Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов. Научная новизна и теоретическая ценность результатов работы заключается, прежде всего, в фундаментальном значении концептуально-теоретических выводов из диссертации.

Впервые на основании эксперимента и сравнительного анализа эсобенностей конструктивного метаболизма мембрано-органных липидов и жирных кислот у главного пользователя липосом - человека - и потенциальных 1оноров липидных носителей - внутренних органов и тканей наземных и морских животных и отдельных наземных растений (соя) проведена липидная и кирнокислотная паспортизация их внутренних органов.

Впервые предложен комплекс хемотипических маркеров гомологичности липидных носителей: Кцнжк> КБпнжк. Кмжк> кк/о ФЛ, - учитывающий :пособность органов и тканей к аккумуляции в мембранах различных жирных сислот и особенности кислотно-щелочного равновесия в органах и тканях, что юмогает обоснованию феномена органотропности гомологичных липосом.

Вскрыты некоторые механизмы взаимодействия липосом и их потребителей • внутренних органов и тканей человека, позволяющие прогнозировать финальный эффект гомологичности искусственных липидных лембранообразующих конструкций.

Научная новизна и практическая ценность результатов исследования II >аздела диссертации заключается в клинико-экспериментальной проверке и (оказательстве ценности фундаментально-концептуальных положений I раздела три использовании новых липосомальных моделей.

Впервые получены, биотестированы, прошли предварительные клинические ютытания и защищены патентами липосомальные комплексы ВДВ -штибиотиков разного действия - фгорхинолона III поколения - таривида офлоксацика), человеческого лейкоцитарного а-интерферона, обладающего

иммуномодулирующим действием с высокой степенью инкапсулирования, гидрофильности, повышенной клеточной проницаемости.

Разработаны и защищены патентами способы получения и лечебно-профилактические рецептуры косметологического назначения для ухода за кожей лица и головы.

И, наконец, научная новизна и теоретическая ценность III раздела

j _ _-^--

настоящей работы заключается в теор тической разработке новых биотехнологий получения БАБ как перспективных наполнителей липосом. Впервые для этой цели использовано природное дальневосточное сырье, традиционно мало используемое или совсем невостребованное медицинской и пищевой промышленностью, как-то: кости, кожа, подкожный жир морских млекопитающих; кровь дальневосточных и северных

оленей; экстракты различной природы из биомассы трепанга японского; из растительных объектов (отходы производства соевого масла, соки лимонника, элеутерококка, калины). Получены композиты БАВ, разработаны способы их очистки, дана их химическая характеристика и на основе результатов биотестирования установлена биологическая иммуномодулирующая, антимикробная, гемопоэтическая, радиопротекторная и биостимулирующая активность.

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется рядом предложений для внедрения, часть которых уже внедрена в народное хозяйство, в медицину, в учебный процесс.

Проведено экспериментальное доклиническое и клиническое испытание на больных-добровольцах липосома тьного комплекса тар шида для лечения пиодермии, угревой сыпи (совместно с Т.А.Михайленко) и липосомального интерферона для лечения рецидивирующего гекитального герпеса (совместно с Л.В.Федоркщевой).

Приморским АО ''Фармация" выпущена опытная партия препарата "Гематоген сухой" по ТУ 429082-003-92 (совместно с В.БТуркугюковым). АС "Приморский сахар" (г.Уссурийск, Приморский край) выпускается постоянная партия лечебно-профилактических продуктов "Сахар витаминизированный" (ТУ 429065-004-92) и "Меласса тростниковая" (ТУ 9112-005-196-94) (совместно с Р.Н.Диго, Н.С.Мотавкиной).

В процессе разработки теоретических и практических основ липосомальной биотехнологии средств для лечения больных с инфекционной патологией оформлено и защищено: 11 патентов и авторских свидетельств на изобретения гемопоэтических, иммуномодулируюших, биостимулируюших, радиопротекторных и других средств; 3 технических условия на производство препаратов; 2 заявки на изобретение, в том числе по приготовлению органотропных липосом и др. Все они перечислены в приложении.

Апробация диссертационной работы.

Основное содержание работы доложено и представлено на 11 научных и Научно-практических конференций и симпозиумов, в том числе и международных: II Симпозиуме Русско-Японского Фонда по медицинскому обмену (Владивосток, 1994), III Симпозиуме Русско-Японского Фонда по Медицинскому обмену (Ниигата, Япония, 1995), Международном конгрессе по пульмонологии (Москва, 1995), Всероссийской конференции с международным представительством "Акупунктура и традиционная медицина" (Владивосток, 1992), Всесоюзной конференции с международным участием "Новые лекарственные средства, приборы, методы диагностики и лечения пострадавших при аварии на ЧАЭС" (Харьков, 1991), на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты" (Владивосток, 1991), Межгосударственной научной конференции "Комплексная переработка пищевого сырья и основные направления расширения ассортимента продуктов питания" (Владивосток, 1993), Научно-практической конференции "Здоровье и болезни человека на ДВ" (Владивосток, 1993), Всесоюзной научно-практической конференции "Актуальные проблемы медицины катастроф" (Владивосток, 1993), Научно-практической конференции "Проблемы клинической, профилактической и экспериментальной медицины на ДВ" (Владивосток, 1994), Всероссийской научно-практической конференции "Цеолиты Приморья" (Владивосток, 1994).

По теме диссертации опубликовано 33 работы, 11 описаний изобретений по авторским свидетельствам и патентам.

Структура диссертации традиционна. Она состоит из введения, обзора литературы (1 глава), собственных исследований (11 глав), заключения, общих выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследований в науку и практику, указателя литературы, включающего 276 отечественных и 17в

иностранных источников. Текст диссертации изложен на 5_Э2. страницах, иллюстрирован 90 таблицами, 37 рисунками, 5 микрофото и 14 рабочими схемами. Особенностью изложения собственных исследований является их распределение по трем разделам.

Первый из них посвящен разработке одного из направлений

фундаментального концептуально-теоретического обоснования феномена

/

органотропности искусственных лит тых мембранообразующих конструкций -липосом. Второй посвящен апробации концептуальных выводов I раздела. Третий, заключительный раздел диссертации, включает теоретические и экспериментальные особенности получения и физико-химической характеристики новых БАВ - наполнителей липосом из природного дальневосточного сырья.

Положения, выносимые на защиту.

1. Особенности конструктивного метаболизма мембраноорганных фосфолипидов и жирных кислот у основного пользователя липосом - человека и источников везикулообразователей - внутренних оргагов наземных и морских животных, одного из наземных растений (соя) могут обеспечить эффект органотропности и биологическую ценность у искусственных транспортных липидных средств - липосом.

2. Все внутренние органы человека и животных являются ацдоспецифичными по качеству и количеству полиеновых жирных кислот и могут быть отстандартизованы при помощи серии специфических показателей ЖК: Кннжк. КБпжк. Кмжк и Кк/о фл. По ним может быть оценена и целенаправлено сконструирована гомологичность органотр( пных липосом.

3. Способ получения липосом. содержащих антибиотики, позволяет увеличить степень инкапсулирования в липосомы таривида (офлоксацина) из группы фторхинолонов III поколения за счет использования везикулообразователя с высокой степенью гомологичности и органотропности при применении накожно-, кожно-, подкожных фосфолипидов и глицеридов морских млекопитающих.

4. Способ получения липосомального человеческого лейкоцитарного а-интерферона позволяет увеличить степень его депонирования в искусственных липидных мембранообразующих конструкциях на основе везикулообразователей

растительного типа с высокой проникающей способностью и гидрофильностью полученных липосомальных комплексов.

5. Как наполнители и импрегнаторы липосом и липидных эмульсионных средств лечебно-профилактического назначения перспективны пептиды, выделенные из костного мозга морских млекопитающих, проявляющие в условиях эксперимента на животных иммуномодулирующую активность. Совокупность биологической активности пептидов определяется особенностями их фракционного состава, композиции и архитектоники аминокислот и других химических компонентов. Составы, приготовленные из крови дальневосточных оленей, стандартизованные по химическому паспорту, проявляют в условиях эксперимента на животных гемопоэтическую и радиопротекторную активность. Биологически активная фракция, выделенная из биомассы трепанга японского, представляет собой комплекс веществ смешанной природы.

Содержание диссертации, результаты и их обсуждение.

Главные направления и объем выполненных исследований отражены в структуре диссертации и суммированы в схемах 1 и 2 (см. Приложение).

Для реализации поставленных задач были использованы наиболее важные современные достоверные и информативные методы исследования: химические (выделение, очистка и концентрирование БАВ; конструирование липидных носителей, липосом и липосомальных комплексов лекарств и БАВ, определение физико-химических характеристик их состава; тонкослойная и колоночная хроматография); физико-химические (газо-жидкостная хроматография с хромато-масс-спектрометрией; ИК-спектроскопия; ультрацентрифугирование; спектрофотометрия; флюоресцентная спектроскопия и микроскопия); биологические (биотестирование липосом и БАВ: определение проникающей способности флуоролипосом в организме лабораторных животных, определение антибактериальных свойств на тест-культурах методом стандартных дисков и тест-культур, тестирование безопасности препаратов липосом, антифунгальной и противовирусной активности методом титрования; иммунологические и радиопротекторные свойства (показатели фагоцитоза, антителообразования, 1-й В-лимфоциты, гемограммы у стимулированных и облученных животных), а также методы статистической обработки цифрового массива данных. Наряду с перечисленными традиционными методами исследования, разработаны 3

методически усовершенствовнные и новые способы, защищенные авторскими свидетельствами, патентами и нормативно-технической документацией по производству препаратов БАВ.

РАЗДЕЛ I. Скрининг липидных носителей из природного сырья

наземного и морского происхождения. 1Л ^Качественная и количественная характеристика - фосФолипидного пуда различных носителей для конструирования липосом.

Основой для поиска оценки гомологичности и органотропности искусственных липидных мембранообразующих конструкций по отношению к фосфолипидному пулу органов человека послужили особенности конструктивного метаболизма главных мембраностроительиых компонентов -ФХ и ФЭ у человека и животных. Так, аккумуляция ФХ и ФЭ у человека в большой степени происходит в сердце, затем в печени и легких. У животных наземного происхождения, например, свиньи, ФХ и ФЭ концентрируются больше всего в сердце и селезенке; у кролика - в сердце и легких; у мыши - в легких и печени. У морских животных эти фосфолипиды концентрируются в печени и селезенке. При этом по суммарному количеству ФХ и ФЭ изученные биообъекты располагаются в следующий ряд: человек > морской котик > кролик > мышь > свинья.

1.2. Особенности жирнокислотного состава композиций фосфолипидов и нейтральных липидов внутренних органов человека как маркеров для тканеспецифического узнавания липосом.

Жидкокристаллическое состояние биологических мембран органов-депонентов липосом у основного пользователя липосом - человека V потенциальных доноров липидных носителей для их прицельной доставки г органы и ткани оценено нами путем изучения и сравнительного анализг особенностей их жирнокислотного состава.

Так, нами методом современной капиллярной газожидкостно( хроматографии установлено, что жирные кислоты фосфолипидов и нейтральны; липидов внутренних органов человека: сердца и легких, печени и почек, селезенки и мозга, тимуса и яичников - представлены 35 наименованиям» различной природы, в том числе, ненасыщенными, моноеновыми I полиеновыми с различным позиционным расположением двойных связей (п-3) 1 (п-6). Фосфолипиды внутренних органов человека - депонентов липосом

- и -

содержат больше ненасыщенных жирных кислот, чем насыщенных. Особенно богаты ненасыщенными жирными кислотами фосфолипиды сердца, среди которых основную массу составляют полиеновые серии (п-6). Моноеновых жирных кислот больше всего в тимусе человека. Самое высокое значение коэффициента ненасыщенности жирных кислот выявлено для сердца, биосинтеза полиеновых жирных кислот - для тимуса. Жирными кислотами "морской" серии (п-3) наиболее богат мозг человека.

В наших экспериментах по поиску органотропных и доступных для местной промышленное™ носителей мы исследовали кожно-подкожные липиды морского млекопитающего - тюленя. Установлено, что при накожном применении транспортных липидных систем на основании данных липидов их органотропность обусловлена не только особенностями конструктивного метаболизма главных мембраностронтельных ФЛ - ФХ и ФЭ, но и жирнокислотньш составом депонированных липвдов - жидких, очищенных по оригинальной методике, глицервдов. Вместе с тем, несмотря на то, что многие исследователи в качестве транспортной оболочки липосом используют фосфолипиды куриного желтка, нами установлено, что они более чужеродны человеческим липидам, чем очищенные ФЛ отходов производства соевого масла. По сведениям Крылова И.Б. с соавт. (1990), особенности же мембран зависят от диеты человека. При преобладании "европейской" диеты органы аккумулируют в основном эйкозотетраеновую (C20:4(n-6))| а "морской" - С20:5(п-э) и С22:6(п-3)-Усиленная миграция европейского населения в прошлом на Дальний Восток и наблюдающаяся в настоящее время тенденция к сотрудничеству в области экономики, в том числе и продовольственной, со странами АТР, по-видимому, не могла не отразиться на топографии в органах человека таких важных строительных блоков мембранных липвдов, как жирные кислоты.

Таким образом, сведения о жирнокислотном составе фосфолипидов и нейтральных липидов органов-мишеней могут быть использованы не только для конструирования липосом с достаточной степенью гомологичное™. Модифицируя модельные липидные мембраны фосфолипидами, содержащими полиеновые жирные кислоты серии (n-З) или серии (п-6), или собственно этими жирными кислотами, можно побиться увеличения эффективности биологической ценности липосомальной технологии.

Однако, несмотря на то, что композиционный состав ФЛ мембран животных обладает относительной видоспецифичностью, по мнению Е.М.Крепса (1981), их жирные кислоты - наиболее изменяемая в зависимости от условий окружающей среды компонента. Поэтому для более четкой дифференциации внутренних органов человека - пользователя липосом с целью создания их жирнокислотного паспорта, который, мы надеемся, будет учитываться не только нами при создании липосом с вы-окой степенью гомологичности, требуется ввести дополнительные хемотипические маркеры, в то же время доступные исследователю.

В этой связи нами была проведена стандартизация и созданы материальные основы жирнокислотного паспорта внутренних органов человека - мишеней липосом с помощью разработанной нами системы хемотипических маркеров -коэффициентов жирных кислот фосфолипидов и нейтральных липидов: КНнжк. Кбпнжк. Кмжк-

С помощью Кннжк (отношение содержания ненасыщенных ЖК к общей сумме ЖК) нами предлагается оценивать степень "твердости" гомологичных липосом, способность удерживаться в кровотоке и сорбироваться на поверхности цели доставки БАВ-биологической мембраны депонента. В то же время, с помощью Кбпнжк (отношение содержания полиеновых ненасыщенных ЖК к общей сумме ЖК) можно прогнозировать биологическую ценность доставляемой в орган транспортной оболочки липосом. Что же касается Кмжк (отношение "морских" ЖК серии (п-3) к ЖК серии (п-6)), то с его помощью можно корректировать и восполнять необходимую для нормального биологического функционирования фосфолипидов мембран депонент, липосом в органах человека потребность в (п-3) полиен вых ЖК.

В результате наших экспериментов установлено, что фосфолипиды и нейтральные липиды легких, сердца, печени, почек, селезенки, мозга, яичников и тимуса человека не характеризуются резкими колебаниями величины Кннжк> который для фосфолипидов изменяется от 2,90 в сердце до 1,78 в печени при Среднем значении 2,19; для нейтральных липидов - от 2,68 в сердце до 1,58 в мозге ири среднем значении 2,00.

В фосфолипцдах всех 8 органов Кспнжк меньше 1 и изменяется от 0,26 для сердца до 0,85 для яичников при среднем значении 0,50; исключение составляет тимус - 1,50.

Все внутренние органы человека можно разделить на 2 группы по величине Кннжк нейтральных липидов: ¿2,0 (сердце, легкие, почки, яичники) и <2,0 (селезенка, тимус, печень, мозг). По значению Кбпнжк - на 3 группы: >3,0 (яичники и тимус), ¿2,0 (мозг и сердце) и <2,0 (почки, селезенка, печень, легкие).

Определено, что Кмжк в фосфолипидах и нейтральных липидах всех 8 органов всегда меньше 1,0; самое высокое значение наблюдается для сердца (0,90, для нейтральных липидов) и мозга (0,78, для фосфолипидов), самое низкое

- для легких (0,12, для нейтральных липидов) и почек (0,16, для фосфолипидов); среднее значение составляет 0,33 (для фосфолипидов) и 0,17 (для нейтральных липидов).

Таким образом, нам удалось на основании детального изучения и сравнительного анализа архитектоники и композиции различных биологически важных жирных кислот создать жирнокислотный паспорт внутренних органов-депонентов липосом у основного их пользователя - человека.

1.3. Физико-химические характеристики липнлных носителей различного

происхождения и обоснование их применения в конструировании липосом.

Сравнительные результаты изучения кислотно-бсновных свойств мембранных фосфолипидов органов человека - пользователя липосом и животных разной степени развития, фосфолипидной основы из природных субстратов животного и растительного происхождения свидетельствует о различных возможностях к аккумуляции нейтральных и кислых фосфолипидов. Клеточные мембраны морских животных, в частности, морского котика, наиболее обеспечены кислыми фосфолипидами в печени и почках (32,9+1,8 и 32,6±1,8%, соответственно), причем показатель этот близок к человеку -30,0±0,9%. Что же касается легких, то обеспеченность их кислыми фосфолипидами иная, ее можно представить убывающим рядом: свинья = кролик = морской котик > мышь > человек. В остальных органах подобные ряды несколько отличны: в сердце - кролик = человек > мышь > свинья > морской котик; в печени - морской котик > человек > мышь > свинья = кролик; в почках

- человек > кролик > мышь = морской котик > свинья. Что же касается селезенки, то она по содержанию кислого ФЭ у всех 5 изученных видов отличается незначительно.

Дифференциация всех внутренних органов-мишеней липосом у человека и животных различной степени развития проведена нами при помощи нового показателя - К^д, - коэффициента кислотно-нейтральных свойств мембранных фосфолипидов. С его помощью оказалось возможным хемотипическое разделение всех внутренних органов изучаемых видов на 3 группы. Первая группа органов имеет значение К*/,, между 0,5 и 1,0, общий поверхностный заряд органа отрицательный; это - печень, точки человека, морского котика и мыши; сердце и селезенка мыши. Вторая группа органов имеет значение К^ОД общий заряд слабоотрицательный; это - легкие и сердце морского котика и мыши, сердце и селезенка человека. Наконец, третья труппа органов имеет Кк/О«0,5, общий зарад нейтральный; это - легкие человека, селезенка морского котика.

Таким образом, на основании особенностей кислотно-основного равновесия фосфолигащных мембраноорганных композиций проведена дифференцировка внутренних органов-депонентов липосом у основного пользователя липосом человека и установлено, что их фосфолипадные мембраны заряжены в основном отрицательно. В целом фосфолипиды печени и почек человека проявляют более кислый характер, чем фосфолипиды селезенки, сердца и легких, что связано, по-видимому, с их детоксикационной функцией, в том числе и по отношению к чужеродным липкдам (Парк В., 1973). при этом кислотность фосфолипидов внутренних органов мыши мало отличается от кислотности фосфолипидов человека.

Нами была предпринята экспериментальная проверка концептуально-теоретических выводов, имеющих значение для прогноз трования ожидаемого феномена органотропности гомологичных липосом. Выяснен клиренс гомофлуоролипосом in vivo у лабораторных животных - мышей.

1.4. Размеры и стабильность фосфолипидных липосом.

Показано, что по величине диаметра все фосфолипидные везикулы могут быть разделены на 3 класса: мелкие (от 61,1 до 184,5 нм), средние (от 450 до 1000 нм) и крупные (свыше 1000 нм). При этом оказалось, что размеры частиц в каждом классе липосом, их дисперсность, оказались зависимыми от многих факторов: состава фосфолипидов носителей, добавох к ним, условий и времени хранения.

Так, свежеприготовленные липосомы из носителя растительного происхождения (источник - отходы производства соевого масла) распределяются по размеру, в основном, на 2 класса: мелкие (61,5±0 нм - 82,6±2,12%) и средние (626,6±60 нм - 17,39±0,85%). При этом по мере хранения распределение липосом имеет тенденцию к уменьшению содержания мелких липосом и увеличению средних. Коэффициент стабильности тех и других одинаков - 0,5. Стабильность всех фракций липосом снижается при хранении, но неодинаково. Наиболее стабильными оказались мелкие липосомы: значение их К^- снижается за 12 месяцев всего в 1,5 раза, в то время как для средних липосом этот показатель падает в 2,4 раза.

Состав добавок и концентрация липидов в липосомальных суспензиях в наших опытах также показали их влияние на стабильность. Так, введение незначительного количества а-токоферола (8x10-3 мкмоль на 1 мкмоль ФЛ) приводило к небольшому увеличению размеров липоссм. Эти результаты аналогичны эффекту антноксиданта на размер п стабильность липосом в работе О.Э.Оксинойд с соавт. (1990). По-видимому, импрегнации фосфолипосом а-токоферолом в силу кооперативного эффекта детергентных и антиоксидантных свойств ФХ и добавки вызывает увеличение среднего размера частиц у всех фракций, положительно сказываясь на стабильности суспензни липосом.

1.5. Флюоролипосомы и распределение их в организме in vivo.

1.5.1. ИК-спекгроскопический контроль особенностей жирнокислотного состава различных органов мышей.

Чрезвычайно удобным для предварительной оценки степени гомологичности мембранных липидов и липидов носителей оказался метод ИК-спектроскопии, ценный своими качествами экспресс-анализа. Полученные результаты структурных особенностей фосфолипидного пула органов-мишеней у биотестируемых животных свидетельствуют о строго детерминированном индивидуальном наборе их для каждого органа и открыва от перспективность использования этого метода для предварительной оценки сродства.

1.5.2. Конструирование гомологичных и гетерологичных флуоролипосом, Исследование поглошаюшей способности флуоролипосом в организме мышей.

Конструирование флуоролипосом для слежения за их судьбой в организме осуществлялось нами путем активного включения ДМХ в липидный бислой,

ДМХ, являясь липофильным гидрофобным зондом, практически полностью включался в липидный бислой.

Несомненно, что уникальность липидного состава различных клеток

позволяет прогнозировать в экспериментах in vitro и in vivo определенное

жидкокристаллическое состояние мембраны, необходимое для узнавания

липосомы._В_оптимально_отобранных экспериментах готовились

/

флуоролипосомы на основе фосфс липидов 3 наиболее важных внутренних органов (легкие, печень, селезенка) биотестируемых животных - белых лабораторных мышей. В качестве гетерологичных липидных носителей отобраны животные липиды на основе куриного желтка.

Обнаруженные закономерности клиренса липосом in vivo имеют тенденцию подобно той, о которой свидетельствуют работы ОАРозенберга с соавт. (1984), но несколько не совпадают с данными Т.С.Саатова с соавт. (1990). Согласно результатам Т.С.Саатова с соавт., полученным при изучении клиренса липосом из печеночных фосфолипидов в сравнении с клиренсом липосом па основе ЯФЛ, уже через 5 минут в кровотоке остается 6,5% печеночных липосом. В наших исследованиях показано, что через 1 час остаток печеночных липосом в кровотоке составляет 5,43±0,6%. Это можно объяснить тем, что кинетика захвата липосом характеризуется быстрой и медленной компонентой.

В пользу тропизма липосом из легочных фосфатидов к легким свидетельствует пониженный захпат липосом из яичных фосфолипидов - 4,62±1,2 (через 20 минут) и 2,58±0,5% (через 1 час). Таким образом, применение ДМХ в липидном окружении из легочных фосфолипидов позволило увеличить их захват легкими в 8 раз через 20 минут и о 5 раз через I час.

При исследовании клиренса легочных липосом через 1 час оказалось, что они не накапливаются в легких, т.к. уровень флуоресценции уменьшается почти в 3 раза. Возможно, что подобный результат обусловлен не столько механизмом захвата тройных липосом, сколько повышенной окислительной деградацией флуоресцентного маркера в легких. По-видимому, в присутствии кислорода происходит окислительная деструкция ДМХ в легких.

Клиренс печеночных липосом обладает радом особенностей. Так, уже чере: 20 минут захват ДМХ составляет свыше 50% от суммарной введенной мето (55.2±5,1%). При этом достигнутый уровень через 60 минут мало изменился v составил 56,8±6,3%. По-видимому, здесь имеет место вновь кооперативный

эффект, достигаемый за счет гомологичных фосфолииидов, конструкции липосом и особенностей механизма биодеградации чужеродного ДМХ в печени.

Исп^чьзование фосфатидов из селезенки мышей для приготовления гомологичных флуоролипосом позволило достигнуть максимально только 20% уровня захвата от суммарной введенной метки. Через 1 час уровень захвата ДМХ возрастает и составляет 23,86+2,7%. Следует отметить, что во всех биотестах на проникающую способность флуоролипосом нами зарегистрирована устойчивая тенденция к нарастанию уровня флуоресценции в селезенке через 1 час после внутривенного введения. Интересно, что селезеночные липосомы в первые 20 минут давали почти одинаковые уровни флуоресценции в легких, печени, почках и селезенке. Это можно объяснить тем, что для селезенки уровень захвата липосом-МЛЛ почти в 5-6 раз меньше чем больших олигослойных (БОЛ (Gregoriadis G., 1976). Кроме того, особенности гепатолиеналыюй системы мышей таковы, что объем красной пульпы их селезенки может депонировать до 10% объема циркулирующей крови. При этом нельзя и исключить обмен липосом с кровью между селезенкой и печенью. И, в-третьих, ДМХ своей кетогруппой, по-видимому, может связываться с аминогруппой концевых аминокислот белков селезенки, за счет чего уровень интенсивности флуоресценции снижается.

Депонирование ДМХ в других органах идет незначительно, в частности, в сердце уровень флуоресценции достигает только 2,5%. Около 5-7% от уровня введенной метки обнаруживается в ЖКТ через 1 час. Следует отметить, что, по-видимому, только в кишечнике ДМХ подвергается наиболее сильной биодеградации за счет гидролиза и ферментативного окисления.

Таким образом, используя гомологичные фосфолипиды для приготовления аутофлуоролипосом в присутствии флуоресцентного маркера ДМХ можно повышать сродство липосом к органам-мишеням - селезенке, печени, легким - в организме лабораторных животных in vivo.

РАЗДЕЛ II. Особенности конструирования липосомальных комплексов БАВ.

2.1. Биотехнология липидных мембранных конструкций, аккумулирующих антибиотики. Особенности депонирования таривида в липосомы. Липосомальные формы антибиотиков разного химического строения и природы получали ряд как отечественных, так и зарубежных авторов. Однако ни

в одном из сообщений нами не обнаружено применения, а тем более анализа эффективности липидных носителей, приготовленных с использованием мембраноорганных липидов. Кроме того, авторами не ставилась задача максимального приближения особенностей химического состава и строения инкапсулируемого антибиотика к аналогичным параметрам липидной матрицы.

_Были_приготовлены_фосфолипосомы с антибиотиком таривидом,

метилированным производным фт рхинолоновой кислоты, давшим самый высокий антимикробный эффект. Установлена зависимость антимикробного действия таривидфосфолипосом от концентрации антибиотического компонента, согласно которой при высоких концентрациях его (>2%) проникающие способности частиц в твердых средах, по-видимому, сильно зависят от присутствия транспортного агента. В качестве транспортного агента нами был использован ДМСО в концентрации 10"2%. Дальнейшее увеличение его концентрации мы сочли нецелесообразным, т.к. ДМСО обладает хорошими растворяющими свойствами по отношению к липидам (Оаэ С., 1975; Пульняшенко И.И., 1993).

2.2. Определение антимикробных свойств антибиотикосодержаших липосом.

Неоднозначные результаты получены нами при исследовании антимикробной активности липосомальных вариантов таривида и других, наиболее часто и давно используемых в клинической практике антибиотиков. Гак, для ЛТ (липосомальный таривид) зона задержки роста тест-культуры свободного антибиотика и комплекса его с ДМСО была почти одинаковой, в то время как для липосомального варианта этот показатель был в 2 раза выше. Возможно, что этот результгт получен за счет ^очетанного эффекта транспортных и противовоспалител1 1ых свойств ДМСО, о которых сообщено Ю.В.Муравьевым с соавт. (1985). Следует отметить, что в обеспечении уровня антимикробного эффекта липосомального таривида, по-видимому, не последнее место занимает его липофильность, что способствует более быстрому проникновению в модельную мембрану и ее контакту с микробной клеткой. В пользу последнего предположения свидетельствует установленный В.Т.Жуковым с соавт. (1992) с помощью высокоразрешающей электронной микроскопии факт образования между липосомами соединяющих их трубчатых структур. Авторы не исключают возможности контакта липосом с клетками путем образования таких

структур, что, по-видимому, обеспечивает проникновение содержимого липосом в заданный объект.

2.3. Технология липосом, аккумулирующих антибиотики.

Настоятельная необходимость разработки безотходной технологии утилизации ценных сырьевых ресурсов ДВ морей, являющихся частью Мирового Океана, привела нас к мысли о более полном использовании источников липидных носителей из липвдоемких органов и тканей морских млекопитающих. В этой связи, для конструирования липидных мембран нами были использованы везикулообразователи как фосфолипидного, так и не фосфолипидного типа. В пользу последней идеи мы использовали довольно много доводов, но один из них, приведенный Е.М.Крепсом (1981) в своей монографии: "...в теле месячного тюленя весом 18 кг содержится около 11 кг жира",- показался нам самым убедительным. В этой связи, липидные носители, отобранные нами для местного применения липосом и их суспензий из кожно-подкожных липидов тюленя были исследованы и стандартизованы с помощью хемотипических маркеров гомологичности по отношению к депоненту липосом: Кцнжк> Кбпнжк. КМжк-Так, на высокий уровень величины Кмжк повлияло то, чго содержание в ФЛ кислот серии (п-3) больше, чем в НЛ почти в 4 раза. При этом доля "европейских" полиненасыщенных ЖК серии (п-6) в данных субстратах мало отличается: 16,90 и 19,42%, соответственно.

На усиление процессов десатурации моноеновых ЖК в мембранных ФЛ указывает более высокая величина Кбпнжк. что, конечно, не может не отразиться на жидкокристаллическом состоянии модельной мембраны, обеспечивающим ее "жидкостность", облегчающую контакт с клеткой-депонентом. Необходимая "жидкостность" липосомальной мембраны, по нашему мнению, должна способствовать более высокому уровню депонирования липофилъных антибиотиков.

В этой связи нами была разработана технология липосом, аккумулирующих амфифильные антибиотики, в том числе и производные фторхинолонкарбоновой кислоты. Результаты экспериментального исследования показали, что Кдеп таривида в липосомы зависит, главным образом, от концентрации ФЛ и ХОЛ. При этом установленная величина КДСГ1 таривида с учетом мнения П.АЛугеП с соавт. (1976) оказалась достаточной для терапевтического использования препарата. По-видимому, немаловажную роль в обеспечении высокой

терапевтической активности липосомального таривида играют и собственно антиоксидантные свойства главного компонента отобранного липидного носителя ФХ, установленные ранее Е.Б.Бурлаковой (1977), Е.Б.Бурлаковой с соавт. (1985, 1986) и подтвержденные in vitro в экспериментах А.В.Стефанова с соавт. (1990).

_ Показано, что при использовании концентрации исходного этанольного

раствора ФЛ куриного желтка ¡7,5 и 33 мг/мл получен комплекс, обеспечивающий максимально возможную концентрацию таривида в липосомах. При более высоких концентрациях ФЛ доля антибиотика в составе комплекса снижается.

Антибиотическая емкость ФЛ носителя была увеличена нами за счет получения носителя из органотропных подкожно-кожных липидов тюленя. Однако, в ходе проверки депонирующих свойств отобранных носителей оказалось, что значение Кдеп в МЛЛ из ФЛ куриного желтка также высоки (от 32 до 66%), но ниже соответствующих значений для МЛЛ из ФЛ подкожного жира тюленя.

Механизм усиления депонирующей активности ФЛ из подкожного жира морских млекопитающих, по-видимому, очень сложен. Однако уже сейчас можно предположить, что карбоксильная группа таривида эффективнее взаимодействует с незамещенной донорной аминогруппой кислого ФЭ, чем с ионизированной полярной группировкой ФХ. В пользу подобного решения в плане "структура - биологическая активность" свидетельствуют наши данные о повышении соотношения ФХ/ФЭ у наземных животных в сравнении с морскими. В этой связи, по-лидимому, таривид, янл ясь производным оксихинолкарбоновой кислоты, лучше аккумулируется в ФЛ с кислыми свойствами, каковыми и являются ФЛ подкожного слоя морских млекопитающих, в частности, тюленя.

Высокий Кдеп таривида (52%) достигается при использовании незикулообразователей нфосфолипидного типа - жидких глицеридов с исходной концентрацией 115 мг/мл. Как указывалось ранее в наших исследованиях, гарнвнд накаплипастся в носителях из кислых фосфолипидных субстратов. Следует отметить, что суммарное содержание ненасыщенных ЖК C|S1(11. 4)+Ci52(„-6) (32,6%) в фосфолипидах меньше, чем в везикулообразователях нефосфолипидного типа (45%). По данным А.И.Клибанова (1990), включение в

липосомы свободной Cig i кислоты приводила к увеличению эффективности направленной доставки липосом с авидином.

Возможно, что эффективные проникающие свойства липофнльного комплекса таривида, полученные нами в результате разработанных схем получения липосом на основе везикулообразоватлей как фосфолипндного, так и не фосфолипндного типа, обусловлены облегченной диффузией через эпидермис, в состав которого входят мембраны I типа (Shaefar Н. et al., 1982). Липосомы относятся к мембранам I типа (Альберт А., 1989).

Вместе с тем, хорошим помощником в усилении проникающего эффекта липосом является ДМСО, в высоких концентрациях обладающий однако мембраноразжижающим действием (Пульнященко H.H., 1993). Это может значительно облегчить депонирование таривида в слоях кожи в случае лечения.

2.4. Биотестирование и клинические испытания липосомальных комплексов таривида на фосфолипидной и не Фосфолипидной основе.

Всестороннее бнотестирование липосомальных вариантов таривида, а именно: токсикологические исследования, контроль раздражающих свойств, оценка сенсибилизирующей активности, испытания hí канцерогенность, мутагенность и тератогенность,- проводились in vivo. Чрезвычайно важным для нас явилось то, что при токсикологическом исследовании липосомального таривида с органотропным носителем токсикологический эффект не обнаруживался ни в остром, ни в хроническом экспериментах.

В клинических условиях на больных-добровольцах с сикозом, угревой сыпью и пиодермией нами был апробирован липосомальный комплекс таривида, отличающийся наряду с очень высокой эффективностью и широким спектром биологического действия высокой стоимостью: цена одной упаковки в ценах 1997 г. составляет 95000 руб. На полный курс лечения требуется 2-3 упаковки.

Липосомальная форма таривида при его концентрации 0,1-0,3% назначалась местно 2 раза в день после умывания. Оказалось, что сроки подсыхания высыпаний на коже снижались при лечении угрей в 2-4 раза, а сроки эпителизации пораженных участков кожи уменьшались в 1,5-2 раза. Нельзя не отметить и экономическую эффективность лечения пиодермии. Он сокращает объем и стоимость закупаемого за рубежом на валюту лекарственного препарата почти в 40 раз, экономит расходы на оплату больничного листа, а также, что немаловажно, и индивидуальный бюджет больных.

Следовательно, высокая эффективность способа лечения достигнута благодаря созданию липосомальных комплексов таривида с высоким КдСП при использовании органотропного близкородственного липидного носителя. По данным Л.П.Мельянцевой с соавт. (1990), даже применение взвеси пустых липосом для купирования экспериментального локального гнойного процесса

(без —учета —Эффекта_органотропности)_ также было небезуспешным, что

свидетельствует о далеко не инертно!, роли липидного носителя. На стимуляцию репаративных процессов как при наружном, так и внутреннем применении препарата полиненасыщенных жирных кислот "Биопсяиена" указывали Г. В.Долгова с соавт. (1992).

2.5. Липосомальный интерферон, его приготовление, биотестирование. перспективы использования в медицине.

2.5.1. Конструирование и стандартизация липосомального интерферона.

В результате экспериментов с липосомальным интерфероном установлено, что степень инкапсулирования препарата в липосомы зависит от природы носителя, его концентрации в исходных этанольных растворах, исходной концентрации самого интерферона. Так, очищенные по оришнальной технологии ФЛ отходов производства соевого масла (ФЛ ОПСМ) проявляют более высокие уровни депонирующих свойств по отношению к пептидной молекуле ИФН, чем животные ФЛ куриного желтка (ФЛ КЖ). Это подтверждается тем, что исхода ый и финальный уровень Кдсп ИФН в ФЛ ОПСМ гораздо выше, чем для ФЛ КЖ: 8,0±0,76 и 56,0±2,5% против 5,0±0,25 и 35,0±1,62% (р<0,05),- при одинаковых концентрациях мембранообразующих липидов -20-160 мг/мл. В силу склонности липосом к агрегации при использовании Сфл>250 мг/мл мы остановились на активных концентрациях эксперимента 40 и 80 мг/мл, которые и использовали в наших дальнейших экспериментах по изучению физико-химических характеристик липосомального интерферона, его терапевтической эффективности и особенностей иммуногенного потенциала. Для экспериментальных и клинических исследований препарата in vivo нами был получен липосомальный комплекс следующего состава: ФЛ:ХОЛ:а-токоферол:ИФН - 76,50:15,09:3,01:6,36 (по массе, %) при исходной концентрации ФЛ 80 мг/мл.

Стабильность депонированного в липосомы интерферона была обеспечена нами за счет двухкомпонентной системы холестерин-а-токоферол при

соотношении 5:1. Это подтверждается высоким уровнем K^j средней фракции липосом - 0,893, определенным нами с использованием в качестве критерия дисперсности липосомальной суспензии. Кроме антиоксидантного действия а-токоферол проявляет в отношении природных мембран стабилизирующий эффект (Сейфулла Р.Д., Борисова И.Г., 1990). Таким образом, кооперативное меМбраностабшшзирующее и антиоксидантное действие холестерина и а-токоферола, близкое к природному, по-видимому, и обеспечивает защиту липосомального интерферона от структурно-функционального повреждения.

Результаты изучения формы и функции фосфолипидных фракций используемого носителя растительного происхождения показали его обогащение кислыми фосфолипидами (48,0%) в большей степени, чем ФЛ КЖ (34%), и более близкому к таковому у человеческим мембраноорганных ФЛ (почки -48,6%; печень - 42,9%). Следует отметить, что значения pH (ИЭТ) а-интерферона, равное 6,8, учтено нами при подборе среды формирования липосом как наиболее физиологичное. В то же время, наличие в модельной мембране большого количества кислых фосфолипидов способствует процессу ионизации молекул интерферона, в результате чего она начинает приобретать положительный заряд. Нами ранее установлено, что мембраноорганные человеческие ФЛ в основном заряжены отрицательно. В этой связи ионизация интерферона в подобранных нами условиях должна способствовать его более глубокому проникновению во внутриклеточную среду в заданной липосомальной форме. Ниже будет показана справедливость этого предположения на результатах применения липосомального интерферона в клинических условиях на модели Заболевания с внутриклеточным паразитированием вируса - урогенитального герпеса у женщин.

Методом ИК-спектроскопии нами установлено почти полное отсутствие в спектре липосомального интерферона, полученном после лиофилизации, гидрофобных компонентов. Это позволяет надеяться на высокую всасываемость и проникающие свойства липосомального интерферона во внутриклеточную гидрофильную среду, по-видимому, за счет адсорбции интерферона на наружной стороне липосомальной мембраны. Есть единичные сведения о неравномерном распределении компонентов липосомальной мембраны (Bergelson I.D. et al., 1977; Лкзбешкин A.B., Себякин Ю.Л., 1994). В частности, отрицательно заряженный ФС локализуется во внутренней части мембраны, а ФХ - во

внешней. В то же время, А.В.Любешкин, Ю.Л.Себякин (1994) сообщают о высокой стабильности пептидных липосом за счет импрегнации ФХ-мембраны длинноцепочечным аналогом аминокарбоновой кислоты с цистеином в качестве полярной группы. Следует отметить, что концевой полярной группой используемого в наших экспериментах по конструированию липосомальных комплексов человеческого лейкоцитарного интерферона является именно сульфгидрильная группа цистеина (Oí ;инников Ю.А., 1987).

2.5.2. Биотестирование и клинихо-экспериментальные испытания.

Терапевтическая оценка эффективности липосомального комплекса интерферона была проведена врачом-гинекологом Приморского центра СПИД (г. Владивосток) Л.В.Федорищевой совместно с нами на больных-добровольцах, женщинах с рецидивирующей формой урогенитального герпеса. Так, в клинических условиях установлено, что лечебная эффективность липосомального интерферона по сравнению с его водным раствором значительно выше. Судя по комплексу признаков, клинический эффект применения липосомального интерферона характ физуется достоверным превышением кратности различных показателей в 1,5-3 раза (р<0,05). Следует отметить, что переносимость препарата всеми больными-добровольцами была хорошая, аллергические реакции в условиях применяемых концентраций ИФН и фосфолипидов отсутствовали.

Хорошую переносимость препаратов из соевых ФЛ, отсутствие пирогенных реакций отмечали Ю.А.Зильберс с соавт. (1981). Кроме того, очищенные нами по оригинальной технологии фосфолипидные носители растительного происхождения совсем не содержали сфингомиеяина, против которого иммунный ответ in vivo наблюдали В/".Schuster et al. (1979).

Отсутствие аллергических реакций на липосомадьный интерферон, пол-видимому, можно объяснить тем, что этиотропный эффект достигается при уменьшении его расхода почти в 40 раз. Это не может не способствовать экономической выгоде применяемого липосомального интерферона, которая достигается как за счет уменьшения расхода препарата и его стоимости, так и, цто немаловажно, продолжительности лечения больного в стационаре. Это подтверждается расчетами экономической выгоды лечения больных липосомальным интерфероном, показывающим, что общие расходы на лечение уменьшаются в 5 раз. На стоимость лечения мало влияет цена отходов

производства соевого масла, из которых был получен ФЛ-носитель для конструирования липосом с ИФН. Так, цена 1 кг отходов составляет всего 15-18 тысяч рублей. Нами же было использовано для лечения 30 больных всего около 500 г липидного носителя, т.е. на одного больного всего 18,8 г.

Высокие проникающие свойства липосомального комплекса интерферона, его пшрофильности, вероятно, имеют прямое отношение к его лечебной эффективности при лечении заболеваний, вызванных внутриклеточным паразитированнем вирусов, в частности, урогенитального герпеса. Прямую роль в индукции эндогенного интерферона под воздействием липосомального экзогенного, по-видимому, играет определенная степень насыщенности биологической мембраны, на что указывали K.Apostolov, W.Barker (1984). Содержание Cis:i(n-9) и Сis:2(n-t.) в используемом ФЛ носителе составляет 8,62i:0,38 и 55,86±1,98%, соответственно. Между тем известно, что именно эти кислоты обеспечивают каскад арахидоновой кислоты, которая превращается потом в мощный агент хемотаксиса - лейкотриен А4 (Крылов И.Б., 1990). Следовательно, в результате использования ФЛ носителей с высоким содержанием Cjs:i(n-9) и Ci8:2(n-6) может, очевидно, происходить интенсификация каскада лейкотриенов, способствуя тем самым индукции собственного интерферона в макроорганизме, что и обусловливает в дальнейшем лечебный эффект липосомального экзогенного интерферона.

Эффективность противовирусного действия липосомального интерферона в сравнении с его водным раствором была установлена нами в экспериментах in vitro на модели реакции агглютинации эритроцитов барана как наиболее чувствительных в присутствии вируса гриппа А (вакцинный штамм).

Перед оценкой противовирусного действия липосомального интерферона в сравнении с его водным раствором и пустыми липосомами была установлена эффективная рабочая доза интерферона (1:32) и вируса гриппа А (1:16 в объеме 0,5 мл) в РГА. Титр вируса в РГА 1:32, интерферона - 1:64. Согласно результатам, полученным в ходе исследования, противовирусная эффективность различных препаратов ИФН и пустых липосом была неодинаковой. Более перспективной оказалась антисыворотка к липосомальному интерферону. В этой связи ее можно будет использовать для обнаружения уровня интерферона в кровотоке больных.

Есть сведения, что химически интерферон не является видоспецифичным, поэтому человеческий лейкоцитарный интерферон в липосомальной форме мы использовали для изучения иммунного ответа у животных (Короткое C.B., 1985; Иовлев В.И. с соавт., 1985). В ходе наших экспериментов по получению антисыворотки к липосомальному интерферону (ЛИФН) установлено, что ЛИФН—обладает—выраженным—иммуноадыовантным—действием,—что подтверждено результатами иммунизации лабораторных животных (кроликов) и получением антител против интерферона. При этом нами показано, что длительность схемы иммунизации ЛИФН животных в эксперименте fa vivo можно снизить с 7-8 недель до 3-4.

При сравнении результатов исследования динамики антителообразования к ЛИФН, водному его раствору и пустым липосомам обнаружились явные различия. Так, антительный ответ животных на внутрибрюшинное введение ЛИФН стимулировал образование мажорного пика при введении одной и той же дозы препарата (0,2 мл) уже на 3-ей неделе эксперимента; водного интерферона - на 4-ой неделе; пустых липосом - на 3-ей неделе. Однако уровень антителообразования к ЛИФН был самым высоким и проявлял себя при разведении сыворотки 1:256-1:512, в то время как для нативного водного и пустых липосом этот показатель был выше и составлял 1:8-1:16 и 1:32-1:64, соответственно.

По мнению F.A.Green, P.B.Costello (1987), на стимулирование антительного ответа к липосомам оказывает влияние фактор концентрации холестерина. В то же время, по данным P.Brudet с соавт. (1976), AJ. van Houte с соавт. (1981), липосомы, состоящие из липидов с точкой фазового перехода 37-38°С менее эффективны и могут считаться иммунонейтральными. Все вышесказанное позволяет оценить свойства липосом, приготовленных нами из очищенных отходов производства соевого масла, как иммуноадьювантные.

2.6. Биостимуляторы в липидных композициях как средства для косметико-

гигиенического vxona за кожей липа и головы

Установлено, что липидные носители животного происхождения, приготовленные на основе морских жидких глицеридов кожно-подкожного жирового слоя тюленей Ларга, близки по своим химическим характеристикам к липидам кожи человека.

Так, ассортимент ЖК кожно-подкожных глицеридов тюленя имеет в своем составе такие же кислоты, как и у соответствующей ткани человека. Это С|8:1(П.9) (28,7*2,5%), С16:0 (18,5±0,45%), С,8:2(п.6) (16,7±1,35%), С16;, (7,8±0,25%), Сц:0 (6,5±0,16%) и C22:i (5,7±0,29%). В то же время биологическая ценность традиционно используемых липидных основ для приготовления эмульсий и кремов обусловливается именно этими ЖК, легко проникающими в волосяной фоликул п верхние слои эпидермиса (Огилец М.В. с соавт., 1988).

Между тем, положительное действие введенного в средство для ухода за кожей лица натурального сока лимонника основано на стимуляции обменных процессов в клетках кожи, регенерации клеток кожи, тонизирующем действии БАВ, а именно, редуцирующих гликозидов, микроэлементов, витамина С, биофлавоноидов (Дардымов И.В., 1976). Сок лимонника обладает антибакгерицидными свойствами, заживляюще действует на кожу (Брехман И.И., 1965, 1968).

Следует отметить, что с целью создания средства для ухода за кожей лица для восстановления нормальных физиологических функций кожи увлажняющего и регенерирующего действия А-И.Борисенкова с соавт. (1990) также вводили в рецептуру комплекс БАВ природного происхождения - экстракт плодов конского каштана и боярышника.

Высокая концентрация восстанавливающих Сахаров в соке лимонника, обнаруженная нами, по-видимому, обеспечивает лучший регенерирующий эффект, чем глюкоза, используемая обычно в качестве гидратанта.

Таким образом, предлагаемая композиции биоактивных компоннетов в средствах для ухода за кожей включает вещества растительного происхождения и органотропные морского. Такие композиции относятся к очень перспективному направлению "фитомарикосметологии".

РАЗДЕЛ III. Биостимуляторы из природного Дальневосточного сырья - источники БАВ, перспективных для депонирования в липосомы

3.1. Пептиды-иммуном»ду7Я|Т9рьт К? костного мо?гя морских млекопитающих

В результате наших научных поисков установлено, что костный мозг морских млекопитающих (тюленя Ларги) являются хорошим источником иммуномодулятора пептидной природы. С помощью метода гель-хроматографии показано, что костно-мозговой пептид гсторогенен и состоит из трех фракций с

неодииаковыми молекулярными массами: I фракция - 5 кДа; II - 8 кДа; III - 10 кДа.

Наша технология позволяет получать очищенный пептид с низкой молекулярной массой 5100-5300 Да. Это снимает межвидовую чужеродность и позволяет применять его для лечения вторичного иммунодефицита у больных.

_Однако результаты исследований показали, что_иммуномодулирующая

активность трех выделенных фракций не одинакова. Наибольший иммуностимулирующий эффект in vivo обнаружили I и II фракции, III фракция совсем не обеспечивала иммунологических сдвигов в В- и Т-лимфоцитах. В то же время известно, что иммуностимулятор из костного мозга млекопитающих, полученный А.А.Михайловой (1982), оказывал стимулирующее влияние только на B-систему иммунитета. Известно влияние иммуномодуляторов микробного происхождения на B-систему и кроветворение.

Нами совместно с Б.В.Туркутюковым установлено, что низкомолекулярный пептид (5100-5300 Да) из костного мозга морских млекопитающих оказывает существенное влияние как на В-, так и Т-систему иммунитета. Пептид проявляет более высокую иммуномодулирующую активность в отношении общего количества В-лимфоцитов, стабильных и аутосубпопуляций Т-лимфоцитов, несколько меньшую - в отношении Тр.рок с хелперной функцией. Все вышеперечисленные особенности биологической активности низкомолекулярного пептида выразились в положительном влиянии на клеточную систему крови у больных со вторичными имммунодефицитами.

С целью установления материальных основ особенностей биологического эффекта пептидов из костного мозга морских млекопитающих был изучен его аминокислотный состав. Результаты исследования показали, что биопотенция пептида формируется за счет высокого содержания гидрофильных (80,14±3,8%) и иммуноактивных (55,04±2,76%) аминокислот. При этом основную массу имммуноактивных кислот составляют Асп, Глу, Ала, Лей, а состав пептида может быть выражен краткой формулой: Асп-Глу-Ала-Лей-Лиз.

По мнению Г.В.Белокрылова с соавт. (1990), аминокислоты - древнейшие участники системы иммуногенеза у млекопитающих.

Вышеописанные результаты наших экспериментов позволяют рекомендовать выделенный нами пептид для инкапсулирования в липосомы. Это

будет способствовать более длительному сохранению его в организме больных с иммунными дефицитами, обеспечивая при этом пролонгирующий эффект БАВ.

3.2. Стимуляторы гемопоэзз и радиационная зашита

Нетрадиционное, а часто и не полностью используемое сырье животного происхождения, в частности, внутренности, кожа, кости, кровь животных, может служить потенциальным источников многих БАВ (Гурии A.C., Ажгихин И.С., 1931; Баренбойм Г.М., Маленков Л.Г., 1986; Туркутюков В.Б. с соавт., 1990).

Совместно с В.Б. Туркуткжовым нами проверена у полученного жидкого оленьего гематогена способность стимулировать процессы кроветворения у лабораторных животных в опыте "острая кровопотеря". Результаты исследования показателей периферической крови (уровень гемоглобина, количество лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, эритроцитов, базофилов, палочкоядерных нейтрофнлов) у животных, получавших олений гематоген, достигали нормы не только на 7-ой, но и на 15-й день после опытного кровопускания. Причем по уровню гемоглобина и эритроцитов несколько превышали ее (8б,53±2,01 против 79,42±0,36% и 8,2+0,46 против 7,8+0,6 млн, соответственно). В контрольной группе животных, получавших бычий гемоглобин, наоборот, имело место отставание по ряду параметров: уровню гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов. При введении 5% раствора эмбрионального гемоглобина животным В.А.Антоненко с соавт. (1985) примерно в одинаковые сроки, на 11-е сутки после острой кровопотери, наблюдали восстановление показателей иммунной защиты, в частности, функции Т-лимфоцитов.

Таким образом, препарат гематогена из оленей крови повы лает способность организма восстанавливать количество и соотношение клетошых элементов периферической крови в значительно более короткие сроки и (¡олее полно, предупреждая возможность развития осложнений, возникающих при острых кровопотерях. Регулирующее действие "морских" метаболитов на гемопоэз и иммуногенез обнаружено и у морских беспозвоночных (Гришин Ю.И. с соавт., 1990, 1991).

Известно, что показатели иммунной защиты организма снижены при облучении (Козлов В.А. с соавт., 1982: Бугров С.А., 1990). В то же время карнозин (низкомол кулярный пептид), выделенный из мясного фарша, стимулировал активность гемопоэтических стволовых клеток костного мозга у облученных животных (Мальцева В.В. с соавт., 1991).

В.БЛГуркугюковым совместно с нами было проведено экспериментальное изучение возможности защитного действия лабораторных животных от ионизирующего излучения гематогеном (согласно "Методическим указаниям по экспериментальному и клиническому изучению радиопротекторов", 1978). Уже на 5-й день после облучения в опытных группах белых мышей оказалось

значительно_выше содержание гемоглобина, эритроцитов, тромбоцитов и

ретикулоцитов, что свидетельствует, с одной стороны, о хорошо идущих восстановительных процессах эритропоэза за счет сохранения эритроцитарного ростка костного мозга, а, с другой, - об активации резервных возможностей организма подопытных животных как в восстановлении разрушенных эритроцитов, так и сохранении свертывающей системы крови.

Исследованный биопотенциал гематогенов ДВ-происхождения подтверждается своеобразием химического состава. Так, олений гематоген содержит гораздо больше белка и меньше железа. Это позволяет нашему препарату не только быстро и качественно восстанавливать гематологические показатели, но и является полезным для создания явления относительной гипоксии, лежащей, по мнению В.Г.Владимирова с соавт. (1989), в основе одного из возможных механизмов радиационной защиты организма.

Особую биологическую ценность препарата гематогена можно объяснить не только вышеперечисленными особенностями химического состава, но и тем, что содержание незаменимых аминокислот оказалось высоким и составило 55,99% от общей суммы. Обращает на себя внимание факт обнаружения в оленьем гематогене большого количества иммуноактивных аминокислот, а именно: Глу, Асп, Ала, Тре, Сер, Вал, Цис, Арг,- составляющих.ячень-большое_количество-54,8% от общей суммы аминокислот.

Таким образом, препараты из крови оленей характеризуются очень благоприятным для организма биопотенциалом, а данные его биотестирования позволяют сделать вывод о возможности его использования для коррекции клеточного состава крови у людей, подвергшихся и подвергающихся воздействию ионизирующего излучения не только на специализированных производствах, но и я зонах с природным повышенным радиационным фоном.

3.3. Биостимуляторы комплексной природы из трепанга японского 3.3.1. Технология получения и очистки комплекса БАВ из трепанга японского.

Изучение химического состава комплексных экстрактов из трепанга японского

Трепанг дальневосточный (Stichopus japónica Selenka) является уникальным продуктом по содержанию различных биологически активных компонентов -белков, минеральных веществ, суммарных гликозидов (Еляков Г.Б., Стоник В.А., 1986, 1989; Kitagawa I., 1988; Аминин ДЛ. с соавт., 1990, 1990а; Kalinin V.l., 1991). Разноплановые вытяжки из биомассы трепанга или отдельных его частей обладают целым рядом важных в отношении здорозья человека свойств -антимикробной, противоопухолевой, противовирусной, гемолитической, контрацептивной, цитостатической и иммуномодулирующей активностью (Lasley

B.I.. Nigrelli R.B., 1970; Анисимсп М.М. с соавт., 1972, 1973, 1974, 1991; Батраков

C.Г. с соавт., 1980; Мац М.Н. с соавт.. 1990).

Известны способы получения средств для стимуляции защитных сил организма из морских гадробионгов (Faulkner Т., 1972; Еляков Г.Б., Стоник В.А., 1986, 1989).

В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения тот факт, что отличительной чертой метаболизма многих морских организмов, а в особенности, морских беспозвоночных является продуцирование часто сложных по своему составу комплексов химических соединений, в которых нередко присутствует по нескольку десятков компонентов, близких друг к другу по свойствам (Anisimov М.М. et al., 1973, 1980; Корспанова E.H., 1980; Gottlieb O.R., 1982; Калинин В.И. с соавт., 1992). Поэтому анализ выделенного нами комплексного БАВ был начат с ИК-спектроскопии. В ИК-спектрах фракций, полученных нами методом ' градиентной гидрофобной хроматографии, обнаружены широкие полосы при 3400-3200 см-1 и 1142 см*1 (гликозшшая связь, С-О- ) и узкая полоса при 650 см"1 (С-На1), типичные для соединений морского происхождения.

Хронобиологические особенности конструктивного метаболизма БАВ у морских гидпобионгов, изучаемые нами на примере комплекса БАВ из трепанга японского, отловленного в различное время, по-видимому, сказываются очень сильно на их количественном содержании. Так, весенняя партия трепанга более обогащена нуклеиновыми кислотами (>в 2 раза), моносахаридами (>в 2,6 раза), больше у нее и суммарных гликозидов, но меньше белка и общих липидов.

Известно, что нерест трепанга идет в летнее время (Левин B.C., 1982, 1989). В этой связи логично предположить, что весной в период подготовки к нересту у трепанга наблюдается активирование обменных процессов, стимулирующих биосинтез веществ, заинтересованных в передаче генетической информации, что требует продуцирования большого количества нуклеиновых кислот и

моносахаридов—как—нммунореактивного_и_энергосберегающего_субстрата.

Аналогичные особенности конструктивного метаболизма морских гидробионтов подмечены Т.Н.Слуцкой (1974), P.I.Scheuer (1979), I.Rodriguez, P.Riguera (1989), Н.Б.Щениковой (1994). 3.3.2. Биотестирование комплексного водно-этанольного экстракта из трепанга

Одним из обязательных тестов на безопасность любого средства, планируемого к применению в медицинской практике, является определение токсичности. В экспериментах по определению острой токсичности комплекса БАВ из трепанга японского нами показано, что средняя токсическая доза препарата, вызывающая гибель в течение 3-х дней 50% мышей при внутрибрюшинном введении, составляет 57,5 мг/мышь. Проверка комплекса БАВ в концентрациях эксперимента не выявила токсических эффектов у животных, получающих его. Комплексные экстракты имеют в своем составе суммарные тритерпеновые гликозиды, присутствие которых, по мнению ряда авторов (Иванов А.С. с соавт., 1981; Лихацкая Г.Н. с соавт., 1990, 1991; Aminin D.L., Anisimov М.М., 1992), обусловливает токсический эффект. Однако, содержание суммарных гликозидов в нашем случае ниже, чем указывает данный литературный источник, - 165-178 мкг/мл.

Результаты биотестирования на наличие иммуномодулирующей активности у комплекса БАВ из трепанга японского показали, что он стимулирует антительный ответ на корпускулярные антигены (эритроциты барана). Это выражается в увеличении титра гемагглютининов в логарифмах от 5,0±0,6 до 7,1±0,5 у мышей, иммунизированных комплексом БАВ с эритооцитами барана в дозе от 0,25 до 25 мг/мышь, при контроле - 4,5±0,6.

Влияние комплекса БАВ на развитие иммунологического ответа к корпускулярным антигенам (эритроциты барана) выразилось также в увеличении общего количества антител ообразующих клеток (АОК) с 4247±143,5 до 10995±712,38 при иммунизирующих дозах от 0,25 до 25 мг/мышь.

О специфическом стимулирующем влиянии химически обработанного водно-этанольного экстракта из трепанга японского говорит и увеличение общей клеточногти селезенки, определенной в камере Горяева с (4,14±0,28)х106 до (6,13±0,25)х106 при контроле (2,б5±0,5)хЮб.

Сопротивляемость организма инфекциям, его защита от микроорганизмов зависит не только от способности развивать иммунный ответ, но и от состояния естественной резистентности организма (Петров Р.В., 198 О-

Совместно с Т.Я.Любавской нами установлено усиление резистентности мышей на модели экспериментального сальмонеллеза. Это выразилось в стимуляции гуморальных и клеточных факторов защиты. Так, общее количество лизоцима и комплемента при иммунизации любой дозой от 0,25 до 25 мг/мышь возросло с 16,6±0,5 до 21,25±0,7 .1 с 41,8±0,б5 до 53,1±0,5 при 14,25±0,7 и 33,5±1,3 в контрольной группе животных. Определение фагоцитарной активности макрофагов у мышей: индекс Райта (фагоцитарное число), индекс Гамбургера (интенсивность фагоцитоза), НСТ-тест (спонтанный активированный фагоцитарный резерв), - показало, что водно-этанольный экстракт из трепанга японского усиливает естественную резистентность организма лабораторных животных к экспериментальной. инфекции, вызванной сальмонеллами мышиного тифа. Это выразилось, в частности, в увеличении интенсивности фагоцитоза (индекс Гамбургера) с 64,8±0,31 до 83,2:'-Л,58% при контроле 51,6±0,85 для доз от 0,25 до 25 мг/мышь.

Таким образом, суммируя результаты исследований в данном направлении можно заключить, что химически обработанный водно-этанольный экстракт обладает выраженным иммуностимулирующим действием и способно ггью усиливать естественную антибактериальную резистентность животных, при этом эффект препарата зависит от его дозы. В этой связи весьма перспективным сЗудет использование комплекса БАВ из трепанга японского как наполнителя липосом в качестве стимулирующего к профилактического средства, усиливающего естественную резистентность к инфекциям.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые дана сравнительная характеристика особенностей фосфолипидного состава мембраноорганных липидов у человека, глазного потребителя липосом, у животных наземного (свинья, кролик, мышь) и морского (морской котик, тюлень) происхождения различных экологических ниш - их носителей

и доноров для конструирования искусственных мембранообразующил липосомальных конструкций. Установлено, что в процессе метаболизма БАВ у человека аккумулирование главных мембраностроителышх ФЛ - ФХ и ФЭ происходит в сердце-печени-лепсих; у животных наземного происхождения в разных органах (у свиньи - в сердце, у кролика - в сердце и легких, у мыши -

в легких и печени; у морских животных - в печени и селезенке.

2. Разработан способ получения дешевого и доступного носителя ФЛ из отходов производства соевого масла. На основании фосфолипидной композиции установлено, что он менее чужероден по отношению к человеческим липидам, чем традиционно применяемые в липосомологии фосфолипиды желтка куриных яиц. Последние более гомологичны по отношению к ФЛ и ЖК внутренних органов мыши.

3. Установлен о, что жирнокислотный спектр фосфолипидов и нейтральных липидов 5 наиболее важных органов человека представлен 35 жирными кислотами. Фосфолипиды внутренних органов человека - депонентов липосом содержат больше ненасыщенных ЖК, чем насыщенных. Особенно богаты ненасыщенными ЖК ФЛ сердца, среди которых основную массу составляют полиеновые "европейской" серии (п-6). Жирными кислотами "морской" серии (п-3) наиболее богат мозг человека.

4. Проведена дифференцировка и хемопаспортизация всех внутренних органов человека с помощью предложенных нами маркеров Кннжк» Кбпнжк» К^жк-Установлено, что моноеновых жирных кислот больше всего в ФЛ тимуса, самое высокое значение Кннжк выявлено в сердце, Кбпнжк - в тимусе, Кмжк - в мозге человека. Найдено, что содержание ненасыщенных моноеновых жирных кислот в НЛ внутренних органов человека больше, чем в ФЛ. При этом самый высокий Кннжк выявлен в ФЛ сердца, Кбпнжк - в яичниках, Кмжк имеет низкий уровень, что свидетельствует о мембраностабилизирующей роли ЖК "морской" серии п-3.

5. Установлено, что внутренние органы человека и животных разной ступени развития наземного происхождения имеют различные возможности к аккумуляции нейтральных и кислых ФЛ. При этом клеточные мембраны органов морских животных, в частности, морского котика, наиболее богать-кислыми фосфолипидами, а легкие нейтральными ФЛ. Показана возможность

дифференцировки внутренних органов человека и животных с помощью маркера - Кк/0 для конструирования липосом.

6. Показана возможность количественной оценки устойчивости липосом в процессе их хранения с помощью предложенного нами коэффициента - К^б. Установлено, что в полидисперской системе самыми стабильными липосомами являются частицы со средними размерами в диапазоне от 62 нм до 160 нм. При этом характер дисперсности липосом, приготовленных из носителя по разработанному нами способу, стабилизированных холестерином и а-токоферолом (8 х 10'3 мкмоль/мкмоль ФЛ) меняется в сторону увеличения количества крупных и уменьшения количества мелких частиц.

7. Экспериментально установлено, что для конструирования эффективно проникающих в органы мышей гомологичных флуоролипосом наиболее оптимальным является соотношение компонентов по массе: 71,5% ФЛ, 28,19% Хол: 0,216% ДМХ. При этом депонирующие способности фосфолииосом из ЯФЛ и гомологичных органных ФЛ по отношению к флуоресцентному маркеру ДМХ не одинаковы. Так, для легочных гомологичных флуоролипосом захват легкими мышей сравним с таковым печеныо; яичные флуоролипосомы дольше удерживаются в кровотоке^ чем гомофлусролипосомы.

8. Получены и стандартизированы по составу и размерам липосомальные комплексы антибиотика нового III поколения из 1руппы фторхинолонов -таривида. Установлено, что эффективность инкапсулирования таривида в липосомах зависит от природы носителя, концентрации ФЛ, соотношения главных мембраностроительных ФЛ ФХ/ФЭ, холестерина и ДМСО. Показано, что таривид, обладая кислыми'свойствам и, лучше депонируется в носителе из подкожного жира морских млекопитающих с более высоким содержанием кислых ФЛ, чем носителями из ЯФЛ. ФЛ и НЛ подкожного жира морских млекопитающих стандартизованы по композиции и архитектонике ЖК: концентрация ЖК "морского" семейства серии п-3 в мембранах превышала таковую в НЛ почти в 4 раза. Установлена безопасность липосомального комплекса таривида для клинического применения.

9. Получены и стандартизованы по составу и размерам липосомальные комплексы человеческого лейкоцитарного а-интерферона с использованием в качестве эффективного депонирующего носителя ФЛ из отходов производства

соевого масла. Показано, что липосомальная основа интерферона обеспечивает эффективную доставку препарата внутрь инфицированных клеток, что в клинических условиях доказано на модели урогенитального герпеса у женщин. Искусственная липосомальная оболочка интерферона усиливает его противовирусный эффект, что установлено in vitro на модели

реакции гемагглютинации^эритроцитов барана^в присутствии—вирусов__

Показано, что липосомальный интерферон обладает хорошим адъювантным эффектом при иммунизации им животных и получении антител против интерферона. Он в 2,5-3 раза сокращает длительность схемы иммунизации.

10. Установлено, что растворимые глицериды подкожного жирового слоя морских млекопитающих близки по химическим характеристикам к липидам кожи и подкожного жирового слоя человека, что определяет их относительную гомологичность и способность служить липндной основой для получения липосом и липидных эмульсий с инкапсулированием биологически активных веществ растительного происхождения из ДВ сырья, благотворно влияющих на обменные процессы в коже.

11. Высокая эффективность липосомальных форм БАВ, сконструированных нами, показала необходимость поиска новых БАВ, перспективных для включения в липосомы. Разработаны способы получения иммуномодуляторов пептидной природы из костного мозга морских млекопитающих, стимуляторов гемопоэза и противорадиационной защиты из крови дальневосточных и северных оленей, биостимуляторов комплексной природы из трепанга японского. Дана детальная характеристика особенностей их химического состава, проведено биотестирование как потенциальных наполнителей липосом.

12. Разработано и оформлено 11 изобретений, 9 из которых защищены патентами и авторскими свидетельствами РФ. Внедрено в производство 3 препарата и разработана нормативно-техническая документация на 3 препарата.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИССЕРТАЦИИ В

НАУКУ И ПРАКТИКУ

В результате проведенных экспериментальных и экспериментально-клинических исследований был разработан ряд рекомендаций для внедрения в науку и практику. Значительная часть рекомендованных предложений внедрена в

производство препаратов биологически активных веществ на основе

дальневосточного сырья. Внедрение осуществлено по следующим предложениям:

1. "Способ получения липосомального интерферона и повышения его терапевтической активности". Апробирован в Приморском краевом центре СПИД для лечения урогенитального герпеса у женщин. Акт внедрения от 10.01.95 г.

2. "Способ лечения кожных заболеваний, сопровождающихся пиодермией". Апробирован в кожно-венерическом диспансере г. Владивостока для лечения больных с угревой сыпью. Акт внедрения от 10.01.96 г.

3. Препарат "Средство для ухода за кожей лица". Внедрение препарата осуществлено в косметологическом отделении кожно-венерического диспансера г.Владивостока для лечебного ухода за лица больных, страдающих от угревой сыпи, имеющих раздражение от воды, мыла, бритья. Акт внедрения от 10.01.96 г.

4. Препарат "Средство ухода за кожей головы". Внедрение препарата осуществлено в лечебную и профилактическую работу косметологического отделения кожно-венерического диспансера г.Владивостока для лечения, в основном, больных, страдающих от частого применения химических средств, лаков, химической завивки. Акт внедрения от 10.01.96 г.

5. Препарат-продукт "Гематоген сухой" предназначен для стимуляции гемопоэза. Производство осуществляется АО "Владгехнопарк", г. Владивосток. Акт внедрения от 01.09.92 г.

6. Препарат "Средство профилактики нарушения процессов кроветворения". Предложен для лечения больных при острых и хронических кровопотерях. Производство осуществляется АО "Владтекнопарк", г. Владивосток.

7. Пищевой продукт "Сахар-рафинад витаминизированный". Производство осуществляется АО "Приморский сахар" (г. Уссурийск). Акт внедрения от 01.11.92 г.

8. Препарат "Средство, влияющее на гемопоэз". Предложен для лечения больных, пострадавших при авариях, подобных Чернобыльской. Производство осуществляется АО "Владгехнопарк", г. Владивосток.

9. Продукт "Меласса тростниковая". Производство осуществляется АО "Приморский сахар" (г. Уссурийск). Акт внедрения от 01.06.96 г.

Кроме того, для внецреиия предлагаются:

1. "Способ получения пептндов-иммуномодуляторов". Защищен патентом РФ №1836954 от 30.08.93 г.

2. "Способ получения липосом, содержащих антибиотики". Защищен заявкой на выдачу патента N»5018028/14 (082423) . с Приоритетом от 27.12.91 (полож. решение ВНИИГПЭ на выдачу патента от 02.06.95 г).

3. "Способ получения полиеновых жирных кислот". Защищен патентом РФ №1803121 от 13.10.93 г.

Научные результаты, полученные в ходе исследования особенностей биотехнологии липосомальных комплексов БАВ и биостимуляторов на основс природного дальневосточного сырья могут быть и оказались полезными в учебном процессе ряда подразделений Владивостокского государственного и Дальневосточного государственного медицинских университетов (Акт внедрения от 15.11.96 г.), Дальневосточного рыбохозяйственныго университета (Акт внедрения от 11.06.97 г.), Амурской медицинской академии (Акт внедрения от 20.06.97 г.)

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Липиды морских млекопитающих - основа для получения липосомальных препаратов антибиотиков и других лекарственных средств (соавт. Мотавкина Н.С. и др)// Всесоюзн. совещание "Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные лечебно-профилактические и технические препараты", Владивосток, 1991, с.43.

2. Эмульгированные лечебные средства с радиопротекторной активностью (соавт. Мотавкина Н.С., Туркупоков В.Б.)// Региональная научно-практическая конференция "Медицина катастроф", Владивосток, 1991, с.38.

3. Перспективы использования липосомальных форм лекарственных препаратов для рефлексотерапии (соавт. Мотавкина Н.С., Михайленко Т.А.)// Всеросс.: конференция с международным представительством, Владивосток, 1992, с.9.

4. Нетрадиционное сырье морского промысла - новый источник пищевых продуктов специального назначения (соавт. Туркупоков В.Б.)// Межгосударственная научная конференция "Комплексная переработка пищевого сырья и основные направления расширения ассортимента продуктов питания", Владивосток, 1993, с.5.

5. Способ получения полиеновых жирных кислот (соавт. Авхутская Т.С. и др.)// Патент РФ № 1803121, опубл. БИ № 11, 1993, с.16.

6. Способ получения иммуномодулиругащих пептидов (соавт. Мотавкина Н.С., Туркупоков В.Б.)// АС № 1836954, опубл. БИ № 32, 1993, с.20.

7. Микроэлементы в витаминизированных сахарах - перспективном лечебно-профилактическом продукте.// Научно-практическая конференция "Здоровье и болезни человека на Дальнем Востоке". Владивосток, 1993, С.26.

8. Оптимизация лекарственного транспорта с помощью аутолипосом.// II Международн. симпозиум медицинского обмена Японии, России и стран северо-восточной Азии, Владивосток, 1994 г., с.213 (англ.-русск.)

9. Эффективность липосомальных комплексов антибиотиков и перспективы их использования при инфекционной патологии (соавт. Мотавкина Н.С., Михайленко Т.А.).// Научно-практическая конференция "Здоровье и болезни человека на Дальнем Востоке". Владивосток, 1993, С.25.

10. Изучение проникающей способности флуоролипосом в организме лабораторных животных (соавт. Пинчук В.А.)// Научная конференция "Проблемы клинической и экспериментальной медицины", Владивосток, 1994, с.20.

11. Перспективы использования липидов морских пщробионтов в народном хозяйстве и медицине (соавт. Мотавкина Н.С.)// Юбилейный сборник научных трудов ученых-медиков, ч.1, Владивосток, 1994, с.21.

12. Перспективы управления доставкой лекарственных препаратов при использовании цеолитов для создания современных транспортных средств -липосомальных комплексов (соавт. Мотавкина Н.С.)// Региональная научно-практическая конференция "Цеолиты Приморья", Владивосток, 1994, с.43.

13. Эффективность включения тинидазола в липосомы из фосфолигадов морских млекопитающих (соавт. Однопозов М.А.)// Научная конференция "Проблемы клинической, профилактической и экспериментальной медицины". Владивосток, 1994. С. 21.

14. Средство для профилактики нарушения процессов кроветворения (соавт. Туркупоков В.Б, Мотавкина Н.С.)// Патент РФ № 2014081, опубл. БИ № 11, 1994, с. 14.

15. Способ получения средства, влияющего на гемопоэз (соавт. Туркупоков В.Б.) // Патент РФ N?. 2017493, опубл. БИ № 15, 1994, с.15.

16. Construction of liposomes and phospholipid-fatty acid composition of target organs.//UI International Symposium of Japan-Russian Médical Exchange Foundation and the NEA Region, Tokyo, Japan, 1995, p.10.

17. Возможности использования липосомных препаратов при обструктивных заболеваниях легких (соавт. Невзорова В.А., Гельцер B.H.)//V Международн.

—конгресс по пульмонологии, Москва, 1995, с.29.___

18. Применение липосомального интерферона для лечения гекитального герпеса (соавт. Федорищева Л.В., Мотавкина Н.С.)// Материалы IV Конференции Сибири и Дальнего Востока, Вып.З, Хабаровск, 1995, с. 122.

19. Биотехнологическое решение производства качественных товаров народного потребления на липосомной основе (соавт. Мотавкина Н.С. и др.)// Международн. конференция "Проблемы качества потребительских товаров и коммерческой деятельности в условиях рынка", ч. II, Владивосток, 1995, с.29.

20. Липосомальная биотехнология конструирования медицинских товаров народного потребления (соавт. Федорищева Л.В., Мотавкина Н.С.)// Международн. конференция "Проблемы качества потребительских товаров и коммерческой деятельности в условиях рынка", ч. II, Владивосток, 1995, с.46.

21. Конструирование оптимальных носителей лекарственных препаратов -липосом.// 36-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1995, С.46

22. Способы получения фосфолипидных комплексов бета-адреномиметиков для лечения бронхообструктивного синдрома (соавт. Гельцер Б.И., Невзорова

B.А.)//36-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1995, С.48

23. Применение липосомальной формы хромогликата натрия и беротека на экспериментальной модели бронхообструктивного синдрома (соавт. Гельцер Б.И., Невзорова В.А.)// 36-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1995, С.49

24. Применение депонированного интерферона для лечения урогенитального герпеса (соавт. Федорищева Л.В. и др.)// 36-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1995, С.207

25. Гемолитическая активность экстрактов из дальневосточного трепанга (соавт. Любавская Т.Я.)// 36-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1995.

C. 15

26. Средство для ухода за кожей лица (соавт. Мотавкина Н.С. и др.) // Патент РФ N> 2053761, опубл. БИ № 4, 1996, С.15.

27. Биотехнологический обзор: конструирование и эффективность эмульсионко-липосомальных комплексов лекарств и БАВ на основе природного ДВ-сырья// В кн.: Региональная ассамблея "Здоровье населения ДВ", Владивосток, изд-во "Уссури", 1996, С.237-238.

28. Перспективы использования сахара с добавками растительных БАВ в борьбе с инфекционной патологией челозека//В кн.: Региональная ассамблея "Здоровье населения ДВ", Владивосток, изд-во "Уссури", 1996, с.239-240.

29. Антимикробный эффект комплексного БАВ из трепанга японского (соавт. Пюбавская Т.Я.)// 37-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1996, С.18

30. Эффективность включения тинидазола в липосомы из фосфолипидов морских млекопитающих.//37-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1996, С.22.

31. Получение кроличьей антисыворотки к липосомальному интерферону и перспективы ее использования.//37-я Научно-практическая конф. ВГМУ. Владивосток, 1996, С. 15.

32. Взаимосвязь гомологичности липосом с липидным составом легких человека.// VI Международный конгресс по пульмонологии. Москва, 1996. С.136.

33. Биостимулирующее влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на течение экспериментального сальмонеллеза у мышей (соавт. Мотавкина Н.С., Любавская Т.Я.)//Депонировано в ВИНИТИ, 1996. 15 с.

СПИСОК ИЗОБРЕТЕНИЙ И НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ

1. Изобретения.

1. Способ получения липосом, содержащих антибиотики. // Полож. решение ВНИИГПЭ на выдачу патента по заявке №5018028/14 (082423) от 02.06.95 г. с приоритетом от 27.12.91. (соавт. Мотавкина Н.С., Михайленко Т.А.)

2. Способ лечения больных пиодермией. // Полож. решение ВНИИГПЭ на выдачу патента по заявке №5019833/14 (082537) от 04.05.95 г. с приоритетом от 27.12.91. (соавт. Мотавкина Н.С.. Михайленко Т.А.)

3. Способ получения липосомального интерферона. // Заявка на выдачу патента №95115187 с приоритетом от 25.08.95. (соавт. Мотавкина Н.С., Федорищева Л.В., Пинчук В.А.)

4. Средство для ухода за кожей лица.// Патент РФ №2053761 от 10.02.96 г. с приоритетом от 12.03.92. (соавт. Мотавкина Н.С., Михайленко Т.Т., Авхугская Т.С., Супрунов М.А.) -----

5. Средство для ухода за кожей головы.// Полож. решение ВНИИГПЭ на выдачу патента по заявке № 5031932/14 (012068) от 19.01.95 г. с приоритетом от 12.03.92. (соавт. Мотавкина Н.С., Туркутюков В.Б.)

6. Способ получения полиеновых жирных кислот.// Патент РФ № 1803121 от 13.10.93 г. с приоритетом от 04.12.90. (соавт. Мотавкина Н.С., Авхутская Т.С.)

7. Способ получения пегстидов-иммуномодулягоров.// Патент РФ №1836954 от 30.08.93 г. с приоритетом от 26.10.90. (соавт. Мотавкина Н.С., Туркутюков В.Б.)

8. Способ получения средства для профилактики нарушения процессов кроветворения.// Патент РФ №2014081 от 15.06.94 г. с приоритетом от 11.06.90. (соавт. Мотавкина Н.С., Туркутюков В.Б.)

9. Способ получения средства, влияющего на гемопоэз.// Патент РФ №2017493 от 15.08.94 г. с приоритетом от 29.04.91. (соавт. Туркутюков В.Б.)

10. Способ получения средства для стимуляции защитных сил организма// Заявка на выдачу патента РФ №97106885/20 от 22.04.97 г. (соавт. Мотавкина Н.С., Любавская Т.Я.)

П. Способ оценки и повышения органотропности искусственных липидных мембранообразующих конструкций (липосом).// Заявка на выдачу патента РФ №97106886/20 от 22.04.97 г. (соавт. Мотавкина Н.С.)

11. Нормативно - техническая документация по продуктам, внедренным в ПР9ИЗР9ДСТР0,

12. Гематоген сухой. ТУ 429082-00392. / соавт. Мотавкина Н.С., Туркутюков В.Б., Петров В А - Внесены в реестр государственной регистрации №035/001136 от 21.05.92.

13. Сахар витаминизированный. ТУ 429065-004-92. / соавт. Мотавкина Н.С., Диго Р.Н., Авхутская Т.С., Черняк Н.Б., Калязина Л.В. - Внесены в реестр государственной регистрации №035//001178 от 26.10.92.

14. Меласса тростниковая. ТУ 9112-005-196-2897-94. / соавт. Мотавкина Н.С., Диго Р.Н. - Внесены в реестр государственной регистрации №035/001365 от 26.05.94.

III. Методические рекомендации.

1. Коррекция железодефицитных состояний гематогенами из крови промысловых морских млекопитающих. (Соавт. Мотавкина Н.С., Туркупоков В. Б.) Вл-к, 1996, 11 с.

2. Применение гематогенов из крови пятнистого и северного оленей в профилактике последствий ионизирующей радиации. (Соавт. Туркупоков В.Б.) Вл-к, 1996, 10 с.

биообъекты

|—( Биообъекты доя поиска

ЛИЛОСОМАЛЬНЫХ НОСИТЕЛЕЙ

~^ наземные млекопитлюмиё1

<

[ человек и его органы i

[ ЛЕГКИЕ! СЕРДЦЕ ) -К СЕЛЕЗЕНКА ) [ ПЕЧЕнТ) [ ЛОЧКУр 1 ТИМУС ) -К ЯИЧНИКИ) [ МОЗГ )

кролики, их органы, кровь

мыши белые

морские свинки

-*1 свиньи. их органы 1 куриные яйца 1 НАЗтИЫЕ^АСТЕНЙаГ

соя, отходы производства масла

ч

МОРСКИЕ ЖИВОТНЫЕ

морской котик1

Ч тюлень ларгаЛ

[ КРОВЬ )

-н морские животные"

р

Биообъекты - источники БАВ

наземные животные

-ЛС.

'олень северный, _пятнистый

тюлень ларга i

ч

[ подкожный жир) органы} '-Ч костный мозг]

трепанг 1

-К водный экстракт] —+{ спиртовый экстракт)

антибиотики и иммуяомрдуляторы

таривид

пенициллин —>1 эритромицин —>1 интерферон

микроорганизмы

бактерии^ грибы ~| вирусы ~]

Схема 1. Биологические объекты, использованные в исследовании.

Схем.: 2. Основные направления исследований.