Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса"
На правахрукописи
ДЖАНАЕВ Вячеслав Феликсович
РАЗРАБОТКА СУСПЕНЗИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ
СИФИЛИСА
03.00.23-биотехнология 03.00.07-микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Ставрополь - 2004
Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор
Тюменцева Ирина Степановна доктор медицинских наук Базиков Игорь Александрович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук
Будыка Дмитрий Александрович
кандидат медицинских наук Алиева Елена Васильевна
Ведущая организация - Северо - Осетинская Государственная медицинская академия.
Защита диссертации состоится 22 декабря 2004 года в 13 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул.Пушкина,д. 1,корпус 2.,аудитори 506.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул.Пушкина, д.1, корпус 1.
Автореферат разослан 11 ноября 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
Т.Н. Джандарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Сифилис - болезнь оборотень, хамелеон, грозная с хроническим волнообразным течением, способная проявить себя множеством кожных симптомов, поражающая практически все органы и ткани, в глубоком смысле — нейроин-фекция, протекающая без особых ощущений для больного, который, находя массу отговорок и объяснений проявлениям её, не обращается к специалисту. Сифилис способен сбить с толку многих врачей не венерологов и требует к себе отношения по принципу - всякая сыпь на коже считается сифилисом,пока не доказано обратное. Необходимо отметить, что заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), и, в частности, сифилис, способствуют распространению такого смертельно опасного заболевания как ВИЧ-инфекция.
По статистике Минздрава РФ, в России в 2002 г. зарегистрировано 1,047 млн. случаев ЗППП, в том числе 207 тыс. 157 случаев заболевания сифилисом. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. За прошедший год зарегистрировано свыше 52 тыс. больных ЗППП в возрасте до 17 лет. У девочек до 14 лет показатель заболеваемости сифилисом по сравнению с 1990 г. возрос в 85 раз. Проведенный в 37 субъектах России анализ путей заражения сифилисом показал, что в 60 % случаев дети заразились половым путем. В таких условиях большое значение приобретает своевременная диагностика данного заболевания, основанная на высокочувствительных и высокоспецифичных реакциях. Особая роль при этом должна отводиться методам массового профилактического обследования населения (скрининга) с целью раннего выявления инфекции, что также диктует необходимость повышения требований к чувствительности и специфичности экспрессных тестов на сифилис (Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекгорский В.В., 1987; Дмитриев Г.А., 1996; Ткачев В.К., 1997; Сухова Л.П., Машеро В.В., Воинова Н.Н., 1999, Онищенко Г.Г., 2002; .ГоИотоп
P.S., Farnie M.A., 1994; Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolf A.H., 1995; Young H.,
В лабораторной практике используют комплекс серологических реакций (КСР), включающий отборочную реакцию
1998).
липиновым антигеном и стандартные серол
1КЦИЮ свя-
зывания комплемента (РСК) с кардиолипиновым и трепонемным антигенами. Кроме того, ставят специфические реакции - иммунофлуоресценции (РИФ) и её модификации (РИФ- абс, РИФ - 200), реакцию иммобилизации бледных трепо-нем (РИБТ), иммуноферментный анализ (ИФА). При этом не все вышеуказанные тесты равнозначны по чувствительности и специфичности из-за разных причин: использование неспецифического кардиолипинового антигена, наличия в исследуемом материале антител к общим антигенам спирохет, перекрестные реакции при других заболеваниях и определенных физиологических состояниях организма.
Поэтому в зоне внимания исследователей постоянно находятся проблемы совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики сифилиса с целью расширения арсенала диагностикумов и повышения их качества.
Цель и основные задачи исследования
Цель диссертационной работы - разработка биотехнологии получения новых эффективных специфичных трепонемных иммунопрепаратов и оценка их пригодности для использования в диагностике сифилиса.
Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:
- провести анализ заболеваемости и лабораторной диагностики сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания;
- получить высокоспецифичный полноценный комплексный трепонем-ный антиген для использования его при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП);
- разработать биотехнологию получения трепонемного антигенного диаг-ностикума на основе полимерной матрицы - латекса для экспресс-диагностики сифилиса в реакции агглютинации (РАЛ);
- разработать трепонемный суспензионный антигенный диагностикум с коллоидным серебром для дот-иммуноанализа (ДИА);
- провести лабораторные и клинические испытания разработанных тре-понемных иммунодиагностикумов.
Научная новизна работы
Впервые представлены данные об особенностях эпидемиологии сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания за последние пять лет. Методом эпидемиологического районирования определены тенденции распространения этой инфекции и причины высокой заболеваемости в отдельных районах Республи-
ки, которые выше многих территориальных показателей по Российской Федерации.
Разработана высокоэффективная схема получения комплексного трепо-немного антигена, который использован в качестве лиганда при конструировании иммунодиагностикумов.
Получен трепонемный суспензионный антигенный латексный диагности-кум, характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью.
Впервые осуществлена разработка биотехнологии получения трепонем-ного антигенного препарата да основе коллоидного серебра для ДИА.
Практическая значимость диссертации
Разработанные суспензионные антигенные трепонемные поли-акролеиновый диагностикум для РА и иммунодиагностикум с частицами золя коллоидного серебра для ДИА, как показали лабораторные и клинические испытания, обеспечивают высокую специфичность, чувствительность, и демонстративность при проведении иммуноанализов. Сочетание этих двух тестов позволяет серологически верифицировать сифилис практически у 100% пациентов и рекомендовать их применение в составе нового комплекса реакций на сифилис.
Результаты реакций учитывают визуально, вследствие чего отпадает нужда в дорогостоящем оборудовании. Простота и экономичность реакций, стабильность их компонентов позволяют осуществлять постановку тестов в лабораториях различного уровня. Это обусловливает их преимущества и особую ценность при проведении массовых скрининговых исследованиях на сифилис.
Материалы научных разработок легли в основу следующих методических документов:
1. Методические рекомендации «Получение и применение суспензионных трепонемных антигенных латексного диагностикума и иммунодиагно-стикума с коллоидным серебром для экспресс-анализа на сифилис», одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол № 8 от 30.09.2004) и утверждены директором СтавНИПЧИ.
2. Информационно-методическое письмо «Характеристика заболеваемости сифилисом с 1999 г. по 2003 г. в Республике Северная Осетия-Алания с учетом региональных особенностей. Совершенствование методов и мер по её снижению», утверждено ЦКМС СОГМА 10.11.2004 г.
Апробацияработы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на 8-й научной сессии сотрудников СОГМА «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (Владикавказ, 2001 г.), межлабораторной научной конференции СтавНИПЧИ (Ставрополь, 2004 г.).
Публикации
Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Она изложена на 125 страницах, содержит 13 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 165 отечественных и 82 зарубежных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
При выполнении работы были использованы штаммы культуральных бледных трепонем, представители трех иммунологических групп по классификации Р.Р.Гельтцера и Л.В. Зебницкой: I группа - IX штамм «Ставрополь»;
II группа - VII и VIII штаммы (штаммы выделены из крови больных вторичным активным сифилисом Л.И.Тутовой под руководством Р.Р.Гельтцера (1949, 1950);
III группа - V штамм «Казань», выделенный З.Х. Каримовой и Г.Г. Кондратьевым (1941); патогенные трепонемы - штамм Никольса и непатогенные трепоне-мы - T.phagedenis (штамм Рейтер).
Клинико-лабораторные исследования проводили с 686 сыворотками больных различными формами сифилиса и 237 - людей контрольной группы (беременные, доноры, больные гонореей, кожные, терапевтические, онкологические и инфекционные больные). Сыворотки крови больных сифилисом разделены по формам заболевания, а контрольной группы - по объединяющим признакам.
При анализе сложных для диагностики случаев с целью уточнения окончательного диагноза заболевания было изучено 65 историй болезней и амбулаторных карт больных сифилисом.
В работе применяли: Антиген трепонемный ультраозвученный сухой (УЗТА) - ФГУП «Аллерген», г.Ставрополь; антиген кардиолипиновый -«Биолек», г.Харьков, Украина; люис- РПГА-тест - «Ниармедик плюс», г.Москва; иммуноглобулины диагностические трепонемные люминесцирую-
щие - «Bio-Rad», Франция; тест-система диагностическая люис — антипаллидум для ИФА - «Бест», Новосибирск.
В работе использовали 10 здоровых кроликов породы "Шиншилла", весом 2,5-3 кг.
Количественное определение белка проводили по методу O.Waiburg и W.Christian (1941) сравнением поглощения белка при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989). Гельфильтрацию проводили на хроматографической установке «Minicoldlab» (LKB, Швеция).
Золь серебра готовили в соответствии с рекомендациями АГ.Полтавченко (1998).
Комплексирование частиц серебра с иммунным реагентом (антигеном) проводили по методикам I.Raska (1988), А.Г.Полтавченко (1998).
Лиофилизацию антигена, диагностических препаратов проводили в камере TG-5 (Германия). Жидкие препараты разливали в ампулы ШПВ-6 по 0,5-1 мл, замораживали в низкотемпературном столе типа NZ-280/75 при температуре минус (45±5) °С в течение 24 часов и лиофилизировали.
Экспериментальные данные были обработаны методами вариационной статистики, изложенными в работах П.И.Сызранцева (1938), И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева (1962), В.Ю. Урбах (1975).
Результаты исследования
1. Сифилис в Республике Северная Осетия-Алания
Республика Северная Осетия-Алания является регионом, где наряду с общероссийскими проблемами (увеличение числа социально неадаптированных лиц, более раннее начало половой жизни, рост проституции и др.), имеются и свои особенности, главными из которых являются высокая плотность населения, приближенность к "горячим точкам", наличие большого количества беженцев и вынужденных переселенцев, выраженность миграционных процессов.
Анализируя заболеваемость сифилисом в РСО - А по районам за пять лет, можно отметить, что она носит циклический характер, во всех районах и в г. Владикавказе наблюдается её нестабильность, со «взлётами» и «падениями». Так, подъем заболеваемости в 2003 г. (43,0 на 100 тыс.) произошёл за счёт увеличения случаев сифилиса в Пригородном (в 2 раза), Ардонском (в 2,5 раза), Кировском (более чем в 3 раза) и Алагирском (почти в 5 раз) районах. В других
районах Республики и в г. Владикавказе наблюдалось некоторое снижение заболеваемости.
С 1999 г. по 2003 г. стало заметно изменение удельного веса различных форм сифилиса в сторону увеличения раннего (с 43,5% до 56,0%), появления позднего скрытого сифилиса (5,8%) и врожденного сифилиса (1,7%). С 2001 г. отмечены случаи нейросифилиса. В структуре заболеваемости превалируют скрытые формы сифилиса, которые характеризуются полным отсутствием симптоматики и выявляются только по положительным серологическим реакциям при обследовании крови в поликлиниках, стационарах, при устройстве на работу и различных профилактических осмотрах.
Основную массу больных сифилисом составляют лица обоих полов в возрасте от 20 до 39 лет. Однако в последнее время отмечается тенденция к увеличению удельного веса лиц в возрасте свыше 40 лет. По семейному положению основную массу больных составляют лица разведённые (5%), состоящие в браке повторно (13,0%) и холостые (60%), т.е. семья является одним из сдерживающих факторов в предупреждении случайных половых связей. Анализ социального состава больных сифилисом показал, что основная масса больных (78,9%) представлена нигде не работающими лицами, что в значительной мере затрудняет проведение противоэпидемических мероприятий. Среди причин, влияющих на заболеваемость, необходимо отметить возросшую сексуальную активность подростков, увеличение числа вне- и добрачных половых связей вследствие возросшей сексуальной раскрепощённости населения, коммерциализацию интимных отношений, широкое распространение порнографии, наркомании и т.д.
Таким образом, анализ заболеваемости сифилисом в Республике Северная Осетия-Алания свидетельствует о высокой тенденции распространения этого заболевания. Это обусловливает необходимость разработки и интенсивного проведения противоэпидемических мероприятий как в неблагополучных районах, так и в целом по Республике. При этом лабораторные методы играют существенную роль в системе этих мероприятий.
В централизованной лаборатории Северо-Осетинского кожновенерологи-ческого диспансера во исполнение приказа МЗ № 87 с 2001 г. для исследования на сифилис широко применяются: тест быстрых плазменных реагинов (RPR), метод иммуноферментного анализа (ИФА), как скрининговый, трепо-немные подтверждающие тесты - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволившие выявить
большее количество поздних форм сифилиса: в 2000 г. поздний скрытый сифилис был в 2-х, в 2002 г. - уже в 4-х случаях; в 2000 г. нейросифилис не обнаруживался, а в 2002 г. - уже диагностировали 7 случаев этой тяжёлой формы болезни. Необходимо отметить, что в 12,4% случаях при установлении диагноза раннего скрытого сифилиса и 50,0% - при нейросифилисе при отрицательной реакции Вассермана ИФА была резко положительной.
Дальнейшее расширение арсенала лабораторных методов, и особенно за счет экспрессных, с помощью которых возможно исследовать большое количество людей за короткий промежуток времени и получить достоверную информацию о сложившейся ситуации по этой инфекции , дает возможность принимать оперативные меры в борьбе с заболеваемостью сифилисом.
2. Получение трепонемного суспензионного антигенного диагностикума для РАЛ
Нами разработана биотехнология приготовления трепонемного суспензионного антигенного диагностикума для реакции агглютинации и дана оценка его диагностической ценности. Изготовление препарата осуществляли в соответствии с методикой, разработанной И.А.Базиковым (2000) в нашей модификации, используя в качестве полимерной матрицы акролар К, полученный из института биоорганической химии им. Шемякина. Гомогенные частицы латекса правильной сферической формы, окрашенные в розовый цвет, имели средний диаметр (1,2±0,1) мкм.
Лигандом служил комплексный антиген, полученный по разработанной нами биотехнологической схеме, состоящий из коммерческого ультраозвучен-ного трепонемного антигена (УЗТА) для РСК производства ФГУП «Аллерген» (г.Ставрополь), подверженного специальной очистке, и цетавлонового суперна-танта, представляющего собой поверхностные антигены трепонем, изолированные нами по методике M.C.Blake, E.C.Goschliech (1982), в соотношении 2:1. Коммерческий антиген и поверхностные антигены извлекали из культураль-ных бледных трепонем штаммов V, VI, VII, VIII, IX и Рейтера.
УЗТА предварительно подвергали очистке , которая заключалась в им-муносорбции неспецифических антигенов, переосаждении сульфатом аммония, гельфильтрации, стабилизации методом сублимации.
Для извлечения поверхностных антигенов использовали цетавлон, позволяющий изолировать полимерный комплекс, включающий липид, полисахарид в сочетании с протеинами и нуклеиновыми кислотами. Комплексный антиген явился в дальнейшем высококачественным сырьем при конструировании
препаратов для иммунодиагностики сифилиса (рисунок 1).
Нами получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе по-лиакролеиновой матрицы. При этом отработаны оптимальные условия сенсибилизации латексных микросфер комплексным трепонемным антигеном: 0,20 мг лиганда соединяли с 2 мл с 2 % полимерного носителя. К смеси добавляли 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида, рН 7,2. Сенсибилизацию проводили в течение 3 ч при температуре 22 °С на магнитной мешалке. Далее суспензию осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 3-4 мин и дважды отмывали от несвязавшегося антигена. Для стабилизации трепонемного полимерного латексного диагностикума отработан оптимальный режим его лиофильного высушивания (рисунок 2).
По вышеописанной технологии изготовлено 10 серий диагностикума. Оценка их диагностической ценности проводилась на базе централизованной лаборатории Северо-Осетинского РКВД . Для исследования были взяты сыворотки крови 416 стационарных больных до лечения и после лечения с различными диагнозами: сифилис первичный серопозитивный; сифилис вторичный свежий, сифилис вторичный рецидивный, сифилис скрытый ранний, сифилис скрытый поздний, нейросифилис ранний в сравнении с КСР (микрореакция преципитации, реакции Вассермана , ИФА, РНГА, РИФ). Контрольной группой служили сыворотки крови 167 лиц, свободных от сифилитической инфекции.
При изучении чувствительности и специфичности диагностикума использовали два варианта постановки РАЛ: на стекле, как скрининг на сифилис (качественный тест), и титрование сывороток в микропланшетах (количественный тест). Для этого использовали 96-луночные микропланшеты для иммунологических реакций из полистирола отечественного и импортного производства.
На основании проведенных испытаний установлено, что изготовленный по разработанной нами технологии трепонемный суспензионный антигенный диагностикум позволяет проводить реакцию агглютинации латекса по чувствительности, сопоставимую с такими трепонемными тестами, как РПГА, ИФА, РИФ, в то же время РАЛ превосходит реакции Вассермана и МР по этому показателю. При сравнительном изучении специфичности РАЛ достоверно установлена его высокая специфичность (таблица 1).
Рисунок 1. Схема получения комплексного трепонемного антигена
Рисунок 2. Принципиальная технологическая схема изготовления суспензионного трепонемного диагностикума для РАЛ
3. Разработка трепонемного антигенного диагностикума с коллоидным серебром для ДИА
В последние годы в иммунодиагностике широко развиваются направления, связанные с иммунохроматографическими, иммунофильтрационными и так называемыми «дот-блот» методиками, в которых в качестве твердой фазы используют пористые мембраны, а в качестве маркера - ферменты, красители или золи металлов. В поисках доступных и дешевых каталитически активных металлов, способных выявляться «физическим проявлением», мы обратили внимание на коллоидное серебро. Золи серебра достаточно стандартны и легко воспроизводимы, а сконструированные с их участием тест-системы по чувствительности практически не уступают другим твердофазным методам.
Таблица 1. Чувствительность РАЛ с сыворотками крови больных сифилисом до лечения в сравнении с КСР
Реакции Сероло- Число сывороток крови
12 8 51 124 7/2* 6/2*
гические Сифилис пер- Сифилис Сифилис вто- Сифилис Сифилис Нейроснфнлнс
тесты вичный серопо- вторичный ричный реци- скрытый скрытый ранний
1ИТИВНЫЙ свежий дивный ранний ПОЗДНИЙ
1 2 3 4 5 6 7 8
РАЛ 4+ 12/10« 8/100,0 51/100,0 122/98,4 6/85,7 6/100,0
3+ - - - 2/1,61 1/14,0 _
2+ - - - -
1+ _ - - - _ _
МР 4+ 10/833 7/87,5 50/98 im тел 4/57,1 1/16,6
3+ 2/16,7 тгд 1/1,9 <0/8/06 1/14,0 -
2+ - - - 7/5,6 2/28.6 3/50,0
1+ — - - - - 2/333
РВ 4+ 11/91,6 7/87,5 51/100,0 110/88.7 - -
3+ 1/8,3 1/12,5 - 8/6,45 2/28,6 -
2+ - - 6/4,83 2/28^ 3/50,0
1+ - - - . 1/14,0 1/16,6
PI II'Л 4+ 12/100,0 8/100,0 51/100,0 -123/99J 7/100,0 6/100,0
3+ - - 1/0,8 - -
2+ - - - - - -
1+ - - - - -
ИФА 4+ 12/100,0 8/100,0 51/100,0 121/97,5 6/85,7 6/100
3+ - - 3/2,41 1/14,0 -
2+ - - - -
1+ - - —
РИФ 4+ 12/100,0 8/100,0 51/100,0 124/100,0 7/100 6/100,0
3+ - - - - -
2+ - - - -
1+ - - - -
Примечание-, числитель — положительные результаты; знаменатель - процентное соотношение; * знаменатель - отрицательные результаты в РВ
Нами отработаны методические подходы при конструировании диагно-стикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепонемного антигена для детекции в ДИА специфических антител.
Золь серебра получали восстановлением азотнокислого серебра боргид-ридом натрия. Для этого к 5 мл 0,05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливали равный объем 0,02% водного раствора азотнокислого серебра. Перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин. При конструировании диагностикума использовали комплексный трепонемный антиген.
Наиболее эффективно стабилизировал золь серебра антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя. Исходя из этого, для приготовления диагностикума к 1 мл антигена (375 мкг белка) при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 5 мл золя серебра. После 10-минутного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в раствор добавляли следующую порцию золя - 3 мл, а спустя 10 мин - еще 2 мл золя и 2 мл 10 % водного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) (для блокирования свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера). Через 30 мин перемешивания диагностикум стабилизировали внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 1 % БСА, 10% нормальной лошадиной сыворотки (НЛС) и 0,04% азида натрия. Приготовляемый препарат дополнительно интенсивно встряхивали в течение 30 минут, разливали в ампулы ШПВ-6 по 2 мл. Срок хранения диагностикума - 6 месяцев (рисунок 3).
Постановку реакции осуществляли традиционным для дот-иммуноанализа способом. Сыворотки крови разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,2 с 0,5% БСА в 200 раз и титровали путем двухкратного разведения до необходимой концентрации в планшете для иммунологических реакций. Каждое разведение сывороток наносили на твердофазный носитель в объеме 1 мкл в виде линейно расположенных точек. В качестве такового мы апробировали нитроцеллюлозные мембраны (НЦМ) для электрофореза «Bio-Rad», «Millipor», «Serva» и мембранные фильтры «Amicon», «Millipor», «Sinpor» и «Владипор» с различным размером пор, исходя из того, что прочность связывания ими антител и их сорбционная емкость может быть неоднозначна.
Проведенные испытания показали, что наименее пригодными оказались мембранные фильтры «Amicon», «Millipor» и «Владипор».Хорошими характе-
ристиками обладали НЦМ и мембранные фильтры «Smpor» (достаточная сорб-ционная емкость и прочность связывания наносимого материала).
После нанесения исследуемого материала (1 мкл) на мембрану мы испытали несколько режимов иммобилизации: 20,30,40 мин при (20±1) °С, 10,15,20 мин при 37 °С. Все режимы сорбции были приемлемы, для дальнейшей работы нами избран режим: 10 мин при 37 °С.
Мембрану после фиксации материала помещали в чашку Петри и однократно промывали ЗФР. Затем подложку заливали ЗФР, содержащим 1 % БСА, блокируя таким образом на ней свободные участки связывания в течение 1015 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания ЗФР мембрану помешали на 5-10 мин в раствор диагностикума, затем тщательно (трехкратно по 2-3 мин) промывали ЗФР и однократно - дистиллированной водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 5-8 мин.
_Т_
Консервация конъюгата (азидом натрия или др.). Розлив в ампулы, запайка., эти-кетировка, упаковка
Рисунок 3. Схема получения антигенного трепонемного иммунодиагно-стикума с частицами коллоидного серебра
Проявитель выбирали по проявляющему веществу: амидол, гидрохинон, глицин, метол, фенидон в разных сочетаниях. Всего нами было апробировано 14 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя. Результаты испытаний показали, что проявители, содержащие метол, развивали высокую оптическую плотность: исследуемые сыворотки крови, содержащие специфические антитела, проявлялись в виде серо-коричневых пятен различной интенсивности в зависимости от количественного содержания антител. В то же время остальные проявители давали светлые, малоконтрастные отложения. В связи с этим в экспериментах мы использовали проявитель, содержащий метол (рисунок 4).
1 • • • е
й • • •
3 Ш • о о _ .р....
^ • • о
$ • о
<5 • • о о
г • 9 о 0
в • О о
9 О О о
т • • • о о
к
Рисунок 4. Общий вид НЦМ с результатами ДИА
1-10- положительные результаты в сыворотках крови с
разным содержанием Am к - отрицательный контроль;
Используя сконструированный иммунодиагностикум, исследовано в ДИА с коллоидным серебром 215 проб сывороток крови больных различными формами сифилиса, 55 - обследуемых на сифилис. Контрольной группой служили сыворотки крови 70 лиц, свободных от сифилитической инфекции (рисунки 5, 6, таблица 2). Эти же сыворотки параллельно оценивались в МР. Результаты испытаний несомненно свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного диагностикума. Так, у 157 (73%) больных обнаруживались антитрепо-немные Ат в титрах 1:400, у 58 (27%) человек - 1:800, в то же время как из 215 больных, обследованных в МР, лишь у 165 (77,3 %) больных отмечен положи-
тельный результат. Из 44 обследуемых на сифилис у 40 (72%) титр сывороток в ДИА был равен 1:400, у 5 (9%) - 1:800, у 10 (18,2%) - отрицательный результат. Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном у 45,7% обследуемых (25 человек) была отрицательной. Специфичность иммунодиагно-стикума на основе коллоидного серебра подтверждена при исследовании
Рисунок 5. Результаты исследования сывороток крови 215 больных сифилисом
Рисунок 6. Результаты исследования сывороток крови 55 обследуемых лиц
Таблица 2. Сравнительное исследование сывороток крови людей на сифилис в ДИА и МР (выборочно )
Результаты исследования
№№ Ла сы- Диагноз ДИА
пп вороток разведения сывороток/ средний геометрический титр МР
1 2 3 4 5
1. 6 Сифилис вторичный свежий 1:400/8,62 2+
2. 12 Силифис первичный серопо-зитивныб 1:800/9,63 4+
3. 15 -«- 1:800/9,63 4+
4. 21 -«- 1:400/8,62 3+
5. 35 -«- 1:400/8,62 4+
6. 42 Сифилис вторичный рецидивный 1:400/8,62 4+
7. 50 -«- 1:400/8,62 Отр.
8. 57 -«- 1:400/8.62 2+
9. 64 Сифилис вторичный свежий 1:400/8.62 3+
10. 70 -«- 1:400/8.62 3+
11. 74 Отр. Отр.
12. 75 Сифилис первичный серопо-зитивный 1:800/9,63 3+
13. 92 -«- 1:400/8,62 3+
14. 101 -«- 1:800/9,63 4+
15. 109 Сифилис вторичный свежий 1:400/8,62 Огр.
16. 115 -«- 1:400/8,62 3+
17. 120 -«- 1:400/8,62 3+
18. 125 -«- 1:800/9,63 3+
19. 131 Сифилис вторичный рецидивный 1:400/8.62 3+
20. 135 1:400/8.62 4+
21. 145 1:800/9.63 4+
22. 159 -«- 1:800/9.63 3+
23. 172 Сифилис первичный серопо-зстивный 1:400/8,62 3+
24. 180 -«- 1:400/8,62 3+
25. 195 -«- 1:400/8,62 3+
26. 127 Сифилис вторичный свежий 1:800/9,63 4+
27. 200 1:400/8,62 Огр.
28. 210 -«- 1:400/8,62 3+
29. 212 Сифилис вторичный рецидивный 1:400/8,62 3+
30. 215 -«- 1:800/9,63 4+
31. 256 Обследованные 1:400/8.62 Отр.
32. 265 1:400/8.62 3+
33. 275 • 1:400/8.62 3+
34. 286 -«- 1.800/9,63 4+
35. 290 -«- 1:400/8,62 Отр.
70 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции.
Таким образом, нами сконструирован высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностикум для ДИА с использованием комплексного трепонемного антигена, меченного частицами коллоидного серебра. Этот тест, в сравнении с традиционными серологическими реакциями на сифилис, более чувствителен, экспрессен, экономичен и свидетельствует о перспективности использования ДИА со специфическим антигеном трепонем, меченным коллоидным серебром, в качестве экспрессного ультрамикрометода лабораторной диагностики сифилиса.
ВЫВОДЫ
1. Впервые представлен многолетний анализ заболеваемости сифилисом в Республике Северная Осетия-Алания, выявивший её высокий уровень и тенденцию к распространению в отдельных районах Республики, что диктует необходимость проведения массовых, скрининговых профилактических обследований населения с привлечением надежных экспрессных методов лабораторной диагностики.
2. Подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций, позволивший получить высокоспецифичный комплексный трепонемный полноценный антиген, явившийся высококачественным сырьем при конструировании препаратов для иммунодиагностики сифилиса.
3. Получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе по-лиакролеиновой матрицы и комплексного антигена, обеспечивающий высокую чувствительность, специфичность, демонстративность, воспроизводимость реакции агглютинации латекса.
4. Впервые отработаны методические подходы для конструирования диагностикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепо-немного антигена и детекции в ДИА специфических антител. ДИА пригоден для исследования на сифилис клинического материала, характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой выполнения, демонстративностью.
5. Лабораторные и клинические испытания разработанных суспензионных антигенных диагностикумов для РАЛ и дот- иммуноанализа показали по ряду параметров свое превосходство над традиционными серологическими реакциями и перспективность их использования в качестве скринирующих тестов на сифилис.
6. Сочетание РАЛ и дот-иммуноанализа позволяет серологически верифицировать сифилис практически у 100 % пациентов и рекомендовать их применение в составе нового комплекса реакций на сифилис.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Бетрозов В.Т., Беликова З.Ф., Сопоева М.А., Джанаев В.Ф. Состояние кишечного микроценоза у женщин с урогенитальным кандидозом // Материалы 8 научной сессии сотрудников СОГМА: Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины. - Владикавказ, 2001. - С. 270-272.
2. Базаев В.Л., Фидаров А.А., Тургиев М.С., Джанаев В.Ф., Губаев АШ. Аутрич среди женщин, занятых в сфере коммерческого секса в Республике Северная Осетия-Алания //Инфекции, передаваемые половым путем. -2002.-№4.-С. 23-25.
3. Джанаев В.Ф., Бетрозов В.Т., Албегонова Л.В., Губаев А.Ш., Кониева С.К. ИФА при приобретенном сифилисе // Материалы конференции, посвященной 10-летию кафедры дерматовенерологии и профилактики ВИЧ-инфекции факультета последипломного образования. Актульаные проблемы дерматовенерологии и клинической медицины. - Владикавказ, 2003. - С.35.
4. Джанаев В.Ф., Бетрозов В.Т., Албегонова Л.В., Губаев А.Ш. Диагностика некоторых ИППП в СОРКВД // Материалы конференции, посвященной 10-летию кафедры дерматовенерологии и профилактики ВИЧ-инфекции факультета последипломного образования. Актульаные проблемы дерматовенерологии и клинической медицины. - Владикавказ, 2003. - С.36.
5. Джанаев В.Ф. Характеристика заболеваемости сифилисом с 1999 г. по 2003 г. в Республике Северная Осетия-Алания с учетом региональных особенностей. Совершенствование методов и мер по её снижению //Ставрополь, 2004.-25 с.-Деп. в ВНТИЦ,№1412-В-2004.
6. Джанаев В.Ф. Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса. Сообщение 1. Трепонемный антигенный суспензионный диагностикум для реакции агглютинации латекса //Ставрополь, 2004. -23 с. -Деп. в ВНТИЦ,№1486-В-2004.
7. Джанаев В.Ф. Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса. Сообщение 2. Трепонемный антигенный диагностикум с коллоидным серебром для дот-иммуноанализа //Ставрополь, 2004.-14 с.-Деп. в ВНТИЦ,№1487-В-2004.
Печать офсетная. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Физ. печ. л. -1,3 Усл. печ. л. - 1,2 Заказ 555 Тираж-100 Отпечатано в цехе оперативной полиграфии краевого комитета государственной статистики г. Ставрополь, ул. Пушкина,4
»2365t
Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Джанаев, Вячеслав Феликсович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА
1.1. Эпидемиология сифилиса 10 1.2 Методы лабораторной диагностики сифилиса. 17 1.3. Использование коллоидного серебра в конструи- 28 ровании диагностических тест-систем.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу
2.2. Питательные среды.
2.3. Основные химические реактивы и сырье.
2.4. Аппаратное оснащение исследований.
2.5. Материалы, полученные из клиник.
2.6. МИБП и биологичесие препараты.
2.7. Лабораторные животные, использованные в опы- 37 тах.
2.8. Физико-химические и иммунологические методы
2.9. Сублимация МИБП.
2.10. Статистическая обработка материала.
Глава 3. СИФИЛИС В РЕСПУБЛИКЕ СЕВЕРНАЯ
ОСЕТИЯ-АЛАНИЯ.
Глава 4. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО СУСПЕНЗИОННОГО ДИАГНОСТИ-КУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА.
Глава 5. РАЗРАБОТКА ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА С КОЛЛОИДНЫМ СЕРЕБРОМ ДЛЯ ДОТ-ИММУНО-АНАЛИЗА
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса"
Сифилис - болезнь оборотень, хамелеон, грозная с хроническим волнообразным течением, способная проявить себя множеством кожных симптомов, поражающая практически все органы и ткани, в глубоком смысле - нейроинфекция, протекающая без особых ощущений для больного, который, находя массу отговорок и объяснений проявлениям её, не обращается к специалисту. Сифилис способен сбить с толку многих врачей не венерологов и требует к себе отношения по принципу - всякая сыпь на коже считается сифилисом,пока не доказано обратное. Необходимо отметить, что заболевания, передающиеся половым путем (3111Ш), и в частности сифилис, способствуют распространению такого смертельно опасного заболевания как ВИЧ-инфекция.
По статистике Минздрава РФ, в России в 2002 г. зарегистрировано 1,047 млн. случаев 3111111, в том числе 207 тыс. 157 случаев заболевания сифилисом. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. За прошедший год зарегистрировано свыше 52 тыс. больных 3111111 в возрасте до 17 лет. У девочек до 14 лет показатель заболеваемости сифилисом по сравнению с 1990 г. возрос в 85 раз. Проведенный в 37 субъектах России анализ путей заражения сифилисом показал, что в 60 % случаев дети заразились половым путем. В таких условиях большое значение приобретает своевременная диагностика данного заболевания, основанная на высокочувствительных и высокоспецифичных реакциях. Особая роль при этом должна отводиться методам массового профилактического обследования населения (скрининга) с целью раннего выявления инфекции, что также диктует необходимость повышения требований к чувствительности и специфичности экспрессных тестов на сифилис (Овчинников Н.М., Беднова, В.Н., Делекторский В.В., 1987; Дмитриев Г.А., 1996; Ткачев В.К., 1997; Сухова Л.П., Машеро В.В., Войнова H.H., 1999, Онищенко Г.Г.,2002; Jo-honson P.C., Farnie M.A., 1994; Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolf A.N., 1995; Young H., 1998).
В лабораторной практике используют комплекс серологических реакций (КСР), включающий отборочную реакцию микропреципитации (MP) с кардиолипиновым антигеном и стандартные серологические реакции -реакцию связывания комплемента (РСК) с кардиолипиновым и трепонем-ным антигенами. Кроме того, ставят специфические реакции - иммуноф-луоресценции (РИФ) и её модификации (РИФ- абс, РИФ - 200), реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), иммуноферментный анализ (ИФА). При этом не все вышеуказанные тесты равнозначны по чувствительности и специфичности из-за разных причин: использование неспецифического кардиолипинового антигена, наличия в исследуемом материале антител к общим антигенам спирохет, перекрестные реакции при других заболеваниях и определенных физиологических состояниях организма.
Поэтому в зоне внимания исследователей постоянно находятся проблемы совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики сифилиса с целью расширения арсенала диагностикумов и повышения их качества.
Цель и основные задачи исследования
Цель диссертационной работы - разработка биотехнологии получения новых эффективных специфичных трепонемных иммунпрепаратов и оценка их пригодности для использования в диагностике сифилиса.
Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:
- провести анализ заболеваемости и лабораторной диагностики сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания; получить высокоспецифичный полноценный комплексный трепонемный антиген для использования его при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП);
- разработать биотехнологию получения трепонемного антигенного диагностикума на основе полимерной матрицы - латекса для экспресс-диагностики сифилиса в реакции агглютинации (РАЛ);
- разработать трепонемный суспензионный антигенный диагности-кум с коллоидным серебром для дот-иммуноанализа (ДИА);
- провести лабораторные и клинические испытания разработанных трепонемных иммунодиагностикумов.
Научная новизна работы
Впервые представлены данные об особенностях эпидемиологии сифилиса в Республике Северная Осетия-Алания за последние пять лет. Методом эпидемиологического районирования определены тенденции распространения этой инфекции и причины высокой заболеваемости в отдельных районах Республики, которые выше многих территориальных показателей по Российской Федерации.
Разработана высокоэффективная схема получения комплексного трепонемного антигена, который использован в качестве лиганда при конструировании иммунодиагностикумов.
Получен трепонемный суспензионный антигенный латексный диаг-ностикум, характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью.
Впервые осуществлена разработка биотехнологии получения трепонемного антигенного препарата на основе коллоидного серебра для ДИА.
Практическая значимость диссертации
Разработанные суспензионные антигенные трепонемные поли-акролеиновый диагностику для РА и иммунодиагностикум с частицами золя коллоидного серебра для ДИА, как показали лабораторные и клинические испытания, обеспечивают высокую специфичность, чувствительность, и демонстративность при проведении иммуноанализов. Сочетание этих двух тестов позволяет серологически верифицировать сифилис практически у 100 % пациентов и рекомендовать их применение в составе нового комплекса реакций на сифилис.
Результаты реакций учитывают визуально, вследствие чего отпадает нужда в дорогостоящем оборудовании. Простота и экономичность реакций, стабильность их компонентов позволяют осуществлять постановку тестов в лабораториях различного уровня. Это обусловливает их преимущества и особую ценность при проведении массовых скрининговых исследованиях на сифилис.
Материалы научных разработок легли в основу следующих методических документов:
1. Методические рекомендации «Получение и применение суспензионных трепонемных антигенных латексного диагностикума и имму-нодиагностикума с коллоидным серебром для экспресс-анализа на сифилис», одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол № 8 от 30.09.2004) и утверждены директором СтавНИПЧИ.
2. Информационно-методическое письмо «Характеристика заболеваемости сифилисом с 1999 г. по 2003 г. в Республике Северная Осетия-Алания с учетом региональных особенностей. Совершенствование методов и мер по её снижению», утверждено ЦКМС СОГМА 10.11.2004 г.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на 8-й научной сессии сотрудников СОГМА «Актуальные проблемы теоретической и клинической медицины» (Владикавказ, 2001 г.), межлабораторной научной конференции СтавНИПЧИ (Ставрополь, 2004 г.). Публикации
Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Она изложена на 125 страницах, содержит 13 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 165 отечественных и 82 зарубежных источника.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Джанаев, Вячеслав Феликсович
ВЫВОДЫ
1. Впервые представлен многолетний анализ заболеваемости сифилисом в Республике Северная Осетия-Алания, выявивший её высокий уровень и тенденцию к распространению в отдельных районах Республики, что диктует необходимость проведения массовых, скрининговых профилактических обследований населения с привлечением надежных экспрессных методов лабораторной диагностики.
2. Подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций, позволивший получить высокоспецифичный комплексный трепонем-ный полноценный антиген, явившийся высококачественным сырьем при конструировании препаратов для иммунодиагностики сифилиса.
3. Получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе полиакролеиновой матрицы и комплексного антигена, обеспечивающий высокую чувствительность, специфичность, демонстративность, воспроизводимость реакции агглютинации латекса.
4. Впервые отработаны методические подходы для конструирования диагностикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепонемного антигена и детекции в ДИА специфических антител. ДИА пригоден для исследования на сифилис клинического материала, характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой выполнения, демонстративностью.
5. Лабораторные и клинические испытания разработанных суспензионных антигенных диагностикумов для РАЛ и дот- иммуноанализа показали по ряду параметров свое превосходство над традиционными серологическими реакциями и перспективность их использования в качестве скрини-рующих тестов на сифилис.
6. Сочетание РАЛ и дот-иммуноанализа позволяет серологически верифицировать сифилис практически у 100 % пациентов и рекомендовать их применение в составе нового комплекса реакций на сифилис.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В последнее время насчитывается более 20 инфекций, передаваемых половым путем, среди которых сифилис занимает значительное место. Заболеваемость сифилисом в России остается крайне высокой и составляет более 143 случаев на 100 тыс. населения. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза, причем её подъем имеет многие признаки эпидемии: преобладают в структуре свежие формы; происходит рост числа детей с врожденным и приобретенным бытовым сифилисом; появились территории с показателями заболеваемости, значительно превышающими статистические показатели по стране (Аковбян В.А., Про-хоренков В.И., Машкиляйсон A.JI. и др. 1995; Адаскевич В.П., 1999; Родионов А.Н., 2000).
Республика Северная Осетия-Алания является регионом, где наряду с общероссийскими проблемами (увеличение числа социально неадаптированных лиц, более раннее начало половой жизни, рост проституции и др.), имеются и свои особенности, главными из которых являются высокая плотность населения, приближенность к "горячим точкам", наличие большого количества беженцев и вынужденных переселенцев, выраженность миграционных процессов.
Анализируя заболеваемость сифилисом в PCO - А по районам за пять лет, можно отметить, что она носит циклический характер, во всех районах и в г. Владикавказе наблюдается её нестабильность, со «взлётами» и «падениями». Так, подъем заболеваемости в 2003 г. (43,0 на 100 тыс.) произошёл за счёт увеличения случаев сифилиса в Пригородном (в 2 раза), Ардонском (в 2,5 раза), Кировском (более чем в 3 раза) и Алагирском (почти в 5 раз) районах. В других районах Республики и в г. Владикавказе наблюдалось некоторое снижение заболеваемости.
С 1999 г. по 2003 г. стало заметно изменение удельного веса различных форм сифилиса в сторону увеличения раннего (с 43,5% до 56,0%), появления позднего скрытого сифилиса (5,8%) и врожденного сифилиса (1,7%). С 2001 г. отмечены случаи нейросифилиса. В структуре заболеваемости превалируют скрытые формы сифилиса, которые характеризуются полным отсутствием симптоматики и выявляются только по положительным серологическим реакциям при обследовании крови в поликлиниках, стационарах, при устройстве на работу и различных профилактических осмотрах.
Основную массу больных сифилисом составляют лица обоих полов в возрасте от 20 до 39 лет. Однако в последнее время отмечается тенденция к увеличению удельного веса лиц в возрасте свыше 40 лет. По семейному положению основную массу больных составляют лица разведённые (5%), состоящие в браке повторно (13,0%) и холостые (60%), т.е. семья является одним из сдерживающих факторов в предупреждении случайных половых связей. Анализ социального состава больных сифилисом показал, что основная масса больных (78,9%) представлена нигде не работающими лицами, что в значительной мере затрудняет проведение противоэпидемических мероприятий. Среди причин, влияющих на заболеваемость, необходимо отметить возросшую сексуальную активность подростков, увеличение числа вне- и добрачных половых связей вследствие возросшей сексуальной раскрепощённости населения, коммерциализацию интимных отношений, широкое распространение порнографии, наркомании и т.д.
Таким образом, анализ заболеваемости сифилисом в Республике Северная Осетия-Алания свидетельствует о высокой тенденции распространения этого заболевания. Это обусловливает необходимость разработки и интенсивного проведения противоэпидемических мероприятий как в неблагополучных районах, так и в целом по Республике. При этом лабораторные методы играют существенную роль в системе этих мероприятий.
В централизованной лаборатории Северо-Осетинского кожновенерологического диспансера во исполнение приказа МЗ № 87 с 2001 г. для исследования на сифилис широко применяются: тест быстрых плазменных реагинов (RPR), метод иммуноферментного анализа (ИФА), как скрининговый, трепо-немные подтверждающие тесты - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), позволившие выявить большее количество поздних форм сифилиса: в 2000 г. поздний скрытый сифилис был в 2-х, в 2002 г. - уже в 4-х случаях; в 2000 г. нейросифилис не обнаруживался, а в 2002 г. - уже диагностировали 7 случаев этой тяжёлой формы болезни. Необходимо отметить, что в 12,4% случаях при установлении диагноза раннего скрытого сифилиса и 50,0% - при нейросифилисе при отрицательной реакции Вассермана ИФА была резко положительной.
Дальнейшее расширение арсенала лабораторных методов, и особенно за счет экспрессных, с помощью которых возможно исследовать большое количество людей за короткий промежуток времени и получить достоверную информацию о сложившейся ситуации по этой инфекции , дает возможность принимать оперативные меры в борьбе с заболеваемостью сифилисом.
Нами разработана биотехнология приготовления трепонемного суспензионного антигенного диагностикума для реакции агглютинации и дана оценка его диагностической ценности. Изготовление препарата осуществляли в соответствии с методикой, разработанной И.А.Базиковым (2000), в нашей модификации, используя в качестве полимерной матрицы акролар К, полученный из института биоорганической химии им. Шемякина. Гомогенные частицы латекса правильной сферической формы, окрашенные в розовый цвет имели средний диаметр (1,2±0,1) мкм.
Лигандом служил комплексный антитиген, полученный по разработанной нами биотехнологической схеме, состоящий из коммерческого ульт-раозвученного трепонемного антигена (УЗТА) для РСК производства ФГУП «Аллерген» (г.Ставрополь), подверженного специальной очистке, и цетавло-нового супернатанта, представляющего собой поверхностные антигены трепонем, изолированные нами по методике M.C.Blake, E.C.Goschliech понем, изолированные нами по методике M.C.Blake, E.C.Goschliech (1982), в соотношении 2:1. Коммерческий антиген и поверхностные антигены извлекали из культуральных бледных трепонем штаммов V, VI, VII, VIII, IX и Рейтера.
УЗТА предварительно подвергали очистке , которая заключалась в иммуносорбции неспецифических антигенов, переосаждении сульфатом аммония, гельфильтрации, стабилизации методом сублимации.
Для извлечения поверхностных антигенов использовали цетавлон, позволяющий изолировать полимерный комплекс, включающий липид, полисахарид в сочетании с протеинами и нуклеиновыми кислотами. Комплексный антиген явился в дальнейшем высококачественным сырьем при конструировании препаратов для иммунодиагностики сифилиса.'
Нами получен трепонемный суспензионный диагностикум на основе полиакролеиновой матрицы, При этом отработаны оптимальные условия сенсибилизации латексных микросфер комплексным трепонемным антигеном: 0,20 мг лиганда соединяли с 2 мл с 2 % полимерного носителя. К смеси добавляли 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида, рН 7,2. Сенсибилизацию проводили в течение 3 ч при температуре 22 °С на магнитной мешалке. Далее суспензию осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 3-4 мин и дважды отмывали от несвязавшегося антигена. Для стабилизации трепо-немного полимерного латексного диагностикума отработан оптимальный режим его лиофильного высушивания.
По вышеописанной технологии изготовлено 10 серий диагностикума. Оценка их диагностической ценности проводилась на базе централизованной лаборатории Северо-Осетинского РКВД . Для исследования были взяты сыворотки крови 416 стационарных больных до лечения и после лечения с различными диагнозами: сифилис первичный серопозитивный; сифилис вторичный свежий, сифилис вторичный рецидивный, сифилис скрытый ранний, сифилис скрытый поздний, нейросифилис ранний в сравнении с
КСР (микрореакция преципитации, реакции Вассермана , ИФА, РИГА, РИФ). Контрольной группой служили сыворотки крови 167 лиц, свободных от сифилитической инфекции.
При изучении чувствительности и специфичности диагностикума использовали два варианта постановки РАЛ: на стекле, как скрининг на сифилис (качественный тест), и титрование сывороток в микропланшетах (количественный тест). Для этого использовали 96-луночные микропланшеты для иммунологических реакций из полистирола отечественного и импортного производства.
На основании проведенных испытаний установлено, что изготовленный по разработанной нами технологии трепонемный суспензионный антигенный диагностикум позволяет проводить реакцию агглютинации латекса, по чувствительности, сопоставимую с такими трепонемными тестами, как РПГА, ИФА, РИФ, в то же время РАЛ превосходит реакции Вассермана и МР по этому показателю. При сравнительном изучении специфичности РАЛ достоверно установлена его высокая специфичность.
В последние годы в иммунодиагностике широко развиваются направления, связанные с иммунохроматографическими, иммунофильтрационными и так называемыми «дот-блот» методиками, в которых в качестве твердой фазы используют пористые мембраны, а в качестве маркера - ферменты, красители или золи металлов. В поисках доступных и дешевых каталитически активных металлов, способных выявляться «физическим проявлением», мы обратили внимание на коллоидное серебро. Золи серебра достаточно стандартны и легко воспроизводимы, а сконструированные с их участием тест-системы по чувствительности практически не уступают другим твердофазным методам.
Нами отработаны методические подходы при конструировании диагностикума с применением коллоидного серебра в качестве маркера трепо-немного антигена для детекции в ДИА специфических антител.
Золь серебра получали восстановлением азотнокислого серебра бор-гидридом натрия. Для этого к 5 мл 0,05% водного раствора боргидрида натрия одномоментно приливали равный объем 0,02% водного раствора азотнокислого серебра. Перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 мин. При конструировании диагностикума использовали комплексный трепонемный антиген.
Наиболее эффективно стабилизировал золь серебра антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя. Исходя из этого, для приготовления диагностикума к 1 мл антигена (375 мкг белка) при постоянном интенсивном перемешивании добавляли 5 мл золя серебра. После 10-минутного перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре в раствор добавляли следующую порцию золя - 3 мл, а спустя 10 мин - еще 2 мл золя и 2 мл 10 % водного раствора БСА (для блокирования свободных сайтов связывания на поверхности частиц маркера). Через 30 мин перемешивания диагностикум стабилизировали внесением равного объема 0,02 М фосфатного буфера pH 7,2, содержащего 1 % БСА, 10% НЛС и 0,04% азида натрия. Приготовляемый препарат дополнительно интенсивно встряхивали в течение 30 минут, разливали в ампулы ШПВ-6 по 2 мл. Срок хранения диагностикума - 6 месяцев.
Постановку реакции осуществляли традиционным для дот-иммуно-анализа способом. Сыворотки крови разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) pH 7,2 с 0,5% БСА в 200 раз и титровали путем двухкратного разведения до необходимой концентрации в планшете для иммунологических реакций. Каждое разведение сывороток наносили на твердофазный носитель в объеме 1 мкл в виде линейно расположенных точек. В качестве такового мы апробировали НЦМ для электрофореза «Bio-Rad», «Mil-lipor», «Serva» и мембранные фильтры«Агшсоп», «Millipor», «Sinpor»H «Вла-дипор» с различным размером пор, исходя из того, что прочность связывания ими антител и их сорбционная емкость может быть неоднозначна.
Проведенные испытания показали, что наименее пригодными оказались мембранные фильтры «Аппсоп», «МлШрог» и «Владипор».Хорошими характеристиками обладали НЦМ и мембранные фильтры «Бтрог» (достаточная сорбционная емкость и прочность связывания наносимого материала).
После нанесения исследуемого материала (1 мкл) на мембрану мы испытали несколько режимов иммобилизации: 20,30,40 мин при (20±1) °С, 10,15,20 мин при 37 °С. Все режимы сорбции были приемлемы, для дальнейшей работы нами избран режим: 10 мин при 37 иС.
Мембрану после фиксации материала помещали в чашку Петри и однократно промывали ЗФР. Затем подложку заливали ЗФР, содержащим 1 % БСА, блокируя таким образом на ней свободные участки связывания в течение 10-15 мин при комнатной температуре. После двукратного промывания ЗФР мембрану помещали на 5-10 мин в раствор диагностикума, затем тщательно (трехкратно по 2-3 мин) промывали ЗФР и однократно - дистиллированной водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембраны в раствор проявителя на 5-8 мин.
Проявитель выбирали по проявляющему веществу: амидол, гидрохинон, глицин, метол, фенидон в разных сочетаниях. Всего нами было апробировано 14 составов проявителей для каталитического усиления сигнала серебряного золя. Результаты испытаний показали, что проявители, содержащие метол, развивали высокую оптическую плотность: исследуемые сыворотки крови, содержащие специфические антитела, проявлялись в виде серо-коричневых пятен различной интенсивности в зависимости от количественного содержания антител. В то же время остальные проявители давали светлые, малоконтрастные отложения. В связи с этим в экспериментах мы использовали проявитель, содержащий метол.
Используя сконструированный иммунодиагностикум, исследовано в ДИА с коллоидным серебром 215 проб сывороток крови больных различными формами сифилиса, 55 - обследуемых на сифилис. Контрольной группой служили сыворотки крови 70 лиц, свободных от сифилитической инфекции. Эти же сыворотки параллельно оценивались в МР. Результаты испытаний несомненно свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного диагностикума. Так, у 157 (73%) больных обнаруживались антитрепонемные Ат в титрах 1:400, у 58 (27%) человек - 1:800, в то же время как из 215 больных, обследованных в МР, лишь у 165 (77,3 %) больных отмечен положительный результат. Из 55 больных обследуемых на сифилис у 40 (72%) титр сывороток в ДИА был равен 1:400, у 5 (9%) - 1:800, у 10 (18,2%) - отрицательный результат. Реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном у 45,7% обследуемых (25 человек) была отрицательной. Специфичность иммунодиагностикума на основе коллоидного серебра подтверждена при исследовании 70 сывороток крови лиц, свободных от сифилитической инфекции.
Таким образом, нами сконструирован высокочувствительный и высокоспецифичный иммунодиагностикум для ДИА с использованием комплексного трепонемного антигена, меченного частицами коллоидного серебра. Этот тест, в сравнении с традиционными серологическими реакциями на сифилис, более чувствителен, экспрессен, экономичен и свидетельствует о перспективности использования ДИА со специфическим антигеном трепонем, меченным коллоидным серебром, в качестве экспрессного ультрамикроме-тода лабораторной диагностики сифилиса.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Джанаев, Вячеслав Феликсович, Ставрополь
1. Адаскевич В.П. Инфекции, передаваемые половым путем. Руководство для врачей. - М.: Мед. книга. - из-во НГМА: Н.Новгород, 1999. -С. 17-83.
2. Аковбян В.А., Прохоренков В.И., Машкилейсон А.Л. и др. Заболеваемость сифилисом в России: опыт истории, эпидемиогический анализ, прогнозы // Бюллетень ассоциации САНАМ «Инфекции, передаваемые половым путем». 1995. - № 4. - С.22-25.
3. Аковбян В. А., Резайкина А. В., Тихонова Л. И. Характеристика эпидемиологических закономерностей, определяющих распространение заболеваний, передаваемых половым путём в России // Вестн. дермато-венерол. 1998. -№1.- С. 4-6.
4. Акопова З.П. Роль реакции агглютинации в серодиагностике сифилиса // Вестн. дермато-венерол. 2000. - № 6. - С. 12-13.
5. Александров М. В., Пиратинская В. А., Соколовский В. В. Циклический характер заболеваемости сифилисом и неспецифическая резистентность микроорганизма// Вестн. дерматол. 1997. - № 3. - С. 48-51.
6. Аравийская Е. Р. Социально-психологические особенности и их взаимосвязи с рискованным сексуальным поведением больных с приобретённым сифилисом // Рос. журн. кожн. и венер. болезней 1999. - № 4. - С. 17-19.
7. Афанасьев E.H. Сравнительная характеристика антигенной структуры рода Brucella: Дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1983. - 173 с.
8. Афанасьев E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чумы, бруцеллез, сибирская язва. Дис. . д-ра мед. наук. - Ставрополь, 2000. - 307 с.
9. Афонин Л.В., Молочков В.А., Буеверов А.О. Гепатиты как причина серорезистентности при сифилисе и ложноположительных серореак-ций // Рос. журн. кожн. и венер. болезней 2003. - № 2. - С. 48-50.
10. Ашмарин И. П., Воробьев А. А., Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL, 1962. - 180 с.
11. Бабий А. В. Клинико-серологическая оценка модифицированного иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса: Дисс. .канд. мед. наук. М., 1990. - 127 с.
12. Базаев B.JI., Фидаров A.A., Тургиев М.С., Джанаев В.Ф., Губаев А.Ш. Аутрич среди женщин, занятых в сфере коммерческого секса в Республике Северная Осетия-Алания //Инфекции, передаваемые половым путем. 2002. - №4. - С. 23-25.
13. Базиков И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диагностики сифилиса. Дис. . д-ра мед. наук. - Ставрополь,2000. -200 с.
14. Бакулев A.JI. Колоколов О.В., Суворов А.П. Особенности сифилиса нервной системы // Вест. Дермато-венерол. 2002. - №4. - С.53-57.
15. Батыршин Р. Ф. Совершенствование организационных форм активного выявления больных сифилисом: Дисс. . канд. мед. наук. М.,1993. - 234 с.
16. Беднова В. Н. Реакция иммунофлюоресценции //Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путём. М., 1987. - С. 126-133.
17. Беднова В. Н., Дмитриев Г. А., Бабий А. В. и др. Новая тест-система иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса //Вестн. дерматол. 1995. - № 1. - С. 19-20.
18. Беднова В. Н., Дмитриев Г. А., Бабий А. В., Милонова Т. И. Новая тест-система ИФА на сифилис // Вестн. дерматол. 1994. - № 4. - С. 5151.
19. Беднова В. Н., Коляденко В. Г., Павлова Е. В. Новый сорбент для постановки РИФ-абс на сифилис // Вестн. дерматол. 1992. - № 6. - С. 37-39.
20. Беднова В. Н., Лосева О. К. Исторические аспекты серодиагностики сифилиса // Вестник дерматол. 1985. - № 2. - С. 14-20.
21. Вельская H.A., Митина B.C., Вейнблат В.И.Микрометод фракционирования и идентификации белков бактерий // Материалы СевероКавказской биохим. конф. Махачкала, 1970. - С.270-271.
22. Вельская H.A., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификации белков //Лаб. дело 1972. - № 10. - С.514-516.
23. Березин И.В., Угарова H.H., Киршенгольц Б.М. Метод очистки пероксидазы //Биохимия. 1975. - Т.40, №2. - С.297-301
24. Благовещенский В.А., Степанчук-Рудник Г.И., Жулина Л.В. Изучение химического состава водных экстрактов культур БЦЖ, подвергнутых обработке ультразвуком, и выделение из них растворимого антигена //Журн. микробиол. 1961. - № 3. - С. 17-22.
25. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. М., 1961. - С. 57-87.
26. Борисенко К. К., Беднова В. Н. Неспецифические положительные серологические реакции на сифилис. Количественные модификации современных серологических реакций // Методические рекомендации. .- МЗ СССР, ЦКВИ.-М., 1990.-20 с.
27. Бухарович А. М. Особенности эпидемиологии сифилиса у жителей сельской местности. // Актуальные вопросы бесплодн. браков, обусл. БППП: Тез. докл. респ. научно-практ. конф. дерм.-вен. и акуш.-гинек.1-2 дек.1989. Свердловск. - 1989. - С.14.
28. Вейнблат В.И., Каминский В.В., Орлова JI.C. Иммунодиск-электрофорез антигенов чумного микроба //Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып. ;(26). - С. 196-200.
29. Винокуров В.М. Химическое серебрение зеркал. -М., 1950.156с.
30. Волкославская В. Н. Заболеваемость сифилисом на Украине в XX веке (обзор литературы и собственные данные) // Врачебное дело. 1998. -№ 1. - С. 197-202.
31. Воробьёва 3. Г., Фокина Е. Н. Экспериментальные основы реакции латекс-агглютинации (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. 1992. - № 7-8. - С. 60-62.
32. Воробьева З.Г., Бурков А.Н., Блинова Т.В. Определение иммуноглобулинов класса М в реакции агглтинации латекса. // Клиническая и лабораторная диагностика 1999. № 5. - С. 54 - 56.
33. Гельтцер Р. Р. О культивировании патогенных спирохет // Анналы Мечниковского института. 1936. - Т. 4. - Вып.2. - С. 359-364.
34. Гельтцер Р. Р., Зебницкая JI. В. Сравнительное изучение антигенных свойств Казанских и Ставропольских штаммов чистых культур бледной спирохеты // Эпидемиология и микробиология: Сб. научн. тр. Ставрополь, 1950. - Вып. 2. - С. 80-84.
35. Гельтцер P.P., Тутова Л.И. Серологические свойства различных культур бледной спирохеты в опытах с сыворотками крови больных сифилисом //Ученые записки: сб. науч. Тр. Ставропольского мед. ин-та. Ставрополь, 1949. - Т.З. - С. 137-141.
36. Голубев Л.Г., Сажин Б.Е., Валашек Е.Р. Сушка в химико-фармацевтической промышленности. М., 1978. - С. 18-50.
37. Горелова О. В., Аковбян Н. А., Фидаров А. А. Сексуальное поведение подростков, больных ИППП // Вестник дерматол. 1999. - № 4. - С. 1920.
38. Гражданцева А. А., Сиволобова Г. Ф., Урманов И. X. Клонирование и экспрессия в E.coli основных антигенов Tr.pallidum и исследование их иммунохимических свойств // Иммунология. 1998. - № 4. - С. 17-20.
39. Гребенников В. А., Жаров Л. В., Ометов В. К. О легализации публичных домов // Вестн. дерматол. 1999. - № 2. - С. 14-15.
40. Гуревич Г. А., Кудрявцев A.A., Фихте Б. А. Инженерно-физические аспекты и феноменология процессов дезинтеграции микроорганизмов //Материалы Всесоюз. конф. по дезинтеграции микроорганизмов (2527 окт. 1972 г.). Пущино-на-Оке, 1972. - С. 15-51.
41. Джанаев В.Ф., Бетрозов В.Т., Албегонова Л.В., Губаев А.Ш. Диагностика некоторых ИЛИИ в СОРКВД // Там же. С.36.
42. Джанаев В.Ф. Характеристика заболеваемости сифилисом с 1999 г. по 2003 г. в Республике Северная Осетия-Алания с учетом региональных особенностей. Совершенствование методов и мер по её снижению //Ставрополь, 2004. 25 с. -Деп. в ВНТИЦ, №1412, В-2004.
43. Джанаев В.Ф. Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса. Сообщение 1. Трепонёмный антигенный суспензионный диагностикум для реакции агглютинации латекса //Ставрополь, 2004. 14 с. -Деп. в ВНТИЦ, №1487-В-2004.
44. Джанаев В.Ф. Разработка суспензионных препаратов для экспрессной иммунодиагностики сифилиса. Сообщение 2. Трепонемный антигенный диагностикум на основе коллоидного серебра для дот-иммуноанализа //Ставрополь, 2004. 14 с. -Деп. в ВНТИЦ, №1487-В-2004.
45. Джеймс X. Теория фотографического процесса /пер. с англ.- JL, 1980.-672 с.
46. Дмитриев Г. А. Тест-системы в лабораторной диагностике сифилиса // Вестн. дерматол. 1996. - № 6. - С. 34-37.
47. Дмитриев Г. А., Брагина Е. Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса // Вестник дерматол. 1996. - № 2,3. - С. 29-38.
48. Дмитриев Г.А., Галишников Ю.А., Зверева Н.С. Опыт применения иммуноферментного анализа для лаборатоной диагностики сифилиса //Вестн. дерматол. 2000. - № 1. - С. 6 - 8.
49. Дьяченко JI.A., Оловянников О.В. Количественная постановка микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном // Вестн. дерма-то-венерол. 1988. - № 12. - С. 44-46.
50. Ерёмин В.Ф., Барабонов Л.Ш., Гасич E.JI. и др. Серологическая и молекулярно-биологическая диагностика инфекций, передаваемых половым путем // Вестн. дермато-венерол. 2002. - № 2. - С. 22-29.
51. Ерохин Е. П. Метод пассивной агглютинации полимерных дисперсий для диагностики легионеллёза // ЖМЭИ. 1991. - № 11. - С. 41 -43.
52. Жарникова И.В. Стабилизация биологического сырья и диагностических препаратов методом лиофильного высушивания . Ставрополь,2003. 22 с. - Деп. в ВИНИТИ 26.12.2003. - №2288-В2003.
53. Жарникова И.В. Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей. Автореф. дис. . доктора биол. наук. - Ставрополь, 2004. - 39 с.
54. Загоскина Т.Ю., Калиновский A.M., Меринов С.П. и др. Дот-иммуноанализ с частицами коллоидного серебра в качестве специфического антигена для исследования сывороток крови людей на бруцеллез // Мед. па-разитол. 2002. - №2. - С.15-17.
55. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И., Голубинский Е.П. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител //ЖМЭИ. 2001. - № 3. -С.65-69.
56. Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Меринов С.П. и др. Современные подходы к конструированию диагностических тест-систем с использованием неорганических корпускулярных меток // Бюл. ВСНЦ СО РАМН.2004.-Т. 2, № 1. С. 176-180
57. Иванов О. J0L, Ломоносов К. М., Стенина М. А. Оценка иммунного статуса больных ранним сифилисом и его прогностическое значение для негативации серологических реакций // Рос. журн. кожн. и венер. болезней. -1998.-№6.- С. 47-51.
58. Ивашкин В.Т., Буеверов А.О. Аутоиммунные заболевания печени в практике клинициста // М,, 2001. С.8-22.
59. Калмыкова Г. Н. Некоторые эпидемиологические особенности распространения сифилиса в Ростове-на-Дону. // Вестн. дерматол. 1991. -№5. - С. 24-26.
60. Капкаев P.A., Проблемы БППП в условиях перехода к рыночной экономике //Новости дераматол и венерол. 1998. - № 3. - С.9-12.
61. Каральник Б.В., Денисова Т.Г., Кешилева З.Б. Антигенсвязы-вающие лимфоциты (АСА) и антитела в диагностике сифилиса //ИППП. -1999.-№5.-С.
62. Каримова 3. X., Кондратьев Т. Т. К вопросу о выделении бледной спирохеты чистой культуры из крови больного сифилисом человека // Мик-робиол., эпидемиол. и иммунунол. 1941. - № 7-8. - С. 99-102.
63. Карпенко В.В., Сачков В.И. Обезболивание животных в эксперименте . ~Методические рекомендации- М., 1985.-53 с.
64. Касторная М.Н. Конструирование диагностических препаратов для экспрессных методов лабораторной диагностики бруцеллеза и детекции его возбудителей //Дис. . канд. биол. наук. Ставрополь, 2003. - 180 с.
65. Ким Э. Г. Особенности иммуногенетики и иммуногенеза при сифилисе (клинико-экспериментальные условия): Дис. . докт. мед. наук. -Ташкент. 1992. - 282 с.
66. Киселёва Г. А., Беднова В. Н., Дмитриев Г. А. Постановка ИФА для серодиагностики сифилиса // Вестн. дерматол. 1998. - № 1. - С. 39-42.
67. Ковалёва JI. Н. Социально-эпидемиологическая и социально-психологическая характеристика, новый отборочный тест диагностики, совершенствование терапии заразных форм сифилиса у работников морского транспорта: Дис. . докт. мед. наук. -М., 1992. 220 с.
68. Короткий Н. Г., Маркин И. Я. Проблема серорезистентности при лечении сифилиса // Актуальные вопросы дерматологии и венерологии: Сб. тр. юбил. конф., посвящ. 5-летию каф. кож. и вен. болезней педиатр, фак. РГМУ (5-6 июня 1997) . М., 1997. - С. 45-46.
69. Короткий Н. Г., Чиненова Е. Г. Современные особенности течения врождённого сифилиса // Педиатрия. 1998. - № 3. - С. 61-64.
70. Котровский А. В. Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса: Дис. . канд. мед. наук. М., 1986. -195 с.
71. Котровский А. В., Беднова В. Н. Значение иммунных нарушений в патогенезе распространённых и тяжелопротекающих дерматомикозов и методы их терапевтической коррекции. М., 1982. - С. 167-170.
72. Красносельских Т. В. Определение спектра и соотношения анти-трепонемных антител в диагностике приобретённого сифилиса: Автор, дис. . канд. мед. наук. С.-Пб. - 1998. - С. 22.
73. Кривеня В.Я., Елигулашвили Р.К. Получение и исследование иммуноферментных комплексов //Вирусные гепатиты типов А и В. Рига, 1983. - С.110-115.
74. Крейнгольд С.У. Каталиметрия в анализе реактивов и веществ особой чистоты. -М., 1983. 190 с.
75. Крутских Е. С., Яцуха М. В., Шевченко А. А. Контроль сифилитической инфекции с помощью компьютерного моделирования // Вестн. дер-матол. 1998. -№ 1.-С. 18-20.
76. Кулагин В.И., Селисский Г.Ж., Богуш П.Г. и др. Проблема сифилиса центральной нервной системы // Вестн. дермато-венерол. 2003. - № 2. -С.63-66.
77. Куфлина С.А., Павлова Т.Н. Эвтаназия экспериментальных животных: Методические рекомендации по выведению животных из экспериментов. М., 1985. - 9 с.
78. Лабораторные работы и задачи по коллоидной химии /Под ред. Ю.С.Фролова. -М., 1986.-215 с.
79. Ломоносов К.М. Актуальное интервью. Глвое в диагностике и терапии сифилиса // Рос. журн. колен, и вен. болезней. 2002. - №5. - С.56-60.
80. Лосева О. К. Сексуальное поведение больных сифилисом (эпидемиологические и медико-социальные проблемы): Дис. . докт. мед. наук. -М., 1991.-280 с.
81. Лосева О. К., Бабкова И. Н. Изучение сексуального поведения мужчин и женщин, заболевших сифилисом (панельное исследование) //Вестн. дерматол. 1999. - № 1. - С. 43-45.
82. Лосева О. К., Доля О. В., Чиханатова А. Г. Трансфузионный сифилис // Новое в трансфузиологии. 1997. - № 18. - С. 55-58.
83. Лосева О. К., Нашхоев М. Р. Социальное происхождение, сексуальное поведение, потенциал в распространении инфекций, передающихся половым путём у женщин, представляющих платные сексуальные услуги //Вестн. дерматол. -1999. № 2. - С. 20-24.
84. Лосева O.K., Тактамышева Э.Ш. Штульман Д.Р. Современный нейросифилис: диагностика, лечение и тактика ведения больных // Рос. дурн. Кожн. вен. болезней. 1999. - №4. - С.39-44.
85. Лузан Н. В. Концепция первичной профилактики ИППП у несовершеннолетних // Вестн. дерматол. 1999. - № 4. - С. 16-18.
86. Лукин Ю. В. Бахарев В. Н., Заиченко А. С. и др. Полиакролеино-вые латексы: синтез, введение наполнителей и механизмы формирования. -Доклад АН СССР. 1985. - Т. 285. - № 1. - С. 159-161.
87. Лукин Ю. В. Синтез и исследование полимерных дисперсных систем для иммуноанализа: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1986. -17с.
88. Лукин Ю. В., Трифонов В. Д., Туркин С. И., Зубов В. П. Полиак-ролеиновые латексы в качестве иммунореагентов // Тр. МХТИ. 1985. -Вып. 135.-С. 88-92.
89. Лямперт И.М. Этиология, иммунология и иммунопатология ревматизма//М., 1972.
90. Милич М.В. Серологическая резистентность при сифилисе //М.,1984.
91. Милич М.В., Антоньев A.A., Блохин Б.А. и др. Роль микрореакции с кардиолипиновым антигеном при массовых серологических исследованиях // Вестн. дермато-венерол. 1983. - № 10. - С. 19-22.
92. Молочков В.Л., Кириченко И.М. Полимеразная цепная реакция и её применение для диагностики дермато-венерологии // Рос. дурн. Кожн. вен. болезней. 2004. - №1. - С.44-54.
93. Мюллер М., Otto М., Вернер Г. Каталитические методы в анализе следов элементов М., 1983. - 193 с.
94. Навроцкий А. П. Медико-социальная профилактика венерических заболеваний среди несовершеннолетних: Дис. . канд. мед. наук. -Минск. 1989. - 170 с.
95. Назаров П. Г., Старченко М. Е., Касаткин Е. В., Данилов С. И. Новая концепция формирования серорезистентности при сифилисе // Вестн. дерматол. 1999. - № 6. - С. 17-19.
96. Овчинников. Н. М., Беднова В. Н., Делекторский В, В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путём. М., 1987. -303 с.
97. Овчинников H. М., Резникова JI. С., Сагдеева JI. Г. Регламент производства ультраозвученного трепонемного антигена. М., 1970. - 143 с.
98. Оксман Г. А., Смоловский К., Ноэл Дж. Математическое моделирование распространения эпидемического сифилиса. // ЗППП,- 1996. № 3. -С. 21-32.
99. Ометов В. К., Авилов Е. Н., Капустюк JI. П. Влияние сезонности на распространение венерических заболеваний в Ростовской области // Вестн. дерматол. 1998. - № 1. - С. 21-23.
100. Ометов В.К., Моргуль М.П., Уразовская Е.В., Крушинская И.А. О применении иммуноферментного анализа в диагностике сифилиса //Вестн. дерматол. 1997. - № 3. - С.46-47.
101. Патент RU № 2092853 С1(51) 6 G01 №33/553, 33/53. Иммуноди-агностикум и способ твердофазного иммуноанализа на его основе /А.Г.Полтавченко, Ю.И.Сенькин, В.С.Караваев. Заявка №5065593/14; заявлено 12.10.92; Опубликовано 10.10.97.
102. Патрушева Н.Б., Рогачей JI.H., Дегтярёва Г.Н., Бейкин Я.Б. Скри-нинговый КСР для диагностики сифилиса // Клин. лаб. диагност. 1997. - № 6. - С. 66-67.
103. Пожарская В. О. Антигенные свойства отдельных клеточных структур культуральных бледных трепонем: Автореф. дис. . канд. мед. наук.-М., 1986. 16 с.
104. Пожарская В.О. Антигенные свойства структурных детерминант трепонем, выращенных на искусственной питательной среде. Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. // Материалы международного симпозиума. Уфа. - 1995. - Ч. 2.- С. 217-218.
105. Пожарская В.О. Особенности иммунного ответа кроликов на введение антигенов из бледных трепонем //Тез. докл.7 Всерос. съезда дерматол. и венер. Казань. - 1996. - Т. 3. - С. 73-74.
106. Пожарская В.О., Беднова В.Н., Падалка С.Ф. Новый специфический сорбент для РИФ-абс при серодиагностике сифилиса //Вестн. дерматол. -1995.-№2.-С.15-16.
107. Полтавченко А.Г., Караваев B.C., Тузиков В.Ф. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа //Журн. микробиол. 1998. -№2.-С. 108-111.
108. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А. Стабилизация коллоидного серебра //Сибирь-Восток. 2002. - Вып. 6(54). - С. 17-18.
109. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Перспективы использования коллоидного серебра как маркера в иммуноанализе //Сибирь-Восток. 2002. - Вып. 3(51). - С.10-12.
110. Полтавченко А.Г., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Проявление золей серебра в микротитровальных планшетах //Сибирь-Восток. -20026.-Вып. 9(57). С.7-9.
111. Полтавченко А.Г., Тузиков Ф.В., Полтавченко Д.А., Загоскина Т.Ю. Получение серебряных золей-маркеров для иммуноанализа //Сибирь-Восток. 2002в. - Вып. 4(52). - С. 18-20.
112. Потекаев Н.С., Потекаев С.Н. Заметки к этиологии и патогенеза сифилиса / Этиология и патогенез сифилиса. 2002. - №1. - С.63-68.
113. Практическая химия белка: М.: Мир, 1989. С.300-301.
114. Приказ № 1179 от 10 октября 1983 г. «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения.-М., 1983.
115. Прокопов Н. И. Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммунодиагностических исследований. // Успехи химии. 1996. - Т. 65. - № 2. - С. 178-192.
116. Разнатовский А. М., Соколовский Е. В., Красносельских Т. В. Причины и факторы, способствующие развитию серологической серорезистентности после современного лечения сифилиса // Дермато-венерол. и косметологии. 1996. - № 1. - С. 60-66.
117. Рассказов Н. И. Временный порядок серологической диагностики и серологического контроля излеченности сифилиса в Астраханской области: Инструкция для врачей. 1998. - 16 с.
118. Родионов А.Н. Сифилис,- Руководство для врачей. С.-Пб.: «Питер», 2000.- 184 с.
119. Родионов П.П., Третьяков В.В. Колларгол и протаргол , свойства // Препринт: коллоидное серебро. Физико-химические свойства. Применение в медицине. Новосибирск, 1992. - С.5-14.
120. Розовский Г.И. Химическое меднение с применением в качестве восстановителя боргидрида // Исследования в области осаждения металлов : Материалы к XI Респ. конф. электрохимиков Литовской ССР. Вильнюс, 1971. - С.93-95.
121. Роуз Н. Р. Основные аспекты аутоиммунного заболевания. Механизмы иммунопатологии,- М., 1989. С. 165-180.
122. Санофи Диагностике Пастер. Стандартизация методов исследования сифилиса // Информационно-методическое пособие М., - 1998. - 23 с.
123. Сафронова A.B., Маликов В.Е., Бурова A.A. и др. Аспекты использования иммуноферментного анализа в серологической диагностике сифилиса //Клиническая лабораторная диагностика . 1999. - №11. - С.22-23.
124. Серегин C.B., Белавин П.Б., Бабкина И.Н. и др. Получение ре-комбинантных антигенов Trponema pallidum и их применение в иммунофер-ментной диагностику сифилиса // Вестн. дерматол. 1979. - № 8. - С. 48-51.
125. Сержантова Т. И. Опыт культивирования бледных трепонем на тиогликолевой среде // Вестн. дерматол. -венерол. 2000. - № 2. - С. 5-8.
126. Свергун Д.И., Фейгин JI.A. Рентгеновское и нейтронное малоуго-вое рассеивание М., 1988. - 279 с.
127. Сивак В.В., Чеботарев В.В., Чеботарева Н.В. Сифилис в пените-циарной системы //Ставрополь, 2003. 166 с.
128. Сидорова Е. В., Ляхов В. Ф. Значение определения противотре-понемных IgM-антител в серодиагностике сифилиса. //Бюллетень ассоциации САНАМ «Инфекции, передаваемые половым путем». 1995. - № 4. - С. 1113.
129. Скрипкин Ю.К., Курбанова A.A., Шарапова Г.Я., Селицкий Г.Д. Инфекции, передаваемые половым путем. Практическое руководство //М.: «МЕДиресс». 1999. - 361 с.
130. Скрипкин Ю. К., Резайкина А. В. Иммунопатологические механизмы патогенеза хронических дерматозов: М., 1997. С. 94-98.
131. Соколовский Е. В. Серологическая резистентность после лечения сифилиса: (причины и факторы развития, профилактика и лечение): Автореф. дис. . докт. мед. наук. С-Пб. - 1996. -40 с.
132. Суханов Е. С., Сметанина С. Е., Максимов В. А. Прямая детекция ДНК Tr.pallidum в клиническом материале и крови доноров методом ПЦР с гарантией достоверности отрицательного результата // Вестн. службы крови России. 1998. -№3.-С.18-21.
133. Сухова Л.П., Машеро В.В., Войнова H.H. Опыт применения ИФА-тест-систем с использованием рекомбинантных белков в диагностике сифилиса //Бюллетень ассоциации САНАМ «Инфекции, передаваемые половым путем». 1999 - № 1. - С.34-35.
134. Сызранцев П. И. Простые способы вычисления основных статистических величин. // Социалистическое зерновое хозяйство. 1938. - № 3. -С. 185-203
135. Тинкер А.И. Влияние сублимационного (лиофильного) высушивания на штамм ЕВ чумного микроба . Дис. . доктора мед. наук. - Ставрополь, 1971.-351 с.
136. Тимченко Г.Ф. РПГА в серодиагностике сифилиса: Дисс. . докт. мед. наук. М. - 170с.
137. Тихонова JI. И. Общий обзор ситуации с инфекциями, передаваемыми половым путём // Вестн. дерматол. 1999. - № 2. - С. 4-7.
138. Ткачев В.К. ИФА диагностика сифилиса. - Информационно-методическое пособие. - Кольцово, 1997. - 30 с.
139. Тутова Л. И. Гемокультуры бледной спирохеты // Материалы по обмену опытом между институтами эпидемиологии и микробиологии: Сб. науч. тр. Ставрополь. - 1947. - С.14.
140. Тюменцева И. С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций: Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. Саратов. - 1996. - 57 с.
141. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях: М., 1975. 296 с.
142. Файгль Ф., Ангер В. Капельный анализ неорганических веществ -М., 1975. Т.2. - С. 116-117.
143. Фриго Н.Ф. Современные критерии дифференциальной диагностики сифилиса и ложнополодительных результатов стандартных серологических раекций на сифилис // Дис. . доктора мед. наук. М., 2001.
144. Фриго Н.В., Комарова В.Д., Обрядина А.П., Бурков А.Н. Сравнительные результаты иммуноферментного анализа, реакции пассивной гемагглютинации и микрореакции в серодиагностике // Вестн. дермато-венерол. 2000. - № 4. - С.34-36.
145. Хамидов Ш.Ф., Ввлиханов У.А., Балтабаев М.К. Особенности эпидемиологии современного течения и лечения раннего приобретенного сифилиса // Вестн. дермато-венерол. 2004. - № 2. - С.55-57.
146. Чеботарёв В. В. Индустрия секса, нравственно-этическое, половое воспитание нерешённые проблемы. // Вестн. дерматол. - 1999. - № 3. -С. 29-30.
147. Чеботарев В.В., Павлик JI.B. Повторные заражения сифилисом // Вестн. дерматол. 1996. - № 4. - С.46-49.
148. Чеботарев В.В., Павлик JI.B., Гуджиева О.Д. Экстрагенитальные и биполярные шанкры казуистика или повседневность ? // Вестн. дерматол. - 1999.-№3,-С. 56-58.
149. Чеботарев В.В., Павлик Л.В., Земцов М.А. Особенности течения сифилиса в период эпидемии //Вестн. дерматол. 1999. - №6. - С.56-58.
150. Шалкаускас М.И., Вашкялис А.Д. Химическая металлизация пластмасс. Л.,1977. - 168 с.
151. Шершевский Я. Г. О распознавании возбудителя сифилиса путём культивирования бледной спирохеты // Харьковский медицинский журнал. -1910. -Т.10. № 7. - С.159-163.
152. Эльпинер И.Е. О механизме действия ультразвуковых волн на микроорганизмы //Микробиология. 1955. -Т.24. - С.371-381
153. Эльпинер И.Е.Биофизика ультразвука //Из-во «Наука», М.,1973. -384 с.
154. Юдицкая H. М. Возможность применения латекс-агглютинации для экспресс-диагностики дизентерии. // Иммунология. 1991. - № 1. - С. 63-64.
155. Юлдашев К.Л., Магрунов Б.Л., Парпиев З.А., Реймназарова Г.Д. Беременность и сифилис // Вестн. дермато-венерол. 2003. - №3. - С.34-35.
156. Яцуха М. В., Аковбян В. А. Эпидемическое значение активного выявления больных сифилисом в соматических стационарах //Современные проблемы дермато-венерологии: Сб. науч. тр. Курск. - 1994. - С. 16-18.
157. Antoni G., Dal Maso G., Berti B. et al. Detection of antigenic determinants in the Treponema pallidum membrane protein Tmp A using overlapping synthetic peptides // J. Immunol. Meth. 1996. - Vol. 189. - № 1. - P. 137-140.
158. Augenbraun M., Rolfs R., Johnson R.;. Treponemal specific tests for the serodiagnosis of syphilis. Syphilis and HIV Study Group // Sex. Transm. Dis. -1998. Vol.25(10). - P.549-552.
159. Backhouse J. L., Hudson B. J. Evalution of immunoglobulin G enzyme immunoassay for serodiagnosis of yaws // J. Clin. Microbiol. 1995. -Vol. 33. -№ 7. - P. 1875-1878.
160. Bailey M. G., Penn C. N., Cockayne A. Evodence for the presence of lipopolysacharide in Treponema phagedenis (biotype Reiter) bat not in Treponema pallidum (Nichols) // FEMS Microbiol Lett. 1985. - Vol. 27. - № 1. - P. 117-121.
161. Balic-Winter A., Kansky A. Seroloska dijagnostika sifilisa //Lijecn.vjens. 1985. - Vol. 107. - № 1-2. - P. 92-94.
162. Batteiger В., Newhall W.J., Jones R.B. The use of tween 20 as a blocking agent in the immunological detection of protein transferred to nitrocellulose membranes //J. Immunol. Methods. 1982. - Vol.55, N3. - P. 297-307.
163. Beebe G. L., Nouri N. G. Comparative evaluation of commercial fluorescent treponemal antibody-absorbent test kits // J. Clin. Microbiol. 1984. -Vol. 19. -№6. - P. 789-793.
164. Berg R. N., Duncan W. P., Thornton C. G. Antigen analysis of cultivable Reiter and Nichols treponems // Br. J. Vener. Dis.- 1972. Vol. 48. - № 6. -P. 489-495.
165. Bernard Ph., Souyri N., Bonnetbanc G. M. Serologia de la Syphilis //Med. Cent. - 1984. - Vol. 1. - P. 109-114.
166. Blanco D.R., Champion C.I., Exner M.M. et al.Porin activity and sequence analysis of a 31-kilodalton Treponema pallidum sub sp. pallidum rare outer membrane protein (Trompl) // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - № 12. - P. 3556-3562.
167. Bolensen E., Abecht S., Benche W. et al. Reativity of locally produced CSF antibodies in patient with neurosyphillis againts antigens of Treponema pallidum // J. of Neurol. 1993. - Vol. 240. - № 8. - P. 470-474.
168. Byrne R.E., Laska S., Bell M. Et al. Evaluation of a Treponema pallidum western immunoblot assay as a confirmatory test for syphilis // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol.30(l). - P.l 15-122.
169. Cannefax G. R., Garson W. Reiter protein complement fixation test for syphilis // Publ. Health. Rep. 1957. - № 72. - P. 335-340.
170. Chermesky M.A., Nucleic axid tesths foediagnosis of sexually trans-mited deseasis //FEMS Immun. Med. Microbiol. -1999.- N24. P.437-448.
171. Christiansen A. H. Studies on the antigenic structure of treponemes especially the polysaccharide fraction // Danich. Med. Bulletin. 1967. - № 14. -P.103-109.
172. Collins U.P. (Коллинз У.П.) Новые методы иммуноанализа . Пер. с англ.-М., 1991.-279 с.
173. Cox D.L, Chang P., Mc Dovall A.M. et al. The outer membrane, not a coat of host proteins, limite antigenicity of virulent Treponema pallidum //Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - № 3. - P. 1076-1083.
174. Cristian C. L., De Simore A. R., AbrussofL. Anti-DNA antibodies in hyperimmunised rabbits // J. of exp. Med. 1965. - Vol. 121. - № 2. - P. 309321.
175. D'Alessandro G. Extract antigen from treponema in the serology of syphilis //11 Intern. Congr. of Dermatology. Proceedings. Stockholm. 1957. -Vol. 3. - P. 718-719.
176. D'Alessandro G., Dardanoni L. On the Antigenic structure of Treponema pallidum with partucular reference to the Treponema group specific protein antigen// Bull. Res. Connsil. Israel. 1958. - № 7. - P. 47-52.
177. D'Alessandro G., Del Carpio C. A. Lipopolysaccharide antigen of the treponema//Natur. 1958. - Vol. 181. - P. 991-992.
178. D'Alessandro G., Oddo F.G., Dardanoni L. The antigens of the Cultured Treponema Pallidum (Reiter Strain) and the antispirochetal antibodies in human syphilis // Ven, Dis. Inf. 1950. - Vol. 31. - P. 314-315.
179. D'Alessandro G., Zaffiro P. Sulla Structura antigenica del Treponema pallidum // Minerva med. 1962. - Vol. 53. - № 102. - P. 3833-3927.
180. Deacon W. E., Hunter E. F. Treponemal antigens a Related to Identification and Syphilis Serologi // Proc. Soc. Exp. Biol. and. Med. - 1962. - № 110. -P. 352-356.
181. Dische Z. Uber uniae nerr characteristische Farben reactionen der Thismonuelein Saure und cene mikromethod zur Bestimmung der selben in tierischen Oroanen mit Hilpedieser Reaktionen // Hikrochem. 1930. - № 8. - P. 432.
182. Doniach A. Autoantibodies in syphilis and chronic biologic false positive reactions // Sex. Transmit. Dis. London: Academic Press. - 1976. - P. 210-214.
183. Egglesttone S/I/. Turner A.J.L. (Эгглстоун С.И., Тернер А.Дж.Л., Серологическая диагностика сифилиса //ИППП. 2001. - №3. - С.4-9.
184. Farchy С.Е., Hunter E.F., Larsen S.A. et al. Double conjugate enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulins Gand Maganst Treponema pallidum. // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20. - № 6. - P. 1109-1113.
185. Farshy C.E., Hunter E.F., Pope V. et al Four serologic tests for syphilis. Results with comparison of selected groupe of sera // Sex. Transmit. Dis. -1986. Vol. 13. - № 4. - P. 228-231.
186. Fitzgerald T. J. Effects of efetamet (Ro 15-8074) on Treponema pallidum and experimental syphilis //Antimicrob. Agents. Chemother. 1992.-Vol. 36.-№3.-P. 598-602.
187. Fostrom L. Reiter protein complement fixation (RPCF) test as a serological test for syphilis //Acta dermato-venerologica. 1967. - Vol. 47. - P. 165171.
188. Fromm G. Spirochäten Antigene in der Serolog. diagnostik der Syphilis //Arzt. Wochenschr. - 1954. -№9. -P. 639-641.
189. Gasponi A., Nedosant M., Fosti A. et al. Valutasione di unnuovo metodo immunoenzimatico per la dimonstrazione delle IgM-treponema specifiche nella sifilide umana // J. of Ital. Dermatol. 1988. - Vol. 123. - № 3. - P. 113-116.
190. Goodhort G.L. Use and Interpretation of serologic Tests for the Diagnosis of Syphilis //Suoth met. J. 1983. - Vol. 76.-№ 3.-P. 373-379.
191. Grob J.J., Bonerand Y.J. Antiphospholipid antibodies and antiphos-pholipid antibody sindrom // Ann. Dermatol. Venerol. 1986. - Vol. 113. - № 9. -P. 811-818.
192. Hardi P. H. Prospects for improved laboratory diagnosis of treponemal infections and species definition // Rev. Infect. Dis. 1985. - Vol. 7. - Suppl. № 2. - P. 300-304.
193. Hardi P. H., Frediricks W. R., Nell E. E. Isolation and Antigenic characteristics of axial filements from the Reiter Treponema // Infect. Immun. -1975.-№11.-P. 380-386
194. Horvath I., Puskas E., Horvath A. et al. Autoantibodies in immune defense againts cholisterol? // Orv. Hetil. 1994. - Vol. 135. - № 5. - P. 965-968.
195. Ito F., Hunter E.F., George R.W. et al. Specific immunofluorescent staining of pathogenetic treponemes with a monoclonal antibody // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - № 4,- P. 831-838.
196. Johonson P. C., Farnie M. A. Testing for syphilis // Dermatol. Clin. -1994.-Vol. 12.-№1.-P. 9-17.
197. Kaplan M., Galef E., Bercovici T., The selective detection of cell surfaces determinants by means of antybodies and acetylated avidin atlached to highly fluorescent polymer microspheres. // Biochim. Biophys.Acta. 1983. - № 728. -P.l 12-120.
198. Kell P.D., Barton S.E., Sammerbell C.D. et al. Sexually transmitted diseases in HIV-1 seropositive monen at presentation // Int. J. STD AIDS. -1991. Vol. 2. -№3. - P. 204-206.
199. Larsen S. A., Steiner B. M., Rudolph A. N. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. // Clin Microbiol Ref. 1995. - Vol. 8. - № 1. -P. 21-22.
200. Lee Y.B., Farshy C.E., Hunter E.F. et al. Detection of immunoglobulin M in cerebrospinal fluid from syphilis patients by enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol. 21. - № 5. - P. 736-744.
201. Lefevre G.C., Prere M.F., Abbal M., Leareng M.B. Quantitative evaluation of the FTA-abs IgM intreated and untreated syphilis // Ann. Dermatol. Venerol. 1983. - Vol. 110(5). - P. 426-430.
202. Margel S., Wesel E. Acrolein polimerazation: Monodisperse, Homo and Hydro microperes, Systhesis mechanism and Reactions // Sci. Polym. Chem. 1984. - V. 22. - P. 145-148.
203. Matsumoto M., Ishikawa F., Matsubayashi T. Et al. Latex agglutination test for detecting antibodies to Treponema pallidum // Clin. Chem. 1993. -Vol.39(8). - P.1700-1705
204. Morrison-Plunner T., Alderte Y.F., Basemon J.B. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of serum antibody to on the membrane protein of T.pallidum // Brit. J. Vener. Dis. 1983. - Vol. 59. - P. 75-79.
205. Nayar R. Campos J. M. Evaluation of the DCL Syphilis-G enzyme immunoassay test kit for the serologic diagnosis of syphilis // Ann. J. Clin. Pathol. 1993. - Vol.99. -№ 3. - P. 282-285.
206. Parus D., Braun W., Oi V. Antigen specific identfication and cleaning of hibidoes with a fluoresce-activated cell sorter. // Proc. Nat. Acad. Sci (USA). -1979.-№76.-P.1962-1966.
207. Paris-Hamelin A., Loupy G., Vaisman A., Deregnancourt G. Recherche et dosage des IgM treponemiques par une methode immunoenzymelogique
208. ELISA). Comparaison avec le FTA-Abs-IgM et le SPHA modifie // Feuill. biol. -1985. Vol. 26. - № 145. - P.13-19.
209. Petersen C. S., Pedersen N. S., Axelsen N. H. A simple method for the isolation of flagella from Treponema Reiter // Acta pathol. et microbiol. scand. -1981. Vol. 89. -№6. - P. 379-385.
210. Peterson C. S., Pedersen N. S., Axelsen N. H. Purification of a Reiter treponemal protein antigen that is immunologically related to an antigen in Treponema pallidum (DNA) // Infect. Immun. 1982. - Vol. 35. - № 3. - p. 974-978.
211. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weight //Biochem. Biophis. Acta. 1964. - Vol.82. -P.463-475.
212. Pucilow K., Zajac W. Biologisch falschpositive seren in der diagnostic/Derm. Moschr. 1980. -Bd.166. -№11. -P. 713-721.
213. Quinn T.C. Recent advanced in diagnosis of sexually transmited diseases // Sex. Trans. Dis. 1994,- N 21. - P.19-27
214. Radolf J. D. Treponema pallidum and quest for outer membrane proteins // Moll. Microbiol. 1995. - Vol. 16. - P. 1067-1073.
215. Radolf J.D., Robinson E.J., .Burell K.W et al. Characterization of outer membranes isolated from Treponema pallidum, the syphilis spirochete //Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - № 11.- P. 4244-4252.
216. Rembaum A., Dreuer W. Immunomicrospheres; reagents for cell labeling and separation. // Sciens. 1980. - Vol. 208. - № 4442. - P. 364-368.
217. Rossetti O.L. AreseA.L. Boschiroli M.L., Cravero S.L. Coloning of Brucella abortus gene and characterization of expressed 26-kilodalton peripasmicprotein: potential use for diagnosis //J.Clin. Microbiol. -1996. Vol.34, N 1. -P.165-169/
218. Schaudinn F. Hoffman E. Vorlaufigen Bericht über das vorkommen von Spirocheaten in syphilitischen krankjeits producten und dei Rupp Papillonen //Arb. a. Kaiserl. Gerund. 1905. - № 22. - P. 527-534.
219. Sevars A. H., Schasfoart R. B., Salden M. H An immunosensor for syphilis screening Based on surface plasmon resonans // Biosens. Bioelectron. -1993. Vol. 8. - № 3-4. - P. 185-189.
220. Silletti R. P. Comparison of Captia syphilis G enzyme immunoassay with rapid plasma reagin test for detection of syphilis // J. of Clin. Microbiol. -1995. Vol. 33. - №7. -P. 1829-1831.
221. Simon M., Milward F., Lefebvere R. et al. Spirochetes: vaccines, animal models and diagnostics // Res. Microbiol. 1992. - Vol. 143. - № 6. - P. 641-647.
222. Stienstra S., Peeters T., Van der Straaten A.M., Kadir N. Treponema pallidum membrane protein A ELISA: a new test for screening and diagnosis of syphilis // Beitr. Infusionsther. 1992. Vol.30. -P.85-91.
223. Vaisman A., Hamelin A. Les antigenes treponemiques dans le sérodiagnostic de la syphilis // Presse med. 1958. - № 66. - P. 1357-1358.
224. Van der Sluis J. J. Laboratoris techniques in diagnosis of syphilis. //Geritourin Med. 1992. - Vol. 68. - P. 413-419.
225. Vajpayee M., Malhotra N., Pandey R.M. et al. Human immunodeficiency virus and syphilis seropositivity among patients attending clinic for sexually transmitted disease letter. [In Process Citation] I I Int. J. STD AIDS. 2000. - Vol. 11 (7). - P.482.
226. Vila P., .Hernander M.C, Lopez-Fernandez M.F. et al.Prevalence, follow-up and clinical significance of the anticardiolipin antibodies in normal subjects // Thromb-Hemoctr. 1994. - Vol.72. - № 2. - P. 209-213.
227. Wachter M.S., Johnson R.C. Treponeme outer envelope'.Chemical analysis //Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. 1976. - Vol. 151. - № 1. - P. 97-100.
228. Warburg O., Christian W., Isolierung and Kristallisation des Garug-sterments Enolase//Biochem. J. 1941. -V.310. - P. 1120-1122.
229. Young H. Syphilis. Serology //Scotland Determatol. Clin. 1998. -Vol. 16(4). - P. 691-698.
230. Young H., Moyes A., de Ste Croix I., McMillan A. A new recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis // Int. J. STD AIDS. 1998. - Vol.9(4). -P.196-200.
231. Young H., Moyes A., Mc.Millan A. et al. Enzyme immunoassay for anti-treponemal IgG: screening or confirmatory test? // J. of Clin. Pathol. 1992. -Vol.45.-№1,- P. 37-41.
232. Young H. (Янг X.) Рекомендации по серологической диагностике сифилиса //Инф., передав. Пол. Путем. 2001. - №3. - С.10-12.Ц1. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
233. Для повышения специфичности трепонемных антигенов необходимо подвергать их специальной очистке путем переосаждения сульфатом аммония, гельфильтрации, иммуносорбции неспецифических антигенов.
234. При получении полиакролеинового суспензионного диагности-кума для РАЛ оптимальными условиями сенсибилизации латексных микросфер комплексным трепонемным антигеном являются: 0,20 мг лиганда на 2 мл 2 % полимерного носителя 3 часа при 22 °С.
235. При конструировании иммунодиагностикума с частицами коллоидного серебра для эффективной стабилизации золя серебра необходим комплексный трепонемный антиген в количестве 375 мкг на 10 мл золя.
236. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
237. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
238. УТВЕРЖДАЮ ДиректйЙЩ^мюпольского на^^л^о^льского " гтитута,1. Деятель науки:5Фгв|•рМШфременко « 2004 г.
239. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ СУСПЕНЗИОННЫХ ТРЕПОНЕМ-НЫХ АНТИГЕННЫХ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА И ИММУ-НОДИАГНОСТИКУМА С КОЛЛОИДНЫМ СЕРЕБРОМ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА НА СИФИЛИС1. Методические рекомендации1. Ставрополь, 2004 г
240. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ СЕВЕРНАЯ ОСЕТИЯ-АЛАНИЯ
241. СЕВЕРО-ОСЕТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
242. Кафедра инфекционных болезней ДЖАНАЕВ В.Ф.
243. ХАРАКТЕРИСТИКА ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ СИФИЛИСОМ С 1999 ПО 2003 г.г. В РСО-АЛАНИЯ С УЧЁТОМ РЕГИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ И МЕР ПО ЕЁ1. СНИЖЕНИЮ.
244. Методические рекомендации)1. Владикавказ 2004 г.
245. РЕСПУБЛИКА СЕВЕРНАЯ ОСЕТИЯ-АЛАНИЯ
246. Министерство здравоохранения Республиканский кожвендиспансергор. Владикавказ, проспект Доватора, 22, телефоны: 52-23-31, 52-24-281. От № 1. АКТ
247. Зав.централизованной лабораторией РКВД, РСО Алании в г. Владикавказ
248. Врач-лаборант централизованной лаборатории РКВД, РСО-Алан г.Владикавказбегоноваанаев
249. РЕСПУБЛИКА СЕВЕРНАЯ ОСЕТИЯ-АЛАНИЯ
250. Министерство здравоохранения
251. Республиканский кожвеедиспансергор. Владикавказ, проспект Доватора, 22, телефоны: 52-23-31, 52-24-281. От №1. АКТ
252. Зав.централизованной лабораторией тАлбегонова
253. РКВД, РСО Алании в г. Владика!
254. Врач-лаборант централизованной Джанаевлаборатории РКВД, РСО-Аланид г.Владикавказ
-
Джанаев, Вячеслав Феликсович
-
кандидата медицинских наук
-
Ставрополь, 2004
-
ВАК 03.00.23
- Молекулярные маркеры сифилитической инфекции
- Хроматографические диагностические критерии люэтической инфекции
- Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей
- Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза
- Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя
