Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов"

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Екатерина МнхяПлоппа

ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.02.03 - микробиологии

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук

Саратов-201!

Работа выполнена п ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору п сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный рукоиодптсль:

кандидат биологических наук Волох Оксана Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник . Матора Лариса Юрьевна

Ведущая оргяшияция:

ФКУЗ «Ростовский-па-Допу ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится « ¿У» Мй/іт-й- 20. и г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научпо-нсследовательскнй противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться » научной библиотеке ФІСУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан « $ » ^урД/х?^? 20 г.

Ученый секретарь диссертационного совета /

доктор биологических наук, (

старшин научный сотрудник Слудскнй А. А.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Туляремия - зооиозная прнродио-очагопая инфекция. Эндемичные очаги туляремии характеризуются стабильностью проявления и широко распространены, и том числе па территории Российской Федерации и соседних стран [Tiirnvilc A. el al., 2004; Топорков В.П. и др., 2007, Мещерякова И. С. и др., 2007; Безсмерг-ный В.Е. н др., 2008; Wang Y. el al., 2011]. Возбудитель туляремии - Francisella lularensis включен в высшую категорию А как потенциальный агент бнотеррорнзма [Dennis D. el al., 2001; Gallagher-Smilh M. et al., 2004]. Несмотря un достигнутые успехи в исследовании особенностей строения н биологии туляремипного микроба, факторы патогенностп этого возбудителя, состав капсулы и протектнпные антигены окончательно не изучены [Mavlasova J. el al., 2002; Sjösledl A., 2003; Eyles J E., 2007; Oyslon P C F., 2008; Saillie M., 2010; Broms .1. E. el al., 2011].

Лабораторная диагностика туляремии основывается па иммунологических (сероал-лергологнческая диагностика) и бактериологических методах, п настоящее время дополнена молекулярно-геиетнческими методами [Лаб. диагност. ООН, 2009]. В области разработки новых способов детекции туляремипного микроба ведутся активные исследования [Splellsloesser W. D. el al., 2005; Осина I I. А. и др., 2007; Романова Л. В., 2008; Johansson А. el al., 2010; Ветчннип С. С. и др., 2011; Larson M. F. el al., 2011].

У возбудителя туляремии лппополисахарпд (ЛПС) и белки внешней мембраны (ВМ) влияют на специфичность иммунного ответа макрооргапизма, обладают уникальной поли-эпнтопной антигенной структурой и рассматриваются как основа для создания профилактических и диагностических препаратов [Хлебников B.C. и др., 1992, 1993; Аронова I I. В., Павлович Н. В., 2000; Ellis J. et al., 2002; Conlan J.W., 2004; Oyslon P C F., 2008, Beasley A S. el al., 2011, Zarella T.M. et al., 2011]. Большое внимание уделяется исследованию комплексных антигенов F. lularensis [Tärnvik A., Berglimd L, 2003; Splellsloesser W. D. et al., 2005; Pierson T. et al., 2011]. Получаемые по классическому методу A. Boivin (1933) лнпополиса-харидо-белковые комплексы (ЛПБК) возбудителя туляремии содержат до 10 % белка и характеризуются высокой серологической активностью [Родионова И.В., Шипицниа Г.К., 1967]. В зависимости or способа получения ЛПБК имеют различный сосгав, молекулярную массу и свойства. В частности, установлена высокая иммунобиологическая активность ЛПБК ВМ F. lularensis, полученного с помощью обработки бактериальных клеток ультразвуком с последующим ультрацентрифугнрованием, с содержанием 12-22 % белка (25 белковых фракции) и 40 % липидов [Хлебников B.C. и др., 1991]. При обработке ВМ растворами детергентов с последующей гель-фильтрацией был получен высокоактивный ЛПБК (IV фракция, 15-35 кДа) с соотношением ЛПС:белок 1:1 [Хлебников B.C. и др., 1992, Кулевац-кий Д.П., 1994]. Показано, что в составе препаратов ЛПБК присутствуют иммунодомпиант-ш,le белки с молекулярными массами 17 и 43 кДа [Аверин С.Ф. и др., 1992; Кулевацкий Д.П., 1994] и белок-шапероп 63 кДа (GroEL) [Коровина О.В., 1993]. Комплекс ЛПС-17кДа

белок рассматривается и качестве протоітша химическом іуля рсмі г гімоіі ппкцииы [Кіііеішікоу У.й. еі аі., 1996], также как и один из препаратов ЛПБК ВМ Іиіагеті! - С-комплекс [Жемчугов В.її., 2004; патенты РФ 2147234, 2221591]. При оптимизации схемы выделения С-комплекса туляремпйпого микроба н условиях масштабированного культивирования штамма-продуцента /\ Ііііагеп.іі.ч 15 ПИИЭГ был разработай метод его нзоэлектрн-ческой преципитации [Шепелев И.А., 2005]. С использованием этою подхода нами был получен препарат ЛГІБК туляреминпого микроба, отличающийся от остальных ранее описанных в литературе комплексных антигенов молекулярной массой, увеличением белкового компонента (более 60 %) и высокой нротективпой акгпшпостыо при экспериментальной туляремии. Этот препарат ЛПБК получил авторское название протсктшшый антигенный комплекс - ПАК [Кузнецова Е.М. н др., 2011].

Несмотря на достигнутые успехи в исследовании антигенных комплексов ВМ Г. Іиіагеїпіх важными условиями при разработке современных эффективных медицинских иммунобиологических препаратов, остаются совершенствование приемов выделения антигенов в иммунологнчеекп активной форме. Изучение особенностей состава и свойств комплексных антигенов тулиремпйпого микроба разных подвидов позволит провести их детальную характеристику.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Получить диагностически значимые антигенные комплексы Іг. іиіагепхіі и сконструировать па их основе экспериментальные иммуиодиагности-ческие препараты.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАН 11Я:

1. Оптимизировать способы получения иммуиохимическн активных антигенных комплексов туляремпйпого микроба.

2. Провести сравнительный анализ полученных препаратов антигенных комплексов туляремпйпого микроба разных подвидов.

3. Получить высокоактивные полпклопальпые иммунные сыворотки к нротектнвно-му антигенному комплексу туляремпйпого микроба и сконструировать на их основе экспериментальные нммуподиапюстикумы для детекции возбудителя туляремии.

4. Разработать па основе антигенных комплексов туляремпйпого микроба экспериментальные препараты для детекции специфических антител.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Оптимизированы способы получения биомассы Р. ШІагеїиіх для последующею выделения биологически активных антигенов. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена оформлением заявки №2010131275 на изобретение «Способ получения биомассы туляремпйпого микроба» (приоритет от 26.07.10 г). Для получения иммуиохимическн активных антигенных комплексов туляремпйпого микроба были усовершенствованы способы их выделения и количественного определения. Выделен и охарактеризован гликозилпроваипый белковый комплекс туляремпйпого микроба, обла-

дающий имрнжепмой нммуногенпостыо и высокой специфичностью, хроматографмческп гомогенный, с молекулярной массой (57±1) кДа, состоящий из диух белковых субъедшнщ (43 н 14-17 кДп). Выделен протектмвный антигенный комплекс, установлен его компонентный cocían: субьединицы с молекулярными массами более 23 кДа имеют белковую природу, 14-17 кДа - липопротеидпую. С помощью иротеомпого анализа в составе мротектмниого антигенного комплекса впервые показано наличие следующих идентифицированных белков: белков-шаперонов (GroES и GroEL), ферментов (GAPDH, KalG, АсрР), белков ВМ (ОшрН, FTL_0617) и регуляторных белков (EF-Tu, RplL). Установлено, что протсктшшый антигенный комплекс является видоспецифичпым антигеном, регистрируется у F. lularensis независимо от подвидовои принадлежности штамма, формы ЛГ1С бактериальной клейки и наличии капсулы.

Впервые на основе сравнительного анализа струюуры и свойств препаратов протек-тивного антигенного комплекса, полученных из штаммов F. lularensis subsp, holarciica био-варов eryR, eryS, japónica, subsp. nearclica, subsp. niecliaasialica, установлено, что все препараты обладают иммуиогепиостыо, сходны по химическому составу и содержат иммунохи-мическн активные субьединицы (10-85 кДа). Антигенный комплекс из F. lularensis subsp. novicicla отличается от ПАК других подвидов более низкой (в 5 раз) иммупохимической активностью, увеличением содержания углеводной части па (70±3) %, наличием субъсдпннц с молекулярной массой более 110 кДа н отсутствием иммунореактивных белков в области 5785 кДа.

Сконструированы экспериментальные антнтельпме и антигенные туляремийные ди-агпостнкумы. Использование Г1АК и гликозилировапиого белкового комплекса в качестве маркерных антигенов и иммупоблотгннге, ИФА п ДИА позволяет определять туляремийные антитела в крови вакцинированных н эксисримеиталыю зараженных лабораторных животных. Чувствительность экспериментальных питательных диагиостикумов для детекции возбудителя туляремии разных подвидов пммуиодиагпостическими методами (ИФА, ДИА) составляет Ю^-Ю5 м.к./мл. Сконструированный иммуиосуспензмопный диагиостикум в реакции латекс агглютинации (РЛА) позволяет выявлять содержащие капсулу (Сар+) и бес-капсульпые (Сар") штаммы F. lularensis в отличии от коммерческого диагпостнкума для реакции непрямой гемагглютипацин (РИГА), выявляющего только Сар+-шгаммы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Применение антител к С-комплексу ту-ляремийного микроба для детекции возбудителя туляремии методами иммупоанализа» и «Получение гликозплнрованпого белкового комплекса внешних мембран клеток туляре-мийного микроба», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 17.04.2008 г. и протокол № 5 от 22.09. 2011 г., соответственно) и утвержденные директором института.

В Госудлрешенной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован бескап-сульный штамм /■' /а/агепхи 1ю1агсПса КМ 9, производный вакцинного штамма /Г /н/а;е/;ш 15 линии ИИИЭГ, который может быть использован нрм создании диагностических туля-ремийимх тест-систем для детекции Сар' штаммов.

Выделенные препараты ПАК разных подвидов используются при выполнении научно-экспериментальных работ и лабораториях вакцинологпн и иммунопрофилактики, иммунодиагностики и молекулярной диагностики РосНИПЧИ «Микроб». Научные данные об особенностях антигенного строения туляремпЛпого микроба, полученные в результате работы, включены в теоретический материал при чтении лекций цикла «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» иа курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования по специальности «бактериология» в институте «Микроб».

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ ПА ЗАЩИТУ:

1. Оптимизированный метод выделепнм комплексных антигенов туляремш'шого микроба, основанный на комбинировании способов химического и ферментативного гидролиза с последующей хроматографнческоп очисткой, позволяет получать иммупохнмичеекп активные препараты.

2. Протектнппый антигенный комплекс является общим антигеном для гуляремпйного микроба основных подвидов (эпЬзр. ИокисНса, пеагсИса, тесИааи1айса), обладает сходной структурой и свойствами.

3. Особенности биохимического н иммунохимпческого строения мрогектиипого антигенного комплекса из Г. шШгепзю вцЬвр. ио\чс1(/а обусловливают снижение его нммупо-гепностн по сравнению с аналогичными антигенами, выделенными из штаммов других подвидов.

4. Экспериментальные аптнтельпые препараты па основе гнпернммупиых полпкло-пальпых кроличьих сывороток к нротекти иному антигенному комплексу туляремпйпого микроба позволяют выявлять в различных вариантах иммуиоанализа клетки К Шкиети разных подвидов в минимальном количестве Ю^-Ю1 м.к./мл, а также антиген в минимальной концентрации (0,5±0,1) пг/мл.

5. Экспериментальные иммунодиагпостические препараты па основе антигенных комплексов позволяют выявлять специфические противотуляремнппые антитела у лабораторных животных (вакцинированных, инфицированных н переболевших) н в гпперпммун-ных сыворотках.

АПРОБАЦИЯ РАВОТЫ. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005, на Российской па-

учпо-практическон конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и поенной медицины», Санкт-Петербург, 2006, на VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения м общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы посі.ми» и санитарная охрана территорий государств-учасгииков СНГ», п. Оболенск, 2006, на IX Съезде Всероссийского научно-практнчсского общества эпидемиологов, микробиологов н паразитологов, Москва, 2007, па научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями па Юге России», Ставрополь, 2007, па IX Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями па территории государств-участников СНГ», Волгоград, 2008, па научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребпадзора «Биологическая безопасность в современном мире», п. Оболенск, 2009, па Всероссийской научпо-ирактпческой конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», Нижний Новгород, 2009, на X Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области сапнтарпо-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ», Ставрополь, 2010, на научно-практической конференции молодых ученых Роспотребпадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», И. Новгород, 2011, на III научно-практической школе-копферепцни молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребпадзора, п. Оболенск, 2011, на ежегодных научно-практических конференциях РосМИПЧИ «Микроб», Саратов, 2005-2011 гг.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, из них 5 сгатей в изданиях, рекомендованных «Перечнем...» ВАК России.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников. Объем диссертации 150 страниц. Список литературы содержит 321 источник, из них 177 зарубежных. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 18 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал 1.1 н методы.

Работа выполнена с использованием 65 штаммов F. tularensis разных подвидов и биоваров (holarclica: eryR, eryS, japónica; nearclica, mediaasiatica, novicida), а также 30 гетс-рологичных микроорганизмов. Все штаммы микроорганизмов получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Культивирование гуляремийного микроба проводили при 37 °С на плотных и жидких питательных средах FT, Т и LB. Анализ коэф-

фицнентов сходства фенограмм штаммов F. tidaremis рассчитывали но формуле Дисс [Звягинцева И. С. и др., 1999].

Для получения препаратов ПАК разных подвидов использовали методику, разработанную ранее для выделения антигенного комплекса из вакцинного штамма [Шепелев И.Л., 2005| в пашен модификации.

Концентрацию белков, углеводов, липпдов, нуклеиновых кислот определили общепринятыми методами [Снирии Л.С., 1958; Amenla J., 196'1; Сборник инструкций но методам контроля..., 1983; Скоупс Р., 1985]. Электрофорез в иолиамнлакрндпом геле в присутствии додецплсульфата натрия (SDS-PAGE) проводили по U. Laemmli [1970] в 4 % концентрирующем и 10-12,5 % разделяющих гелях. Для детекции белков использовали окрашивание Кумасси яркосиним R-250, для ЛПС-содержащпх компонентов - азотнокислым серебром. Иммупоблотгипг проводили но методу Н. Towbin [1979].

Протеомпый анализ ПАК был проведен и ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА России (г. Москва) rio договору о научно-исследовательском сотрудничестве. Белки идентифицировали с помощью программы Mascol в базе данных NCBI (National Cenler for Biotechnology Information, 2010 г.). Надежно идентифицированными (р< 0,05) считались белки с критерием достоверности score > 74.

Для получения сывороток к антигенным комплексам туляремннного микроба использовали взрослых (2 кг) кроликов породы «Шиншилла». Иммупоглобулнновые фракции (Ig «ПАК») выделяли по L. Rane, L. Newhauser [1954]. Для постановки метода флуоресцирующих антител (МФА) использовали препарат Ig «Г1АК» п его Р(а1г)2-фрагмснты, меченные флуореецеипизотпоцнапатом по методу J. Marshall el al. [1958]. Иммуиопероксидазпыи коп'ыогат получали методом периодагиого окисления [Фримель Г., 1987]. Для прямого ДИА использовали антитела, комыогироваииые с коллоидными металлами (серебром - проведено в РосИИПЧИ «Микроб» 11.А. Шараповой, золотом - в ИБФРМ РАН д.б.н. Л.А. Дыкмапом).

Для очистки препаратов антигенов и иммуноглобулинов, разделения их компонентов применяли колоночную хроматографию с использованием различных носителей па хроматографе низкого давления Biologic LP фирмы «Bio-RAD» (США). В работе использовали РИГА с иммуиоглобулиновым и антигенным диагпостикумами («48 ЦНИИ МО РФ» г. Киров, СтавМИПЧИ г. Ставрополь), ИФА и ДИА с экспериментальными препаратами и коммерческими тест-системами (СтавМИПЧИ).

Для изучения иммуногенностн полученных препаратов использовали беспородных белых мышей (19±1 г) и морских свинок (250±20 г). Среднюю заражающую дозу (LD5I1) вирулентных штаммов F. liilarensis и среднюю иммунизирующую дозу (ED¿n) антигенных препаратов рассчитывали по методу Кербера. Работу с животными проводили по стандартным методикам [МУ 3.3.1.2161-07].

При обработке полученных результатов применяли общепринятые статистические методы, вычисляя среднеарифметические величины, степень достоверности различий по (-критерию Стыодеита, исходя из уровня значимости (Р) <0,05 (95 %) [Ашмарнн И. П., Воробьев А. А., 1962; Рокицкий П.Ф., 1973].

Результаты исследований и их обсуждение

Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремниного микроба и характеристика их компонентного состава. Протективпый антигенный комплекс туляремийного микроба, полученный нз клеток вакцинного штамма К шЬтшх 15 ПИИЭГ (ПАК-15), представляет собой антиген сложной химическом природы, в состав которого входят белки, липнлм и углеводы в соотношении 3:1:1. Данный препарат характеризуется высокой иммунохимической активностью. Особенности этого комплексного антигена но сравнению с другими ЛПБК представлены в таблице I.

Таблица I - Сравнительная характеристика препаратов ЛПБК и ПАК F. lularensis 15.

Препарат Способ получения М. масса, кДа Белок, % ED.J, мкг ИФА', мкг/м

ЛПБК ВМ [Хлебников B.C. и др., 1991] ультрацептрнфугпрованпе ультразвукового дезиптеграта бактериальных клеток — 12-22 720 1

ЛПС-17 кДа белок [Кулевацкий Д.П., 19941 обработка ВМ детергентами, ультрацептрифугнропапие, колоночная гель-фильтрация 15-35 50 25 0,1

С-комплекс [Патент РФ 2221591; Жемчугов В.е., 2005] дифференциальное центрифугирование ультразвукового дезиптеграта бактериальных клеток, ультрафильз рация 2000 15-26 261 1

ПАК-15 высаливание и нзоэлектрнческая преципитация из водорастворимого пула ВМ 280±10 60-65 2,4 0,0005

I - ЕОмі препаратов при однократной подкожной иммунизации белых мышей с последующим заражением Р. Магепзії 503 в дозе 80-100 м к.; 2 - ИФА со специфическими антителами.

Была проведена работа по определению состава белковых субі.едиииц ПАК-15 и их идентификации. С помощью ЗОЭ-РАОЕ был установлен белковый спектр данного антигена, представленный субьедипнцами с молекулярными массами от 10 до 85 кДа, мажорные из которых 81-85, 57-60, 43, 32, 23, 19 и 14 кДа были мммунохнмическн активны. Протеом-ным анализом в составе ПАК были идентифицированы 9 биологически активных молекул, специфических для К ШІагепт (рисунок 1). Высокую иммунобиологическую активность ПАК, возможно, обусловливает присутствие в его составе стрессовых белков-шапероиов (ОгоЕБ и ОгоЕЕ), регуляторных белков (ЕР-Тп и 1*р1Ь), бактериальных ферментов (бАРОН, КаЮ, АсрР) и белков ВМ (ОпірІ І, ПЪ_0617).

л

Б

4

30— 28—

Kart!

GioEL

EF-Tu

GAPDH

OmpH

FTL 061 ■

A< pP

17—

■ «Ml M і

GioES'

RjilL

"«••te

K«0

A - SDS-PAOE: I - белковый профиль, 2 - иммуиоблотпшг с Ig «ГІАК», M - маркеры молекулярной массы.

Б - Двумерный РАО-элеюрофорез и идентифицированные белки.

Рисунок I - Определение субъедииичиого состава и идентификация белковых компонентов протекипшого антигенного комплекса туляремийпого микроба.

Учитывая сложную химическую природу протектпвпого антигенного комплекса туляремийпого микроба, а также его высокую иммупохимическую активность, проводили работу по определению его активных компонентов. Было установлено, что ПАК-15 термостабилен, устойчив к действию кислот и щелочен в диапазоне pli от 1,0 до 13,0, обратимо пре-ципитирует при 50-55 % насыщении сульфатом аммония. Химическим гидролизом растворами детергентов была определена белковая природа его основных субьеднииц с молекулярными массами от 20 до 58 кДа. Наибольшей устойчивостью к действию детергентов обладали субі.едииицьі с молекулярной массой 81-85 п 14-17 кДа. Максимальной иммуиохп-мической активностью (тигр в ДИА 1/102400) по сравнению с контрольным ПАК (1/51200) обладал модифицированный саркозплом препарат - ПАК-Д, который может использоваться как сепситин в ИФА и ДИА при определении специфических антител. Фенольная экстракция позволила разделить препарат ГІАК-15 па две фракции: фенольную, на 70 % состоящую из углеводных и лнпидных компонентов, н водную, содержащую в своем составе мажорные белки ПАК-15 (78-80 % белка). Фенольная фракция обладала меньшей активностью (тигр и ДИА 1/3200), чем подиай (титр 1/25600). Присутствие в обеих фракциях двух нммунорсак-тивпых компонентов с молекулярными массами в диапазоне 14-17 кДа свидетельствовало о

липопротеидпой природе этих субъедипиц, что согласуется с данными литературы [5|6я1е(]1 А. е1 а1., 1991].

Установлена высокая чувствительность ПАК к действию пепсина, вызывающего его полный гидролиз, и протенпазы К, приводящей к гидролизу только белковой части и позволяющей получить компонент ЛПС природы, который имеет структуру, типичную для 5-формы грамотрнцательиых бактерий. Иммунохнмнческая активность данного препарата по отношению к контролю была значительно ниже (титр в ДИА 1/800, по сравнению с контрольным 1/51200), что указывает на зависимость серологической активности компонентов ПАК ог содержания в них белка.

Разработанный нами метод ферментативного гидролиза ПАК-15 ироиазой Е позволил получить комплексный антиген углевод-белковой природы (глпкозилированный белковый комплекс). Препарат является хроматограф11чески гомогеиым, его молекулярная масса около (57±1) кДа, и содержит в своем составе, по данным 808-РА0В, мембранные белки 41-43 и 14-17 кДа (рисунок 2) и О-полпсахаридпый компонент. Соотношение белков и углеводов -2:1.

250 — 95

»■я»

36— **» \

ее* I \

ttt.

1Н—00 -»

s „ f

1 — —' ¿mm mm U.----J\j

M 1 2 J

4. I

\ \

Time [minutes]

A - белковый профиль (1), нммупоблопниг с lg «ПАК» (2), пммупоблогпшг с МкАт к ЛПС F. mlareiuis 15 ПИИЭГ (3), М - маркеры молекулярной массы.

Б - гель-хроматография па Sephacryl S-300: по осп абсцисс - время элюции, мин; по осп ординат - оптическая плотность эЛШепта при 280 им (А.и.)

Рисунок 2 - Результаты SDS-PAGE, нммупоблотгнпга и гель-хроматографии глико-знлированиого белкового комплекса туляремнйпого микроба.

В экспериментах па лабораторных животных было установлено, что препарат глико-зилированпого белкового комплекса нетоксичен, безвреден, обладает высокой нммупогеп-

■ ioii активностью. После однократной подкожной иммунизации белых мышей (дозой 20 мкг) и морских сипнок (дозой 1 мг) аитнтельпый отпет регистрировался на 7-е и 22-е сутки соответственно. Реакция лейкоцптолиза была резко положительная у мышей к 7-м суткам (33 %), у морских спинок - к 28-м суткам (35 %). В «остром» опыте при заражении бномо-делей вирулентным штаммом F. lularensis subsp. holarclicci 503/840 (в дозе для белых мышей 100 LD5o, для морских свинок - 1000 LD31|) было установлено достоверное увеличение продолжительности жизни иммунизированных углевод-белковым комплексом ЖИВОТНЫХ 110 сравнению с контрольной группой (Р<0,05), EDj0 для белых мышей составила (2,5±0,3) мкг, для морских свинок (200± 10) мкг.

Учитывая поверхностное расположение Г1АК, был проведен эксперимент по определению участия данного антигена в формировании каисулоподобного вещества F. lularensis. Нами с помощью обработки клеток акридиновым оранжевым [Sanilslrcim G. el al., 1988] из культуры F. lularensis 15 ПИИЭГ были получены Сар" штамм F. lularensis КМ 9 (депонирован в ГКПБ «Микроб») и субкультура в R-форме, которые взаимодействовали с lg «ПАК» в ИФА, ДИА в концентрации Юг' м.к./мл и нммуноблоттннте. При анализе состава ПАК из клеток бескансульпых штаммов F. lularensis LVS Сар' и КМ 9 было установлено, что по основным физико-химическим и нммупохнмическим свойствам они сходны с аналогичными препаратами, выделенными из штаммов F. lularensis с Сар* фенотипом. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что присутствие ПАК па поверхности клетки не зависит от формы ЛПС, и в его состав пе входят антигенные компоненты каисулоподобного вещества туляремийпого микроба.

Основываясь на полученных данных о составе и свойствах прогективиого антигенного комплекса туляремийпого микроба, была проведена работа но оптимизации условий культивирования штамма-продуцента и схемы выделения ПАК. Введение дробной подкормки (глюкозы совместно с витаминами группы В) при выращивапнн на жидкой питательной среде увеличивало выход Г1АК. Учитывая литературные данные, что в услоинях повышенной температуры увеличивается экспрессия белков-шаперопов F. lularensis [Романова J1.B, 2008; Savill A G. el al., 2009], было проведено культивирование нрн 42 "С и 52 °С (тепловой шок). В результате lie получили ожидаемого увеличения выхода ПАК или его компонентов, что может свидетельствовать о стабильности этого антигена. Применение комплексного подхода, основанного на комбинировании способов химического и ферментативного гидролиза ПАК с последующей хромагографической очисткой, позволило получить нммупохнмнчсскн активные антигены - ПАК-Д и гликозплпровапный белковый комплекс (рисунок 3). С целью повышения технологичности выделения ПАК была уменьшена кратность циклов гидродинамической обработки клеток до двух, а фракционирование сульфатом аммония с последующим осаждением в пзоточке позволило более эффективно освобождаться от балластных вещест в.

Рисуиок 3 - Схема получения диагностически значимых антигенных комплексов ту-ляремийпого микроба.

Сравнительный анализ препарат»» протектшшого антигенного комплекса ту-ллремнйного микроба, полученных нз hit а мм оп-п роду центов разных подвидов.

Для оценки возможности получении ГІАК из штаммов-продуцентов разных подвидов туляремийпого микроба был проведен элекфофоретический анализ суммарных клеточных белков 65 штаммов F. lulcirensis. Коэффициент сходства суммарных клеточных белков F. lulcirensis внутри подвида в среднем составлял 99 %, между подвидами - 95 %, что соответствует литературным данным [Sjósledl А. В., 2003; Sveiisson К. el al., 2005]. Иммуиоб-лотгиигом доказано наличие белковых фракций протектшшого антигенного комплекса туляремийпого микроба в составе всех исследуемых штаммов.

По оптимизированной методике, представленной па рисунке 3, нами были получены препараты ПАК из следующих штаммов-продуцентов: F. lulcirensis subsp. holarclica eryR 503/840 (ПАК-503), holarclica eryS B-300 (ГІАК-В 300), holarclica japónica Miura (ПАК-Міїїга), neardica B399 A'Cole (IlAK-A'Cole), mediaasialica A 179 (ПАК-А 179), mediaasialica A-61 (117) KM 4 (IIAK-A 61), novicida Ulali 112 (ПАК-Ulali 112). Все штаммы по проведенным биохимическим тестам внутривидового тішировашш соответствовали своему подвиду. В результате сравнительного анализа физико-химических, антигенных и биохимических свойств было установлено, что все протективпые антигенные комплексы, кроме ПАК-Ulali 112, сходны по составу с препаратом ПАК-15 и содержат в среднем (61,8±2,7)% белков, (15,1±1,6) % углеводов, (23,6±2,3) % липпдов. Иммунохимическая активность ПАК F. lularensis основных подвидов и бноваров в ИФА составила около (0,5±0,1) пг/мл. Препарат из подвида novicida отличался большим содержанием углеводной части до (26,5±1,2) % и снижением белковой до (45,5±4,1) %, его иммунохимическая активность была в 4 раза ниже.

Элсктрофоретический белковый профиль ПАК из клеток пиру леи i...... штаммов (503,

В 300, Minra, A'Cole, А 179, А 61) не отличался от препарата, полученного из клеток вакцинного штамма. Было установлено наличие во всех полученных препаратах ПАК компонентов липополнеахарндиоп природы, которые представлены лнпидом А с коровым олпго-сахаридом и боковыми цепями. Показано, что иммуиохимическая активность этих комплексных антигенов связана с пх белковой частью, в составе которой были определены им-мунодомииантиые полипептиды, характерные для всех исследованных препаратов и аналогичные ПАК-15 (рисунок 4).

Л Б

250----

А - белковый профиль; Б - иммупоблоттнпг с lg «ПАК» препаратов: 1 - ПАК-15; 2 -НАК-В 300; 3 - ПАК-503; 4 - ПАК-Miura; 5 - ПАК- А 179, 6 - ПАК-А'Со1е; 7 - ПАК-Utah 112. М - маркеры молекулярной массы.

Рисунок 4 - SDS-PAO электрофорез и иммуноблогтииг препаратов прогектнвного антигенного комплекса туляремпйиото микроба разных подвидов.

Препараты ПАК-15, ПАК-503, ПАК-В 300, ПАК-А 179, ПАК-А 61 и Г1АК-А'Со1е, по данным гель-хроматографии па Sephacryl S-300, были хроматографнчески гомогенными, представлены одним мажорным пиком с молекулярной массой около 280 кДа. Профиль ПАК-Ulali 112 имел два пика с молекулярными массами около 280 и 160 кДа, состав которых отличался: в первом были белки с молекулярной массой более 43 кДа, а по втором -менее 23 кДа. Установлено, что ПАК-Utali 112 взаимодействовал со специфическими антителами, по не был иммуиохнмическн идентичен препаратам ПАК других подвидов. Элек-трофоретический профиль препарата ПАК-Ulah 112 также отличался наличием дополнительных белков с молекулярной массой более 110 кДа и отсутствием пммунореактппиых белков в диапазоне от 50 до 90 кДа (рисунок 4).

Поскольку важным условием при использовании антигенов для получения специфических сывороток является их высокая иммунологическая эффективность н отсутствие токсичности для животных-продуцентов, была проведена работа но оценке иммунобиологических свойств полученных препаратов. Было показано, что все препараты ПАК, независимо от нодвндовой принадлежности штамма-продуцента, обладают выраженной антигенной активностью. Их однократное введение биомодслям (мыши, морские свинки, кролики) вызывало формирование выраженного антителыюго ответа, независимо от способа иммунизации. Все препараты ПАК были нетоксичны для лабораторных животных, пе оказывали выраженного повреждающего действия на сплепоциты и гимоциты белых мышей. Положительная реакция лейкоцнтолиза у белых мышей па 14-21 сутки после введения препаратов ПАК подтверждала пх высокую иммуногеипость. Максимальной нммуиомодулирующей активностью обладал препарат, полученный из вакцинного штамма. В частности, при однократной подкожной иммунизации белых мышей препаратом ПАК-15 в дозе 10 мкг отмечено формирование антителыюго ответа в ранние сроки (па 3-7 сутки). При иммунизации морских свинок (доза 100 мкг) антительпый ответ также регистрировался в ранние сроки, стабилизировался па высоком уровне к 42-м суткам (ппр в ИФА 1/640-1/960) и сохранялся до 4,5 месяцев.

Показано, что все препараты ПАК защищают белых мышей от гибели при экспериментальной туляремии, вызванной вирулентными штаммами голарктического, пеарктиче-ского и среднеазиатского подвидов (заражающая доза 100 Ь05,>), а также большими дозами (Ю7 м.к.) вакцинного штамма. Во всех случаях отмечено достоверное увеличение продолжительности жизни иммунизированных ПАК животных по сравнению с контрольными группами (Р<0,05). Было установлено, что препарат ПАК-15 обладал максимальной протек-тнвпой активностью при заражении штаммами голарктического подвида (ВО50 = 3,1 (2,4-11,3) мкг для Г. шЬгетк 503/840 и ЕР3„ = 1,4 (0,6-2,9) мкг для /Г шЬгаии 15 НИИ-ЭГ). При заражении /Г Шкиамз эиЬвр. пеагсИса В399 А'Со1е максимальная протективпая активность отмечена у препарата Г1АК-А 179 (ЕО50 = 16,21 (9,2-25,1) мкг). Минимальной протективпои активностью по отношению к К Шк1ге>ш5 виЬвр. 1ю1агсЧса 503/840 обладал препарат ПАК-ШаЬ 112 (ЕО50 = 155,9 (66,7-469,4) мкг). Это может быть связано с особенностями его строения, в частности с большим содержанием углеводного компонента и с отсутствием ряда нммуиореактивиых белков.

Разработка экспсрнмснтяль...... нммунодпагностичсскнх препаратов дли детекции возбудители тулиремнн II специфических антител. Для получения гнпернммунных туляремпГшых поликлопальпых сывороток были разработаны две схемы иммунизации кроликов. Был получен ряд сывороток к каждому препарату ПАК основ...... подвидов (ПАК-15,

ПАК-503, Г1АК-А'Со1е). Показано, что все сыворотки этого ряда иммупохимически идентичны и выявляют иммуиодомииаитпые субъединицы всех препаратов, независимо от под-

пидоной принадлежности штамма-продуцента, что наряду с данными сходства строения и свойств свидетельствует о видовой специфичности протектпвпого антигенного комплекса. Установлено, что применение на первых этапах иммунизации кроликов комплекса водпо-фенолышх экстрактов штаммов F. tularensis различной иодвидовой принадлежности (subsp. mediaasiatica А-61 (117) КМ 4, subsp. nearclica В399 A'Cole, subsp. holarclica 503/840 и 15 ПИИЭГ) с последующим внутривенным введением препарата ПАК-15 позволило увеличить специфичность сывороток, которые использовались в пашей дальнейшей работе.

На следующем этапе был проведен анализ чувствительности и специфичности полученных иммунных сывороток в сравнении с коммерческой туляремпйпой сывороткой - КТС (сыворотка диагностическая туляремнниая агглютинирующая, Иркутский НИГ1ЧИ). При этом в ДИА чувствительность КТС мри разведении 1/100 для штаммов F. tularensis составляла I07 м.к./мл, тогда как экспериментальные сыворотки при тех же разведениях выявляли возбудителя в концентрации 10й м.к./мл. Специфичность последних составила 100 % при концентрации гетсрологнчных штаммов 10* м.к./мл, тогда как при использовании КТС были отмечены перекрестные реакции с клетками Yersinia peslis, )'. pseudotuberculosis, Escherichia coli и Salmonella paratyphi в концентрации 107 m.ic./mji. Для повышения специфичности экспериментальных сывороток была проведена сорбция перекрестиореагирующих антител с применением в качестве адсорбентов микробных клеток чумного и псевдотуберкулезпого микробов. Из цельной гипериммупной сыворотки были получены lg «ПАК», которые использовали при конструировании экспериментальных антительпых препаратов для детекции возбудителя.

Чувствительность экспериментальной иммуиофермептпой тест-системы (ИФА, ДИА) анализировали па расширенной панели штаммов F. tularensis разных подвидов (50 штаммов). В среднем этот показатель составил в ИФА (3,2±0,3)хI05 м.к./мл, в ДИА -(6,5±0,4)х105 м.к./мл (таблица 2). Специфичность экспериментальных антительпых препаратов была проверена па панели из 30 гетсрологнчных штаммов и составила 100 % при концентрации 10* м.к./мл и 84 % при концентрации 109 м.к./мл.

При определении влияния способа инактивации бактериальных клеток па чувствительность экспериментальных ИФА и ДИА было установлено, что экспериментальные тест-системы в 100 раз чувствительнее при обработке культур F. tularensis фенолом без нагревания, чем формалином с прогреванием. Пороговый уровень чувствительности экспериментальной иммуиофермептпой тест-системы в модельных опытах: пробы почвы, речном воды, суспензии паренхиматозных органов н сыворотки белых мышей, искусственно коитамиии-роваппые различными концентрациями вакцинного штамма F. tularensis 15 ПИИЭГ, составил 2х|05 м.к./мл. При апробации разработанной экспериментальной тест-системы для выявления возбудителя туляремии н смешанных культурах использовали взвесь клеток F. tularensis 15 ПИИЭГ с Y. peslis l£V, Y. pseudotuberculosis I серовара, Y. enterocolitica 121 и

Brucella abortus I9BA. В этом случае чувствительность составила 6* I03 м.к./мл при 100 % специфичности для гетерологичиых штаммов в концентрации 10* м.к./мл.

Таблица 2 - Чувствительность (м.к./мл) экспериментальных аптительных препаратов.

Подвндоиая Количество штаммов в %, выявляемых в

принадлежность ИФА ДИА

штаммов F. lularensis 1x10'' 5х|05 |х|05 sxio11 1х|06 5х|05 |х|05 5х|0"

holarclica eryR 100 100 35 12 100 41 18 6

liolarclica eryS 100 100 25 13 100 63 25 13

holarclica japonica 100 100 0 0 100 100 33 0

nearclica 100 100 67 0 100 33 II 0

mediaasiatica 100 100 45 0 100 55 9 0

novicida 100 0 0 0 100 0 0 0

Экспериментальный лагексиый дпагпостикум па основе «ПАК» выявлял Сар+ и Сар" штаммы Г. ш1аге!т$ в РСА на стекле и РЛА микрометодом. Чувствительность РЛА для Сар* штаммов составила 5x10й м.к./мл, для Сар' - 107 м.к./мл, тогда как коммерческий дпагпостикум для РИГА не выявлял Сар" штаммы /Г Ги/лтшл в концентрации 10^ м.к./мл.

На основе ^ «ПАК» и его Р(аЬ')2-фрагмептов получены экспериментальные конъю-гаты: нммунопероксидазные и с коллоидными металлами, позволившие повысить чувствительность ИФА и ДИА для клеток 1\ ыЬгепт до 10м м.к./мл и упростить методику постановки анализа, используя прямой вариант. Эти экспериментальные препараты отличались низкой стабильностью (менее 3 месяцев) и нуждаются в дальнейшем усовершенствовании. Также были получены экспериментальные ФИТЦ-копъюгаты 1ц «ПАК» и Р(аЬ')2-фрагмепгов. При постановке МФА с использованием экспериментальных препаратов было отмечено специфическое свечение возбудителя в мазках-отпечатках органов, зараженных вирулентными штаммами Г. Ш1агепш разных подвидов белых мышей па 3 кресга так же, как при использовании коммерческого дпагностикума (ИД'ГЛ, производство ИИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). При бактериологическом анализе отпечатков этих органов в 100 % проб был отмечен рост туляремннпого микроба, а при их бактериоскопии (окраска мазков-отпечатков по Романовскому-Гимзе) возбудитель обнаруживали только в некоторых пробах, что согласуется сданными литературы [Олсуфьев II.Г., 1975].

Были проведены лабораторные испытания сконструированных аптительных иммуно-диагност икумов (ИФА и ДИА) для обнаружения возбудителя туляремии у экспериментально зараженных лаборатор...... животных н в природном материале. Исследование суспензии

парапхематозпых органов от 21 белой мыши, инфицированной /Г /к/тм/5 503/840 и В399 А Со1е в дозе 100 Ь0„ь и 20 мышей, вакцинированных /\ й//лге;ии 15 НИИЭГ в дозе Ю'м.к., показало, что возбудитель туляремии выявлялся с помощью ИФА в 34 пробах (83 %), ДИА - в 29 пробах (71 %), тогда как бактериологическим методом - только в 15

пробах (36,6 %). В период от 1 до 8 суток после заражении была отмечена 100 % корреляция между результатами бактериологического анализа и экспериментальным ИФА и ДИА. При сравнении полученных результатов с использованием коммерческой диагностической пест-системы для выявления возбудителя туляремии в ИФА (ИФА-Тул-СтавИИПЧИ) было

показано, что возбудитель обнаруживался только в 22 пробах из 41 (54 %). В ......... сроки

(до 8 сут.) корреляция полученных с помощью ИФА-Тул-СтавИИПЧИ результатов сданными бактериологического анализа и эксперимента;.....ыми антительными препаратами составила 95 %.

Поскольку Саратовская область относится к эпзоотичпым по туляремии территориям [Федорова 3. П., 1995, Матросов А. 1-І. и др., 2007], представляло интерес использовать разработанные экспериментальные нммуподиагиостнческие препараты для анализа природного материала. При эпизоотологическом обследовании зеленой зоны г. Саратова на обнаружение антигенов туляремийного микроба было проанализировано 106 проб от фоновых животных данного региона. Положительные результаты получены в ИФА и ДИА в 17 и 15 случаях, соответственно (таблица 3). Было отмечено, что положительные пробы зарегистрированы в трех из 15 исследованных природных эпитопах.

Таблица 3 - Результаты обнаружения ан тигенов туляремийного микроба в суспензии печени и селезенки в различных объектах эпизоотологического обследования.

Вид исследуемого материала Количество проб Количество положительных проб

ИФА ДИА ИФА-Тул-СтавИИПЧИ

Рыжая полевка 51 10 9 10

Обыкновенная полевка 3 2 2 2

Желтогорлая мышь 18 5 4 6

Лесная мышь 22 0 0 0

Домовая мышь 1 0 0 0

Обыкновенная бурозубка 7 0 0 1

Малая бурозубка 1 0 0 0

Большая синица 3 0 0 0

Сконструированные антигенные препараты для ИФА на основе ГІАК выявляли специфические антитела как в гипериммуиных туляреминпых сыворотках (в титрах 1/512001/204800), так и у зараженных, иммунизированных и вакцинированных лабораторных животных (в титрах 1/800- 1/3200). Использование пшкознлированиого белкового комплекса в качестве сепснтниа в ИФА также давало возможность выявления туляреминпых антител (у лабораторных животных в титре 1/100-1/400, в сыворотках - 1/3200). Специфичность экспериментальных антигенных днагностикумов в обоих случаях составила 100 % в отношении нормальных сывороток и коммерческих гетерологичпых аитительпых препаратов. Показана возможность использования ПАК-15 в иммупоблоттмиге для регистрации туляре-

минной инфекции у лабораторных животных. Идентификацию проводили по антигенам с молекулярной массой около 43 и 17 кДа. Этим методом в течение 2-х месяцев регистрировали туляремнниые антитела у белых мышеи, вакцинированных F. lularensis 15 ИИИЭГ в дозе 10 м.к. Применение препаратов антигенных комплексов в качестве маркерных антигенов в 11 м му иоблотти и ге может быть использовано как подтверждающий тест при постановке ИФА п ДИА.

Полученные данные представляют научный н практический интерес, поскольку впервые было показано, что иротектнвиын антигенный комплекс является общим антигеном для тулирсмийпого микроба, независимо от подвида возбудителя. Были получены препараты ПАК из штаммов F. lularensis subsp. holarctica, nearcíica, mecliacisialica и novicida, проведен сравнительный анализ их структуры, антигенных, биохимических и иммунологических свойств. Разработанные способы получения и выявления антигенных комплексов туляремпнпого микроба и специфических антител могут служить основой для создания новых средств диагностики туляремии.

ВЫВОДЫ

1. С помощью оптимизированного метода выделения комплексных антигенов туля-ремийпого микроба, основанного на способах химического и ферментативного гидролиза с последующей колоночной хроматографией, были получены иммупохнмнчески активные препараты: протектнвпый антигенный комплекс и гликознлироаанпый белковый комплекс.

2. Выявлена высокая нммунохимическая активность и антигенная идентичность препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из клеток штаммов F. lularensis subsp. holarctica бповаров eryR, eryS, japónica, subsp. nearcíica и subsp. mediaasialica. Протектнвпый антигенный комплекс регистрируется у тулирсмийпого микроба независимо от формы липополнеахарнда н наличия капсулы.

3. Выявлены особенности протективного антигенного комплекса F. lularensis subsp. novicida, состоящие в преобладании углеводного и липпдного компонентов над белковым и отсутствии иммуподомппаитных полипептидов с молекулярной массой в диапазоне от 50 до 90 кДа, которые приводят к снижению его нммупогеиности.

4. Разработанная схема гипериммупиэацни кроликов-продуцентов с последовательным использованием в качестве иммуногепа смеси водпо-фепольпых экстрактов клеток F. lularensis subsp. holarctica, nearcíica, mediaasialica и протективного антигенного комплекса, позволяет получать активные туляремийиые сыворотки с минимальным уровнем содержания гегерологнчных антител. Сконструированные па основе полученных полпкло-пальпых антител экспериментальные иммуиоднагпостикумы (иммуноферментные, иммуно-суспеизноипые, нммупофлуоресцептпые) выявляют возбудитель туляремии в концентрациях, соответствующих чувствительности методой.

5. Лабораторные испытания экспериментальных антнтельных препаратов для детек-

hihi F. tularensis i) ИФА н ДИЛ па чистых и смешанных культурах, и искусственно копта-мипиропапных пробах биологического материала н инешней среды показали их высокую специфичность и чувствительность. При исследовании органон инфицированных лабораторных животных была отмечена 100 % корреляция результатов экспериментального ИФА с данными бактериологического анализа и ранние сроки после заражения. Эффективность применения экспериментальных иммуноферментных тест-систем подтверждена исследованиями полевого материала, собранного при эиизоотологическом обследовании зеленой зоны г. Саратова.

6. Применение ан тигенных комплексов туляремийпого микроба в качестве сепсити-иов в ИФА и ДИА и маркерных антигенов в нммупоблоттниге позволяет определять специфические антитела в гипериммуииых туляремийных сыворотках и при изучении динамики образования антител у иммунизированных, вакцинированных и экспериментально зараженных лабораторных живот ных.

Список работ, опублшеопапиых но материалам диссертации

1. Волох O.A., Шепелев И.А., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Ерёмин С.А., Дятлов И.А. Разработка иммуноферментпого анализа на основе «Си-комплекса туляремийпого микроба //Сапит. охрана геррит. государств участников СИГ: пробл. биол. безоп. и противодействия биотерроризму в совр. условиях: Матер. VI Межгосуд. иауч.-практ. копф. - Волгоград, 2005.-С. 217-219.

2. Волох O.A., Ерёмин С.А., Шепелев И.А., Храмкова (Кузнецова) Е.М., Авдеева I I Г., Дятлов И.А. Разработка комплексного профилактического препарата против чумы и туляремии // Инф. болезни: пробл. здравоохр. и военной медицины: Матер. Рос. иауч.-практ. копф. - СПб, 2006. - С. 70.

3. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох O.A., Шепелев И.А., Ерёмин С.А. Использование препарата С-комплекса Francisella tularensis для определения иротивотуляремпйпых антител И Чрезвыч. ситуации междуиар. значения в общественном здравоохр. и сапит. охрана терриг. государств-участников СИГ: Матер. VII Межгосуд. иауч.-практ. копф. - п. Оболепск, 2006. - С. 254-255.

4. Храмкова (Кузнецова) Ё.М., Волох O.A., Шепелев H.A., Ерсмпп С.А., Днглов И.А. Использование С-комплекса туляремийпого микроба дли создания диагностических тест-систем // Биотехнологии. - 2007. - №2. - С. 72-77 (из перечня ВАК).

5. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Волох O.A., Шепелев И.А., Ерёмин С.А., Авдеева И.Г. Использование аитнтел к С-комплексу Francisella tularensis для выявления возбудителя туляремии // Матер. IX съезда Всерос. иауч.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. — С. 91.

6. Храмкова (Кузнецова) Е.М., Шепелев И.А., Волох O.A., Кузнецов О.С., Алёшина Ю.А., Ерсмпп С.А. Изучение ответных реакций макрооргаипзма па введение С-комплекса

туляремміііюго микроба // Coup, аспекты эпид. надзора за особо опасными ииф. заболеваниями па Юге России: Матер, науч.-нракт. конф. - Ставрополь, 20Ü7. - С. 152-154.

7. Волох O.A., Шепелев H.A., Фнрстова H.H., Храмкова (Кузнецова) Ü.M., Авдеева II.Г., Самохпялова Ю.И., Іьремші С.А., Дятлов ІІ.А. Оценка иммунобиологической активности препаратов С-комплскса возбудители туляремии как перспективного компонента химических пакцнн // Жури, мпкробнол., эппдемиол. н нммунобнол. -2007. - № 3. - С. 16-21 (из перечня ВАК).

8. Храмкоиа (Кузнецова) Е.М., Уткин Д.В., Шепелев И.А., Авдеева 1-І.Г., Волох O.A. Оценка чувствительности и специфичности аіггителмімх препаратов к «Си-комплексу гу-ляремийиого микроба // Coup, технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с ииф. бол. па террит. государств-участников СИГ: Матер. IX Межгосуд. иауч.-практ. конф. -Волгоград, 2008. - С. 143-144.

9. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Шепелев И.А., Авдеева II.Г. Разработка препарата для иммунодиагностики возбудителя туляремии // Бнол. безоп. в совр. мире: Матер, иауч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов пауч.-исслед. учрежд. Роспотребпадэора. - п. Оболспск, 2009. - С. 129-131.

10. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Шепелев И.А. Актуальные вопросы дифференциации подвидов Francisella liilarensis II Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Мат. юбнл. Всерос. науч.-нракт. конф., поев. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И. 1-І. Блохиной Роспотребпадэора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. - 1-І. Новгород, 2009. - С. 143-146.

11. Волох O.A., Кузнецова Е.М., Еремин С.А., Гусева 1-І.П., Шепелев И.А., Авдеева И.Г. Перспективы создания химической туляремийпой вакцины // Научное обеспечение противоэпид. защиты населения: Мат. юбнл. Всерос. иауч.-практ. конф., поев. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.I I. Блохиной Роспотребпадэора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилакт. и борьбе со СПИД. - I I. Новгород, 2009. - С. 329-331.

12. Кузнецова Е.М., ІІІенеліів H.A., Волох O.A. Струїстурно-фупкціїонлльнлл характеристика основных антигенов Francisella liilarensis II Проблемы особо опасных инфекций - 2009. - Вып. 2 (100). - С. 44-49 (нз перечня ВАК).

13. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Терехова И.В., Сырова H.A., Шепелев И.А. Получение и характеристика модифицированного С-комплекса туляремнйиого микроба // Актуальные проблемы предупреждения м ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области саиптарно-эпидемического благополучия населения государств-участпнкои СНГ: Мат. X Межгосуд. науч.-нракт. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 198-199.

М.Смолькова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., Волох O.A., Никифоров А.К. Аиоптоз и иролиферативпая активность иммунокомпетептпых клеток биомо-

делен при нммунизпцип С-комплсксом гуляремийного микроба различных подвидов // Актуальные проблемы предупреждения н ликвидации последствии чрезвычайных ситуаций н области сапитарпо-эпидемического благополучия населения государств-участников СНГ: Мат. X Межгосуд. иауч.-иракт. коиф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. — С. 269-270.

15. Смолькопа (i.A., ІЦукопскаи Т.Н., Кравцов АЛ., Кузнецова Е.М., Волох O.A., Никифоров А.К. ДПК-цнтометрнл нммупокомнетентных клеток бномодслеп D усли-внпх иммунизации препаратами С-комплсксп туляремнйпого мнкриба различных подпндов // Проблемы особо опасных инфекции - 2011. - Выи. 1 (107). - С. 74-76 (из перечни ВАІС).

16. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Шепелев И.А., Авдеева 1-І.Г. Гликозилировапный белковый комплекс Francisella lularensis // Инновационные технологии в противоэпид. защите населения: Мат. пауч.-практ. конф. молодых ученых Росгшгребпадэора. - 1-І. Новгород, 2011.-С. 93-95.

17. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Смолькопа Е.А., Щукооская Т.Н., Шенслёв H.A., Авдеева II.Г., Кравцов А.Л., Никифоров А.К. Иммунобиологические свойства антигенных комплексов тулиремннного микроба // Проблемы особо онасных инфекций - 2011. - Вып. 3 (109). - С. 46 - 49 (из перечни ВАК).

18. Шепелев H.A., Волох O.A., Самохвалова Ю.И., Кузнецова Е.М., Еремин С.А. Использование феномена QS в технологии культивирования штаммов-продуцентов протек-тивпых антигенов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Мат. III науч.-практ. школы-копф. молодых ученых и специалистов иауч.-исслед организаций Роспотребнадзора. - п. Оболенск, 2011. - С. 301-304.

- 39 3 0

20102827

Подписано к печати 19.12.2011 г. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура «Тайме». Усл.-печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано па полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

2010282784