Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серологические и иммунологические способы первичного и вторичного сифилиса

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Серологические и иммунологические способы первичного и вторичного сифилиса"

ПУНЧЕИКО Ольга Евгеньевна

На правах рукописи

ргз од

? 9 ЯНП ?пгц

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ ПЕРВИЧНОГО И ВТОРИЧНОГО СИФИЛИСА

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена в Государственном образовательном учрежден! высшего профессионального образования Санкг-Петербургскс медицинской академии последипломного образования Минздра) России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Кубась Валентин Григорьевич; доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Сиволодский Евгений Петрови доктор биологических наук, профессор Полевщиков Александр Витальевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учрежден высшего профессионального образования Санкт-Петербургск государственная педиатрическая медицинская академия Минздра России

Защита состоится « 20 » января 2003 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.086.03 в ГОУВПО Саш Петербургской государственной медицинской академии и И. И. Мечникова Минздрава России (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО Саш Петербургской государственной медицинской академии и И. И. Мечникова Минздрава России

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Бойцов А. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема заболеваний, передающихся половым путем, является в настоящее время весьма актуальной в мире и в особенности для России. Уровень заболеваемости сифилисом неуклонно растет: в 1995 г. зарегистрировано 177 больных на 100000 населения, что оказалось в 40 раз выше по сравнению с 1989 г., за последующие 6 месяцев 1996 г. он возрос еще на 60,1%. По данным некоторых исследователей, эпидемиологическая ситуация по сифилису будет ухудшаться, ожидается новое повышение уровня заболеваемости к 2005 году [Аковбян В. А. с соавт.,1995; Гришина A. JL с соавт., 2001; Привалова Н. К., 2000]. В Санкт - Петербурге, несмотря на стойкую тенденцию к снижению уровня заболеваемости с 1996 года, отмечен рост в 8 раз по сравнению с уровнем 1991 года, когда заболеваемость была минимальной. Обнадеживающими такие данные считать нельзя, так как они свидетельствуют скорее о плохой регистрации больных сифилисом в связи с их анонимным обследованием у частнопрактикующих врачей [Жолобов В. Е., 2002].

Поскольку большую роль в активном выявлении заболевания играют неспециализированные учреждения, в первую очередь должен быть очерчен круг высокочувствительных тестов для качественного серологического обследования. К сожалению, в настоящее время серологический индекс обследованных в стационарных условиях составляет всего лишь 12,5 %, при этом допускаются ошибки на всех этапах анализа и очень редко используются специфические тесты [Смирнова Т.А., 2003]. Большую тревогу вызывает увеличение доли больных скрытыми формами сифилиса и сифилиса со стертой клинической картиной в последние десятилетия [Брико Н.И. с соавт, 1999; Прохоренков В.И. с соавт., 2000], а также серорезистентность. Возможно, это связано с особенностями функционирования иммунной системы у больных сифилисом.

Все вышеизложенное свидетельствует о том, что, несмотря на широкое применение серологических реакций и иммунохими-ческого метода для диагностики сифилиса, остается неизученной

их чувствительность на самых ранних этапах заболевания, а также неясна роль Т-клеточных механизмов и провоспалительных цитокинов в развитии сифилитической инфекции.

Цель работы: Целью настоящей работы явились поиск и изучение наиболее чувствительных серологических и иммунологических методов для улучшения диагностики первичного и вторичного сифилиса.

Задачи исследования:

1. Провести исследование сывороток больных первичным сифилисом с помощью специфических серологических, иммуно-химических методов и классических серологических реакций.

2. Провести исследование сывороток больных вторичным сифилисом с помощью специфических серологических, иммуно-химических методов и классических серологических реакций.

3. Исследовать концентрацию в сыворотке Т-клеточных (ИЛ-4, у-ИФН) цитокинов у больных первичным и вторичным рецидивным сифилисом.

4. Исследовать концентрацию в сыворотке провоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-IRA, ИЛ-8) цитокинов у больных вторичным рецидивным сифилисом.

Научная новизна исследования. Впервые для более ранней диагностики первичного сифилиса у больных со сроком заболевания до 11 дней как наиболее чувствительные выбраны РПГА, РПА. Показано, что чувствительность специфических тестов стала одинаковой и приблизилась к 100%, начиная с 21-го дня заболевания. Показана низкая чувствительность неспецифических серологических реакций до 20-ти суток от начала заболевания, что является недостатком для реакций отбора. Впервые выявлено усиление активности как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета у больных первичным сифилисом со сроком заболевания до 20 дней. При вторичном рецидивном сифилисе показано преобладание гуморального звена иммунитета.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований определена степень приемлемости иммунохи-мического метода для диагностики различных стадий сифилиса, очерчен круг реакций отбора и подтверждающих реакций, опре-

делен перечень обязательных реакций и целесообразность использования ряда реакций (реакция Вассермана, РСК с антигенами сапрофитной трепонемы). Разработана таблица в помощь практикующим врачам по позитивации ряда реакций (ИФА, РПГА, РПА, РВк, РМП) при первичном сифилисе.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ИФА, РПА, РПГА, в отличие от КСР, обладают достоверно более высокой чувствительностью при диагностике сифилиса у больных с первичным сифилисом до 20-го дня от момента появления первичного аффекта.

2. ИФА с определением антитрепонемных ^С обладает достоверно более низкой чувствительностью по сравнению с РИФ-Абс, РПГА и РПА.

3. РИФ-Абс, обладающая практически 100% чувствительностью, начиная с первых дней заболевания, остается подтверждающей реакцией.

4. У больных вторичным рецидивным сифилисом со сроками заболевания 2-3 года усиливается влияние гуморального звена иммунитета по сравнению с первичным сифилисом до 20-ти дней от появления первичного аффекта.

Апробация и внедрение результатов работы. Основные положения диссертационного исследования доложены на 37 научно - практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт - Петербурга (21 мая 2002), на 3 8 городской научно- практической конференции врачей дерматовенерологов, педиатров и врачей смежных специальностей (15 апреля 2003), на Семинаре «Диагностика и лечение ИППП на основе принципов доказательной медицины (Москва, ГУНИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, 8 апреля 2003)на 7-ом Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (24 июня 2003). Результаты работы используются в процессе подготовки и переподготовки специалистов на кафедре микробиологии и микологии ГОУВПО СПбМАПО (акт о внедрении от 04.12.2003).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из глав, включа-

ющих введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные данные, заключение, выводы и практические рекомендации, а также список использованной литературы, содержащей 269 источника (в том числе 170 на иностранных языках). Работа иллюстрирована 14 таблицами и 9 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Объекты и объем исследования. Сыворотки больных первичным и вторичным сифилисом были предоставлены областным КВД. Диагноз сифилиса у больных был верифицирован по клиническим и лабораторным данным в стационаре областного кож-но - венерологического диспансера Ленинградской области (главный врач - заслуженный врач РФ Б. Н. Никифоров).

Для исследования динамики позитивации серологических и иммунохимических тестов обследовано всего 475 сыворотки (в том числе 293 сыворотки больных первичным и 182 сыворотки больных вторичным сифилисом). Для выбора наиболее чувствительных методов диагностики больные первичным сифилисом были разбиты на 3 группы в зависимости от времени от начала появления первичного аффекта (шанкр половых органов) - до 10 дней, 11-20 дней и 21-35 дней. Больные вторичным сифилисом были разбиты на 2 группы - сифилис на стадии первого высыпания и рецидивный. Распределение больных по полу при первичном и вторичном сифилисе было примерно одинаковым. Возраст больных составил от 15 до 69 лет.

Для исследования иммунитета было обследовано 52 сыворотки, в том числе 25 от больных первичным сифилисом со сроком заболевания до 20 дней и 27 от больных вторичным рецидивным сифилисом со сроком заболевания 2-3 года. Критерии отбора больных сифилисом были следующие: 1) возраст больных составил от 17 до 35 лет (известно, что при старении происходит повышение концентрации ИЛ-4 [Иванов Л. Н. с соавт., 1998]; 2) в

анамнезе отсутствовал прием наркотических и иммунотропных средств, у женщин исключался прием гормональных контрацептивов; 3)отсутствовали острые или хронические воспалительне заболевания в фазе обострения во время течения сифилиса, а также аутоиммунная патология; 4)исключался хронический алкоголизм; 5) не было приема антибиотиков во время течения люити-ческой инфекции. Больные по полу распределились следующим образом: при первичном сифилисе количество мужчин и женщин было примерно одинаковым, при вторичном-женщин в 2 раза больше. Возраст больных составил от 17 до 32 лет.

Методы исследования. Методы исследования включали РИФ - Абс, РПГА, РПА, ИФА, РП в микроварианте, PB с трепо-немным и кардиолипиновым антигенами, ИФА для определения цитокинов ИЛ-lß, ИЛ-IRA, ИЛ-4, ИЛ-8, у-ИФН в сыворотке.

РИФ - Абс проводилась по общепринятой методике (приказ МЗ РФ №87 от 26.03.2001 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»),

РПГА на основе эритроцитарного диагностикума разработана в НИИЭМ им. Пастера (Санкт - Петербург). Антигены, предназначенные для сенсибилизации обработанных танином эритроцитов, представляли собой белки с молекулярной массой 15, 17 и 47 кД, полученные с помощью генно - инженерной технологии с использованием культуры клеток Е. coli. Разведения диагностикума и сывороток готовили на свежеприготовленном физиологическом растворе (0,85% NaCl) с добавлением формалина (конечная концентрация 0,5%). Постановку осуществляли в планшетах со сферическим дном, при этом делали двухточечную раститровку -1:10 и 1:100. Реакцию читали через 20 минут при отсутствии спонтанной агглютинации эритроцитов в контроле. Положительными считали сыворотки, которые агглютинировали эритроциты в лунке с образованием кольца с просветом в центре, либо когда наблюдали ровный слой агглютинированных эритроцитов.

В РПА, разработанной японской фирмой Fujirebio INC, в качестве носителя использованы желатиновые частицы, сенсибилизированные антигенами Tr. pallidum (штамм Nichols). Конечное разведение образцов составило 1:40 и 1:80. Учет реакции прово-

дили после 2-х часов инкубации при комнатной температуре. Положительной считали реакцию, когда проагглютинированные частицы однородно покрывали дно лунки или образовывали большое кольцо с неровным внешним краем и периферийной агглютинацией.

Диагностикум для ИФА разработан в НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург) для определения IgG- антител к Tr. pallidum в сыворотке больных сифилисом. Это осуществляется за счет связывания антител с сорбированными рекомбинантными белками, которые соответствуют естественным антигенам возбудителя сифилиса. Образующиеся комплексы антиген- антитело обнаруживаются с помощью пероксидазного конъюгата на основе монокло-нальных антител к тяжелой цепи IgG человека по появлению желто- коричневого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора. Учет результатов проводили с помощью вертикального фотометра при длине волны 490 мкм.

РМП проводились с сывороткой по общепринятой методике. В качестве антигена использовали кардиолипин, стабилизированный холино - хлоридом. Положительной считали реакцию при выпадении хлопьев различной величины в лунках планшета.

Данные по реакции Вассермана и РСК с антигенами сапрофитной трепонемы предоставлены лабораторией областного КВД (зав. лабораторией — Дорофеева О. В.).

Количественное определение цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-IRA, ИЛ-4, ИЛ-8, у-ИФН проводилось на базе ГосНИИ особо чистых биопрепаратов с использованием ИФА по «сэндвич» - варианту.

Методы статистической обработки результатов. Определялись основные статистические характеристики: среднее, ошибка среднего, стандартное отклонение. Для оценки межгрупповых различий применялся критерий х2. При исследовании взаимосвязи между сроком заболевания и позитивации реакций проводился корреляционный анализ с вычислением коэффициента Пирсона (С). Проверка гипотез о равенстве двух средних производилась с помощью U теста Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05, в некоторых случаях - 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Динамика специфических реакций (РИФ-Абс, ИФА, РПГА, РПА) при первичном сифилисе в зависимости от сроков заболевания. РИФ-Абс при сроке заболевания до 10 дней оказалась поло-жительнойу 95 (98,9±1,1%) больных, в группе больных со сроком заболевания 11-20 дней положительно прореагировали 89 (100%) сыворотки больных. При сроке заболевания 21-35 дней также все 108 (100%) сывороток были положительными. РПГА в группе больных со сроком заболевания до 10 дней оказалась положительной у 82 (85,4±3,6%) больных. Сыворотки от больных со сроком заболевания 11-20 дней прореагировали положительно в РПГА у 87 (97,8±1,6%) больных. К исходу первичного сифилиса при сроке заболевания 21-35 дней положительными были 108 (100%) сывороток. РПА показала практически одинаковые результаты с РПГА: в первой группе со сроком заболевания до 10 дней положительными оказались 83 (86,4±3,5%) сыворотки, во второй группе со сроком заболевания 11-20 дней - 87 (97,8±1,6%) сыворотки и в третьей группе больных со сроком заболевания 21-35 дней положительно прореагировали 108 (100%) сывороток. Что касается ИФА, положительно прореагировавшие сыворотки уступали в количественном отношении таковым в РИФ-Абс, РПГА и РПА. Таким образом, количество положительных сывороток при сроке заболевания до 10 дней составило 68 (70,8±4,7%), при сроке 11-20 дней положительная реакция наблюдалась у 82 (92,1±2,9%) больных, в последней группе со сроком заболевания 21-35 дней положительно прореагировали 104 (96,3±1,8%) сыворотки.

При анализе полученных данных были выявлены следующие достоверные различия между вышеперечисленными реакциями. При сроке заболевания до 10 дней процент выявленных в РИФ-Абс сывороток оказался значительно выше, чем в ИФА (р<0,01), в РПГА (р<0,05) и РПА (р<0,05). ИФА также уступил РПГА в группе больных со сроком заболевания до 10 дней (р<0,05) и РПА (р<0,05). В группе больных со сроком заболевания 11-20 дней РИФ-Абс оказалась чувствительнее ИФА (р<0,05). В последней группе больных со сроком заболевания 21-35 дней достовер-

ные различия не были обнаружены. Только в одном случае (1,1% сывороток) при сроке заболевания до 10 дней РИФ-Абс оказалась отрицательной, но и все другие специфические тесты были также отрицательными. В этой же группе больных у 6 больных оказалась положительной только РИФ-Абс, у 64 больных положительными были все тесты. Положительные РИФ-Абс и агглютинаци-онные тесты зарегистрированы у 16 больных при отрицательном ИФА. У 4 больных ИФА оказалась положительной при отрицательных агглюнатиционных тестах: 2 сыворотки прореагировали положительно в РИФ-Абс и РПА, еще 2 - в РИФ-Абс и РПГА.

В группе больных со сроком заболевания 11-20 дней при 100% положительной РИФ-Абс у 6 больных только ИФА оказался отрицательным, у 1 больного отрицательными были ИФА и агглюти-национные тесты, еще у 1 больного только РПГА и РПА были отрицательными.

Динамика РСК с трепонемным антигеном при первичном сифилисе в зависимости от сроков заболевания. При определении чувствительности РВ с трепонемным антигеном у больных первичным сифилисом получены следующие результаты. До 10 дней заболевания этот тест оказался совершенно не чувствителен и не показал ни одного положительного результата. В группе со сроком заболевания 11-20 дней его чувствительность составила 10±3,2% (9 сывороток). Среди сывороток больных из третьей группы он выявил с положительным результатом 101 (93,5±2,4%) сыворотку. При сравнении его с РИФ-Абс, ИФА, РПГА и РПА видно, что он обладает достоверно гораздо более низкой чувствительностью; во второй группе больных со сроком заболевания 11-20 дней различия отмечаются между РВ с трепонемным антигеном и РИФ- Абс (р<0,01), РПГА (р<0,01), РПА (р<0,01), ИФА (р<0,01). Чувствительность его при сроке заболевания 21-35 дней хотя и приближается к чувствительности остальных тестов, но все же достоверно отличается от РПГА (р<0,01), РПА (р<0,01), РИФ -Абс (р<0,01).

Динамика КСР при первичном сифилисе в зависимости от сроков заболевания. РМП при сроке заболевания до 10 дней оказалась отрицательной во всех случаях, в группе больных со сро-

ком заболевания 11-20 дней положительно прореагировали 15 (16,8±4,0%) сыворотки. При сроке заболевания 21-35 дней у 95 (88,0±3,1%) больных тест был положительным. РВ с кардиолипи-новым антигеном в группе больных со сроком заболевания до 10 дней также оказалась совершенно не чувствительной и не выявила ни одной положительной сыворотки. Сыворотки от больных со сроком заболевания 11-20 дней прореагировали положительно в РВ с кардиолипином у 6 (6,7±2,7%) больных. К исходу первичного сифилиса при сроке заболевания 21-35 дней положительными были 96 (88,9±3,0%) сывороток. Достоверное различие в чувствительности было выявлено только во второй группе больных со сроком заболевания 11-20 дней (р<0,01) в пользу РМП, которая оказалась положительной у 16,8±4,0% больных по сравнению с 10±3,2% при РВ с кардиолипиновым антигеном.

Из полученных данных видно, что неспецифические серологические реакции, в особенности РВ с кардиолипиновым антигеном, мало чувствительны на ранних сроках заболевания до 20-го дня от момента появления первичного аффекта в силу того, что неспецифические для сифилиса кардиолипиновые антитела появляются на более поздних сроках заболевания.

По чувствительности классические серологические реакции как РМП, так и РВ с кардиолипиновым антигеном, значительно уступают всем изученным специфическим реакциям. При сроке заболевания до 10 дней РПГА оказалась положительной у 82 (85,4±3,6%) больных, РПА - у 83 (86,4±3,5%), ИФА - у 68 (70,8±4,7%), РМП и РВ с кардиолипиновым антигеном оказались не чувствительными и не выявили ни одного больного. У больных со сроком заболевания 11-20 дней положительно прореагировали в агглютинационных тестах по 87 (97,8±1,6%) сывороток, в ИФА - 82 (92,1±2,9%) сывороток, в РВ с кардиолипиновым антигеном-6 (6,7±2,7%), в РМП- 15 (16,8±4,0%) сывороток. В конце первичного сифилиса при сроке заболевания 21-35 дней агг-лютинационные тесты оказались положительными у 108 (100%) больных,ИФА-у 104 (96,3±1,8%), РМП-у95 (88,0±3,1%)больных, РВ с кардиолипином - у 96 (88,9±3,0%) больных. Отсюда следует, что в качестве реакции отбора классические серологичес-

кие реакции подлежат замене на одну из специфических или комбинацию специфических реакций.

(Данные о чувствительности специфических и классических серологических реакций при первичном сифилисе представлены в таблице 1.)

Динамика специфических реакций (РИФ-Абс, ИФА, РПГА, РПА) при вторичном сифилисе в зависимости от сроков заболевания. При вторичном сифилисе на стадии первого высыпания РИФ-Абс была положительной у 64 (100%) больных. РПА оказалась положительной также у 64 (100%) больных. Чувствительность РПГА оказалась несколько ниже - 63 (98,4±1,6%) выявленных положительных сывороток. Реакция ИФА оказалась положительной у 62 (96,9±2,2%) больных.

При рецидивном сифилисе РИФ-Абс осталась такой же высокочувствительной, как и на стадии первого высыпания - 100% положительных результатов. РПГА оказалась положительной у 115 (97,5±1,4%) больных. РПА показала такую же чувствительность, как и РПГА, и была положительной у 115 (97,5±1,4%) больных. ИФА выявила 114 (96,6±1,7%) положительных сывороток.

При вторичном сифилисе на стадии первого высыпания достоверных различий по чувствительности обнаружено не было.

При вторичном рецидивном сифилисе при сравнении ИФА и агглютинационных методов было выявлено, что в одном случае (0,83%) при отрицательной РПА ИФА был положительным, еще в одном случае (0,83%) только ИФА был отрицательным при положительных агглютинационных реакциях и в трех случаях (2,54%) были зафиксированы отрицательные ИФА и РПГА при положительной РПА. Таким образом, полного совпадения результатов агглютинационных тестов (РПА, РПГА) не наблюдается, хотя эти различия и носили единичный характер. Во всех этих случаях РИФ-Абс была положительной. Этот пример еще раз подтверждает, что на сегодняшний день РИФ-Абс остается референтной реакцией.

Динамика РВ с трепонемным антигеном при вторичном сифилисе. При вторичном сифилисе на стадии первого высыпания РВ с трепонемным антигеном была положительной у 61 (95,3±2,7%) больного.

Таблица 1

Чувствительность специфических и классических серологических реакций при первичном сифилисе

До 10 дней; всего 96 сывороток

РИФ-Абс ИФА РПГА РПА РВтреп РМП РВк

+ 95 68 82 83 0 0 0

% 98,9 ±1,1 70,8+ 4,7 85,4± 3,6 86,4± 3,5 0 0 0

11-20 дней; всего 89 сывороток

РИФ-Абс ИФА РПГА РПА РВтреп РМП РВк

+ 89 82 87 87 9 15 6

% 100 92,1 ±2,9 97,8 ±1,6 97,8 ±1,6 10,0 ±3,2 16,8±4,0 6,7±2,7

21 - 35 дней; всего 108 сывороток

РИФ-Абс ИФА РПГА РПА РВтреп РМП РВк

+ 108 104 108 108 101 95 96

% 100 96,3 ±1,8 100 100 93,5±2,0 88,5*3,1 88,9+3,0

При вторичном рецидивном сифилисе РВ с трепонемным антигеном выявила 113 (95,8±1,9%) положительных сывороток. Привто-ричном сифилисе достоверные различия были обнаружены с РИФ-Абс как у больных с первичными высыпаниями, так и с рецидивными (р<0,05).

Динамика КСР при вторичном сифилисе. При вторичном сифилисе на стадии первого высыпания РМП была положительна у 62 (96,2±2,4%) больных, при рецидивирующем положительна у 116 (98,3±1,2%) больных. Достоверных различий в чувствительности РМП при свежем и рецидивирующем сифилисе не обнаружено.

Несмотря на достаточно высокую чувствительность КСР, которая имела место у больных вторичным сифилисом (97,8%), она все же уступаеттрепонемным тестам (100%у РИФ- Абс, 98,4% у РПА). Однако при сравнении РМП с РВ с трепонемным антигеном видно, что РМП достоверно более чувствительна (р<0,05) и при вторичном сифилисе. (Результаты о чувствительности специфических и РМП при вторичном сифилисе отражены в таблице 2)

Таблица 2

Динамика специфических и классических реакций по срокам при вторичном сифилисе

Вторичный свежий - 64 сыворотки (1-е высыпание)

РИФ-Аб с И ФА РИГА РПА РМП РВтреп

+ 64 62 63 64 62 61

% 100% 96,9±2,2 98,4+1,6 100 96,2±2,4 95,3±2,7

Вторичный рецидивный -118 сывороток

РИФ-Аб с И ФА РИГА РПА РМП РВтреп

+ 118 114 115 115 116 113

% 100% 96,6±1,7 97,5+1,4 97,5±1,4 98,3+1,2 95,8±1,9

Из-за высокой чувствительности РИГА, РПА и ИФА по сравнению с КСР, эти специфические реакции наиболее приемлемы для целей отбора (скрининг больных) как при первичном сифилисе, так и при вторичном.

В данной работе использован набор для постановки ИФА с раздельным определением Ig класса G. Для повышения чувствительности ИФА на ранних сроках заболевания целесообразно одновременное определение антитрепонемных антител как IgG, так и IgM классов. Хотя следует отметить, что при вторичном рецидивном сифилисе чувствительность ИФА (96,6±1,4%) в использованном варианте достоверно не отличалась от чувствительности РИГА (97,5±1,4%) и РПА (97,5±1,4%).

Полученные данные ставят под сомнение использование РВ с трепонемным антигенном. Tr. phagedenis обладает всего четырьмя общими антигенами с Tr. pallidum, соответственно ответ на эти антигены в силу немногочисленности антигенной общности развивается медленнее, сравниваясь со специфическими только на 35-е сутки заболевания и несколько обгоняя РМП. Для ранних сроков заболевания до 20 дня в качестве реакции отбора тест крайне непригоден в силу низкой чувствительности. На поздних сроках он уступает по чувствительности другим специфическим реакциям (ИФА, РПГА, РПА) и особенно РИФ- Абс. С учетом всего вышеизложенного РСК с антигенами культуральной трепонемы (Тг. phagedenis) не пригодна в качестве отбора. Как известно из литературных данных, негативация этой реакции идет также длительно, как и прочие реакции. То есть в прогностических целях ее использование нецелесообразно. Поэтому возникает вопрос о дальнейшем использовании РВ с трепонемным антигеном в серологической диагностике сифилиса и для контроля излеченности.

Феномен прозоны при постановке РПА. При обследовании сывороток в РПА был выявлен эффект прозоны в 7 сыворотках. При этом 3 сыворотки были получены от больных вторичным сифилисом на стадии первого высыпания, 4 - от больных с рецидивирующим сифилисом (более 3 высыпаний). В начальном разведении 1:80 реакция показала сомнительный результат - частицы сконцентрировались в форме компактного кольца с гладким

круглым внешним краем. Так как все остальные специфические реакции (РИФ-Абс, РПГА, ИФА) были в этих случаях положительными, то сомнительно прореагировавшие сыворотки переставили в конечном разведении от 1:20 до 1:1280. В дальнейшем образцы сывороток, раститрованные от 1:160 до 1:1280 показали положительный результат - четкое большое кольцо с неровным внешним краем и периферийной агглютинацией.

Исследование цитокинового статуса у больных первичным и вторичным сифилисом.

1) Динамика уровня уИФН у больных первичным и вторичным сифилисом.

У больных первичным сифилисом со сроком заболевания до 20 суток от момента появления первичного аффекта концентрация уИФН в сыворотке составила 159,0±13,26 пкг/мл. У больных со сроком заболевания 2-3 года (вторичный рецидивный сифилис) выявлено достоверное снижение концентрации до 98,00±7,44пкг/ мл (р< 0,05).

Снижение концентрации уИФН может свидетельствовать о падении его продукции и как следствие, об иммунном дисбалансе у больных сифилисом со сроком заболевания 2-3 года. Можно сделать предположение, что у больных из данной группы идет угнетение системы противоинфекционной защиты и снижены процессы репарации поврежденных органов и тканей.

2) Динамика уровня ИЛ-1Р у больных первичным и вторичным сифилисом.

У больных первичным сифилисом со сроком заболевания до 20 суток от момента появления первичного аффекта концентрация ИЛ-1Р в сыворотке составила 0 пкг/мл. У больных со сроком заболевания 2-3 года (вторичный рецидивный сифилис) выявлено увеличение концентрации до 1,34±0Д6 пкг/мл.

Повышение уровня ИЛ-10 является очень значимым при инфекционных заболеваниях, при этом острота процесса коррелирует с уровнем его продукции. Зная особенности течения сифилитической инфекции, в частности отсутствие у больных острофазового ответа организма, выраженной лихорадки, можно объяс-

нить недостаточно высокую концентрацию ИЛ-1Р сыворотке больных сифилисом.

3) Динамика уровня ИЛ-IRA у больных первичным и вторичным сифилисом.

У больных первичным сифилисом со сроком заболевания до 20 суток от момента появления первичного аффекта концентрация ИЛ-IRA в сыворотке составила 265,45±7,06 пкг/мл. У больных со сроком заболевания 2-3 года (вторичный рецидивный сифилис) выявлено достоверное снижение концентрации до 207,96±6,52 пкг/мл (р< 0,05).

ИЛ-IRA является эндогенным ингибитором ИЛ-1 р и связывается с теми же рецепторами, что и ИЛ-ip, блокируя его действие. Полученные результаты о снижении концентрации циркулирующего ИЛ-1RA на фоне роста ИЛ-1 р могут говорить о возрастании роли ИЛ-1р.

4) Динамика уровня ИЛ-4 у больных первичным и вторичным сифилисом.

У больных первичным сифилисом со сроком заболевания до 20 суток от момента появления первичного аффекта концентрация ИЛ-4 в сыворотке составила 5,83±1,18 пкг/мл. У больных со сроком заболевания 2-3 года (вторичный рецидивный сифилис) выявлено достоверное увеличение концентрации до 20,15±2,60 пкг/мл (р< 0,05).

Главный эффект ИЛ-4 состоит в активации пролиферации В-лимфоцитов. Увеличение продукции ИЛ-4 говорит о системном ответе по Th2 типу.

5) Динамика уровня ИЛ-8 у больных первичным и вторичным сифилисом.

У больных первичным сифилисом со сроком заболевания до 20 суток от момента появления первичного аффекта концентрация ИЛ-8 в сыворотке составила 16,25±1,84 пкг/мл. У больных со сроком заболевания 2-3 года (вторичный рецидивный сифилис) выявлено достоверное увеличение концентрации до 72,45±5,92 пкг/мл (р< 0,05).

Синтез ИЛ-8 происходит под воздействием других цитоки-нов, в том числе и ИЛ-1 р, поэтому увеличение в сыворотке после-

днего ведет к возрастанию концентрации и ИЛ-8. В организме он играет роль индуктора острой воспалительной реакции и вызывает массивную миграцию нейтрофильных лейкоцитов в очаг воспаления, принимая участие в регуляции хронического воспаления. (В сводной таблице 3 представлены обобщенные данные по концентрации в сыворотке уИФН, ИЛ-1(3, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-IRA у больных первичным и вторичным сифилисом.)

Была сделана попытка оценки уровней цитокинов в зависимости от клинической картины сифилиса. При первичном сифилисе в клинической картине в качестве единственного признака преобладал шанкр половых органов, всего 22 (88%) больных.

Таблица 3

Динамика уровней цитокинов у больных первичным и вторичным сифилисом.

СЩЕУИ ЗсбОПЕЕЕНИЯ Ц-ттскины (концштроуы в пкг/мг}

ИП-1 р ИП-1Н\ ИЛ-4 ИЛ-8 у-ИФН

Пдвичньй офгис (ФСК зйзогшзнияд о 20 дна*) 0 265,45*7,06 5,83±0,59 16,25t 0,92 159,6+6,63

Вторя-ньм рщцгувньй сифипс (ФСК зйхгаэния 2-Згодз) 1,34± Q08 207,96 ±6,52 2Q15t1,3 72,4£±2,96 96,ШЗ,7

У 3 (12%) больных шанкр сопровождался генерализованной лим-фаденопатией с вовлечением в патологический процесс паховых, подмышечных и подчелюстных лимфоузлов. Из литературных источников известно, что генерализованная лимфаденопатия регистрируется у некоторых больных первичнымсифилисом [Цин-зерлинг А. В., 1993]. Возможно, это связано с тем, что наряду с продвижением по лимфатической системе бледная трепонема уже в первые дни после заражения проникает в кровеносную систему и разносится по всем органам и тканям. При вторичном сифилисе больные были поделены на 2 группы в зависимости от количества сифилидов: у 19 (70,37%) человек элементы сыпи были малочисленны, преимущественно с локализацией в области ладоней и подошв, у 8 (29,63%) больных зафиксированы множественные распространенные высыпания с локализацией на коже туловища, половых органах, слизистых оболочках.

Для уИФН зависимость концентрации в сыворотке от клинической картины была выявлена как для первичного, так и для вторичного рецидивного сифилиса. При первичном сифилисе твердому шанкру соответствовала концентрация этого цитокина от 160 пкг/мл до 602 пкг/мл (среднее значение 257,34±10,91 пкг/мл). При развитии генерализованной лимфаденопатии концентрация цитокина была от 40 пкг/мл до 140 пкг/мл (среднее значение 55,92±9,64 пкг/мл). При вторичном рецидивном сифилисе множественным высыпаниям соответствовала концентрация уИФН от 170 до 440 пкг/мл (среднее значение 245,40±20,09 пкг/мл). Если высыпания были единичными, то в этом случае концентрация регистрировалась от 40 до 120 пкг/мл (среднее значение 64,37±13,33 пкг/мл).

Для ИЛ-4 зависимость обнаружена только при первичном сифилисе. Низкая концентрация от 0 до 10 пкг/мл (среднее значение 0,53±0,38 пкг/мл) выявлена при преобладании в клинической картине твердого шанкра. При генерализованной лимфаденопатии концентрация цитокина была от 20 до 56 пкг/мл (среднее значение 32,50±3,00 пкг/мл).

Также только при первичном сифилисе выявлена зависимость концентрации ИЛ-8 от клинических проявлений заболевания. Так

при наличии первичного аффекта концентрация ИЛ-8 составила от 0 пкг/мл до 32 пкг/мл (среднее значение 12,07±1,29 пкг/мл). Если у больного развивалась генерализованная лимфаденопатия, то в этом случае концентрация была 52,00±6Д5 пкг/мл.

Для остальных интерлейкинов - ИЛ-1 (3 и ИЛ- 1ИА-никакой зависимости между их концентрацией и клинической картиной ни при первичном, ни при вторичном рецидивном сифилисе обнаружено не было.

ВЫВОДЫ

1. Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности иммуноферментного анализа, реакции пассивной агглютинации и реакции пассивной гемагглютинации на самых ранних стадиях развития инфекции (до 10 суток); при этом агглюти-национные тесты обладают большей чувствительностью по сравнению с иммуноферментным анализом.

2. На более поздних сроках первичного сифилиса (21-35 суток) чувствительность иммуноферментного анализа, реакции пассивной агглютинации и реакции пассивной гемагглютинации составила 96, 100 и 100% соответственно.

3. Чувствительность реакции иммунофлюоресценции с абсорбцией превосходила по этому показателю все трепонемные тесты на всех сроках сифилитической инфекции.

4. Классические серологические реакции, в особенности реакция Вассермана с кардиолипиновым антигеном, мало чувствительны на ранних сроках заболевания (до 20 суток), что является большим недостатком для использования их в качестве реакций отбора.

5. На ранних сроках первичного сифилиса (до 20 суток) отмечается увеличение уровней провоспалительных и Т-клеточных цитокинов.

6. При вторичном рецидивном сифилисе преобладает гуморальное звено иммунитета, о чем свидетельствует увеличение уровня интерлейкина-4 и уменьшение концентрации у интерферона на фоне выраженного антителогенеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для более полного выявления больных первичным сифилисом целесообразно использовать высоко чувствительные реакции ИФА и агглютинационные тесты, более широкое внедрение их в практику первичного обследования населения и донорской крови на сифилис может значительно повысить уровень выявляемое™ больных и тем самым способствовать снижению темпов роста заболеваемости.

2. Для постановки РИФ-Абс необходимо использовать в качестве антигена свежеприготовленную, но не замороженную взвесь Tr.pallidum; просматривать не менее 10 полей зрения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кубась В. Г., Пунченко О. Е. Лабораторная диагностика сифилиса // Сборник материалов 35-ой научно-практической конференции «Эколого-эпидемиологическая экспертиза здоровья населения - основа рациональной профилактики болезней» под ред. А. П. Щербо и С. С. Першина.-СПб.:МАПО, 2002.-С.125-129.

2. Пунченко О. Е. Специфические и классические реакции при первичном сифилисе // Сборник материалов 37-ой научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии и репродуктивное здоровье населения».-СПб., 2002.-С.25-26.

3. Пунченко О. Е. Специфические серологические реакции в диагностике первичного и вторичного сифилиса // Сборник материалов 36-ой научной конференции «Медико-биологические проблемы химической безопасности» под ред. А. П. Щербо и В. В. Шилова.-СПб.:МАПО, 2003.-С.78-79.

4. Кубась В. Г., Пунченко О. Е. Иммунный ответ при вторичном сифилисе // Сборник материалов 3 8-ой городской научно-практической конференции врачей дерматовенерологов, педиатров и

врачей смежных специальностей «Актуальные проблемы дерматовенерологии (роль интегральных смежных специальностей».-СПб., 2003.-С.30-31.

5. Пунченко О. Б., Котов А. Ю., Синева С. А. Изучение уровней цитокинов у больных сифилисом // Медицинская иммунология.- 2003.-Т.5.-№3-4.-С.318.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ Интерлейкин

ИЛ-IRA Рецепторный антагонист интерлейкина-1

ИППП Инфекции, передающиеся половым путем

ИФА Иммуноферментный анализ

ИФН Интерферон

КСР Классические серологические реакции

РВк Реакция Вассермана с кардиолипиновым антигеном

РВт Реакция Вассермана с трепронемным антигеном РИФ-Абс Реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией

РМП Реакция микропреципитации

РПА Реакция пассивной агглютинации

РПГА Реакция пассивной гемагглютинации

Ig Иммуноглобулин