Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей

Жарникова, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей"

На правах рукописи

ЖАРНИКОВА Ирина Викторовна

МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ И РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСОБО ОПАСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ДЕТЕКЦИИ ИХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ставрополь — 2004

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Тюменцева Ирина Степановна

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович

доктор биологических наук Майский Виктор Григорьевич

доктор биологических наук Владимцева Ирина Владимировна

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита диссертации состоится « О » октября 2004 года в 7 С/ часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 2, аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 1.

Автореферат разослан 1_» ^/^Щ^ПШ г.

Ученый секретарь диссертационного совета Джандарова Т.И.

•у-

4S44

Z\ Ъ Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из основных приоритетов государственной политики является охрана здоровья населения как важнейший фактор национальной безопасности. Это нашло отражение в распоряжении Правительства Российской Федерации от 10 июня 2001 г. №910 — Р «О программе социально-экономического развития Российской Федерации на среднесрочную прерогативу (2002-2004 гг.)».

В этой связи особое значение приобретает борьба с инфекционными заболеваниями. По данным ВОЗ, из 50 млн человек, ежегодно умирающих в мире, более чем у 16 млн причиной смерти являются инфекционные и паразитарные заболевания.

Изменившиеся социально-экономические и санитарно-гигиенические условия жизни и медицинского обеспечения населения в России и большинстве стран СНГ, возросшая опасность возникновения чрезвычайных ситуаций, в том числе актов биотерроризма, повлекли за собой повышение риска заражения людей опасными инфекционными болезнями. Вследствие этого особую важность приобретает своевременное выявление возбудителей опасных инфекций в биотических и абиотических объектах и оперативное уведомление соответствующих служб об эпидемиологической обстановке, что обуславливает повышение требований к качеству средств и методов лабораторной диагностики, применяемых при эпидемиологическом надзоре, реализации мер по санитарной охране территорий (Онищенко Г.Г., 2002).

Все чаще традиционные, а порой и казавшиеся недавно перспективными методы диагностики оказываются недостаточными и принципиально неприемлемыми, что заставляет вести поиск новых и унифицировать имеющиеся методы выявления и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний, обладающих экспрессностью, надежностью, высокой специфичностью.

Стремительное развитие биотехнологии в последние годы привело к появлению многочисленных новых методов исследования, однако огромное значение имеют и хорошо известные реакции, которые необходимо унифицировать. Привлечение иных методических подходов, характеризующихся большей разрешающей способностью, может значительно повысить эффективность детекции возбудителей инфекционных заболеваний (Афанасьев E.H., 2000; Drosten С. et al., 2002).

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

ЬИ'. .'(ККА

С , ¡.f\,jjr

ИЮбРК

создания специальных условий и применения метода химического модифицирования, активирования матрицы (Тривен М., 1983). Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твердофазнь'е носители, в том числе различные гранулированные сорбенты (Шахани-на K.J1. с соавт., 1976; Camargo Z., Guesdon J., Drouhet E, 1984), а также сорбенты с магнитными свойствами (Ефременко В.И,,1996; Владимце-ва И.В., 2002; Richardson J., 2001; Tanaka Т., Matsunaga Т., 2001 и др.).

Ранняя лабораторная диагностика, своевременное выявление источника инфекции занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий. Современная микробиология характеризуется развитием диагностических технологий, основанных на глубоких фундаментальных знаниях биологии микроорганизмов и передовых инженерно-технических решениях задач автоматизации и повышения эффективности анализа (Они-щенко Г.Г. с соавт., 2003). В связи с этим возникает необходимость в развитии и совершенствовании иммунобиологических методов, конструировании новых экспрессных методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надежности и легкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.

Цель исследования: совершенствование и унификация биотехнологий производства иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики особо опасных, других инфекционных заболеваний и детекции их возбудителей.

Основные задачи исследования:

— подобрать эффективные способы извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных биомасс для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препара тов (МИБП);

— отработать производственные схемы для получения иммунных сывороток с высокими титрами специфических антител и провести сравнительную оценку методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве МИБП;

— определить оптимальные параметры биотехнологий производства иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изучить их диагностическую ценность;

— унифицировать биотехнологию производства эритроцитарных ди-агностикумов;

— изыскать надежные методические подходы к изготовлению суспензионных диагностикумов на основе полиакролеиновой и алюмоси-ликатной матриц для реакций агглютинации;

— разработать методические основы конструирования аффинных сорбентов с магнитными свойствами для диагностики инфекций и индикации их

возбудителей в экспрессных методах (иммуноферментном анализе — И ФА, количественном иммунофлуоресцентном анализе — КИФА, хемютюминес-центном анализе — ХЛИА, полимеразной цепной реакции — ПЦР);

— оценить возможность и эффективность использования разработанных твердофазных сорбентов для иммуносорбции сывороток крови;

— определить параметры ускоренного режима лиофилизации биологического сырья и МИБП и разработать эффективные защитные среды для них;

— оценить эффективность применения разработанных диагностикумов на экспериментальном, клиническом и полевом материале.

Научная новизна работы. Определены методические приемы и их последовательность, дающие возможность извлечения полноценных специфических водорастворимых антигенных комплексов белковой природы из микроорганизмов, относящихся к различным родам и вадам, в количестве, достаточном для производственных целей.

Впервые в сравнительном аспекте проведена комплексная оценка преимущества (или недостатка) того или иного способа выделения иммуноглобулинов из иммунных сывороток при конструировании различных МИБП (иммуноферментных, иммунофлуоресцентных, суспензионных).

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства микрогранулированных иммуносорбентов с магнитными свойствами, обладающих высокими сорбционной емкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.

Разработаны методические приемы по сочетанному применению селективного концентрирования микроорганизмов на магноиммуносор-бентах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей традиционные, что значительно повысило достоверность полученных результатов исследований.

Впервые разработан и применен аффинный сорбент с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных сывороток, позволяющий получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускоряя и упрощая процесс сорбции.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена 9 патентами РФ на изобретения.

Теоретическая и практическая значимость диссертации. Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в определении методо-

логии конструирования иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики различных инфекционных заболеваний и детекции их возбудителей, которая учитывает характерные особенности биологической организации того или иного возбудителя, свойства матриц биотической и абиотической природы, определяя направления последовательных, взаимосвязанных стадий и операций биотехнологии производства каждою конкретного препарата.

Разработанные методические подходы и приемы по извлечению антигенного материала из микробных биомасс, получению иммунных сывороток и выделению из них иммуноглобулинов, оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркеров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей. Эти биотехнологии позволили изготовить серии диагностикумов (иммунофермен-тных, иммунофлуоресцентных, эритроцитарных, суспензионных поли-акролеиновых и алюмосиликатных для реакции агглютинации), стабильно отвечающие общим медико-биологическим требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам.

Применение разработанных аффинных сорбентов с магнитными свойствами позволило провести эффективную иммуносорбцию неспецифических компонентов сывороток крови, получая высокоспецифичные препараты.

Разработан ускоренный экономичный режим стабилизации биологического сырья и МИБП методом лиофильного высушивания, позволяющий сохранять их исходные свойства длительное время.

Применение сконструированных магноиммуносорбентов в сочетании с экспрессными методами диагностики повышает их чувствительность до единичных микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения до 3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает эффективность проведения противоэпидемических мероприятий.

Материалы научных разработок легли в основу следующих методических рекомендаций: «Приготовление органокремнеземных магно-сорбентов с иммобилизованными лигандами белковой природы (иммуноглобулины, антигены, ферменты)». Утверждены Госкомсанэпид-надзором РФ от 15.05.1996; «Применение магноиммуносорбентов в методах экспресс-диагностики чумы». Одобрены ученым советом СтавНИПЧИ (протокол № 9 от 22.09.1999) и утверждены директорами СтавНИПЧИ и Всекитайского лечебно-профилактического центра чумы и бруцеллеза и 11 методических рекомендаций, утвержденных на учрежденческом уровне (протоколы: № 10 от 23.12.1994; № 6 от 29.06.1999; № 2 от 27.01.2000; №2 от 27.01.2000; № 3 от 30.03.20О0;

№ 5 от 21.05.2001; № 1 от 28.01.2002; №2 от 27.02.2003; № 6 от 26.06.2003; № 6 от 26.06.2003).

На федеральном уровне утверждены 5 нормативных документов: регламент № 510-95 на диагностикум магноиммуносорбентный туляремий-ный жидкий для ИФА и РИФ; регламент № 511-95 на диагностикум магноиммуносорбентный чумной жидкий для ИФА и РИФ; временная фармакопейная статья № 42/Д-014 ВС-95 на диагностикум магноиммуносорбентный туляремийный жидкий для ИФА и РИФ; временная фармакопейная статья № 42/Д-015 ВС-95 на диагностикум магноиммуносорбентный чумной жидкий для ИФА и РИФ; регламент № 1313-03 на диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуноглобулиновый.

На диагностические тест-системы: магноиммуносорбентные для ИФА и КИФА, эритроцитарные, латексные, суспензионные алюмосиликат-ные, иммуноферментные и иммунофлуоресцентные составлена первичная нормативная документация (регламенты производства (РП), фармакопейные статьи (ФС), инструкции по применению — всего 13 НД), прошедшая экспертизу в ОБТК института, одобренная ученым советом (протоколы № 7 от 16.06.1995; № 10 от 11.09.1998; № И от 28.11.1998; № 6 от 29.06.1999; № 12 от 23.12.1999; № 1 от 27.01.2000; № 8 от 26.09.2002; № 1 от 28.01.2002; № 2 от 28.02.2002; № 4 от 28.04.2003; № 6 от 26.06.2003), регламенты утверждены директором СтавНИПЧИ.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ и семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Научно-методические подходы к получению высококачественного биологического сырья (антигенов и антител) для производства различных МИБП.

2. Методические приемы конструирования иммуноферментных, имму-нофлуоресцентных, суспензионных диагностикумов, обеспечивающих высокую эффективность обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов возбудителей особо опасных и других инфекций в экспериментальных и полевых условиях.

3. Научно-методические основы биотехнологии изготовления твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных органомине-ральных магносорбентов для избирательного концентрирования патогенов и использования в экспрессных методах (ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР).

4. Методические приемы конструирования и применения аффинных сорбентов с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных сывороток.

5. Экономичный, ускоренный режим сублимации биологического производственного сырья и сконструированных МИБП для стабилизации их исходных свойств.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Российской научной конференции «Иммунология и специальная профилактика ООИ» (Саратов, 1993); Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний» (Ставрополь, 1994); первой конференции Северо-Кавказского региона «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 1995); Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва,1995); юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария», посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998); Международной научно-практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств» (Саратов, 1998); Межгосударственном симпозиуме по стратегии борьбы с чумой (Китай, Байчэн, 1999); Международном симпозиуме «Листериоз на рубеже тысячелетий» (Покров, 1999), 3-й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2001); научной конференции «Природные инфекционные заболевания» (Улан-Батор, 2001); научной конференции, посвященной 70-летию биолого-химического факультета «Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе» (Ставрополь, 2001); Международной научно-практической конференции «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы» (Алма-ты, 2001); 2-й Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, сентябрь 2002); научной конференции (Махачкала, 2002); Международной научно-практической конференции «Биоресурсы. Биотехнологии. Инновации Юга России» (Ставрополь-Пятигорск, 2003); Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003).

Публикации- Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 10 НИР, отражено в 63 опубликованных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК, — 11 статей, депонированных — 6 статей, в 9 патентах РФ на изобретения, в материалах международных, всероссийских, российских научных конференций — 16 публикаций, в иностранных журналах — 4 публикации, в материалах научно-практических и методических конференций — 17. а также в 18 нормативных документах (регламентах производства, фармакопейных статьях) и 13 методических рекомендациях и указаниях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Она изложена на 308 страницах, содержит 38 таблиц и 48 рисунков. Список литературы включает 352 отечественных и 126 зарубежных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. При выполнении работы использовано 137 штаммов микроорганизмов I, H, III и IV групп патогенности родов: Yersinia, Brucella, Francisella, Bacillus, Vibrio, Salmonella, Shigella, Listeria, Leptospira, Escherichia, Staphylococcus, Streptococcus.

В опытах были использованы: 345 кроликов обоего пола породы «Шиншилла»; 300 беспородных белых мышей; 210 морских свинок; 3 барана.

Водорастворимые туляремийные, бруцеллезные, лептоспирозные, ли-стериозные и сибиреязвенные антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией и дезинтеграцией микроорганизмов. Дезинтегрирование осуществляли разрушением под высоким давлением в Х-прессе (пресс Френча, Швеция) и ультразвуковым методом на аппарате УЗДН-2Т (Россия). Капсульный антиген чумного микроба получали по методу E.F. Baker et al (1952).

Иммунизацию животных проводили с применением адъювантов и иммуномодуляторов (полного адъюванта Фрейнда, тималина, цикло-фосфана, феракрила).

Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлуоресценции по T.H.Weller, A.H.Coons (1954). Микроскопию препаратов осуществляли в падающем отраженном свете в люминесцентном микроскопе серии «Люмам», используя соответствующие фильтры согласно инструкции по эксплуатации прибора.

Для осаждения белков использовали сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980); метод фракционирования белковых смесей с использованием высокомолекулярного, незаряженного, линейного полимера - полиэтиленгликоля (ПЭГ) по A.Polsori и др. (1964). Иммуноглобулины также преципитировали каприловой (октановой) кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969).

Количественное определение белка проводили по методу О. Warburg и W. Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Диск-электрофорез в ПААГ осуществляли по Н. Maurer (1971). Аналитический иммуноэлектрофорез проводили по методу, предложенному Р. Grabar, С.А. Williams (1953) в модификации J.J. Schedegger (1955).

Для иммуноэлектрофореза использовали 1% агар Дифко на веронал-мединаловом буфере, pH 8,6, ионная сила 0,05. Для проведения электрофореза использовали комплектную систему для горизонтального электрофореза «Мультифор» LKB.

Специфическую активность антигенов микроорганизмов и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по О. Ouchterlony (1949).

Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1974), с флуоресцеином изотиоциа-натом (ФИТЦ) фирмы «Sigma» (C21HnN05S) проводили по X. Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по

A.Н. Coons, М.Н. Kaplan (1950). Очистку конъюгатов от непрореагиро-вавшего флуорохрома осуществляли методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985). г

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi (1974) в модификации Е.А. Тка-ченко с соавт. (1982). Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике М. Clark и A. Adams (1977) в «сэндвич»-варианте ИФА. Очистку конъюгатов от несвязавшихся иммуноглобулинов и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, используя сефадекс G-100.

Микроструктуру поверхности магносорбентов (MC) определяли на сканирующем электронном микроскопе (1М2-Т3000, Япония) по методу, описанному в работе Д. Фрайфелдера (1980), удельную поверхность MC — по методу A.A. Клячко-Гурвича (1961), основанному на низкотемпературной адсорбции азота. Суммарный объем и радиус пор определяли по методу Н.В.Кельцева (1984). Количественный иммунофлуоресцентный анализ проводили по методу К.Г. Стоева,

B.А. Чибисовой, К.Л. Шаханиной (1981).

Хемилюминесцентный иммуноанализ проводили согласно методических рекомендаций, разработанных Волгоградским научно-исследовательским противочумным институтом совместно с МГУ им. М. В. Ломоносова, утвержденных в 1991 г. МЗ СССР. Для проведения ХЛИА использовали прибор люминомер (Л КБ 1250).

Для постановки ПЦР использовали диагностические наборы производства РосНИПЧИ «Микроб» и «НиарМедик» (Россия). Амплификацию проводили на амплификаторе «Perkin Elmer 2400» и Терцик™ MC 2 (ЗАО «ДНК-технология», Россия), программируя по схеме в соответствии с инструкцией к набору. После амплификации проводили электрофорез продуктов ПЦР в 1,5% агарозном геле и окрашивание бромистым этидием.

Лиофилизацию проводили в камерах TG-5 (Германия) и LZ-9c (Чехия).

Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на компьютере (программа EXCEL). Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д., Уэст Д., 1979).

Результаты исследований Оптимизация методов получения антигенов микроорганизмов, иммунных сывороток и иммуноглобулинов Основным биологическим сырьем при производстве МИБП являются специфические антигены, выделенные из микробных биомасс, иммунные сыворотки, полученные на их основе, и иммуноглобулины.

При всем многообразии способов (экстрагентов) извлечения специфических антигенов из микробных клеток нам необходимо было подобрать комплекс последовательных манипуляций, который бы позволил изолировать полноценные в антигенном отношении фракции в достаточном количестве для производственных целей и был эффективен при работе с микроорганизмами, относящимися к различным родам и видам. В связи с этим мы остановили свой выбор на водно-солевых экстрактах. Это обосновано тем, что данные ряда исследователей (Вейнблат В.И., 1974; Тюменцева И.С., 1996; Афанасьев Е.Н., 2000 и др.) показывают, что такие экстракты обладают сложным макромолекулярным составом, и в них обнаруживается в тех или иных количествах большинство выявляемых у бактерий антигенов. Водорастворимые туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные, лептоспирозные, листериозные антигены изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией, механической и ультразвуковой дезинтеграцией, осаждением белковых фракций сульфатом аммония (рис. 1). Капсульный антиген чумного микроба извлекали водно-солевой экстракцией с переосаждением сульфатом аммония (Baker E.F. et. al., 1952). Выход белковых фракций составил не менее 10 мг/мл, а фракции 1 чумного микроба — 5 мг/мл. Опыт получения многочисленных серий белковых антигенов из микроорганизмов разных видов подтвердил высокую эффективность подобранной схемы последовательных манипуляций извлечения комплекса водорастворимых биополимеров при сохранении их нативности в количестве, достаточном доя производственных целей (авторское свидетельство № 1425910 от 22.05.1988 «Способ получения туляремийного антигена»).

Для получения поли- и моновалентных иммунных сывороток нами апробировано много различных схем иммунизации, которые отличались количеством и способом, кратностью вводимого антигена, а также сопутствующими иммунизирующей субстанции адыовантами или им-мунокорректорами (полный и неполный адъювант Фрейнда, арлацель, феракрил, тималин, циклофосфан).

Обеззараженная бакмасса микроорганизмов

Экстракция хлоридом натрия

Центрифугирование при 20 ООО g, 30 мин

-Т----

Супернатант * ~

Фракционирование сульфатом аммония до 80 % насыщения

Осадок ▼

Инкубация 16-18 ч при 4 С

Центрифугирование при 20 ООО g, 30 мин

Ресуспендирование в 0,9 % растворе натрия хл орида

Разрушение в экспресс -дезинтеграюре

Центрифугирование при 20 000 g, 30 мин

Супернатант удалить

Осадок

Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCl

Супернатант -,-

белково-полисахарцзный комплекс, липиды

Диализ

Осадок ZE

Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCl

поверхностные белки микроба

Добавление i вин -80 и разрушение на УЗДН - 2Т, 20 мин, 22 кГц

Центриф)'гирсвание при 20000g 20 мин

Объединение фракций

Супернатант

мембранные, рибосомальные, оболочечные белки

Рисунок 1. Схема получения водорастворимых антигенных комплексов микроорганизмов

Осадок удалить

При отработке схем иммунизации животных с полным адъювантом Фрейнда нами показана возможность замены вирулентного производственного штамма (B.anthracis ICO) на вакцинные (В anthracis 228/8 и

B.anthracis Sterne). Курс иммунизации состоял из 10-кратного введения антигена возрастающими дозами с интервалом в три дня. Первые пять инъекций делали подкожно, следующие пять — внутривенно. В результате получены высокоактивные (1:6400 и выше) сыворотки животных при снижении их гибели, а специфичность не отличалась от сывороток против спор вирулентного штамма.

Общими недостатками схем иммунизации с применением адъюван-гов, особенно на основе минеральных масел, являются: трудность создания стойкой эмульсии «вода в масле», длительность цикла иммунизации, травматичность для животных, связанная с возникновением у них адъювантной болезни.

Применение иммуномодуляторов (тималина, циклофосфана, ферак-рила) позволяет значительно сократить сроки иммунизации и расход антигенного материала при существенном повышении титров специфических антител, при полной атравматичности для животных (Тюменце-ва И.С., 1994; Афанасьев E.H., 2000).

Для получения полигрупповой гипериммунной сыворотки, необходимой при производстве полигрупповых флуоресцирующих иммуноглобулинов, предназначенных для быстрого обнаружения прямым лю-минесцентно-серологическим методом одновременно шести возбудителей (чума, сап, мелиоидоз, туляремия, бруцеллез, сибирская язва), а также моновалентных гипериммунных сывороток, как показали результаты наших многолетних опытов, наиболее приемлемой оказалась схема с использованием феракрила в сочетании с комплексом антиген-антитело (Аг-Ат), который инъецировали животным на определенном этапе: грундиммунизация включала пять последовательных парентеральных введений смеси того или иного антигена с 3% водно-спиртовым раствором феракрила с интервалами в 3-7 дней. Через 30 суток после последней инъекции антигена у животных брали из краевой вены уха кровь и получали не менее 4 мл иммунной сыворотки, в которую добавляли антиген с целью получения комплекса Аг-Ат. Основной цикл иммунизации состоял из четырех внутривенных инъекций комплекса Аг-Ат через каждые 3-4 дня тому же животному, от которого была получена иммунная сыворотка. Специфические титры антител в этих сыворотках достигали в НРИФ 1:512 - 1:2048, а в РИД - 1:16 - 1:64, что вполне удовлетворяло требованиям оценки сырья для дальнейшего получения различных диагностических препаратов.

При получении агглютинирующих сывороток оптимальной оказалась схема, в которой использованы вещества с иммунотропной активностью (тималин и циклофосфан). Антигенный материал пятикратно вводили внутривенно, одновременно внутримышечно инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводили внутримышечно

циклофосфан. Эта схема дала возможность заменить живые вирулентные штаммы микроорганизмов на водорастворимые белковые антигены, что позволило полностью исключить инфицирование персонала. Агглютинирующие сыворотки, полученные таким способом, по титрам агглютининов и специфичности не уступали аналогичным коммерческим препаратам и с успехом были использованы при конструировании МИБП.

Способы преципитации из иммунных сывороток иммуноглобулинов, часто используемых при конструировании иммунобиологических препаратов, отличаются разнообразием и эффективностью. Наиболее производительными являются следующие: фракционирование полиэтиленгли-колем (ПЭГ), сульфатом аммония и каприловой кислотой. Как показала наша сравнительная оценка этих методов, каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.

Так, общим преимуществом является возможность осуществлять эту операцию при комнатной температуре, не опасаясь денатурации белка. На преципитацию иммуноглобулинов каприловой кислотой затрачивается в 2 раза меньше времени по сравнению с остальными (2 суток против 4 суток), при этом выделяется наиболее чистая фракция иммуноглобулинов. Кроме того, при выделении иммуноглобулинов полиэтиленгликолем и сульфатом аммония затрачивается значительное время на удаление ПЭГа и освобождение от ионов аммония растворов белков при проведении диализа. Достоинством выделения иммуноглобулинов сернокислым аммонием является возможность длительного хранения (в течение многих лет) иммуноглобулинов в его растворе без потери нативности. В дальнейшем эти иммуноглобулины были использованы при конструировании различных иммунобиологических диагностических препаратов.

Биотехнологии производства иммуноглобулиновых препаратов для реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и ИФА и суспензионных диагностикумов

При проведении конъюгации иммуноглобулинов О (^О) с ФИТЦ, выделенных вышеописанными способами из гипериммунных сывороток, установлено, что лучшие флуоресцирующие конъюгаты получены при использовании фракционированных каприловой кислотой. Это можно объяснить тем, что в преципитате содержалось более 90% фракции а для конъюгации с ФИТЦ требовалось наименьшее количество флуо-рохрома (20 мг на 1 г белка) для получения оптимальных молярных отношений Мф/М6, в связи с чем снижалась вероятность неспецифических реакций и достигалась высокая специфическая активность препаратов. Было отмечено, что после добавления красителя в первые минуты происходит снижение рН среды, затем на протяжении 25-30 минут продолжается дальнейшее снижение рН. При этом степень конъюгации бел-

ка с ФИТЦ уменьшается прямопропорционально снижению значения рН реакционной смеси, и значительная часть красителя не вступает в реакцию с белком. В связи с этим, важен контроль показателей рН и проведение их корректировки. В результате серии опытов по отработке параметров конъюгации с ФИТЦ определены их оптимальные значения: рН реакционной смеси — 9,5, температура конъюгации — 20°С, 4-часовой контакт белка с красителем. Таким способом были получены (совместно с сотрудниками Волгоградского научно-исследовательского противочумного института) экспериментальные серии высокоспецифических полигрупповых флуоресцирующих иммуноглобулинов, предназначенных для быстрого обнаружения прямым люминесцентно-серологи-ческим методом одновременно шести возбудителей (чума, сап, мелиои-доз, туляремия, бруцеллез, сибирская язва). Этот способ защищен авторским свидетельством № 286000 от 01.12.1988. Диагностикум успешно прошел лабораторные и комиссионные испытания и включен в номенклатуру препаратов, по которой создаются запасы на случай возникновения эпидемических осложнений в Российской Федерации.

По этой же технологии изготовлены моноспецифические чумные, бруцеллезные, сибиреязвенные, туляремийные, листериозные, лептоспи-розные флуоресцирующие иммуноглобулины (рис. 2), характеризующиеся красящим титром 1:32 — 1:128.

В результате проведенных исследований по получению высокоактивных и специфичных иммуноферментных конъюгатов отработан ряд параметров: эффективный метод выделения иммуноглобулинов из гипериммунных сывороток с помощью ПЭГ-6000, так как при данном способе активность конъюгатов (чумных, бруцеллезных, туляремийных, холерных, лептоспирозных, листериозных) максимальная — 1:400-1:800, чувствительность — 5Х104 — 1х105 м.к./мл. Для увеличения срока годности сенсибилизированных планшет (с 20 дней до 4,5 месяцев — срок наблюдения) проведена их фиксация с помощью диэтилового эфира. Для увеличения чувствительности иммуноферментного анализа цами-предпринята попытка обработки планшет с целью придания им новых свойств в отношении сорбции биомакромолекул. Для этого планшеты обрабатывали бензальдегидом в вакууме под действием высокочастотного электрического поля. В результате увеличена чувствительность ИФА в 4 раза.

Кроме этого, нами разработан бивалентный ферментно-люминесцен-тный конъюгат для РИФ и ИФА. Для получения такого конъюгата вместо немеченных иммуноглобулинов использовали иммуноглобулины, уже имеющие флуоресцирующую метку. Полученный конъюгат имел активность в РИФ 1:16-1:32, в ИФА — 1:400, концентрация белка — 5 мг/мл, Мф/М6 —3, — 0,4. Ценность этого диагностикума состоит в том, что, используя одну его ампулу, можно единовременно провести три вида

экспрессных анализов (традиционный ИФА, ИФА на стекле и РИФ). Это увеличивает вероятность достоверной диагностики, экономит время, расход дорогостоящих бакпрепаратов и создает неоспоримые удобства при выполнении лабораторных исследований, особенно в чрезвычайных ситуациях.

Рисунок 2. Микроорганизмы, окрашенные флуоресцирующими иммуноглобулинами

А — полигрупповыми, Б — монопрепаратами: 1 — чумными; 2 — бруцеллезными; 3 — туляремийными; 4 — сибиреязвенными (антиспоровыми)

До сих пор традиционно используются простые, достаточно чувствительные серологические тесты и, в частности, реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Подходы к их изготовлению отличаются большим разнообразием. При отработке условий и параметров изготовления диагностикумов эритроцитарных иммуноглобулиновых чумных, туляремийных, бруцеллезных, листериозных нам удалось унифицировать биотехнологию их производства от этапа подготовки бараньих эритроцитов (формалинизация эритроцитов путем дозированной подачи формалина), их сенсибилизации белковыми лигандами (оптимальная нагрузка иммуноглобулинов — 400 мкг/мл; при увеличении нагрузки лиганда отсутствует отрицательный контроль, при уменьшении — снижается чувствительность диагностикума) до стабилизации готовых препаратов (подбора эффективных сред высушивания и режимов лиофилизации). Наилучшие результаты получены при использовании в качестве сенситина специфических иммуноглобулинов, выделенных из агглютинирующих сывороток преципитацией каприловой кислотой. Наиболее эффективным конъюгирующим агентом определен 2% раствор вторичного алкилсульфата натрия при температуре 45°С; 12-часовом контакте 20% взвеси формалинизированных эритроцитов с иммуноглобулинами, рН раствора при сенсибилизации — 5,0. Чувствительность всех изготовленных диагностикумов составила 7,8 хЮ5— 1,56 хЮ6 м.к./мл, что полностью удовлетворяет нормативной документации. При проведении статистической обработки в серии опытов чувствительность РНГА I равна 9,1х105 (+8,7%; -8,0%) м.к./мл.

Суспензионные микроносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению с эритроцитами в связи с тем, что химические свойства полимерных микросфер относительно постоянны и поддаются точной характеристике по сравнению с поверхностными свойствами наружной мембраны эритроцитов (Лазовская АЛ., Воробьева З.Г., Сли-нина К.Н., 2002 и др.). Нами разработаны методические приемы изготовления суспензионных диагностикумов для реакции агглютинации на основе двух синтетических матриц — полиакролеиновой (латексной) и алю-мосиликатной, окрашенных пиронином Ж и аурамином соответственно для лучшей визуализации результатов. При разработке латексных диагностикумов использовали акролар К, полученный из института биоорганической химии им. Шемякина. Оптимальная нагрузка иммуноглобулинов туляремийных и бруцеллезных составляла (200±5) мкг/мл; листериозно-го — 400 мкг/мл; время сенсибилизации 9 ч; температура — 50°С, рН (7,2±0,1). В качестве разводящей жидкости использовали белковый стабилизатор с твин-80. Концентрация твина-80 подобрана опытным путем и составляла 1:80 000. При увеличении количества данного детергента в два раза чувствительность диагностикума снижалась на один порядок. При умень-

шении его концентрации в 4 раза отсутствовал отрицательный контроль. На постановку реакции огромное влияние оказывает рН разводящей жидкости. При уменьшении рН до 5,0 уменьшалась активность препаратов, при увеличении рН до 9,0 отсутствовал отрицательный контроль. В результате постановки реакции установлено, что чувствительность данных диагности-кумов — 7,8х105 — 1,56x10й м.к./мл, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. При проведении статистической обработки, в серии опытов титр реакции агглютинации латекса (РАЛ) Т равен 1,02х106 (+14,1 %;-12,3%) м.к./мл.

При разработке диагностикумов для реакции суспензионной агглютинации (РСА) на стекле необходимы частицы, образующие устойчивые комплексы с антителами. Мы остановили свой выбор на кремнеземе — алюмосиликате, для которого характерна высокая реакционная способность поверхностных групп. При активировании матрицы для иммобилизации лиганда и достижения агрегативной устойчивости суспензии использовали поверхностно-активное вещество — вторичный алкилсульфат натрия, благодаря которому предотвращается сближение частиц, их агрегирование. Суспензия комплекса матрица — антитело не должна давать агглютинацию при взаимодействии с гетерологичными антигенами. Для этих целей (для блокировки свободных активных центров матрицы) использовали бычий сывороточный альбумин. Нами изучены закономерности иммобилизации антител и условия, при которых они проявляют иммунологическую активность в суспензиях. В результате подбора параметров установлено, что для оптимальной иммобилизации достаточной является концентрация белка 2 мг/мл, время иммобилизации — 2ч при температуре 37 — 50°С. Количественное соотношение красителя и аэросила (2:1) оптимально. В результате проверки чувствительность суспензионных диагностикумов составила 1,56x10'— 3,12x106 м.к./мл, при отсутствии агглютинации с гетерологичными штаммами. При проведении статистической обработки титр РСАТ равен 1,92x10 6 (+7,2%;-6,7%) м.к./мл.

По высокой чувствительности, специфичности, универсальности эти препараты практически не уступали традиционным эритроцитарным диагнос-тикумам, но превосходили их по экспрессное™ (постановка реакции и учет результатов 1-5 мин), стандартности и экономичности биотехнологии производства (время получения препарата — 3 ч). На основании научно-исследовательских разработок получен патент РФ на изобретение № 2228764 от 20.05.2004 «Способ получения суспензионного диагностикума (варианты)».

Разработка и изучение свойств органокремнеземных аффинных сорбентов с магнитными свойствами

Эффективность ряда методов индикации и выделения возбудителей инфекционных заболеваний и их антигенов может быть значительно

увеличена после предварительного концентрирования микробов и антигенов с отделением их от контаминирующей микрофлоры и примесей. Эта цель может быть достигнута путем применения методов имму-носорбции, особое место среди которых занимают методы с использованием сорбентов с магнитными свойствами. Магносорбенты служат в качестве твердой фазы для селективного концентрирования на их поверхности патогенов (Владимцева И.В. с соавт.,1989; Ефременко В.И., Тюменцева И.С., 1995; Ефременко В.И., 1997; Lucore Liza et al, 2000).

Наш опыт экспериментально-производственного освоения диагнос-тикумов магноиммуносорбентных на основе полиакриламидного геля (ПААГ) показал, что недостатками технологии их изготовления являются длительность и многостадийность получения, использование дорогостоящих импортных высокотоксичных реактивов.

Нами впервые разработаны научно-методические основы конструирования микрогранулированных органокремнеземных аффинных сорбентов / с магнитными свойствами. В качестве структурных единиц, формирующих

остов кремнезема, использовали пирогенную форму диоксида кремния (аэросил А-380) и магнитный порошок (Fe203). Модифицирование матрицы проводили декстраном с последующим ковалентным связыванием белкового лиганда методом окисления. Механизм образования пористого кремнийорганического магносорбента в присутствии полимера декстра-на сопровождался формированием корпускулярной структуры кремнеземного скелета из непористых частиц аэросила и включением в данный остов полимера (декстрана) за счет многоточечной адсорбции на катио-нообменных центрах поверхности кремнеземного носителя. На основе проведенных исследований рекомендованы следующие условия получения кремнеземных аэросильных магносорбентов (KMC): соотношение компонентов синтеза 1:2:5, соответственно Fe203, декстран, аэросил А-380; время гелеобразования 1 час, значение рН гелеобразования 7,0. Получены сорбенты со стандартными структурными характеристиками — удельная поверхность 66 м2/г, объем пор 1,24 см3/г, радиус пор — 38 нм. Разработанный синтез алъдегидосодержащих композиционных магносорбентов методом окисления отличался простотой и технологичностью, активирование носителя осуществлялось в течение 1 часа. Содержание альдегидных групп (0,68 мг-экв/г) на единицу поверхности носителя обеспечивало высокую концентрацию иммобилизованного лиганда. Последним служили иммуноглобулины G, выделенные из гипериммунных сывороток полиэтиленгликолем. На основании научно-исследовательских разработок получен патент РФ № 2102134 от 20.01.1998 «Способ получения им муносорбента».

Так как сырье (аэросил А-380) перешло в разряд импортного, мы перешли к подбору отечественных компонентов с аналогичными

свойствами. Проанализировав ряд научных работ, согласно которым алюминирование кремнезема существенно увеличивает адсорбционную активность в отношении белков (Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С., 1991), а поверхностно-активные вещества оказывают стабилизирующее действие (Лунина М.А. с соавт., 1980), образуя на поверхности частиц мономолекулярный адсорбционный слой, препятствующий сближению частиц (Матусевич Н.П., Рахуба В.К., 1980), нами разработана биотехнология органокремнеземного магносорбента на основе алюмосиликата, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полимера — декстрана и поверхностно-активного вещества — вторичного алкилсульфата натрия (рис. 3).

Для оптимизации структурных характеристик магносорбентов проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза (дек-стран, Ре2Оэ, алюмосиликат), а также изучение влияния времени геле-образования и рН среды на величину удельной поверхности сорбентов, объем и радиус пор. В результате установлено, что увеличение количе- \ ства Ре203 не приводит к резкому изменению структурных характеристик, удельной поверхности, сорбционному объему пор.

Рисунок 3. Схема получения алюмосиликатного МИС

Некоторое увеличение радиуса пор, уменьшение удельной поверхности магносорбентов, вероятно, обусловлено стабилизирующим действием окиси железа, проявляющимся в противодействие процессу, связанному с укрупнением корпускулярных частиц в структуре композиционного сорбента. Поверхностная энергия металла расходуется на образование адсорбционных слоев из молекул среды и растворенных в ней молекул декстрана (Лунина МА. с соавт., 1980). При исследовании влияния продолжительности времени гелеобразования на структурные характеристики магносорбентов установлено, что увеличение продолжительности времени гелеобразования при синтезе МС приводит к увеличению значений удельной поверхности и уменьшению радиуса пор. На наш взгляд, наилучшим значением времени гелеобразования при синтезе сорбентов является 1-2 ч, так как при увеличении времени удлиняется процесс синтеза магносорбента, уменьшается радиус его пор, что приводит к снижению степени иммобилизации лиганда при ковалентном связывании в порах сорбента, стерическим препятствиям образования специфического комплекса антиген-антитело. Проведенные исследования позволили рекомендовать следующие условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 2:2:1, соответственно Ре203, декстран, алюмосиликат; время гелеобразования 2 ч, значение рН гелеобразования 7,0. При исследовании микроструктуры алюмосиликатного магносорбента установлено, что у данного образца наблюдается губчатая структура.

Исследование удельной поверхности показало, что сорбент, не содержащий в своем составе Ре203, имеет удельную поверхность 58 м2/г, объем пор 1,70 см3/г, радиус пор 42,5 нм. Введение магнитного порошка (Ре203) в структуру кремнеземного сорбента изменяет его структурные характеристики: удельная поверхность в данном случае имеет значение 18 м2/г, объем пор 1,19 см3/г, радиус пор 132,2 нм.

Нами проведено химическое активирование МС, для чего разработаны два метода модифицирования твердофазных носителей: окислением (с помощью натрия перхлората) и действием вторичного алкилсуль-фата натрия (ПАВ). В первом случае ковалентное связывание иммуноглобулинов с твердой матрицей осуществлялось через альдегидную группу с образованием азометиновой связи. При активировании ПАВ прочность связи антител с магносорбентом повышается за счет создания дополнительных связей, которые образуются между активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсульфата натрия. В частности, хемосорбция последнего возможна при взаимодействии с аминогруппами белка. Изучена кинетика процесса иммобилизации и оценка связывания иммуноглобулинов с сорбентом. Из полученных данных следует, что двух часов достаточно, чтобы произошло полное насыщение

антителами. Это еще раз доказывает преимущества полученных МИС, так как равновесие меоду антителами и сорбентом — не более 2 часов против 16-18 часов в случае использования обычных органополимер-ных носителей. Концентрация белка иммуноглобулинов 2,5 мг/мл является оптимальной для полного насыщения антителами сорбента в объеме 0,4 мл 10% взвеси, тогда как при использовании иммуноглобулинов с концентрацией белка больше 2,5 мг/мл адсорбционная емкость МИС снижалась. Наиболее вероятно, что зависимость адсорбционной емкости от количества иммобилизованного белка объясняется факторами сте-рического характера (Муромец В.И., Наградова Н.К., 1984). Установлено, что изменение рН раствора иммуноглобулинов во время иммобилизации от 5 до 9,5 не оказывает влияния на специфическую активность и чувствительность МИС, а максимальная адсорбционная емкость сорбента наблюдается при температуре (22 ± 4)°С и (37±1)°С.

На основании данных разработок сконструированы магноиммуно-сорбенты и получен патент РФ № 2138813 от 27.09.1999 «Способ получения иммуносорбента (варианты)».

В результате вышеизложенного по методологическим подходам к разработке биотехнологии диагностикумов схематично определена взаимозависимость методов выделения иммуноглобулинов из иммунных сывороток при конструировании того или иного иммунобиологического препарата (рис. 4).

Рисунок 4. Пригодность вица иммунной сыворотки, способа выделения иммуноглобулинов при производстве различных МИБП

Сочетанные методы экспресс-индикации микроорганизмов с применением магноиммуносорбентов

Для дальнейшего совершенствования экспрессных методов индикации возбудителей опасных инфекционных заболеваний мы объединили метод предварительного концентрирования искомого инфекционного агента на разработанных магноиммуносорбентах с последующей детекцией его в ИФА, КИФА, ХЛИА или ПЦР. Привлечение МИС для проведения этих анализов приводит к целому ряду положительных эффектов (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительная характеристика традиционных и сочетанных экспресс-анализов

Анализы Традиционные экспресс-анализы Экспресс-анализы с МИС (сочеганные)

время постанов- срок годности сенси-бил. твердой фазы исследуемые объекты время постанов-ки, ч срок годности сен-сибил твердой фазы исследуемые объекты

чистая культура загрязненные объекты внешней среды чистая культура загрязненные объекты внешней среды

чувст вительность, м.к. в мл чувствительность, м к. в объеме пробы

ИФА : 21 20 дн 1x105 1x10й 1 10 лет 1х\0 1x102

КИФА 2 - 1x105 1x106 1 - 1x102 1х\02

ХЛИА , 21 1 20 дн. 1x10х" не определяется 2 10 лет 1x10 2 1x10'

ПЦР , 6 - 1x102 ШОМхШ5 3 - 1x102 1x10 ^

Так, например, для ИФА отпадает необходимость использования полистироловых планшет, а срок годности сенсибилизированной твердой матрицы, т.е. МИС, достигает 10 лет против 20 дней иммобилизованных планшет, при увеличении чувствительности (МИС+ИФА) в 1000 раз по сравнению с традиционным ИФА. Важным являлась блокировка свободных центров иммуноферментного конъюгата БСА и количество отмывок после контакта с конъюгатом, так как при отмывке меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т.е. наблюдались фоновые значения оптической плотности в отрицательном контроле.

При использовании МИС с КИФА появилась возможность учитывать реакцию не только визуально, но и количественно (с помощью вольтметра), без приготовления мазков и их фиксации при чувствительности, в 1000 раз превышающей традиционную РИФ.

Сочетание магноиммуносорбции с ХЛИА впервые позволило проводить исследование объектов внешней среды, так как из-за серьезных фоновых помех, низкой концентрации патогена и наличия посторонней микрофлоры ХЛИА без МИС при исследовании таких проб не пригоден; исключить необходимость иммунной сенсибилизации планшет и создать возможность использования для постановки реакции стеклянных пробирок, что упрощает и удешевляет анализ. На данные разработки получен патент РФ на изобретение № 2218411 от 10.12.2003 «Способ обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды».

Использование магноиммуносорбентов в ПЦР позволило максимально сконцентрировать исследуемый микроорганизм и исключить отрицательное влияние на компоненты реакции всевозможных примесей различного происхождения, поскольку некоторые из них способны значительно снижать чувствительность ПЦР за счет угнетения активности термостабильной ДНК-полимеразы.

Как показали экспериментальные исследования, оптимальными режимами концентрирования и инкубирования исследуемой культуры с магно-иммуносорбентом являются: количество МИС — 5 мкл/мл, инкубация — 15 мин. Сочетайное проведение МИС с ПЦР осуществляли следующим образом: магноим-муносорбент после контакта с исследуемым материалом и промывки суспендировали в 0,1 мл деионизированной воды и прогревали на водяной бане при 100°С в течение 30 мин для лизиса клеток и стерилизации исследуемого материала. Для сибиреязвенного микроба предварительно проводили посев на бульоне Хотгингера в течение 2-3 ч, а затем кипятили 1 ч. Аликвоту в 5 мкл исследовали в ПЦР со специфичными праймерами для амплификации ДНК соответствующих видов искомых микроорганизмов. Положительными контролями служили образцы ДНК гомологичных микроорганизмов. На данные разработки получен патент РФ на изобретение № 2223499 от 10.02.2004 «Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды».

Отработанные методические приемы по предварительному селективному концентрированию патогенов на МИС с последующей их детекцией в экспрессных методах отражены в ряде методических рекомендаций и схематично представлены на рис. 5.

Разработаны тест-системы магноиммуносорбентные со всеми необходимыми ингредиентами для постановки экспресс-анализов, которые испытаны как в лабораторных, так и в полевых условиях. В июне 1994 г. и 2003 г. проводились учебно-тренировочные занятия в полевых условиях специализированной противоэпидемической бригады (СПЭБ) Ставропольского научно-исследовательского противочумного института при участии представителей МЧС по индикации возбудителей особо опасных инфекций в зашифрованных пробах (смывы из внешней среды).

Общепринятые методы экспресс-диагностики дали отрицательные результаты на первом этапе исследования нативного материала в связи с низкой концентрацией возбудителей инфекций в пробах (ниже чувствительности методов). Использование же МИС позволило в течение 1,5 — 2 ч выявить в зашифрованных пробах соответствующих возбудителей особо опасных инфекций, что в дальнейшем было подтверждено общепринятыми методами.

1 —I

>п

Ш.Ы

Исследуе- Отмыв доОаи

мыи

чатериат

ление мертио-

J ыта натрия

11рогревание на водяной бане 56 "С 60 мин

для с/я

Подращивание 2-3 ч в бульоне Хотгаш ера

Прогревание на водяной бане 100°С ,40 60 мин 1-1_

Цен грифу- I гирование ] 0 ! тыс g, 10 мин '

Г*

Рисунок 5. Схема проведения анализов с применением МИС

Обозначения: 1 — пробирка (флакон); 2 - стеклянный чехол;

3 — магнитная палочка; 4 — постоянный магнит;

5- гранулы МИС; ч, т, б, л, с/я — чума, туляремия, бруцеллез, лептоспироз, сибирская язва.

Магноиммуносорбенты были применены но время вспышки холеры в Республике ДЭ1естан в 1994 г , где удалось выявить 15 положительных результатов на холеру; общепринятым бактериологическим методом нй в одном случае выделить культуру холерного вибриона не удалось (Тю-менцева И.С., 1996). В работе специализированной противоэпидемической бригады Ставропольского НИПЧИ в 1995 г. в Чеченской Республике выделено 14 культур холерного вибриона Эльтор против 3 культур, выделенных общепринятым бактериологическим методом. Магноиммуносорбенты были испытаны при выявлении возбудителя туляремии во внешней среде. Исследования проводились в Ставропольском крае в

1999 г. При этом из 116 проб 16 дали положительный результат в ИФА с магноиммуносорбентами, что в дальнейшем было подтверждено бактериологическим и серологическими методами. На протяжении 19972003 гг. на территориях Краснодарского и Ставропольского краев проводились полевые испытания тест-системы полигрупповой диагностической лептоспирозной. В 1998 г. она нашла успешное применение при локализации и ликвидации вспышки лептоспироза среди людей и сельскохозяйственных животных в г. Абинске Краснодарского края. При обследовании водоемов, подозрительных на контаминацию патогенными лептоспирами, в 25% случаев был выявлен положительный результат (Бинатова В.В. с соавт., 2001).

Трепонемные антигенные магноиммуносорбенты на основе кремнезема апробировали при исследовании материала от больных, предоставленного из Ставропольского кожвендиспансера. Позитивность теста при использовании Треп-МИС в ИФА выше на 4,3% случаев по сравнению с РСК (Базиков И.А., 2001). Биотехнология способа диагностики сифилиса с помощью магноиммуносорбентов защищена патентом РФ № 2200327 от 10.03.2003 «Способ диагностики сифилиса (варианты)». Диагностическая ценность разработанного антигенного МИС бруцеллезного была определена при исследовании сывороток беременных женщин (1326), здоровых и с отягощенным акушерским анамнезом (Ставропольский родильный дом). С использованием МИС выявлены положительные сыворотки крови (у 14 больных) с более высокими титрами специфических антител, чем в традиционных методах иммуно-анализа (ИФА и НРИФ).

Исследованы возможности выявления возбудителей бруцеллеза, сибирской язвы в пищевых продуктах. Объектами исследований служили жидкие (молоко, простокваша) и плотные (брынза, мясо) пищевые продукты, контаминированные перечисленными выше микроорганизмами. После инкубации проб с МИС в течение 1-1,5 часов, последние извлекали магнитной сепарацией и использовали в качестве твердой фазы в ИФА и РИФ. Лабораторные испытания показали высокую чувствительность и специфичность диагностикумов (ЬсЮМхЮ3 м.к./мл) и возможность их применения при ветеринарно-санитарном мониторинге различных сельскохозяйственных продуктов (Ефременко В.И. с соавт., 1995).

Кроме того, магноиммуносорбентные сибиреязвенные антиспоровые дйагностикумы были неоднократно испытаны в полевых условиях параллельно с классическим методом, в полимеразной цепной реакции, иммуноферментном анализе и количественной иммунофлуорес-ценции (Егегаепко Е.1. е1 а!., 1999).

Таким образом, нами сконструированы аффинные магноиммуносор-бенты на основе органокремнеземной матрицы, испытания диагностической ценности которых в лабораторных и полевых условиях показали

возможность эффективного использования МИС при исследовании объектов внешней среды (детекции возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии, холеры, чумы, лептоспироза) в сочетанных экспрессных анализах — ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР с чувствительностью МО2 — 5х102 м.к. в исследуемой пробе.

Опыт конструирования и применения магноиммуносорбентов выявил еще одну важную сторону их использования при производстве МИБП.

Для получения качественных диагностических препаратов необходимы высокоактивные, специфичные сыворотки. Как правило, сыворотки, полученные иммунизацией животных, недостаточно специфичны, поэтому необходима сорбция антител, дающих перекрестные реакции с гетерологичными штаммами. Результаты предыдущих исследователей и наш собственный опыт показали, что сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител, зачастую приводя к полной непригодности сырья. Мы использовали твердофазный полиакриламидный сорбент на основе водорастворимых антигенов из гетерологичных штаммов, микрогранулируя его продавливанием через фильеры. Титры специфических антител снижались незначительно (в 1,5-2 раза) и конечный продукт оставался качественным сырьем для дальнейшей работы. Но так как технология приготовления полиакриламидных сорбентов базируется на использовании высокотоксичных импортных реактивов и довольно трудоемка, мы впервые для этих целей использовали разработанный аффинный сорбент с магнитными свойствами, где в качестве твердой фазы выступает кремнезем-алюмосиликат. МС готовили по вышеописанному методу со следующими соотношениями компонентов — 5:1:1 (алюмосиликат, декстран, оксид железа). Активирование сорбента производили вторичным ал килсул ьфатом натрия. Для придания магносорбенту аффинных свойств на его поверхность иммобилизовали белковые лиганды - водорастворимые антигены (2,5 мл с концентрацией белка 2 мг/мл), полученные из гетерогенных штаммов микроорганизмов. После инкубации, используя постоянный магнит (при этом отпадает необходимость центрифугирования или фильтрования) для фиксации МИС, сыворотку сливали. Сорбент регенерировали и использовали 10-15 раз. Магнитные свойства иммуносорбента позволили значительно упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования. В процессе сорбции иммунной сыворотки использование данного иммуносорбента позволило не только освободить препарат от неспецифических антител на одном этапе, но и сохранить первоначальную активность нативных сывороток (табл. 2). При этом сорбент можно использовать многократно путем десорбции антител раствором калия роданистого. На биотехнологию изготовления МИС антигенного на основе алюмосиликата и способ сорбции получен па-

тент РФ № 2200324 от 10.03.2003 «Способ сорбции иммунной сыворотки крови».

Таблица 2. Результаты контроля активности и специфичности сыворотки сибиреязвенной (споровой формы) в НРИФ

Мазки со взвесями культур Визуальная оценка специфической люминесценции (4-крестовая) в мазках, окрашенных иммуноглобулинами флуоресцирующими антикроличьими

до сорбции после сорбции

1:1600 1.3200 i 1:6400 1:1600 1.3200 1:6400

B.anthracis СТИ 44 33 i 22 44 33 22

B.anthracis Sterne 44 33 22 44 33 22

B.anthracis (ICO) 44 44 33 44 43 22

В cereus 183 33 22 -- --

B.cereus 111 33 22

B.cereus 8 33 22

B.cereus 250 44 33 32 22

B.cereus 104 44 33 1 22 —

В cereus 96 44 33 i 22 22

B. megatenum 5 33 22 ! -- -

B. megatenum 1 44 33 1 22 22

B.megaterium 1024 22 1- --

Обозначения: «--« — отрицательный результат,

1, 2, 3, 4 — интенсивность свечения по 4-крестовой оценке; 1-, 22, 32 и т.д. — интенсивность свечения в двух повторных опытах.

Все иммунобиологические препараты, разработанные нами, а также и биологическое сырье для их производства нуждались в стабилизации их исходных свойств. До настоящего времени лучшим методом консервации свойств биополимеров является их лиофилизация. В связи с тем, что названные выше диагностические препараты и сырье для их производства имеют (каждый) свой порог биодеградации, необходим был единый экономичный режим их высушивания. Одним из специальных приемов, способных защитить диагностикумы при замораживании и лиофилизации, является применение защитных сред. В результате многочисленных опытов нами были изготовлены серии диагностикумов эрит-роцитарных иммуноглобулиновых с различными защитными средами. Наилучшие результаты получены при использовании полиглюкина с твин-80 и азидом натрия. При применении данных защитных сред образуется прочная мелкопористая таблетка. Специфическая активность препаратов сохраняется и через 48 месяцев.

Лиофилизацию проводили на установке для сублимационной сушки ЬХ- 9с при двух режимах: «умеренном» (длительность удаления свободной воды — (14 — 15) ч, связанной влаги — (10 — 11) ч, конечная температура подогрева — (25±1) "С, общая длительность процесса сушки — (25 ± 1) час) и «ускоренном» (рис. 6).

«Г

а. &

в 8

время, ч

десублимат.

•подогрев

■ продукт ■вакуум

■■§•-•— —•

8 • 10 11 , 12 13 14

-70 -70 -70 -70 -70 -70 -70

45 45 45 45 45 45 45

10 25 30 35 35 35 35

10 10 10 10 10 10 10

Рисунок 6. Режим лиофилизации препаратов (14-часовой)

Длительность периода сублимации и десорбции при данном режиме предусмотрены в течение (14 ± 1) ч при повышении температуры плиты до (45 ± 1 )°С. Замораживание препаратов проводили при температуре минус 40°С, т.е. достаточно низкой, чтобы избежать оттаивания, но и достаточно высокой, чтобы не удлинять процесс высушивания. Сокращено время удаления не только свободной, но и связанной воды в препарате за счет глубокого вакуума —10 Па, интенсивного (до 45°С), плавного подвода тепла и низкой температуры десублиматора — минус 70°С, тем самым исключено оттаивание и вспенивание препарата при сохранении его свойств, по всем показателям полностью удовлетворяющим требованиям нормативной документации.

После лиофилизации «умеренным» и «ускоренным» режимами, а также через 7-10 лет хранения (срок наблюдения) показатели контроля специфической активности, чувствительности МИБП, других их показателей (растворимости, прозрачности) оставались на уровне исходных. Результаты данных экспериментов позволяют рекомендовать этот довольно жесткий, но эффективный режим сублимации при производстве МИБП.

В итоге проведенных исследований подтверждены основные методологические подходы к разработке, изучению и производству диагностических препаратов. Составлена принципиальная схема производства (рис. 7), которая складывается из последовательных стадий и операций, характерных для каждого конкретного препарата.

Рисунок 7. Принципиальная схема производства диагностикумов

выводы

1. Подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций (водно-солевая экстракция, механическая и ультразвуковая дезинтеграция), позволяющий изолировать полноценные белковые антигенные фракции микроорганизмов (с активностью в РИД 1:16- 1:128), относящихся к различным родам и видам, в количестве, достаточном для производственных целей.

2. Отработана производственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами специфических антител, основанная на оптимальной комбинации комплекса специфических антигенов и им-муномодуляторов, обеспечивающая 100% иммунный ответ у животных, снижение материальных, трудозатрат, и проведена сравнительная оценка преимущества (или недостатка) того или иного способа выделения иммуноглобулинов при конструировании различных МИБП (иммуно-ферментных, иммунофлуоресцентных, суспензионных).

3. Определены оптимальные параметры биотехнологии производства им-муноферментных тест-систем (эффективный метод выделения иммуноглобулинов- с помощью ПЭГ- 6000, обработка полистироловых планшет парами бензальдегида, фиксация сенсибилизированных планшет диэгиловым эфиром) и флуоресцирующих иммуноглобулинов (значение рН реакционной смеси — 9,5, нагрузка красителя на белок — 20 мг/г, температура конъюгации — 20°С, 4-часовой контакт белка с красителем), позволяющие получать диагностикумы, отвечающие ОМБТ, предъявляемым к индикационным препаратам. Разработан бивалентный ферментно-люминесцентный конъюгат, дающий возможность единовременного проведения трех экспрессных анализов (традиционного ИФА, ИФА на стекле и РИФ).

4. Унифицирована биотехнология производства эритроцитарных ди-агностикумов для обнаружения возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, листериоза за счет формалинизации эритроцитов барана путем дозированной подачи формалина, в качестве конъюгирующего агента определен вторичный алкилсульфат натрия в концентрации 2%; температура сенсибилизации антител с эритроцитами — 4543; рН раствора при сенсибилизации — 5,0.

5. Разработаны методические приемы изготовления суспензионных диагностикумов для реакции агглютинации на основе пол иакроле и ново й и алюмосиликатной матриц. По высокой чувствительности (1,56х106- 3,12х106 м.к./мл), специфичности эти препараты не уступают традиционным эритроцитарным диагностикумам, но превосходят их по экспрессности (постановка и учет РСА на стекле проходит в течение 1 -5 мин), стандартности и экономичности технологии производства (время приготовления алюмосиликатных диаг носгикумов —3 ч).

6. Впервые разработаны научно-методические основы конструирования микрогранулированных органокремнеземных аффинных сорбентов с магнитными свойствами, обладающих стандартностью структурных характеристик (удельная поверхность 18 м2/г, объем пор 1,19 см3/г, радиус пор 132,2 нм), высокой адсорбционной активностью и емкостью, механической и химической прочностями. Структура этого носителя способствует эффективному образованию иммунохимического комплекса антиген-антитело, исключает внутридиффузионное торможение при проведении экспрессных методов лабораторного анализа.

7. Разработаны методические приемы по сочетанному применению селективного концентрирования микроорганизмов и их антигенов на магноиммуносорбентах с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей традиционные, что значительно повышает достоверность как положительных, так и отрицательных результатов исследований. При этом сокращается время проведения анализов до 1-3 ч.

8. Впервые разработан и применен аффинный сорбент с магнитными свойствами для проведения иммуносорбции гетерологичных антител из иммунных сывороток, позволяющий получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускоряя и упрощая процесс сорбции, дающий возможность использовать его многократно после регенерации.

9. Для сохранения исходных свойств иммунобиологических препаратов и биологического сырья для их производства отработан экономичный ускоренный режим сублимации (14-часовой), позволяющий одномоментно лиофилизировать биополимеры, имеющие различный порог биодеградации, при ускорении удаления не только свободной, но связанной влаги за счет глубокого вакуума — 10 Па, низкой температуры десубли-матора — минус 70°С, высокого, плавного подвода тепла до 45°С.

10. Диашостическая ценность разработанных МИБП и методических приемов подтверждена в экспериментах, клинических и тюлевых условиях, а также при эпидемических вспышках инфекционных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При получении наиболее полных и активных антигенных комплексов микроорганизмов проводить извлечение антигенного материала ьу-тем последовательной водно-солевой экстракции и дезинтеграции. П{Ьи производстве иммунных (гипериммунных) сывороток необходимо стре-

миться не только получить высокоактивные и специфичные антитела, но и учитывать конечную цель (класс искомых иммуноглобулинов и пр.). В зависимости от этого подбирать соответствующую схему иммунизации с использованием иммуномодуляторов и адъювантов, повышающих выход антител при снижении вводимых доз антигена. Для каждого конкретного диагностикума проводить подбор метода выделения иммуноглобулинов, так как каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.

2. Перед постановкой ИФА проводить обработку полистироловых планшет парами бензальдегида (при этом увеличивается чувствительность ИФА в 4 раза).

3. При конструировании суспензионных диагностикумов необходимо тщательно подбирать нагрузку лиганда опытным путем. При конструировании эритроцитарных диагностикумов формалинизацию эритроцитов осуществлять путем дозированной подачи формалина; в качестве конъюгирующего агента использовать вторичный алкилсулъфат натрия, pH раствора при сенсибилизации 5,0.

4. При получении магноиммуносорбентов рекомендуем использовать в качестве носителя алюмосиликат. Для прочной иммобилизации лиганда использовать перхлоратное окисление или вторичный алкилсуль-фат натрия.

5. Качественную и эффективную иммуносорбцию сывороток от неспецифических компонентов можно осуществлять с помощью аффинных магноиммуносорбентов, полученных иммобилизацией с гетероло-гичными антигенами. Наличие у сорбента магнитных свойств упрощает и ускоряет процесс очистки.

6. Проводить селективное концентрирование на магноиммуносорбенте (используя магнитные ловушки, постоянный магнит) с последующей постановкой ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР. При постановке анализов можно использовать флаконы, пробирки, планшеты.

7. Для увеличения срока годности диагностических препаратов рекомендуем эффективный ускоренный режим лиофилизации (14=часовой): (замораживание препаратов — при температуре минус 40°С, вакуум — 10 Па, плавный интенсивный (до 45°С) подвод тепла и температура десублиматора — минус 70°С).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Буравцева Н.П., Фунтикова Т.Н., Матющенко Л.С., Чернова ЭА, Жар-никова И В., Барковский С.С. Получение антиспоровых люминесцирующих иммуноглобулинов при использовании антигена из вакцинного сибиреязвенного штамма 228/8 // Профилактика чумы и других природно-очаговых инфекций: Материалы Всесоюз. научи, конф. — Ставрополь, 1983. — Т. 2. — С. 33-34.

2. Мирошниченко А И., Жарникова И.В., Лопаткин О.Н. Некоторые особенности процесса сублимационной сушки антигенов, сывороток и иммуно-глобулиновых диагностических препаратов против ООИ // Особо опасные инфекции на Кавказе: Материалы докл. 6 краев, конф., поев. 70-летию ВОС рев. - Ставрополь, 1987. - Ч. И. - С. 22-25.

3. A.c. № 1425910 СССР, МКИ3 А 61 К 39/02. Способ получения туляре-мийного антигена / Василенко Н.Ф., Кронгауз И.В., Лопаткин О.Н., Баси-лова Г.И., Жарникова И.В. Зарегистрировано в Гос реестре изобретений СССР 22.05.88 г.

4. A.c. № 286000 СССР, МКИ3 А 61 К 39/02. Способ получения иммуноглобулинов диагностических чумных, сапных, мелиоидозных, туляремий-ных, бруцеллезных, сибиреязвенных адсорбированных полигрупповых лю-минесцирующих сухих / Манолов А.Д., Лопаткин О.Н., Высочинская H.H., Волков Е.А., Мананков В.В., Ливень H.H., Замарин А.Е., Жарникова И.В., Жаркова С.Ф., Кронгауз И.В. Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 1.12.88 г.

5. Жарникова И.В., Лопаткин О.Н., Кальной С.М. Сравнительная характеристика активности различных иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных люминесцирующих сухих при различных условиях хранения // Иммунология и специфич. профилакт. опасных инфекций: Материалы Рос.на-уч.конф. - Саратов, 1993. - С.259.

6. Жарникова И.В., Михайлова М.И., Кальной С.М. Модифицированный способ постановки ИФА // Иммунология и специфич. профилакт. особо опасных инфекций: Материалы Рос. науч. конф. - Саратов, 1993. — С.283.

7. Кальной С.М., Жарникова И.В., Зайцев A.A. Контроль сорбируемой емкости поверхностей с помощью серологических реакций с физическими носителями // Иммунология и специфич. профилакт. особо опасных инфекций: Материалы Рос. науч. конф. - Саратов, 1993. - С.282.

8. Тюменцева И.С., Жарникова И.В, Жданова Е.В. Сравнительная характеристика иммуноглобулинов, выделенных разными способами // Акт. вопр. профилакт. чумы и др. инф. заб: Материалы Межгос. науч.-практ. конф. — Ставрополь,1994. - С. 211-212.

9. Жарникова И.В., Брыкалов A.B., Тюменцева И.С. Опыт конструирования композиционных магноиммуносорбентов для диагностических тест-систем//Акт. вопр. профилакт. чумы и др. инф. заб: Материалы Межгос. науч.-практ. конф. - Ставрополь, 1994. - С.224-225.

10. Жарникова И.В., Мирошниченко А.И., Брыкалов A.B. Стабилизация композиционных магноиммуносорбентов (КМИС) методом лиофилизации // Современные достижения биотехнологии: Материалы Первой конференции Северо-Кавказского региона. - Ставрополь, 1995. — С.89.

11. Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H., Жарникова И.В., Брыкалов A.B. Индикация возбудителей особо опасных инфекций с помощью композиционных магноиммуносорбентов. — 6 с. — Деп. в ВИНИТИ 25.01.95. — № 221-В95.

12. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Брыкалов A.B., Жарникова И.В. Новые препараты для диагностики и ветеринарно-санитарного мониторинга //Пища. Экология. Человек: Материалы Междун науч.-техн конф. — М., 1995. — С. 206.

13. Жарникова И.В , Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Василенко Н.Ф. Разработка магносорбентов для экспресс-диагностики возбудителей ООИ путем различных методов иммобилизации // Эпидем. и клинико- иммунолог, аспекты профилакт. важнейших инф.заболеваний: Материалы Астраханской конф.—Астрахань, 1996. — С. 115-116.

14. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H. Некоторые аспекты технологии получения органокремнеземных магнитоуп-ранляемых сорбентов // Материалы науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочум. службы России — Саратов, 1997. — Т.2. — С. 177.

15. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H. Условия адсорбции специфического иммуноглобулина на кремнеземе // Материалы науч -практ. конф., поев. 100-летию образования противочум службы России - Саратов, 1997. - Т.2. - С.254.

16. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H. Способ определения специфического комплекса антиген-антитело ускоренным методом // Материалы науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочум. службы России - Саратов, 1997. - Т.2. - С. 176.

17. Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Жарникова И.В., Афанасьев E.H., Мезенцева О.Н. О разработке магншоуправляемого туляремийного иммуно-сорбента // Материалы науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочум. службы России — Саратов, 1997. — Т.2. — С.227.

18. Жданова Е.В., Малецкая О.В., Жарникова И.В., Тюменцева И.С. Выбор метода выделения иммуноглобулинов для получения высокоактивных диагностических препаратов// Материалы науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочум. службы России — Саратов, 1997. — Т.2. - С.255.

19. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Жарникова И.В., Афанасьев E.H., Василенко Н.Ф., Бинатова В.В., Сун Чжичжоу. К вопросу о совершенствовании лабораторной диагностики особо опасных инфекций // Проблемы сани-тарно-эгоадем. охраны территории стран Содружества Независимых Государств: Материалы, докл. Междун. науч.-практ. конф. — Саратов, 1998. — С.137-139.

20. Жарникова И.В., Афанасьев E.H., Жданова Е.В., Тюменцева И.С. Сравнительная характеристика различных способов очистки флуоресцирующих конъ-югатов от свободного красителя // Диагностика, лечение и профилактика опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбил. науч. конф., поев 70-летию НИИ микробиол. МО РФ. - Киров, 1998. - С.94-95.

21. Жарникова И В., Касторная М.Н., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H. Увеличение срока годности сенсибилизированных планшет // Диагностика, лечение и профилактика опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария- Материалы юбил. науч. конф., поев. 70-летию НИИ микробиол. МО РФ. — Киров, 1998.-С. 96.

22. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H. Упрощение конъюгации иммуноглобулинов с ферментом // Диагностика, лечение и профилактика

опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбил. науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиол. МО РФ. - Киров, 1998. - С. %-97.

23. Жарникова И.В., Жданова Е.В., Афанасьев E.H., Тюменцева И.С. Стабилизация эритроцитарныхдиагностикумов//Диагностика, лечение и профилактика опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбил. науч. конф., посвяш. 70-летию НИИ микробиол. МО РФ. — Киров, 1998.-С. 95-96.

24. Патент на изобретение № 2102134 6 В 01 J 20/10,20/32. Способ получения иммуносорбента / А. В. Брыкалов, И. В. Жарникова. — Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 20.01.98 г. Бюл.№ 2.

25. Патент на изобретение № 2138813 6 G 01 N 33/543, А 61 К 39/385, С 12 N 11/14. Способ получения иммуносорбента (варианты) / Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H., Бина-това В.В. - Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 27.09.99 г. Бюл.№ 27.

26. Тюменцева И.С., Будыка Д.А., Афанасьев E.H., Жданова Е.В., Иванова Г.Ф., Жарникова И.В. Создание, совершенствование и перспективы дальнейшего развития производства диагностических и профилактических препаратов в СтавНИПЧИ // Акт. вопр. эпиднадзора карантинных и других о. о. и.: Материалы юбил. конф. - Ставрополь, 19-20 ноября, 1997. - 6 с. — Деп. в ВИНИТИ 14.05.99 №1522- В99.

27. Афанасьев E.H., Тюменцева И.С., Егшатян Т.И., Жарникова И.В. К вопросу люминесцентно- серологической идентификации возбудителей лис-териоза // Листериоз на рубеже тысячелетий: Материалы Междун. симпозиума (18-20 мая). - Покров, 1999. - С. 90-91.

28. Efremenko V.l., Tyumentseva LS., Song Zhizhong, Afanasiev E.N., Zharnikova I.V., Markova T.V. Combined application of magnoimmunosoibents and PCR a new method for the indication of Yersinia pestis // Chinese Journal of Control of Endemic Disease. - 1999. - V. 14. - P. 72.

29. Zharnikova I.V., Tyumentseva I.S., Afanasiev E.N.. Efremenko V.l., Song Zhizhong. Development of magnetoimmunosorbent diagnosticums for the detection of Yersini pestis using rapid methods //Chinese Journal of Control of Endemic Disease. - 1999. - V. 14 - P. 73.

30. Афанасьев Е.И., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Еременко Е.И., Касторная М.Н., Маркова Т.И., Сергеев Д.В. Совершенствование экспресс-методов индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний. - Ставрополь, 2000. - 11 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.02.2000, №362 - В00.

31. Жарникова И.В., Жданова Е.В., Афанасьев E.H., Тюменцева И.С., Маркова Т.В., Касторная М.Н., Юркина И.В. Конструирование туляремий-ного бифункционального диагностикума // Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем: Материалы 3-й Междун. науч.-практ. конф. - Махачкала, 2001. - С. 68-69

32. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Ефременко В.И., Юркина И.В., Жданова Е.В. Обнаружение туляремийного микроба в объектах внешней среды экспрессным методом с помощью магноиммуносорбен-тов // Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе: Матери-

алы науч. конф , поев. 70-летию биолого-хим. факультета. — Ставрополь, 2001.-С. 42-43.

33. Жарникова И.В., Жданова Е.В., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Маркова Т В. Аффинная очистка с помощью магноиммуносорбентов // Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе: Материалы науч. конф., посвящ. 70-летию биолого-хим. факультета. — Ставрополь, 2001. — С.44.

34. Бинатова В.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H., Жарникова И.В. Разработка магноиммуносорбентной тест- системы для индикации лептоспир в объектах внешней среды // Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе: Материалы науч. конф., поев. 70-летию биолого-хим. факультета. - Ставрополь, 2001. - С. 12-13.

35. Zharnikova I.V.,Tymentseva LS., Afanasiev E.N., Efremenko V.l., Zhdano-va E.B., Tikhenko N.L, Levchenko B.I., Yurcina I.V. Detection uf the causative agent of tularemia in environmenal objects by an express method using magnetoimmmunosorbents // Natural infectios diseases:Abstracts of scientific conference. - Ulaanbaator, 2001. - P. 81-83.

36. Касторная M.H., Афанасьев E.H., Тюменцева И.С, Ефременко В.И., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Климова И.М. Хемилюминесцентный им-муноанализ в лабораторной диагностике бруцеллеза с использованием МИС // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Материалы Меж-дун. науч.-практ.конф. «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы». — Алматы, 2001. — Вып.З. — С. 116—119.

37. Жарникова И.В., Афанасьев E.H., Тюменцева U.C., Ефременко В.И., Жданова Е.В., Тихенко Н.И., Левченко Б.И., Маркова Т.В, Юркина И.В., Касторная М.Н. Биотехнологическое конструирование магноиммуносорбентов, применяемых в мониторинге возбудителя туляремии // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Материалы Междун. науч.-практ.конф. «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы». — Алматы, 2001. - Вып. 3. - С. 104-107.

38. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Жарникова И.В., Василенко Н.Ф., Еременко Е.И., Жилченко Е.Б. Новые препараты для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний и их применение в чрезвычайных ситуациях//ЖМЭИ. Приложение. — 2001. — № 6. — С.55-58.

39. E.Eremenko, E.Afanasiev, V.Efremenko, A.Abgaryan, O.Tsygankova, I.Zharnikova., E.Zhdanova, N. Sarkisova. Use of Immune Magnetic Separation And PCR For BaCillus antracis Detection In Soil Samples Program and Abstracts Book // 4-th International Conference on Anthrax. - Maryland, USA. - 2001. - P. 22.

40. Воробьева О.В., Анисенко О.В., Жарникова И.В. Применение биосорбентов для экспресс-диагностики возбудителя туляремии // Современные достижения биотехнологии: Материалы 2-й Всерос. науч.-технич. конф. — Ставрополь, 12-13 сентября 2002. - С. 136-137.

41. Жарникова И.В., Тюменцева U.C., Афанасьев Е.Н, Ефременко В.И , Жданова Е.В., Борисенко О.В. Биотехнология иммуносорбентных диагнос-тикумов для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций // Современные достижения биотехнологии: Материалы 2-й Всерос. науч.-технич. конф. — Ставрополь, 12-13 сентября 2002. — С. 162-164.

42. Жарникова И.В. Изучение стабильности магноиммуносорбентов // Эпидемиологическая безопасность. Итоги и перспективы: Материалы юбилейной науч.-практич. конф., поев. 50-летию СтавНИПЧИ - Ставрополь,

2002.-С. 102-104.

43. Касторная М.Н., Жданова Е.В., Жарникова И.В., Зайцев А.А Разработка латексного антигенного диагностикума для обнаружения специфических бруцеллезных антител // Эпидемиологическая безопасность. Итоги и перспективы: Материалы юбилейной науч.-практич. конф. — Ставрополь, 2002. — С. 118-120.

44. Патент РФ № 2200327 С 2 7 G 01 N 33/543, 33/571. Способ диагностики сифилиса (варианты) / Базиков И.А., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев E.H., Жарникова И.В. — Зарегистрир. в Гос. реестре изобретений РФ 10.03.2003. Бюл. №7.

45. Патент РФ № 2200324 С 2 7 G 01 N 33/53. Способ сорбции иммунной сыворотки крови / Афанасьев E.H., Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Жарникова И.В., Жданова Е.В. - Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 10.03.2003. Бюл. №7.

46. Жарникова И.В. Унификация технологии изготовления диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого // Пробл. особо опасных инфекций. — Саратов, 2002. — Вып. 1 (83). — С. 142-148.

47. Ляпустина JI.B., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Жарникова И.В., Соколова И.А., Малецкая О.В. Лиофильное высушивание как способ консервации бруцеллезных диагностических бактериофагов // Пробл. особо опасных инфекций. - Саратов, 2002. - Вып. 1 (83). - С. 159-165.

48. Жарникова И.В. Разработка люминесцентно-ферментного конъюгата для выявления возбудителя туляремии // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Приложение. — Ростов-на-Дону, март 2003. - №2. - С. 48-51.

49. Жарникова И.В., Алиева Е.В., Касторная М.Н. Магноиммуносорбент-ные методы диагностики// Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Приложение. — Ростов-на-Дону, март

2003,-№2.-С. 51-54.

50. Ефременко В.И., Зайцев A.A., Жарникова И.В., Богданов И.К. Совершенствование методов индикации возбудителей природноочаговых инфекций в условиях чрезвычайных ситуаций с эпидемиологическими последствиями // ЖМЭИ. - 2003. - № 6. - С. 37-42.

51. Абгарян А.Г., Еременко Е.И., Ефременко В.И., Афанасьев E.H., Жарникова И.В. Совершенствование метода индикации возбудителя сибирской язвы//ЖМЭИ. - 2003. - № 6. - С.47-51.

52. Жарникова И.В. Магноиммуносорбенты и изучение их стабильности в зависимости от срока хранения // Пробл. особо опасных инфекций. — Саратов, 2003. - Вып. 1 (85). - С. 171-178.

53. Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Ефременко В.И., Жарникова И.В Тенденции развития научно-исследовательских работ по разработке и усовер-

шенствованию диагностических препаратов по особо опасным и другим инфекциям // Биоресурсы. Биотехнологии. Инновации Юга России: Материалы Междун. науч.-практич. конф. - Ставрополь- Пяти горе к, 2003. — С. 175-179.

54. Жарникова И.В. Иммобилизованные диагностические препараты и их стабильность // Междун. конгресс «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы». — С-Пб., 2003. — С. 163.

55. Жарникова И.В. Стабилизация биологического сырья и диагностических препаратов методом лиофильного высушивания.— Ставрополь, 2003. — 22 с. - Деп. в ВИНИТИ 26.12.2003, № 2288 - В 2003.

56. Патент РФ № 2218411 С 12 0 1/04, в 01 N 33/53, 33/543, 33/560. Способ обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды/ Ефременко В. И., Тюменцева И.С., Касторная М.Н., Афанасьев Е.Н., Жарникова И.В., Жданова Е.В. —Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ

10.12.2003. Бюл. №34.

57. Жарникова И.В., Жданова Е.В. Унификация биотехнологии производства эритроцитарных диагностикумов и изготовление суспензионных диаг-ностикумов на основе полиакролеиновой и алюмосиликатной матриц. — Ставрополь, 2004. - 26 с. - Деп. в ВИНИТИ 26.02.2004, № 346 - В 2004.

58. Жарникова И.В. Структурированный керамический носитель с магнитным материалом для иммобилизации антител // Биотехнология. — 2004. — №1.- С. 71-79.

59. Афанасьев Е.Н., Брюханов А.Ф., Брюханова Г.Д., Тюменцева И.С., Сун Чжичжоу, Жаринова Н.В., Ефременко В.И., Жарникова И.В. Обнаружение чумного микроба в блохах методом полимеразной цепной реакции с использованием магноиммуносорбентов // Медицинская паразитология и паразитарные болезни.— 2004. — №1. — С.33-36.

60. Жарникова И.В. Разработка суспензионного диагностикума для выявления возбудителя туляремии в реакции суспензионной агглютинации // ЖМЭИ. - 2004. - № 1. - С. 67-69.

61. Патент РФ № 2223499 О 01 N 33/543, С 12 0 1/04. Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды / Абгарян А.Г., Еременко Е.И., Ефременко В.И., Саркисова Н.В., Жарникова И.В., Афанасьев Е.Н., Жданова Е.В. — Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ

10.02.2004. Бюл. №4.

62. Жарникова И.В., Еременко Е.И., Абгарян А.Г. Сочетанные методы детекции микроорганизмов с магноиммуносорбентами.— Ставрополь, 2004. - 33 с. - Деп. в ВИНИТИ 14.04.2004, № 625 - В 2004.

63. Патент РФ № 2228764 А 61 К 39/44 в 01 N 33/543, 33/551. Способ получения суспензионного диагностикума (варианты)/ Жарникова И.В., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С. — Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 20.05.2004. Бюл. №14.

РНБ Русский фонд

2006-4 4574

Подписано в печать 10.08.04. Бумага офсетная. Формат 60x84 '/|6 Гарнитура «Тайме». Усат. печ. л. 2,3. Тираж 100 экз. Заказ 487.

Издательство Ставропольского государственного аграрного университета «АГРУС» 355019, Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12.

Отпечатано в типографии издательско-полиграфического комплекса «АГРУС» г. Ставрополь, ул. Мира, 302. |

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Жарникова, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. АНАЛИЗ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС- ДИАГНОСТКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И МАТРИЦ ДЛЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ СИСТЕМ (обзор литературы)

1.1. Анализ современного состояния экспресс-диагностики инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей.

1.2. Матрицы для иммобилизованных систем твердофазного иммуно-анализа.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу

2.2. Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов

2.3. Получение антигенных комплексов микроорганизмов

2.4. Лабораторные животные, использованные в экспериментах

2.5. Методы иммунизации животных

2.6. Методы контроля антигенов и сывороток

2.7. Выделение иммуноглобулинов

2.8. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов

2.9. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов

2.10. Физико-химические методы

2.11. Иммунохимические методы анализа

2.12. Лиофилизация биологического материала

2.13. Характеристика реагентов, используемых для получения магно-иммуносорбентов

2.14. Методы математической и статистической обработки материалов

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ МИКРООРГАНИЗМОВ,

ИММУННЫХ СЫВОРОТОК И ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

3.1. Получение антигенных комплексов микроорганизмов г

3 .2. Получение гипериммунных кроличьих сывороток

3.3. Подбор методов выделения иммуноглобулинов

ГЛАВА 4. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИМ

МУНОГЛОБУЛИНОВЫХ КОНЪЮГАТОВ 93 4.1 Получение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирую

4.2 Получение иммуноглобулинов диагностических иммунофер-ментных

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА СУСПЕНЗИОННЫХ ДИАГНОСТИ

КУМОВ

5.1. Биотехнология производства эритроцитарных диагностикумов

5.2. Биотехнология производства латексных диагностикумов

5.3. Разработка суспензионных алюмосиликатных диагностикумов

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ МАГНО

ИММУНОСОРБЕНТОВ (МИС)

6.1. Разработка полиакриламидных магноиммуносорбентов

6.2. Конструирование композиционных магноиммуносорбентов на основе аэросила 149'

6.3. Разработка композиционных магноиммуносорбентов на основе алюмосиликата

6.4. Получение аффинных сорбентов для сорбции неспецифических компонентов из сывороток крови

ГЛАВА 7. СОЧЕТАННЫЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С МАГНОИММУНОСОРБЕНТАМИ

7.1. Разработка метода селективного концентрирования на магно-иммуносорбенте с последующей постановкой иммуноферментного анализа (ИФА)

7.2. Разработка метода селективного концентрирования на магно-иммуносорбенте с последующей постановкой количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА)

7.3. Разработка метода селективного концентрирования на магно-иммуносорбенте с последующей постановкой хемилюминесцент-ного иммунного анализа (ХЛИА)

7.4. Разработка метода селективного концентрирования на магно-иммуносорбенте с последующей постановкой полимеразной цепной реакции (ПЦР)

7.5. Изучение диагностической ценности тест-систем магноиммуно-сорбентных

ГЛАВА 8. СТАБИЛИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ МЕТОДОМ ЛИОФИЛЬНОГО ВЫСУШИВАНИЯ

8.1. Отработка оптимальных защитных сред и параметров лиофильного высушивания

8.2. Характеристика лиофилизированных препаратов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей"

Одним из основных приоритетов государственной политики является охрана здоровья населения как важнейший фактор национальной безопасности. Это нашло отражение в распоряжении Правительства Российской Федерации от 10 июня 2001 г. № 910 - Р «О программе социально-экономического развития Российской Федерации на среднесрочную прерогативу (2002-2004 г.г.)».

В этой связи особое значение приобретает борьба с инфекционными заболеваниями. По данным ВОЗ, из 50 млн. человек, ежегодно умирающих в мире, более чем у 16 млн. причиной смерти являются инфекционные и паразитарные заболевания.

Изменившиеся социально-экономические и санитарно-гигиенические условия жизни и медицинского обеспечения населения в России и большинстве стран СНГ, возросшая опасность возникновения чрезвычайных ситуаций, в том числе актов биотерроризма, повлекли за собой повышение риска заражения людей опасными инфекционными болезнями. Вследствие этого особую важность приобретает своевременное выявление возбудителей опасных инфекций в биотических и абиотических объектах и оперативное уведомление соответствующих служб об эпидемиологической обстановке, что обуславливает повышение требований к качеству средств и методов лабораторной диагностики, применяемых при эпидемиологическом i надзоре, реализации мер по санитарной охране территорий (Онищенко Г.Г., 2002).

Всё чаще традиционные, а порой и казавшиеся недавно перспективными методы диагностики оказываются недостаточными и принципиально неприемлемыми, что заставляет вести поиск новых и унифицировать имеющиеся методы выявления и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний, обладающих экспрессностью, надёжностью, высокой специфичностью.

Стремительное развитие биотехнологии в последние годы привело к появлению многочисленных новых методов исследования, однако огромное значение имеют и хорошо известные реакции, которые необходимо унифицировать. Привлечение иных методических подходов, характеризующихся большей разрешающей: способностью, может значительно»повысить эффективность детекции возбудителей инфекционных, заболеваний (Афанасьев Е.Н., 2000; Drosten С. et al., 2002).

Разработка технологий на основе использования иммобилизованных форм биологических объектов является одним из научных направлений современной биотехнологии. Иммобилизация лигандов путём присоединения их к инертной i и нерастворимой матрице, вызывает большой интерес благодаря повышению стабильности лигандов в 100-10 000 раз путём создания специальных условий и применения метода химического модифицирования, активирования матрицы (Тривен М., 1983). Перспективными для применения в методах иммуноанализа являются твердофазные носители, в том числе различные гранулированные сорбенты (Шаханина K.JL с соавт., 1976; Camargo Z., Guesdon J., Drouhet Е, 1984), а также сорбенты с магнитными свойствами (Ефременко В.И.,1996; Владимцева И.В., 2002; Richardson J., 2001; Tanaka Т., Matsunaga Т., 2001 и др.).

Ранняя лабораторная диагностика, своевременное выявление источника инфекции занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий. Современная микробиология характеризуется развитием диагностических технологий, основанных на глубоких фундаментальных знаниях биологии микроорганизмов и передовых инженерно-технических решениях задач автоматизации и повышения эффективности анализа (Онищенко Г.Г. с соавт., 2003). В связи с этим возникает необходимость в развитии и совершенствовании иммунобиологических методов^ конструировании новых экспрессных методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надёжности и лёгкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель диссертационной работы: совершенствование и унификация биотехнологий производства иммунобиологических препаратов для; экспресс-диагностики особо опасных, других инфекционных заболеваний: и детекции их возбудителей.

Основные задачи исследования:

- подобрать эффективные способы извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных биомасс для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП);

- отработать производственные схемы для получения иммунных сывороток с высокими титрами специфических антител и-провести сравнительную оценку методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве МИБП;

- определить оптимальные параметры биотехнологий; производства иммуно-ферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изучить их диагностическую ценность;

- унифицировать биотехнологию производства эритроцитарных диагности-кумов;

- изыскать надёжные методические подходы к изготовлению суспензионных диагностикумов на основе полиакролеиновой и алюмосиликатной матриц для реакций агглютинации;:

- разработать методические основы конструирования аффинных сорбентов с магнитными свойствами для диагностики инфекций и индикации их возбудителей ! в экспрессных методах (иммуноферментном анализе - ИФА, количественном иммунофлуоресцентном анализе - КИФА, хемилюминесцентном анализе -ХЛИА, полимеразной цепной реакции - ПЦР);

- оценить возможность и эффективность использования разработанных твёр-дофазных сорбентов для иммуносорбции сывороток крови;

- определить параметры ускоренного режима лиофилизации биологического сырья иМИБП и разработать эффективные защитные среды для них; оценить эффективность применения разработанных диагностикумов на экспериментальном, клиническом и полевом материале.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Определены методические приёмы и их последовательность, дающие возможность извлечения полноценных специфических водорастворимых антигенных комплексов белковой природы из микроорганизмов, относящихся к различным родам и видам, в количестве, достаточном для производственных целей.

Впервые в сравнительном аспекте проведена комплексная оценка преимущества (или недостатка) того или иного способа, выделения иммуноглобулинов из иммунных сывороток при конструировании различных МИБП (иммуноферментных, иммунофлуоресцентных, суспензионных).

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства! микрогранулированных иммуносорбентов с магнитными свойствами, обладающих высокими сорбционной. ёмкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.

Разработаны методические приёмы по сочетанному применению селективного концентрирования микроорганизмов на магноиммуносорбентах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объёма, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в

1000 и более раз превышающей традиционные, что значительно повысило достоверность полученных результатов исследований.

Впервые разработан и применён аффинный сорбент с магнитными, свойствами! при проведении иммуносорбции неспецифических антител из; иммунных сывороток, позволяющий!; получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускоряя и упрощая процесс сорбции.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена 9 патентами РФ на изобретения.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

РАБОТЫ

Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в определении-методологии конструирования иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики различных инфекционных заболеваний и детекции, их возбудителей, которая учитывает характерные особенности! биологической организации того или иного возбудителя, свойства матриц биотической и абиотической; природы, определяя направления последовательных, взаимосвязанных стадий и операций биотехнологии производства каждого конкретного препарата;

Разработанные методические подходы и приёмы, по извлечению антигенного материала-из микробных биомасс, получению иммунных сывороток и выделению»из них иммуноглобулинов, оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркёров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний; и: индикации их возбудителей. Эти биотехнологии позволили»изготовить серии диагностикумов (иммуноферментных, иммунофлуоресцентных, эритроци-тарных, суспензионных полиакролеиновых и алюмосиликатных для реакции агглютинации), стабильно отвечающие общим медико-биологическим требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам.

Применение сконструированных магноиммуносорбентов в сочетании с экспрессными методами диагностики повышает их чувствительность до единичных микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения до 3 часов за счёт ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает эффективность проведения противоэпидемических мероприятий.

Материалы научных разработок легли в основу следующих методических рекомендаций: : «Приготовление органокремнеземных магносорбентов с иммобилизованными; лигандами белковой* природы (иммуноглобулины, антигены, ферменты)». Утверждены Госкомсанэпиднадзором РФ от 15.05.1996; «Применение магноиммуносорбентов в методах экспресс-диагностики чумы». Одобрены Ученым Советом СтавНИПЧИ (протокол № 9 от 22.09.1999) и утверждены директорами СтавНИПЧИ и Всекитайского лечебно-профилактического центра чумы и бруцеллеза и 11 методических рекомендаций утверждённых на учрежденческом уровне (протоколы: № 10 от 23.12.1994; №6 от 29.06.1999; № 2 от 27.01.2000; №2 от 27.01.2000; № 3 от 30.03.2000;№ 5 от 21.05.2001 ;№-1! от 28.01.2002;№2 от 27.02.2003; № 6 от 26.06.2003; № 6 от26.06.2003).

На Федеральном уровне утверждены 5: нормативных документов: регламент № 510-95 на диагностикум магноиммуносорбентный туляремийный жидкий для ИФА и РИФ; регламент № 511-95 на диагностикум магноиммуносорбентный : чумной жидкий для ИФА и РИФ; временная фармакопейная статья № 42/Д-014 ВС-95 на диагностикум магноиммуносорбентный туляремийный жидкий для ИФА и РИФ; временная фармакопейная статья № 42/Д-015 ВС-95 на диагностикум магноиммуносорбентный чумной жидкий для ИФА и РИФ; регламент № 1313-03 на диагностикум эритроцитарный ту-ляремийный иммуноглобулиновый.

На диагностические тест-системы: магноиммуносорбентные для ИФА И: КИФА, эритроцитарные, латексные, суспензионные алюмосиликатные, иммуноферментные и иммунофлуоресцентные составлена первичная нормативная документация (регламенты производства (РП), фармакопейные статьи (ФС), инструкции; по применению - всего 13 НД), прошедшая экспертизу в ОБТК института, одобренная Ученым советом (протоколы№7 от 16.06.1995; №10 от 11.09.1998; № И от 28.11.1998; № 6 от 29.06.1999; № 12 от 23.12.1999; № 1 от 27.01.2000; № 8 от 26.09.2002; № 1 от 28.01.2002; № 2 от 28.02.2002; № 4 от 28.04.2003 ;№ 6 • от 26.06.2003), регламенты утверждены директором СтавНИПЧИ.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ и семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике: инфекционных заболеваний и применению магносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

2. Методические приёмы конструирования! иммуноферментных, иммуно-флуоресцентных, суспензионных диагностикумов, обеспечивающих высокую эффективность обнаружения корпускулярных и растворимых антигенов возбудителей особо опасных и других инфекций в экспериментальных и полевых условиях.

3. Научно-методические основы биотехнологии изготовления твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных органоминеральных магносорбентов для избирательного концентрирования патогенов и использования в экспрессных методах (ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР).

4. Методические приёмы конструирования и применения аффинных сорбентов с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных сывороток.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты диссертационной работы были представлены на Российской научной конференции «Иммунология и специальнаяс профилактика ООИ» (Саратов, 1993); Межгосударственной • научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики? чумы и других инфекционных заболеваний», (Ставрополь, 1994); первой конференции СевероКавказского региона «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 1995); международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва, 1995); юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария», посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998); международной научно-практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств» (Саратов, 1998); Межгосударственном симпозиуме по стратегии борьбы с чумой; (Китай, Байчэн,. 1999); международном? симпозиуме «Листериоз на рубеже тысячелетий» (Покров, 1999); 3 международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2001); научной конференции «Природные, инфекционные заболевания» (Улан - Батор, 2001); научной конференции, посвященной 70 - летаю биолого-химического факультета «Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе» (Ставрополь, 2001); международной научно -практической конференции: «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы» (Алматы, 2001); 2-ой Всероссийской научно-технической конференции; «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, сентябрь 2002); научной конференции (Махачкала, 2002); международной научно-практической конференции «Биоресурсы. Биотехнологии. Инновации юга России" (Ставрополь-Пятигорск, 2003); международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 10 НИР, отражено в 63 опубликованных работах (в ведущих научных журналах, ре/ комендуемых ВАК - 11статей, депонированных -6 статей, в 9 патентах .РФ на изобретения, в материалах Международных, Всероссийских, Российских научных конференций — 16 публикаций, в иностранных журналах — 4 публикации, в материалах научно-практических и методических конференций — 17, а также в 18 нормативных документах (регламентах производства, фармакопейных статьях) и 13 методических рекомендациях и указаниях.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и спи,/

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Жарникова, Ирина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Подобран эффективный комплекс последовательных манипуляций (водно-солевая экстракция, механическая и ультразвуковая дезинтеграция), позволяющий изолировать полноценные белковые антигенные фракции микроорганизмов (с активностью в РИД 1:16-1:128), относящихся к различным родам и видам, в количестве, достаточном для производственных целей.

2. Отработана производственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами специфических антител, основанная на оптимальной комбинации . комплекса специфических антигенов и иммуномодуляторов, обеспечивающая 100 % иммунный ответ у животных, снижение материальных, трудозатрат, и проведена сравнительная оценка преимущества (или недостатка) того или иного способа выделения иммуноглобулинов при конструировании различных МИБП (иммуноферментных, иммунофлуоресцентных, суспензионных).

3. Определены оптимальные параметры биотехнологии: производства иммуноферментных тест-систем (эффективный метод выделения* иммуноглобулинов- с помощью ПЭГ- 6000, обработка полистироловых планшет парами бен-зальдегида, фиксация сенсибилизированных планшет диэтиловым эфиром) и флуоресцирующих иммуноглобулинов (значение рН реакционной смеси-9,5, нагрузка красителя на белок - 20 мг/г, температура конъюгации — 20 °С, 4 часовой контакт белка с красителем), позволяющие получать диагностикумы, отвечающие ОМБТ, предъявляемым к индикационным препаратам. Разработан бивалентный ферментно-люминесцентный конъюгат, дающий возможность единовременного проведения трёх экспрессных анализов (традиционного ИФА, ИФА на стекле и РИФ).

4. Унифицирована биотехнология производства эритроцитарных диагностикумов для обнаружения возбудителей чумы, туляремии, бруцеллёза, листериоза за счёт формалинизации эритроцитов барана путём дозированной ; подачи формалина, в качестве конъюгирующего агента определен вторичный алкилсульфат натрия в концентрации 2 %; температура сенсибилизации антител с эритроцитами - 45°С; рН раствора при сенсибилизации - 5,0.

5: Разработаны методические приёмы изготовления суспензионных диагностикумов для реакции агглютинации на основе полиакролеиновой и алюмосили-катной матриц. По; высокой чувствительности ? (1,56x10 6- 3,12x106 м.к./мл), специфичности эти препараты не уступают традиционным эритроцитарным диагностикумам, но превосходят их по экспрессности; (постановка и учёт PGА на стекле проходит в течение 1-5 мин), стандартности и экономичности технологии производства (время приготовления алюмосиликатных диагностикумов—3 ч).

6. Впервые разработаны научно-методические основы конструирования микро-гранулированных органокремнезёмных аффинных сорбентов с магнитными свойствами, обладающих стандартностью? структурных характеристик л л удельная поверхность 18 м /г, объем пор 1,19 см /г, радиус пор 132,2 нм), высокой адсорбционной - активностью и ёмкостью, механической и химической прочностями. Структура этого носителя способствует эффективному образованию иммунохимического комплекса антиген-антитело, исключает внутридиффузионное торможение при проведении экспрессных методов лабораторного анализа.

7. Разработаны методические приёмы по сочетанному применению селективного концентрирования микроорганизмов и их антигенов на магноиммуносор-бентах с последующим проведением экспрессных методов (ИФА,. КИФА, ХЛИА, ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объёма, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью^ в 1000 и более раз превышающей традиционные, что значительно повышает достоверность как положительных, так и отрицательных результатов исследований. При этом сокращается время проведения анализов до 1-3 ч.

8. Впервые разработан и применён аффинный сорбент с магнитными свойствами для проведения иммуносорбции гетерологичных антител из иммунных сывороток, позволяющий получать специфичный препарате сохранением его первоначальной активности, ускоряя и упрощая процесс сорбции, дающий возможность использовать его многократно после регенерации.

9. Для сохранения исходных свойств иммунобиологических препаратов и биологического сырья для их производства отработан экономичный ускоренный режим сублимации (14 часовой), позволяющий одномоментно лио-филизировать биополимеры, имеющие различный порог биодеградации, при ускорении удаления не только свободной, но связанной влаги за счёт глубокого вакуума-10 Па, низкой температуры десублиматора - минус 70 °С, высокого, плавного подвода тепла до 45 °С.

10. Диагностическая ценность разработанных МИБП и методических приёмов подтверждена в экспериментах, - клинических и > полевых условиях, а также при эпидемических вспышках инфекционных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При получении наиболее полных и активных антигенных комплексов микроорганизмов проводить извлечение антигенного материала путём последовательной водно-солевой экстракции и дезинтеграции. При производстве иммунных (гипериммунных) сывороток необходимо: стремиться не только получить высокоактивные и специфичные антитела, но й учитывать конечную цель (класс искомых иммуноглобулинов и пр.). В зависимости от этого подбирать соответствующую схему иммунизации с использованием имму-номодуляторов -- и адъювантов, повышающих выход антител при снижении вводимых доз антигена. Для каждого конкретного диагностикума проводить подбор метода выделения иммуноглобулинов, так как каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.

3. При конструировании суспензионных диагностикумов необходимо тщательно подбирать нагрузку лиганда опытным путём; При конструировании эритроцитарных диагностикумов формалинизацию эритроцитов осуществлять путем дозированной подачи формалина; в качестве конъюгирующего агента использовать вторичный алкилсульфат натрия, рН раствора при сенсибилизации 5,0.

5. Качественную и эффективную иммуносорбцию сывороток от неспецифических компонентов можно осуществлять с помощью аффинных магноиммуносорбентов, полученных иммобилизацией с гетерологичными антигенами. Наличие у сорбента магнитных свойств упрощает и ускоряет процесс очистки.

7. Для увеличения срока годности диагностических препаратов рекомендуем эффективный ускоренный режим лиофилизации (14 часовой): (замораживание препаратов - при температуре минус 40 °С, вакуум — 10 Па, плавный интенсивный (до 45 °С) подвод тепла и температура десублимато-ра - минус 70 °С).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Жарникова, Ирина Викторовна, Ставрополь

1. Абгарян А.Г., Ерёменко Е.И, Ефременко В .И. и др. Способ индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды. Патент РФ № 2223499 МПК 7G 01 N 33/543, С 12 Q 1/04. Бюл. № 4 от 10.02.2004 г.

2. Абелян В.А., Африкян Э.Г. Иммобилизация циклодекстрин-гликозилтрансферозы и характеристика полученного биокатализатора' // Журн. прикладная биохимия и микробиол. 1992. - Том 28 №2. - С. 205209.

3. Адамов А.К, Бердиков В.Т. Об адсорбциях иммунных антител на частицах суспензий // Журн.микробиол. 1964. - № 12. - С.83-89.

4. Адамов А.К. Свойства антител, фиксированных на частицах, и перспективы применения их в микробиологии. Сообщение VI7/ Журн. микробиол. 1965.-№2.-С. 100-105.

5. Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антитела и иммуносорбенты. -М.- 1969:- 175 с.

6. Азаренок К.С. К возможности обнаружения токсина в крови больного ботулизмом при помощи реакции пассивной гемагтлютинации//Журн. микробиол. 1970. - N 7. - С. 1.12:

7. Айлер Р. Химия кремнезёма. Пер. с англ./Под ред.В.П. Пряшникова. М., Мир.- 1982.-Т. 1, Т.2.- 1127 с.

8. Айлер Ю.П., Макарова Е.В. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий. М. - 1976. - 146 с.

9. Айманова О.Я. Усовершенствование методов производства эритроци-тарных препаратов для диагностики особо опасных инфекций Авто-реф. дисс. канд. мед.наук. - Саратов, 1986. — 36 с.

10. Ю.Александер С.К., Фидлер Л.М., Лукин Ю.В. Определение титров противокорьевых антител в реакции агглютинации латекса // Вопр.вирусол. 1992. - №5-6. - С.259-261.

11. Алесковский В.В;, Юффа А.Я. Модифицирование поверхности неорганическими соединениями // Журнал Всес. Хим. общ. Им. Д.И.Менделеева.-1989.- Ш3.- С.317-324.

12. Ананова Е.В;, Каменнова Л.С.,Мещерякова И.С. и др. Обнаружение возбудителя туляремии; у больных с помощью реакции иммунофлуоресцен-ции // Журн. микробиол. 1989. - N4. - С.46-49.

13. Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез,.сибирская язва): Автореф. дис. . докт. мед. наук. — Ростов, 2000. — 45 с.

14. Афанасьев Е.Н:, Таран И.Ф., Тюменцева И.С. Антигенная структура бру-целл. Сообщ. I. Сравнительная оценка методов выделения водорастворимых антигенов бруцелл Ставрополь, 1986. — 16с. — Деп. в ВИНИТИ, № 6635-В86.

15. Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С., Егшатян Т.И. и др. К вопросу люминес-центно-серологической идентификации возбудителей листериоза // Листериоз на рубеже тысячелетий: Матер, междун. симпозиума. Покров, 1999 - С.90-91.

16. Баташев В .В., Уралёва B.C., Кучин В.В. и др. Эпидемиологическая характеристика бруцеллёза в современных условиях // Журн. микробиол. -1998.-№3.-С. 23-26.

17. Беднова В.Н., Дмитриев Г.А., Бабий А.В. и др. Новая тест-система ИФА на сифилис // Вестн. дермат. 1994. - №4. - С.51-53.

18. Вельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификации белков бактерий // Материалы Северо-Кавказской биохим. конф. Махачкала, 1970. — С.270-271.

19. Бельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификация белков // Лаб. дело. — 1972. № 10. -С.514-616.

20. Бендикене В.Г., Песлякас И.Г., Веса B.C. Хроматография сериновых протеаз на хитине и его производных // Прикладная; биохимия и микробиол. 1981; -Т. 17, №3. - С. 441-447.

21. Бендикене В.Г., Юодка Б.А., Казлаускас P.M. и др. Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих магнитными свойствами. Получение и; характеристика магнитных производных хитина // Прикладная биохимия и микробиол. 1995. - Т. 31, №4. - С. 393-399.

22. Березин В.Б., Лахтин В.М., Ямсков И.А. Аффинный хроматографический сорбент, содержащий? группировки конканавалина А, иммобилизованного комплексообразованием с кобальтом // Прикладная биохимия и микробиол. 1995. - Т.31, N 4. - С.400-404.

23. Благовещенский В.А. Кульберг А.Я., Булатова Т.И. и др. Получение специфической сибиреязвенной флюоресцирующей сыворотки // Журн. микробиол. 1961. - № 3. - С. 18-22.

24. Благородов B.F., Шепелев А.П., Федорова Т.А. и др. Определение антиокислительной активности сывороточного сырья и препарата иммуноглобулина //Актуальные вопросы бактериологии и прикладной иммунологии. Тбилиси, 1984. - С.437-439.

25. Брыкалов А.В. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации: Дисс. . докт. химич. наук. Санкт-Петербург, 1993.-330 с.

26. Брыкалов А.В. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине // Материалы конф. химиков Сев.Кавказа,-Нальчик, 1991.- С.185-186.

27. Брыкалов А.В., Воронина О.В, Несмеянова И.В. и др. Способ получения иммобилизованной пероксдазы. Патент № 2005784 С1. С 12 № 11/14, С 12 № 11/10 от 05.06.1990.

28. Брыкалов А.В., Ковальков В.И., Тельбух В.П. и др. Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов. Патент № 1084300 А С 12 №11/14 от 27.08.1982.

29. Бусеев А.И., Ефимов И.П. Словарь химических терминов. М.,1971.- С. 92.

30. Быкова О.И.,Храпова Н.П. Выбор оптимальных параметров сапных люминесцирующих моноклональных антител с помощью количественной иммунофлуоресценции // Сб.науч.работ. Волгоград,1989. - С.202-205.

31. Быкова О.И., Алексеев В.В. Количественная иммунофлуоресцен-ция.Аспекты практического применения // ЖМЭИ. 1986. - N 5. - С.94-99.

32. Быкова О.И., Алексеев В.В. Характеристики • люминесцирующих иммуноглобулиновых препаратов // Особо опасные инфекции на Кавказе. -Ставрополь, 1985. С.68-69.

33. Василенко Н.Ф., Кронгауз И.В., Лопаткин О.Н. и др. Способ получения туляремийного антигена / А. с. № 1425910 от 22.05.1988.

34. Вейнблат В.И., Бельская Н.А., Митина B.C. Белковый и антигенный состав фракций, выделенных осаждением сульфатом аммония из экстрактов чумного микроба штамма ЕВ // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1971. - Вып. 5 (22). - С. 120-123.

35. Вейнблат В.И., Каминский В.В., Орлова JI.C. Иммунодискэлектрофорез антигенов чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. -Саратов, 1972. - Вып. 4(26). - С. 196-200.

36. Вершилова П.А., Драновская Е.А. Способ получения антигена / А.с. СССР №467933 С 12 К 5/00 от 23.04.75.

37. Вишневская Е.Б. Диференцальный подход к выделению ДНК для полиме-разной цепной реакции из различных типов патологического материала // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - №9. - С.31.

38. Вишневская Е.Б., Бобченок А.П:, Мельникова Н.Н. и др. Идентификация L- форм микобактерий туберкулёзного комплекса с применением полиме-разной цепной реакции (ПЦР) // Проблемы туберкулёза.-2001. №3. -С.38-39.

39. Владимцева И.В. Научно-методические аспекты приготовления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных микробиологических систем: Автор. докт. биол. наук. Ставрополь, 2002. - 39 с.

40. Владимцева И.В., Храпова Н.П., Ефременко В.И. и др. Изучение моно-клонального сапного магноиммуносорбента методом количественной иммунофлуоресценции // Сб. науч. работ. Волгоград, 1989: - Вып.4: - С.206-209.

41. Водолазова А.М., Никитина JI.H. Электрофоретическая характеристика стадии риванолового осаждения иммуноглобулинов//Биологические препараты и иммунологическая реактивность организма. Томск, 1981. -С.14-15.

42. Воробьёва З.Г., Лазовская А.Л., Лукин- Ю.В. Способ выявления микобактериального антигена / А. с. СССР№ 1723526 от 01.12.1991.

43. Воробьёва О.В;, Анисенко О.В., Жарникова И.В: Применение биосорбентов: для экспресс-диагностики возбудителя туляремии // Современные достижения биотехнологии: Тез.докл. 2-ой Всерос. науч.-технич. конф. -Ставрополь, 12-13 сентября 2002. С.136-137.

44. Ворошилова О.И., Киселев А.В., Никитин Ю.С. Синтез и исследование кремнеземистых носителей с поверхностью, модифицированной s гамма-аминопропильными группами // Колоидный журн. 1980. - Т.42. - N 2. -С. 223-229:

45. Гавенский С.Д., Ефременко В.И:, Климова И.М. и др. Бактериологический; метод- определения концентрирующей способности магнитных иммуно-сорбентов // Сборн. научн. работ. Волгоград, 1989. - Вып. 4 - С.23-27.

46. Гавилевский Ю.М; Опыт применения флуоресцирующих антител для изучения зараженности бактериями туляремии искодовых клещей // Туляремия на Северо-Западе РСФСР: Труды Лен. Института эпид: и мик-робиол. им: Пастера. JL, 1967. - Т.31.- С.149.

47. Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.В., Егоров A.M. Иммуноферментный анализ: Тез.докл.З-го Всес.науч.симпоз. "Получение иммобилизованных; ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине"-Л., 1980. С.37-38.

48. Гайда A.Bi, Староверов С.М. Модифицироранные кремнезёмные носители в биотехнологии // Журн. Всесоюзного хим. общества им.Менделеева.-1989. Т34. №3. - С. 356-363.

49. Герстунбергер>М.Р., Сухорукое Г.Б., Радченко И.Л. и др. Новый метод получения биополимерных микрокапсул для создания лекарственных средств // Биотехнология- состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междун. Конгресса. М, 2002. - С.54.

50. Гинзбург А.ЛГенодиагностика инфекционных заболеваний // Журн. микробиол; 1998. - №3. - С.86-95.

51. Голубинский Е.П, Загоскина Т.Ю. Твёрдофазные методы исследования в лабораторной диагностике бруцеллёза // Журн. инфекционной патол. — 2001. Том 8 №2-3. - С.94-101.

52. Горисюк А.Ф., Голодюк Л.Ф. Формирование противодифтерийного иммунитета при иммунизации кроликов соматическими антигенами дифтерийной палочки и дифтерийным анатоксином.- В кн.: Вакцины и сыворотки. Вып. 7. - Киев. - 1973. - С.57.

53. Гонтарь И.П., Зборовский И. А., Александров А.В и др. Р1ммуномодулирующий эффект магносорбентов в терапии реавматических заболеваний // Y Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тез. докл. — 1998. — С.35.

54. Гриценко А.И., Кошепян Т.Ф., Морозов Л.Н. и др. Способ определения иммунных комплексов / А. с. СССР № 1464694,.МКИ G 01 N33/543. -1986;

55. Губина Е. А., Желудков М. М., Дьяков С. И. И др. Иммунофлюоресцент-ный экспресс-метод определения антибиотикочувствительности бруцелл //Антибиотики и химиотерапия. 1989. - № 2. - С.107.

56. Гучетль Е.В;, Пономарёва Л.П. Опыт определения противотуберкулёзных антител в краевом противотуберкулёзном диспансере Краснодара // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - №9. - С.36

57. Дацева Т.А., Перцева М.Ю., Краснова! Е.А. Биотехнология; защитных покрытий для биологически активных веществ // Биотехнология-состояние и; перспективы развития: Материалы 1 -го Междун. Конгресса. (14-18 октября).- М, 2002. С.75.

58. Дентовская С.В., Куличенко А.Н. Использование: молекулярно-генетических подходов для лабораторной > диагностики i бруцеллеза; // Проблемы ООИ. Саратов, 1999: - С. 3-11.

59. Дентовская С.В., Гаранина С.Б., Щербакова С.А. и др. Применение ПЦР и ИФА для диагностики хронического у людей //Карантин, и; зооноз. ин-фекц. в Казахстане. Алматы,1999. — Вып. 1. - С. 193-195.

60. Дмитриев Г.А., Киселёва Т.А. Применение ИФА для серодиагностики сифилиса// Актуальные вопросы дерм, и венер.: Сб.тр. юбил конф., посвящ. 5-летию созд.кож. и вен. болезней педиатр. фак.РГМУ М., 1997. - С.36-37.

61. Драновская Е.А., Вершилова П. А. Экспериментальное изучение протективного антигена (белковополисахаридного комплекса) // Журн.микробиол. 1981. - № 8. - С.49-51.

62. Дубинин М.М. Методы проведения изоттерм адсорбции и удельная поверхность адсорбентов.- В кн.:Адсорбция и пористость. Mi, 1976. -С. 105-111.

63. Дулатова М.В., Репина Г.В. Изучение специфичности и гемосенситивной активности кроличьих анти Зонне иммуноглобулинов. - В кн.: Вопросы серологической диагностики. - Алма-Ата, 1975. - С.40.

64. Дыкман Л.А., Богатырёв В.А. Коллоидное золото в твёрдофазных методах анализа//Биохимия.-1997. Т.62, В.4. - С.411-418.

65. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия. М.,1983. - С. 348, 352.

66. Дячина М.Н., Лукин Ю.В., Зубов В.П. и др. Микротитрационный вариант реакции латекс-агглютинации в диагностике лепры // Клин.лабат.диагн. -1995. №2. - С.24-26.

67. Еркова Л.Н., Чечик О.С. Латексы. Л, 1983. - 224 с.

68. Ерохин Е.П. Метод пассивной агглютинации полимерных дисперсий для диагностики легионеллеза // Журн. микробиол. 1991. - № 11.- С. 41-43.

69. Ерохин Е.П., Прозоровский С.В. Тартановский И.С. и др. Способ получения антительного диагностикума / А. с. СССР № 1596926 от 24.02.1989.

70. Ефременко В.И., Брыкалов А.В., Жарникова И.В: Новые препараты для диагностики и ветеринарно-санитарного мониторинга // Пища. Экология. Человек : Тез.докл. междун. научн.-технич. конф. Москва, 1995. - С. 206.

71. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней // Журн. микробиол. 1997. - №2. - С. 102-106.

72. Ефременко В.И., Климова И.М., Трофимов Е.Н. Магнитный иммуно-ферментный анализ антигенов чумного микроба // Журн. микробиол. -1989;- № 7.- С.62-66.

73. Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н. и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов//Журн. микробиол. 1989. - №12. - С. 100-105.

74. Ефременко В.И;, Тюменцева* И.С. Магносорбенты в микробиологических исследования. Применение магнитных сорбентов в иммунофлуоресцентном анализе (Обзор; литературы). — Ставрополь, 1995а. г-30 с. Деп. в ВИНИТИ 28.12.95, № 3444-В95.

75. Ефременко В.И;,. Тюменцева И.С. Магносорбентыi в микробиологических исследования. Применение магнитных сорбентов в иммуноферментном и радиоиммунном анализах (Обзор литературы). — Ставрополь, 1995. 23 с. - Деп. в; ВИНИТИ 28.12.95, № 3445-В95.

76. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Василенко Н.Ф. и др. Разработка технологической линии производства в методах иммуноанализа микроорганизмов: Заключительный отчег о НИР, инв. № 02.9.70001181. — Ставрополь, 1996. 96 с.

77. Жарникова И.В;, Алиева Е.В., Касторная М.Н. Магноиммунносорбент-ные методы диагностики // Известия Высших учебных заведений. СевероКавказский регион. Приложение. Ростов-на-Дону., март 2003. - С. 51-54.

78. Жарникова И.В., Михайлова М.И., Кальной С.М. Модифицированный способ постановки ИФА // Иммунология и спец.проф. ООИ Тез. докл. науч.- практич. конф. Саратов,1993. - С.283.

79. Жданова Л.Г., Перс И.Ф. Действия ультразвука на биологические свойства бактерий кишечной группы. Сооб. 1. Дезинтегрирующее действие ультразвука // Журн. микробиол. 1961. - N 11. - С.73-79.

80. Желудков М.М., Чернышёва М.И., Павлова И.П1 и др. Антигенемия в динамике инфекционного процессов при бруцеллёзе // Журн.микробиол.-1992.-№7-8.-С. 71-72.

81. Журов С.А.,Васерин Ю.И. Эритроцитарные тест-препараты для ■ стандартизации флуоресцирующих антител и серологической диагностики гриппа // Журнал микробиол.- 1985.- N1.- С.81-85.

82. Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П. Перспективные методы лабораторной диагностики бруцеллеза // Пробл. мед; и экологич. Биотехнологии: Тез. докл. юбилейной науч. конф. Оболенск, 1999. - С. 64.

83. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Алексеева JI.A. Точечный иммуноанализ с использованием антител, меченных коллоидным золотом, для обнаружения антигенов бруцелл // Материалы VII съезда

84. Всероссийск. общества эпидемиолог., микробиолог, и паразитолог. М., 1997. - T.I. - С. 440-441.

85. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И. и др. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц коллоидных металлов в качестве маркеров специфических антител // Журн.микробиол. 2001. - № 3. -С.65-69:

86. Загоскина Т.Ю., Голубинский Е.П., Калиновский А.И. и др. Способ обнаружения антигенов бруцелл. Заявка № 2000117885/13; Заявлено 05.07.2000; Опубликовано 20.04.2003, Бюл.№11. Приоритет 05.07.2001.

87. Загоскина Т.Ю., Марков Е.Ю., Калиновский А.И. и др. Использование специфических антел, меченных частицами колоидного золота, для обнаружения антигенов бруцелл методом дот-иммуноанализа // Журн. микробиол. 1998. - №6.- С. 64-69.

88. Зайцев А.А. Перспективы серодиагностики сывороток при эпизоотологическом обследовании и ретроспективной диагностике чумы // Материалы юбилейной науч.-практич., конф. Ставрополь, 2002. -С. 107-109.

89. Зубжицкий Ю.Н. Эффективный метод получения преципитирующих сывороток с высоким титром для работы с люминесцирующими антителами // Лаб.дело. 1960. - N 5. - С.8-11.

90. Зубжицкий Ю.Н. Метод люминесцентной микроскопии в микробиологии, вирусологии и иммунологии / Л.: Медицина, 1964. -С.94-105.

91. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под редакцией Т.В. Перадзе и П. Халонена. М., 1985. - С.281-301.

92. Иммуноферментный анализ и его применение при инфекционной патологии / Под редакцией В; И. Покровского И; П. Голубинского.- М., 1986.-С. 1-6.

93. Иммуноферментный анализ / Под редакцией Нго Т. Т., Ленхоффа Г. М. М., 1988. - С. 25-167.

94. Калинина О.А., Емельянова И.В., Локтионова М.А. ИФА в серодиагностике сифилиса // Совр. вопр. дермато-венерологии: Сб. юбил науч. Тр., посвящ.70-летию обл.кож.- вен.дисп.г. Курска. Курск.- 1997.- G.65-67.

95. Кальной С.М. Метод увеличения ферромагнитных свойств магнитного момента у сорбентов; на основе биологических клеток // Эпидемиологическая безопасность. Итоги и перспективы: Материалы юбилейной науч.-практич. конф. Ставрополь, 2002. - С. 114-116.

96. Кальной С.М., Гончаров А.И., Абгарян Г.П. Изучение возможности получения биосорбентов с магнитными! свойствами // Акту ал. вопр. про-филакт. Особо опас. и других инфекционных заболеваний: Материалы на-уч.-практ.конф. Ставрополь, 1995. - С.362-363.

97. Кальной С.М., Жарникова И.В., Зайцев А.А. Контроль сорбируемой емкости поверхностей с помощью серологических реакций с физическими носителями // Иммунология и спец.проф.ООИ. Саратов,1993. - С.282.

98. Кальной С.М., Лопаткин О.Н., Ефременко В.И. Увеличение эффективности адсорбции иммуноглобулинов на различных поверхностях // Генетические и биохимические вирулентности возбудителей ООИ. Волгоград, 1992. - С. 192.

99. Каральник Б.В., Шамардин В.А., Шмуттер М.Ф. О влиянии танизации на процесс сенсибилизации эритроцитов бактериальными антигенами небелковой природы // Материалы 10-й науч. практ. конф. — Алматы,1969.-С.119.

100. Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы // Изд. "Наука" Алматы, 1982. — 148 с.

101. Каральник Б.В., Еркинбекова Б.К., Гришина Т.А.Ускоренная идентификация бактерий агглютинацией на стекле эритроцитов, сенсибилизированных антителами // Журн. микробиол. 1999. - ТЗ. - С.74-77.

102. Карпенко В.В., Сачков В.И. Обезболивание животных в эксперименте: Метод, рек. М., 1985. - 53 с.15 7. Карпов A.M., Улумиев А.А. Сушка продуктов микробиологического синтеза. М:: Легкая и пищевая промышленность, 19821- 216 с.

103. Карпов С.П, Прегер С.М., Синельников Г.Е. и др. Гипериммунные сыворотки. Томск, 1976. - 378 с.

104. Касьян И.А., Казакова Е.С., Куличенко А.Н. Разработка состава среды для транспортировки и хранения проб, исследуемых методом ПНР // Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочум. службы России. Саратов, 1997. - Т.2. — С. 185:

105. Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники .-М: Химия, 1984. С. 280;

106. Кирдей Е.Г., Пинигина Н.М., Тюменцев С.Н., Пинигин А.Ф., Андриевская А.И. Способ стимуляции антителообразования у животных // А.с. N1390836, 1986.

107. Киселёва И.Н;, Беднова В .Н., Дмитриев Г.А. Постановка ИФА для серодиагностики сифилиса // Вестн. дерматол. 19981- №1.- С.36-42.

108. Киселев А.В., Кустова Т. JL Способ приготовления аэросилогелей // А.с. N264369.-1976.

109. Кислицын Ю.В., Мешандин А.Г. Способ определения наличия противомозшвых антител в ликворе. Заявка № 2000127007/14, Бюл № 20.20.06. 2002.

110. Кислицын Ю.В., Мешандин А.Г. Способ определения наличия противоопухолевых антител в сыворотке крови. Заявка № 2000127310/14, Бюл№20.- 20.06. 2002.

111. Климова В.А. Основные методы анализа органических соединений. -М: Химия, 1971. С.159-161.

112. Климова И.М;, Ефременко В.И., Пушкарь В:Г. и др. Иммунохимические свойства различных типов магносорбентов //Актуал. вопр. иммунодиагностики ООИ: Тез. докл. Всес. науч.- практич. конф. (26-27 мая 1986 г.). Ставрополь, 1986 - 4.1. - С.150-152.

113. Клячко-Гурвич А.А. Методы определения удельной поверхности //Из-во АН СССР. 1964. - № 10. - С. 1885.

114. Коваленко А. А. Разработка хемилюминецентного анализа для иммунодиагностики сибирской язвы: Автореф. . дис. канд. биол. наук. Саратов, 1992. - 16 с.

115. Коваленко Г.А, Комова О.В. Симаков А.В. и др. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов // Биотехнология. 2002. -№3. - 0.55-66.

116. Коваленко Г.А., Перминова JI.B., Комова О.В. и др. Гетерогенный биокатализатор для непрерывного гидролиза крахмала // Биотехнология -состояние и перспективы развития: Материалы 1-го междун. Конгресса.-М., 2002. С.230.

117. Кольцов С.И., Алесковский В.Б. Силикагель, его строение и физико-химические свойства. JI: Госхимиздат, 1973. - С.96.

118. Кондрашова З.Н. Реакция непрямой гемагглютинации как группоспе-цифический тест диагностики некоторых вирусных заболеваний // Вопросы медицинской вирусологии. М. - 1975. - С. 156.

119. Королев Б.В., Девдариани 3.JL, Солодовников Н.С. и др. Идентификация капсульной формы чумного микроба препаратами поликлональных и моноклональных антител. М., 1992.- 13 е. -Деп. в ВИНИТИ 13.05.92, № 1578.

120. Котровский А.В. Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твёрдофазного носителя для серодиагностики сифилиса: Дис.канд.мед.наук. М.,1986.- 195 с.

121. Крюченников В.Н. Простой тест для серологической верификации боррелиоза // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. -1998.- № 4. С.35-36.

122. Кудрявцев Г.В., Староверов С.М. Структура модифицированных кремнеземов //Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. 1989. -№ 3. -С.300-316.

123. Кузовлева А.А., Шаханина К.Л. Сравнение различных способов иммобилизации препаратов чистых антител и неспецифических иммуноглобулинов // Лаб.дело. 1982. - N 3. - С.9-12.

124. Кузьмин Ю.А., Шамардин В.А., Каральник Б.В. и др. Способ получения антительного диагностикума/ А.с. СССР № 1474935 от 10.07. 81. -Бюл.№ 46.

125. Кузьмин Ю.А. Способ получения антительного диагностикума / А.с. СССР № 889002 от 15.12.81. Бюл. № 46.

126. Кузьмин Ю.А., Мека-Меченко Т.О. Эритроцитарные листериозные диагностикумы // Материалы науч.- практ. конф., посвященной 100-летию организации противочум. службы России. Саратов, 1997.- Т.2.-С.264.

127. Кулаков Ю. К., Горелов В. Н., Мотин В. Л. и др. Высокочувствительная неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР) для идентификации бруцелл // Молекуляр. генетика, микро-биол. и вирусол. Mi, 1992. - № 7 -8. - С. 23.

128. Кулаков Ю.К., Желудков М.М. Молекулярные основы вирулентности бруцелл // Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол. — 2001.- № 4. С. 8-12.

129. Лавриненко И:А., Костровский В.Г. Использование высокоёмких иммуноносителей при определении антител к вирусу иммунодефицита человека // Журнал микробиол. -1997. -№1. С. 18-22.

130. Лазовская А.Л., Воробьёва З.Г., Синицина Н.А. и др. Выявление мико-бактериальных антигенов в моче с помощью реакции агглютинации латекса// Проблемы туберкулёза. -2001. № 4. - с.37-38.

131. Лазовская А.Л., Воробьёва З.Г., Слинина К.Н. Способ выявления мико-бактериальных антигенов. Патент № 2188428, Бюл.№24. 27.08.2002.

132. Леви М.И., Орлова Г.М., Сучков Ю.Г. Серологические исследования при чуме: Труды Азерб. противочум. станции.- 1962.- Т.З.- С.281.

133. Леви М.И., Шимко Т.А., Темиралиева Т.А. Испытания в полевой практике иммуноферментного метода с применением (3-лактамазы в качестве маркера моноклональных антител к капсульному антигену чумного микроба // Журн. микробиол. 1987. - № 3; - С.43-49.

134. Левина Е.Н. Меченные флуорохромом антитела для выявления бактерий сибирской язвы. Собщение I:// Журн. микробиол. 1958. - N 1.- С.9-15.

135. Левчук Б.А., Кузнецов С.Л., Кузнецов С.М. и др. Способ получения ди-агностикума эритроцитарного антигенного, сапного. Патент РФ № 2188036, МПК6 7А 61 К 39/104, G 01 №33/53 ; Опубл. 27.08.02, Бюл. №24. 2002

136. Леонтьев А.И. Разработка иммунофлуоресцентного метода ускоренного обнаружения возбудителя; туляремии г в: кормах и трупах грызунов: Автореф; дисс. канд.вет.наук. М:, 1967. - 16 с.

137. Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В. Оптимизация параметров метки иммуноглобулинов изотиоцианатом флуоресцеина // Болезни с природной очаговостью на Кавказе: Тез. докл. Ставрополь, 1982!- С. 173-175.

138. Луканина Л.М., Лямкин Г.И., Ляпустина Л.В. и др. Диагностика бруцеллёза с использованием реакции агглютинации; латекса. // Акту ал. вопр. профилакт. Особо опас. и других инфекционных заболеваний: Матер. науч.-практ.конф. Ставрополь, 1995.- С.183-185.

139. Лукин Ю.В., Трифонов В.Д:, Туркин С.И. и др. Полиакролеиновые латесы в качестве иммунореагентов // Тр. МХТИ. 1985. — Вып. 185. - С. 88-92:

140. Лунина М.А., Хачатурян А.А., Ромина Н.Н. и др. Колоидно-химические основы получения устойчивых золей ферромагнетитов в различных средах // Всесоюзный симпозиум. "Гидродинамика и теплофизика магнитных жидкостей".- Юрмала. ,1980. С.13-20.

141. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф. и др. Лиофильное высушивание как способ консервации бруцеллёзных диагностических бактериофагов // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2002. С. 159-165.

142. Мананков В.В., Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. и др. Усовершенствование ТИФА на основе авидин-биотиновой системы для лабораторной диагностики бактериальных ООИ //Генетика и биохимия вирулент. возбуд. ООИ. Волгоград, 1992. - С. 161

143. Манолов А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии //Журн. микробиол. 1985. - N4. - С. 100-107.

144. Манолов А.Д., Васильев В.П., Закревский В.И. Получение высокоактивного меченого I капсульного антигена чумного микроба // Журн. микробиол. 1987. - N7. - С. 117-118.

145. Манолов А.Д., Зыкин Л.Ф., Костюковский В:М. и др. Использование радиоиммунологического анализа для изучения Центрально-Кавказского природного очага чумы. Разработка и производство препаратов мед.биотехнологии: Тез.конф. Махачкала, 1990. - С.28-29.

146. Манолов А.Д., Зыкин Л.Ф., Голубинский Е.П. Радиоиммунологический анализ при изучении персистенции чумного антигена в организме грызунов и у эктопаразитов природных очагов Сибири // Журн. микробиол. -1991. N3. - С.44-47.

147. Марчев Н., Ревашка А. Опыт получения специфической туляремийной флуоресцентной сыворотки с помощью авирулентного штамма//Ветеринарная наука. 1974. - Т. 11, N7. - С. 86-91.

148. Масько А.А., Морозова А.А., Лыга Л.К. и др. Иммобилизация трипсина на углеволокнистых носителях, различающихся структурой, пористостью и химией поверхности // Прикладная биохимия и микробиология. -М., Наука, 1992. -Том 28, №2. С. 211-216.

149. Матусевич Н.П., Рахуба В.К. Получение ферромагнитных жидкостей методом пептизации. // Гидродинамика и теплофизика магнитных жидкостей: Всесоюзный симпозиум.- Юрмала, 1980.- С.21-28.

150. Меньшов П.И., Шмутер М.Ф. Подбор оптимальных методов формали-низации эритроцитов для приготовления стойких эритроцитарных диагностикумов для чумы и бруцеллеза // Пробл. особо опас. инфекций. Саратов, 1969. - N 6 - С.231.

151. Мешандин А.Г., Ванеева Л.И., Агапкина Н.П. и др. Использование: модифицированных полистироловых планшетов в твердофазном иммуноферментном анализе для диагностики некоторых инфекций // Журн. микробиол.- 1993.- №5.- С.97-100.

152. Мешандин А.Г., Ванеева Л.И., Даргеева Т.А. Проблемы потери активности сорбированных лигандов в гетерогенном» иммуноферментном анализе // Журн. микробиол. 1994. - №4. - С.52-55.

153. Мешкова Л.Ю., Дунаев Г.С., Яковлев А.Т. и др. Хемилюминесценция нейтрофилов как диагностический тест при чуме.//Актуал. вопр. профи-лакт. Особо опас. и других инфекционных заболеваний: Материалы науч.-практ.конф. Ставрополь, 1995.-С.195-196

154. Мешкова Л.Ю., Рыбкин B.C., Яковлева А.Т и др. Хемилюминесцентный иммуноанализ в ранней диагностике сапа и мелиоидоза // Акту ал. вопр. профилакт. Особо опас. и других инфекционных заболеваний: Материалы науч.-практ.конф.- Ставрополь, 1995.- С. 165.

155. Модифицированные кремнезёмы в сорбции, катализе и хроматографии/ Под ред. Докт. хим. наук Лисичкина Г.В.- М."Химия",1986.- 247 с.

156. Мониашвили И.Я. Способ приготовления антитоксического эритроцитарного диагностикума; /А.с. СССР № 552086, Бюл № 12.30.03.1977.

157. Муромец В.И., Наградова Н.К. Иммобилизованные олигомерные ферменты. М: Наука, 1984. - С.10.

158. Неймарк И.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов. Наукова думка. Киев, 1982. - 216 с.

159. Нечаева Е.А., Вараксин Н.А., Рябичева T.F. и др. Разработка микрогранулированных форм вирусных вакцин // Биотехнология-состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Международного Конгресса. -М., 2002. С.49.

160. Ниязматов А.А., Покровский В.И., Блинковский A.M. и др / А. с. РФ № 1633549. 12.09.1989.

161. Носков Ф.С. Флуоресцирующие антитела и их применение в вирусологии.- В кн.: Респираторные вирусные инфекции. Л., 1969. - С.217-242.

162. Носков Ф.С. Очистка конъюгатов от непрореагировавшего флюоро-хрома // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В;Перадзе, ПХалонена. М., 1985.-С. 254:

163. Олейник В.В., Шендерова Р.И. Способ диагностики миелопатии при туберкулёзе позвоночника. Патент РФ бюл.№7 от 27.07.2002.

164. Оловников А.М. Агрегат- гемагглютинационная s проба на антиэритро-цитарные антитела // Бюл. экспер. медиц. 1975. № 9.- С.61.

165. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М: Медицина, 1975. - 192 с.

166. Ометов В.К., Моргуль М.П., Уразовская Е.В; и др. О применении им-муноферментного анализа в диагностике сифилиса // Вестн. дермат.-1997.- №3.-С.24-35.

167. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическая обстановка и основные направления борьбы с инфекционными болезнями в Российской Федерации за период 1991-1996гг. // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 1997.- №3.- С.4-13.

168. Онищенко Г.Г. Об эпидемиологической ситуации и заболеваемости природно-очаговыми инфекциями в Российской Федерации и мерах по их профилактике // Журн. микробиол. 2001.- № 3.- С. 22-28.

169. Петров В.Г., Ананова Е.В. Обнаружение Francisella. tularensis в; организме клещей i Dermacentor marginatus Sulz методом люминесцентной микроскопии//Зоол.журн. 1966. -Т.44, вып. 11.- С. 16-18.

170. Подзолкова F.F., Климова И*М, Ефременко В.И. и др. Применение количественной иммунофлуоресценции для определения адсорбционной способности магнитных иммуносорбентов // Журн. микробиол. — 1988. -№ 5. С.56-58.

171. Подоляко М.П., Баташев В.В., Уралева B.C. и др. Иммуноферментный метод обнаружения бруцеллезных антител и антигена в сыворотках крови животноводов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств // Журн. микробиол. 1995. - № 6. - С. 53 - 54.

172. Полтавченко А.Г., Караваев B.C., Тузиков Ф.В. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах // Журн. микробиол.- 1998.- №2.- С. 108-111

173. Постнова A.M., Пак В.Н., Кольцов С.И. Исследование, протонной кислотности титаносодержащих силикагелей, полученных методом молекулярного наслаивания // Журн. физ.химии. 1981. - Т.35, N8. -С.2140-2142.

174. Практическая химия белка. М. Мир, 1989. - С.300-301.

175. Пушкарь В.Г., Климова И.М., Ефременко В.И. и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов // Метод, рекоменд. Волгоград, 1984.- 15 с.

176. Раковская И.В., Горина Л.Г., Зигангирова Н.А. и др. Опыт применения различных методов диагностики респираторного микоплазмоза // Журн. микробиол. 2002.- №5.-С.57-62.

177. Рогожина С.В., Варламов В.П., Вальковский Д.Г. Получение модифицированных кремнеземов для присоединения биологически активных соединений // Изв. АН СССР; 1975; - № 8. - С.1718-1721.

178. Роуз Э. Химическая микробиология. — М., 1981. С. 45-60.

179. Рыбкина Р.А., Яковлев А.Т. Возможности использования хемилюми-несцентного анализа в диагностике КУ риккетсиоза // Эпидемиолог, и клинико-иммунолог. аспекты профилакт. важнейших инфекц. заболеваний: Материалы конференции.- Астрахань, 1996. - С. 127.

180. Самсонова С.А., Самсонов В.В., Гудима М.Ю. и др. Методы ПЦР для паспортизации и классификации микроорганизмов // Биотехнология-состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междунар. Конгресса.- М., (14-18 октября) 2002. С.176:

181. Санитарные правила СП 1.2.011 -94. Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп 1 патогенности. Госкомсанэпиднадзор России. М., 1994.-С.74-76.

182. Синицин А.П., Клебанов A.M., Клесов А.А. и др. Зависимость стабильности иммобилизованной; глюкозоамилазы от способа иммобилизации//Приклад, биохим. и микробиол. 1978; - N2.- С.236-242.

183. Селиванов А.В., Маренникова В.В. Иммунные свойства ассоциированной вакцины против сибирской язвы, бруцеллеза и листериоза в опытах на лабораторных животных.- В кн.: Ученые записки Казанского вет. ин-та им. Баумана. 1974. - Т. 115. - С.25-28.

184. Скачек Д.В. Научно-методические основы стандартизации люминесцирующих иммуноглобулинов для диагностики возбудителей особо опасных инфекций. Автореф. дисс. . канд.мед.наук. - Саратов, 1984. -173.

185. Скуч Д., Уэст Д. Основы аналитической химии. М: Мир. 1979.-Т.1. - С.71-73.

186. Смирнов В.В., Чаплинский В.Я., Андреева З.М. и др. Научные основы производства диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий). 1Сиев: Наукова Думка, 1980.- 195с.

187. Сомова А.В., Бурлеев В.А., Сперанский А.И. и др. Оценка чувствительности и специфичности теста агглютинации частиц латекса для выявления антигена гепатита В. В кн.: Эпидемиология и профилактика вирусного гепатита. - Таллин, 1976. - С. 134-135.

188. Сорбенты на основе силикагеля в радиохимии.Химические свойства. Применение. Под общей редакцией академика Б.НШаскорина. М. Атомиздат, 1977. - С. 16-19 (304с)

189. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. Биргера М.О. -Mi, 1982. -С.49-280.

190. Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Волина Е.Г. и др. Получение антительных диагностических тест-систем заданной специфичности // Биотехнология. М., 2003. -№2. - С.81-85.

191. Стоев К.Г., Чибисова В.А., Шаханина К.А. и др. Новый количественный иммунофлуоресцентный метод определения IgE с помощью специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа // Журн. иммунология. М,1981. - N1. - С.85-88.

192. Сухоруков А.М., Пономарёва A.M. Изучение сорбционных свойств полистироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе * // Журн. микробиол.- 1987.- №9.-С.18-22.

193. Сучков Ю.Г., Канатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов иммунными гамма-глобулинами// Журн. микробиол. 1965.-N 8.- С.63.

194. Табаков П.К, Чибрикова Е.В., Шуркина И.И. и др. Быстрый способ получения меченых флуоресцентными красителями антител// Журн: микробиол. 1962. - Т 10. - С.26-30.

195. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций // Журн. микробиол. 1969.- №Ю.-С.26-31.

196. Темишевская JI.Я. Использование техники иммобилизации клеток для непрерывного культивирования токсинообразующих анаэробов // Журн. микробиол.- 1995.- №6. С.21-22.

197. Тертых В.А., Павлов В.В., Ткаченко К.И. и др. О размещении гидро-ксильных групп на поверхности аэросила // Теоретическая и экспериментальная химия.- 1975.-Т.11, № 3.-С.415-420.

198. Тинкер А.И. Влияние сублимационного (лиофильного) высушивания на штамм ЕВ чумного микроба. Дисс. . доктора мед. наук. Ставрополь, 1971.-С.351.

199. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М:Мир, 1983. - С.23.

200. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов. СтГСХА. 1997. - 251 с.

201. Тюменцева И.С., Жданова Е.В., Афанасьев E.Hi Усовершенствование производственной схемы иммунизации животных моно- и поликомпонентными. антигенами Ставрополь, 1994г. - 15 с. -Деп. в ВИНИТИ 04.11.94, №2507-В94:

202. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для > выявления возбудителей 00 и других инфекций: Автореф. дис------доктор, мед.наук. -Саратов, 1996. -57 с.

203. Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н:, Ефременко В.И. и др. Способ получения диагностической сыворотки. Патент РФ № 2135210. Бюл. №24. -27.08.99.

204. Фикс Л.И. Разработка и аппробация, реакции латексной агглютинации для экспрес-диагностики стафилококковой инфекции // Журн. микробиол. -1995.-№6.-С. 73-74.

205. Филатов В.Н., Белов А.А., Рыльцев В.В. и др. // Биотехнология-состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междун. Конгресса. -М., (14-18 октября) 2002. С.70.

206. Филатова Т.Н., Гамзулина Л.Н., Замятина Т.А. Использование катио-нообменных сорбентов на основе силикагелей для выделения одного из железозависимых белков менингоккоков // Журн. микробиол. 1995.- №6. -С. 19-20.

207. Фихте Б.А. Дезинтеграция микроорганизмов. Задачи и перспективы // В сб.: Дезинтеграция микроорганизмов: Матер. Всесоюзн. конф. по дезинтеграции микроорганизмов (25-27 окт., 1972 г.) Пущино-на-Оке, 1972.-С.5-14.

208. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М: Мир, 1980. - С.73:

209. Харлашина Л.Я., Демкин В .В., Николаева Н.П. и др. ПЦР в диагностике Chlamydia trachomatis у больных недифференцированными моноолиго-артритами и реактивными урогенитальными артритами // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - №9. - С.21-22

210. Хмельницкий Р.А. Физическая и коллоидная химия. Изд. Высшая школа.-М., 1988.-С. 342-343.

211. Ходж Ф. Органические реакции с использованием реагентов или субстратов, ковалентно закрепленных на функционализированных неорганических носителях // Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. ДИМенделеева. 1989. - Т.34, N3. - С.331-339.

212. Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах//

213. Прикладная биохимия и микробиология.- М., Наука. 1991. Т. 27, №5. - С. 720-724.

214. Цыбин Б.П. Эритроцитарные диагностикумы и перспективы их использования в диагностике бруцеллеза, холеры и туляремии: Дисс. . канд.мед. наук. Ставрополь, 1974.- С. 180.

215. Цыбин Б.П., Таран И.Ф. Оценка диагностических свойств бруцеллёзного антигенного эритроцитарного диагностикума // Пробл.ООИ. Саратов, 1976. - Вып.6 (52).- С.26-30.

216. Чайка Н.А. Реакция агглютинации латекса. В кн.: Серологическая диагностика паразитарных болезней.- М.: ВНИИМИ, 1982. - С. 14-25.

217. Чард Т. Радиоиммунологические методы. Пер. с англ. / Под ред. Я.М.Варшавского. .М.,1981. - 246 с.

218. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. -Л., 1991.-239 с.

219. Черкасов И.А., Кравченко Н.А., Павловский В.Н. Получение и свойства лизоцима, иммобилизованного на силохроме // Биоорг. химия. -1976. Т.2, N10. - С.1422-1428.

220. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. -Л, 1991.-239 с.

221. Чернявская Е.Г.Получение моноклональных антител к возбудителю туляремии и их применение в диагностике туляремийной инфекции: Дисс. канд.биол. наук. Ставрополь, 1990.- 137 с.

222. Чибисова В.А. Приготовление и стандартизация люминесцирующих сывороток для непрямого метода иммунофлуоресценции: Автореф. дисс. . канд. мед наук. М., 1975. - 25 с.

223. Чуйко А.А., Горлов Ю.И. Строение поверхности пирогенного кремнезема, природа его активных центров и механизмы сорбционных процессов // Кремнеземы в медицине и биологии: Сб. науч.трудов. Киев-Ставрополь, 1993. - С.4-41.

224. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Способ приготовления диагностикума направленного действия / А.с. СССР № 889 004 А 61 К 39/44. Бюл. №46. - 1981.

225. Шамардин В.А., Маркова С.Г., Каральник Б.В. Способ получения эритроцитарнош диагностикума / А.с. СССР № 913626 А 61 К 39/00. — Бюл. № 29. 1983.

226. Шарова И.Н., Плотникова И.А., Самойлова Л.В. Применение ПЦР для обследования групп риска по бруцеллезу //Материалы науч.- практич. конф., посвящ. 100-летию образов, противочумн. службы России Саратов, 1997.- т. 2. - С.237.

227. Шаханина К.Л. Современные методы приготовления люминесцирующих сывороток. В кн.: Иммунохимический анализ. - М.,1968. -С.202.

228. Шаханина К.Л. Методы контроля и стандартизации люминесцирующих антител. В кн.: Люминесцирующие антитела. - М., Медицина, 1972. -С.31-49.

229. Шаханина К.JI. Приготовление люминесцирующих антител. -В кн.: Иммунофлуоресценции в медицине. М.:Медицина, 1977. -С.23-46.

230. Шаханина К.Л. Иммуносорбенты и их использование для выделения чистых антител 7/ Биохим. и биофиз. микроорганизмов. -1981. В.9. -С. 15-23.

231. Шаханина К.Л. Научные основы производства и стандартизации люминесцирующих антител. Автореф. дисс. . докт.мед.наук. - М., 1975.-52 с.

232. Шаханина К.Л;, Клеев Б.В., Фёдоров Ю.М. Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител // Журн.Вопр.мед.химии. 1976. - T.XYII, Вып. 1.-С.127-136.

233. Шаханина К.Л., Манько М.И. Избирательное концентрирование бактерий и риккетсий при помощи? поликонденсационных иммуносорбентов //Журн. микробиол. 1969. - N9 -С. 140-144.

234. Шаханина К.Л., Походзей И.В. Приготовление сефарозных пневмококковых диагностикумов и их использование в клинике легочных заболеваний // Журн. микробиол. 1978. - N3. - С.75-79.

235. Шаханина К.Л., Соколенко А.А., Павлова И.П. Выбор критериев пригодности твёрдофазных носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного анализа // Журн. микробиол. 1987. - N9 -С.86-89.

236. Шейнфайн Р.Ю., Неймарк Н.Е. Роль старения гидрогеля кремневой кислоты в формировании пористой структуры силикагелей // Журн. Адсорбция и адсорбенты. 1972. - Вып.1. - 0.55-57.

237. Шин Н.Г., Ищанова Р.Ж. Индуцирование активности размножения бруцелл ультразвуком низкой частоты //Актуальные вопросы борьбы с бруцеллезом. Алматы, 1978. — Вып. 15. - С.65-68.

238. Шмидт Д;Л. (US), Пименов А.В: (RU), Либерман А.И. (RU) Адсорбционный материал (варианты). Заявка на изобретение 7 В 01 J 20/26, 20/20 от 01.09.99. Бюл.№ 2. - 200И

239. Шульфе X. Введение радиоактивной метки в белки. В^кн:Иммунологические методы / Под редакцией Г.Фримеля- М:, 1987.-С.457-466.

240. Щедрин В .И., Козлов С.С. Изучение специфичности иммунофермент-ных тест-систем для серодиагностики сифилиса // Актуальные вопросы дерматологии: Сб.тез.докл.науч.-практ.конф., посвящ. 125-летию созд.кож. и вен. болезней.- С-Пб., 1994.- С.82-831

241. Экспериментальные методы в адсорбции и молекулярной хроматографии / Под.ред. Киселёва А.В., Древинга В.П. М:: Изд-во MFY. -1973. 444с.

242. Юдицкая М.Н. Возможность применения латекс-агглютинации для экспресс-диагностики дизентерии // Иммунология. — 1991.- № 1. — С.63-64.

243. Яковлев А.Т., Коваленко А.А. Хемилюминесцентный иммуноанализ и его применение в микробиологии // Биотехнол., иммунол. и биохимия ООИ.- Саратов, 1989.- С. 3-9.

244. Яковлев А.Т. ИФА в лабораторной диагностике бактериальных особо опасных инфекций: Автореф. дисс. . доктора мед. наук.- Саратов, 1992.43 с

245. Anaokar S., Garry P.J., Standefer J.C. Solid-phase enzyme immunoassay for serum ferritin //Clin.Chem.- 1979. V.25. - P. 1426-1431.

246. Ansari A.A. et. al., Purification antigemoglobin antibody using cross-einked immunoadsorbent //S. immunoL Methods. -1981. V. 42. - N 1, P. 45-51.

247. Avrameas S. Coupling of enzymes of proteins with glutaraldehyde: use of the conjugates for detection of antibodis // Immunochemistry.- 1969.- V. 6., N1. -P. 43-52.

248. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E. et ah Studies on immunization against plague I. The isolation and characterization of the Soluble antigen of Pasteurella pestis//J. Immunol. 1952. - V.68, №2. -P. 131-145.

249. Boorsma D.M., Strefkert J.G; Peroxidase on glutaraldehyde for propering peroxidase conjugates // J.immunol. methods. 1979. - N 30. - P. 245-255.

250. Boyden S.V. The adsorption of proteins on eritrocytes treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera // J. Exp. Med.-1951.-Vol. 93, N 1.- P. 107-120.

251. Bricker B.J., Ewalt D.R., MacMillan A.P. et al. Molecular Characterization of Brucella Strains Isolated from Marine Mammals //J. Clin Microbiol.- 2000.-Vol.38(3).- P.1258-1262.

252. Brodzicki S. Oznaeznie nickilkicii ielosci bialka toksyng botulinowey nuthoda immunoenzymaticana z odezytem chemiliiminesnoyjnym //Prz. epidemiol.- 1984.- v. 38, N 1.- P. 67-72.

253. Bushway R.J., Perkins L.B., Hurst H.L., Ferguson B.S. //Food chemistry.-1992.-V.43. -P. 283.

254. Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E. Magnetic enzyme-linked immunosorbent assay (Melisa) for determination of specific IgG in paracoccidiodomycosis //Sabouraudia.- 1984. V.22, N 4. - P.291-299

255. Cavanaught D.C., Fortier M.K., Robinson D.M. Application of the ELISA technigue to problems in the serologic diagnosis of plague// Bull. Panam. Health. Org., 1979.-V. 13, N 4.-P.399-402

256. Chim C., Wold F. The preparation of matrix bound proteases and their use in the hydrolisis of proteins // Anal.Biochem. - 1974. - V. 61., N 2. - P. 379-391.

257. Chard T. In :K.E. Kirkham and W.M.Hunter . Radioimmmunoassae Methods (Churchill- Livingstone, Edinbergh).- 1971. P.491.

258. Chard Т., Martin M.G., Landon J In :K.E. Kirkham and W.M.Hunter. Radioimmmunoassae Methods (Churchill- Livingstone, Edinbergh). 1971. -P.257.

259. Chemla Y.R., Grossman H.L., Poon Y. et al. Ultrasensetive magnetic biosensor for gomogeneous immunoassay // Proc. Nat.Acad Sci. USA, 2000. - V. 97 (26). -P.72.

260. Cerri D., Ebani V.V., Pedrini A. et al. Epididymitis by Brucella ovis: expere-mental infection in virgin ram lambs //New. Microbiol. 1999. - V. 22 (3). -P. 227-231.

261. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. — 1977. V.36, №3. - P.475-483.

262. Clement G. Concept and desigh of an automated radioimmunoassay system using contanious flowand magnetic separation //J. Clin. Chem. Clin Biochem. -1977.-V. 15.-P.148.

263. Cloeckaert A., Gray on M., Grepinet O. An IS711 element downstream of the bp 26 gene is a specific marker of brucella spp. Isolated from marine mammals //Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. -V. 7(5). - P.835-839.

264. Coons А.Н., Greech H.G., Gones A.N. et al. The demonstration of pneumococcal antigens in tissue for the use of fluorescent antibody // J.Immunol.-1942.-V. 45, N 3.- P. 159-170

265. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. 1950.-V.91, N 1.-P.81-89.

266. Crizmas L. Preparation of fermalinised erythrocytes. "Proc. soc. exp. Biol."-1960.- V.103. - P. 157.

267. Cunliffe D, Smart C.A., Tsibouklis J. et al. Bacterial adsorption to termore-sponsive polimer surfaces // Biotechnol. Lett.- 2000.-22. N 2.-P.141-145

268. De Boer J.H., Okkerse C. La mecanisme de la condensation catalytigue die I' acide siligue // J. Chim.phys.et chim.-phys.biol. I960,- V. 57, N5. - P.439-441.

269. Dietrich F.M., Frischkneett H. Application of microspheres in separation of cells // Nature.- 1968.- V. 217.- P.264.

270. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. •• V.8., N 9.-P. 871-879.

271. Eremenko E.I., Buravtseva N.P., Tsygancova O.I. et al. Scheme for solation and identification of Bacilus anthracis // Proceds of the 1st European Conference on Dangerous Pathogeus. Wiuchester (England), 1999. — P.43.

272. Evans., Steel M., Arthur E. A hemagglutination inhibition technigue for detection of immunoglobulins in supernatants of human lyphoid cell lines-Cell.-1974.- V. 3. -P.153-158.

273. Feket A., Bantle J.A., Hailing S.M. Detection of brucella by polimerase chain reaction in bovine and maternal tissues // J.Vet.Diagn.Invest.-1992.-V.4-p. 7983.

274. Ficapal A, Alonso-Urmeneta B, Velasco J. et al. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate //Vet. Rec. — 1995.-V. 5137,N6.-P. 145-147.

275. Franchimont P. In :K.E. Kirkham and W.M.Hunter Radioimmmunoassae Methods. (Churchill- Livingstone) Edinbergh, 1971. - P.535.

276. Freedlender A., Cathou R.E. In :K.E. Kirkham and W.M.Hunter Radioimmmunoassae Methods.- (Churchill- Livingstone) Edinbergh, 1971. P. 121.

277. Gall D:, Nielsen K., Forbes L. et al. Alidation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for the detection of serum antibodies to Brucella abortus in bison // J. Wildl. Dis. 2000. - Vol.36(3). -P.76- 469.

278. Gallien P., Dom C., Alban G. et al. Detection of Brucella species in organs of naturally infected cattle by polymerase chain reaction //Vet. Rec. — 1998. V. 9;142 (19). -P.512-514.

279. Guesdon J.L., Avrameas S. Solid-phase enzyme immunoassay //Appl. Bio-chem. and Bioeng. 1981. - V. 3. - P.207-232.

280. Greenlee M.T., Farrar .J.A., Hird D.W. et al. Comparison of particle concentration fluorescence immunoassay to card and complement fixation tests using isolation of Brucella abortus as the standard // J. Vet. Diagn. Invest. — 1994.-V. 6(2).-P.182-187.

281. Harding N. Laboratory equipment digest //J.immunol. Meth. 1982. -V.20,- N 4.-P. 89-93.

282. Hayes M.A., Poison T.N., Phayre A.N. et al. Flow-baased microimmunoassay // Anal.Chem. 2001. - V. 73(24). - P.902.

283. Herbert W.J.Passiv hemagglutination with special reference to tanned cell technigue// Jn. Handbook of experimental immunolody.-Oxford, 1973. P.29-48.

284. Hornung M., Ludwic M, Schmauder H.P. A New Technology for an optimised supply of emerged microbial cultures // 1-st International congress. Biotechnology- state of the art and prospects of development/ Russia. Moscow, (14-18 октября) 2002. C.202.

285. Janowski F., Heger W. Porose et al. Adsorbenzien and ratalistager // Z.Cyem., 1979.- V. 19, N1.-P.l-11.

286. Karlsson K. Studies on the immunofluorescent technique as a diagnostic tool in bacteriology with special referense to the genera Francisella, Salmonella and Yersinia. Stockholm. -1975.-48 p.

287. Karnaukhov A.P. -In: Proc. of the RILEM/ IUPAC Internat. Symp. on Pore Structure and Properties of Materials. Prague, Academia. -1974. V.l. - P. 199-205.

288. Kato К., Hamguchi Y., Fukui H. et al. Enzyme-linked immunoassay. Novel method for synthesis of the insulin — D galactosidase conjugate and its applicability for insulin assay //J.Biochem.- 1975. - V. 78. - P. 235-237.

289. Kiselev M.V., Gladdilin A.K., Melik-Nubarov N.S. et al. Determination of cyclosporin A in 20 % ethanol by a magnetic beads-based immunofluorescence assay // Anal.Biochem. 1999. - V. 269 (2). - P.393.

290. Kriz K., Gerhrke J., Kriz D. Advancementstoward magneto immunoassays. Biosens Biolectron. 1998. - V. 13 (7-8). -P.817-823.

291. Krogsgaard-Jensen A. Indirect hemagglutination with Mycoplasma antigens: effect of pH on antigen sensitization of tanned fresh and formalinized sheep erythrocytes.- Appl. Microbiol.-1971.- V. 22.- P.756.

292. Kronick P.L., Campbell G.L., Joseph K. Magnetic microspheres prepared by redox polymerization used in a cell separation based on gangliosides //Science. 1978. - V.200. - P. 1074-1076.

293. Lachman P.J. The production of antibodies specific to nunor immunoglobulins by the immunization of rabbit paralysed with IgG//In. Standartization in immunofluorescence. Oxford,1970. - P. 225-234.

294. Lea Т., Vartdal F., Davies C., Ugelstad J. Magnetic monosired polymer pasti-cles for fast and specific fractionation of human mononuclear cells //Scand. J. Immunol. 1985. - V.22 , № 2. - P.207-216.

295. Leal-Klevezas D.S., Martinez-Vazquez I.O., Garcia-Cantu J. et al. Use of polymerase chain reaction to detect Brucella abortus biovar 1 in infected goats // Vet. Microbiol. 2000. - Vol. 75(1):91> P. 7.

296. Lenis V.J., Brooks J.B: Comparison of fluorochromes for the preparation of fluorescent-antibody reagents // J.Bact.-1964. V.64. - P. 1520-1521.

297. Lefkovits I., Pernis B. Immunological Metods.- New York, San Francisko, London: Academic Press, 1979. P.234.

298. Lucore Liza, Cullison Marc A., Jaykus Lee Ann //Appl. Fnd Environ. Microbiol. - 2000.- 66, N 5. P. 1766- 1769.

299. Lowe C.R., Dean D.G. Affinity Chromatography. London- New-York-Toronto: Wiley- Intersci; Publ., 1974. P.135.

300. Lu Q., Zhang W., Hao Z. Study on double antigens sandwich enzyme immunoassay for detection of Brucella specific antibodies in human and animals // Chung. Hua. Liu. Hsing. Ping. Hsueh. Tsa. -Chih.- 1999.- Vol.20 (2). P.21-118.

301. Marshall J.D., Eveland W.C., Smith S.W. Superiority of fluoresceinisothiocyanate (Riggs) for fluorescent antibody technic with a modification of its application // Proc.Soc. exp. Biol; Med. 1958. - V.98, N 4. - P.898-900.

302. Matar G.M., Khneisser I.A., Abdelnoor A.M. Rapid laboratory confirmation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA // J. Clin. Microbiol. 1996. - V.34 (2). - P.477-478.

303. Matsunaga Т., Takeuyama H., Kamiya S. et al. Chemiluminescence enzyme immunoassays using protein A-bacterial magnetite cjmplex // J. Of Magnetism and magnetic Materials, 1999. V. 1-3. - P. 126-131.

304. Meurman O., Ruuskanen O., Sarkiknen H. Immunoassay diagnosis of adenovirus infections in children // J. Clin. Microbiol., 1983. V. 18. - P. 11901195.

305. Molday R.S., Jen S.P.S., Rembaum A. Application of magnetic microspheres in labelind and separation of cells // Nature. 1977. - V.268. -P.437-438.

306. Moreno E., Pitt M.W., Jones L.M. et al. Purification and characterization of smooth and rouh lipopolisaccharides from Brucella abortus // J. Bacterid. —1979. V.138., № 2. - P. 361-369.

307. Morner T. The use of FA-technique for detection Francisella tularensis in formalin fixed material. A method useful in routing post morton work //Acta Veterinaria Scand. 1981. -V.22. - P.296-306.

308. Nielsen K., Lin M., Gall D. et al. Fluorescence Polarization Immunoassay: Detection of Antibody to Brucella abortus // Methods. 2000.- Vol. 22(1). P-71-76.

309. Nielsen K.H., Kelly L., Gall D. et al. Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis //Vet. Immunol. Immunopathol. 1995. - V.46(3-4). - P.285-291.

310. Nielsen K., Kelly L., Mallory M. Standartization of smooth lipopolysaccha-ride preparations for use in diagnostic serological tests for bovine antibody Brucella abortus // J. Immunoassay/ 1998. - V.19, № 4. - P.239-250.

311. Nusbacher J., Berkman E.M., Wong K.Y. Assay of Jg G and other human plasma proteins by quantitive inhibition of passive hemagglutination// J.Immunologi, 1972. V. 108. - P. 893-902.

312. Ocholi R.A., Ezeokoli C.D., Akerejola O.O. et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for screening cattle for Brucella antibodies in Nigeria // Vet. Q. 1996. - V.l8(1). - P.22-24.

313. O'Sullivan M.J., Marks V. Method of preparation of enzymatibody conjugates for use in enzyme immunoassay // Meth. In Enzymol.- New.York, 1981. V. 73.-P.147- 166.

314. O'Berry P.A. A comprasion of 3 methods of serum fractionation in the preparation of vibrio fetus fluorescent antibody conjugates // J. Vet. Res. -1964.-V.25.-P.1669-1672.

315. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel. // Arkiv for Kemi. Mineral.

316. Ged. 1949. - V.261, N 14. -P.l-9.

317. Patel R.D., Wood J., Gibbs A. Development of magnetic ensyme immunoassay (MELA) teihnique for determinatien of and (St. enterotoxin) immunoglobulin G-type antibodies // Biochem. Soc. Trans. 1984.- V. 12. - P. 264268.

318. Paulo P.S., Vigliocco A.M., Ramondino R.F. et al. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in argentina // Clin. Diagn. Lab. Immunol.- 2000. Vol. 7(5). - P.31-828.

319. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh // Biochem. Biophis. Acta. -1964. V.82. - P.463-475.

320. Ramadass P., Samuel В.,Nachimuthu K. A rapid latex agglutination test for detection of leprospiral antibodis // Vet.Microbiol.1999.-V. 70, N 1-2.- P.137-139.

321. Richardson J., Hawcins P., Luxton R. The use of coated paramagnetic particles as a physical labels for use in magetj-immunossays. Biosens Bioelectron.-2001.-V. 16.-P. 989.

322. Richardson J., Hill A., Luxton R et al. A novel measuring system for the determination of paramagnttic particles labels for use in magetj-immunossays. Biosens Bioelectron.- 2001. V.16. - P. 1127.

323. Riggs J.L., Sciwald R.J., Burckhalter J.H. et al. Isothiocyanate compounds as fluorescent labelling agents for immune serum //Am.J.Path. -1958. V.34, N6. - P.1081-1097.

324. Romero C., Pardo M., Grillo M.J. et al. Evaluation of PCR and indirect enzyme-linked immunosorbent assay on milk samples for diagnosis of brucellosis in dairy cattle // J. Clin. Microbiol. 1995 - V. 33 (12). - P.3198-3200.

325. Sarkiknen H, Halonen P., Salmi A. Detection of influenza A virus by radioimmunoassay and enzyme- immunoassay from nasopharyngeal specimens // J. Med. Virol., 1981.- V.7. P. 213-220.

326. Smith K.O., Gehl W.D. Magnetic transfer devices for use in solid-phase radioimmunoassays and enzyme-linked immunosorbent assays //J. Infect. Diss. 1977. - V. 136. - P.5329-5336.

327. Scheidegger J.J. Une micro-methode de l'immunoelectrophoresese // Int. Ach. Allergy Appl. Immunol. 1955. - V.7. - P. 103-110.

328. Schmidt W, Klein M. A new metod for the determinenation of virus specific Ig G and Ig M antibodis.- Arch, ivrol., 1980.- V. 66 , N1. P.67-70.

329. Schmidt W, Klein M. Latex- Agglutinationtest zur Typenbestimmung Von Enterovizen.- Arch. Ges. Virusforsh., 1973. V. 43, N3. - P.213-220.

330. Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to modern liguid chromatography. N.Y.- Wiley, 1979.- 863 p.

331. Soergel M.E., Shaffer E.L., Blank H.F. Solid-phase radioimmunoassay for detection of plague antigen in animal tissue // J.Clin. Microbiol. 1982. -V.16, N 5. - P.953-956.

332. Singh S.V., Gupta V.K., Singh N. Comparative evaluation of a field-based dot-ELISA kit with three other serological tests for the detection of Brucella antibodies in goats //Trop. Anim. Health. Prod. 2000.- V. 32(3): 155.- P. 63.

333. Staak C., Draeger A., Bahn P., Dorn C. et aL Comparison of the results from commercially available Brucella ELISA test kits for the investigation of bovine sera// Berl. Munch Tierarztl. Wochenschr. 1997. - V.l 10(6). - P.206-210.

334. Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of caprilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. 1969. - V.139. - P. 279-284.

335. Sting R., Ortmann G. Erfahrungen mit einfachen ELISA-Testsystemes fur die Brucellose Serologie bei Rind, Schaf und Ziege //Berlin. Und munch. Wochenschr.- 2000.-Vol.113.- N 1. -P. 22-28.

336. Stortz H. (Шторц X.) Иммунофлуоресценция //Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - С.128-148.

337. Taylor D. The thermal expansion behaviour of the framework silicates // Min-eral.Mag. 1972. - V.38, N297. - P.593-604.

338. Tan W, Xia N, Cong Y. // Zhonghun Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Zazhi. -1998.-Vol.12, №2.-P.176-178

339. Tanaka Т., Matsunaga T. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles // Biosens Bioelectron.- 2001. — P. 1089.

340. Tandon A., Zahner H., Lammler G. CELISA (complement-enzymeimmunosorbent assay) a new method for the estimation of complement fixing antibodies, its use for Chagas disease //J.Tropenmed. parsit. 1979. -V.30. - P.189-193.

341. Tcherneva E., Rijpens N., Jersek B. et al. Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis //J.- Appl. Microbiol. -2000.-Vol. 88(1).-P. 69-80.

342. Thorpe G., Kricka L. Incorporation of enhanctd chemiliminescent reactions into fully automated enzyme immunoassay //J. Bioiumin. Chemiliemines.-1989.- V. 3, N 2.- P. 97 100.

343. Torrance L. Use of protein A to inprove sentsitization of latex particles with: antibodis to plant viruses // Ann.Appl.Biol; 1980. - V.96, N1. - P.45-50.

344. Turkova J. Leakage of the coupled affinant // J. Chromatogr. — 1978. V. 12. -P. 189.

345. Unger K.K. Porous silica, its properties and use as support in column liguid chromatography // J. Chromatogr.Library. Amsterdam, Elsevier, 1979. -V.16.-336.

346. Van Weemen B.K., Schuurs A.N.W.M. immunoassays using hapten- enzyme conjugates // FEBS Lett.-1972.-Vol 24,N1.-P. 77-81.

347. Voller A., Sidwell D.E., Bartlett A. et al. A microplate enzyme immunoassay for toxoplasma antibody//J. Clin. Pathol. 1976.-V. 29, N 2. -P. 150- 153.

348. Weetall H.H., Detor C.C. Covalent attachment! of proteins to inorganik supports directional activation cyanogen bromide // J. Biotechnol. and Biogen. -1975. V.17. - P.295-297.

349. Weinbach R. Die Verwendbarkeit formolbehandelter Erythrocyten als Anti-gentrager in der indirecten Haemagglutination. 2. "Schweiz. Z. Allg. Path." —1958.-V.21.-P.1043.

350. Weinbach R. Die Verwendbarkeit formolbehandelter Erythrocyten als Anti-gentrager in der indirecten Haemagglutination. — I. "Schweiz. Z. Allg. Path." —1959.-V. 22.-P.1.

351. Weimer B.C., Walsh M.K., Beer C. et al. // Appl. And Environ. Microbiol. -2001.-№3.-P. 1300-1307.

352. Weller Т.Н., Coons A.H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. 1954. — V.86. — P.789-794.

353. Weston P.D., Devries G.A., Wriggleworth R. Conjugation of enzyme to immunoglobulins using dimallimids //J. Bioch. Biophys. Acta. 1980. - V. 612. - P.40-49.

354. Williams J.E. Use of ELISA to reveal rodent infections in plafue surveillance and control programmes // Bull. World Health Organ 1990. - V.68(3). -P.341-345

355. Yallow R., Berson S., Assay of plasma insulin in yuman subjects by immunological methods // Nature.- 1959.-V.184.-P. 1648-1656.

356. Yu H. Comparative studies of magnetic particle-based solid phase fluoro-genic and electrochemiluminescent immunoassay // J. Immunol. Methods.-1998.- V.218 (1-2).- P.l-8.

Информация о работе

Жарникова, Ирина Викторовна
доктора биологических наук
Ставрополь, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы