Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса

Гражданцева, Антонина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса"

На правах рукописи

РГ6 од

Гоажданцева Антонина Анатольевна

РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИГЕНЫ В РАЗВИТИИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

03.00.23. —биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2000 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научные руководители:

доктор биологических наук, чл-кор. РАМН Зверев В.В кандидат химических наук Серпинский О.И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Локтев В.Б. кандидат биологических наук Пыринова Г.Б.

Ведущая организация:

Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Минздрава РФ, Москва

Защита диссертации состоится « » 2000 г.

в 9—часов на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 в ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 630559 Кольцово Новосибирской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « » ¿С^^С^к2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Шубина

Р5~9( - а 5, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В России отмечается устойчивая тенденция роста заболеваемости сифилисом — с 4,3 в 1989 году до 277,3 в 1997 году (заболеваемость на 100 тыс. населения), которая сохраняется на высоком уровне и в настоящее время. В сложившейся ситуации большое значение имеет совершенствование существующих методов лабораторной диагностики, т.к. она играет определяющую роль при выявлении сифилиса. Ни один из стандартных серологических тестов, применяемых в медицинских учреждениях нашей страны, не является идеальным диагностическим методом. Одни из них сложны при постановке и являются дорогостоящими, другие достаточно часто дают лож-ноположительные результаты.

Одним из перспективных методов серологической диагностики является иммуноферментный анализ (ИФА). Учитывая недостатки, связанные с применением в ИФА антигена из непатогенных и «культуральных» трепонем и антигена из патогенной трепонемы — Treponema pallidum, возникает вопрос о разработке новых методов получения антигена. Таким методом является получение рекомбинантных белков Treponema pallidum, синтезируемых в экспрессирующей системе E.coli. Изучение возможности использования рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для выявления антител к возбудителю сифилиса позволит повысить существующий уровень диагностики заболевания.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является получение и сравнительное исследование природных и рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для иммунофер-

ментной диагностики сифилиса; изучение спектра антител к антигенам 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 kDa Tr.pallidum на разных стадиях заболевания методом ИФА с помощью рекомбинантных белков.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

— культивирование бледной спирохеты Treponema pallidum на кроликах;

- получение природного антигена Treponema pallidum для ИФА;

- литературно-теоретический анализ с целью выбора наиболее антигеннозначимых белков, видоспецифичных для Treponema pallidum;

- выделение ДНК Treponema pallidum;

- получение методом ПЦР генов рекомбинантных белков;

- определение структуры генов;

— клонирование генов в экспрессирующий вектор;

— наработка рекомбинантных белков в E.coli и их выделение;

— изучение возможности использования рекомбинантных белков в качестве антигена в ИФА;

- получение экспериментальных партий тест-систем;

— исследование сывороток больных сифилисом с помощью опытных партий тест-систем.

— анализ результатов использования отдельных рекомбинантных белков и их комбинации при выявлении антител при различных стадиях инфекции.

Научная новизна работы.

Выбрана комбинация белков Treponema pallidum для использования в качестве антигена в твердофазном ИФА. 4

Сконструированы четыре бактериальных штамма-продуцента, экспрессирующие белки Treponema pallidum: 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa.

С использованием как отдельных, так и суммарных реком-бинантных белков проведено исследование сывороток больных сифилисом на разных стадиях заболевания.

Показано преимущество использования набора рекомбинант-ных белков по сравнению с использованием отдельных рекомби-нантных белков в качестве антигена для лабораторной диагностики заболевания.

Практическая ценность работы.

Получен набор рекомбинантных белков Treponema pallidum.

Показана возможность их использования в качестве антигена в ИФА как в комплексе, так и раздельно.

На основе рекомбинантных белков выпускаются диагностические наборы для определения антител к бледной спирохете (ТОО «Биосервис», г. Москва).

Получен патент на изобретение «Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum» (RU 2103362).

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998).

По материалам работы опубликовано 3 печатные работы.

Получен патент на изобретение (RU 2103362).

Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков Treponema pallidum используются для получения антигена при выпуске иммуноферментных тесг-систем.

Структура и объем работы.

Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 106 страницах печатного текста, включая 12 рисунков, 7 таблиц, 120 библиографических ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДНОГО АНТИГЕНА TREPONEMA PALLIDUM

В настоящее время в России иммуноферментный анализ для диагностики сифилиса применяется с использованием в качестве антигена «культуральных» трепонем; он позволяет определить наличие в сыворотке крови группоспецифических антител к трепонемам. Для выявления видоспецифических антител необходимо использование антигена из бледной спирохеты — возбудителя сифилиса. Одной из задач настоящей работы является получение антигена из патогенной Treponema pallidum для использования в ИФА.

1.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ TREPONEMA PALLIDUM

Из данных литературы известно, что Treponema pallidum при культивировании в питательных средах и на культурах клеток сохраняется без изменений только в течение нескольких генераций. При перевивании же кроликам интратестикулярно патогенные свойства трепонем не теряются.

С целью получения активного концентрированного антигена Treponema pallidum необходимо было определить оптимальные параметры культивирования микроорганизма, так как рекомендации литературных источников о величине заражающей дозы и сроке извлечения тестикул с целью получения максимального количества трепонем весьма различны у разных авторов. Для определения оптимальной инфицирующей дозы трепонем группы животных были инфицированы Treponema pallidum, шт. Nichols

интратестикулярно следующими концентрациями трепонем: (4±1)хЮ5, (4±1)хЮв, (4±1)хЮ7 и (4±1)х108 трепонем/мл. Концентрацию возбудителей определяли темнопольной микроскопией.

Было замечено, что для получения активного концентрированного АГ наиболее оптимальной является доза заражения кроликов (4±1)х107 трепонем/мл, а тестикулы необходимо извлекать на вторые сутки после появления первых признаков орхита. 1.2. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА TREPONEMA PALLIDUM

Для получения антигена из бледных трепонем использовали метод ультразвуковой дезинтеграции.

Асептически извлеченные на 2 сутки после появления признаков орхита из инфицированных кроликов тестикулы, освобождали от оболочек и измельчали. Трепонемы экстрагировали на шейкере фосфатно-солевым раствором с рН 7,4±0,1. Повторно меняли фосфатно-солевой раствор до тех пор, пока в темном поле обнаруживалось не менее 20 трепонем в поле зрения. Тре-понемный экстракт центрифугировали в низкоскоростном режиме при 500 g в течение 10 мин для осаждения крупных тканевых неспецифических агрегатов. Содержащий трепонемы супернатант центрифугировали при 12.000 g в течение 20 мин для осаждения микроорганизмов, осадок трижды отмывали и ресуспендировали в ФСБ, рН 7,4±0,1 до концентрации (1-5)х10э трепонем/мл. Часть полученной суспензии трепонем была использована в качестве цельноклеточного антигена (АГ1) в непрямом ИФА с различными разведениями пула положительных и отрицательных на сифилис сывороток (Рис.1), другая часть была подвергнута

ультразвуковой дезинтеграции пятикратно по 10 сек. через 8

оп4М -в-К+1:100 2,5 т К+1:200

К+1:400

2,0 -

1,5 -

1,0 -

0,5 -

0,0 ^-1—

О 0,5

2,5

АГ, мкг/мп

Рис.1. Показатель ОП492 в зависимости от дозы сорбируемого антигена Tr. pallidum (АГ1) при различных разведениях сыворотки.

*К+ 1:50 - разведение пула положительных на сифилис сывороток **К -1:50 - разведение пула отрицательных на сифилис сывороток

1 мин во льду с последующим центрифугированием при 12.000 об/мин в течение 40 сек для удаления крупных фрагментов. В результате был получен АГ2, который также использовали в непрямом ИФА (Рис.2.).

1.3. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕНА TREPONEMA PALLIDUM В WESTERN-BLOT

Иммунореактивность АГ2 исследовали в Western-blot анализе с сыворотками больных сифилисом людей. На Рис. 3. показан спектр антигенов Tr. pallidum, шт. Nichols (АГ2) и Treponema phagedenis, subsp. Reiter, узнаваемых антителами сывороток людей, больных сифилисом. Было показано, что полученный нами антигенный препарат АГ2 связывается в иммуноблоте с сыворотками, содержащими антитела к патогенной Tr. pallidum, и

0П492

3,0 т

—К+1:50

—«— К+1:100

2,5 --

К+1:200 - Ю 1:400

-*-К+1:800

2,0 --

-•—К-1:50**

К-1:100

1,0 --

1,5 --

-К-1:200

-К-1:400

К-1:800

0,5 --

0,0 *-1-1-+

АГ, мкг/мл

0 0,5 1 2,5 5 10 20 25 Рис.2. Показатель ОП492 в зависимости от дозы сорбируемого антигена Тг. pallidum (АГ2) при различных разведениях сыворотки.

*К+ 1:50 - разведения пула положительных на сифилис сывроток **К -1:50 - разведения пула отрицательных на сифилис сывороток

не связывается с пулом сывороток здоровых людей, причем спектр

белков в реакции с Tr.phagedenis отличен от такового в реакции

с Tr. pallidum. Профиль узнаваемых белков полученного нами

препарата АГ2 из Тг. pallidum, шт. Nichols включает в себя

около 15 полипептидов с М.в. 15-69 kDa (69 kDa, 67 kDa,

60-62 kDa, 54 kDa, 47 kDa, 43 kDa, 37 kDa, 36 kDa, 25 kDa,

17 kDa и 15 kDa. Белок 47 kDa многими авторами считается

одним из важнейших белков для диагностики сифилиса. При

взаимодействии с непатогенной Tr. phagedenis положительными

сыворотками больных сифилисом (5 образцов) узнается белок с

М.в. 33 kDa, 2 из 5 сывороток реагируют с 45 kDa белком и две

сыворотки образуют полосу в области 55-56 kDa белка. 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12

pallidum, шт. Nichols) и коммерческого антигена (Treponema phagedenis, biotip Reiter, обработанные ультразвуком) с сыворотками, содержащими антитела к Treponema pallidum.

Слева нанесены маркеры мол. весов белков. Дорожки:

1-6 - антиген из Treponema pallidum, ил-. Nichols; 7-12 - антиген из Treponema phagedenis, biotip Reiter; 1,12- реакция с отрицательной сывороткой.

При применении АГ2 в Western blot с сыворотками больных с первичным, вторичным сифилисом и сыворотками наблюдаемых после лечения лиц мы получили некоторые различия как в спектре антигенов, так и в интенсивности ответа на один и тот же белок в зависимости от стадии заболевания (Рис.4). Было показано, что антиген АГ2 (Tr. pallidum, обработанные ультразвуком) связывается в иммуноблоте с сыворотками больных

сифилисом людей с различными стадиями заболевания, причем

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис.4. Иммуноблотинг белков антигена из Treponema pallidum, шт. Nichols (АГ2) с сыворотками больных первичным и вторичным сифилисом, а также лиц, наблюдаемых 1-2 года после лечения.

Слева нанесены маркеры мол. весов белков. Дорожки:

1-6 - сыворотки больных первичным сифилисом; 7-12 - сыворотки больных вторичным сифилисом; 13-16 - сыворотки наблюдаемых после лечения пациентов; 17 - смесь отрицательных сывороток.

при первичном сифилисе более выражена реакция антител с высокомолекулярными антигенами, при вторичном — как с высокомолекулярными, так и низкомолекулярными белками 17 и 15 kDa, в сыворотках наблюдаемых лиц, в основном, — с низкомолекулярными белками, особенно 17 kDa

1.4. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕНА TREPONEMA PALLIDUM В ИФА

Для определения чувствительности и специфичности АГ1 и АГ2 методом непрямого ИФА исследовано 258 сывороток больных первичным и вторичным сифилисом, подтвержденным или наличием трепонем (темнопольная микроскопия) и/или положительными стандартными серологическими реакциями (реакция микропреципитации, реакция связывания комплемента, реакция иммунофлюоресценции) и 42 сыворотки здоровых людей. Результаты сравнивали с таковыми при использовании коммерческой «Тест-системы иммуноферментной для серодиагностики сифилиса», ФАО «Ферейн», г.Электрогорск, в качестве АГ в которой применяется взвесь непатогенных трепонем, обработанных ультразвуком (Табл. 1). Из 258 обследованных сывороток больных

Таблица 1

Сравнение чувствительности и специфичности экспериментальных и коммерческой тест-систем

Диагностикум Чувствительность Д* Специфичность Д~ ДифА

Абс. % % Абс. % % %

Диагностикум с АГ1 241* 93,4 98,3 38" 90,5 69,1 93,0

Диагностикум с АГ2 248 96,1 99,5 41 97,6 80,3 96,3

Коммерческий диагностикум 247 95,7 99,1 40 95,2 78,4 95,7

*) проанализировано 258 сывороток больных с подтвержденным диагнозом сифилиса;

**) проанализировано 42 отрицательных сыворотки; Д* - индекс достоверности положительных результатов; Д~ - индекс достоверности отрицательных результатов; ДИфА - достоверность результата иммунологического анализа

сифилисом в случае применения ATI антитела IgG регистрировались в 241 сыворотке, что составило 93,4% от всех обследованных положительных сывороток. При использовании АГ2 как положительные были определены 248 образца, что составило 96,1%. Коммерческая тест-система позволила как положительные тестировать 247 сывороток, что составило 95,7%. При тестировании сывороток здоровых доноров из 42 образцов 38 были отрицательными, т.е. 90% с применением АГ1, 41 была отрицательна при использовании АГ2, что составило 97,6%, а в коммерческой тест-системе как отрицательные были определены 40 сывороток, что составило 95,2%. Таким образом, результаты этого исследования позволили сделать заключение, что диагностические системы на основе антигена АГ2 — Treponema pallidum, обработанные ультразвуком, по чувствительности и специфичности не уступали коммерческой тест-системе.

На основе АГ2 было получено 4 серии экспериментальных тест-систем с чувствительностью 95-100% и специфичностью 96-100% по 30 наборов в трех сериях и 100 наборов в четвертой серии (данные отдела биотехнологического контроля ГНЦ ВБ «Вектор»). Тест-системы этих серий были использованы нами впоследствии в качестве стандарта при создании диагностических наборов на основе рекомбинантных белков.

2. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ TREPONEMA PALLIDUM

В связи с тем, что получение природного антигена связано с целым рядом трудностей (сложность культивирования патогенной

трепонемы в культуральных средах и на культурах клеток, связанная с потерей патогенных свойств, высокая вероятность инфицирования персонала, высокая себестоимость при культивировании Treponema pallidum на кроликах), возникла проблема поиска новых методов получения антигена. В качестве альтернативы была выбрана технология рекомбинантных ДНК, позволяющая нарабатывать белки патогенных микроорганизмов в бактериальной клетке E.coli.

Ввиду значительного количества антигеннозначимых белков в Tr. pallidum, необходимо было выбрать перспективные для ИФА антигены, которые отвечают определенным требованиям. Они должны быть, во-первых, видоспецифичны и, во-вторых, антитела к этим антигенам должны выявляться во всех стадиях сифилиса.

2.1. ВЫБОР АНТИГЕНОВ TREPONEMA PALLIDUM

К настоящему времени в той или иной степени изучены многие белки Treponema pallidum, subsp. pallidum.

При исследовании перекрестной реактивности между Tr. pallidum и другими членами семейства Spirochaetaceae была выделена группа антигенов, общих для членов семейства Spirochaetaceae. Это полипептиды с М.в. 80, 69, 48, 41, 37, 35, 33, 30, 28, 22 kDa. Рядом исследователей как видоспецифические для Tr.palidum были охарактеризованы полипептиды с М.в. 190 kDa, 42 kDa, 47 kDa, 39 kDa, 37 kDa, 17 kDa, 15 kDa.

Из анализа литературы и данных по структуре белков (генома) мы предположили, что наиболее перспективными для серологической диагностики сифилиса являются белки с молеку-

лярыыми весами 15 kDa, 17 kDa, 42 kDa (TmpA) и 47 kDa. Во-первых, эти белки являются видоспецифическими, то есть, представлены только в патогенной трепонеме (Tr. pallidum), и отсутствуют в непатогенных видах трепонем. Во-вторых, известны последовательности данных белков, что существенно облегчает работу по конструированию рекомбинантных штаммов-продуцентов. В-третьих, на каждый из этих белков в сыворотках больных сифилисом людей регистрируются антитела, что свидетельствует об их высокой иммуногенности. По данным литературы реком-бинантные аналоги для трех из выбранных нами белков —

15 kDa, 47 kDa и TmpA сохраняют иммунохимические (по результатам иммуноблоттинга) свойства природных антигенов.

2.2. ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ БЕЛКОВ.

Фрагменты ДНК, кодирующие белки 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa микроорганизма Treponema pallidum, штамм Nichols, были получены методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры для ПЦР рассчитывали с использованием банка данных по структуре ДНК и добавляли нуклеотидные последовательности, кодирующие участки узнавания эндонуклеаз рестрикции для удобного клонирования в экспрессирующую векторную ДНК: 5'- ccggatcctagcgCTCATCATGAGACGCACTA (32 о.) 47 kDa 5'- ccgtcgaCTACTGGGCCACTACCTTC (26 о.) 47 kDa 5'- ccggatcCGGGCGCCAAGGAGGAAGC (26 о.) TmpA 5'- ccgtcgACGTGTCTTCATCGAGAGGC (26 о.) TmpA 5'- ccggatccacaaTTGTGTGTCTCGTGCACA (30 о.) 17 kDa 5'- ccgtcgACTATTTCTTTGTTTTTTTGA (27 o.) 17 kDa

5'- ccggatcCATTTAGTTCTATCCCGAATGGCAC (32 о.) 15 kDa 5'- ccgtcgaCTACCTGCTAATAATGGCTTCCTTC (32 о.) 15 kDa Прописные буквы обозначают некомплементарные генам участки ДНК, содержащие участки узнавания рестриктаз SalGI и BamHI.

ПЦР проводили в следующих условиях: 15 kDa — 48 (2 мин), 71 (3 мин), 91 (1мин) 17 kDa — 63 (2 мин), 71 (3 мин), 91 (1мин) ТтрА — 54 (2 мин), 71 (3 мин), 91 (1мин) 47 kDa — 54 (2 мин), 71 (3 мин), 91 (1мин) ПЦР-фрагменты были клонированы в плазмиде pUC18 и определена их первичная структура методом Максама-Гилберта. При сравнении нуклеотидных последовательностей полученных нами генов с данными GenBank был обнаружен ряд нуклеотидных замен (Табл.2), некоторые из которых приводили к замене аминокислот. Так как представленные замены стабильно обнаруживались во всех взятых для секвенирования клонах (не менее трех для каждого гена Treponema pallidum), можно заключить, что они не являются ошибками ПЦР, а присутствуют в используемом нами варианте Treponema pallidum.

Представленные ниже результаты свидетельствуют о том, что данные замены не влияют на иммунохимические свойства выбранных нами белков.

Секвенированные ПЦР-фрагменты, содержащие гены белков Treponema pallidum переносили в экспрессирующую векторную ДНК pEL5c. ДНК pEL5c содержит ген устойчивости к ампициллину, ген бета-галактозидазы под контролем PL-промотора и

Сравнение нуклеотидных последовательностей клонированных генов рекомбинантных белков Treponema pallidum с данными GenBank*

Наименование Позиция Основание Аминокислота

белка основания Данные Данные Данные Данные

в гене" GenBank секвенирования GenBank секвенирования

15 kDa 74 А G D S

321 Т С D D

323 Т С V A

17 kDa 79 А С Т P

263 С т Р L

270 С G т T

433 А G M V

TmpA 306 С Т L L

501 G А L L

886 G А G E

906 Т С I I

47 kDa 125 т С L S

420 А G E E

710,711 ТС TG V G

* - приведены только нуклеотидные и соответствующие аминокислотные отличия структур полученных рекомбинантных белков с данными СепВапк [52];

** - позиции оснований указаны от первой буквы инициирующего АТЗ-кодона.

универсальный полилинкер, позволяющий клонировать гены различных белков в С-конец гена бета-галактозидазы E.coli. В данной системе экспрессии целевые белки синтезируются в виде химер с бета-галактозидазой и накапливаются в нерастворимых тельцах включений, что позволяет существенно упростить и стандартизовать их выделение. Наличие встроенных фрагментов ДНК Treponema pallidum подтверждали рестрикционным анализом. Получен-

ные плазмиды обозначили рР15К, рР17К, рРТтрА, рР47К в соответствии с встроенными в них генами Treponema pallidum. 2.3. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

Для наработки белков полученными плазмидами трансформировали компетентные клетки E.coli, содержащие С1-репрессор. Клетки E.coli, содержащие рекомбинантные плазмиды, культивировали в 500 мл среды LB при интенсивной аэрации при 30 °С до оптической плотности при 550 нм 0,8-1,0. Затем температуру повышали до 42 "С и продолжали культивирование в течение 2-3 ч. Биомассу осаждали центрифугированием при 7000 об/мин в течение 20 мин (5 °С) и осадок хранили при -20 °С.

Биомассы после обработки ультразвуком анализировали электрофорезом по Лэммли (Рис.5). Рекомбинантные белки нарабатывались в виде химер с Р-галактозидазой в тельцах включений. Целевые белки экстрагировали 1% раствором додецилсуль-фата натрия в 0,01 М трис-НС1, 0,2 М NaCL, рН 7,6. Выделенные белки после двукратного диализа против 8М мочевины анализировали электрофорезом, а специфичность их проверяли иммуно-блоттингом по связывнию с сыворотками людей, больных сифилисом. Было показано, что все четыре белка связываются со специфическими сыворотками. Результаты иммуноблоттинга ли-затов трансформированных рекомбинантными плазмидами клеток E.coli приведены на Рис.5.

12 3 4

(> - rail

-» t

(116 к I )a )

^ 1

о- РФ < f* " *

>' I

г fr"

, " "" Ts

Рис.5. Анализ лизатов клеток E.coli, трансформированных рекомбинант-ными плазмидами рР15К, рР17К, рРТтрА, рР47К.

А - электрофореграмма в 7,5% ПААГ.

Б - результаты иммуноблота с сывороткой, содержащей антитела к Treponema pallidum. Дорожки:

1 - лизат исходных клеток E.coli;

2 - лизат клеток E.coli, продуцирующих белок 15 kDa;

3 - лизат клеток E.coli, продуцирующих белок 17 kDa;

4 - лизат клеток E.coli, продуцирующих белок ТтрА;

5 - лизат клеток E.coli, продуцирующих белок 47 kDa.

2.4. ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ TREPONEMA PALLIDUM ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ СЫВОРОТОК ЛЮДЕЙ, БОЛЬНЫХ СИФИЛИСОМ

Смесь рекомбинантных белков Treponema pallidum —

15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa была использована в качестве

антигена в непрямом ИФА. Подбор концентрации рекомбинант-

ных антигенов для сенсибилизации на планшетах осуществляли перекрестным титрованием антигена со смесью сывороток, содержащих антитела к Tr. pallidum, и сыворотками здоровых людей. Она составила 1-4 мкг/мл.

Была сконструирована экспериментальная тест-система для выявления антител класса IgG человека против Tr. pallidum. С использованием данного диагностического набора было проанализировано 824 сыворотки, полученных от больных с разными стадиями сифилиса. Для сравнения использовали природный антиген Treponema pallidum, обработанных ультразвуком, АГ2. В ИФА с АГ2 как положительные были определены 799 образцов, что составило 96,9%, а из 54 сывороток здоровых людей как отрицательные — 50 сывороток, что составило 92,6%. Эти данные согласуются с данными литературы. В случае использования в качестве антигена комбинации всех четырех рекомбинантных белков (15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa) чувствительность в наших экспериментах составила 99,5% (820 образцов), а специфичность 100% (Табл.3).

Из полученных данных видно, что применение в качестве антигена комбинации исследуемых рекомбинантных белков позволяет увеличить чувствительность и специфичность ИФА по сравнению с использованием природного антигена Tr. Pallidum.

Сыворотки крови пациентов с диагнозом сифилиса в анамнезе, которые показали отрицательный или сомнительный результат в ИФА с природным антигеном, АГ2 (25 образцов), проявились как явно положительные в реакции с рекомбинантным антигеном (Табл.4). При этом важно отметить, что при тестировании

Сравнение чувствительности и специфичности экспериментальных тест-систем с антигеном Treponema pallidum, шт. Nichols (АГ2) и рекомбинантными антигенами (15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa)

Диагностикум Чувствительность Д* Специфичность Д~ ДиФА

Абс. % % Абс. % % %

Диагностикум с АГ2 799* 96,9 99,5 50** 92,6 66,7 96,6

Диагностикум с рекомбинантными антигенами 820 99,5 100 54 100 93,1 99,5

*) проанализировано 824 сывороток больных с подтвержденным диагнозом сифилиса; **) проанализировано 54 отрицательных сыворотки; Д* - индекс достоверности положительных результатов; Д" - индекс достоверности отрицательных результатов; ДИФА- достоверность результата иммунологического анализа.

сывороток с применением рекомбинантных антигенов уровень сигнала, полученного на спектрофотометре, существенно превышал соответствующие показатели для АГ2.

Существенную часть образцов, имеющих слабоположительный или отрицательный результат в ИФА с природным антигеном Tr. Pallidum (АГ2), составляют сыворотки людей, ранее переболевших сифилисом и прошедших один или несколько курсов лечения. Такие сыворотки, как правило, слабоположительны или отрицательны и в стандартных серологических реакциях (реакция микропреципитации, реакция связывания комплемента, реакция иммунофлюоресценции). В связи с этим представляло интерес

проанализировать такие сыворотки в ИФА с использованием ре-

Сравнительный анализ сывороток с низким содержанием IgG методом ИФА с использованием природного и рекомбинантного антигенов Treponema pallidum

Номер Природный антиген Рекомбинантный антиген

сыворотки (ОП«и) (on492)

12 0.220 0.955

15 0.301 0.906

17 0.238 0.856

115 0,394 0.778

272 0.190 0.780

281 0.397 1.156

289 0.310 0.736

455 0.321 0.732

531 0.220 0.550

532 0.357 1.054

546 0.307 1.056

548 0.280 0.906

569 0.252 0.461

603 0.284 0.904

608 0.437 1.277

624 0.196 1.110

626 0.238 0.555

628 0.344 0.878

655 0.552 1.057

689 0.308 0.882

706 0.366 0.993

729 0.354 1.484

732 0.260 0.688

Отриц. контроль* 0.160±0.031 0.148+0.024

* - здоровые доноры (n=20), р < 0,05

комбинантного антигена. Результаты анализа приведены в Табл.5, из которой видно, что сыворотки, отрицательные или сомнительно положительные при анализе стандартными тестами, явно положительны в ИФА с рекомбинантным антигеном.

Таблица 5

Сравнительный анализ сывороток наблюдаемых после лечения больных сифилисом стандартными методами исследования и ИФА

Номер сыворотки ИФА срекомб. белками (ОП492) Реакция иммунопре-ципитации Реакция связывания комплемента Реакция иммунофлюо-ресценции

161 0.580 ++++** 1:40+*** +

460 0.826 - ± -

503 1.270 - - +

531 0.652 - 1:10+ +

569 0.461 - - +

570 0.874 - ± -

603 0.906 + 1:10+ +

624 1.110 - 1:5+ +

626 0.555 - + +

655 1.057 - 1:5+++ ±

706 0.754 - 1:5+ +

811 2.0 - 1:5+ +

Отриц. контроль* 0.148±0.024 - - -

* - здоровые доноры (п=20);

** - ++++ - положительная реакция, ++ и + - слабоположительная реакция;

*** - разведение сыворотки, в котором получен данный результат. 24

На основании этих данных можно сделать заключение, что высокая чувствительность тест-систем на основе рекомбинантных белков позволяет тестировать антитела в сыворотках указанных лиц более продолжительное время, в титрах, которые не регистрируются стандартными серологическими реакциями.

На основе комбинации рекомбинантных белков было выпущено 14 серий экспериментальных тест-систем по 100 наборов в 3-х сериях и по 200 наборов в 11-ти сериях с чувствительностью 98-100% и специфичностью 98-100% (данные отдела биотехнологического контроля ГНЦ ВБ «Вектор»).

2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ СОРБИРОВАННЫХ НА ПЛАНШЕТАХ ПРИРОДНОГО И РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНОВ

Для определения стабильности сорбированных антигенов при хранении полистироловые планшеты сенсибилизировали антигеном Тг. Pallidum и комбинацией исследуемых рекомбинантных антигенов 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 KDa. при 4 °C в течение 18 часов без применения стабилизирующих препаратов, после чего удаляли жидкость из лунок и высушивали. Затем планшеты герметично упаковывали и хранили в темном месте при 4 °С. Активность сорбированного антигена определялась тестированием одних и тех же положительной и отрицательной сывороток в ИФА в разведениях 1:100 через равные интервалы времени. На основании полученных данных можно сказать, что активность сорбированного при вышеприведенных условиях природного антигена Tr. Pallidum начинает постепенно снижаться с третьей недели и к 15 неделе хранения уменьшается вдвое (Рис.6.), а

0,0 —T .........T...........~У ........—? • ■ -- - --

0 3 6 9 12 15 18

недели

Рис.6. Изменение ОП492 при хранении при температуре 4 С планшетов, сорбированных антигеном Тг.раШйит (АГ2).

*К+1:100-разведения положительной на сифилис сыворотки **К-1:100-разведения отрицательной на сифилис сыворотки

активность рекомбинантного антигена при хранении планшетов при 4 °С снижается постепенно и вдвое уменьшается к концу девятого месяца (Рис. 7.) в отличие от природного. Быстрое сни-

ОП492

месяцы

Рис.7. Изменение On492 при хранении при температуре 4°С антигена из комплекса рекомбинантных белков Treponema pallidum 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa, сорбированного на планшетах.

К+ - положительная сыворотка К- - отрицательная сыворотка

жение активности сорбированного природного антигена Tr. Pallidum является еще одним весомым доводом в пользу применения рекомбинантного антигена.

2.6. ИЗУЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ 15 KDA, 17 KDA, ТМРА, 47 KDA И ИХ КОМБИНАЦИИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИТЕЛ К TREPONEMA PALLIDUM НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Для анализа сывороток в работе использовали как смесь всех 4-х белков, так и каждый из них отдельно для того, чтобы оценить вклад каждого из данных антигенов в иммунном ответе на разных стадиях сифилиса. Для более полной характеристики сывороток определяли иммуноглобулины двух классов — IgG и IgM. Все используемые в работе положительные сыворотки тестировались предварительно общепринятыми серологическими методами, на основе чего, а также клинической картины и данных анамнеза, все сыворотки были разбиты на 4 группы: сыворотки от больных первичным, вторичным свежим, вторичным рецидивным сифилисом и сыворотки от лиц, наблюдаемых 1-2 года после лечения.

Данные сравнительного анализа антител класса IgG в индивидуальных сыворотках людей с различными стадиями сифилиса приведены на рис.8.

В табл.6, приведены данные по частоте выявляемости антител класса IgG во всех вышеперечисленных группах больных к отдельным рекомбинантным антигенам и их комбинации. Как видно из этой таблицы, антитела класса IgG в ИФА со смесью рекомбинантных белков 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa были

обнаружены у всех пациентов всех исследуемых групп — с

4 ■

* г

■

i: ■■ i

on.

X 1

t : •

к 4

'491

on,

t 1

1 г

1 »

■ 1 1 а

1 •

t 1 ■ ■

■ ■

I »

'492

» 1

I ■

I I

t v

Рис.8. Сравнительный анализ специфических антител класса IgG в сыворотках больных с различными стадиями сифилиса к рекомбинантным антигенам (А - 15 kDa, Б - 17 kDa, В - ТтрА, Г-47 kDa) методом ИФА.

1 - сыворотки крови здоровых людей, (-) контроль;

2 - сыворотки крови больных первичным сифилисом;

3 - сыворотки крови больных вторичным свежим сифилисом;

4 - сыворотки крови больных вторичным рецидивным сифилисом;

5 - сыворотки крови наблюдаемых после лечения сифилиса людей.

■

Анализ сывороток больных на разных стадиях сифилиса методом ИФА на наличие антител класса с использованием рекомбинантных

антигенов

Белок Частота выявления антител на разных стадиях заболевания

Больные первичным сифилисом п=33* Больные вторичным свежим сифилисом п=39 Больные вторичным рецидивным сифилисом п=33 Пациенты, наблюдаемые после лечения 1-2 года п=22 Общее количество обследованных п=127

15 кйа 78,8% 97,4% 100,0% 50% 85%

ТтрА 100,0% 100,0% 100,0% 54,5% 92,1%

47 кйа 93,9% 100,0% 100,0% 31,8% 86,6%

17 кРа 90,9% 97,4% 100,0% 86,3% 94,4%

Сумма четырех белков 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100%

* - количество образцов.

первичным, вторичным свежим, вторичным рецидивным сифилисом и наблюдаемых 1 -2 года пациентов после лечения.

Частота выявляемости ^О к отдельным белкам была различна. Так, к белку 15 кБа зарегистрированы нами в 78,8% случаев при первичном, возрастая до 97,3% при вторичном свежем и 100% при вторичном рецидивном сифилисе. И лишь у половины пациентов с леченым сифилисом обнаружены к этому белку. К белку ТтрА антитела класса определяются в 100% случаев, как при первичном, так и вторичном сифилисе; после лечения (спустя 1-2 года) циркуляция этих антител снижается и регистрируется у половины больных. У пациентов с первичным сифилисом к белку 47 кБа определялись в 93,9%

случаев, при вторичном — в 100% и снижались до 31,8% в группе больных с леченым сифилисом. Антитела класса IgG к антигену 17 kDa в группе больных с первичным сифилисом обнаружены в 90,9%, при вторичном свежем регистрируются уже в 97,4%, а при вторичном рецидивном сифилисе выявлены во всех исследованных образцах. В сыворотках крови больных с леченным сифилисом IgG к белку 17 kDa снижаются медленно и через 1-2 года обнаруживаются в 86,3% случаев, причем у 13% леченных больных спустя 1-2 года определены IgG только к белку 17 kDa. Выявляемость антител IgG к этому антигену среди всех исследованных образцов оказалась довольно высокой, близкой к таковому показателю при использовании ТшрА, и составила 94,4%.

На Рис.9 приведены данные сравнительного анализа антител класса IgM в индивидуальных сыворотках людей с различными стадиями сифилиса. Как видно из рисунка, картина выявления IgM антител к индивидуальным белкам Tr. pallidum чрезвычайно разнородна, однако, можно выделить ряд закономерностей. Интенсивность ОП4В2 не высока, достигает только в отдельных образцах 1,500. При этом в сыворотках больных с вторичным рецидивным сифилисом антитела IgM к 15 kDa антигену не выявляются. В сыворотках при леченном сифилисе IgM не обнаруживаются ко всем исследуемым белкам.

Наиболее наглядно закономерности выявления IgM отражены в табл. 7. Антитела класса IgM к смеси исследуемых нами белков зарегистрированы у 92,3% людей с диагнозом «первичный сифилис», у больных с вторичным свежим и вторичным рецидивным 30

ОП,, А

OHL

ОП

t ! i i i

в •

i : i

113 4 9

Рис.9. Сравнительный анализ специфических антител класса 1дМ в сыворотках больных с различными стадиями сифилиса к рекомбинантным антигенам (А - 15 кйа, Б - 17 кйа, В - ТтрА, Г-47 кРа) методом ИФА.

1 - сыворотки крови здоровых людей, (-) контроль;

2 - сыворотки крови больных первичным сифилисом;

3 - сыворотки крови больных вторичным свежим сифилисом;

4 - сыворотки крови больных вторичным рецидивным сифилисом;

5 - сыворотки крови наблюдаемых после лечения сифилиса людей.

Анализ сывороток больных на разных стадиях

сифилиса методом ИФА на наличие антител класса ^М с использованием рекомбинантных

антигенов

Белок Частота выявления антител при различных стадиях заболевания

Больные первичным сифилисом п=13* Больные вторичным свежим сифилисом п=22 Больные вторичным рецидивным сифилисом п=9 Пациенты, наблюдаемые после лечения 1 -2 года п=19 Общее количество обследованных п=63

15 кОа 15,4% 22,7% 0 0 10,9%

ТшрА 46,2% 40,9% 33,3% 0 28,1%

47 кОа 23,1% 36,4% 33,3% 0 21,9%

17 кОа 76,9% 50,0% 55,6% 0 40,6%

Сумма четырех белков 92,3% 72,7% 77,8% 0 54,7%

* - количество образцов.

данные антитела определяются в меньшем числе случаев — в 72,7% и 77,8% соответственно, и у пациентов, перенесших сифилис 1-2 года назад, не обнаруживаются.

Антитела класса ^М к белку 17 кБа и ТшрА у больных с первичным сифилисом определяются в 76,9% и 46,2% соответственно и обнаруживаются у еще меньшего числа пациентов с вторичным сифилисом — 40,9-33,3% и 50,0-55,6% соответственно. Выявляемость у всех обследованных на наличие составила к 17 кБа антигену 40,6% и к ТшрА — 28,1%.

К белку 47 кБа при вторичном сифилисе отмечаются у большего количества людей, чем при первичном — 36,4%, 33,3% и 23,1% соответственно, у лиц группы леченого сифилиса они

не определяются. 1дМ у всех обследованных к 47 кБа антигену удалось определить в 28,1% случаев.

^М к белку 15 кБа встречаются реже,чем к другим белкам (17 кБа, ТшрА, 47 кБа), у 10,9% всех обследованных; у больных с вторичным свежим сифилисом в 22,7%, у больных с первичным сифилисом в 15,4% и вообще не определяются у больных со вторичным рецидивным сифилисом и у лиц из группы леченого сифилиса.

На основании данных при исследовании образцов сывороток больных в ИФА с отдельными рекомбинантными белками и их комбинацией на наличие антител к возбудителю сифилиса можно заключить, что использование отдельных рекомбинантных белков не приводит к 100% чувствительности, что делает целесообразным их сочетанное применение, при котором чувствительность диаг-ностикума увеличивается.

Можно предположить, что при диагностике поздних форм сифилиса (третичный и сифилис нервной системы), отличающихся слабой сероконверсией, комплексное использование рекомбинантных антигенов будет особенно необходимым.

выводы

1. Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для лабораторной диагностики сифилиса на основе антигена Treponema pallidum. Выпущено четыре серии экспериментальных тест-систем для выявления IgG человека к Treponema pallidum.

2. Получены бактериальные штаммы-продуценты E.coli, экспрессирующие белки 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 kDa Treponema pallidum в виде химер с ß-галактозидазой.

3. Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для лабораторной диагностики сифилиса, основанная на рекомбинантных белках 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa. Получен патент на изобретение «Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum» (RU 2103362). Выпущено четырнадцать серий экспериментальных тест-систем для выявления IgG человека к Treponema pallidum.

4. Проведено сравнительное изучение ИФА тест-систем:

а) на основе анализа 824 сывороток, полученных от больных с разными стадиями сифилиса, и 54 сывороток здоровых людей показано, что диагностикум на основе рекомбинантного антигена обладает более высокими чувствительностью и специфичностью (99,5 и 100%) по сравнению с тест-системой на основе природного антигена (96,9 и 92, 6%);

б) показано, что тест-системы на основе рекомбинантных белков при хранении при 4 °С обладают большей стабильностью (9 месяцев) по сравнению с тест-системами на основе природного антигена Treponema pallidum (4 месяца).

5. Показаны особенности накопления ^О и 1г*М к четырем рекомбинантным белкам в группах пациентов с различными стадиями сифилиса:

а) первичный сифилис — антитела класса были обнаружены у 92,3% пациентов, в основном, к белкам ТтрА и 17 кБа;

определяются у всех пациентов к белку ТтрА;

б) вторичный свежий сифилис — антитела класса регистрируются в 72,7% случаев; регистрируются у всех больных к белкам ТтрА и 17 кБа;

в) вторичный рецидивный сифилис — не определяются ^М к белку 15 кБа, а к остальным белкам определяются в 20-50%;

определяются у всех пациентов на все четыре белка;

г) леченый сифилис — ^М к данным белкам не определяются;

регистрируются у всех пациентов этой группы, причем наиболее часто к белку 17 кБа — 86,3%, а в 13% — только к этому белку.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., КочневаГ.В., Урманов И.X. и др. Клонирование и экспрессия в E.coli основных антигенов Treponema pallidum и исследование их иммунохимических свойств. // Иммунология, 1998, № 4, с.17-20.

2. Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Цивковский Р.Ю., Серпинский О.И. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомби-нантных антигенов. // Иммунология, 1998, № 4, с. 20-23.

3. Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Урманов И.Х., Серпинский О.И., Блинов В.М. и др. Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema Pallidum, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema Pallidum 15 kDa, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema Pallidum 17 kDa, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema Pallidum TMP А. // Патент RU 2103362. Бюл. № 3, 1998.

4. Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Серпинский О.И., Цивковский Р.Ю. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием ре-комбинантных антигенов. // Конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 1998 г., с. 133.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гражданцева, Антонина Анатольевна

Список используемых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Сифилис: характеристика инфекции и проблемы ее диагностики.

1.1. Этиология сифилиса

1.2. Патогенез, патанатомия и клинические формы заболевания.

1.3. Лабораторная диагностика сифилиса

1.3.1. Серологические методы диагностики сифилиса с использованием неспецифического антигена.

1.3.2. Серологические методы диагностики сифилиса с использованием специфических антигенов.

1.3.3. Рекомбинантные белки Treponema pallidum в диагностике сифилиса.

Антигенный состав Treponema pallidum.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса"

В России после продолжительного периода относительно низкой и стабильной заболеваемости сифилисом отмечается устойчивая тенденция ее роста с 4,3 в 1989 году до 277,3 в 1997 году (заболеваемость на 100 тыс. населения). Несмотря на некоторое снижение в 1998 заболеваемости сифилисом, ее уровень по-прежнему остается высоким и составляет 155,6. Вследствие увеличения в 1997 году числа выявленных беременных женщин, больных сифилисом, в 10 раз по сравнению с 1993 годом значительно чаще стали регистрироваться случаи врожденного сифилиса. Показатель числа случаев врожденного сифилиса на 10000 родившихся возрос с 0,3 в 1993 году до 5,6 в 1997 году [40]. Вызывает большую тревогу то, что этот подъем заболеваемости имеет некоторые признаки эпидемического характера: подавляющее преобладание в структуре заболеваемости заразных форм сифилиса (98%); высокий процент среди заразных форм первичного и вторичного свежего сифилиса (60%); снижение соотношения вторичных рецидивных и свежих форм — 1:1,6 в 1990 г., 1:2,2 — в 1994 г.; резкое увеличение числа больных сифилисом детей в возрасте до 14 лет, включая врожденный сифилис: в 1990 г. - 38 (до 14 лет) и 10 (врожденный), в 1997 г. - 2703 (до 14 лет) и 513 (врожденный) [1, 40]; выраженные различия уровня заболеваемости в отдельных регионах страны как друг от друга, так и от среднего показателя по России [1]. Наиболее значимыми причинами такого высокого уровня заболеваемости сифилисом являются изменения в социальной сфере и экономические факторы: военные, гражданские и национальные конфликты, падение уровня жизни населения, проституция и т.д. В сложившейся ситуации преодоление социального и экономического кризиса имеет большое значение, но при этом значительную роль играет и совершенствование современных методов диагностики заболевания, которые бы позволили обследовать в короткие сроки значительные группы населения с целью выявления сифилиса и проведения системы лечебных и профилактических мероприятий.

При выявлении сифилиса определяющую роль играет лабораторная диагностика. С 1985 г. практически не изменялся как комплекс стандартных серологических реакций (КСР), применяемый в медицинских учреждениях нашей страны [35], так и используемые в качестве отборочных тестов реакция микропреципитации и реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). КСР включает реакцию связывания комплемента с кардиолипиновым и трепонемным антигенами (РСК), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) [34, 75]. Следует подчеркнуть, что пока ни один из этих тестов не является идеальным диагностическим методом и не может удовлетворить полностью практическую медицину. Одни из них сложны при постановке и являются дорогостоящими, другие достаточно часто дают ложноположительные результаты [13, 14, 27].

Так, реакция микропреципитации, которая применяется в основном при массовых обследованиях, является быстрой, простой в исполнении, но может давать ложноположительные, а в отдельных случаях и отрицательные результаты при активных формах сифилиса [27]. Ложноположительные ответы могут иметь место при постановке РСК с кардиолипиновым антигеном (реакция Вассермана) в случае болезней печени, желудка, желез внутренней секреции, а в РСК с трепонемным антигеном — при системной красной волчанке, болезни Лайма [22, 71]. В пожилом возрасте стандартные серологические реакции на сифилис могут быть ложнопозитивными у 60% лиц. При беременности ложнопозитивные реакции составляют 2% [25].

Реакции РИФ и РИБТ, несмотря на свою специфичность, являются сложными в постановке и дорогостоящими, поэтому они применяются в основном при диагностике латентного сифилиса и верификации ложноположительных результатов после скрининговых обследований [27].

Недостатки этих классических методов, а также успехи научно-технических разработок заставляют вводить в практику новые методы диагностики, более удобные в постановке, позволяющие обследовать в короткие сроки большое количество людей и в то же время обладающие достаточной чувствительностью и специфичностью. Одним из таких перспективных методов серодиагностики является иммуноферментный анализ (ИФА). В конце 70-х годов в работах зарубежных авторов появляются сообщения о возможности применения ИФА для определения антител к Treponema pallidum [34, 74]. В ряде работ в последующие годы содержатся данные по использованию рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для выявления сифилиса [87,91,106].

В России кроме обязательного комплекса серологических реакций в некоторых лабораториях в последние десять лет применяется ИФА с использованием антигена из непатогенных и "культуральных" трепонем [34], позволяющего определить антитела лишь к группоспецифическим антигенам спирохет. Для определения антител к видоспецифическим антигенам Treponema pallidum необходимо применять в качестве антигена патогенную трепонему - Treponema pallidum. Однако, при ее культивировании возникает ряд серьезных трудностей: необходимость пассирования трепонемы на животных (кроликах), вероятность заражения персонала, сложность стандартизации антигена, его дороговизна. Перечисленные выше недостатки ставят вопрос о разработке новых методов получения антигена. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных аналогов белков Treponema pallidum, синтезированных в экспрессирующей системе E.coli. Получению некоторых рекомбинантных белков Treponema pallidum и применению их в качестве антигена в иммуноферментном анализе и посвящена данная работа.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы является получение и сравнительное исследование природных и рекомбинантных антигенов Treponema pallidum для иммуноферментной диагностики сифилиса; изучение спектра антител к антигенам 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 kDa Tr.pallidum на разных стадиях заболевания методом ИФА с помощью рекомбинантных белков.

Решение поставленной задачи включало следующие этапы:

• культивирование бледной спирохеты Treponema pallidum на кроликах;

• получение природного антигена Treponema pallidum для ИФА;

• литературно-теоретический анализ с целью выбора наиболее антигеннозначимых белков, видоспецифичных для Treponema pallidum;

• выделение ДНК Treponema pallidum;

• получение методом ПЦР генов рекомбинантных белков;

• определение структуры генов;

• клонирование генов в экспрессирующий вектор;

• наработка рекомбинантных белков в E.coli и их выделение;

• изучение возможности использования рекомбинантных белков в качестве антигена в ИФА;

• получение экспериментальных партий тест-систем;

• исследование сывороток больных сифилисом с помощью опытных партий тест-систем.

• анализ результатов использования отдельных рекомбинантных белков и их комбинации при выявлении антител при различных стадиях инфекции.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Выбрана комбинация белков Treponema pallidum для использования в качестве антигена в твердофазном ИФА.

Сконструированы четыре бактериальных штамма-продуцента, экспрессирующие белки Treponema pallidum: 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa.

С использованием как отдельных, так и суммарных рекомбинантных белков проведено исследование сывороток больных сифилисом на разных стадиях заболевания. Показано преимущество использования набора четырех рекомбинантных белков по сравнению с использованием отдельных рекомбинантных белков в качестве антигена для лабораторной диагностики заболевания.

На основе рекомбинантных белков выпускаются диагностические наборы для определения антител к бледной спирохете (ТОО "Биосервис", г. Москва).

Получен патент на изобретение "Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum" (RU 2103362, см. Приложение).

Благодарности. Автор благодарен научным руководителям Звереву В.В. и Серпинскому О.И. за их постоянное внимание и помощь в ходе выполнения диссертационной работы. Автор выражает глубокую благодарность Сиволобовой Г.Ф., Кочневой Г.В., Урманову И.Х., в соавторстве с которыми были получены основные результаты работы; Курлаевой Т.Б. и Судариковой Е.Г. за оказанную помощь в сборе образцов сывороток и тестировании их стандартными лабораторными методами. и

Публикации по теме диссертации:

1. Гражданцева A.A., Сиволобова Г.Ф., Кочнева Г.В., Урманов И.Х. и др. Клонирование и экспрессия в E.coli основных антигенов Treponema pallidum и исследование их иммунохимических свойств. // Иммунология, 1998, № 4, с. 17-20.

2. Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Цивковский Р.Ю., Серпинский О.И. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов. // Иммунология, 1998, № 4, с. 20-23.

4. Гражданцева A.A., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Серпинский О.И., Цивковский Р.Ю. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов. // Конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998 г., с. 133.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гражданцева, Антонина Анатольевна

Выводы.

2. Получены бактериальные штаммы-продуценты E.coli, экспрессирующие белки 15 kDa, 17 kDa, TmpA, 47 kDa Treponema pallidum в виде химер с р-галактозидазой.

3. Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для лабораторной диагностики сифилиса, основанная на рекомбинантных белках 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa. Получен патент на изобретение "Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum" (RU 2103362). Выпущено четырнадцать серий экспериментальных тест-систем для выявления IgG человека к Treponema pallidum.

4. Проведено сравнительное изучение ИФА тест-систем: а) на основе анализа 824 сывороток, полученных от больных с разными стадиями сифилиса, и 54 сывороток здоровых людей показано, что диагностикум на основе рекомбинантного антигена обладает более высокими чувствительностью и специфичностью (99,5 и 100%) по сравнению с тест-системой на основе природного антигена (96,9 и 92, 6%); б) показано, что тест-системы на основе рекомбинантных белков при хранении при 4 °С обладают большей стабильностью (9 месяцев) по сравнению с тест-системами на основе природного антигена Treponema pallidum (4 месяца). V

5. Показаны особенности накопления IgG и IgM к четырем рекомбинантным белкам в группах пациентов с различными стадиями сифилиса: а) первичный сифилис - антитела класса IgM были обнаружены у 92% пациентов, в основном, к белкам TmpA и 17 kDa; IgG определяются у всех пациентов к белку TmpA;

87 б) вторичный свежий сифилис — антитела класса ^М регистрируются в 72% случаев; регистрируются у всех больных к белкам ТтрА и 17 кСа; в) вторичный рецидивный сифилис - не определяются ^М к белку 15 кБа, а к остальным белкам определяются в 20-50%; ^О определяются у всех пациентов на все четыре белка; г) леченый сифилис - ^М к данным белкам не определяются; ^О регистрируются у всех пациентов этой группы, причем наиболее часто к белку 17 Ша - 86,3%, а в 13% — только к этому белку.

Заключение.

В России за последнее десятилетие наблюдается устойчивая тенденция роста инфекционных заболеваний, в том числе и сифилиса. По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации [40] рост заболеваемости сифилисом составил с 4,3 в 1989 году до 277,3 в 1997 году (заболеваемость на ЮОтыс. нас). В связи с этим возникла острая необходимость в создании новых методов диагностики, позволяющих одновременно обследовать большие группы населения, недорогих и удобных в практическом применении. До начала настоящей работы (1995 г.) в медицинских учреждениях применялся комплекс стандартных серологических реакций, который не изменялся с 1985 г. Эти методы не удовлетворяли практическую медицину: одни из них сложны при постановке и являются дорогостоящими, другие достаточно часто дают ложноположительные результаты. Сложившаяся ситуация требовала более совершенных методов лабораторной диагностики.

Одним из таких методов, получившим широкое применение за последнее десятилетие, стал иммуноферментный анализ. В настоящее время ИФА широко используется как при детекции антител и антигенов при вирусных, бактериальных, паразитарных заболеваниях, так и при определении белковых компонентов крови (гормоны, цитокины, онкогены) и других биологических жидкостей. Данная работа посвящена постановке и усовершенствованию иммуноферментных методов диагностики сифилиса.

На пути к достижению этой цели были оптимизированы параметры культивирования Treponema pallidum, шт. Nichols, установлена оптимальная инфицирующая доза (4±1)х107 трепонем/мл и время забора инфицированных тестикул — 2 день после появления первых симптомов орхита; получен природный антиген Treponema pallidum; сконструирована на его основе экспериментальная тест-система и выпущно 4 серии, включающие по 30 тест-систем каждая (Заключение Отдела биотехнологического контроля ГНЦ ВБ "Вектор" о качестве тест-систем).

Однако, использование в ИФА антигенов из патогенных трепонем сопряжено с рядом очевидных трудностей — необходимостью культивирования на животных активного возбудителя сифилиса и, в связи с этим, высокая вероятность заражения персонала, невозможность получения больших количеств антигена, высокая себестоимость и проблема его стандартизации. Учитывая все эти недостатки, была поставлена задача создания рекомбинантных аналогов антигенов бледной спирохеты.

На основе анализа данных литературы и GenBank был осуществлен выбор белков Тг. pallidum, видоспецифичных, обладающих выраженными антигенными свойствами. Дальнейшие исследования подтвердили, что рекомбинантные аналоги выбранных липопротеинов 15 kDa, 17 kDa, TmpA и 47 kDa в комплексе позволяют определить антитела практически во всех сыворотках больных первичным, вторичным сифилисом и лиц, наблюдаемых 1-2 года после лечения.

Полученные на основе комбинации рекомбинантных белков диагностические наборы превышали по чувствительности и специфичности существовавшие в то время отечественные иммуноферментные системы на основе природного антигена (в том числе и разработанные нами) и были более стабильны, удобны и безопасны в работе.

При сравнении срока хранения нативного и рекомбинантного антигенов, сорбированных на планшетах, при одинаковых условиях рекомбинантный антиген оказался более стабилен, что позволяет увеличить длительность срока хранения тест-систем.

На основании выявляемое™ антител к отдельным рекомбинантным белкам и их комплексу было установлено, что для серологической диагностики важно применять комбинацию антигенов, так как использование отдельных белков не позволяет определять антитела во всех сыворотках пациентов с первичным, вторичным и леченым сифилисом.

Проведенные нами исследования появления антител к индивидуальным белкам позволили определить напряженность гуморального иммунного ответа к каждому белку на разных стадиях сифилиса, а также судить о роли полученных антигенов для серологической диагностики. Выявленная нами особая значимость 17 kDa и ТтрА антигенов была впоследствии подтверждена японскими и немецкими исследователями [61, 62].

С использованием в качестве антигена набора сконструированных нами рекомбинантных белков было выпущено 14 серий экспериментальных тест-систем по 100-200 наборов в каждой серии, чувствительность и специфичность которых составляла 98-100% (см. Заключение Отдела биотехнологического контроля ГНЦ ВБ "Вектор"). При помощи разработанной тест-системы исследовано более 800 образцов крови. Получен патент на изобретение "Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum" (RU 2103362), основанный на рекомбинантных антигенах 15 kDa, TmpA, 47 kDa и 17 kDa.

Данная работа была выполнена при финансовой поддержке ТОО "Биосервис".

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гражданцева, Антонина Анатольевна, Кольцово

1. Аковбян В.А., Тихонова Л.И., Машкиллейсон А.Д., Борисенко К.К., Прохоренко В.И. Заболеваемость сифилисом в России: опыт истории, эпидемиологический анализ, прогнозы. // ЗППП, 1995, № 4, с. 22-25.

2. Антитела. Методы. Кн.2. // под ред. Кетти Д., М.: "Мир", 1991, с. 152-238.

3. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: "Ленмедгиз", 1962.

4. Беднова В.Н., Дмитриев Г.А. и др. Новая тест-система иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса. //Вестн. дерматол. венерол. 1995, № 1, с. 19-20.

5. Беленький Г.Б. Реакция иммобилизации бледных трепонем. М.: "Медгиз", 1964.

6. Борисенко К.К., Тимченко Г.Ф., Дмитриев Г.А. и др. Первый опыт применения в России тест-системы "TPHA-NOSTICON" фирмы "Органон-Техника БВ" (Голландия) для диагностики сифилиса. // ЗППП, 1995, № 1, с. 33-34.

7. БСЭ. 1984, Т.23, с. 326-327.

8. Вектор pEL5c. // Заявка на получение патента N5027679/13/007659 от 18.02.1992 г.

9. Вербов В.Н., Золотухин В.А., Шутова О.В., и др. Модификация иммуноферментной тест-системы для серодиагностики описторхоза. // Мед. паразитол. и паразитар. бол., 1990, №2, с. 9-11.

10. Воробьев A.A., Быков A.C., Пашков Е.П., Рыбакова A.M. Микробиология. М.: "Медицина", 1998, с. 297-298.

11. Гицу Г.А., Нгуен Тхи Хой, Баллад Н.Е., и др. Эффективность иммуно-ферментного теста с гомологичным и гетерологичными антигенами при клонорхозе. // Мед. паразитол. и паразит, бол., 1991, № 4, с. 20-23.

12. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Часть 1. // Вест. Дерматол. Венерол., 1996, № 2, с. 29-32.

13. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. Часть 2. // Вест. Дерматол. Венерол., 1996, № 3, с. 33-38.

14. Исаков С.А., Ивлева Е.А., Эрдман Ю.С. Значение ТРНА теста в подтверждении ложноположительных реакций на сифилис. // Вопр. диагностики, лечения и профилактики ЗГТПП и дерматозов. Сб. н.-практ. конф., Рязань, 1995, с. 25.

15. Каур С., Сильм X., Виндиревских Г., Шевчук О. Усовершенствование методов диагностики сифилиса при помощи определения антител к специфическим белкам возбудителя. // ЗППП, 1998, № 4, с. 21 -22.

16. Комарова В.Д., Фриго Н.В. Результаты апробации иммуноферментной тест-системы Lues Screen для серодиагностики сифилиса. // Вопр. диагностики, лечения и профилактики ЗППП и дерматозов. Сб. н.-практ. конф., Рязань, 1995, с. 29.

17. Корбут С.Е., Каштанова М.Г., Милонова Т.И. Фильтруемость бледных трепонем через стерилизующие фильтры с различной величиной пор.// Вестн. Дерматол., 1979, № 1, с. 70-77.

18. Котровский А.В.Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса. //Дисс. канд. мед. наук. М, 1986.

19. Красильников А.П. Микробиологический словарь справочник. "Беларусь", 1986, с. 274-275.

20. Краткий определитель бактерий Берги. // под ред. Хоулта Д. Г., М.: "Мир", 1980, с. 93-97.

21. Кубась В.Г., Данилова О.П. Ложно-положительные реакции в диагностике сифилиса. // Материалы XXXIII Научно-практ. конф. дерматологов, акушер-гинекологов и урологов Санкт-Петербурга, С-Пб, 1998, с. 27-28.

22. Лосева O.K., Котровская Л.Г., Максудов Ф.М. и др. Клиническая оценка осадочных реакций Кана и Закса-Витебского. // Вестн. Дерматол., 1985, № 7, с. 69-74.

23. Ляхов В.Ф., Борисенко К.К., Потекаев Н.С., Борисова Т.К., Сидорова Е.В. Динамика трепонемоспецифической иммуноглобулинемии при ранних формах сифилиса. // Вестн. Дерматол. Венерол., 1990, № 8, с. 39-42.

24. Мавров И.И. и др. Контактные инфекции, передающиеся половым путем. Киев: "Здоровье", 1989, с. 90-94.

25. Маниатис Т.М., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: "Мир", 1984.

26. Милич М.В. Эволюция сифилиса. М.: "Медицина", 1987, с. 4-120.

27. Новое в клонировании ДНК. Методы. // под ред. Гловера Д.М., М.: "Мир", 1989, с. 95-137.

28. Обрядина А.П., Фриго Н.В., Комарова В.Д., Чепурченко Н.В., Абалкина Л.М. Бурков А.Н. Ультраозвученные белки Treponema pallidum и их рекомбинантные аналоги в иммуноферментной диагностике сифилиса. // ИППП, 1999, № 1, с. 25-28.

29. Овчинников Н.М. Экспериментальный сифилис. М.: "Медгиз", 1955.

30. Овчинников Н.М., Делекторский В.В. Ультраструктура бледной трепонемы и механизмы клеточной защиты до и в процессе лечения сифилиса. // Вестн. Дерматол., 1981, № 12, с. 37-40.

31. Овчинников Н.М., Резникова Л.С., Милонова Т.И. и др. Результаты комплексного изучения ускоренного метода для серодиагностики сифилиса. // Вестн. Дерматол., 1978, № 5, с. 28-33.

32. Овчинников Н.М., Милонова Т.И., Тимченко Г.Ф. и др. Сравнительное изучение реакции пассивной гемагглютинации, иммунофлюоресценции с адсорбцией и микропреципитации с активной сывороткой крови на сифилис. // Вестн. Дерматол., 1983, № 5, с. 17-20.

33. Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающимхся половым путем. М.: "Медицина", 1987.

34. О совершенствовании серодиагностики сифилиса. Приказ N 1161 от 2 сентября 1985 г., МЗ СССР.

35. Скоупс Р. К. Методы очистки белков. М.: "Мир", 1985, с. 341-342.

36. Скрипкин Ю.К. Кожные и венерические болезни. М.: "Медицина", 1980, с. 417-424.

37. Сидорова Е.В., Ляхов В.Ф. Значение определения противотрепонемных IgM-антител в серодиагностике сифилиса. // ЗППП, 1995, № 4, с. 11-14.

38. Суворова К.Н. Современный аспект неведомого сифилиса. // Вестн. Дерматол., 1969, № 3, с. 70-73.

39. Тихонова. Л.И. Обзор ситуации с ИППП. Анализ заболеваемости врожденным сифилисом в Российской Федерации. // ИППП, 1999, № 1, с. 15-19.

40. Яговдик Н.З., Сосновский А.Т., Качук М.В., Белугина И.Н. Венерические болезни. Минск: "Беларусская наука", 1997, с. 7-36.

41. Akins D.R., Purcell В.К., Mitra М.М., Norgard M.V., Radolf J.D. Lipid modification of the 17-kilodalton membrane immunogen of Treponema pallidum determines macrophage activation as well as amphiphilicity. // Infect. Immun., 1993, V. 61, p. 1202-1210.

42. Baker-Zander S.A., Hook E.W., Handsfield H.H., Lukehart S.A. Antigens of Treponema pallidum recognized by IgG and IgM antibodies during syphilis in humans. // J. Infect. Dis., 1985, V. 151, p. 264-272.

43. Baker-Zander S.A., Lukehart S.A. Antigenic cross-reactivity between Treponema pallidum and other patogenic memberrs of the family Spirochaetaceae. // Infect. Immun., 1984, V. 46, p. 116-121.

44. Baseman J.B., Hayes E.C. Molecular characterization of receptor binding proteins and immunogens of virulent Treponema pallidum. // J. Exp. Med., 1980, V. 151, p. 573-586.

45. Blanco D.R., Lovett M.A., Miller J.N. Surface antigens of the syphilis spirochete and their potential as virulence determinants. // Emerg. Infect. Dis., 1997, V. 3, p. 11-20.

46. Catteral R.D. Presidental address to the M.S.S.V.D.: systemic disease and the biological false-positive reaction. // Br. J. Vener. Dis., 1972, N 48, p. 1-12.

47. Chamberlain N.R., Brandt M.E., Erwin A.L., Radolf J.D., Norgard M.V. Major integral membrane protein immunogens of Treponema pallidum are proteolipids. // Infect. Immun., 1989, V. 57, p. 2872-2877.

48. Codd A.A., Sprott M.S., Narang H.K. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for Treponema pallidum antibodies. // J. Med. Microbiol., 1988, V. 26, p. 153-157.

49. Cunningham T.M., Walker E.M., Miller J.N., Lovett M.A. Selective release of the Treponema palidum outer membrane and associated polypeptides with Triton X-l 14. // J. Bacteriol., 1988, V. 170, p. 5789-5796.

50. Dallas W. S., Ray P.H., Leong J., Benedict C.D., Stamm L. V., Bassford P.J. Identification and purification of a recombinant Treponema pallidum basic membrane protein antigen expressed in Escherichia coli. // Infect. Immun., 1987, V. 55, p. 1106-1115.

51. Database GeneBank. rel.96. 1996

52. Fehniger T.E., Walfield A.M., Cunningham T.M., Radolf J.D., Miller J.N., Lovett M.A. Purification and characterization of cloned protease-resistent Treponema pallidum-specific antigen. // Infect. Immun., 1984, V. 46, p. 598-607.

53. Fehniger T.E., Radolf J.D., Lovett M.A. Properties of an ordered ring structure formed by recombinant Treponema pallidum surface antigen 4D. // J. Bacteriol., 1986, V. 165, p. 732-739.

54. Farshy C.E., Hunter E.F., Hensel L.O., Larsen S.A. Four-step enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Treponema pallidum antibody. // J. Clin. Microbiol., 1985, V. 21, p. 387389.

55. Farshy C.E., Hunter E.F., Larsen S.A., Gerni E.N. Double-conjugate enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulins G and M against Treponema pallidum. // J. Clin. Microbiol., 1984, Y. 20, p. 1109-1113.

56. Fieldsteel O.H., Cox D.L., Moeckli R.A. Further studies on replication of virulent Treponema pallidum in tissue cultures of sflEp cells. // Infect. Immun., 1982, V. 35, p. 449-455.

57. Fräser C.M., Norris S.J., Weinstock C.M. Complete genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete. // Science, 1998, V. 281, p. 375-388.

58. Fujimura K., Ise N., Ueno E. et al. Reactiviti of recombinant Treponema pallidum (r-Tp) antigens with anti-Tp antibodies in human syphilitic sera evaluated by ELISA. // J. Clin. Lab. Anal., 1997, V 11, N 6, p. 315-322.

59. Gerber A., Krell S., Morenz J. Recombinant Treponema pallidum Antigens in Syphilis Serology. // Immunobiol. 1996-1997, V. 196, p. 535-549.

60. Gershoni J.M., Palade G.E. Protein blotting: principles and applications. // Anal. Biochem., 1983, V. 131, p. 95 — 137.

61. Hanff P.A., Fehniger T.E., Miller J. N., Lovett M.A. Humoral immune response in human syphilis to polipeptitdes of Treponema pallidum. // J. Immunol., 1982, V. 129, p. 1287-1291.

62. Hay P.E., Clarke J.R., Strugnell R.A. et al. Use of the polymerase chain reaction to detect DNA sequences specific to pathogenic treponemes in cerebrospinal fluid. // FEMS Microbiol. Lett., 1990, V. 68, p. 233-238.

63. Hay P.E., Clarke J.R., Taylor-Robinson D., Goldmeier D. Detection of treponemal DNA in the CSF of patients with syphilis and HIV infection using the polymerase chain reaction. // Genitour. Med. 1990, V. 66, p. 428-432.

64. Kraus S.J., Haserick J.R., Logan L.C., Bullard J.C. Atipical fluorescence in the fluorescent treponemal antibody-absorbtion (FTA-ABS) test related to dezoxyribonucleic acid (DNA) antibodies. // J. Immunol., 1971, V. 106, p. 1665-1669.

65. Kox D.L., Moockli R.A., Keoney K.M. Enumeration of Treponema pallidum cell cultivated in vitro by an Enzime-Linked Immunosorbent Assay. // Infect. Immun., 1984, V. 44, p. 103-106.

66. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970, V. 227, p. 680-685.

67. Larcen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of test for syphilis. // Clin. Microbiol. Rev., 1995, V. 8, p. 1-21.

68. Larcen S.A. Siphilis. // Clin. Lab. Med., 1989, V. 9, p. 545-557.

69. Lefevre J.C., Bertrand M.A., Bauriaud R. Evaluation of the Captia enzyme immunoassays for detection immunoglobulins G and M to Treponema pallidum in syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1990, V. 28, p. 1704-1707.

70. Liu Wei, Cai Rui-kang, Zhao qing-li. Clinical evaluation of western blot assay as specific test for syphilis. // World STD/AIDS Congress 1995, 19th-23rd March 1995, Singapore 1995, p.85.

71. Lukehart S.A., Baker-Zander S.A., Gubish E.R. Identification Treponema pallidum antigens: comparison with a nonpatogenic treponeme. // J. Immunol., 1982, V 129, p. 833-838.

72. Lukehart S.A., Baker-Zander S.A., Sell S. Characterization of the humoral immune response of the rabbit to antigens of Treponema pallidum after experimental infection and therapy. // Sex. Trans. Dis., 1986, V. 13, p. 9-15.

73. McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R. PCR. A Practical Approach. New York: "Oxford University Press", 1991.

74. Magnuson H.J., Rosenau B.J. The rate of development and degree of acquired immunity in experimental syphilis. // Am. J. Syph., 1948, V. 32, p. 418-436.

75. Magnuson H.J., Thomas E.W., Olansky S., Kaplan B.I., DeMello L., Cutler J.C. Inoculation syphilis in human volunteers. // Medicine, 1956, V. 35, p. 33.

76. Marchito K.S., Jones S.A., Schell R.F., Holmans P.L., Norgard M.V. Monoclonal antibody analisis of specific antigenic similarities among pathogenic Treponema pallidum subspecies. // Infect. Immun., 1984, V. 45, p. 660-666.

77. Marchito K. S., Selland-Grossing C.K., Norgard M.V. Molecular speciflties of monoclonal antibodies directed against virulent Treponema pallidum. // Infect. Immun., 1986, V. 51, p. 168-176.

78. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.,1977, V. 74, p. 560-564

79. Meyer M.P., EddyT., Baughn R.E. Analysis of western blotting (immunoblotting) technique in diagnosis of congenital syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1994, V. 32, p. 629-633.

80. Miller J.N., De Bruijn J.H., Bekker J.H., Onvlee P.C. The antigenic structure of Treponema pallidum, Nichols strain. // J. Immunol., 1966, V. 96, p. 450-456.

81. Moskophidis M., Muller F. Molecular analysis of immunoglobulins M and G immune response to protein antigens of Treponema pallidum in human suphilis. // Infect. Immun., 1984, V. 43, p.127-132.

82. Moskophidis M., Muller F. Molecular characterization of glycoprotein antigens on surface of Treponema pallidum. Comparison with nonpathogenic Treponema phagedenis byotype Reiter. // Infect. Immun., 1984, V. 46, p. 867-869.

83. Norgard M.V. Clinical and diagnosis issues of acquired and congenital syphilis encompassed in the current syphilis epidemic. // Curr. Opin. Infect. Dis., 1993, V. 6, p. 9-16.

84. Norgard M.V., Chamberlain N.R., Swancutt M.A., Goldberg M.S. Cloning and expression of the major 47-kilodalton surface immunogen of Treponema pallidum in Escherichia coli. // Infect. Immun., 1986, V. 54, p. 500-506.

85. Norrander J., Kempe T., Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. // Gene. 1983, V. 26, p. 101-106.

86. Norris S.J. Sell S. Antigenic complexity of Treponema pallidum: antigenicity and surface localization of major polypeptides. // J. Immunol., 1984, V. 133, p. 2686-2692.

87. Pedersen N.S., Petersen C.S., Wejtorp M., Axelsen N.H. Serodiagnosis of syphilis by an enzime-linked immunosorbent assay for IgG antibodies against the Reiter treponema flagellum. // Scand. J. Immunol., 1982, V. 15, p. 341-348.

88. Pedersen N.S., Oram O., Mouritsen. Enzime-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to veneral disease research laboratory (VDRL) antigen in syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1987, V. 25, p. 1711-1716.

89. Peterson K.M., Baseman J.B., Alderete J.F. Treponema pallidum receptor binding proteins interact with fibronectin. // J. Exp. Med., 1983, V. 157, p. 1958-1970.

90. Porcella S.F., Popova T.G., Hagman K.E., Penn C.W., Radolf J.D., Norgard M.Y. A mgl-like operon in Treponema pallidum, the syphilis spirochete. // Gene, 1996, V. 177, p. 115-21.

91. Purcell B.K., Chamberlain N.R., Golberg M.S., Andrews L.P., Robinson E.J., Norgard M.V., Radolf J.D. Molecular cloning and characterization of the 15-kilodalton major immunogen of Treponema pallidum. // Infect. Immun., 1989, V. 57, p. 3708-3714.

92. Purcell B.K., Swancutt M.A., Radolf J.D. Lipid modification of the 15- kilodalton major membrane immunogen of Treponema pallidum. // Mol. Microbiol. 1990, V. 4, p. 1371-1379.

93. Rockwell D.H. The tuskegle study of untreated syphilis; the 30th year of observation. // Arch. Intern. Med., 1964, V. 114, p. 792-798.

94. RodgersG.C., Laird W.J., Coates S.R., Mack D.H., Huston M., Sninsky J.J. Serological characterization and gene localisation of an Escherichia coli-expressed 37-kilodalton Treponema pallidum antigen. // Infect. Immun., 1986, V. 53, p. 16-25.

95. Roy W.S., Schenectedy N.Y. Serological test for syphilis. // U.S. Patent 4.288.426, Sep. 8, 1981.

96. Stamm L.V, Greene S.R, Bergen H.L, Hardham J.M, Barnes N.Y. Identification and sequence analysis of Treponema pallidum tprJ, a member of a polymorphic multigene family. // Microbiol. Lett., 1998, V. 169, p. 155-63.

97. Strungell R.A., Cockayne A., Penn C.W. Molecular and antigenic analysis of treponemes. // Crit. Rev. Microbiol., 1990, V. 17, p. 231-250.

98. Thornburg R.W., Baseman J.B. Comparison of major protein antigens and protein profiles of Treponema pallidum and Treponema pertenue. // Infect. Immun., 1983, V. 42, p. 623-627.

99. Veldkamp J., Visser A.V. Application of the enzime-linked immunosorbent assay (ELISA) in the serodiagnosis of syphilis. // Br. J. Vener. Dis., 1975, V. 51, p. 227-231.

100. Walfield A.M., Hanff P.A., Lovett M.A. Expression of Treponema pallidum antigens in E.coli. // Science, 1982, V. 216, p. 522-523.

101. Weigel L.M., Brandt M.E., Norgard M.V. Analisis of the N-terminal region of the 47— kilodalton integral membrane lipoprotein of Treponema pallidum. // Infect. Immun., 1992, V. 60, p. 1568-1576.

102. Wicher V., Zabec J., Wicher K. Phatogen-specific humoral response in Treponema Pallidum -infected humans, rabbits and guinea pigs. // Infect. Dis., 1991, V. 163, p. 830-836.

103. Wilcox R.R. Textbook of veneral diseases and treponematoses. London, 1964.

104. White T.J., Fuller S.A. Visu Well Reagin, a nontreponemal enzime-linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1989, V. 27, p. 2300-2304.

105. Yelton D.B., Limberger R.J., Curci K. et al. Treponema phagedenis encodes and expresses homologs of Treponema pallidum TmpA and TmpB proteins. // Infect. Immun., 1991,V. 59, p. 3685.

106. Young H., Moyes A., Seagar L., Mcmillan, A. Novel recombinant-antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1998, V. 36, p. 913917.

107. Young H., Moyes A., de Ste Croix I., McMillan A. A new recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis. // Int. J. STD. AIDS, 1998, V. 9, p. 196-200.

Информация о работе

Гражданцева, Антонина Анатольевна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2000
ВАК 03.00.23

Диссертация

Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы