Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя

Курчева, Светлана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя"

На правах рукописи

КУРЧЕВА 4855344

Светлана Александровна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУЛЯРЕМИИ И ИНДИКАЦИИ ЕЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

_ 6 0КТ 2011

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь-2011

4855344

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Тюменцева Ирина Степановна доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Будыка Дмитрий Александрович кандидат биологических наук Воробьева Оксана Владимировна

Ведущая организация: ФГУЗ «Волгоградский научно-

исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится 25 октября 2011 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.109.01 при Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского научно-исследовательского противочумного института

Автореферат разослан « 1 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Жарникова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туляремия - природно-очаговая инфекция, относящаяся к особо опасным инфекционным болезням, крупные вспышки и спорадические случаи которой периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе в России (Никифоров В.В., Кареткина Г.Н., 2007; Splettsfoesser W.D., Tomaso Н„ Al Dahouk S. et al., 2005).

Природные очаги туляремии отличаются длительностью существования, стойкостью и способностью проявлять активность через много лет эпизоотического и эпидемиологического спокойствия. Особенностью эпидемиологии туляремии является большое разнообразие источников, носителей, переносчиков, факторов передачи возбудителей, механизмов заражения, входных ворот инфекции (Олсуфьев Н.Г., 1975; Новиков Н.Л., Попов В.П., Жуков В.И. с соавт., 2003; Онищенко Г.Г., Дроздов И.Г., Федоров Ю.М. с соавт., 2003; Онищен-ко Г.Г., 2006; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009 и др.). Возбудитель туляремии обладает высокой экологической пластичностью и вследствие этого высокой устойчивостью в объектах окружающей среды, а по своим биологическим свойствам отнесен к высшей категории «А» среди наиболее опасных патогенных микроорганизмов - потенциальных агентов биологического оружия (Мещерякова И.С., Демидова Т.Н., Горшенко В.В., 2007; Романова Л.Н., 2008).

Диагностика туляремии складывается из индикации и идентификации возбудителя или его специфических антигенов и определения сывороточных антител у человека и восприимчивых животных, при этом, как правило, на практике предпочтение отдается иммунодиагностике, характеризующейся экс-прессностью, высокой специфичностью и чувствительностью. К настоящему времени для диагностики туляремии отечественными и зарубежными учеными предложено значительное количество эффективных иммунодиагностических тестов. Однако большая их часть - экспериментальные разработки (Сыро-ва H.A., Терешкина Н.Е., Девдариани З.Л., 2008).

В связи со сказанным, исследования, направленные на совершенствование и разработку туляремийных иммуподиагностикумов, налаживание производственного выпуска сертифицированных препаратов, не утрачивают своей актуальности.

Цель исследования - разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для идентификации Francisella (F.) tularensis и лабораторной диагностики туляремии.

Основные задачи исследования:

1. Осуществить подбор штаммов Р. ш1агеп515 для получения специфических антигенов (водорастворимый белковый комплекс и липополисахарид (ЛПС)).

2. Получить специфические, высокоактивные гипериммунные сыворотки при различных схемах иммунизации кроликов-продуцентов и выделить из них иммуноглобулины класса С (1§0).

3. Разработать производственную биотехнологию получения эритроцитар-ных туляремийных диагностикумов (иммуноглобулинового и антигенного) и разработать стандартный образец (СО) ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной.

4. Получить флуоресцирующие иммуноглобулины для идентификации возбудителя туляремии в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и иммуноперок-сидазные конъюгаты для выявления /'. ш1агепх1.ч и сывороточных антител против возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ИФА).

5. Разработать иммуномагнитные сорбенты (МИС) для мониторинга возбудителя туляремии в объектах окружающей среды.

6. Провести лабораторные и полевые испытания разработанных медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), определить их диагностическую ценность.

Научная новизна работы. Разработанные методические подходы и приемы по извлечению антигенного материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов, оптимизация параметров конъюгации ли-гандов и маркеров, лигандов и твердофазных носителей позволяют унифицировать биотехнологию производства МИБП для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя: диагностикумов эритроцитарных, тест-систем иммуно-ферментных, иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих, тест-системы диагностической магноиммуносорбентной. Для мониторинга открытых водоемов на наличие возбудителя туляремии с применением МИС сконструировано техническое устройство «Аквадиамаг», на которое получен патент РФ на полезную модель № 64784 от 10.07.2007 г. «Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды».

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования по конструированию иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и детекции ее возбудителя, базирующиеся на особенностях антигенной структуры туляремийного микроба и иммунного ответа животных

при инъецировании его антигенов, свойствах матриц биотической и абиотической природы, позволили составить алгоритм микробиологических и биотехнологических манипуляций процесса производства и контроля различных туля-ремийных диагностических препаратов.

Разработаны производственные биотехнологии ряда МИБП для идентификации /•'. шки&шх и диагностики туляремии, стабильно отвечающие требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам. На все разработанные МИБП составлена нормативная документация: промышленный регламент (ПР) № 1879-07 и фармакопейная статья предприятия (ФСП) №9168-08 на диагностикум эритроцитарный туляремийный антигенный жидкий; ПР № 1313-03 и ФСП № 9169-08 на диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуногло-булиновый жидкий; получены регистрационные удостоверения от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2011/10270 от 05.03.2011 г. и № ФСР 2011/10271 от 05.03.2011 г., соответственно; пусковой регламент (ПУР) № 01897080-07-09 и Технические условия (ТУ) 9388-010-018978-2009 на Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммупоферментном анализе (протокол № 7 от 09.06.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора), № ФСР 2010/06744 от 05.02.2010 г.; СО№ 001-9389-2008 ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной адсорбированной сухой (одобрен Ученым советом и утвержден директором института, протокол № 4 от 16.04.2009 г.); ПУР №01897080-10-10 и ТУ 9389-017-01897080-2010 на иммуноглобулины диагностические туляремийные флуоресцирующие (протокол № 6 от 28.05.2010 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора); ПУР №01897080-04-09 и ТУ 9388-006-17897080-2009 на тест-систему диагностическую магноиммуносорбентную для выявления возбудителя туляремии в иммупоферментном анализе (протокол № 4 от 16.04.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанные биотехнологии обеспечивают получение высококачественного биологического сырья, пригодного для производства туляремийных МИБП.

2. Сконструированные эритроцитарные, иммуноферментные, иммунофлуорес-центные, магноиммуносорбентные туляремийные диагностикумы отвечают требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам.

3. Лабораторные и полевые испытания разработанных туляремийных МИБП демонстрируют их высокую чувствительность, специфичность, соответствие нормативной документации, что позволяет наладить производство сертифицированных препаратов.

Апробация работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010); III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011).

Апробация диссертации состоялась 6 апреля 2011 г. на расширенном заседании научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с д.б.н. Жар-никовой И.В., к.б.н. Ждановой Е.В., д.м.н. Зайцевым A.A.

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР (№№ Госрегистрации 01.2008 02135; 01.2009 52158; 01.2009 52157) и федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)», контракт №117-Д от 11.08.2009 г., отражено в 11 научных работах, две из которых опубликованы в журналах, рекомендуемых «Перечнем ВАК».

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 187 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения; иллюстрирова-

на 28 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 288 источников, из них 181 - отечественных и 107 - зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. В работе использованы 33 штамма микроорганизмов II, III, IV групп патогенности: F. tularensis, Brucella (abortus, melitensis, suis), Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Salmonella typhimuriunt, Escherichia coli.

В работе находились 100 кроликов породы «Шиншилла», массой 3-3,5 кг.

При выполнении работы использован полевой материал, собранный в Ставропольском, Краснодарском краях, Карачаево-Черкесской республике: 327.1 экземпляр клещей, 40 грызунов, 12 проб воды открытых водоемов. Исследовано 140 сывороток крови здоровых людей из Тюменской области. Клещей систематизировали согласно определителям Б.И. Померанцева (1950), H.H. Плавилыцикова (1994).

Антигены (Аг) микроорганизмов изолировали водно-солевой экстракцией с последующей ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток. Дезинтегрирование осуществляли на аппарате УЗДН-2Т (Россия). Количественное определение белка проводили по методу О. Warburg и W. Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989). Диск-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) осуществляли по Н. Maurer (1971). Электрофоретическую подвижность (Rf) рассчитывали по формуле, предложенной К. Weber и M. Osborn (1969).

Иммунизацию животных проводили с применением иммунокорректоров феракрила, тималина, циклофосфана и тимогена. Контроль титра специфических антител (Ат) в сыворотках определяли в непрямой реакции иммунофлуо-ресценции (НРИФ) по Т.Н. Weller, А.Н. Coons (1954). Для осаждения белков использовали сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980); метод фракционирования белковых смесей с использованием высокомолекулярного, незаряженного, линейного полимера - полиэтиленгликоля - 6000 (ПЭГ) по A. Poison, G.M. Potgieter, J.E. Largier (1964). Иммуноглобулины также преципи-тировали октановой (каприловой) кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969). Специфическую активность Ar микроорганизмов и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии (РИД) в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по О. Ouchterlony (1949).

Конъюгацию At с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) (Sigma, USA) проводили по X. Шторц (Stortz Н„ 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по А.Н. Coons, М.Н. Kaplan (1950).

Иммунопероксидазные конъюгаты (КПХ) получали методом перйодатно-го окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi (1974) в модификации М.В. Wilson, P.K. Nakane (1978). Рабочий титр и специфическую активность КПХ определяли по методике М. Clark и A. Adams (1977) в «сэндвич»-варианте ИФА, их очистку от несвязавшихся Ат и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB (Швеция), используя сефадекс G-100 (Sigma, USA).

Для получения МИС в качестве основной матрицы использовали алюмосиликат (ТУ 6-09-01-356-76), модификаторами сорбента служили декстран (по-лиглюкин) и вторичный алкилсульфат натрия (ТУ 38-10719-77), в качестве магнитного материала использовали оксид железа (ГОСТ 4173-77).

Сублимацию биопрепаратов проводили в камере LZ-9.2 (Чехия).

Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на компьютере (программа EXCEL). Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Там-бовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скутч Д., Уэст Д., 1979).

Результаты собственных исследований и их обсуждение Получение специфических туляремийных антигенов, антисывороток и их характеристика

Из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФГУЗ Став-НИПЧИ Роспотребнадзора были получены следующие штаммы: F. tularensis 543/6 (mediaasiatica)-, F. tularensis Schu (nearctica); F. tularensis 83erys, F. tularensis 503/840; F. tularensis Miura, F. tularensis 325/1765 (holarctica) и вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ (ЖТВ) для их сравнительного изучеиия и выбора для производственных целей.

Для извлечения нативных водорастворимых Ar F. tularensis мы использовали щадящий режим дезинтеграции микробных клеток с помощью ультразвуковой установки в сочетании с водно-солевой экстракцией и последующим осаждением белков (рисунок 1). Экстракция осадка 2,5 % раствором NaCl и выделение второго супернатанта позволяют в максимальной степени извлечь Аг из бактериальной массы, а фракционирование Аг из супернатантов сульфатом аммония, помимо концентрирования и очистки, приводит к стабилизации белков. Такая схема позволяет получать наиболее полный антигенный комплекс из микробов с сохранением на-

тивности биополимеров, снизить потери на стадиях выделения. Выход отдельных Лг из биомассы объемом 310 мл и их специфическая активность представлены в таблице I. РИД ставили с сывороткой диагностической туляремийной сухой, выпускаемой ФГУЗ НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора.

Изучение методом диск-электрофореза в ПААГ белкового спектра Аг F. tularensis показало, что при разделении образуется от шести до 10 белковых зон. На основании проведенных исследований, для дальнейшей работы нами выбраны три штамма F. tularensis разных подвидов: F. tularensis 543/6, F. tularensis Schu и F. tularensis 503/840. Объединив стерильные бактериальные массы (этих штаммов) ana, получили полигрупповой водорастворимый Аг по схеме, описанной ранее. Количество белка в изолированном Аг, измеренное спектрофотометрически, составило 17,45 мг/мл, а суммарное содержание нуклеиновых кислот - 264,5 мкг/мл.

Термостабильность полигруппового водорастворимого Аг определяли в РИД после его прогревания при 100 °С в течение 15, 30, 45 и 60 мин. Нативный Аг и антисыворотка формировали шесть преципитационных линий, три из них были термостабильными при всех режимах термообработки.

Обеззараженная хлороформом бакмасса F. tularensis

Экстракция раствором NaCI (2.5%), 48 ч

Супернатант * Центрифугирование при 20000 об/мин, 30 мин

Осадок микробных клеток

Фракционирование сульфатом аммония до 80 % насыщения при инкубации 16-18 ч при 4 "С

Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCI и замораживание при минус 40 °С

Центрифугирование при 20000 об/мин, 30 мин

'Супернатант\ \ удалить '

Разрушение в экструдере (4-х кратно)

Осадок

Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCI. Поверхностные белки микробной клетки. Фракция I

Центрифугирование при 20000 об/мин, 30 мин

Супернатант. Белково-

полисахаридно-липидный комплекс. Фракция II

Детрит

Количественное Объединение

определение белка. фракций

Розлив в ампулы. I+II+III.

Лиофилизация. Диализ

против ДН1О

Ресуспендирование в 0,9 % растворе NaCI с твин 80

Супернатант. Мембранные, рибосомальные, оболочечные белки. Фракция III

УЗ-дезинтеграция

Центрифугирование при 20000 об/мин 20 мин

Детрит n

v ;

Рисунок 1 - Биотехнологическая схема получения Ч';™1"; водорастворимых антигенных комплексов F. tularensis

Таблица 1 - Характеристика антигенов туляремийного микроба

Антиген Объём Аг. мл Концентрация белка, мг/мл Титр в РИД

Поверхностные белки 105 30 1:32

Белково-полисахаридный комплекс и липиды 95 20-25 1:32

Мембранные, рибосомальные и оболочечные белки 130 10-15 1:128

Кроме туляремийного водорастворимого полигруппового белкового антигенного комплекса, мы изолировали ЛПС водно-фенольной экстракцией по модифицированному методу Е. Moreno, S. Speth, L.M. Jonesetal. (1981), используя смесь, состоящую из равных пропорций биомасс F. tularensis 543/6, F. tula-rensis Schu, F. tularensis 503/840.

Иммунные туляремийные сыворотки получали по разработанным нами схемам иммунизации кроликов-продуцентов, используя иммунокорректоры: феракрил, тималин, циклофосфан, тимоген, обладающие различным механизмом действия, иммуногеном при этом служил полигрупповой туляремийный водорастворимый Аг. При сравнении эффективности различных схем иммунизации изучали специфическую активность гипериммунных сывороток, вычисляя средние титры НРИФ и РИД, которые были равны 1:512 (+18,1 % - 15,3 %) и 1:32 (+13,3 % - 11,7 %), соответственно.

Для повышения специфичности полученных гипериммунных сывороток мы проводили сорбцию перекрестнореагирующих антител с помощью твердофазного аффинного сорбента на основе алюмосиликата, так как применение в качестве адсорбентов микробных клеток, широко распространенное в сывороточном производстве, приводило к существенному снижению титров специфических Ат.

Разработка препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя До сих пор остаются актуальными и широко используются в диагностике туляремии простые, достаточно чувствительные, не требующие применения специальной аппаратуры и поэтому общедоступные серологические тесты, в частности, РИГА, РТПГА, РНАт. Нами налажен производственный выпуск ди-агностикумов эритроцитарных туляремийных - антигенного и иммуноглобули-нового (№ ФСР 2011/10270 и № ФСР 2011/10271, соответственно), при этом оптимальная биотехнология их изготовления заключается в следующем: концентрация формалинизированных эритроцитов - 20 %, температура связывания эритроцитов с сенситином (при его нагрузке в 200 мкг/мл) - полигрупповым водорастворимым белковым туляремийным Аг либо IgG, фракционированными октановой кислотой - 45 °С, рН раствора - 6,0 в течение 18 ч. Для использова-

ния в качестве положительной контрольной сыворотки при постановке сероре-акций с этими диагностикумами нами разработан СО сыворотки диагностической туляремийной адсорбированной сухой. Эта сыворотка входит в комплекты наборов диагностикумов эритроцитарных туляремийных.

Исследования по конструированию диагностикума эритроцитарного ту-ляремийного антигенного при использовании ЛПС в качестве сенситина показали, что при его нагрузке в 100 мкг/мл титры РНГА достигали не менее 1:20480. Это свидетельствовало о достаточно высокой чувствительности препарата и возможности использования ЛПС при изготовлении антигенного эритроцитарного диагностикума.

При разработке иммуноглобулинов диагностических туляремийных флуоресцирующих нами изучены различные условия конъюгации 1«0, выделенных различными способами, с ФИТЦ: значение рН реакционной смеси (8,5; 9,0; 9,5), нагрузка красителя (20 мг и 25 мг на 1 г белка), время его контакта с белком (1 ч; 2 ч; 4 ч; 12 ч), температурный режим конъюгации (4±1 °С; 20±1 °С; 37±1 °С). Отмечено, что после добавления красителя в первые минуты происходит снижение рН на 0,3-0,5, при этом значительная часть ФИТЦ не вступает в реакцию с белком. В связи с этим необходимо проводить контроль показателей рН и их корректировку после добавления красителя и через 30 мин после начала метки. Наилучшие серии конъюгатов получены при значении рН реакционной смеси - 9,5, нагрузке ФИТЦ - 20 мг на 1 г белка, температуре 20 °С и четырехчасовом контакте белка с красителем (рисунок 2). Специфическая активность препаратов всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром 1:32-1:64 при исследовании мазков гомологичных штаммов. Специфическое окрашивание микробных клеток ^ Ги/вгеи.ш флуоресцирующими иммуноглобулинами иллюстрирует рисунок 3.

Рисунок 2 - Получение иммуноглобулинов диагностических туляремийных флуоресцирующих сухих

Рисунок 3 Ги/агепадокрашенные флуоресцирующими иммуноглобулинами. Увеличение в 450 раз

При разработке производственной технологии изготовления иммуногло-булинового КПХ лучшие результаты отмечены при использовании высокоактивных выделенных из туляремийных гипериммунных сывороток при помощи ПЭГ-6000 (в отличие от конъюгата с ФИТЦ и эритроцитарного иммуног-лобулинового диагностикума, которые были получены на основе изолированных октановой кислотой). Рабочий титр КПХ составил 1:200-1:400. Чувствительность конъюгатов по водорастворимому Аг - 50-100 нг/мл, по корпускулярному Аг - 5x104- 1х105 м.к./мл. Все серии полученных КПХ для ИФА дали отрицательные результаты с гетерологичными штаммами, что свидетельствовало об их специфичности. Названные конъюгаты входят в «Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в имму-ноферментном анализе (ИФА)» (№ ФСР 2010/06744).

Для определения туляремийных сывороточных Ат нами получен антигенный КПХ, при конструировании которого использовали полигрупповой туляре-мийный водорастворимый белковый комплекс. Установлено, что наиболее чувствительный и специфичный антигенный КПХ получен при концетрации белка Аг 8 мг/мл и времени его инкубации с ферментом 2 ч. Рабочий титр разработанных антигенных КПХ всех изготовленных серий составил 1:400-1:800 с туляре-мийной сывороткой. Чувствительность конъюгатов при титровании гомологичных сыворогок - 1:25600-1:51200. Все серии полученных КПХ для ИФА дали отрицательные результаты с гетерологичными сыворотками, что свидетельствовало об их высокой специфичности. Биотехнология изготовления разработанных туляремийных КПХ включает три этапа и представлена на рисунке 4.

Рисунок 4 - Получение конъюгата туляремийного иммунопсроксидазного (иммуноглобулинового / антигенного)

Важным условием повышения чувствительности и специфичности методов диагностики является селективное концентрирование возбудителя инфекции с последующей постановкой экспресс-анализов, так как чаще всего в исследуемом материале концентрация возбудителя ниже порога чувствительности метода диагностики. С этой целью нами разработаны композиционные магнитные иммуносорбенты на основе поликлональных туляремийных ¡¿С. В качестве структурных единиц, формирующих остов кремнезема, использовали алюмосиликат, модифицирование поверхности которого осуществляли в при-

Рисунок 5 - Принципиальная технологическая схема получения МИС

Полученный МИС использован для проведения иммуномагнитной сепарации возбудителя туляремии и детекции его в иммуноферментном анализе, при этом в качестве твердой фазы вместо полистироловых микропланшет, традиционно используемых при постановке ИФА, применяли разработанный нами МИС в «сэндвич»-варианте этого метода.

При постановке сочетанного метода МИС+ИФА искомый инфект, содержащийся в исследуемом материале, специфически взаимодействовал с 1«С против Аг Р. ш1агеп.иь, иммобилизованными на МИС. Образовавшийся комплекс Аг-Ат выявляли с помощью «Набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в ИФА». При проведении ИФА с помо-

щыо МИС туляремийные микробы обнаруживались в концентрации 1,0x102- 1,0x101 м.к./мл. Все изготовленные серии МИС не выявляли в ИФА ге-терологичные штаммы микроорганизмов в концентрации 1,0x105 м.к./мл и выше. Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшет - 20-21 ч. При этом значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы (с 10 дней до двух лет и более), чувствительность модифицированного метода повышалась на два-три порядка по сравнению с общепринятым ИФА.

Разработанный нами аффинный кремнеземный микрогранулированный сорбент с магнитными свойствами имеет большую величину сорбционной емкости за счет развитой поверхности и специфического лиганда, обладает стандартностью структурных характеристик, механической прочностью, химической и микробиологической устойчивостью. Применение МИС позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных промываний сорбента с фиксированным на нем инфекционным агентом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное воздействие на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повышает специфичность и чувствительность методов экспресс-анализа, а также достоверность как положительных, так и отрицательных результатов. Разработанный нами туляремийный МИС входит в набор тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии в ИФА. Названная тест-система включена в сетевой график разработки и внедрения препаратов для диагностики особо опасных инфекционных болезней на 2012 г.

В итоге проведенных исследований составлена принципиальная схема производства туляремийных МИБП, которая складывается из последовательных стадий и операций, характерных для каждого конкретного препарата, и определены критические контрольные точки на этапах производства (рисунок 7).

Диагностическую ценность разработанных нами МИБП подтвердили многочисленные лабораторные испытания и исследования полевого материала (таблица 2).

При исследовании внутренних органов грызунов, добытых в туляремий-ном очаге Ставропольского края (40 грызунов, объединенных в 14 проб по виду животного и их местонахождению), в ИФА с разработанным КПХ антигенным и в РИГА с диагностикумом эритроцитарным туляремийным антигенным спе-

цифические Ат не были обнаружены. В то же время в РНГА с диагностикумом туляремийным иммуноглобулиновым, а также в традиционном ИФА «сэн-двич»-варианте с КПХ иммуноглобулиновым выявлен туляремийный Аг в двух пробах в РНГА и трех пробах в ИФА. Это может свидетельствовать о заражении туляремией грызунов и возможном начале эпизоотии в данном очаге.

В сентябре 2010 г. в 12 точках различных районов Краснодарского края была исследована вода открытых водоемов с применением специальных магнитных ловушек, «заряженных» туляремийным МИС. В двух разных точках забора воды Славинского района определен Аг возбудителя туляремии в модифицированном методе ИФА. При постановке ПЦР результаты подтвердились.

Характеристика сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов

Выращивание биомассы бактерий К„В

КЛБТК

Стерилизация К,;К„В

Микробная биомасса - Дезинтеграция м.к., экстракция; очистка — К,, В

К,;К4, В

Ь АНТИГЕНЫ

Водорастворимые белковые, ЛПС (и др.)

К,. В

Для иммунизации

Иммунная сыворотка

К4;К5, В

Для конъюгации

С ферментом

к,еде,, в -

Конъюгирование

Сорбция сыворотки • Аффинный сорбент

Иммуноглобулины (IgG) Выделение иммуноглобулинов

С флуоресцирующим красителем ..........—У

С эритроцитами -;-

Полиакриламидный гель или органокремнеземная основа с магнитным материалом (матрица)

| Иммуноферментные ; (для ИФА)

Иммунофлуорес-; центные (для РИФ)

Эритроцитарные (для РНГА. РНАт)

К»;К5, В

Розлив в ампулы, флаконы

Сорбенты, магно-иммуносорбенты j-1

К4;К5, В

Лиофилизация

К4;К„ В, ЛБТК

К3;К4;К5, ЛБТК

Хранение готовой продукции

Этикетировка, упаковка

Рисунок 7 - Схема процесса производства и контроля туляремийных иммунобиологических диагностических препаратов Обозначения: К-К5 - критические контрольные точки; К- входной контроль; JCi - контроль чистоты культуры; К2 -контроль специфичной стерильности; К? - количественный контроль; К4 - контроль специфичности; К5 - контроль специфической активности и чувствительности ; В - внутренний контроль; ЛБТК - контроль, производимый лабораторией биологического и технологического контроля предприятия

Таблица 2 - Результаты исследования объектов окружающей среды

Количество Количе- Количество положительных

Вид исследуемого материала экземпля- ство пу- пулов

ров, особей лов, проб РИГА ИФА МИС+ИФА

КЛЕЩИ

Demacentor marginatus 1452 204 3 5 13

Haemaphysalis punctata 32 11 0 0 1

Ixodes ricinus 399 51 0 0 3

Dermacentor reticulatus 645 53 0 7 7

Hyalomma marginatum 227 65 0 0 8

Hyalomma scupense 358 71 0 0 1

Rhipicephatus rossicus 33 7 0 0 1

Bnophilus annulatus 125 2 0 0 0

ГРЫЗУНЫ

Степная мышь 32 10 1 2 2

Полевая мышь 4 2 1 1 1

Домовая мышь 3 1 0 0 0

Обыкновенная полевка 1 ' 1 0 0 0

ВОДА ОТКРЫТЫХ ВОДОЕМОВ 12 12 0 0 2

Обозначения: 0 - отрицательный результат

Проведенные исследования большого количества полевого материала показали достаточно высокую эффективность разработанных МИБП, при этом следует отметить, что использование магнитной сепарации значительно повышает чувствительность ИФА, увеличивая вероятность положительных находок и достоверность отрицательного результата.

Таким образом, проведенные исследования позволили унифицировать биотехнологию производства иммунобиологических препаратов для идентификации Р. ш1аге>ш.ч и диагностики туляремии. Полученные нами туляремийные МИБП пользуются постоянным спросом и применяются в лабораторной практике Федеральными государственными учреждениями «Центры гигиены и эпидемиологии», противочумными учреждениями Роспотребнадзора (научно-исследовательскими институтами, станциями и отделениями), й они входят в перечень укомплектования диагностическими препаратами и расходными материалами специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) согласно Приказу № 330 от 22.11.2007 г. МЗ и соцразвития РФ «О регламенте функционирования СПЭБ».

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения белковых спектров водорастворимых антигенов и их свойств определены три производственных штамма возбудителя туляремии разных подвидов: Г. /м/ягаш'.? 543/6 (тесНааз^аИса), /•'. ш 1агепзк ЯсЬи (пеагсйса), /\ /н/«/с7ш'.у 503/840 (Ьо1агсйса), из которых получен по разработанной нами схеме полигрупповой белковый антиген.

2. Предложены производственные схемы иммунизации, позволяющие получать высокий иммунный ответ практически у 100 % кроликов-продуцентов. Определены наиболее эффективные методы выделения ^С из гипериммунных сывороток и их очистки для различных групп диагностических препаратов.

3. Разработана биотехнология производства эритроцитарных туляремий-ных антигенного и иммуноглобулинового диагностикумов (№ ФСР 2011/10270 и № ФСР 2011/10271), а также стандартного образца ФГУЗ СтавНИПЧИ Рос-потребнадзора сыворотки диагностической туляремийной, используемой в качестве контрольной при постановке серологических реакций и входящей в комплекты наборов диагностикумов.

4. Унифицирована биотехнология изготовления туляремийных иммунопе-роксидазных конъюгатов для выявления антигенов и сывороточных антител. Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в ИФА зарегистрирован в Росздравнадзоре (№ ФСР 2010/06744).

5. Определены биотехнологические параметры изготовления туляремийных флуоресцирующих иммуноглобулинов, обеспечивающие рабочее разведение препарата 1:16 - 1:32: рН реакционной смеси - 9,5, нагрузка ФИТЦ - 20 мг на 1 г белка, температура 20 °С при четырехчасовом контакте белка с красителем.

6. Многочисленные лабораторные испытания изготовленных серий эритроцитарных, иммунофлуоресцентных, иммуноферментных препаратов показали их соответствие разработанным параметрам качества и требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам. Диагностическая ценность названных МИБП подтверждена исследованиями различного полевого материала (клещи, грызуны, вода открытых водоемов), собранного в Ставропольском и Краснодарском краях, Карачаево-Черкесской республике.

вания проб с высокой степенью загрязнений биотической и абиотической природы, низкой концентрацией патогена, при этом чувствительность модифицированного ИФА повысилась на два-три порядка по сравнению с традиционным анализом, и это позволило увеличить число положительных находок более, чем в шесть раз.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1.Жарникова Т.В., Жарникова И.В., Курчева С.А., Тюменцева И.С., Кочерян A.C., Грядских Д.А., Ефременко Д.В., Самарина И.В., Кузнецова И.В., Брыкалов A.B., Велик A.B. Конструирование тест-систем диагностических бивалентных магноиммуносорбентных для одновременного выявления возбудителей туляремии и лептоспироза в иммуноферментном анализе (ИФА) // Труды Кубанского государственного университета. - 2008. - № 5 (14). - С. 88-90 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

2. Курчева С.А. Разработка биотехнологии производства иммунодиагно-стических препаратов для выявления возбудителя туляремии // Вестник Московского государственного областного университета. Серия «Естественные науки». - 2011. - № 3. - С. 52-55 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

3. Алиева Е.В., Таран A.B., Афанасьева Е.Е., Жарникова Т.В., Курчева С.А., Тюменцева И.С., Жарникова И.В., Самарина И.В. Унификация и разработка диагностических тест-систем для мониторинга возбудителей бактериальной и вирусной природы // Вестник Ставропольского государственного университета. - 2006. - Вып. 47, ч. 2. - С. 236-242.

4. Ефременко В.И., Столяров А.Л., Игуменов Э.М., Игуменов A.M., Афанасьев E.H., Таран A.B., Жарникова И.В., Левченко Н.В., Курчева С.А.. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды Патент РФ RU 64784 U1 - № 2006144331/22; заявлено 12.12.2006; опубл. 10.07.2007, Бюл. № 19.-2 с.

5. Ефременко В.И., Зуенко A.A., Коготкова О.И., Чурикова Н.В., Тюменцева И.С., Шиянова Е.С., Майская В.Д., Афанасьева Е.Е., Жарникова Т.В., Курчева С.А. Применение тест-систем магноиммуносорбентных для выявления возбудителей инфекционных заболеваний (обзор литературы) // Деп. В ВИНИТИ 18.07.2007, №741.-28 с.

6. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Ефременко В.И., Жданова Е.В., Жарникова Т.В., Афанасьева Е.Е., Орлова Т.Н., Ефременко Д.В., Афанасьев Н.Е., Лаврешин М.П., Левченко Н.В., Семирчева A.A.,

Курчева С.А., Бабий A.M. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний II Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008.-№ 2 (22), приложение, ч. 1. - С. 180-181.

7. Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Жданова Е.В., Жарникова И.В., Афанасьев Н.Е., Лаврешин М.П., Горобец Е.А., Курчева С.А., Семирчева A.A. Разработка рациональной биотехнологии получения диагностических иммунных сывороток // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. -№ 2 (22), приложение, ч. 1. - С. 210-211.

8. Чурикова Н.В., Коготкова О.И., Омельянчук П.А., Шиянова Е.С., Зуенко A.A., Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Курчева С.А. Критерии контроля качества экспериментальных серий тест-системы диагностической маг-ноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии методом иммуно-ферментного анализа // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: матер. Всерос. науч,-практич. конф., посвящен. 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров, 2008. - С. 382-385.

9. Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Курчева С.А., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Юркина И.В., Коготкова О.И. Конструирование и характеристика туляремийных полигрупповых иммуноглобулиновых конъюгатов // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. X Межгос. науч.-практич. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 235-236.

10. Курчева С.А., Тюменцева И.С., Афанасьев E.H., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Юркина И.В., Коготкова О.И. Разработка биотехнологии получения гипериммунной туляремийной сыворотки для ее использования в качестве стандартного образца предприятия // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. X Межгос. науч.-практич. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 202.

11. Курчева С.А. Конструирование иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер. III науч.-практич. шко-лы-конф. молодых ученых и специалистов науч.-исследовательских организаций Роспотребнадзора, 31 мая-2 июня 2011 г. - Оболенск, 2011. - С. 200-202.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ И ЕДИНИЦ

Аг - антиген

ИФА -иммуноферментный анализ

КПХ - конъюгат пероксидазы хрена

ЛПС - липополисахарид

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

МИС - магноиммуносорбент

м.к. - микробная клетка

мкг - микрограмм

МС - магносорбент

Мф/Мб - молярное соотношение флуорохром/белок

нг - нанограмм

нд - нормативная документация

НРИФ - непрямая реакция иммунофлуоресценции

об/мин - оборотов в минуту

ОП - оптическая плотность

ОСО - отраслевой стандартный образец мутности (ОСО мутности)

ПААГ - полиакриламидный гель

ПР - промышленный регламент

ПУР - пусковой регламент

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РА - реакция агглютинации

РИД - реакция иммунодиффузии

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

РНАт - реакция нейтрализации антител

РПГА (РИГА) - реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации

СО - стандартный образец

ТУ - технические условия

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФСБ-'Г - фосфатно-солевой буфер с твином 20 (или 80)

ФС - фармакопейная статья

°с - градус Цельсия

ДО - иммуноглобулины класса в

дН20 - дистиллированная вода

рН - отрицательный логарифм концентрации водородных ионов

ФГУЗ - Федеральное государственное учреждение здравоохранения

СтавНИПЧИ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный

институт»

Подписано в печать 12.09.2011. Печать на ризографе. Бумага офсетная. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. - 1,0 Заказ-445 Тираж 100 экз. Отпечатано в оперативной полиграфии отдела сводной информации и региональной статистики Ставропольстата г. Ставрополь, ул. Пушкина,4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курчева, Светлана Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Природные очаги и заболеваемость туляремией.

1.2. Микробиология возбудителя туляремии.

1.2.1. Основные биологические свойства туляремийного микроба

1.2.2. Антигены возбудителя туляремии и их применение в иммунодиагностике этой инфекции.

1.3. Иммунодиагностика туляремии.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в опытах.

2.2. Лабораторные животные, использованные в экспериментах

2.3. Полевой и клинический материал.'

2.4. Аппаратное оснащение исследований.

2.5. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле.

2.5.1. Определение электрофоретической подвижности белковых фракций.

2.6. Методы контроля антигенов и сывороток.

2.7. Выделение иммуноглобулинов.

2.8. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюга-тов.

2.9. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов

2.10. Количественное определение белка.

2.11. Лиофилизация биологического материала.

2.12. Характеристика реагентов, используемых для получения магноиммуносорбентов.

2.13. Методы математической иVстатистической обработки материалов

3 Стр.

Глава 3. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ ПЫЖ^ЕНА ТиЬАЯЕтК И ТУЛЯРЕМИЙНЫХ АНТИСЫВОРОТОК

3.1. Получение специфических туляремийных антигенов и их характеристика

3.2. Разработка схем иммунизации для получения туляремийных гипериммунных сывороток

Глава 4. РАЗРАБОТКА ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ

ДИАГИОСТИКУМОВ. .;.

4.1. Диагностикум эритроцитарный туляремийный антигенный

4.2. Диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуногло-булиновый

4.3. Разработка стандартного образца ФГУЗ СтавНИПЧИ Роснотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной адсорбированной сухой.;.

Глава 5. ПОЛУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ИММУНО-ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА . ^. ■.

5.1. Получение флуоресцирующих иммуноглобулинов для индикации возбудителя туляремии .-------------------.

5.2. Получение иммунопероксидазных конъюгатов для выявления РгапсшеИа ийагеюш и сывороточных антител против и возбудителя туляремии в иммуноферментном методе анализа

Глава 6. РАЗРАБОТКА ИММУНОМАГНИТНЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ МОНИТОРИНГА ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ В

ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЬГ.

6.1. Конструирование тест-системы магноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии в ИФА.

4 Стр.

6.2. Разработка критериев контроля качества экспериментальных серий тест-системы диагностической магноиммуносор-бентной для выявления возбудителя туляремии методом ИФА.

6.3. Мониторинг объектов окружающей среды на наличие возбудителя туляремии с применением МИС и технических средств для работы с ними.

Глава 7. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ ТУЛЯРЕМИЙНЫХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя"

Актуальность проблемы.

Туляремия - природно-очаговая инфекция, относящаяся к особо опасным инфекционным болезням, крупные вспышки и спорадические случаи которой периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе в России (Никифоров В:В., Кареткина Г.Н., 2007; Splettstoesser W.D., Tomaso Н:, A1 Da-houk S. et al., 2005). I

Природные очаги туляремии, отличаются длительностью существования, I стойкостью и способностью проявлять активность через много лет эпизоотического и эпидемиологического спокойствия. Особенностью эпидемиологии туляремии является большое разнообразие источников, носителей, переносчиков, факторов передачи возбудителей, механизмов заражения, входных ворот инфекции (Олсуфьев Н.Г., 1975; Новиков H.JL, Попов В.П., Жуков В.И. с соавт., 2003; Онищенко Г.Г., Дроздов И:Г., Федоров Ю.М. с соавт., 2005; Онищен-ко Г.Г., 2006; Онищенко Г.Г., Смоленский В.Ю., 2009 и др.).

Возбудитель туляремии обладает высокой экологической пластичностью ,и вследствие этого высокой устойчивостью- в объектах окружающей среды, способностью переживать, неблагоприятные условия. Туляремийному микробу свойственна высокая степень вирулентности: инокуляция или ингаляция 10-15 бактерий приводит к развитию инфекционного процесса у практически 100 % инфцированных людей. Поэтому по своим биологическим свойствам отнесен к высшей категории «А» среди наиболее опасных патогенных микроорганизмов — потенциальных агентов биологического оружия (Мещерякова И.С., Демидова Т.Н., Горшенко В.В., 2007; Куница Т.Н., Мека-Меченко Т.В., Некрасова JI.E. с соавт., 2011; Dennis D.T., Inglesby T.V., Henderson D.A. et al., 2001).

Важной задачей в борьбе с бактериальными инфекциями, в том числе и туляремией, является обнаружение и идентификация возбудителя, решение которой обеспечивается широким арсеналом методических приемов: от классических методик микробиологического тестирования до современных иммуноди-агностических, характеризующихся экспрессностью, высокой специфичностью и чувствительностью, возможностью их использования при исследовании материала, непригодного для бактериологического анализа (МУ 3.1.2007-05; Никифоров В.В., Кареткина Г.Н., 2007; Девдариани З.Л., Терешкина Н!Е., 2010).

Диагностика туляремии складывается из индикации и идентификации возбудителя или его специфических антигенов и определения' сывороточных антител у человека и* восприимчивых животных, при» этом, как правило; на1 практике предпочтение отдается иммунодиагностике; характеризующейся экс-прессностью, высокой> специфичностью, и чувствительностью. К настоящему времени для> диагностики туляремии отечественными: и зарубежными учеными предложено значительное количество^ эффективных иммунодиагностических тестов. Однако большая их часть - экспериментальные разработки' (Сыро-ва H.A., Терешкина HiE., Девдариани З.Л., 2008).

В! связи со сказанным; исследования, направленные на совершенствование и разработку туляремийных иммунодиагностикумов, налаживание производственного выпуска сертифицированных препаратов, не утрачивают своей актуальности.

Цель исследования,— разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для; идентификации Francisella (F.) tularensis и лабораторной диагностики туляремии.

Основные задачи исследования:

1. Осуществить подбор штаммов F. tularensis для получения специфических антигенов (водорастворимый' белковый' комплекс и липополисахарид (ЛПС)).

2. Получить специфические, высокоактивные гипериммунные сыворотки при различных схемах иммунизации, кроликов-продуцентов* и выделить из них иммуноглобулины,класса G (IgG).

3. Разработать производственную биотехнологию получения эритроци-тарных туляремийных диагностикумов (иммуноглобулинового и антигенного) и разработать стандартный образец (СО) ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной.

4. Получить флуоресцирующие иммуноглобулины для идентификации возбудителя туляремии в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) и иммунопе-роксидазные конъюгаты для выявления Р. Шагетгв и сывороточных антител против возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ИФА).

5. Разработать иммуномагнитные сорбенты (МИС) для мониторинга возбудителя туляремии в объектах окружающей среды. 6. Провести лабораторные и полевые испытания разработанных медицинских иммунобиологических препаратов; (МИБП), определить их диагностическую ценность.

Научная новизна; работы;. Разработанные методические подходы и приемы по извлечению антигенного' материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов; оптимизация параметров конъюгации ли-гандов и маркеров, лигандов и твердофазных носителей позволяют, унифицировать биотехнологию производства МИБП для; диагностики туляремии и индикации ее возбудителя: диагностикумов эритроцитарных, тест-систем иммуно-ферментных, иммуноглобулинов- диагностических флуоресцирующих, тест-системы диагностической магноиммуносорбентной. Для мониторинга открытых водоемов на наличие возбудителя туляремии с применением МИС сконструировано техническое устройство «Аквадиамаг», на которое получен патент РФ на полезную модель № 64784 от 10.07.2007 г. «Установка для микробиологического мониторинга объектов.водной среды».

Теоретическая и; практическая значимость работы. Проведенные исследования по конструированию иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и детекции ее возбудителя, базирующиеся на особенностях антигенной структуры туляремийного микроба и иммунного ответа животных при инъецировании его антигенов, свойствах матриц биотической и абиотической природы, позволили составить алгоритм микробиологических и биотехнологических манипуляций процесса производства и контроля различных туля-ремийных диагностических препаратов.

Разработаны производственные биотехнологии изготовленижряда МИБП для идентификации Р. Ш1агет1я и диагностики туляремии, стабильно отвечающие требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам. На все разработанные МИБП составлена нормативная? документация: промышленный регламент (ПР) № 1879-07 и фармакопейная статья предприятия (ФСП) № 9168-08 на диагностикум эритроцитарный тулярёмийный антигенный жидкий; ПР'№ 1313-03 и ФСП № 9169-08 на диагностикум эритроцитарный тулярёмийный иммуноглобулиновый жидкий; получены, регистрационные удостоверения от Федеральной службьь по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2011/10270 от 05.03.2011 г. и № ФСР 2011/10271 от 05.03:2011 г., соответственно; пусковой регламент (ПУР) № 01897080-07-09 и Технические условия<ТУ) 9388-010-018978-2009 на Набор реагентов тест-системы диагностической; для выявления? возбудителя- туляремии в иммуноферментном анализе (протокол № 7 от 09.06.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора), № ФСР12010/06744 от 05.02.2010 г.; СО № 001-9389-2008 ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической I гуляремийной адсорбированной сухой (одобрен Ученым советом и утвержден директором института, протокол № 4 от 16.04.2009 г.); ПУР № 01897080-10-10 и ТУ 9389-017-01897080-2010 на иммуноглобулины диагностические туляремийные флуоресцирующие (протокол № 6 от 28.05.2010 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора); ПУР № 01897080-04-09 и ТУ 9388-006-17897080-2009 на тест-систему диагностическую магноиммуносорбентную для выявления* возбудителя туляремии в иммуноферментном: анализе (протокол № 4 от 16:04.2009 г. заседания Ученого совета ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора).

Основные положения^выносимые на защиту:

2. Сконструированные эритроцитарные, иммуноферментные, иммуноф-луоресцентные, магноиммуносорбентные туляремийные диагностикумы отвечают требованиям, предъявляемым к диагностическим и индикационным препаратам.

3. Лабораторные и полевые испытания разработанных туляремийных МИБП демонстрируют их высокую чувствительность, специфичность,.соответствие нормативной документации, что позволяет наладить производство сертифицированных препаратов.

Апробация* работы. Результаты диссертации доложены, обсуждены, опубликованы в материалах Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения- и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010); III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения'биологической безопасности» (Оболенск, 2011).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной- в рамках

НИР (№№ Госрегистрации 01.2008 02135; 01.2009 52158; 01.2009 52157) и федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)», контракт № 117-Д от 11.08.2009 г., отражено в 11 научных работах, две из которых опубликованы в журналах, рекомендуемых «Перечнем ВАК».

Структура и* объем работы. Диссертация изложена на 187 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, шести глав

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Курчева, Светлана Александровна

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения белковых спектров водорастворимых антигенов и их свойств определены три производственных штамма возбудителя туляремии разных подвидов: Р. ы1агеж\5 543/6 (тесНаазгШма), Р. tularensis БсЬи (пеагсНса), Р. ш1агет1Б 503/840 (Ио1агсНса), из которых получен по разработанной нами схеме полигрупповой белковый антиген.

2. Предложены производственные схемы иммунизации, позволяющие получать высокий иммунный ответ практически у 100 % кроликов-продуцентов. Определены наиболее эффективные методы выделения иммуноглобулинов класса в из гипериммунных сывороток и их очистки для различных групп диагностических препаратов.

3. Разработана биотехнология производства эритроцитарных туляре-мийных антигенного и иммуноглобулинового диагностикумов (№ ФСР 2011/10270 и № ФСР 2011/10271), а также стандартного образца ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора сыворотки диагностической туляремийной, используемой в качестве контрольной при постановке серологических реакций и входящей в комплекты наборов диагностикумов.

4. Унифицирована биотехнология изготовления туляремийных имму-нопероксидазных конъюгатов для выявления антигенов и сывороточных антител. Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в ИФА зарегистрирован в Росздравнадзоре (№ ФСР 2010/06744).

5. Определены биотехнологические параметры изготовления туляре- ' мийных флуоресцирующих иммуноглобулинов, обеспечивающие рабочее разведение препарата 1:16-1:32: рН~ реакционной смеси - 9,5, нагрузка ФИТЦ -20 мг на 1 г белка, температура 20 °С при четырехчасовом контакте белка с красителем.

7. Сконструированный аффинный сорбент с магнитными свойствами на основе алюмосиликатной матрицы и поликлональных туляремийных антител обладает высокой специфической активностью и специфичностью, что подтверждено полевыми испытаниями, демонстрирующими возможность исследования проб с высокой степенью загрязнений биотической и абиотической природы, низкой концентрацией патогена, при этом чувствительность модифицированного ИФА повысилась на два-три порядка по сравнению с традиционным анализом, и это позволило увеличить число положительных находок более чем в шесть раз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция остается актуальной проблемой в инфекционной патологии человека. Возбудитель туляремии F. tu-larensis, циркулируя в природных очагах, может вызвать значительные вспышки заболевания, что представляет серьезную проблему для практического здравоохранения. Туляремия характеризуется различными механизмами и путями передачи возбудителя, лихорадкой, интоксикацией, образованием лимфаденитов, полиморфизмом клеточных проявлений, затяжным течением (Олсуфьев Н.Г., 1975; Гусева Е.В., Дудникова И.С., 2001; Refersen J.M., Schriefer М.Е., 2005). Природные очаги туляремии отличаются стойкостью, постоянными эпизоотическими и эпидемиологическими проявлениями (Мещерякова И.С., 2002).

Эпидемическими особенностями туляремии является высокая (практически 100 %) восприимчивость организма человека п]эи минимальных инфицирующих дозах возбудителя и множественность механизмов, заражения. Вдыхание всего 10 клеток F. tularensis может вызвать заболевание человека, что обусловлено высоким уровнем вирулентности и инфекциозности. Эти характеристики возбудителя туляремии определили его место в высшей катеi гории «А» патогенных агентов бактериального оружия (Воробьев A.A., 2001; Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridse S.R. et al., 2002; Thomson N., Cerdeno-Tarraga A., Bentley R., 2005).

Г.Г. Онищенко (2005) отмечает, что «система здравоохранения и причастные государственные структуры должны быть готовы к обнаружению и ликвидации последствий вспышки, вызванной любым биологическим агентом, включая традиционные и экзотические виды микроорганизмов». Для этого существующая система государственного эпидемиологического надзора и борьбы с инфекционными болезнями должна быть вооружена комплексом эффективных и адекватных диагностических препаратов и методов для индикации и i идентификации возбудителей.

Для обнаружения возбудителя туляремии в объектах окружающей среды и в клинических образцах используют биологические, бактериологические, иммуносерологические, молекулярно-биологические методы исследования (МУ 3.1.2007-05). При этом следует отметить, что большинство иммунодиагно-стических тестов — экспериментальные разработки.

При производстве диагностических препаратов необходимым условием является получение высококачественного антигенного и антительного материала.

Для извлечения-наиболее полного антигенного комплекса из микробов с сохранением нативности биополимеров мы избрали, щадящий режим дезинтеграции микробных клеток с помощью ультразвуковой установки в сочетании с водно-солевой экстракцией и последующим осаждением белка.

Сравнительное изучение методом диск-электрофореза в ПААГ антигенной структуры водорастворимых комплексов семи штаммов F. tularensis, относящихся' к разным подвидам,, дал о возможность выбрать три штамма: F. tularensis 543/6 (mediaasiatica), F. tularensis Schu (nearctica) и F. tularensis 503/840 (holarctica), из которых изолирован полигрупповой водорастворимый антиген.

Иммунные туляремийные сыворотки получили по разработанным нами схемам иммунизации кроликов-продуцентов, используя иммунокорректоры феракрил, тималин, циклофосфан, тимоген; обладающие различным, механизмом действия, иммуногеном при этом служил и полигрупповой туляремийный водорастворимый антиген и ЛПС.

При определении специфичности полученных гипериммунных туля-ремийных сывороток на гетерологичных штаммах микроорганизмов в непрямой реакции иммунофлуоресценции наблюдалось свечение на два-три креста у представителей рода Brucella, вследствие чего возникла необходимость в сорбции неспецифических антител. Для этой цели мы применили алюмосили-катный антигенный магноиммуносорбент. Таким образом, нами получено высококачественное биологическое сырье, пригодное для производства различных иммунобиологических препаратов.

До сих пор остаются актуальными и широко используются в диагностике туляремии простые, достаточно чувствительные, не требующие применения специальной аппаратуры и поэтому общедоступные серологические тесть»х? в частности, РНГА, РПГА, РНАт. Нами налажен производственный выпуск д^аг-ностикумов эритроцитарных туляремийных — антигенного и им-муноглобулинового (№ ФСР 2011/10270 и № ФСР 2011/10271, соответственно), при этом оптимальная биотехнология их изготовления заключается в след^ую щем: концентрация формалинизированных эритроцитов - 20 %, темперагэгура связывания эритроцитов с сенситином (при его ^ нагрузке в 200 мкг/мл) — полигрупповым водорастворимым белковьш туляремийным антигеном либо фракционированными октановой кислотой - 45 °С, рН раствора - 6,0 в течение 18 ч. Для использования в качестве положительной контрольной сыворотки; црИ постановке серореакций с этими диагностикумами нами разработан стандартный образец предприятия (СО) сыворотки диагностической туляремийной; адсорбированной сухой (регистрационный номер 001-9389-2008). Эта сывор>отка входит в комплекты наборов диагностикумов эритроцитарных туляремийных.

Исследования по конструированию диагностикума эритроцитарногчэ ту-ляремийного антигенного при использовании ЛПС в качестве сенситина Показали, что при его нагрузке в 100- мкг/мл титры РНГА достигали не тиенее 1:20480, и это свидетельствовало о достаточно высокой чувствительности препарата и возможности использования ЛПС при изготовлении антигенного эрит-роцитарного диагностикума.

При разработке иммуноглобулинов диагностических туляремийных флуоресцирующих нами изучены различные условия конъюгации иммуноглобулинов класса О, выделенных различными способами, с ФИТЦ: значение рН реакционной смеси (8,5; 9,0; 9,5), нагрузка красителя (20 мг и 25 мг ца 1 г белка), время его контакта с белком (1 ч; 2 ч; 4 ч; 12 ч), температурный режим конъюгации (4±1 °С; 20±1 °С; 37±1 °С). Отмечено, что после добавления ^красителя в первые минуты происходит снижение рН на 0,3-0,5, при этом значительная часть ФИТЦ не вступает в реакцию с белком. В связи с этим необходимо проводить контроль показателей рН и их корректировку после добавления красителя и через 30 мин после начала метки. Наилучшие серии конъюгатов получены при значении рН реакционной смеси — 9,5, нагрузке ФИТЦ— 20 мг на 1 г белка, температуре 20 °С и четырехчасовом контакте белка с красителем. Специфическая активность препаратов всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром 1:32 — 1:64 при исследовании мазков гомологичных штаммов. Оценка физико-химических свойств флуоресцирующих иммуноглобулинов, специфичности, чувствительности показала их соответствие требованиям, предъявляемым к подобным препаратам.

При использовании высокоактивных ^О, выделенных из туляремийных гипериммунных сывороток с помощью ПЭГ-6000, получены иммунопе-роксидазные . конъюгаты, рабочий титр которых составил 1:200 — 1:400, чувствительность по водорастворимому антигену — 50-100 нг/мл, по корпускулярному антигену - 5х104-1х105 м.к./мл. Все серии полученных конъюгатов для ИФА дали отрицательные результаты с гетерологичными штаммами, что свидетельствовало об их специфичности. Названные конъюгаты входят в «Набор реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ЙФА)», который зарегистрирован в Росзд-равнадзоре (№ ФСР 2010/06744).

Важным условием повышения г чувствительности и специфичности методов диагностики является селективное концентрирование возбудителя инфекции с последующей постановкой экспресс-анализов^ так как чаще всего в исследуемом материале концентрация возбудителя ниже порога чувствительности метода диагностики. С этой целью нами разработаны композиционные магнитные иммуносорбенты на основе поликлональных туляремийных < ^О. В качествесфуктурных единиц, формирующих остов кремнезема, использовали алюмосиликат, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полиглюкина и вторичного алкилсульфата натрия. Полученный иммуносорбент использован для проведения иммуномагнитной сепарации возбудителя туляремии и детекции его в иммуноферментном анализе, при этом в качестве твердой фазы вместо полистироловых микропланшет, традиционно используемых при постановке. ИФА, применяли разработанный нами магнитоуправляемый иммунный сорбент при постановке «сэндвич»-варианта этого метода. '

При постановке сочетанного метода МИС+ИФА искомый инфект, содержащийся в исследуемом материале, специфически взаимодействовал с IgG против антигенов F. tularensis, иммобилизованными на МИС. Образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляли с помощью «Набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в ИФА».

При проведении ИФА с помощью МИС туляремийные микробы, обнаруживались в концентрации, эквивалентной по ОСО 42-28-85Г1, 1,0x102 — 1,0x10 м.к./мл. Все изготовленные серии МИС не выявляли в ИФА гетероло-гичные штаммы микроорганизмов в концентрации, эквивалентной? по ОСО 42-28-85П, 1,0x105 м.к./мл и выше. Время постановки ИФА с применением МИС , составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18-ти часовую сенсибилизацию микропланшет - 20-21 ч. При этом значительно увеличивался? срок хранения сенсибилизированной твердой фазы (с 10 дней до двух лет и более), чувствительность модифицированного ИФА повышалась, на два-три порядка по сравнению с общепринятым ИФА. .

Разработанный нами аффинный кремнеземный микрогранулированный сорбент с магнитными свойствами имеет большую величину сорбционной емкости за, счет развитой поверхности и специфического лиганда, обладает стандартностью. структурных характеристик, механической прочностью, химической и микробиологической устойчивостью.

Применение МИС позволяет на этапе подготовки пробы путем многократных. промываний сорбента с фиксированным на. нем инфекционным агентом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым, исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повышает специфичность и чувствительность методов экспресс-анализа, а также достоверность как положительных, так и отрицательных результатов.

Разработанный нами туляремийный МИС входит в набор тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе. Названная тест-система включена в сетевой график разработки и внедрения препаратов* для диагностики особо опасных инфекционных болезней на 2012 г.

В итоге проведенных исследований составлена^ принципиальная^ схема производства туляремийных МИБП, которая складывается из последовательных стадий и, операций, характерных для каждого конкретного препарата; и определены критические контрольные точки на этапах производства (рисунок 27).

Диагностическую .ценность, разработанных, нами МИБП подтвердили многочисленные лабораторные испытания и исследования полевого материала,. собранного в Ставропольском и Краснодарском краях, Карачаево-Черкесской республике:; 3271. экземпляров клещей; 40 *грызунов, 12 проб воды открытых водоемов.

Таким образом, проведенные исследования позволили унифицировать, биотехнологию: производства иммунобиологических препаратов для идентификации F. tularensis и диагностики туляремии (Алиева Е.В., Тараш A.B., Афанасьева Е.Е. с соавт., 2006; Курчева С;А., 20М, 201Та)^Иолученные;намитуля-ремийные МИБП пользуются постоянным спросом и применяются в лабораторной практике Федеральными государственными учреждениями-«Центры гигиены и эпидемиологии», противочумными учреждениями Роспотребнадзора (научно-исследовательскими институтами, станциями и отделениями); и они входят в перечень, укомплектования диагностическими препаратами и расходными материалами, специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) согласно Приказу № 330 от 22Л К2007 г. М31и- соцразвития^РФ;«©^регламенте функционирования СПЭБ».

Характеристика сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов

К; ЛБТК

Выращивание биомассы бактерий

Стерилизация Ki.K-i, В

Микробная биомасса - Дезинтеграция м.к , экстракция; очистка L

АНТИГЕНЫ И

Водорастворимые белковые, ЛПС (и др.)

Для иммунизации

Для конъюгации

С ферментом

Ki,K4,K5; В

Иммунная сыворотка

Сорбция сыворотки * Аффинный сорбент 4

Иммуноглобулины (IgG) Выделение иммуноглобулинов

Конъюгирование f .

С флуоресцирующим красителем

Иммуноферментные (для ИФА) Г I

Полиакриламидный гель или органокремнеземная основа с магнитным материалом (матрица)

-Тштг тпрмгппЛ

И м му нофлу орес-центные (для РИФ) I

К+Дз; В

Эритроцитарные (для РИГА, РПГА, РНАт)

Розлив в ампулы, флаконы Лиофилизация

Сорбенты, магноиммуносор-бенты

KJCs; В

К4Д5; В; ЛБТК

Этикетировка, упаковка

Хранение готовой продукции

Рисунок 27 - Схема процесса производства и контроля туляремийных иммунобиологических диагностических препаратов

Обозначения: К-К5 - критические контрольные точки: К- входной контроль, Ki - контроль чистоты культуры, К2 -контроль специфичной стерильности, Кз - количественный контроль, К4 -контроль специфичности, К5 - контроль специфической активности; В - внутренний контроль; ЛБТК - контроль, производимый лабораторией биологического и технологического контроля предприятия

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курчева, Светлана Александровна, Ставрополь

1. Абусуева A.C., Арбулиева Е.У., Хаиров С.Г. Сравнительная оценка различных диагностикумов в РПГА при бруцеллезе // ЖМЭИ. 1999. — № 4. -С. 98-100.

2. Аграновская E.H., Карпенкова Н.И. Вопросы прикладной иммунологии. Ленинград, 1967. - С. 144-157.

3. Айманова О.Я. Усовершенствование методов производства эрит-роцитарных препаратов для диагностики особо« опасных инфекций: автореф. дис. . канд. мед. наук. — Саратов. -1986. 22'с.

4. Унификациям разработка диагностических тест-систем для мониторинга возбудителей бактериальной и вирусной природы / Е.В. Алиева; A.B. Таран, Е.Е. Афанасьева и'др. // Вестник СГУ. 2006. - Вып: 47, ч. 2. - С. 236-242.

5. Обнаружение возбудителя туляремии у больных с помощью реакции иммунофлуоресценции! / Е.В. Ананова, Л.С. Каменнова, И.С. Мещерякова и др.«// ЖМЭИ. 1989. - Т. 4. - С. 46-^19.

6. Аронова Н.В., Павлович Н.В. Фазовые вариации липополисахарида Francisella tularensis npn инфекции человека // ЖМЭИ: — 2005. — № 4. — С. 8—12.

7. Аронова Н.В., Павлович Н.В. Использование препаратов липополисахарида Francisella tularensis в точечном твердофазном' иммуноферментном анализе // ЖМЭИ. 2000. - № 5. - С. 75-78.

8. Афанасьев E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): автореф. дис. . д-ра мед. наук. — Ростов, 2000: —45 с.

9. Афанасьев E.H. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella: автореф. дис. . канд. мед. наук. — Саратов, 1984. -20 с.

10. Безсмертный В.Е., Горшенко В.В., Попов В.П. К оценке эпидемиологической ситуации по туляремии в Российской* Федерации // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. - № 2 (96). - С. 8-12.

11. Современное состояние природный очагов чумы, сочетанных с другими инфекционными болезнями на территории Ставропольского края /I

12. Вельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификация белков // Лаб. дело. — 1972. -№ 10. — С. 514-616.

13. Бельская Н.А., Митина B.C., Вейнблат В.И. Микрометод фракционирования и идентификации белков бактерий // Материалы Северо-Кавказской биохим. конф. Махачкала, 1970. - С. 270-271.

14. Благовещенский В.А., Степанченок-Рудник Г.И:, Жулина JI.B. Изучение химического состава экстрактов культур Б.Ц.Ж., подвергшихся обработке ультразвуком, и выделение из них растворимого антигена // ЖМЭИ. 1961. -№3.-С. 17-22.

15. Богоявленская Л.Б. Стандартизация диагностических реагентов на модели О-сальмонеллезных сывороток: автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., 1973.-45 с.

16. Васенин А.С., Вейнблат В .И., Самойлова Л.В. О* перекрестном иммунитете против чумы и туляремии // ЖМЭИ. 1980. - № 2. - С. 49-52.

17. Веренинова Н.К., Олли В.Д. К вопросу о стимулирующем действии цистина на рост туляремийного микроба // Тр. ин-та «Микроб». — Саратов, 1951.-Вып. 1.-С. 257-259.

18. Веренинова Н:К., Урода. Л.А. К вопросу об общности антигенов у Y. pestis и F. tularense // Тр. ин-та «Микроб». Саратов, 1951. — Вып. 1. -С. 110-114.

19. Воробьев A.A. Оценка вероятности использования биоагентов в качестве биологического оружия // Эпидемиол. и инф. болезни. — 2001. — № 6. — С. 54-56.

20. Гайдамович С .Я., Клисенко Г.А., Шаноян Н.К. Реакция агглютинации сенсибилизированных антителами эритроцитов вирусом колорадской клещевой лихорадки // Вопросы вирусол. — 1974. — № 2. С. 169.

21. Гайский H.A. Живая туляремийная вакцина // ЖМЭИ. 1944'. — № 12.-С. 14—19.

22. Гайский H.A. Туляремийный'вирус-вакцина, ее получение и применение // Иркут. противочумн. ин-т. 1948. - Изд. 1. - 70 с.

23. Гайский H.A. Туляремийный вирус-вакцина, ее получение и применение // Иркут. противочумн. ин-т. — 1948. Изд. 2. — 11'1 с.

24. Гайский H.A., Эльберт Б.Я. О механизме инфекции, и иммунитета, при экспериментальной туляремии. Сообщ. IL // ЖМЭИ. 1946. — № 12. — С. 37-39. '

25. Гайский.Н.А., Эльберт Б.Я.О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. IV // ЖМЭИ. 1946. - № 12. - С. 42.

26. Гофман И.Л. Опыт производственного изготовления сывороток к типовым и групповым антигенам шигелл Флекснера // Кишечные нвоздушнока-пельные инфекции. М., 1969. — С. 511—518.

27. Григорьева Г.И. Мембраны и мембранные белки в сравнительной характеристике стафилококков: автореф. дис. . канд. биол. наук. — Пущино, 1980.-21 с.

28. Гуревич Г.А., Кудрявцев A.A., Фихте Б.А. Инженерно-физические^ аспекты и феноменология процессов дезинтеграции микроорганизмов // Дезинтеграция микроорганизмов: материалы Всесоюзн. конф. по дезинтеграции микроорганизмов. Пущино-на-Оке, 1972.-С. 15-51.

29. Гусева Е.Д., Дудникова Н.С. Туляремия Владимир.: Изд-во ОКНИИ и MC ВНИИЗЖ, 2001. - 40 с.

30. Атлас Природного очага туляремии, степного типа на Северном Ка:вказе / Л.В. Дегтярева, A.B. Антонов, Н.И. Тихенко и др.. Ставрополь, 2005. -— 54 с.

31. Влияние тимических иммуномодуляторов на систему циклических нуклеотидов Т- лимфоцитов селезенки при вакцинации БЦЖ / C.B. Демидов, А.П. Костромин, Е.Ф. Чернушенко и др. // Проблемы туберкулеза: 1990. — № 10.-С. 63-65.

32. Анализ заболеваемости туляремией на территории Российской Федерации в 2001-2004'гг. / Т.Н. Демидова, В.В. Горшенко, В.П. Попов и др. // Сб. науч. тр. кафедры эпидемиологии РМАПО. — 2006. Т.8. — С. 265-273.

33. Анализ эпизоотической ситуации по туляремии на территории Российской Федерации в 2001-2005 гг. / Т.Н. Демидова, И.С. Мещерякова,

34. B.И. Жуков и др. // Материалы IX съезда Всерос. науч.-практич. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — М.: Санэпидмедиа, 2007. — Т. 3.-С. 167-168.

35. Доморадский И.В. Возбудители пастереллезов и близких к ним заболеваний. -М.: Медицина, 1971. 228 с.

36. Дорофеев K.A. О классификации возбудителя туляремии: сб. науч. работ Читинского института эпидемиол. и микробиол. 1947. - Вып. 1.1. C. 170-180.

37. Егорова Л.С., Дунаев Н.Б. Применение метода флюоресцирующих антител для обнаружения возбудителя туляремии в органах экспериментально зараженных животных // Журн. микробиол. — 1973. — № 10. — С. 135- 136.

38. Получение мембранных стафиллококков и их ферментативная и белковая характеристика / В. А. Ермаченко и др..- М. 1978 г. - С. 74.

39. Ефременко В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях. — Ставрополь: Ставрополье, 1996. —131 с.

40. Пат. RU 64784' U1. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды / В.И! Ефременко, A.JI. Столяров, Э.М. Игуменов и др..-№2006144331/22; 12.12.2006; опубл. 10:07:2007, Бюл. № 19:-2 с.

41. Жарникова И.В: Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей: , автореф. дис. . д-ра биол. наук. Ставрополь, 2004. - 39 с.

42. Разработка и применение иммобилизованных систем для экспресс-диагностики различных заболеваний / И.В: Жарникова, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. — 2008. № 2 (22), приложение, ч. 1. - С. 180-181.

43. Калитина Т.А'. Кожная аллергическая реакция как показатель иммунитета при туляремии: дис. канд. мед. наук. -М;, 1953. 109 с.

44. Каральник Б.В. Научные основы изготовления!эритроцитарных ди~ агностикумовУ/ ЖМЭИ. 1977. - № 4 - С. 29:

45. Каральник Б!В; Теоретическое обоснование принципов стандартизации эритроцитарных диагностикумов // Материалы межинстит. науч. конф. памяти Л.А. Тарасевича. Москва, 1967. — С. 225! ,

46. Каральник Б^В:, ЦаревскийЮ.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы. — Алма-Ата: Наука,1982; — 148?с.63:. Карпенко В.В;, Сачков В.Ж Обезболивание животных в эксперименте: метод, рек. М., 1985. — 53 с.

47. Способ стимуляции антителообразования у животных / Е.Г. Кирдей, Н.М. Пинигина, С.Н. Тюменцев и др. // А.С. СССР № 1390836. 1986:

48. Коннова A.M. О полном антигене туляремийного микроба // Тр. Ростов-на-Дону гос. науч.-исслед. противочумного ин-та. 1959. - Т. XI. Вып. 2. — С. 205-215.

49. Корн М.Я; Основные физические представления о люминесценции и методика, исследования препаратов, обработанных люминесцентными сыворотками // Иммунолюминесценция в медицине / под ред. Е. Р: Левиной. М.: Me-1 дицина, 1977.-С. 240: ,

50. Иммуноглобулиновый пенициллиназный конъюгат. для выявления антигена возбудителя туляремии / Д.Ы. Куанбаев, О.Б. Чемиров; Г.А; Темира-лиеваидр. //Лаб. дело.- 1990.-№1.-С. 44-46. .

51. Куделина Р.И, Ананова E.B. Применение иммунофлуоресцентного метода с целью обнаружения; возбудителя- туляремии в развивающихся куриных эмбрионах // ЖМЭИ; 1975; - №10. - С. 18-221

52. Кузнецова Е.М., Шепелев И. А'., Волох О. А. Структурно. функциональная характеристика, основных антигенов! Francisella tularensis // Проблемы особо опасных инфекций;,—2009К—ВыпПОО^—C. 45-49i

53. Курчева G.A. Разработка биотехнологии производства иммунодиаг-ностических препаратов для выявления возбудителя туляремии? // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2011. - № 3. - G. 52-55.

54. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы, иммунитета. М.: Медицина, 1985.-255 с. . . .

55. Ларионова Л.В. Химический состав и- некоторые биологические свойства водно-солевого экстракта туляремийного микроба // Актуальные проблемы и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций. Саратов, 1991.-С. 106-110.

56. Реакция пассивной гемагглютинации в:реакции нейтрализации антител при некоторых инфекциях / М.И. Леви и др. // ЖМЭИ. 1962. - № 10. -С. 40-45.

57. Методические рекомендации по тактике эпизоотологического обследования природного очага; туляремии Центрального Предкавказья в современных условиях / Б.И: Левченко, Л.В. Дегтярева, Н.И. Тихенко и др.. Ставрополь, 2009. - 24 с.

58. Лопаткин О.Н:, Кронгауз И.В. Получение и изучение чистых вых антител к термостабильным споровым антигенам В: cereus и В. ап1 Профилактика природно-очаговых инфекций: тез. докл. Всесоюзн. науч тич. конф.-1983.-С. 308-310. '

59. Максимов A.A. Природные очаги туляремии в СССР. -- М.; • Изд Академии Наук СССР, 1960. 192 с.

60. Меньшов~Ж№, Шмутёр;М;Ф^ Формалинизация1эритро с пом' . щыо мешалки // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов; 196S>— ^ С. 202-203. ' ■ ! ■ ' '

61. Мещерякова И.С. Туляремия: современная эпидемиология: вакцИнопрофилактика // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2010: ~---. ^1. С. 17-22. • , ; ., . ' :

62. Мещерякова? И.С., Родионова И;В., Кормилицина М:И: П^^гзгогенные микроорганизмы рода Francisella // Материалы науч.-практич. конф»100.лет. образования* противочумной; службы>России. Саратов, — х 21. С. 84-85. :

63. Использование иммуноферментного метода ELISA для1 выявления возбудителя туляремии / И.С. Мещерякова, H.G. Умнова, K.JI. Шаханина и др. // ЖМЭИ. 1988. - № 2. - С. 109-112.

64. Мещерякова И;С. Антигенное строение штаммов туляремийного микроба различной степени вирулентности // Журн. гиг., эпидемиол., микро-биол., иммунол. 1970. - Т. 14, №> 4. - С. 420-429.

65. Мещерякова И.С. Антигены*туляремийного микроба;, их серологическая характеристика и применение в реакции пассивной гемагглютинации: дис. . канд:.мед; наук.- MV19681-134;с:

66. Мирошниченко: М.А. Некоторые эпидемиологические особенности-туляремии в Ставропольском крае// Вопр. эпизоотологии и эпидемиол.: тр. на-уч.-исслед. противочумн. ин-та Кавказа и? Закавказья: Ставрополь: Ставр. правда, 1960. - Вып.4. - С. 149-157.

67. Подъем эпизоотической активности природного очага туляремии степного типа в Ставр01 юльском крас и его эпидемические последствия / A.A. Некрасов и др. // ЖМЭИ. 1985. - № 2. - С. 88-92.

68. Никифоров В.В;, Кареткина Г.Н. Туляремия: от открытия до наших дней // Инф. болезни. 2007. - Т.5^ № 1. - С. 67-76;.

69. Проблемы эпизоотологического надзора за природными очагами туляремии/ H.JI; Новиков, В;П. Попов, В.И. Жуков и др. // Материалы IX съезда ВОЭМП-М.,2003.-Т. 3. С. 210-211.

70. Носков Ф^С. Флуоресцирующие антитела и их применение в вирусологии // Респираторные вирусные инфекции. JI;, 1969. — С. 217-242.

71. Об итогах работы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в 2005 году и задачах на 2006 г. -М., 2006.-С. 42-43.

72. Олсуфьев Н.Г. Современное состояние и перспективы развития исследований по »природной-очаговости туляремии // Природно-очаговые болезни человека. -М., 1979. С. 41-46.

73. Олсуфьев Н.Г., Емельянова О.С. Об антигенной структуре Bacterium tularensis Me Coy and Chapín // Журн. гиг., эпидемиол., микробиол. и иммунол. -Прага, 1957. -№ 1.-С. 305-314.

74. Туляремия / под ред. H.F. Олсуфьева, Г.П. Руднева. М.: Медгиз, 1960: — 460 с.

75. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М:: Медицина, 1975.-416с.

76. Онищенко Г.Г. Борьбам инфекционными болезнями! — приоритетная тема председательства Российской* Федерации на саммите «Группы восьми»-в 2006 г. // ЖМЭИ. 2006. - № 7. - С. 3-7.

77. Онищенко FX. Меры по- противодействию биологическому терроризму в Российской Федерации // ЖМЭИ. 2005. - № 4. - С. 33-37.

78. Онищенко Г.Г. Инфекционные болезни — важнейший фактор биоопасности»// ЖМЭИ. 2003. - № 3. - С. 4-16.

79. Онищенко Г.Г. Контроль и ликвидация' инфекционных заболеваний — стратегическое направление здравоохранения // ЖМЭИ. 2002. — №-4. — С. 3-16:

80. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др.. -М.: Мир, 1997. С. 86, 112, 147.

81. Остерман JI.A. Очистка иммуноглобулина типа IgG // Исследованиебиологических макромолекул электрофокусированием; иммуноэлектрофорезомсiи радиоизотопными«методами. Иммуноэлектрофорез*. М.: Наука, 1983. - Ч. П -С. 107-109.

82. Павлова И.Б., Мещерякова И:С., Емельянова О.С. Изучение ультратонкой структуры двух географических разновидностей туляремийного микро— ба различной степени вирулентности // Журн. гиг., эпидемиол., микробиол. иммунол. 1967. - Т. 11, №*3. - С. 290-296.

83. Видо- и родоспецифические антигенные эпитопы липополисахариг дов Francisella tularensis / H.B. Павлович, H.B. Аронова, H.H. Оноприенкс и др. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2000. - № 3. - С. 7—12.

84. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. Фосфатазная и. пенициллиназн; активности, как, стабильные признаки* для дифференциации расовой принад^ лежности Francisella tularensis // ЖМЭИ. 1992. - № 11-12. - С. 5-7.

85. Пашов Т.В. Эпизоотология туляремии свиней и дифференциальна диагностика туляремии5 и бруцеллеза // Докл. Всесоюзн. ордена Ленина акад сельхоз. наук им. В:И. Ленина. — 1950. — № 7. — С. 19-22.

86. Плавильщиков H.H. Определитель Насекомых. Краткий определитель наиболее,распространенных насекомых Европейской* части России. — М.: 'Гопикал, 1994. 544 с.

87. Померанцев Б.И. Паукообразные иксодовые клещи (Ixodidae). Фауна СССР. М.; Л.: Из-во Академии наук, 1950. - Т. IV, Вып: 2. - 223 с.

88. Практическая химия белка / пер. с англ. / под ред. А. Дарбре — М: Мир, 1989.-С. 22-23.126: Приказ Министерства Здравоохранения РФ от 14.04.1999 г. № 125. Об усилении мероприятий по туляремиш -Mi, 1999:!

89. Приказ МЗ СССР № 1179 от 10 октября* 1983 г. Об. утверждении нормативов затрат, кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения. — М., 1983.

90. Родионова И.В. Сравнительное биохимическое исследованиенекот-рых ферментных систем и антигенных комплексов географических рас туляре-мийного микроба: автореф. дис: . канд. мед. наук.-М., 1967. 19 с.

91. Родионова И.В., Захаренко В.И. Антигенный состав белков наружной мембраны туляремийного микроба // Мол. ген., микробиол. и вирусол. — 1990. — № 11.-С. 8-16.

92. Родионова И.В., Шипицина Г.К. Иммунохимичекая характеристика двух географических разновидностей туляремийного микроба // Биохимия. — 1967. Т. 32, № 6. - С. 1161-1168.

93. Романова-JI.M". Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики: автореф. дис. . докт. биол. наук. — Ставрополь, 2008. — 36 с.

94. Скопинская С.Н., Ярков С.П., Храмов E.H. Применение липосомаль-ного иммуноанализа для выявления антител к возбудителям^ туляремии, холеры, брюшного тифа, сапа? и мелиоидоза // Пробл. особо4 опасн. инф. — 2007. — №2 (94).-С. 67-71.1

95. Скуч-Д., Уест Д.Основы аналитической химии. М.: Мир, 1979-— Т. 1.-С. 71-73.

96. Научные основы* производства'диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) / В.В. Смирнов, В.Я. Чаплинский, З.М: Андреева и др. Киев: Наукова« Думка, 1980: - 195с.

97. Станиславский Е.С. Бактериальные структуры и'их антигенность. — М.: Медицина, 1971. 220>с.

98. Суворов'C.B., Вольферц A.A., Воронкова М.М. Чумоподобные лим-фодениты в районе Астрахани // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитол. — 1928. T. VII, Вып. 3. - С. 293-299.

99. Суворов C.B., Вольферц A.A., Воронкова М.М.' Чумоподобные лимфадениты в низовьях Волги летом 1926 г. // Тр. I Всесоюзн. противочумн. со-вещ., 1927. Саратов, 1928. - С. 90-101.

100. Сухарь В.В". Гликолипидный состав штаммов Francisella tularensis различной степени аттенуации // Микробиол. журн. — 1993. № 55 (1). — С. 8—12.

101. Сухарь,В.В. Изучение антигенного состава некоторых штаммов туляремийного микроба. Сообщение II // Журн. микробиол. 1966. - № 8. -С. 104.

102. Сухарь B.B. Химическая и биологическая характеристика антигенов туляремийного микроба: автореф. дис. . канд. мед. наук. — Ростов-на-Дону, 1988.- 18 с.

103. Сухарь В.В., Непомнящая Н.Б. Липополисахаридный 0-а.нтиген Francisella tularensis // ЖМЭИ. 2009. - № 5. - С. 110-113.

104. Сучков Ю.Г., Канатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов иммунными гамма-глобулинами // Журн. микробиол. — 1965. -№ 8.- С. 63.

105. Сырова H.A., Терешкина З.Я., Девдариани З.Л. Современное состояние иммунодиагностики туляремии // Проблемы особо опасных инфекций. — Саратов, 2008. Вып. 97. - С. 12-15.

106. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций // Журн. микробиол. 1969. -№ 10.-С. 26-31.

107. О полном антигене туляремийного микроба / И.С. Тинкер, A.M. Дрожевкина, A.M. Коннова и др. // Тр. Астраханской противочумной станции. 1955. - Вып. I. - С. 135-149.

108. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявлениявозбудителей особо опасных и других инфекций: автореф. дис. . д-ра мед. наук. Ставрополь, 1996. - 57с.

109. Разработка рациональной биотехнологии получения диагностических иммунных сывороток / И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Е.В. Жданова и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. — .N® 2 (22), приложение, ч. 1. — С. 210-211.

110. Фихте Б.А. Дезинтеграция микроорганизмов. Задачи и перспективы // Дезинтеграция микроорганизмов: материалы Всесоюзн. конф. по дезинтеграции микроорганизмов. Пущино-на-Оке, 1972. — С. 5—14.

111. Фонталин JI.H., Певницкий Л.А. Иммунологическая толерантность. —1. М., 1978.-282 с.t

112. Хавинсон В.Х., Мороз В.Г. Тималин — иммуномодулирующий препарат из тимуса // Тимус и его влияние на организм. — Томск: Изд-во Томского университета, 1982. С. 201-203.

113. Хатеневер Л.М., Грунтфест М.Ю. Серологическая характеристика материала туляремического очага и получение агглютинирующих F. tularesnsis сывороток // ЖМЭИ. 1934. - № 2. - С. 76-80.

114. Изучение биохимических, антигенных и протективных свойств внешней мембраны возбудителя туляремии / B.C. Хлебников, И.Р. Головлев, Д.П. Кулевацкий и др. // Мол. ген., микробиол. и вирусол. — 1991. — J^ 7. — С. 15-20.

115. Определение антигенной детерминанты превентивных моноклональ-ных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis / B.C. Хлебников и др. // Микробиол. журн. 1993. — № 1. - С. 83-87.

116. Черепахина И.Я., Козловский В.Н., Ефанова Е.А. Динамика образования антител к вакцинному штамму Francisella tularensis при различных схемах иммунизации // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, № 2. - С. 89—93.

117. Цыбин Б.П., Таран И.Ф. Оценка диагностических свойств бруцеллезного антигенного эритроцитарного диагностикума // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1976. - Вып. 6 (52). - С. 26-30.

118. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Способ получения эритроцитарного диагностикума // АС СССР, № 634749 от 11.07.77, Б.И. № 44, 1978.

119. Шаханина K.JI. Иммуносорбенты и их использование для выделения чистых антител // Биохим. и биофиз. микроорганизмов. — Горький, 1981. — Вып. 9.-С. 15-23.

120. Шаханина K.JI. Методы контроля и стандартизации люминесцирую-щих антител // Люминесцирующие антитела (в изучении патогенных микроорганизмов). М.: Медицина. - 1972. - С. 31—49.

121. Шаханина К.JI. Современные методы приготовления люминесци-рующих сывороток // Иммунологический анализ. М.: Медицина. - 1968. -С. 202-223.

122. ПТварцман Я.С., Синицын В.А. Реакция непрямой гемагглютинации (обзор литературы) // ЖМЭИ. 1961. - № 9.- С. 97-102.

123. Ультразвуковая дезинтеграция бруцелл / Н.Г. Шин, и др. // Изв: А. Н. Каз. ССР. Сер. биол., 1973. -№ 1. - С. 68-71.

124. Шипицина Г.К. О корреляции химического-* состава специфических веществ туляремийного микроба и его вирулентности // Изменчивость микроорганизмов и бактериология: тез. докл. конф. — М., 1958. — С. 63-641

125. Шипицина Г.К., Емельянова О.С. О зависимости между химическим составом специфических веществ туляремийного микроба и вирулентностью культуры // Докл. АН СССР, 1956. Т. 109, № 2. - С. 365-368.

126. Шипицина Г.К. О химическом составе антигенных веществ возбудителя туляремии. ДАН СССР, 1955.-Т. 105, №2. -С. 315-318.

127. Шипицина Г.К. Химический состав и биологические свойства антигенного комплекса возбудителя туляремии: автореф. дис. . канд. биол. наук. — М., 1955.-10 с.

128. Штибен В.Д., Бабич И.К. Определитель бактерий, патогенных для человека. М:, 1955. - 546 с.

129. Шторц X. Иммунофлуоресценция // Иммунологические методы. -М.: Медицина, 1987. С. 128-148.

130. Штуцер М.И. Отдифференцировании бруцеллеза^(мальтийской лихорадки-и туляремии) при помощи кожной реакции // ЖМЭИ. — 1936. — Т. XVII, №2.-С. 184-187.

131. Эльберт Б.Я., Гайский H.A. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. I // ЖМЭИ. -1941. —№ 12. С. 35-37.

132. Эльберт Б.Я., Гайский H.A. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. III // ЖМЭИ. — 1941. — № 12. -С. 39-41.

133. Эльберт Б.Я., Гайский Н.А. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. V // ЖМЭИ. 1941. — J4fe 12. — С. 42-^45.

134. Эльберт Б.Я., Гайский Н.А. О механизме инфекции и иммунитета при экспериментальной туляремии. Сообщ. VII // ЖМЭИ. 1941. — JSfe 12- — С. 47-49.

135. Эльпинер И.Е. О механизме действия ультразвуковых волн микроорганизмы // Микробиология. — 1955. Т. 24. - Вып. 3. — С. 371—381.

136. Использование микроточечного 5 иммуноферментного-анализа. с визуальной индикацией для определения туляремийных антител / С.В. Юров, С.Ю. Пчелинцев, С.С. Афанасьев и др:. ЖМЭИ. - 1991. - № 3. - С. 61--64.

137. Prairie dog to human tularemia transmission, Texas 2002 / S. .¿^rvashia,i

138. J.M. Petersen, C. Lindy et al. // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 483-486.

139. Avrameas S.M., Ureal J'. Methode de marquage d antigene et d amrtiicorps avec des enzymes et sons application en* immunodiffusion // C. R. Acad. Sci CD)- — 1966. Vol. 2. - №-26. - P. 2543-2545.

140. Avrameas S.M. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehy«<zie: iase of the conjugates for detections of antibodies // Immunochemistry. 1969. —^ V-ol. —■ № 1. — P. 43-52.

141. Detection of diverse new Francisella like bacteria in enviror3r^ca.exital samples / S.M. Barns, C.C. Grow, R.T. Okinaka et al. // Appl Environ. Micrcz^>t>iol- — 2005. - Vol. 71, № 9. - P. 5494-5500.

142. Studies on the immunization of white mice against infections with Bacterium tularense / J.F. Bell, C.L. Larson, W.C. Wicht et al. // J. Immunol. 1952. — Vol. 69.-P. 515-524.

143. Field detection of Francisella tularensis / B. P. Berdal, R. Mehl, H. Haa-heim et al. // Scand. J. Infect. Dis. 2000. - № 32 (3). - P. 287-291.

144. Bergey D.H. Berrgey's Manual of Determinative Bacteriology. — 1936; 1948; 1957.

145. A reveas immunodiffusion assay for antibody protein concentration in antisera or conjugates to human IgG / E.H. Beuntner et al. // Standartization in immunofluorescence. Oxford. : Blackwell Scientific Publ, 1970. - Pat. 2. - P. 165-169.

146. Bevander L., Maeland J.A., Naess A.I. Agglutinins and antibodies to F. tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia // J. Clin Microbiol. 1988. - № 26. - P. 433-437.

147. Boyden S.V. The adsorption, of proteins treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera // J. Exp. Med.-1951. № 93. — P. 107— 120.

148. Carlisle H.N., Hinchliffe V., Saslaw S. Immunodiffusion studies with Pas-teurella tularensis antigen rabbit antibody systems // J. Immunol. - 1962. - Vol. 89. -P. 638-644.

149. Center for Disease Control and Prevention. Tularemia. United States. 1990-2000 // Morb. Mortal Wkly Rep. - 2002. - Vol. 51. - P. 182-184.

150. Assembly of type IV pili in Francisella tularensis and role in virulence / S. Chakroborty, M. Monfett, T.M. Maie et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biological Laboratory. USA, 2006. - P.SC.

151. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. — 1977. Vol. 36, № 3. - P. 475—483.

152. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. 1950.-V. 91, № l.-P. 81-89.

153. Cowlay S.C., Myltseva S.V., Nano F.E. Phase variation in Francisella tularensis affecting intracellular growth, lipopolysaccharide antigenicity and nitric oxide production // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20 (4). - P. 867-874.

154. Immunohistochemical demonstration of Francisella tularensis in lesions of cats with tularemia / B.M. DeBey, G.A. Andrews, M.C. Chard-Bergst et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2002. - Vol. 14 (2). - P. 162-164.

155. Tularemia as biological weapon: medical and public health management / D.T. Dennis, T.V. Inglesby, D.A. Henderson et al. // JAMA, 2001. № 285. -P. 2763-2773.

156. Downs C.M., Bond G.C. Studies on the cultural characteristics of Pasteu-rella tularensis // J. Bacteriol. 1935. - Vol. 30, № 5. - P. 485-490.i

157. Eigelsbach H.T., McGann V.G. Genus Francisella // Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. N.R. Krieg, J.G. Holt- Baltimore, 1984. Vol. 1. — P. 394-399.

158. Fomsgaard A. Antibodies to LPS: some diagnostic and protective aspects // AMPIS Suppl. 1990. - №-18. - P. 1-38.

159. Francis E., Evans A.C. Agglutination, cross-agglutination and agglutinin absorption in tularemia // Publ. Health Rep: 1926. - Vol. 41. - P. 1273-1295. .

160. Francis E. Fermentation of sugars by Bacterium tularensis // J: Bact. — 1942. Vol. 43, № 3. - P: 343-346:

161. Problems in identification of Francisella philomiragia associated'with fatal bacterimia in patient with chronic granulomatous disease / A. Friis-Moller et al. // J. Clin Microbiol: 2004. - Vol. 42, № 4. - P. 1840-1842.

162. Production and character ization of lipopolysaccharide of F. tularensis / M. Fulop,* T. Webber, RJ. Manchee et al. // J. Clin Microbiol! 1991. - № 29 (7). -P.1407-1412.

163. Fulthorpe A.M. Tetanus antitoxin titration by haemagglutination // J-. Hyg. -1957.-Vol. l.-P. 46.

164. Gaspar A. J., Tresselt H.B*, Ward M:K. New solid medium for enhanced growth»of Pasteurella tularensis // J. Bact. 1961. - Vol. 82. - P. 564-569.

165. Gijs M.A. Magnetic particle handling Microsystems for miniaturized analytical applicatons // Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol'. Soc. 2007. - P. 4088-4089.

166. Gil H., Benach J.L., Thanassi D.G. Presnce of pili on the surface of Francisella tularensis // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 3042-3047.

167. Goldman M. Fluorescent antibody method // New York, 1968.- 242 p.

168. HuelsewefoB:, .EhrictitRI, MarschallTL Ji As simple andirapidlproteihsarray based method for the simultaneous detection of biowarfare agents // Proteomics. — 2006. Vol. 6 (10). - P. 2972-2981

169. Biofilm Formation by Francisella tularensis / Ph. Ireland; M.S. Lever, R.W. Titball et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biological laboratory. USA, 2006. -P. 219A.

170. GomparativeAnalysisofPCRversusCulture for Diagnosis of Ulcerogla-dular Tularemia / A. Johansson, L. Berglund, U. Eriksson? et al;. // J; of clinical microbiology.-2000:-Voh 38, №1.-P: 22-26.

171. Magnetic monosized polymer for fast and specific fractionation:of humen mononuclear cells / T. Lea et al. // Scand. J: Immunol. 1985. - Vol. 22, № 21 -P. 207-216.

172. Maurer H: (Maypep Г.) Диск-электрофорез. Теория и; практика электрофореза в полиакриламидном геле. М.: Мир, 1971. - 248 с.

173. Мс Coy G.W. A-plague-like disease of rodents // Pub. HealthBull. 1911'. -№43.-P. 53-71.238: Mc Coy G.W., Chapin C.W. Bacterium,tularense the cause of plague-like disease of rodents // Pub. Health Bull: 1912. - № 53. - Pi 17 -23.

174. Mizuhara M. Relationship between terminal oxidation: systems and« virulence of Pasteurella tularensis // Jinsen Igaku. 1961. - Vol. 16. - P. 855.

175. Mollaret H., Knapp W. Report (1966-1970) of the Subcommitee on Pasteurella, Yersinia and Francisella of the International Committee on nomenclature ofI

176. Bacteria//Int: J: systemBäct: 1971. -Voll 21. -PI 1571

177. Immunochemical characterisation of Brucella lipopolysaccharides and polysaccharides / E. Moreno, S. Speth, L.M. Jones etal. // Infect Immun. — 1981. -Vol. 31, № 1. P. 214-222.

178. Ormsbee R., Bell F., Larson C.L. Stadies of Bacterium tularense antigens. I. The isolation, purification and biologic activity of antigen preparations from Bacterium tularense//J; Immunol. 1955. - Vol. 74, № 5. - P. 351-358.

179. Ormsbee R., Larson C.L. Stadies on Bacterium antigens. II. Chemical and physicaf characteristics of protective antigen preparation// J. Immunol. 1955. -Vol. 74, № 5. - P. 359-370.

180. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel // Arkiv for Kemi. Mineral. О Ged. 1949. - Vol. 261, № 14. - P. 1-9.

181. Parnas J. (Парнас Ю;) Антигенные и иммунологические взаимоотношения между бруцеллами и F. tularensis // Здравоохранение Белоруссии. — 1967. № 7. — С. 56-57.

182. Parnas J., Burdzy K., Cegielko M. Studies on the antigenic structure of Pasteurella tularensis with the aid of gel precipitation and Electrophoresis // Bull. Acad. Pol. Sci. Biol. 1961. - V. 7. - P. 295-298.

183. Parnas J., Burdzy K., Cegielko M. Dalsze badania nad budowa antigeno-wa paleczek Brucella brucei i Pasteurella // Acta Microbiol. Pol. 1962. - Vol. II. -P. 33-42.

184. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in argentina / P.S. Paulo et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -2000. Vol. 7 (5). - P. 31-828.

185. Peruski A.H., Peruski L.F. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003 -Vol. 10, № 4. - P. 506-513.

186. Peruski A.H., Johnson 3rd L.N., Peruski L.F.Jr. Rapid and sensitive detection of biological warfare agents using time-resolved fluorescence assay // J. Immunol. Methods. -2002. Vol. 263, № 1-2. - P. 35-41.

187. Petersen J.M., Schriefer M.E. Tularemia: emergence/re-emergense // Vet. Res. 2005. - Vol. 36, № 32. - P. 455-467.

188. Novel modification of lipid A of Francisella tularensis. / N.J. Phillips, B. Schilling, M.K. McLendon et al. // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, № 9. -P. 5340-5348.

189. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh // Biochem. Biophis. Acta. — 1964. -Vol. 82.-P. 463—475.

190. Role of wbt locus of Francisella tularensis in lipopolysaccharide O-antigen biogenesis and pathogenicity / C. Raynand, K.L. Meibom, V.A. Lety et al. // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75, № 1. - P. 536-541.

191. Characterization and sequencing of respiratory burst-inhibiting acid phosphatase from Francisella tularensis / T.J. Reily, G.S. Baron, F. Nano et al. // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271, № 18. - P. 10973-10983.

192. Characterization of recombinant Francisella tuiarensis acid phosphatase A / T.J. Reily, R.L. Felts, M.T. Henzi et al. // Protein Exp. Purif. 2006. - Vol. 145. -P. 134-141.

193. Ribeiro M.A., Romero E.C., Brandao A.P. Evaluation of diagnostic test for human leptospirosis//Draz. J. Med. Biol. Res. 1996. - Vol. 29, № 8.-P. 773777. ; '

194. Ribi E., Shepard C. Morphology of bacterium tularens during its growth cycle in liquid medium as revealed by the electron microscope // Exp. Cell: Res. — 1955. Vol. 8. - P. 474-487.

195. Public health assesment of potential biological terrorism agents / L.D. Rotz et al. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 225-230.

196. Characterization and classification of strains of Francisella tuiarensis isolated in the Central Asian focus of the Soviet Union and; in Japan / G. Sandstrom, A. Sjostedt, M. Forsman etal;. // J; Clin. Microbial; 1992. - Vol. 30, № 1. -P. 172-175. ' '

197. Sjostedt A. Virulence, determina and protective antigens of Francisella tuiarensis // Curr. Opin. Microbiol. 2003. - № 6. - P. 66-71.

198. Slcrodzki E. Characterystyka szczepow B. tularense wyhodowanych w Polsce w latach 1952-1953 // Biuletin Inst. Med: Morskiej w Gdañsku. 1957. Vol. VIII ('/4). — P. 51-56.

199. Smith K.O., Gehl W.D. Magnetic transfer devices for use in solid-phase radioimmuno assays and enzym-linked immunosorbent assay // J. Infect. Diss. — 1977. Vol. 136. - P. 5328-5336.

200. Diagnostic procedures in tularemia with special focus on molecular and immunological techniques / W.D. Splettstoesser, H. Tomaso , S. A1 Dahouk et al. // J. Vet. Med. Infect. Dis. Vet. Public. Health. 2005. - Vol. 52, № 6. - P. 249-261.

201. Stavitsky A.B. Haemagglutination and haemagglutination-inhibition reactions with tannic acid and bis-diazotired benzidine-protein-conjugated erythrocytes-// Immunological Methods / Ed. J.F. Ackroyd - Oxford. - 1964. - 363 p.

202. Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of capr,ilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. 1969. - Vol. 139. — P. 279-284.

203. Protein heterogeneity of Francicella tularensis: detection of proteins with antigenic determinants. / J. Stulik, J. Gerna, H. Kovarova et al. // Folia-microbial. -Praha, 1989. № 34 (4). - P. 316-323.

204. Evolution^ of subspecies of Francisella tularensis / K. Svensson, P: Lars-son, D. Johansson*et al. // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 11. - P. 3903-3908:

205. Tarnvik A\y Priebe H.S., Grunow R. Tularemia'in Europe: an epidemiological overview // Scand. Ji Infect. Dis. 2004. - Vol. 36, № 5. - P: 350-355."

206. Titball R.W., Johansson A., Forsman M. Will the enigma of Francisella tularensis virulence soon-be solved ? // Trends in Micro biology. — 2003. — Vol. 11, №3.-P: 118-128.

207. Thomson N., Cerdeno-Tarraga A., Bentley S. Massive attack // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol. 3, № 8. - P. 586-587.

208. Vidziunaite R., Mikulskis P., Kulis J: Ghemiluminescent immunoassay (CLIA) for the detection of brucellosis and'tularemia antigens // J. Biolumim Chemi-lumin. 1995. Vol. 10, № 4. - P. 199-203.

209. Vinogradov E., Perry M.B., Conlan J.W. Structural analysis of Francisella tularensis lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol. 269. - P. 6112-6118.

210. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristallisation des Garugster-ments Enolase // Biochem. Z. 1941. - Vol. 310. - P. 384-421.

211. Weber R., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis // J-. Biol. Ghem. — 1969. -Vol. 244. 16. -P. 4406-4412.

212. Weinbach R. Die Verwendbarkeit formolbehandelfer Erythrocyten als Antigentrager in der indirecten Haemagglutinatin // Schweiz. Z. Allg. Path. 1959. -Vol. 22.-P. 1.

213. Weller T.H., Coons A.H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. 1954. -Vol. 86.-P. 789-794.

214. An outbreak of Francisella tularensis in captive prairie dogs: an immuno-histochemical analysis / N.S. Zeidner et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 2004. -Vol. 16, №2.-P. 150-152.

Информация о работе

Курчева, Светлана Александровна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Разработка биотехнологии производства иммунобиологических препаратов для диагностики туляремии и индикации ее возбудителя - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы