Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние липосомальных форм антибиотиков на патогенные свойства Treponema Pallidum, паразитирующей в организме экспериментальных животных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние липосомальных форм антибиотиков на патогенные свойства Treponema Pallidum, паразитирующей в организме экспериментальных животных"

На правах рукописи

ОДИНЕЦ Алексей Васильевич

ВЛИЯНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ АНТИБИОТИКОВ НА ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА TREPONEMA PALLIDUM, ПАРАЗИТИРУЮЩЕЙ В ОРГАНИЗМЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь - 2008

003164074

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» и ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Ефременко Виталий Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Афанасьев Евгений Николаевич,

Ведущая организация: ФГУЗ «Волгоградский научно-

исследовательский противочумный институт»

Защита диссертации состоится 19 февраля 2008 г в 15 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256 09 в Ставропольском государственном университете по адресу- 355009, г Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 2, комн 506

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета

Автореферат разослан_У^Ь ^_2008 г

кандидат медицинских наук Алиева Елена Васильевна

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема заболеваний, передающихся половым путем, в том числе сифилиса, является актуальной во всем мире, и в особенности для России (Аковбян В.А. и соавт., 1998; Чеботарев В.В и соавт., 1997) Во многом это связано с приспособляемостью бледных трепонем к антибиотикотерапии и, как следствие, с их изменчивостью в сложных условиях паразитирования в организме хозяина, связанной с морфофункциональными особенностями его организма

В связи с этим большое значение приобретает разработка способов, направленных на создание новых лекарственных форм, в том числе липосомальных, оказывающих в рамках паразитоценоза двоякое действие: бактерицидное - на микроорганизм и иммуностимулирующее - на ткани хозяина (Ефременко В И., 1999). Способы лечения липосомальными формами антибиотиков различных инфекций в литературе представлены широко (Гребёнкина М.Б и др., 1993, Ефременко В .И и др., 1995, Кузнецов СМ и др , 1999, Мисетова Е.Н, 2003; Medda S et al, 1995, и др ) Тем не менее, данных о лечении сифилитической инфекции в эксперименте липосомальными формами антибиотиков нами не обнаружено

Неотъемлемой частью конструирования липосомальных препаратов на основе конкретного лекарственного средства является экспериментальное подтверждение их эффективности путем изучения биологических свойств возбудителя, важнейшим из которых является его патогенность, то есть способность наносить ту или иную степень вреда организму хозяина, наиболее ярко проявляющуюся клинико-морфологическими особенностями и иммуногенностью возбудителя.

Известно, что именно эти характеристики являются объективным отражением факторов патогенности, свойственных возбудителям инфекционных болезней (инвазивности, адгезии, факторов агрессии и других) Литературные сведения о факторах патогенности Treponema pallidum спорны и малочисленны Поэтому экспериментальное изучение клинических, патоморфологических и иммунологических показателей хозяина в исследуемой паразитарной системе позволит восполнить этот пробел и составить мнение не только о характере взаимоотношения макроорганизма и возбудителя, но и об изменчивости его биологических свойств под влиянием новых липосомальных форм антибиотиков, разработанных нами

Поскольку сведений о патоморфологических изменениях в макроорганизме на введение липосомальных антибиотиков при различных инфекциях крайне мало (Таран Т.В , 2004), то необходимым этапом исследований является и исключение возможных повреждений клеток различных органов на введение липосомальных лекарственных средств при сифилитической инфекции, так как этот факт также может влиять на факторы патогенности возбудителя или изменять его в1фулентность.

В связи с этим решение задач, связанных с изучением клинических, патоморфологических и иммунологических показателей организма лабораторных животных, обусловленных патогенными свойствами Treponema pallidum, под влиянием новых антибактериальных липосомальных препаратов, является своевременным и актуальным

Цель исследования: оценить особенности влияния липосомальных препаратов антибиотиков в сравнении с их интактными формами на патогенные свойства возбудителя сифилиса, паразитирующего в организме экспериментальных животных

Основные задачи исследования:

1. Получение и характеристика липосомальных форм экстен-циллина и натриевой соли бензилпенициллина, оказывающих бактерицидное действие на возбудитель сифилиса m vivo

2. Изучение особенностей клинических проявлений первичного и вторичного сифилиса у экспериментальных животных как критерия оценки меры патогенности возбудителя под влиянием интактных и липосомальных форм антибиотиков, в зависимости от схем их применения.

3. Оценка динамики изменений серологических показателей у животных с экспериментальным сифилисом при введении им интактных и липосомальных форм антибиотиков.

4. Сравнительное изучение патоморфологических изменений как интегративного показателя взаимоотношений макроорганизма и возбудителя в паразитарной системе, в органах больных сифилисом животных, получавших антибиотики в свободной и липосомальной формах.

Научная новизна.

1. Впервые на основе комплекса клинических, морфологических и иммунологических показателей установлено влияние новых липосомальных форм антибиотиков на степень болезнетворного действия Treponema pallidum на организм лабораторных животных, яв-

ляющегося следствием его патогенных и иммуногенных свойств.

2 Разработаны схемы лечения первичного и вторичного экспериментального сифилиса, полученными липосомальными формами антибиотиков, и доказаны их преимущества перед интактными лекарственными препаратами

3. Показана возможность оценки эффективности действия ли-посомальных антибиотиков на организм экспериментальных животных при лечении сифилитической инфекции с помощью серологических реакций

4. Проведена сравнительная оценка патоморфологических изменений в органах и тканях животных, которым вводили интактные и липосомальные антибиотики при лечении экспериментального сифилиса.

5. Результаты применения новых схем лечения сифилиса с использованием липосомальных форм антибиотиков являются научно-экспериментальным обоснованием усовершенствования существующих в практическом здравоохранении схем лечения сифилитической инфекции.

Практическая и теоретическая значимость исследований.

Результаты исследования имеют как теоретическое, так и практическое значение, поскольку впервые в рамках одной работы представлены новые аспекты получения, оценки эффективности использования липосомальных форм экстенциллина и натриевой соли бензилпени-циллина для лечения экспериментального сифилиса. Полученные результаты существенно дополнили имеющиеся сведения о закономерностях паразитирования Treponema pallidum в организме под влиянием антибактериальных препаратов, в частности липосомальных форм антибиотиков

Использование липосомальных форм антибиотиков позволило предложить новую схему лечения, что повысило эффективность проводимой терапии экспериментального первичного и вторичного сифилиса.

Теоретические положения и практически значимые результаты диссертационной работы включены в цикл лекций и практических занятий для студентов на кафедре дерматовенерологии и косметологии Ставропольской государственной медицинской академии

Материалы диссертации легли в основу методических рекомендаций «Получение липосомальных форм антибиотиков для лечения экспериментального сифилиса» и «Разработка схем лечения экспери-

ментального сифилиса липосомальными формами антибиотиков», одобренных Ученым советом и утвержденных ректором Ставропольской государственной медицинской академии (протокол заседаний Ученого совета СГМА № 6 от 22 февраля 2006 года).

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Получены высокоэффективные, стабилизированные липосо-мальные антибиотики, оказывающие выраженное лечебное действие, заключающееся в снижении степени патогенности микроорганизма при его паразитировании в организме лабораторных животных

2. Под влиянием новых липосомальных форм антибиотиков на паразитарную систему макроорганизм-трепонема, применяемых в рекомендуемых схемах, существенно ускоряется полное исчезновение и нивелирование клинических проявлений инфекционного процесса, а также снижается интенсивность повреждений в органах и тканях

3 Оценка специфических серологических реакций заражённых сифилисом животных свидетельствует о высокой эффективности липосомальных форм антибиотиков в качестве лечебных препаратов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на научно-практической конференции дерматовенерологов, посвященной 50-летию Краевого кожно-венерологического диспансера (Ставрополь, 2001), конференциях молодых учёных СГМА (Ставрополь, 2002, 2003), Всероссийском съезде дермато-венерологов (Москва, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы Она изложена на 110 страницах компьютерного текста, содержит 9 таблиц, 13 рисунков Список литературы включает 147 отечественных и 34 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

В работе использовали 80 кроликов самцов породы «Шиншилла», весом приблизительно 3 кг, которых получали из питомника Ставропольского государственного аграрного университета. После ка-рантинизации их использовали в опытах.

Животных заражали патогенными трепонемами штамма Ни-кольса, полученного из бактериологической лаборатории Ставропольского краевого клинического кожно-венерологического диспансера В качестве тест-микроба при определении специфической активности антибиотиков использовали штамм Escherichia coli АЕСС 25922, полученный из коллекционного центра Ставропольского научно-исследовательского противочумного института

Для определения липидного состава липосом в качестве метчиков для тонкослойной хроматографии в опыт брали фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозид, сфин-гомиелин, цереброзид, холестерин («Sigma», США).

Тонкослойную хроматографию липидов осуществляли в специальной камере с растворителем (хлороформ метанол вода в соотношении 65 25 4) на пластинке с силуфолом («Kavalier», Чехия) (Кейтс М., 1975), на которую наносили отдельные фосфолипиды или их смесь.

В работе использовали следующие антибиотики- бензилпени-циллина натриевая соль кристаллическая во флаконах для внутримышечного введения по 500 ООО ЕД (регистрационный номер 64/228/41 -Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез», г Курган, Россия) Зарубежный дюрантный антибиотик бензатин-бензилпенициллин (экстенциллин) во флаконах для внутримышечного введения по 2,4 млн. ЕД (регистрационный номер 003833 от 07.04 1994 - Aventis/ Rhone-Poulenc Rorer, Германия)

Приборы, испаритель ротационный ИР-1 М2 (Россия); спектрофотометр БИАН-120 (Россия), ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т (Россия), электронные весы «Sartonus» (США), электронный микроскоп JEM - 100SX «JEOL» (Tokyo, Japan), световой микроскоп бинокулярный БИОЛАМ-Л-211 (Россия), ультрацентрифуга «Becman L5-75» (США), центрифуга К-24Д (Россия), холодильник низкотемпературный «ARDO» (Италия), фотоколориметр КФК-3 (Россия); анализатор «ЭКСАН-Г» (Россия); микротом МС-1 (Россия); магнитная ме-

шалка ММ-1 (Россия), лиофильная сушка LZ-9c (Чехословакия).

Сифилитическую инфекцию моделировали у кроликов путём введения взвеси патогенных бледных трепонем в мошонку и во внутреннюю сторону бедра подкожно в дозе 5000 м к. Каждая исследуемая группа включала по 10 животных. В качестве контрольных групп служили инфицированные животные - контроль заражения; инфицированные животные, получавшие пустые липосомы - контроль липосом; инфицированные животные, получавшие свободную форму антибиотиков - контроль антибиотика. Наличие антител к бледным трепо-немам исследовали в течение всего процесса развития сифилитической инфекции у животных при постановке микрореакции преципитации (MP) и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Бледную трепонему обнаруживали в тканевой жидкости методом микроскопии в темном поле

Фосфолипиды, используемые для получения липосом, получали по методу, описанному в патенте РФ № 2192265 «Способ получения комплекса фосфолипидов» (Ефременко В.И и соавт, 2002)

Для приготовления липосом использовали природные фосфолипиды, экстрагированные и очищенные из головного мозга свиньи (Ефременко В.И., Таран Т.В., 2002) методами этанольной инжекции (Kremer J.M. et al., 1977), ручного встряхивания (McCown J.T. et al, 1981), озвучивания мультиламеллярных везикул (Hauser Н.О et al, 1973), «выпаривания в обращенной фазе» (Szoka F et al., 1978, 1980, Cafiso D.S. et al., 1981), «замораживания-оттаивания» (Pick U, 1981)

Расчёт удельного внутреннего объёма липосом проводили, используя глюкозу в качестве включаемого материала После разрушения липосом 1% раствором додецилсульфата натрия определяли количество «захваченной» глюкозы на анализаторе «ЭКСАН-Г» (Россия) глюкозооксидазным методом (Прохорова М.И, 1982) Определение количества фиксированного в липосомы антибиотика осуществляли методом серийных разведений путем выявления количественной специфической биологической активности при диффузии антибиотика в агар после разрушения липосом 1% раствором додецилсульфата натрия.

Электронно-микроскопический контроль образования, размеров и структуры осуществляли при исследовании нативных липосом.

Лечение животных проводили антибиотиками в дозах в соответствии с «Методическими указаниями по лечению и профилактике сифилиса» (Москва, 1999) После появления шанкров кролики полу-

чали лечение Свободный бензилпенициллин вводили внутримышечно четыре раза в день в суммарной дозе 150 тыс ЕД Продолжительность курса составила 10 дней Другая группа животных получала аналогичное лечение после 3 месяцев от заражения с момента наступления появлений вторичного периода сифилиса Продолжительность курса составила 20 дней. Свободный экстенциллин вводили кроликам также внутримышечно по 150 тыс ЕД - 2 инъекции с интервалом 7 дней при первичном сифилисе и 3 инъекции с интервалом 7 дней при вторичном сифилисе Каждая из 8 исследуемых групп животных содержала 10 кроликов. Об эффективности лечения судили по регрессу клинических проявлений сифилитической инфекции у животных, негативации серологических реакций, данным патоморфологических изменений в органах

У всех животных, получавших антибиотики, учитывали динамику патологического процесса путем наблюдения и оценки патоморфологических особенностей.

Гистоморфологическому исследованию подвергались печень, селезенка, почки экспериментальных животных, подвергшихся лечению липосомальными и свободными формами антибиотиков

Методы статистической обработки материала.

Группировку первичных данных, вычисление средних величин, достоверности различий полученных результатов проводили на компьютере Pentium-IV 1800, используя компьютерную обработку программой Excel 11.0 по методам биометрии (Лакин Г Ф., 1990)

Обработку полученных результатов серологического анализа осуществляли с определением средних геометрических титров и ошибки в их определении (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий НН., 1996). Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики по И.А.Ойвину (1960) с определением средних величин (М) и их ошибки (т), достоверности различий по критерию t Стьюдента при уровне статистической значимости различий 95% (Р<0,05)

Результаты и их обсуждение.

Для получения липосом в качестве источника фосфолипидов использовали головной мозг свиньи Исследование состава полученного комплекса фосфолипидов показало наличие фосфатидилхолина (8,2%), фосфатидилэтаноламина (16,5%), фосфатидилсерина (6,2%), фосфатидилинозида (6,3%), сфингомиелина (8,5%), цереброзида (16,5%) и холестерина (16,5%).

Из фосфолипидов и холестерина головного мозга свиньи, куда для стабилизации мембран липидных везикул добавляли а-токоферол методом «обращения фаз», получены липосомы размером 100-850 нм и внутренним объёмом 9 л/моль липида. Последующую иммобилизацию натриевой соли бензилпенициллина или экстенциллина во внутренний объём липосом осуществляли методом «замораживания-оттаивания», обеспечившим фиксацию 72-86% антибиотиков. Указанные методы получения липосом из всех изученных животных обеспечивали формирование липидных везикул с максимальным внутренним объемом

В дальнейшем количество антибиотиков, вводимых экспериментальным животным, рассчитывали, исходя из концентрации препаратов, включённых в липосомы

Полученные препараты, представляющие собой опалесцирую-щую жидкость, хранили в ампулах, в атмосфере азота, при температуре плюс 4°С При таком режиме хранения препараты сохраняли свою структуру липидных везикул и антибактериальную активность в течение одного года (срок наблюдения). Однако при этом количество иммобилизованного в липосомы антибиотика незначительно снижалось на 7,б±0,3% (для бензатин-бензилпенициллина) и 9,3±0,4% (для бензилпенициллина натриевой соли)

Для стабилизации в процессе хранения и сохранения бактерицидных свойств липосомальных антибиотиков их подвергали лиофи-лизации В качестве криопротектора применяли раствор с окончательной концентрацией сахарозы 10% и желатина - 2%, который добавляли к взвеси липосомального антибиотика в 30% объеме.

Замораживание материала проводили при минус 40°С. Было сокращено время удаления не только свободной, но и связанной воды до 14 ч за счет интенсивного плавного подвода тепла до 45°С и низкой температуры десублиматора - минус 70°С, что исключало оттаивание и вспенивание материала (рис. 1)

Определение количества инкапсулированных антибиотиков, стабилизированных с применением лиофильного высушивания, показало, что использованные параметры сушки не отразились на биологических свойствах липосомального антибиотика В лиофилизирован-ном виде липосомальные антибиотики сохраняли все свои свойства при хранении в атмосфере азота при плюс 4°С в течение одного года (срок наблюдения).

Рис 1 Режим лиофильного высушивания липосомальных

препаратов бензатин-бензилпенициллина и натриевой соли бензилпенициллина.

С целью изучения влияния полученных новых липосомальных форм антибиотиков на патогенные свойства Treponema pallidum экспериментальным путем были подобраны схемы и терапевтические дозы их применения При первичном экспериментальном сифилисе лечение животных липосомальным бензилпенициллином проводили внутримышечно четыре раза в день в суммарной дозе 75 тыс. ЕД. Продолжительность курса составила 10 дней При вторичном экспериментальном сифилисе использовали аналогичную схему. Продолжительность курса составила 20 дней.

Липосомальный экстенциллин вводили кроликам также внутримышечно по 75 тыс. ЕД - 2 инъекции с интервалом 7 дней при первичном сифилисе и 3 инъекции с интервалом 7 дней при вторичном сифилисе.

У всех животных до лечения наблюдали развитие инфекционного процесса. Инкубационный период составил в среднем 2 недели. Затем на месте введения материала появлялось небольшое уплотнение, которое постепенно увеличивалось с одновременным увеличением плотности, принимающей хрящевую консистенцию Воспали-

11

тельная реакция вокруг шанкров у кроликов отсутствовала Через некоторое время после появления уплотнения в центре образовывался некроз, и шанкр покрывался сначала маленькой тонкой кровянистой корочкой, которая постепенно становилась очень толстой и окружалась плотным инфильтратом

Патологически измененные ткани при сифилитических орхитах у кроликов отличались плотностью и последующим изъязвлением На поверхности шанкров обнаруживали большое количество бледных трепонем Вместе с появлением шанкров у кроликов начинали прощупываться плотные регионарные лимфоузлы, увеличенные до размеров горошины или небольшой фасоли

Через 3 месяца после заражения патогенными трепонемами развивался вторичный инфекционный процесс Чаще всего это были яркие мелкие множественные папулезные высыпания, локализующиеся на половых органах (кожа мошонки) У некоторых кроликов высыпания папулёзного характера были сосредоточены у корня ушей и на лапах У одного кролика мы наблюдали паренхиматозный кератит Генерализацию сифилитического процесса также подтверждало значительное количество животных (70%) с очаговыми выпадениями шерсти на морде. В 30% случаев наблюдали полиаденит

Динамика клинических проявлений при лечении экспериментального первичного сифилиса свободным и липосомальным экстен-циллином указана в таблице 1

В группе животных, получавших лечение липосомальной формой экстенциллина, уже через 15 дней после начала лечения наступало бесследное заживление эрозий В то время у животных, которым вводили свободную форму экстенциллина, сохранялся в эти сроки рубец с округлыми формами. Через 30 дней эпителизация эрозий в этой группе приводила к сохранению пигментации на месте проявлений

На 60 сутки после введения липосомального экстенциллина количество животных с полной негативацией реакции микропреципитации увеличилось до 90%, и только у одного кролика титр МР оставался положительным и составлял 1 2. Следует отметить, что курсовая доза антибиотика, включенного в липосомы, была в два раза ниже, чем при использовании свободного экстенциллина.

Промежуточное значение по рассматриваемым показателям эффективности лечения составляла группа животных, которым вводили внутримышечно свободный экстенциллин в курсовой дозе 0,3 млн. БД и одновременно внутримышечно пустые липосомальные везикулы. В

этом случае через 60 суток проведенной терапии 80% кроликов были серонегативны, а у двух животных титр реакции микропреципитации составлял 1 2

В группе кроликов, получавших только пустые липосомы, не-гативации серореакций не произошло, но титры МР снизились у всех экспериментальных животных, хотя снижение не было статистически достоверным (Р>0,05). В контрольной группе у всех животных, зараженных сифилисом, на протяжении эксперимента титры серологических реакций не снижались (Р>0,05)

Таблица 1

Динамика клинических проявлений при лечении первичного сифилиса экспериментальных животных свободным

и липосомальным экстенциллином

Форма экстенциллина Курсовая доза, млн ЕД Клинические проявления

Через 30 дней после заражения Через 15 дней после начала лечения Через 30 дней после начала лечения

Свободная 0,3 Уплотнение в месте введения, некроз, появление эрозивного твердого шанкра Увеличение регионарных лимфатических узлов Рубец округлой формы с чёткими границами Пигментация

Липосомальная 0,15 Бесследное заживление Отсутствие проявлений

Свободная + пустые липосомы 0,3 Временная пигментация Отсутствие проявлений

Пустые липосомы - Начинающаяся эпителизация эрозии Пигментация

Контроль заражения - Сохранение инфильтрата Рубец округлой формы с четкими границами

Динамика патологического процесса при лечении экспериментального вторичного сифилиса свободным и липосомальным экстенциллином указана в таблице 2

Через 30 дней после начала лечения полный регресс высыпаний произошёл в группах животных, которым вводили липосомальный экстенциллин и свободный экстенциллин совместно с пустыми липо-сомами. > .

Таблица 2

Динамика клинических проявлений при лечении вторичного сифилиса экспериментальных животных свободным и липосомальным экстенциллином

Форма экстенциллина Курсовая доза, млн ЕД Клинические проявления

Через 90 дней после заражения Через 30 дней после начала лечения Через 60 дне{ после начала лечения

Свободная 0,45 Папулезные высыпания половых органов, лап и корня ушей Остаточная пигментация Отсутствие проявлений

Липосомальная 0,225 Бесследное заживление Отсутствие проявлений

Свободная + пустые липосомы 0,45 Бесследное заживление Отсутствие проявлений

Пустые липосомы - Единичные папулы застойного характера Отсутствие проявлений

Контроль заражения - Единичные папулы застойного характера Отсутствие проявлений

В группе животных, получающих только свободный экстенцил-лин, можно было наблюдать остаточную пигментацию на месте вторичных элементов. Единичные папулы застойного характера наблюдали через 30 дней после начала лечения у кроликов, получавших пустые липосомы и в контрольной группе Через 60 дней после начала лечения отсутствовали какие-либо клинические проявления во всех группах кроликов

При лечении кроликов с экспериментальным вторичным сифилисом свободной формой экстенциллина через 180 дней 40% животных имели отрицательные реакции микропреципитации, а через 360 суток с полной негативацией серологических реакций оказалось 70% взятых в опыт кроликов Титры МР у оставшихся серопозитивными животных снизились достоверно только через 360 суток сероконтроля.

Лечение животных липосомальной формой экстенциллина, взятого в половинной курсовой дозе относительно используемой дозы интактного антибиотика, уже на 180 сутки способствовало полной не-гативации реакции микропреципитации у 60% кроликов соответст-

14

вующей экспериментальной группы и достоверному снижению титра МР у остальных кроликов (Р>0,05) Через 360 суток серонегативными были 90% экспериментальных животных

Терапевтическую эффективность широко применяемого для лечения сифилитической инфекции зарубежного дюрантного препарата - экстенциллина мы сравнивали с эффективностью отечественного бензилпенициллина натриевой соли.

Динамика изменений клинической картины при лечении экспериментального первичного сифилиса свободной и липосомальной солью бензилпенициллина указана в таблице 3

Таблица 3

Динамика клинических проявлений при лечении первичного

сифилиса экспериментальных животных свободной и липосомальной формой натриевой соли бензилпенициллина

Форма натриевой соли бензилпенициллина Курсовая доза, млн. ЕД Клинические проявления

Через 30 дней после заражения Через 15 дней после начала лечения Через 30 дней после начала лечения

Свободная 1,5 Уплотнение в месте введения, некроз, появление эрозивного твёрдого шанкра Увеличение регионарных лимфатических узлов Рубец округлой формы с чёткими границами Отсутствие проявлений

Липосомальная 0,75 Бесследное заживление Отсутствие проявлений

Свободная + пустые липосомы 1,5 Временная пигментация Отсутствие проявлений

Пустые липосомы - Начинающая эпителизация эрозии Пигментация

Контроль заражения - Сохранение инфильтрата Рубец округлой формы с чёткими границами

В группе животных, получавших лечение липосомальной формой бензилпенициллина, уже через 15 дней после начала лечения наступало бесследное заживление эрозий В то же время у животных, которым вводили свободную форму бензилпенициллина, сохранялся в эти сроки рубец с округлыми формами. В этой группе полное исчезно-

вение признаков патологических процессов наступило только через 30 дней после окончания лечения

На 60-й день после начала лечения свободной натриевой солью бензилпенициллина животных с полной негативацией реакции микропреципитации оказалось 70% от общего числа взятых в опыт

Количество серонегативных кроликов, получавших липосомаль-ный бензилпенициллин, уже на 30 сутки лечения составило 80%, а через 60 дней после лечения у 100% животных отмечена полная нега-тивация МР. При этом курсовая доза антибиотика была в два раза ниже, чем при использовании свободного бензилпенициллина В группе животных, которым вводили внутримышечно свободный бензилпенициллин в курсовой дозе 1,5 млн ЕД и пустые липосомы, на 30 сутки 60%, а на 60 сутки 80% от общего числа кроликов были серо-негативны.

В последующем в эксперименте было изучено терапевтическое действие липосомальной формы натриевой соли бензилпенициллина при лечении вторичного сифилиса. Изучение влияния липосомальных форм антибиотиков на генерализованный процесс, возникающий при развитии вторичных проявлений сифилиса у животных, представлено в таблице 4.

Через месяц после начала лечения полный регресс высыпаний произошёл во всех группах животных, которым вводили натриевую соль бензилпенициллина. Единичные папулы застойного характера наблюдали через 30 дней после начала лечения у кроликов, получавших пустые липосомы, и в контрольной группе Через 60 дней после начала лечения также отсутствовали какие-либо клинические проявления во всех группах кроликов.

Применение липосомальной формы бензилпенициллина привело к полной негативации МР через 360 дней после начала лечения у всех испытуемых животных, в то время как при использовании ин-тактного антибиотика в дозе, вдвое превышающей дозу липосомаль-ного препарата, серонегативными через 360 суток были 80% кроликов. У животных, получавших внутримышечно свободный бензилпенициллин и пустые липосомальные везикулы, через 180 дней после начала лечения количество животных с полной негативацией сероре-акций составило 70%, а через 360 суток - 90% от общего количества в группе.

Таблица 4

Динамика клинических проявлений при лечении вторичного

сифилиса экспериментальных животных свободной и липосомальной формой натриевой соли беизилпенициллина

Форма натриевой соли бензшшенициллина Курсовая доза, млн ЕД Клинические проявления

Через 90 дней после заражения Через 30 дней после начала лечения Через 60 дней после начала лечения

Свободная 3,0 Папулезные высыпания половых органов, лап и корня ушей Регресс высыпаний Отсутствие проявлений

Липосомальная 1,5 Регресс высыпаний Отсутствие проявлений

Свободная + пустые липосомы 3,0 Регресс высыпаний Отсутствие проявлений

Пустые липосомы - Единичные папулы застойного характера Отсутствие проявлений

Контроль заражения - Единичные папулы застойного характера Отсутствие проявлений

Итак, использование в лечении первичного и вторичного сифилиса экспериментальных животных липосомальных форм экстенцил-лина и натриевой соли беизилпенициллина способствовало повышению эффективности проводимой антибиотикотерапии, о чем свидетельствовали полученные результаты серологического исследования биологической модели, а также динамика клинической картины заболевания (табл 1-4)

Применение липосомальных форм антибиотиков позволило в два раза снизить курсовую дозу препаратов При этом липосомальная форма натриевой соли беизилпенициллина по результатам серологических реакций и клиническим показателям оказалась более эффективной при лечении как первичного, так и вторичного сифилиса. Полученные результаты, вероятно, связаны с внутриклеточным проникновением липосомальных препаратов и предотвращением изменчивости бледных трепонем в атипичные цист- и Ь-формы, обусловливающие серорезистентность, скрытые, поздние и осложнённые формы заболевания

При введении липосомальных форм антибиотиков негативация МР проходила в два раза быстрее, чем при использовании свободной формы антибиотиков, а количество животных с полной негативацией реакции микропреципитации достигало 100% при применении натриевой соли бензилпенициллина через 60 дней после начала лечения экспериментального первичного сифилиса и через 360 дней после начала лечения экспериментального вторичного сифилиса Даже удвоенная курсовая доза свободных антибиотиков не обеспечивала аналогичных результатов лечения Анализ серологических показателей и клинических проявлений кроликов при сочетанном введении им свободных антибиотиков с интактными липосомами также свидетельствовал о существенном повышении терапевтического эффекта.

Таким образом, в эксперименте доказана высокая биологическая эффективность липосомальных форм экстенциллина и натриевой соли бензилпенициллина по сравнению с их свободными формами. В результате проведённых исследований нами разработаны рациональные схемы этиотропного лечения сифилитической инфекции, позволяющие снизить курсовые дозы препаратов и повысить эффективность терапии.

Данные литературы о патоморфологических изменениях в органах и тканях при введении экспериментальным животным липосомальных форм антибиотиков (Крейнес В М с соавт, 1990, Невзорова В.А. с соавт , 1998; Севастьянов В И , 1999, Мартынова О.М с соавт , 2000; Тюрина О.П. с соавт, 2001, Таран Т В , 2004) не включают антибиотики, используемые для лечения сифилитической инфекции. В связи с этим была проведена оценка патоморфологических изменений в макроорганизме в ответ на введение антибиотиков в свободной и липосомальной формах в сравнительном аспекте при экспериментальном сифилисе

При использовании липосомальных антибиотиков патоморфо-логические изменения носили менее выраженный характер. Причем у животных, получавших лечение бензатин-бензилпенициллином, изменения были более деструктивные, чем у животных, получавших бензилпенициллина натриевую соль.

Изучение патоморфологических изменений в печени, селезенке и почках кроликов с первичным и вторичным сифилисом, получавших лечение свободными и липосомальными формами антибиотиков, показало, что под влиянием липосомальных антибиотиков, по сравнению с интактными, значительно меньше выражены процессы повреж-

дения во всех исследуемых органах.

Таким образом, нами показана возможность использования ли-посомальных форм антибиотиков для лечения экспериментальной сифилитической инфекции Полученные результаты подтверждают многочисленные литературные данные о глубоком проникновении липосомальных препаратов в ткани, в клетки. Внутриклеточная ДОСтавка антибиотика, вероятно, предотвращает изменчивость бледных трепонем в атипичные цист- и Ь-формы, обусловливающих сероре-зистентность, скрытые, поздние и осложнённые формы заболевания

В эксперименте доказана высокая биологическая эффективность полученных липосомальных форм антибиотиков по сравнению с их свободными формами.

В целом, полученные результаты отражают особенности влияния новых липосомальных форм антибиотиков, выражающиеся в снижении повреждающего действия на ткани возбудителя сифилиса при его паразитировании в организме экспериментальных животных, что открывает широкие возможности для последующих клинических исследований.

ВЫВОДЫ

1 Получены высокоэффективные, стабилизированные липосо-мальные антибиотики, оказывающие выраженное влияние на паразитарную систему (макроорганизм - трепонема), заключающееся в снижении степени отрицательного побочного действия на ткани при усилении антибактериального эффекта классических антимикробных препаратов, используемых для заключения в липосомы.

2. Полное исчезновение клинических проявлений первичного инфекционного процесса, вызываемого возбудителем сифилиса у экспериментальных животных под влиянием липосомальных форм антибиотиков (натриевой соли бензилпенициллина или экстенциллина), происходит в два раза быстрее (на 15 дней), чем при использовании свободных форм тех же антибиотиков по аналогичным схемам, но в двойных дозах по сравнению с липосомальными препаратами.

3 Применение липосомальных форм антибиотиков при вторичном сифилисе на фоне выраженных клинических проявлений приводит к их полному исчезновению уже к 30 дню лечения, в то время как при использовании свободной натриевой соли бензилпенициллина и экстенциллина срок, необходимый для полного исчезновения основных клинических признаков инфекционного процесса, удлиняется до

60 суток, а к 30 суткам отмечено лишь их нивелирование

4. Наиболее эффективным для лечения первичного и вторичного экспериментального сифилиса оказался липосомальный препарат натриевой соли бензилпенициллина, обеспечивающий не только скорейшую регрессию всех клинических проявлений, но и полную нега-тивацию специфических серологических реакций на сифилис, регистрируемых в реакциях микропреципитации Интактные антибиотики и липосомальный экстенциллин достигали такого эффекта лишь в 60-70 и 90% случаев соответственно.

5. При использовании липосомальных форм антибиотиков, особенно липосомальной формы натриевой соли бензилпенициллина, по сравнению с интактными лекарственными препаратами, вводимыми животным по схемам, рекомендуемым для лечения экспериментального сифилиса, отмечены менее выраженные патоморфологичес-кие изменения, свидетельствующие о повреждении ткани печени, селезёнки и почек.

6. Установленный комплекс клинических, морфологических и иммунологических изменений, отражающий особенности взаимоотношений макроорганизма и возбудителя сифилиса при его паразити-ровании в организме экспериментальных животных, свидетельствует о выраженном снижении под влиянием липосомальных антибиотиков повреждающего действия, обусловленного патогенными свойствами Treponema pallidum

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Базиков, И.А. Иммобилизация в липосомы натриевой соли бензилпенициллина для лечения сифилиса в эксперименте / И А Базиков, A.B. Одинец, Т.В. Таран // Актуальные вопросы венерологии и дерматологии: Сб. научн. работ. - Ставрополь, 2003. - С 93-94.

2. Одинец, А.В Изучение терапевтической эффективности липосомальных форм антибиотиков при экспериментальном сифилисе / А.В Одинец, И.А. Базиков // Вопросы дерматологии, косметологии, клинической микологии и Щ11111. Сб научн. работ. - М, 2005. - С 106-107.

3. Одинец, AB Анализ результатов введения липосомальных форм антибиотиков кроликам при экспериментальном сифилисе / А В. Одинец // X Всерос. конференция дерматовенерологов: Тез. науч. работ.-М., 2006.-С. 62.

4. Одинец, А.В Способ конструирования липосомальных препаратов для лечения сифилиса / А.В Одинец // X Всерос конференция дерматовенерологов. Тез науч. работ. - М., 2006. - С. 72.

5. Одинец, A.B. Патоморфологические изменения в органах экспериментальных животных при лечении сифилиса / A.B. Одинец, И.А. Базиков, В И Ефременко. - М, 2006. - 4 с. - Деп. в ГЦНМБ 20.08 06.-№Д-27790. . ,

6. Одинец, A.B. Разработка схем лечения экспериментального сифилиса / А В. Одинец, И А Базиков, В.И Ефременко - М., 2006. -4 с. - Дел. в ГЦНМБ 20 08.06 - № Д-27791.

7. Одинец, А В Биотехнология получения липосомальных форм антибиотиков / А.В Одинец - М, 2006. - 4 с. - Деп в ГЦНМБ 20 08 06. - № Д-27792

8. Базиков, И А. Получение липосомальных форм антибиотиков для лечения сифилиса- Учебно-методические рекомендации / И.А. Базиков, В.И. Ефременко, В В Чеботарев, А В. Одинец. - Ставрополь: Изд-во СГМА, 2006. - 8 с.

9. Базиков, И А Разработка схем лечения экспериментального сифилиса липосомальными формами антибиотиков: Учебно-методические рекомендации / И.А. Базиков, В.И. Ефременко, В В.Чеботарев, A.B. Одинец - Ставрополь. Изд-во СГМА, 2006. - 8 с.

10. Исмаилова, Г.К. Эффективность применения липосомальных форм антибиотиков при лечении некоторых инфекционных заболеваний в эксперименте / Г К. Исмаилова, Е Б. Жилченко, Д.В Ефременко, Т В. Головченко, О В Малецкая, A.B. Одинец // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2007 -№ 1.-С. 64-67.

11. Одинец, A.B. Получение и использование липосомальных антибиотиков для лечения экспериментального сифилиса / A.B. Одинец // Альманах клинической медицины. Сб научн. работ. - М, 2007.-С. 78-80.

ОДИНЕЦ Алексей Васильевич

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЛР № 020326 от 20 января 1997 г.

Сдано в набор 16 01 08 Подписано в печать 16 01 08 Формат 60x84 '/16 Бумага типогр №2 Печать офсетная Гарнитура офсетная Уел печ 1,2. Уч-изд л 1Л Заказ 1946 Тираж 100 экз

Ставропольская государственная медицинская академия, 355017, г. Ставрополь, ул. Мира, 310.