Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики

Романова, Людмила Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики"

На правах рукописи

Романова Людмила Васильевна

ЖКА1ЧС18Е1ХА ТиЬАЬНШЗК: НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОЛОГИИ И ДИАГНОСТИКИ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ставрополь - 2008

003170950

Работа выполнена в ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора РФ

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Борис Николаевич Мишанькин.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Нина Пантелеймоновна Буравцева;

доктор биологических наук, профессор Виктор Григорьевич Майский;

доктор биологических наук Ирина Сергеевна Мещерякова.

Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский

противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора РФ

Защита диссертации состоится 18 июня 2008 г в /-?часов на заседании диссертационного совета ДМ 212 256 09 в Ставропольском государственном университете по адресу 355009, г Ставрополь, ул Пушкина, 1, корп. 2, комн 506

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета

Автореферат разослан___2008 г

Ученый секретарь I /-—

диссертационного совета I/ (/А^САД^ОгШ Ржепаковский И В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туляремия - зоонозное природно-очаговое инфекционное заболевание, известное еще с давних времен Упоминания о страшной эпидемии, сходной с бубонной чумой или тифом, которая поразила Древний Египет в середине бронзового века, были обнаружены в медицинских папирусах, датированных 1715 г до н э (Trevisanoto S , 2004,2007) Она характеризуется различными механизмами и путями передачи возбудителя, лихорадкой, интоксикацией, образованием лимфаденитов, полиморфизмом клеточных проявлений, затяжным течением (Francis F, 1925, Олсуфьев Н Г ,1970,1975, Гусева Е В и др 2002, Ellis J et al, 2002, Khouiy J et al, 2005, Petersen J et al, 2005)

Несмотря на несомненные успехи в борьбе с возбудителями особо опасных болезней в целом, значимость туляремийного микроба, как этиологического фактора в патологии человека, не только не снижается, но и проявляет тенденцию к нарастанию (Мещерякова И С, 1983, 1997, 2002, 2003; Они-щенко Г Г, 1998, 2001, 2002, 2005, Сергиев В П и др ,1999, Покровский В И и др , 1999, Шаханина И J1 и др 2001, Домарадский И В , 2005) К тому же возбудитель туляремии входит в перечень патогенных биологических агентов, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия Такого рода агенты должны отвечать комплексу критериев, учитывающих их биологические параметры в сочетании с взаимоотношением с организмом человека, средой обитания, а также технологическими, техническими и экономическими показателями Согласно классификации А А Воробьева (2001), возбудитель туляремии включен в I группу биоагентов Реальная возможность применения противником биологического оружия в локальных войнах, вооруженных конфликтах или при террористических актах является серьезной проблемой для любой страны (Мельниченко ПИ и др, 2000, Лобзин Ю В и др , 2001, Воробьев А А , 2001, Cronquist S , 2004, Онищенко Г Г, 2005, Jones S et al, 2005, Tomioka К et al, 2005) Для решения проблемы национальной биологической безопасности издан Указ Президента Российской Федерации № 2194 от 4 12 2003 г, определяющий основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2010 года и дальнейшую перспективу Учитывая высокую инфекциозность возбудителя туляремии при минимальной заражающей дозе, длительную утрату трудоспособности инфицированных людей, его значительную устойчивость в окружающей среде, способность к эпидемическому распространению и др, возбудитель был включен в «Перечень возбудителей (патогенов) человека, животных и растений, генетически измененных микроорганизмов, токсинов, подлежащих экспортному контролю в целях защиты национальных интересов и обеспечения выполнения международных обязательств Российской Федерации, вытекающих из Конвенции о запрещении разработки, производства и пополнения запасов бактериального (биологического) и токсинного оружия и об их уничтожении» (Указ Президента РФ №1004 от 8 08 2001)

В настоящее время род Francisella включает два вида - Francisella tula-rensis и Francisella philomiragia, а вид F tularensis представлен четырьмя подвидами - F tularensis subsp tularensis (тип A), F tularensis subsp holarcti-ca (тип В), F tularensis subsp mediaasiatica и F tularensis subsp novicida Четыре подвида заметно различаются по вирулентности и по месту выделения в различных регионах мира, однако имеют сходную антигенную структуру (Broekhuysen М et al, 2003, Sjostedt А, 2003, Titball R et al, 2003, Johansson A et al, 2004, Svensson К et al, 2005) Наиболее вирулентные изоляты возбудителя принадлежат к F tularensis subsp tularensis Хотя в настоящее время сфера распространения этого подвида ограничена Северной Америкой, сообщалось о выделении штаммов неарктического подвида в Европе (Gurycova D, 1998)

В последнее десятилетие эпидемиологическая и эпизоотологическая обстановка в России по туляремии оценивается как напряженная (Онищенко Г Г , 2001, 2002, Мещерякова И С , 1998, 2002, Горшенко В Р и др , 2001) Существование в естественных биоценозах стойких природных очагов туляремии, заметная тенденция к появлению новых эндемичных очагов объясняет необходимость проведения постоянного мониторинга за состоянием этих очагов с использованием комплекса бактериологических, серологических и генодиагностических методов исследования Занимая около 80% территории Юга России, природные очаги туляремии характеризуются исключительной стойкостью, циклическим проявлением активности, что обусловливает периодические подъемы заболеваемости К факторам, определяющим устойчивость природных очагов туляремии, относят полигостальность, поливектор-ность, множественность механизмов передачи возбудителя, его гидрофиль-ность (способность длительно сохраняться в водных экосистемах, особенно при низких температурах и, вероятно, в ассоциациях с беспозвоночными животными гидробионтами), а также возможность персистировать в организме восприимчивых животных (Олсуфьев НГ, и др 1969, 1970, 1979, Шеенко Н В и др ,2006) и во внешней среде

результате сохранения способности реверсировать в вегетативные вирулентные формы при изменении условий существования (Литвин В Ю и др , 1998, Colwell Ret al, 1986, Colwell R , Huq К , 1994) Используемые в лабораторной практике методы определения жизнеспособности бактериальных клеток (бактериологические) непригодны для выявления некультивируемых форм (НФ) бактерий в окружающей среде Между тем проблема НФ возбудителя туляремии представляет не только теоретический интерес, но имеет огромное практическое значение, поскольку эти формы, по-видимому, способны поддерживать существование возбудителя в окружающей среде в межэпизоотические (межэпидемические) периоды

В связи с этим возникла необходимость разработки новых, достаточно информативных методов обнаружения и идентификации туляремийного микроба, а также совершенствование тактики лабораторной диагностики в целом при эпизоотологическом надзоре за природными очагами туляремии

Все это обусловило настоятельную необходимость внедрения принципиально нового и важного направления, связанного с изучением разных аспектов адаптационной изменчивости туляремийного микроба, позволяющей ему сохраняться в объектах внешней среды в межэпизоотические (межэпидемические) периоды, а также разработкой новых методических подходов обнаружения и идентификации возбудителя туляремии как в лабораторных условиях, так и при исследовании объектов внешней среды активных природных очагов

Цель исследования: изучение феномена перехода возбудителя туляремии в некультивируемое состояние, в котором он может существовать в межэпизоотический период, исследование механизмов адаптации патогена к неблагоприятным условиям среды, разработка новых методических подходов к идентификации как типичных, так и атипичных штаммов F tularensis, включая его некультивируемые формы, с использованием молекулярно-биологических методов

Задачи исследования:

1 Выявить способность клеток туляремийного микроба к переходу в некультивируемое состояние

2 Изучить влияние искусственно созданных неблагоприятных условий внешней среды на способность перехода туляремийного микроба в некультивируемое состояние

3 Изучить влияние стрессовых факторов (голодание, тепловой, осмотический и солевой стресс) на основные свойства возбудителя туляремии

4 Сконструировать ДНК-зонд для идентификации возбудителя туляремии

5 Сконструировать специфические праймеры для индикации возбудителя туляремии в ПЦР

6 Апробировать методы ДНК - зондирования и ПЦР - анализа для детекции и идентификации атипичных штаммов F tularensis, включая некультивируемые формы возбудителя

7 Подобрать универсальные (случайные) праймеры для исследования генома туляремийного микроба в системе однопраймерной ПЦР

8 Определить место ПЦР в системе эпидемиологического надзора за туляремией (молекулярно - биологический уровень эпидемиологического надзора)

9 Усовершенствовать тактику лабораторной диагностики при эпидемиологическом надзоре за туляремией

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые описан феномен перехода возбудителя туляремии в некультивируемое состояние под влиянием условий внешней среды Показано, что ревертанты некульти-вируемых форм туляремийного микроба восстанавливают свои основные свойства, в том числе и вирулентность Существование таких покоящихся форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и его адаптации к неблагоприятным условиям среды Определено, что возбудитель туляремии наделен важной для персистенции адаптивной пластичностью, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды Предложен комплекс молекулярно-биологических приемов для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии Сконструирован и апробирован ДНК-зонд для идентификации ^ шЫгетгв, сконструированы специфические праймеры для индикации возбудителя туляремии Подобраны универсальные (случайные) праймеры для изучения генома (ПЦР-типирование, геномотипи-рования, генотипирование) туляремийного микроба в системе однопраймерной ПЦР С помощью этих праймеров показана генетическая гетерогенность штаммов представителей рода РгапсиеПа Впервые определено место ПЦР в практике эпизоотологического и эпидемиологического надзора за туляремией в природных очагах Метод ПЦР при условии низкотемпературного хранения проб полевого материала повышает эффективность эпизоотологического мониторинга территорий, так как обеспечивает возможность ускоренного предварительного отбора положительных проб для последующего целенаправленного бактериологического анализа, а также дает возможность обнаружения туляремийных микробов, находящихся в некультивируемом состоянии, в котором они персистируют в окружающей среде в межэпизоотический период

Наше исследование позволило предложить новый комплекс информативных методов обнаружения и идентификации как типичных, так и измененных форм туляремийного микроба, усовершенствовать тактику лабораторной диагностики при эпизотоологическом надзоре за природными очагами туляремии Проведенные эксперименты по стрессовым воздействиям можно рассматривать как моделирование определенных экологических ситуаций, в которые попадает Рш1агепш во время пребывания во внешней среде, а также его возможности для выживания Они позволяют лучше понять экологию возбудителя вообще и его поведение в стрессовых условиях, в частности, выявить факторы внешней среды, вызывающие индукцию некуль-тивируемых форм у туляремийного микроба, что важно для объективного прогнозирования состояния природных очагов туляремии и определения

объема профилактических мероприятий, необходимых для предупреждения возникновения эпизоотических и эпидемических осложнений

Практическая значимость. Результаты исследований оформлены, утверждены и нашли свое отражение в следующих документах

-В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован штамм - продуцент плазмидной ДНК Е coli JM103 pRD6-KM7, Саратов, 1988

- Оформлена инструкция по изготовлению и контролю препарата ДНК -зонда для диагностики возбудителя туляремии, Ростов-на-Дону, 1990 (одобрена Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 14 05 90, протокол №6)

- Получено авторское свидетельство « Рекомбинантная плазмидная ДНК pRD6 - источник зонда для тестирования представителей рода Francisella, штамм бактерий Echerichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pRD6 - источник зонда для тестирования представителей рода Francisella», М , №1669981, 1991

-Предложены «Методические рекомендации по использованию ПЦР для генотипического скрининга штаммов Francisella tularensis», Ростов-на-Дону, 1994 (одобрена Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 11 07 94, протокол №6)

-Методические рекомендации «Детекция туляремийного микроба методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью родоспецифических праймеров», Ростов-на-Дону, 1997 (одобрены Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 19 07 97, протокол №5)

- Методические рекомендации «Использование метода ПЦР для детекции Francisella tularensis», Саратов, «Микроб», 1998

- «Методические рекомендации по получению некультивируемых форм туляремийного микроба», Ростов-на-Дону, 1999 (одобрены Ученым Советом и утверждена директором РПЧИ 24 12 99, протокол №5)

-Методические рекомендации «Совершенствование эпидемиологического надзора и тактики лабораторных исследований при эпидемиологическом мониторинге природных очагов туляремии», Ростов-на-Дону, 2000 (одобрены Ученым Советом и утверждены директором РПЧИ 5 04 00, протокол №3)

Предложения и рекомендации используются в работе лабораторий различных противочумных учреждений (лаборатория туляремии РНИПЧИ, зоо-лого-паразитологический отдел ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Ростпотребнадзора, Ставропольский НИПЧИ, Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока и др), а также при чтении лекций на курсах специализации и усовершенствования врачей и лаборантов по ООИ при Ростовском ПЧИ Акты внедрения представлены в приложении

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Возбудитель туляремии под воздействием стрессовых условий окружающей среды способен обратимо переходить в некультивируемое состояние, что должно обеспечивать ему возможность персистировать в окружаю-

щей среде в межэпизоотический период Полученные ревертанты некульти-вируемых форм туляремийного микроба сохраняют свои основные дифференциально-диагностические свойства, в том числе и вирулентность Факт существования некультивируемых форм туляремийного микроба имеет прямое отношение к резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды

2 Возбудитель туляремии наделен исключительно важной для перси-стенции адаптивной пластичностью, что проявляется в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды Возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, который сопровождается заметной перестройкой его метаболизма и структуры хромосом

3 С помощью современных молекулярно-генетических технологий, включающих клонирование, зондирование и ПЦР-анализ подобран комплекс молекулярно-биологических методических приемов для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии Сконструированный ДНК-зонд, а также полученные на его базе специфические праймеры позволяют выявлять туляремийный микроб в ПЦР как в чистой культуре, так и в смеси культур с другими микроорганизмами ОП-ПЦР с универсальными праймерами позволяет осуществлять генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба, идентификацию штаммов на межродовом и внутривидовом уровне и демонстрировать их генетическое разнообразие

4 ПЦР-анализ в силу своей чувствительности и специфичности позволяет использовать его в качестве надежного инструмента в системе эпидемиологического надзора за туляремией Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим и иммуно-серологическими методами, а также криоконсер-вированием при исследовании различных компонентов паразитарной системы и абиотических объектов позволяет оперативно получать эпидемиологически значимую информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага или защиты общества от угрозы биологического нападения

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных конференциях

Актуальные проблемы профилактики туляремии Симферополь, 1991 Актуальные проблемы особо опасных и природноочаговых инфекционных болезней Иркутск, 1994 Актуальные проблемы разработки мед средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил Санкт-Петербург, 1994 Актуальные проблемы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний Ставрополь, 1994 7 European Congress of Clinical Microbiology and Infection Diseases Vienna, 1995 Научно-производственная конференция, поев 100-летию образования противочумной службы России Саратов, 1997 Second International Conference of Tularemia Hradec Kralove, 1997, Чехия Всероссийская конференция - ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний Москва, 1998 Всероссийская конференция - Гомеостаз и инфекционный процесс Саратов, 1998 Природноочаговые инфекции в России Современная эпидемиология,

диагностика, тактика защиты населения Омск, 1998 I Всероссийская научно-практическая конференция - Генная диагностика ООИ Саратов, 2000 VL Российско-Итальянская научная конференция Инфекционные болезни Диагностика, лечение, профилактика Москва, 2000 9 International Congress for Culture Collection Bnsban (Australia), 2000 Актуальные вопросы ООИ Нальчик, 2000 3 International Conference on Tularemia Umea (Sweden), 2000 Российская научно-производственная конференция Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг Москва, 2002. 4 International Conference on Tularemia The Assembly Rooms, City of Bath, United Kingdom, 2003 Медицинская микробиология - XXI век Саратов, 2004 Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств Оболенск, 2006

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 (19 из них в центральной печати и в материалах международных конференций) работы, подготовлено 6 нормативно правовых документов Исследования выполнены в течение 1990-2004 годов в рамках 5 плановых научных тем (номера государственной регистрации 01 93 0 003258, 01 9 50 003708, 01 9 70 009328, 01 9 70 009332, 01 200 1 15561), в которых автор являлся соруководителем или ответственным исполнителем

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 298 листах машинописного текста, состоит из Введения и 5 глав, включающих обзор литературы и результаты собственных исследований, заключения, выводов и приложения Работа иллюстрирована 15 таблицами и 35 рисунками Указатель литературы включает 601 источник, из них 234 отечественных и 367 иностранных авторов

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы

Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали штаммы F tularensis, неарктического, среднеазиатского и голарктического подвидов а также штаммы Fnovicida, F novicida-like и F philomiragia (любезно предоставленные И С Мещеряковой), штаммы бактерий родов Yersinia, Vibrio, Escherichia и др из музея живых культур РПЧИ

Методы. В разделе содержится описание бактериологических методов, использованных при выделении, культивировании и изучении свойств микроорганизмов, молекулярно-биологических методов выделения плазмидной и хромосомальной ДНК, гибридизации ДНК, рестрикционного анализа, ПЦР, а также биохимических методов и методов изучения фагоцитоза Эпидемиологические проявления туляремии изучены по периодам, выделенным в соответствии с действующими на момент исследования «Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии» (М , 1983)

Статистическую обработку материала проводили на ПЭВМ Pentium Intel Рюпег с помощью программ АРМСТАТ, Exell 7 0 и FoxPro 2 6 5

2. Результаты молекулярно - биологических исследований Francisella tularensis

Молекулярное зондирование. Методом молекулярного клонирования на основе вектора pUC19 была сконструирована рекомбинантная плазмида с EcoRI-фрагментом ДНК размером в 800 п н, комплементарным видоспеци-фическому участку хромосомной ДНК туляремийного микроба Из случайно отобранных клонов с наименьшей подвижностью плазмид при электрофорезе по сравнению с исходным вектором pUC19 была отобрана молекула со встроенным EcoRI-фрагментом длиной 800 пн Плазмиду обозначили как pRD6

В результате определения первичной структуры клонированного EcoRI-фрагмента ДНК F tularensis и проведенного компьютерного анализа нуклео-тидной последовательности построена физическая карта фрагмента по сайтам узнавания для 34 рестриктаз, определен GC-состав клонированного участка ДНК Содержание GC составило 34,8%, причем распределение GC-nap по длине фрагмента оказалось неравномерным с явно выраженным минимумом в средней части, доходящим до 28% и ниже Содержание GC-nap у изученного фрагмента является аномально низким, тогда как для большинства грамотрицательных микроорганизмов оно в среднем составляет 50-55% и лишь у немногих неродственных видов снижается до 35-40% (Harnes В et al ,1985) Вероятно, подобное низкое GC-содержание является особенностью клонированного фрагмента На исследованном участке идентифицированны три потенциальных промотора, сходных с консенсусной последовательностью промотора кишечной палочки (85%, 89%, 85%, соответственно), на небольшом расстоянии за которыми находились последовательности, гомологичные последовательностям Шайна-Дальгарно, и ATG-кодоны Транслируемые с этих инициирующих кодонов аминокислотные последовательности не прерывались стоп-кодонами до 3 -конца фрагмента

При сравнении локализации первичной структуры полученного Eco RI-фрагмента ДНК туляремийного микроба в пределах недавно прочитанной полной нуклеотидной последовательностью хромосомной ДНК F tularensis Schu (Larsson P et al, 2005) удалось определить его местоположение (рис 1) Наш EcoRI фрагмент расположен между 550 000 пни 560 000 п н хромосомы возбудителя туляремии в области гена бифункционального белка - глута-редоксина 3

В составе фрагмента ДНК, специфичном для представителей F tularensis, удалось обнаружить структуру, весьма напоминающую IS-подобный элемент При анализе EcoRI -фрагмента pRD6 были выявлены образования, характерные как для IS-элемента, так и для «генетического переключателя» (рис 2)

'ЭМ*«*:.® 3 СМашкш! С1)5_216 ^ Шфтопе Ью$угйЬе815 ргоЫп

"" „ у

I икая» мотУАоМШ® ~ ЕсоКиррагмект 1

рПМ \ 560 ООО п.н.

Рис. 1. Локализация ЕсоШ фрагмента на физической карте хромосомы туляремийного микроба.

Участок последовательности с 295 по 672 нуклеотид несет по концам несовершенные инвертированные повторы из 17 нуклеотидных пар и имеет в пяти рамках считывания из шести возможных большое количество стоп-кодонов. В оставшейся рамке нет ни одного терминируюшего кодона и находится последовательность, имеющая высокую степень гомологии с обобщенным промотором Е.соИ. Кроме того, этот участок фланкирован прямым совершенным повтором в 9 п.н., что характерно для 18-элементов, которые удваивают небольшой участок ДНК в области встраивания.

# # # I # #

# #

т т

а а т с

А А

А-Т

6- С А

А-Т А Т :

А-Т С-6

А-Т Т 5-с :

в-с е Т/

А-Т

Б*Т

Т-А

а-с

А-Т

А-Т С А „.г

С-8 С А

с с

А-Т 681

Т А-Т Т в 6 Т А А А А Т

Рис. 2. Фланкирующий совершенный и концевой инвертированный несовершенный повторы предполагаемого мобильного элемента ЕсоЮ-фрагмента р1Ш6. Взаимодействие между основаниями: - -уотсон-криковское; *-неуотсон-криковское.

Перечисленные особенности позволяют с определенной долей вероятности утверждать, что представленный участок ДНК несет характерный для F tularensis мобильный генетический элемент, который может выполнять различные функции, включая функцию генетического переключателя В случае, если рассмотренная структура является реальным мобильным элементом, ко-пийность которого на хромосоме может варьировать, становится понятным описанное ниже различие в гибридизационном сигнале между F tularensis и F novicida Этот факт может дополнительно свидетельствовать в пользу самостоятельности вида F novicida

EcoRI фрагмент был использован в качестве ДНК зонда для тестирования Francisella spp Результаты гибридизации приведены в табл 1, из которой следует, что с зондом гибридизовались только 171 штамм представителей F tularensis (ДНК F novicida давала сигнал в 2 раза слабее) и не взаимодействовали представители других близкородственных (Brucella spp) и отдаленных видов микроорганизмов, что позволяет использовать этот зонд для ви-доспецифического тестирования франсисел

Следует отметить, что при переносе по Саузерну разделенных с помощью электрофореза в геле агарозы гидролизованных по EcoRI препаратов ДНК F novicida и F tularensis (неарктический, среднеазиатский и голарктический подвиды) с последующей гибридизацией с ДНК-зондом, расположение комплиментарных зонду последовательностей ДНК для различных подвидов было разным, что объясняется отличиями в структуре хромосом сравниваемых подвидов Чувствительность ДНК-зонда на модели клеток штамма F tularensis 15/10 составила 5Х104-6Х105 микробных клеток на пятно, или 5Х107-108 кл/мл, что является обычным для данного метода исследования

ДНК-зонд был использован при сравнительном исследовании биологических свойств коллекции штаммов F tularensis, выделенных в 1987-1998 гг в различных регионах Советского Союза В работе использовали 171 штамм F tularensis, выделенный из различных источников в разных районах СССР в 1987-1989 гг, а также 3 музейных штамма голарктической, среднеазиатской и неарктической разновидностей (503, 543 и Schu, соответственно), изолированных более 20 лет назад География выделения использованных в работе штаммов туляремийного микроба оказалась обширной и была представлена, в частности, Ленинградской, Ростовской, Одесской, Крымской областями, Калмыцкой АССР, а также Средней Азией (Казахской ССР) и Сибирью (Иркутская область)

Сконструированный на основе фрагмента хромосомы F tularensis 15/10 зонд давал положительные результаты со всеми штаммами F tularensis собранной коллекции вне зависимости от географии их выделения

Ранее в лаборатории туляремии РостНИПЧИ была получена и охарактеризована коллекция авирулентных бескапсульных и капсулодефицитных мутантов F tularensis (15 штаммов) (Павлович НВ и др, 1993, Sorokin V, 1997) Такие варианты возбудителя туляремии были авирулентны для высоко чувствительных лабораторных животных (белые мыши, морские свинки и

кролики) и обладали измененной антигенной структурой (отрицательные результаты в РНАт с коммерческим диагностикумом) (Павлович Н В , 1993)

Таблица 1

Результаты гибридизации микроорганизмов разных видов с ДНК-зондом _для тестирования представителей РгапахеИа ш1агегних_

Вид микроорганизмов Кол-во Гибридизация с

штаммов ДНК-зондом

Francisella tularensis (представители 171 ++++

голарктического, неарктического

и среднеазиатского подвидов)

Francisella novicida 1 ++

Francisella philomiragia 1 -

Escherichia coli 26 -

Yersinia pestis 6 -

Yersinia pseudotuberculosis 13 -

Yersinia enterocolitica 22 -

Yersinia kristensenn 5 -

Yersinia intermedia 2 -

Vibrio cholerae 13 -

Pseudomonas aeruginosa 2 -

Pastereulla multocida 2 -

Klebsiella pneumonia 2 -

Alcaligenes faecalis 2 -

Proteus vulgaris 2 -

Bacillus subtilis 2 -

Salmonella paratyphi 2 -

Shigella dysentheriae 2 -

Brucella melhtensis 2 -

Brucella abortus 2 -

Brucella suis 2 -

Sarcina flava 2 -

Streptococcus pyogenes 1 -

Streptococcus aureus 1 -

Нельзя исключить, что появление таких форм бактерий в природных условиях может пройти незамеченным при эпизоотологическом обследовании, так как биологический и иммунологический методы диагностики мало эффективны для их детекции В связи с этим важным и интересным представлялась апробация разработанного нами зонда для выявления таких измененных форм возбудителя Зондирование проводили как с типичными, так и с измененными штаммами туляремийного микроба (коллекция из 15 бескап-сульных и капсулодефицитных авирулентных мутантов F Ш1агет1я трех основных подвидов, были любезно предоставлена Н В Павлович, лаборатория туляремии, РостНИПЧИ) Как оказалось, ДНК-зонд гибридизовался как с типичными штаммами, так и полученными измененными (бескапсульными) вариантами этих штаммов Таким образом, ДНК-зондирование, проведенное на репрезентативной коллекции природных (типичных) и измененных (атипич-

ных) штаммах Т7 ийагеп.чич, показало его перспективность для детекции и идентификации туляремийного микроба

Таким образом, скоструирована рекомбинантная плазмида рШЭб с ЕсоМ-фрагментом ДНК размером в 800 п н, комплементарным видоспеци-фическому участку хромосомной ДНК туляремийного микроба Построена физическая и функциональная карты клонированного участка ДНК Плазмида несет фрагмент ДНК, который может служить зондом для эффективного обнаружения франсисел, выявляя при этом только штаммы Р ш1агеш и не взаимодействуя с представителями других близкородственных и отдаленных видов микроорганизмов ДНК-зондирование сыграло важную роль на этапе идентификации возбудителя и позволила приступить к разработке вопросов генотипирования штаммов

ОП - ПЦР - генотипирование

В своих исследованиях мы осуществили генотипирование штаммов различных микроорганизмов (молекулярное типирование) с различными универсальными, или случайными, праймерами в однопраймерной ПЦР (ОП-ПЦР или ЯАРБ) Характерно, что каждый праймер дает различные картины распределения продуктов ПЦР в геле, что обеспечивает ему потенциальную способность к детекции различий между штаммами В своих исследованиях по генотипированию возбудителей особо опасных заболеваний и их бактериофагов (данные не представлены) мы использовали преимущественно од-нопраймерный вариант ПЦР и набор случайных праймеров (1,2,9,15, 21,45, Д9А) Оказалось, что все взятые праймеры в использованных для отжига условиях могли относительно неспецифически связываться с большим числом сайтов на ДНК - мишени и образовывать множество ПЦР - продуктов в виде дескретных фрагментов

Приобретенный опыт работы с ОП-ПЦР и универсальными праймерами позволил осуществить генотипическую характеристику штаммов Р Магети Наиболее информативными оказались прамеры №15, №21, №45 и Д9А Использовали 49 штаммов - Р Ыагетк йиЬяр ш1агетич (биотип А) (3 штамма) и Р Ш1агет1я яиЬзр 1ю1агсПса (биотип В) (40 штаммов), Р Нйагеп-т ьиЬхр теЛаазШгса (6 штаммов), один штамм Р по\т<1а (получен в 1956 г из Гамильтоновского института, США) и штаммы различных микроорганизмов из МЖК РостНиПЧИ Для характеристики геномов возбудителя туляремии мы воспользовались модифицированной методикой постановки ПЦР (Булат С А и др , 1990,1991) Исследование возможности ее применения в нашем случае показало способность каждого из использованных праймеров эффективно амплифицировать отдельные участки генома различных штаммов возбудителя туляремии (рис 3), что проявлялось в виде 9 - 10 мажорных полос размером от 300 до 5000 п н

Для праймера № 15 (рис За) было отмечено, что расположение, характер и интенсивность свечения ампликонов ДНК неарктического и среднеазиатского подвидов отличались только по наличию полос в области 4000-2000 п н, в остальном они были практически одинаковы

Рис. 3. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР с использованием ДНК из клеток штаммов F. tidarensis и олигонуклеотида № 15 (а). 21 (о) и Д9А (в): 1 - штамм Schu', 2- 261; 3 -nevada (биотип А, неарктического происхождения); 4 - 543; 5 - 240; 6 - 150 (среднеазиатского происхождения); 7 - 503: 8 - 1182; 9 - 822; 10- 250 (биотип В, голарктического происхождения); 11 -F.novicida; 12-Р8Н-гидролизат фага X.

Резкое отличие наблюдали между ампликонами ДНК представителей этих двух подвидов и ампликоном ДНК представителей голарктического подвида, которое заключалось в постоянном присутствии и повышенной степени выраженности в ДНК первых подвидов мажорного фрагмента размером в 300 п н Различия были обнаружены также в ампликонах штамма F novici-da, который характеризовался появлением дополнительных полос размером около 600 и 450 п н Та же закономерность подвидовых различий прослеживалась и при использовании праймеров 21 (рис 36) и 45 Использование праймера Д9А позволяло осуществлять межвидовую дифференциацию штаммов (рис Зв) так, штамм F novicida характеризовался наличием фрагмента ДНК в 500 п н, отсутствующим у представителей F tularensis У F novicida отсутствовали также фрагменты в 5000 и 1700 п н , наблюдаемые у F tularensis

Проведенное исследование показало возможность использования ОП-ПЦР для реальной демонстрации генотипической гетерогенности штаммов туляремийного микроба Использованный прием позволяет выявлять различия в исследованной коллекции штаммов F íularensis , которая четко делилась на четыре группы, первая - штаммы неарктического, вторая - среднеазиатского подвидов, третья - штаммы голарктического подвида, четвертая -F novicida

ПЦР: детекция представителей Francisella tularensis

Для детекции представителей F tularensis в ПЦР мы использовали набор специфических праймеров Основанием для выбора нуклеотидной последовательности праймеров явилось осуществленное нами ранее клонирование и детальное изучение фрагмента ДНК размером в 800 п н , комплементарного видоспецифическому участку хромосомной ДНК туляремийного микроба и успешно использованному в качестве ДНК-зонда для идентификации большой группы штаммов представителей F tularensis Анализ структуры позволил выбрать и сконструировать для ПЦР синтетические олигонуклеотидные праймеры "прямой" - F1 (22 п н ), 5'-АСА TAC AAG ССТ ТТТ ААС ТАТ С-3' и "обратный" - F2 (21 п н ), 5'-TTG АТС ATA ATA GTT CTG ACC-3' Как показали результаты исследований (рис 4), праймеры F1 и F2 были способны эффективно амплифицировать последовательности хромосомной ДНК туляремийного микроба, что выражалось в появлении в геле полосы ожидаемого размера в 210 п н С целью изучения специфичности выбранной пары праймеров (Fl + F2) их использовали для анализа других микроорганизмов, которые исследовали как индивидуально, так и в смеси с различными количествами ДНК возбудителя туляремии Оказалось, что праймеры позволяли амплифицировать ДНК только F tularensis и F novicida и не амплифицировали ДНК из других видов бактерий Следует отметить, что присутствие разных концентраций (до 1 мкг на пробу) ДНК гетерологичных бактерий на результаты амплификации не влияло

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 4. Анализ продуктов ПЦР с ДНК штаммов F. tularensis

и специфических праймеров FI и F2: 1-штамм Schu- 2 - 261; 3 - 543; 4 - 240; 5 - Mspl-гидролизат ДНК pUC19; 6 - 503; 7-250; 8- 1182; 9 - 1510; 10-LVS; 11 - F.novicida\ 12 - ДНК pRD6.

Интересными оказались результаты изучения возможности использования специфических праймеров в ПЦР при обнаружении возбудителя в крови и тканях зараженных биопробных животных.

Приведенные результаты свидетельствуют, что сконструированные нами праймеры специфически амплифицировуют ДНК туляремийного микроба и пригодны для детекции представителей F. tularensis.

Таким образом, показана возможность использования одно - и двух-праймерной ПЦР как для детекции, так и генетического типирования штаммов туляремийного микроба. С помощью сконструированных праймеров (Fl и F2) удается идентифицировать до 100 клеток туляремийного микроба в чистой культуре, в смеси культур с другими патогенными микроорганизмами и в органах зараженных биопробных животных. Универсальные (случайные) праймеры позволяют осуществлять генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба и идентификацию штаммов на межвидовом и внутривидовом уровне, а также демонстрировать их генотипическую гетерогенность.

3. Некультивируемые формы возбудителя туляремии

Для индукции некультивируемого состояния у клеток штаммов F. tularensis Sehn, 503 и 543, а также F. novicida, F. novicida-Пке, F. philomiragia использовали флаконы со стерильной деионизированной водой с 0,15 М NaCI, так как помещение клеток в воду без NaCl сопровождалось резким, «обвальным» снижением числа жизнеспособных клеток уже через сутки, независимо от испытуемого штамма и температуры инкубации колб.

Обнаружено, что высеваемость клеток различных штаммов туляремийного микроба на плотных питательных средах прекращалась при инкубации при различных температурах и в разные сроки наблюдения по-разному. Так,

для штаммов F tularensis Schu , 543 и 503 рост микроба на Т-агаре из колб, инкубируемых при 37°С, прекращался уже на 6 сутки, при 28°С - на 14 сутки, а из колб, содержавшихся при 4°С, только на 28-48 сутки На 48 сутки эксперимента все колбы помещали в условия холодильника (4°С) В течение 130 суток (срок наблюдения) при высеве на плотные питательные среды роста не наблюдали, хотя в ПЦР постоянно регистрировали положительный результат, свидетельствовавший о присутствии недеградированной ДНК F tularensis

Для штаммов F novicida и F novicida-like рост клеток, инкубированных при 37°С, прекращался на 8-20 сутки, при 28°С - на 20-92 сутки (соответственно), а при 4°С культуру высевали весь срок наблюдения

Для штамма F philomiragia рост клеток из колб, инкубированных при 37°С, регистрировали на протяжении всего срока исследования. По-видимому, штаммы F.novicida, F novicida-like и F philomiragia более адаптированы к резко меняющимся условиям существования в воде (Кормилицина МИ идр, 1994)

Добавление необходимых для роста F tularensis аминокислот (аргинин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, пролин, треонин, гистидин, валин, цис-тин, цистеин, серин, тирозин, аспарагиновая кислота) (Майский В Г и др ,1984) не влияло на скорость перехода возбудителя в НС.

Для оценки метоболического состояния клетки штамма F tularensis Schu, содержавшиеся при 37° и 28°С в деионизированной воде с 0Д5М NaCl, метили 14С-глюкозой Отбор проб для ПЦР и регистрацию включения метки осуществляли на 1-14-23-43 и 87 сутки Контакт клеток с меткой продолжался 1-5-10-20-44 суток, соответственно (рис 5) Отмечено возрастание включения метки клетками туляремийного микроба на 23 и 43 сутки наблюдения (инкубация при 28°С), что свидетельствовало в пользу жизнеспособности клеток, хотя культура на плотных питательных средах в эти сроки уже не высевалась Это заключение подтвердилось и результатами авторадиографии гелей после электрофоретического разделения белков лизатов тех же клеток.

При электронно-микроскопическом изучении взвеси исходной культуры штамма F tularensis Schu было обнаружено, что она представлена преимущественно клетками круглой или слегка овальной формы, имеющих размеры от 0,4 до 1,2 мкм В ряде случаев наблюдали конгломераты из структур различной формы и размера, представленные, по-видимому, подвергнувшимися автолизу клеточными элементами В целом, электронно-микроскопические данные указывают, что при индукции НФ туляремийного микроба в данных условиях эксперимента, образуются так называемые формы несбалансированного роста, относящиеся, вероятно, к начальным этапам L-трансформации (Прозоровский С В и др , 1981)

Получить ревертанты туляремийного микроба из НФ простым посевом на богатые питательные среды, как описано (Fields Р et al, 1989, Nilsson Н et al, 1991), не удалось Высевы при этом производили в разные сроки в Т-бульон с 5% фетальной сыворотки и без нее, простым посевом и с предвари-

тельной температурной индукцией (43°С) из проб после прекращения роста клеток на Т-агаре.

14 23 сутки

Рис.5. Включение радиоактивной метки [14С-глюкоза] клетками штамма/7. tularensis Schu в процессе перехода в некультивируемое состояние.

Реверсию НФ F. tularensis в исходное состояние удалось получить при использовании модели чувствительных животных только для вариантов, перешедших в некультивируемое состояние при 4° и 28°С. При подкожном заражении белых мышей 0,1 мл НФ-4°С и НФ-28°С штаммов F. tularensis Schu и 543 (69 сутки инкубации при 4°С и 28°С после перехода в некультивируемое состояние) животные погибали на 7-10 сутки с выделением культуры. НФ-37°С гибели животных не вызывали. При заражении белых мышей культурой (92 сутки инкубации при 4°С и 28°С после перехода в некультивируемое состояние) мыши стали погибать (на 20-25 сутки). При последуюших пассажах (суспензии из органов павших мышей) сроки падежа биопроб сократились до 3-5 суток. В обоих случаях была выделена культура F. tularensis. Складывается впечатление, что содержание клеток при 28° и 37°С сопровождается более глубокими изменениями, на устранение которых требуется больше времени и определенные условия.

Таким образом, в результате комбинированного стрессового воздействия - голодания и низкой температуры туляремийный микроб может переходить в «некультивируемое» состояние, в котором он персистирует в окружающей среде (микрокосме) в межэпидемический период. Следует указать на гетерогенность возникающих при этом НФ, обусловленную, видимо, сочетанием факторов окружающей среды (Макаров A.A. и др., 1998). Так, для возбудителя туляремии его адаптация к неблагоприятным условиям и адекватная перестройка метаболизма лучше происходит в условиях низкой температуры. Переход в НФ возможен и при иных, например, более высоких

температурах, однако условия реверсии при этом остаются, по крайней мере, не выясненными

Метод ПЦР со специфическими праймерами был использован для обнаружения возбудителя туляремии в пробах полевого материала (вода, солома, органы животных, кровососущие насекомые и др), собранного при плановом эпизоотологическом обследовании степного и пойменно-болотного очагов туляремии в Ростовской области в весенне - летний и осенне - зимний периоды 1996 - 1998 г г Всего было исследовано более 400 проб биотических и абиотических объектов, из которых от 17 до 34% (в зависимости от сезона и типа природного очага) оказались положительными в ПЦР, хотя культуру удалось выделить только из 9 и 15 объектов Расхождение результатов в использованных методах исследования можно объяснить персистированием туляремийного микроба в окружающей среде в виде некультивируемых форм (НФ), детекция которых традиционными способами оказывается практически не возможной Подтверждением существования туляремийного микроба в окружающей среде в НФ могут служить результаты наших исследований с положительными в ПЦР образцами, но не вызвавшими гибели биопробных животных в определяемые инструкцией сроки (15 суток) Заражение белых мышей такими пробами не вызвало гибели животных в течение 15-28 суток Однако положительный результат в ПЦР экстрактов из селезенок умерщвленных биопробных животных послужил ориентиром для продолжения пассажей Таким способом после 3-5 пассажей удалось выделить культуру ^ Ыагети из 25 объектов Полученные данные являются, на наш взгляд, весомым аргументом в пользу необходимости изменения методических подходов в практике эпизоотологического обследования природных очагов на туляремию Наиболее перспективным в этом случае представляется метод ПЦР Этот метод может оказаться особенно важным для повышения эффективности эпизоотологического мониторинга территорий, так как обеспечивает возможность ускоренного предварительного отбора положительных проб для последующего целенаправленного бактериологического анализа, а также дает возможность обнаружения туляремийных микробов, находящихся в «некультивируемом» состоянии, в котором возбудитель персистирует в окружающей среде в межэпизоотийный период Таким образом, некультиви-руемое состояние туляремийного микроба следует рассматривать как реальную форму его существования в почвенных и водных экосистемах

Так как переход в НС у туляремийного микроба происходит в ответ на стрессовые условия окружающей среды, представлялось необходимым более полно исследовать эти условия Поэтому мы остановились на тепловом и осмотическом (солевом) стрессах, как наиболее вероятных, которые испытывают микроорганизмы при попадании в окружающую среду

4. Стрессовый ответ у возбудителя туляремии.

Тепловой стресс у возбудителя туляремии

Клетки штаммов ^ ш1агетк неарктического, среднеазиатского и голарктического подвидов, а также штамм F п(тас1а выращивали на Т - агаре

(37°С), отмывали физиологическим раствором, суспендировали в свежей порции Т-бульона и инкубировали в статических условиях при определенных значениях температуры (10°С, 28°С, 37°С и 43°С) Через 18 часов число жизнеспособных клеток определяли посевом на плотные питательные среды В наших условиях эксперимента при температуре 37°С и 28°С отмечено возрастание числа жизнеспособных клеток, при 10°С их число оставалось стабильным, а при 43°С число жизнеспособных клеток снижалось и составляло примерно 3-5% для штаммов неарктического и среднеазиатского подвидов и 8-10% - для европейского от количества внесенных в пробу Для штамма F novicida при использованных температурах выращивания число жизнеспособных клеток оставалось примерно одинаковым, видимо, из-за состояния стаза, сопровождающегося прекращением клеточного деления (Водопьянов СО и др , 1993) Тем не менее, биосинтетические процессы у подвергнутых тепловому стрессу клеток, протекали активно, что удалось подтвердить путем введения в стрессированные клетки смеси [14С-] аминокислот и последующего выявления меченных полипептидов Полученные данные свидетельствуют (рис 6), что при температуре 10°С включение метки не происходит (за данный промежуток времени), тогда как при повышении температуры туляремийный микроб способен к индукции стрессового ответа Это выражается в ингибиции общего белкового синтеза и в нарастании интенсивности радиоактивной белковой полосы с молекулярной массой в районе 60-70 кДа Белок с такой подвижностью регистрировали и у культур, меченных в условиях макроорганизма в диффузионных камерах (рис 7) В качестве экспериментальной модели использовали морских свинок, которым подкожно имплантировали диффузионные камеры с диаметром пор 0,22 микрон, заполненные взвесью вакцинного 1510 и вирулентного 543 штаммов туляремийно-го микроба В различные интервалы времени в камеры вводили смесь [ИС]-аминокислот, спустя сутки после этого содержимое камер анализировали методом гель-электрофореза с последующей радиоавтографией на наличие вновь синтезированных белков В содержимом диффузионных камер установлено резкое снижение числа жизнеспособных клеток вирулентного штамма возбудителя туляремии Так, к исходу первых суток после имплантации число живых клеток составляло 4%, а к исходу вторых - лишь 2,8% от числа первоначально внесенных бактерий Кроме того, обнаружен факт повышенной абсорбции клетками возбудителя туляремии белков плазмы крови (преимущественно альбуминов) Анализ радиоавтографов показал, что в условиях in vivo клетки возбудителя туляремии штамма 543 продуцируют мажорные полипептиды с молекулярной массой порядка 65, 70 и 90 кДа (рис 7) Полипептиды с такой же массой были выявлены в контрольных экспериментах in vitro при воздействии фактора теплового стресса (43°С) на клетки различных штаммов туляремийного микроба

Таким образом, установлено, что возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа в условиях т vivo и т vitro, который сопровождается заметной перестройкой белкового состава Повышение температуры приводит к индукции синтеза типичных для стрессового ответа полипепти-

дов, среди которых присутствуют возможные аналоги белков теплового стресса ОгоЕЬ и ЭпаК (Сео^ороиЬв С. ег а1, 1993).

Рис. 6. Радиоавтография белков различных штаммов возбудителя туляремии, меченных смесью 14С-аминокислот при различных температурах после электрофореза в градиентном геле БЭЗ-ПААГ и окраски Кумасси.

\-F.tularensis 5сйи-28°С; 2-&Ли-10°С; 3-РЛи1агеш1$ 543-42°С; 4- 543-37°С; 5-543-28°С; 6-543-10°С; 1-Р.1и1аге^ 15/10-42°С; 8-15/10-37°С; 9-15/10-28°С; 10-15/10-10"С; \\-Schu-28°С; 12-5сйи-37°С; 13-5сйи-42°С; \4-F.tularensis 503-10°С; 15-503-28°С; 16-503-37°С; 17-503-42°С; 18-Киоу|«</а-10°С; 19-^.«оу;сйа-28°С; 2й-Р.гита<1а-ЪТС; 21-Киоу/е^а-42°С.

1 2 3 4 5 кЭа

Рис. 7. Радиоавтография стрессовых белков возбудителя туляремии в условиях диффузионной камеры.

1-Контрольные клетки F.tularensis 543, меченные при 28°С, 2- 37°С, 3- 42 "С; 4-Содержимое диффузионной камеры (первые сутки инкубации); 5-Содержимое диффузионной камеры (вторые сутки инкубации).

Известно, что белки стрессового ответа характеризуются высоким уровнем консерватизма, а нативный шаперон GroEL кишечной палочки является высокомолекулярным полимером, который построен из 14 идентичных белковых субъединиц с молекулярной массой около 60 кДа (Neidhardt F. et al, 1987; Ericsson M. et al., 1994). Для выделения GroEL из клеток туляремийного

микроба мы использовали методику, успешно использованную для очистки GroEL из клеток чумного микроба (Водопьянов С.О. и др., 1996). В результате ионообменной хроматографии осветленного экстракта клеток вакцинного штамма 15/10 туляремийного микроба на ДЕАЕ-целлюлозе, белок, состоящий из субъединиц с массой 60 кДа, был выявлен во фракциях, элюирован-ных 0,2-0,ЗМ NaCl. Объединение этих фракций позволило получить неочищенный препарат, содержавший до 40% целевого продукта. Дальнейшая очистка предусматривала прием ультрафильтрации через ультрагель АсА 34 (LKB, Sweden). Практически весь белок, состоящий из субъединиц массой 60 кДа, выходил в составе первого пика в свободном объеме колонки. Объединенный материал первого пика содержал гомогенный препарат белка массой 60 кДа. Согласно данным литературы (Потоцкая И.В. и др. 1991), нативный GroEL белок на электронных микрофотографиях представляет собой характерную структуру из двух сочлененных колец, каждое из которых включает 7 субъединиц. При электронно-микроскопическом изучении полученного белка из F. tularensis 15/10 обнаружено большое количества надмолекулярных комплексов с характерной звездчатой структурой (рис. 8), причем оказалось, что раствор белка содержит крупные и мелкие частицы. К первым относится множество дискообразных частиц, имеющих центральное отверстие и звездчатый наружний контур (А), частицы второго типа представляют более крупные цилиндрические структуры (А и Б) и образующие их при ассоциации дискообразные частицы (Б, В, Г). В целом, особенности структурной организации частиц первого типа, а также их размеры и, прежде всего, диаметр центрального канала, согласуется с характеристиками олигомерных структур, образуемых стрессовым белком шапероном 60 кД (GroEL-СрпбО) (Потоцкая И.В. идр. 1991; Водопьянов С.О. и др., 1996; Ericsson ML et al., 1997).

Рис. 8. Электронная микроскопия олигомеров белка СгоЕЬ туляремийного микроба. А - мелкие дискообразные частицы звездчатой формы и крупные цилиндрические структуры (увеличение х 163 000); Б - блоки, составляющие крупную цилиндрическую структуру (увеличение х 173 600); В, Г - неассоциированные в цилиндр крупные дискообразные частицы (увеличение х 240 000).

Осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии

Найдено, что клетки возбудителя туляремии выдерживают значительную концентрацию хлористого натрия (до 4М NaCl) в течение 20 дней, что согласуется с данными литературы (Nano F , 1988), при этом солевой стресс сопровождается изменением содержания общих Сахаров Увеличение содержания Сахаров в 3-4 раза наблюдали у стрессированных клеток штаммов Schu , 543 и в 2-3 раза - у штамма 503 по сравнению с контрольными клетками, причем увеличение содержания Сахаров наблюдали как в результате выращивания клеток в среде с различным содержанием хлористого натрия в течение длительного времени, так и через 3 часа после приложения стрессовых условий (собственно солевой стресс)

При помещении клеток в условия высокого содержания соли отмечали также увеличение накопления глицинбетаина (таблица 2) В первые 4 часа инкубации в условиях стресса наблюдали увеличение содержания бетаина в пробах в 5,5 раз для штамма Schu и в 4,8 раз - для штамма 503 (концентрация соли 2,0-4,0 М) Через 8 часов инкубирования содержание бетаина было примерно одинаковым для штаммов обоих подвидов, а затем начинало снижаться Экзогенное внесение коммерческого препарата глицинбетаина несколько замедляло (до одной недели) сроки перехода клеток возбудителя туляремии в некультивируемое состояние

Таблица 2

Накопление глицинбетаина (шМ) клетками возбудителя туляремии __при солевом стрессе_

Штаммы Контакт с 0,15М 0,5М 1,0М 2,ОМ 4,ОМ

NaCl (час) NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl

Schu 4 154 256 256 684 855

8 239 384,6 341 598 596

12 171 171 341 470 598

503 4 214 341 341 940 1026

8 171 256 341 855 641

12 171 214 256 641 596

При электронномикроскопическом изучении стрессированных клеток туляремийного микроба штаммов Яс/ш и 503 по сравнению с контрольными были выявлены определенные различия в характере аутолитических изменений, которые выражались в той или иной степени нарушениях цитоплазма-тических структур При этом характер этих изменений лучше прослеживался у штамма &/ю На поверхности стрессированных клеток туляремийного микроба штамма БсНи обнаружен электронно - плотный слой, состоящий из хлопьевидного материала, включавшего мелкие плотные глыбки Значительное количество подобного материала наблюдали и между клетками В контрольных препаратах такого препарата на поверхности клеток было значительно меньше, а в межклеточном пространстве его не было вообще На поверхности стрессированных клеток штамма 503 слой глобулярного контрастного материала был выражен слабо, хотя количество хлопьевидного плотно-

го материала между клетками было почти таким же, как у штамма Sehn. Таким образом, с помощью электронно-гистохимического метода показано, что в условиях солевого стресса туляремийный микроб штамма Schu активно продуцирует «вещество», которое локализуется на наружней мембране и которое выявляется с помощью красителя, имеющего выраженные катионные свойства. В отличие от Schu штамм 503 в таких условиях это «вещество» активно не продуцирует.

Фагоцитоз туляремийного микроба, который проводили на перитони-альных макрофагах белых мышей, показал, что при воздействии осмотического (солевого) шока на клетки F. tularensis штаммов Schu и 503 (0Д5М-1М -2М NaCl) происходит повышение антифагоцитарной активности микробов. Одновременно наблюдали снижение значения ИЗФ (клетки Schu - с 0,002 до 0,2; клетки 503- с 0,03 до 0,3) и повышение % ПМ (Schu - с 92 до 95%; 503- с 90 до 95%). На захват микроорганизмов осмотический шок заметного влияния не оказывал, но стимулировал размножение стрессированных микробов внутри фагоцитов, что, как минимум, свидетельствует в пользу усиления патогенных свойств возбудителя.

При генотипическом изучении ДНК клеток туляремийного микроба в ОП-ПЦР с праймером №15 отмечены отличия в геноме стрессированных клеток (клетки подвергали стрессу в течение 4 часов) по сравнению с ин-тактными, что выражалось в изменении характера распределения полос ДНК-ампликонов, причем штамм американской разновидности отличался от штамма европейской разновидности явными перестройками хромосомы (рис.

9).

Рис. 9. ПЦР-профиль ДНК стрессированных клеток различных штаммов туляремийного микроба с праймером №15 (контакт клеток с солью в течение 3 часов при температуре 37°С). \-F.tularensis ЯсИи-0,15М №С1; 2-&/ги-0,5 М КаС1; 3-&/ги-1,0 М ЫаС1; 4-&/ги-2,0 М ЫаС1; 5-&/ш-4,0 М ЫаС1; 6-К503-0,15 М ЫаС1; 7-503-0,5 М ЫаС1; 8-503-1,0 М ЫаС1; 9503-2,0 М ЫаС1; 10-503-4,0 М ЫаС1; М-маркер молекулярных весов.

ДНК стрессированных клеток штамма БсИи изменила картину распределения амликонов исчезли минорные полосы в районе 1500, 700 и 450 пни появилась полоса в районе 300 п н Для штамма 503 таких наблюдений не отмечено Картина распределения ДНК-ампликонов при солевом стрессе была фактически одинаковой

Таким образом, возбудитель туляремии обладает устойчивостью (соле-толерантностью) к повышенным содержаниям в среде хлористого натрия В ответ на солевой стресс туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему адаптироваться к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать в почвенных и водных экосистемах в межэпидемические (межэпизоотические) периоды

5. ПЦР в практике эпизоотологического обследования и эпидемиологического надзора за туляремией (на примере Ростовской области)

В системе комплексного изучения природных очагов туляремии лабораторная диагностика имеет особое значение Информация о состоянии компонентов паразитарной системы в совокупности с информацией о показателях заболеваемости служит основой рационального планирования и осуществления мероприятий по борьбе с инфекционными болезнями, а в межэпизоотий-ный период позволяет оценить эффективность этих мероприятий

Лабораторными методами, позволяющими судить об инфицированности популяций носителей и переносчиков, а также контаминации абиотических объектов окружающей среды (экосистемный уровень), в настоящее время являются бактериологический, серологический (направленный на поиск антигена и антител), биологический (постановка биопробы на высокочувствительных животных) и молекулярно - биологический

Выбор объекта для лабораторного исследования материала из природных очагов туляремии определяется типологией очага, сезоном обследования, конечными целями исследования (контроль за динамикой эпизоотологического процесса или территориального распределения эпизоотических участков) В природных очагах исследуют биотические и абиотические объекты различных уровней Информативность молекулярно-биологического, бактериологического и биологического методов, используемых при изучении биотических объектов полевого материала, во многом определяется сроками доставки проб из природного очага в лабораторию Хранение проб при неблагоприятных температурных условиях в летне-весенний период может сделать невозможным выделение инфекционных агентов Рекомендуемые существующими инструктивно - методическими документами консерванты позволяют увеличить время сохранения биологических объектов, но не всегда способны обеспечить должное качество Поэтому нами при обследовании природных очагов в Ростовской области был применен метод криоконсерви-рования (Терентьев А Н , и др , 1993)

Для получения объективной, эпидемиологически значимой информации и оценки использованных приемов полевой материал, добытый в природных очагах туляремии, исследовали бактериологическим и молекулярно-биологическим методами в комплексе с серологическими реакциями Серологические реакции включали поиск антигена (РКОА, РАО, РНАт) и антител к туляремийному микробу (РИГА) Молекулярно-биологический метод (метод ПЦР) с использованием видоспецифических праймеров - для детекции туляремийного микроба Анализ результатов проводили по двум типам природных очагов туляремии, учитывая все структурные уровни и компоненты

Метод ПЦР со специфическими праймерами был использован для обнаружения возбудителя туляремии в пробах полевого материала, собранного при плановом эпизоотологическом обследовании степного и пойменно-болотного очагов туляремии в Ростовской области в весенне - летний и осен-не - зимний периоды 1996 - 1999 г г (более 4000 проб)

При анализе результатов, независимо от типа очага установлено преимущество ПЦР в сравнении с РНАт, РКОА и РАО при исследовании проб мышевидных грызунов (р<0,001, р<0,05, р<0,05, соответственно) При исследовании в степном очаге биотических и абиотических объектов подземного (гнездонорового) уровней позитивные результаты получены только в ПЦР В пробах воды из очага этого типа частота позитивных результатов в ПЦР была ниже, чем в серологических реакциях(р<0,05) При исследовании воды поверхностных водоемов в очаге пойменно-болотного типа, где она играет несомненно большую роль в персистенции туляремийного микроба, чем в очаге степного типа, частота позитивных результатов была выше в ПЦР Как отмечалось ранее, этот факт необходимо учитывать при проведении эпидемиологического надзора за туляремией (таблица 3)

Как уже отмечалось, методологической базой исследования полевого материала на туляремию явились положения, сформулированные на момент исследования в «Методических указаниях по лабораторным методам диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии» (1983) В своих исследованиях мы внесли в них некоторые дополнения Начальным этапом является разбор и сортировка проб полевого материала. Затем следуют серологические и молекулярно - биологические исследования, важнейшая задача которых состоит в получении информации для дальнейших лабораторных исследований обнаружение ДНК, антигенов и антител к туляремийному микробу Наличие такой информации на этапе, предшествующем постановке биологических проб, исключительно важно, так как она позволяет определить приоритетность проб и сконцентрировать внимание на наиболее значимых объектах Подобный подход целесообразен, рационален и позволяет повысить производительность труда, в особенности при одномоментном поступлении в диагностическую лабораторию большого количества полевого материала Следующим является этап постановки биологических проб с высокочувствительными лабораторными животными Информационное обеспечение этого этапа (положительные результаты в ПЦР и серологических реакциях) является показанием для обязательной постановки биоло-

гической пробы с последующими пассажами и прямого посева полевого материала на плотные питательные среды Если на этом этапе исследования падежа биопробных животных не наблюдается, то положительные результаты в ПЦР и нарастание титров серологический реакций, полученных при изучении материала от биологических проб, является показанием для проведения последующих пассажей В нашем исследовании применение такого методического подхода как многопассажной методики, не предусмотренной действовавшими инструктивно-методическими документами, было выделено 16% культур туляремийного микроба Заключительный этап исследования предполагает выделение туляремийного микроба на питательных средах и его идентификацию

Таблица 3

Информативность реакций коагглютинации, аггломерации, нейтрализации _антител и полимеразной цепной реакции_

Структурные уровни и объекты Превышение частоты положительных результатов в

исследования ПЦР по сравнению с серологическими реакциями

Степной очаг Пойменно-болотный очаг

РКОА РАО РНАт РКОА | РАО | РНАт

I. Наземный (воздушный) уровень

Биотические объекты

Мышь домовая 3,6 1,6 2,0 10,9 3,3 9,8

Полевка обыкновенная 3,7 1,3 4,6 3,4 2,0 3,3

Мышь лесная 3,8 0 3,0 4,0 2,3 3,2

Землеройка 2,5 0,9 2,3 Положительные резуль-

таты только в ПЦР

Хомячок серый 2,5 0 2,0 - - -

Клещи иксодовые 3,3 1,5 0

Комары 10,5 2,9 6,0

Абиотические объекты

Солома из скирд 0 0 0 2,8 0,8 2,5

II Подземный (гнездоноровый) уровень

Биотические объекты

Клещи гамазовые Положительные результаты только в ПЦР

Абиотические объекты

Гнездоноровый субстрат Положительные результаты только в ПЦР 1,2 0,6 1,0

III Водный уровень

Абиотические объекты

Вода поверхностных водоемов 0,8 0,4 0,8 5,2 1,3 2,3

Таким образом, при отработке тактики лабораторных исследований при эпидемиологическом надзоре за туляремией установлено, что информационными параметрами, характеризующими состояние паразитарной системы являются

1 Выделение и идентификация туляремийного микроба из биотических и абиотических объектов всех трех уровней системы,

2 Детекция ДНК туляремийного микроба в ПЦР в биотических и абиотических объектах всех трех уровней системы,

3 Обнаружение антигена туляремийного микроба в биотических и абиотических объектах всех трех уровнях системы,

4 Обнаружение антител к туляремийному микробу в биотических объектах (позвоночные животные первого и второго уровней системы

При сравнении информативности использованных методов показано преимущество использования ПЦР при эпизоотологическом обследовании территорий природных очагов туляремии

Нами установлено, что применение ПЦР в комплексе с бактериологическими и иммуно - серологическими методами при исследовании различных компонентов паразитарной системы и абиотических объектов может быть использовано для характеристики эпизоотической активности очага высокая - детекция специфической ДНК подтверждается выделением культур туляремийного микроба, повышенная - детекция специфической ДНК регистрируется на фоне обнаружения антигена, низкая - отрицательные результаты при использовании всех методов исследования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С использованием комплекса молекулярно-биологических приемов нам впервые удалось описать феномен некультивируемого состояния у возбудителя туляремии Показано, что ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба сохраняют свои основные свойства, в том числе и вирулентность Это может иметь значение в природных условиях в межэпизоотический период и явиться механизмом запуска начала эпизоотии среди чувствительных животных Существование некультивируемых форм имеет прямое отношение к резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды Определено, что возбудитель туляремии наделен адаптивной пластичностью, важной для персистенции, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды Изучение механизма адаптационной изменчивости туляремийного микроба, роли в этом процессе стрессовых условий, возможность перехода возбудителя в некуль-тивируемое состояние значительно расширило наши представления об экологии возбудителя туляремии Проведенные исследования легли в основу совершенствования принципов лабораторной диагностики и специфической индикации возбудителя туляремии Использованный нами впервые метод ПЦР-диагностики при обследовании природных очагов туляремии включен в приказ №125 Минздрава РФ, посвященный усилению мероприятий по профилактике туляремии (1999), что явилось основой для последующего обоснования введения молекулярно-биологических методов в методические указания по эпидемиологическому надзору за туляремией (1999, 2005) Разработанный новый комплекс информативных методов обнаружения и идентификации туляремийного микроба, усовершенствование тактики лабораторной диагностики при эпизоотологическом надзоре за природными очагами туляремии позволили лучше понять паразитарную систему возбудителя, его эко-

логию вообще и в стрессовых условиях, в частности, выявить факторы окружающей среды, вызывающие индукцию некультивируемого состояния у ту-ляремийного микроба, что позволяет по-новому и объективно подходить в прогнозированию состояния природных очагов туляремии и планировать объем профилактических мероприятий, необходимых для предупреждения возникновения эпизоотических и эпидемических осложнений

ВЫВОДЫ

1 Впервые показано, что в результате голодания и низкотемпературного стресса туляремийный микроб может обратимо переходить в «некульти-вируемое» состояние, в котором он персистирует в окружающей среде экосистемы в межэпизоотийный период Существование «некультивируемых» форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и их адаптации к неблагоприятным условиям среды

2 Ревертанты «некультивируемых» форм туляремийного микроба сохраняют свои основные дифференциально-диагностические свойства в том числе и вирулентность Реверсия в природных условиях в межэпизоотийный период и может явиться механизмом запуска начала эпизоотии туляремии среди чувствительных животных

3 Туляремийный микроб наделен генетически закрепленной адаптивной изменчивостью, важной для сохранения возбудителя в изменяющихся условиях окружающей среды и проявляющейся в адекватной реакции на стрессовые факторы

4 В силу своей природной пластичности возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, сопровождаемого заметной перестройкой его метаболизма В ответ на стрессовые условия туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему приспособиться к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать (иногда в виде «некультивируемых форм») в почвенных и водных экосистемах в межэпизоотийные периоды

5 Для изучения различных аспектов экологии F tularensis, его взаимоотношений с факторами окружающей среды, а также обнаружения и идентификации предложен комплекс молекулярно-биологических приемов, прошедший испытания в лабораторных и полевых условиях Сконструирована рекомбинантная плазмида pRD6 с комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК туляремийного микроба фрагментом, служащим ДНК-зондом для эффективного выявления только штаммов F tularensis и не взаимодействующим с представителями других близкородственных и отдаленных микроорганизмов На базе ДНК-зонда сконструированы видос-пецифические праймеры F1 и F2 для идентификации в ПЦР клеток возбудителя туляремии в чистой культуре, смеси культур с другими микроорганизмами, в суспензиях из органов зараженных биопробных животных и пробах клещей

6 Осуществлен генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба на межвидовом и внутривидовом уровне, а также продемонстриро-

вана их генотипическая гетерогенность с помощью ОП-ПЦР и набора универсальных (случайных) праймеров ОП-ПЦР с универсальными праймерами позволяет не только выявлять генетическую гетерогенность штаммов F tula-rensis, но и четко делить их на неарктический, среднеазиатский, голарктический подвиды и F novicida

7 Впервые определено место ПЦР как важного элемента совершенствования тактики лабораторной диагностики за туляремией в природных очагах Внедрение ПЦР в практику эпидемиологического надзора за туляремией позволяет получать оперативную информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага

8 ПЦР-анализ обладает рядом важных моментов (скорость получения ответа, чувствительность, а также специфичность), позволяющих использовать его в качестве надежного инструмента эпидемиологического надзора Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим и иммуносерологиче-скими методами при исследовании различных биотических и абиотических компонентов экосистемы может быть использовано для углубленной характеристики эпизоотической активности очага, так как этот метод учитывает, как типичные формы возбудителя туляремии, так и атипичные с измененной антигенной структурой, и микроорганизмы, находящиеся в «некультивируе-мом» состоянии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Авторское свидетельство Госкомитета СССР по делам изобретений и открытий № 1669981 Рекомбинантная плазмидная ДНК-источник зонда для тестирования представителей рода Francisella Штамм Е coli JM 103 pRD 6ГШ7-продуцент рекомбинантной плазмиды / Романова Л В , Павлович Н В, Мишанькин Б Н - Зарегистрировано в Гос реестре изобретений СССР 15 04 1991

2 Павлович, Н В Сравнительная характеристика биологических свойств штаммов F tularensis, выделенных на территории СССР / Н В Павлович, Б Н Мишанькин, Н К Тынкевич, И В Рыжко, Л В Романова и др // Антибиотики и химиотерапия - 1991 -Т 36 -№10 - С 23-25

3 Романова, Л В Использование полимеразной цепной реакции для геноти-пического скрининга штаммов F tularensis / Л В Романова, И Ю Сучков, Б Н Мишанькин // Актуальные проблемы профилактики туляремии Тез докл Всесоюзн конф - Симферополь, 1991 -С 160-161

4 Романова, Л В ДНК-зонд для обнаружения возбудителя туляремии / Л В Романова, Н В Павлович, Б Н Мишанькин // Актуальные проблемы профилактики туляремии Тез докл Всесоюзн конф - Симферополь, 1991 -С 162-163

5 Романова, Л В ДНК-зонд для идентификации представителей рода Francisella / Л В Романова, Н В Павлович, Б Н Мишанькин // Биотехнология -1992 -№4 - С 52-55

6 Романова, JIB Полимеразная цепная реакция генотипический скрининг штаммов Francisella tularensis с использованием универсальных праймеров / Л В Романова, И Ю Сучков, Б H Мишанькин//Биотехнология - 1993 -№6 - С 8-9

7 Романова, JIВ Анализ ДНК штаммов Brucella sp в полимеразной цепной реакции с использованием универсальных праймеров / Л В Романова, Б H Мишанькин//Биотехнология - 1994 -№4 - С 8-10

8 Романова, JIВ ПЦР-детекция представителей рода Francisella / J1В Романова, И Ю Сучков, Б H Мишанькин // Актуальные проблемы разработки мед средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил Тез докл - Санкт-Петербург, 1994 - С 127

9 Романова, JIВ Использование полимеразной цепной реакции для геноти-пического скрининга Y pestis / JI В Романова, Б H Мишанькин, В К Ва-ленцев // Актуальные проблемы особо опасных природно-очаговых инфекционных болезней Тез докл - Иркутск, 1994 - С 133

10 Романова, JI В Стрессовый ответ у возбудителя туляремии / JIВ Романова, С О Водопьянов, И JI Олейников, Б H Мишанькин // Актуал опр профилакт чумы и других инф заболеваний Матер межгос нучно-ракт конф - Ставрополь, 1994 - С 203-204

11 Романова, JIВ Праймеры для специфического обнаружения Francisella tularensis в полимеразной цепной реакции / Л В Романова, Б H Мишанькин//Журн микробиол эпидемиол иммунобиол - 1995 -№ -С 77-80

12 Romanova, L V Polymerase chain reaction species-specific primer set for rapid detection of Francisella tularensis / L V Romanova, В N Mischankin // Abstract 7th European congress of Clinical Microbiolog and Infectious Diseases-ECCMID-95 - Vienna - Austria - March 26-30,1995 - P 97

13 Романова, JI В ПЦР-генотипувания холерных в1бршшв видшенных в Дагестане в 1993-1994 рр / JIB Романова, Б H Мишанькин, ЮМ Ломов, И Ю Сучков // XII зьезд Украшского наук товариства мшроб ешдем па-раз - Кпв - Винниця, 1996 - С 55

14 Романова, Л В Полимеразная цепная реакция детекция и генотипирова-ние представителей рода Francisella / Л В Романова, Б H Мишанькин, ИЮ Сучков//Биотехнология - 1996 -№3 - С 27-32

15 Романова, Л В ПЦР-генотипирование ДНК-содержащих бактериофагов / Л В Романова, В И Марченков, Т H Бородина, Б H Мишанькин // Биотехнология - 1997 - № 1 - С 21-25

16 Москвитина, Э А Эпидемиологический надзор за туляремией с позиций социально-экологической концепции / Э А Москвитина, Б H Мишанькин, H Л Пичурина, H В Павлович, Л В Романова и др // Матер научно-практ конф посвящ 100-лет образов противочумной службы России - Саратов, 1997 -Т 1.-С 110-111

17. Романова, Л В Продукция основных белков теплового стрессового ответа клетками Francisella tularensis в подкожно имплантированных диффузионных камерах / Л В Романова, С О Водопьянов, И П Олейников,

Б Н Мишанькин // Матер научно-практ конф посвящ 100-лет образов противочумной службы России - Саратов, 1997 - Т 2 - С 113-114

18 Романова, Л В Стрессовый белок GroEL Francisella tularensis / JI В Романова, С О Водопьянов, С Р Саямов, Б Н Мишанькин // Матер научно-практ конф посвящ 100-лет образов противочумной службы России - Саратов, 1997 - Т 2 - С 114

19 Романова, Л В Выявление некультивируемых форм Francisella tularensis с помощью полимеразной цепной реакции / Л В Романова, Б Н Мишанькин // Матер научно-практ конф посвящ 100-лет образов противочумной службы России -Саратов, 1997 -Т 2 - С 115

20 Романова, Л В ПЦР - в практике эпизоотологического обследования природных очагов туляремии в Ростовской области / Л В Романова, Н Л Пичурина, Б Н Мишанькин // Матер научно-практ конф посвящ 100-лет образов противочумной службы России - Саратов, 1997 - Т 2 - С 213

21 Romanova, L V Francisella tularensis stress protein / L V Romanova, S О Vodopyanov, S R Sajamov, В N Mischankin // Vojenske Zdravotmske Listy, Rocnik LXVI, 1997 - N 1 - P 18 - Second International Conferens on Tularemia

22 Mischankin, В N Nonculturable forms of Francisella tularensis and their possible epideviological significance /BN Mischankin, L V Romanova, N L Pichurina//Vojenske Zdravotmske Listy, Rocnik LXVI, 1997 - N 1 - P 25 - Second International Conferens on Tularemia

23 Мишанькин, Б H База данных о нуклеотидных последовательностях, используемых в качестве базы данных «Праймеры микроорганизмов» / Б Н Мишанькин, Н Л Волохонская, Э А Москвитина, Л В Романова и др //Журн микробиол эпидемиол иммунобиол - 1998 -№5 - С 39-43

24 Романова, Л В Использование метода ПЦР для детекции Francisella tularensis / Л В Романова, Б Н Мишанькин, Н Л Пичурина // Методические документы и отчеты по сан - эпид охране территории РФ - Саратов, 1998 - С 24-25

25 Романова, Л В Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в диагностике Francisella tularensis / Л В Романова, Б Н Мишанькин, Н Л Пичурина // Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний Матер II Всерос конф 20-22 января 1998 г -Москва, 1998 - С 112-113

26 Мишанькин, Б Н Туляремия / Б Н Мишанькин, Н В Павлович, Л В Романова, И Я Черепахина и др // Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней - Саратов - 1998 - Т 1 - С 111-143

27 Орехов, И В Фауна переносчиков, как составная часть паразитарной системы природных очагов туляремии в Ростовской области /ИВ Орехов, А В Родионов, В Г Налетов, Б Н Мишанькин, Э А Москвитина, Н Л Пичурина, Л В Романова // Природноочаговые инфекции в России Совре-

менная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения Матер Всесоюзн научно-практ конф - Омск, 1998 - С 150-151

28 Кадетов, В В ПЦР - диагностика криоконсервированного полевого материала / В В Кадетов, H J1 Пичурина, J1В Романова, В Г Налетов и др // Природноочаговые инфекции в России Современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения Матер Всесоюзн научно-практ конф - Омск, 1998 - С 156-157

29 Романова, J1В Применение ПЦР в генотипической характеристике холерных бактериофагов / JIВ Романова, Т А Кудрякова, JIД Македоно-ва, Г В Качкина и др // Генная диагностика особо опасн инф Матер I-ойВсерос научно-практ конф - Саратов, 2000 -С 31-33

30 Романова, Л В Некультивируемые формы Francisella tularensis условия получения и реверсии в исходное состояние / Л В Романова, Б H Ми-шанькин, H Л Пичурина, С О Водопьянов и др // Журн микробиол эпидемиол иммунобиол -2000 -№2 - С 11-15

31 Романова, Л В ПЦР и проблема некультивируемых форм Francisella tularensis / Л В Романова, Б H Мишанькин, H Л Пичурина // Инфекционные болезни диагностика, лечение, профилактика Матер VI Российско-Итальянской науч конф - Санкт Петербург, 2000. - С 215

32 Пичурина, H Л Совершенствование тактики лабораторных исследований при эпизоотологическом мониторинге природных очагов туляремии / H Л Пичурина, Э А Москвитина, Б H Мишанькин, Л В Романова и др // Инфекционные болезни диагностика, лечение, профилактика Матер VI Российско-Итальянской науч конф -Санкт Петербург, 2000 - С 197

33 Romanova, L V , Kudryakova Т А, Makedonova L D, Kachkina G V , Mi-schankin В N Genotyping of Vibrio cholerae bactenophages using arbitrary primer polymerase chain reaction (AP-PCR) / L V Romanova, T A Kudryakova, L D Makedonova, G V Kachkina, В N Mischankin // The 9Л International Congress for Culture Collection (ICCCI) - Bnsbane -Australia, 2000 -P 105

34 Мишанькин, Б H Туляремия перспективы использования полимераз-ной цепной реакции при эпидемиологическом надзоре / Б H Мишанькин, Э А Москвитина, H Л Пичурина Л В Романова и др // Актуальные вопросы особо опасных инфекций - Нальчик, 2000 - С 49-51.

35 Romanova, L V Transfer of Francisella tularensis to the nonculturable state mdaction and condition favourable for reversion / L V Romanova, В N Mischankin, N L Pichurina // The 3-rd International Conférence on Tularemia -Umea - Sweden, 2000 - P 25

36 Романова, Л В Осмотический стресс у возбудителя туляремии / Л В Романова, H Я Шиманюк, Т Г Мордвинцева, Б H Мишанькин // Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг Матер Российской научно-практ конф - Москва, 2002 - С 83

37 Москвитина, Э А Компьтерные базы данных для эпизоотического и эпидемического процессов при туляремии / Э А Москвитина, Г Б Ани-симова, H Л Пичурина, Б H Мишанькин, И В Орехов, С Ю Водяниц-

кая, Д А Феронов, JI В Романова // Эпидемиологический надзор и социально - гигиенический мониторинг Матер Российской научно - практ конф - Москва, 2002 - С 67-68

38 Орехов, И В Особенности фаунистической структуры паразитарных систем некоторых природно-очаговых инфекций в условиях крупного города /ИВ Орехов, Э А Москвитина, Б Н Мишанькин, Н Л Пичурина, А Д Линкович, В И Адаменко, С Ю Водяницкая, Л В Романова и др // Проблемы особо опасных инфекций - 2002 - Вып 1/83 - С 64-72

39 Romanova, L V Influence of osmotic stress on Francisella tularensis / L V Romanova, N Ya Shimanyek, T G Mordvmtseva, В N Mishankin // Fourth International Conference on Tularemia The Assembly Room, City of Bath, Romsey - UK, 2003 -P 10

40 Романова, Л В Место ПЦР в эпидемиологическом мониторинге природных очагов туляремии Ростовской области / Л В Романова, Н Л Пичурина, Э А Москвитина, С Ю Водяницкая и др // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней Матер 4-й Межгосударст научно-практ конф государств - участников СНГ - Саратов, 2003 -С 157-160

41. Романова, Л В Тепловой стресс и белок теплового стресса GroEL у возбудителя туляремии / Л В Романова, С О Водопьянов, С Р Саямов, И П Олейников и др // Биотехнология - 2004 - № 5 - С 33-39

42 Романова, Л В Солетолерантность и осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии / Л В Романова, Н Я Шиманюк, С Р Саямов, А К Киселева и др // Биотехнология - 2004 - № 6 - С 27-33

43 Романова, Л В Изучение солевого стресса туляремийного микроба с помощью ОП-ПЦР / Л В Романова, Б Н Мишанькин // Медицинская микробиология - XXI век Матер Всеросс научно-практ конф - Саратов, 2004 - С 192

44 Романова, Л В Возбудитель туляремии современные аспекты экологии и диагностики / Л В Романова, Б Н Мишанькин // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт - Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств Матер VII Межгосударств научно-практ конф Оболенск, 2006 - С 119-120

Печать цифровая Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Формат 60x84/16 Объем 1,5 уч -изд -л Заказ №641 Тираж 100 экз Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г Ростов-на-Дону, ул Суворова, 19, тел 247-34-88

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Романова, Людмила Васильевна

ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы.

ГЛАВА 1. ТУЛЯРЕМИЯ - АКТУАЛЬНАЯ ПРОБЛЕМА СОВРЕМЕННОГО

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ.

ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.

2.1. Молекулярное зондирование.

2.1.1.Обзор литературы.

2.1.2.Собственные исследования.

2.1.2.1.Материалы и методы.

2.1.2.2.Конструирование плазмиды рШЭ 6 с фрагментом ДНК

Б. ийагег^Б.

2.1.2.3.Характеристика ЕсоВД - фрагмента р!Ш 6.

2.1.2.4.Получение радиоактивного зонда для видоспецифического определения франсиселл.

2.1.2.5.Использование зонда для тестирования представителей

Б. ийагег^Б.

2.2. Полимеразная цепная реакция (ПНР) в диагностике возбудителя туляремии.

2.2.1. Обзор литературы.

2.2.2.Собственные исследования.

2.2.2.1 .ПЦР-генотипирование.

2.2.2.1.1.Материалы и методы.

2.2.2.1.2. Изучение методических возможностей ОП-ПЦР: генотипирование штаммов различных микроорганизмов и

ДНК-содержащих бактериофагов.

2.2.2.1.3 .Генотипирование штаммов Р. йЛагегшэ.

2.2.2.2.ПЦР: детекция представителей F.tularensis

ГЛАВА 3. НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ (НФ) ВОЗБУДИТЕЛЯ

ТУЛЯРЕМИИ.

3.1.Обзор литературы.

3.2.Собственные исследования.

3.2.1. Материалы и методы.

3.2.2. Получение и исследование НФ туляремийного микроба.

3.2.3. Получение ревертантов НФ туляремийного микроба.

ГЛАВА 4. СТРЕССОВЫЙ ОТВЕТ У ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ

4.1 .Обзор литературы.

4.2. Собственные исследования.

4.2.1. Материалы и методы.

4.2.2. Тепловой стресс у возбудителя туляремии.

4.2.2.1. Стрессовый GroEL- подобный белок туляремийного микроба.

4.2.2.2. Выделение и очистка белка.

4.2.2.3. Характеристика белка стрессового белка Gro EL.

4.2.3. Осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии.

4.2.3.1.Солетолерантность туляремийного микроба и исследование некоторых биохимических параметров туляремийного микроба в условиях солевого стресса.

4.2.3.2.Исследование морфологии стрессированных клеток возбудителя туляремии.

4.2.3.3.Изучение профиля белков туляремийного микроба в условиях солевого стресса.

4.2.3.4.Изучение антифагоцитарной активности стрессированных клеток

F.tularensis (солевой стресс).

4.2.3.5.Генотипическое изучение ДНК стрессированных клеток туляремийного микроба (солевой стресс).

ГЛАВА 5. МЕСТО ПЦР В ПРАКТИКЕ ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ТУЛЯРЕМИЕЙ (НА ПРИМЕРЕ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ).

5.1. Обзор литературы.

5.2.Собственные исследования.

5.2.1. Материалы и методы.

5.2.1.1. Исследование полевого материала с применением бактериологического, серологического и молекулярно-биологических методов. Сравнительная оценка результатов.

5.2.1.2. Использование ПЦР при эпидемиологическом надзоре за туляремией.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики"

Актуальность проблемы

Туляремия - зоонозное природно-очаговое инфекционное заболевание, известное еще с давних времен. Упоминания о страшной эпидемии, сходной с бубонной чумой или тифом, которая поразила Древний Египет в середине бронзового века, были обнаружены в медицинских папирусах, датированных 1715 г. до н.э. (Trevisanoto S.I., 2004,2007). Она характеризуется различными механизмами и путями передачи возбудителя, лихорадкой, интоксикацией, образованием лимфаденитов, полиморфизмом клеточных проявлений, затяжным течением (Francis F., 1925; Олсуфьев Н.Г., 1970, 1975; Гусева Е.В., Дудникова И.С., 2002; Ellis J., Oyston C.F., Green M., Titboll R.W., 2002; Petersen J.M., Schriefer M.E., 2005).

Мельниченко П.И., Шумилов В.И., Карниз А.Ф., 2000; Лобзин Ю.В., Лукин Е.П., Усков А.Н., 2001; Воробьев A.A., 2001; Cronquist S.D., 2004; Онищенко Г.Г., 2005; Jones S.W., Dobson М.Е., Francesconi S.D. et al., 2005; Tomioka K., Peredelchuk M., Zhu X. et al., 2005). Для решения проблемы национальной биологической безопасности Президентом Российской Федерации был издан Указ № 2194 от 4.12.2003 г., определяющий основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2010 года и дальнейшую перспективу. Учитывая высокую инфекциозность возбудителя туляремии при минимальной заражающей дозе, длительную утрату трудоспособности инфицированных людей, его значительную устойчивость в окружающей среде, способность к эпидемическому распространению и др., возбудитель был включен в «Перечень возбудителей (патогенов) человека, животных и растений, генетически измененных микроорганизмов, токсинов, подлежащих экспортному контролю в целях защиты национальных интересов и обеспечения выполнения международных обязательств Российской Федерации, вытекающих из Конвенции о запрещении разработки, производства и пополнения запасов бактериального (биологического) и токсинного оружия и об их уничтожении» (Указ Президента РФ №1004 от 8.08.2001).

В настоящее время род Francisella включает два вида - Francisella tularensis и Francisella philomiragia, а вид F. tularensis представлен четырьмя подвидами - F. tularensis subsp. tularensis (тип А), F. tularensis subsp. holarctica (тип В), F. tularensis subsp. mediaasiatica и F. tularensis subsp. novicida. Четыре подвида заметно различаются по вирулентности и по географии распространения, однако имеют сходную антигенную структуру (Broekhuysen М., Larsson Р., Johansson А. et al., 2003; Sjostedt А., 2003; Titball R.V. et al., 2003; Jahansson A., Forsman M., 2004; Svensson K., Larsson Р., Johansson D. et al., 2005). Наиболее вирулентные изоляты возбудителя принадлежат к F. tularensis subsp. tularensis со смертностью при отсутствии эффективного этиотропного лечения около 60% (Center for Disease Control and Prevention., 2002; Broekhuysen M., Larsson P., Johansson A. et al., 2003; Avashia S., Petersen J.M., Lindy C. et al., 2005). В последнее десятилетие в США ежегодно регистрируется в среднем 124 случая заболевания туляремией (Barns S.M., Grow С.С., Okinaka R.T., 2005). Хотя сфера распространения этого подвида, ограничена, в основном, Северной Америкой, сообщалось о выделении штаммов неарктического подвида и в Европе (Gurycova D., 1998).

В последнее десятилетие эпидемиологическая и эпизоотологическая обстановка в России по туляремии оценивается как напряженная (Онищенко Г.Г., 2001, 2002; Мещерякова И.С., 1998, 2002; Горшенко В.Р., Мещерякова И.С., Кючерян А.Н., 2001). Существование в естественных биоценозах стойких природных очагов туляремии и заметная тенденция к появлению новых, объясняет необходимость проведения постоянного мониторинга за состоянием этих эндемичных очагов с использованием комплекса бактериологических, серологических и генодиагностических методов исследования. Занимая около 80% территории Юга России, природные очаги туляремии характеризуются исключительной стойкостью, циклическим проявлением активности, что обусловливает периодические подъемы заболеваемости. К факторам, определяющим устойчивость природных очагов туляремии, относят полигостальность, поливекторность, множественность механизмов передачи возбудителя, его гидрофильность (способность длительно сохраняться в водных экосистемах, особенно при низких температурах и, вероятно, в ассоциациях с беспозвоночными животными - гидробионтами), а также возможность персистировать в организме восприимчивых животных (Олсуфьев Н.Г., Доброхотов Б.П., 1969; Олсуфьев Н.К., Дунаева Т.В., 1970; Олсуфьев Н.К.,1979; Шеенко Н.В., Опочинский Э.Ф., Валышев A.B. и др., 2006) и во внешней среде.

В последние годы при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии отмечается снижение количества культур возбудителя, изолированных от млекопитающих, членистоногих и из различных объектов окружающей среды (Мещерякова И.С. 1998). Однако, следует отметить, что относительно благополучная эпизоотологическая обстановка не дает представления об истинной ситуации в паразитарной системе. Проводимые при этом исследования не всегда учитывают в полном объеме условия циркуляции микроба и сохранения его во внешней среде. Не учитывается возможность пребывания туляремийного микроба в окружающей среде в виде некультивируемых форм. Существование подобных покоящихся форм, получивших название «некультивируемых» у ряда патогенных бактерий, имеет прямое отношение к закономерностям резервации возбудителей в природе и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Обладая сниженным метаболизмом, такие формы обеспечивают выживание популяции в неблагоприятных (стрессовых) экологических ситуациях в покоящемся состоянии, сохраняя при этом способность реверсировать в вегетативные вирулентные формы при изменении условий существования (Литвин В.Ю. и др., 1998; СоЬуеИ Я. & а1., 1986; Со1\уе11 Я., Ищ К., 1994). Используемые в лабораторной практике традиционные бактериологические методы определения жизнеспособности бактериальных клеток непригодны для выявления некультивируемых форм (НФ) бактерий в окружающей среде. Между тем, проблема НФ возбудителя туляремии представляет не только теоретический интерес, но имеет огромное практическое значение, поскольку эти формы способны поддерживать существование возбудителя в окружающей среде в межэпизоотические (межэпидемические) периоды.

В связи с этим возникла необходимость разработки новых, более информативных методов обнаружения и идентификации туляремийного микроба, а также, совершенствование тактики лабораторной диагностики в целом при эпизоотологическом надзоре за природными очагами туляремии.

Все это обусловило в свою очередь настоятельную необходимость внедрения принципиально нового и важного направления, связанного с изучением разных аспектов адаптационной изменчивости туляремийного микроба, позволяющей ему сохраняться в объектах внешней среды в межэпизоотические (межэпидемические) периоды, а также к разработке новых методических подходов обнаружения и идентификации возбудителя туляремии как в лабораторных условиях, так и при исследовании объектов внешней среды активных природных очагов.

ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ явилось изучение феномена перехода возбудителя туляремии в некультивируемое состояние, в котором он может существовать в межэпизоотический период, исследование механизмов адаптации патогена к неблагоприятным условиям среды, разработка новых методических подходов к идентификации как типичных, так и атипичных штаммов ¥Ли1агет\8, включая его некультивируемые формы, с использованием молекулярно-биологических методов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить способность клеток туляремийного микроба к переходу в некультивируемое состояние.

2. Изучить влияние искусственно созданных неблагоприятных условий внешней среды на способность перехода туляремийного микроба в некультивируемое состояние.

3. Изучить влияние стрессовых факторов (голодание, тепловой, осмотический и солевой стресс) на основные свойства возбудителя туляремии.

4. Сконструировать ДНК зонд для идентификации возбудителя туляремии.

5. Сконструировать специфические праймеры для индикации возбудителя туляремии в ПЦР.

6. Апробировать методы ДНК-зондирования и ПЦР-анализа для детекции и идентификации атипичных штаммов Т7. ШагетгБ, включая некультивируемые формы возбудителя.

7. Подобрать универсальные (случайные) праймеры для исследования генома туляремийного микроба в системе однопраймерной ПЦР.

8. Определить место ПЦР в системе эпидемиологического надзора за туляремией (молекулярно - биологический уровень эпидемиологического надзора).

9. Усовершенствовать тактику лабораторной диагностики при эпидемиологическом надзоре за туляремией.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Впервые описан феномен перехода возбудителя туляремии в некультивируемое состояние под влиянием условий внешней среды. Показано, что ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба восстанавливают свои основные свойства, в том числе и вирулентность. Существование таких покоящихся форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и его адаптации к неблагоприятным условиям среды. Определено, что возбудитель туляремии наделен важной для персистенции адаптивной пластичностью, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Предложен комплекс молекулярно-биологических приемов для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии. Сконструирован и апробирован ДНК-зонд для идентификации Р. Ш1агет1я, сконструированы специфические праймеры для индикации возбудителя туляремии. Подобраны универсальные (случайные) праймеры для изучения генома (ПЦР-типирование, геномотипирования, генотипирование) туляремийного микроба в системе однопраймерной ПЦР. С помощью этих праймеров показана генетическая гетерогенность штаммов представителей рода РгапЫзеПа. Впервые определено место ПЦР в практике эпизоотологического и эпидемиологического надзора за туляремией в природных очагах. Метод ПЦР при условии низкотемпературного хранения проб полевого материала повышает эффективность эпизоотологического мониторинга территорий, так как обеспечивает возможность ускоренного предварительного отбора положительных проб для последующего целенаправленного бактериологического анализа, а также дает возможность обнаружения туляремийных микробов, находящихся в некультивируемом состоянии, в котором они персистируют в окружающей среде в межэпизоотический период.

Наше исследование позволило предложить новый комплекс информативных методов обнаружения и идентификации как типичных, так и измененных форм туляремийного микроба, усовершенствовать тактику лабораторной диагностики при эпизотоологическом надзоре за природными очагами туляремии. Проведенные эксперименты по стрессовым воздействиям можно рассматривать как моделирование определенных экологических ситуаций, в которые попадает Р.ш1агепБ1Б во время пребывания во внешней среде, а также его возможности для выживания. Они позволяют лучше понять экологию возбудителя вообще и его поведение в стрессовых условиях, в частности, выявить факторы внешней среды, вызывающие индукцию некультивируемых форм у туляремийного микроба, что важно для объективного прогнозирования состояния природных очагов туляремии и определения объема профилактических мероприятий, необходимых для предупреждения возникновения эпизоотических и эпидемических осложнений.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты исследований оформлены, утверждены и нашли свое отражение в следующих документах.

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован штамм - продуцент плазмидной ДНК Е.соИ ЗМ103 рШ36-КМ7, Саратов, 1988.

Оформлена инструкция по изготовлению и контролю препарата ДНК -зонда для диагностики возбудителя туляремии, Ростов-на-Дону, 1990 (одобрена Ученым советом и утверждена директором РостНИПЧИ 14.05.90., протокол №6).

Получено авторское свидетельство « Рекомбинантная плазмидная ДНК рЫЗб - источник зонда для тестирования представителей рода Ргап^еИа, штамм бактерий ЕскепсЫа соН, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК р!Ш6 - источник зонда для тестирования представителей рода РгетсиеИа», М., №1669981, 1991.

Предложены: «Методические рекомендации по использованию ПЦР для генотипического скрининга штаммов Ргап^еИа Ш1агеж1з», Ростов-на-Дону, 1994 (одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ 11.07.94., протокол №6).

Методические рекомендации. «Детекция туляремийного микроба методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью родоспецифических праймеров», Ростов-на-Дону, 1997 (одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ 19.07.97., протокол №5).

Методические рекомендации. «Использование метода ПЦР для детекции ЕгапЫзеПа ы1агет{8У>, Саратов, «Микроб», 1998.

Методические рекомендации по получению некультивируемых форм туляремийного микроба», Ростов-на Дону, 1999 (одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ 24.12.99., протокол №5).

Методические рекомендации. «Совершенствование эпидемиологического надзора и тактики лабораторных исследований при эпидемиологическом мониторинге природных очагов туляремии», Ростов-на Дону, 2000 (одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ 5.04.00., протокол №3).

Предложения и рекомендации используются в работе лабораторий различных противочумных учреждений (лаборатория туляремии РостНИПЧИ, зоолого-паразитологический отдел ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Ростпотребнадзора, Ставропольский НИПЧИ, Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока и др.), а также при чтении лекций на курсах специализации и усовершенствования врачей и лаборантов по ООИ при Ростовском ПЧИ. Акты внедрения представлены в приложении.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Возбудитель туляремии под воздействием стрессовых условий окружающей среды способен обратимо переходить в некультивируемое состояние, что должно обеспечивать ему возможность персистировать в окружающей среде в межэпизоотический период. Полученные ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба сохраняют свои основные дифференциально-диагностические свойства, в том числе и вирулентность. Факт существования некультивируемых форм туляремийного микроба имеет прямое отношение к резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды.

2. Возбудитель туляремии наделен исключительно важной для персистенции адаптивной пластичностью, что проявляется в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, который сопровождается заметной перестройкой его метаболизма и структуры хромосом.

3. С помощью современных молекулярно-генетических технологий, включающих клонирование, зондирование и ПЦР-анализ подобран комплекс молекулярно-биологических методических приемов для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии. Сконструированный ДНК-зонд, а также полученные на его базе специфические праймеры позволяют выявлять туляремийный микроб в ПЦР как в чистой культуре, так и в смеси культур с другими микроорганизмами. ОП-ПЦР с универсальными праймерами позволяет осуществлять генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба, идентификацию штаммов на межродовом и внутривидовом уровне и демонстрировать их генетическое разнообразие.

4. ПЦР-анализ в силу своей чувствительности и специфичности позволяет использовать его в качестве надежного инструмента в системе эпидемиологического надзора за туляремией. Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим и иммуно-серологическими методами, а также криоконсервированием при исследовании различных компонентов паразитарной системы и абиотических объектов позволяет оперативно получать эпидемиологически значимую информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага или защиты общества от угрозы биологического нападения.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований были представлены на научных конференциях: Актуальные проблемы профилактики туляремии. Симферополь, 1991. Актуальные проблемы особо опасных и природноочаговых инфекционных болезней. Иркутск, 1994.

Актуальные проблемы разработки мед. средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил. Санкт-Петербург, 1994.

Актуальные проблемы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний. Ставрополь, 1994.

7 European Congress of Clinical Microbiology and Infection Diseases. Vienna, 1995.

Научно-производственная конференция, поев. 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997.

Second International Conference of Tularemia. Hradec Kralove,1997, Чехия. Всероссийская конференция - ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. Москва, 1998.

Всероссийская конференция - Гомеостаз и инфекционный процесс. Саратов, 1998.

Природноочаговые инфекции в России: Современная эпидемиология, диагностика, тактика защиты населения. Омск, 1998.

I Всероссийская научно-практическая конференция -Генная диагностика ООН. Саратов, 2000.

VL Российско-Итальянская научная конференция. Инфекционные болезни. Диагностика, лечение, профилактика. Москва, 2000.

9 International Congress for Culture Collection. Brisban (Australia), 2000.

Актуальные вопросы ООИ. Нальчик, 2000.

3 International Conference on Tularemia. Umea (Sweden), 2000.

Российская научно-производственная конференция. Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг. Москва, 2002.

4 International Conference on Tularemia. The Assembly Rooms, City of Bath, United Kingdom, 2003.

Медицинская микробиология - XXI век. Саратов, 2004.

Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств. Оболенск, 2006.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 44 (19 из них в центральной печати и в материалах международных конференций) работ, подготовлено 6 нормативно правовых документов. Исследования выполнены в течение 1990-2004 годов в рамках 5 плановых научных тем (номера государственной регистрации 01.93.0 003258,01.9.50 003708,01.9.70 009328, 01.9.70 009332, 01.200.1 15561), в которых автор являлся соруководителем или ответственным исполнителем.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация изложена на 298 листах машинописного текста, состоит из Введения и 5 глав, включающих обзор литературы и результаты собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 35 рисунками. Указатель литературы включает 601 источник, из них 234 отечественных и 367 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Романова, Людмила Васильевна

выводы

1. Впервые показано, что в результате голодания и низкотемпературного стресса туляремийный микроб может обратимо переходить в «некультивируемое» состояние, в котором он персистирует в окружающей среде экосистемы в межэпизоотийный период. Существование «некультивируемых» форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и их адаптации к неблагоприятным условиям среды.

2. Ревертанты «некультивируемых» форм туляремийного микроба сохраняют свои основные дифференциально-диагностические свойства в том числе и вирулентность. Реверсия в природных условиях в межэпизоотийный период и может явиться механизмом запуска начала эпизоотии туляремии среди чувствительных животных.

3. Туляремийный микроб наделен генетически закрепленной адаптивной изменчивостью, важной для сохранения возбудителя в изменяющихся условиях окружающей среды и проявляющейся в адекватной реакции на стрессовые факторы.

4. В силу своей природной пластичности возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, сопровождаемого заметной перестройкой его метаболизма. В ответ на стрессовые условия туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему приспособиться ' к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать (иногда в виде «некультивируемых форм») в почвенных и водных экосистемах в межэпизоотийные периоды.

5. Для изучения различных аспектов экологии F.tularensis, его взаимоотношений с факторами окружающей среды, а таюке обнаружения и идентификации предложен комплекс молекулярно-биологических приемов, прошедший испытания в лабораторных и полевых условиях. Сконструирована рекомбинантная плазмида рШЭб с комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК туляремийного микроба фрагментом, служащим ДНК-зондом для эффективного выявления только штаммов Р. Ш1агетгз и не взаимодействующим с представителями других близкородственных и отдаленных микроорганизмов. На базе ДНК-зонда сконструированы видоспецифические праймеры и ¥2 для идентификации в ПЦР клеток возбудителя туляремии в чистой культуре, смеси культур с другими микроорганизмами, в суспензиях из органов зараженных биопробных животных и пробах клещей.

6. Осуществлен генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба на межвидовом и внутривидовом уровне, а также продемонстрирована их генотипическая гетерогенность с помощью ОП-ПЦР и набора универсальных (случайных) праймеров. ОП-ПЦР с универсальными праймерами позволяет не только выявлять генетическую гетерогенность штаммов Р. Ыагетгя, но и четко делить их на неарктический, среднеазиатский, голарктический подвиды и Р.потыйа.

7. Впервые определено место ПЦР как важного элемента совершенствования тактики лабораторной диагностики за туляремией в природных очагах. Внедрение ПЦР в практику эпидемиологического надзора за туляремией позволяет получать оперативную информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага.

8. ПЦР-анализ обладает рядом важных моментов (скорость получения ответа, чувствительность, а также специфичность), позволяющих использовать его в качестве надежного инструмента эпидемиологического надзора. Применение ПЦР в комплексе с бактериологическим и иммуносерологическими методами при исследовании различных биотических и абиотических компонентов экосистемы может быть использовано для углубленной характеристики эпизоотической активности очага, так как этот метод учитывает, как типичные формы возбудителя туляремии, так и атипичные с измененной антигенной структурой, и микроорганизмы, находящиеся в «некультивируемом» состоянии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

И хотя туляремия была известна жителям Восточного Средиземноморья еще в XIV веке до н.э. (Trevisanato S., 2007), в настоящее время значимость туляремийного микроба, как этиологического фактора в патологии человека не только не снижается, но и проявляет тенденцию к нарастанию. Актуальность исследования возбудителя туляремии сегодня определяется двумя аспектами. Первый - туляремийный микроб вызывает опасное заболевание человека, характеризующееся различными механизмами и путями передачи возбудителя. Экологическая пластичность возбудителя туляремии, прочные связи с кругом различных носителей и переносчиков обеспечивающих полигостальность и поливекторность позволяет существовать ему в естественных биоценозах в виде эндемичных стойких природных очагов инфекции, широко распространенных в северном полушарии, включая Российскую Федерацию и соседние страны. Кроме того, наблюдается четкая тенденция к формированию новых очагов на ранее неэндемичных территориях (Косово, Испания, Австралия). Вторым важным аспектом актуальности исследования возбудителя туляремии является возможность его применения как биологического агента в локальных войнах, вооруженных конфликтах или при террористических актах. Многие исследователи считают, что проведение террористических актов будет сопровождаться имитацией активизации природных очагов инфекций и в этом случае туляремийный микроб может оказаться удобным биологическим агентом. Это обстоятельство в немалой степени явилось причиной столь повышенного интереса к F.tularensis в последние годы (Oyston P.C.F., Sjostedt А., Titball R.W., 2004).

Все это обусловливает важность и необходимость изучения экологии возбудителя, резервуары которого в окружающей среде остаются неизвестными (Titball R.W., Johansson А., Forsman М., 2003), исследования механизмов адаптационной изменчивости туляремийного микроба, способов его персистенции в окружающей среде, в организме больных и носителей, выявлению закономерностей сохранения возбудителя в межэпизоотийный период, исследования механизмов активации очагов. Естественно, что для этого необходим комплекс новых адекватных и эффективных методов индикации и идентификации как типичных, так и измененных штаммов туляремийного микроба.

Свои исследования мы начали более 15 лет назад, когда для обнаружения возбудителя в клинических образцах и в объектах окружающей среды традиционно использовали биологические, бактериологические и иммуно-серологические методы исследования. Поэтому первоочередной задачей наших исследований по изучению экологии туляремийного микроба явилось совершенствование принципов лабораторной диагностики и специфической индикации возбудителя туляремии. Для этого был разработан и апробирован комплекс новых молекулярно-биологических методов исследования. В результате проведенного исследования удалось сконструировать один из первых в нашей стране ДНК-зондов, а также первые в нашей стране специфические праймеры для ПЦР-диагностики туляремийного микроба, и дополнительно, подобрать неспецифические (универсальные) праймеры для его генотипирования.

С помощью метода молекулярного клонирования сконструирована плазмида рШЭб с ЕсоШ фрагментом ДНК размером 800 п.н., комплементарным участку хромосомной ДНК туляремийного микроба. В результате определения первичной структуры клонированного ЕсоШ фрагмента ДНК РЛиШгетгя и проведенного компьютерного анализа построена физическая карта фрагмента по сайтам узнавания для 34 рестриктаз, определен вС - состав клонированного участка ДНК. Как оказалось, содержание вС составило 34,8%, что является аномально низким (для большинства грамотрицательных микроорганизмов оно составляет 50-55%). Вероятно, такое низкое содержание GC является особенностью клонированного фрагмента. На исследованном участке идентифицированы три потенциальных промотора, сходных с консенсусной последовательностью промотора кишечной палочки, на небольшом расстоянии за которыми находились последовательности, гомологичные последовательностям Шайно-Дальгарно и ATG кодоны. На изученном фрагменте ДНК туляремийного микроба имеются два участка, проявляющие 60% гомологии с участками плазмиды pRD322. Положение областей гомологии позволяет предположить их регуляторную природу. При сравнении первичной структуры полученного EcoRI фрагмента F.tularensis с секвинированной недавно полной нуклеотидной последовательностью хромосомной ДНК F.tularensis Schu (Larsson P., Oyston P.C., Chain K. et al., 2005), удалось определить местоположение полученного фрагмента. Он расположен между 550 000 п.н. и 560 000 п.н. на хромосоме возбудителя туляремии в области гена бифункционального белка - глутаредоксина 3. Кроме того, на EcoRI фрагменте pRD 6 удалось обнаружить образования, характерные, как для IS - элементов, так и для «генетического переключателя» (Хесин Р.Б., 1985). Это позволяет с определенной долей вероятности утверждать, что EcoRI участок ДНК несет характерный для F. tularensis мобильный генетический элемент, который может выполнять различные функции, включая функцию генетического переключателя. EcoRI- фрагмент плазмиды pRD 6 использовали в качестве зонда для обнаружения франсиселл, так как он гибридизовался только с ДНК представителей F. tularensis ( всего исследовано более 150 штаммов; ДНК F.novicida давала сигнал в 2 раза слабее) и не гибридизовался с ДНК представителей других близкородственных (Brucella spp.) и отдаленных родов микроорганизмов (всего 25 видов). Чувствительность зонда составила 6x105 микробных клеток на пятно и позволяет идентифицировать представителей четырех подвидов F.tularensis не только в клеточных суспензиях, но и в мазках — отпечатках павших от инфекции животных. Четкость, воспроизводимость и специфичность получаемых результатов гибридизации доказывала возможность и перспективность использования разработанного нами зонда в диагностике туляремии у диких грызунов с эндемичных территорий. Зонд использовали и при идентификации культур Е.Шагет'и.

Однако тот факт, что зондирование не отличается высокой чувствительностью (104 - 105 микробных клеток на мишень) делает этот метод малоэффективным при низкой концентрации микроорганизмов в пробе, или когда микроорганизмы плохо размножаются в лабораторных условиях. С такими ситуациями сталкиваются при диагностике хронических инфекций, обусловленных персистенцией бактерий и вирусов, при обследовании полевого материала из природных очагов различных инфекций. Поэтому открытие и разработка нового молекулярно - генетического метода — полимеразной цепной реакции (ПЦР) явилось революционным этапом в системе новых методов диагностики в биологии и медицине. Высокая чувствительность ПЦР, ее специфичность, быстрота постановки и воспроизводимость обеспечили этому методу успешное применение, как для обнаружения, так и для генотипической характеристики штаммов различных микроорганизмов и вирусов. Поэтому следующий этап нашей работы включал адаптацию метода ПЦР для диагностики возбудителя туляремии. В своих исследованиях мы апробировали ПЦР - генотипирование с различными универсальными, или случайными, праймерами в однопраймерной ПЦР (ОП-ПЦР или КАР О). Метод ОП-ПЦР, в отличие от двухпраймерной, не требует информации о последовательностях и сканирует весь геном. Прием особенно важен для генотипирования тех микроорганизмов, для которых генетические карты еще не построены, а информации об особенностях их молекулярной биологии относительно мало. Характерно, что каждый праймер дает различные картины распределения продуктов ПЦР в геле, что обеспечивает ему потенциальную способность к детекции различий между штаммами. В своих исследованиях по ПЦР-генотипированию возбудителей особо опасных заболеваний и их бактериофагов мы использовали преимущественно однопраймерный вариант ПЦР и набор случайных праймеров (№ 1, 2, 9, 15, 21,45, Д9А). Оказалось, что все взятые праймеры в использованных для отжига условиях могли относительно неспецифически связываться с большим числом сайтов на ДНК -мишени и образовывать множество ПЦР продуктов в виде дескретных фрагментов. Из испытанного набора универсальных прймеров наиболее информативными оказались праймеры №15, 21,45 и Д9А.

Накопленный опыт работы с ОП-ПЦР и универсальными праймерами позволил провести генотипическую характеристику ДНК различных штаммов туляремийного микроба. При исследовании коллекции штаммов возбудителя туляремии в ОП-ПЦР оказалось, что праймеры 15, 21 и 45 позволяют четко дифференцировать неарктический и среднеазиатский подвиды от голарктического по мажорному фрагменту в 300 п.н., а неарктический от среднеазиатского подвида по присутствию у последнего фрагментов ДНК размером 4000-2000 п.н. Более того, при использовании праймера 45 штаммы первых двух подвидов отличались от голарктического отсутствием у последнего фрагмента размером 1 150 п.н. и появлением мажорного фрагмента размером 900 п.н. У штамма F.novicida картина распределения ампликонов отличалась от таковой у F.tularensis.

Проведенное исследование показало возможность использования ОП-ПЦР для генотипической характеристики штаммов туляремийного микроба. Использованный прием позволяет выявить различия в исследованной коллекции штаммов F.tularensis , которая четко разделяется на четыре группы: первая - штаммы неарктического подвида; вторая - штаммы среднеазиатского подвида; третья - штаммы голарктического подвида; четвертая - F.novicida. Наше заключение о генетической гетерогенности рода Francisella было подтверждено многими исследователями и в настоящий момент принято считать, что род Francisella, включает два вида - Francisella tularensis и Francisella philomiragia, а вид F. tularensis представлен четырьмя подвидами -F. tularensis subsp. tularensis (тип А), F. tularensis subsp. holarctica (тип В), F. tularensis subsp. mediaasiatica и F. tularensis subsp. novicida (Broekhuysen M., Larsson P., Johansson A., ET AL., 2003; Sjostedt A., 2003; Petersen J.M., Schriefer M.E., 2005; Svensson K., Larsson P., Johansson D. Et al., 2005). В связи с этим, как сконструированный нами ранее ДНК-зонд, так и полученные на его базе праймеры следует считать видоспецифическими.

В дальнейшем на базе ранее созданного зонда (pRD 6) нам удалось сконструировать и испытать праймеры для диагностики представителей F. tularensis, обозначенные, как Fl и F2. Как показали исследования, с помощью праймеров Fl и F2 специфически амплифицировались последовательности хромосомной ДНК туляремийного микроба, что выражалось в появлении в геле продукта амплификации ожидаемого размера - 210 п.н. При использовании дополнительно к комбинации F1 + F2 промежуточного праймера - зонда F3 кроме полосы в 210 п.н. отмечено появление дополнительной слабо выраженной полосы ДНК размером 153 п.н., обусловленной формированием фрагмента между F2 + F3.

Таким образом, показана пригодность одно- и двухпраймерной ПЦР как для детекции, так и генетического типирования штаммов туляремийного микроба. С помощью сконструированных праймеров (Fl + F2) удается идентифицировать до 10 клеток туляремийного микроба в чистой культуре, в смеси культур с другими патогенными микроорганизмами и в органах зараженных биопробных животных. Универсальные (случайные) праймеры позволяют осуществлять генотипический скрининг штаммов туляремийного микроба и идентификацию штаммов на межвидовом и внутривидовом уровне.

Одной из наиболее интересных сфер приложения ПЦР в эпидемиологии является использование этого метода для мониторинга объектов внешней среды. Сконструированные нами праймеры Р1 + ¥2 были впервые использованы при осуществлении эпидемиологического надзора за туляремией в природных очагах степного и пойменно - болотного типов Ростовской области (1996-1997-1999 годы). Установлено, что применение ПНР в комплексе с бактериологическими и иммуносерологическими методами при исследовании различных компонентов паразитарной системы и абиотических объектов может быть использовано для характеристики эпизоотической активности очага:

- высокая - детекция специфической ДНК подтверждается выделением культур туляремийного микроба;

- повышенная - детекция специфической ДНК регистрируется на фоне обнаружения антигена;

- низкая - отрицательные результаты при использовании всех методов исследования.

В ходе исследования обнаружено, что ПЦР-анализ обладает рядом важных моментов, позволяющих использовать его в качестве надежного инструмента эпидемиологического надзора. Это прежде всего его чувствительность, которая характеризуется наименьшей концентрацией бактериальных клеток, дающих положительный результат анализа (Куличенко А.Н., Касьян И.Н., Гаранина С.Б. и др., 1997), а также его специфичность -способность выявлять возбудителя искомой инфекции в присутствии любых других микроорганизмов, вирусов и клеток организма-хозяина. При эпизоотологическом обследовании на туляремию объектами изучения являются биотические и абиотические компоненты различных структурных уровней природного очага, которыми в зависимости от сезона обследования и типа очага могут быть носители разной степени инфекционной чувствительности, кровососущие переносчики, вода, бентос, гнездо-норовый субстрат и другие.

Эти компоненты, а также облигатная бактериальная и вирусная загрязненность не влияют на ход и результаты ПЦР - анализа. Метод позволяет получать эпидемиологически значимые результаты в течение рабочего дня, то есть за 6-8 часов, или с учетом первичной подготовки материала за 12 часов. Очевидные достоинства метода позволяют успешно использовать ПЦР - анализ на различных этапах эпиднадзора за природно-очаговыми инфекциями (Наумов A.B., Кокушкин A.M., Куличенко А.Н. и др., 1997; Пичурина Н.Л., 1999). Так, при эпизоотическом обследовании природных очагов туляремии, положительные результаты, полученные на этапе, предшествующем постановке биопробы, дают возможность для предварительного заключения о присутствии возбудителя. Это способствует более рациональному отбору проб для последующего целенаправленного и углубленного анализа. На этапе постановки биопроб получение положительных результатов ПЦР определяет целесообразность продолжения биопассажей, даже при отсутствии роста F.tularensis на питательных средах. Использование этого метода при эпидемиологическом надзоре показало, что ПЦР по информативности выше серологических реакций, так как позволяет выявлять как типичные, так и атипичные (с измененной антигенной структурой и вирулентностью) штаммы возбудителя.

Таким образом, внедрение ПЦР в практику эпидемиологического мониторинга за туляремией позволяет получать значимую информацию, необходимую для углубленного суждения об эпидемическом потенциале природного очага.

Помимо чисто прикладных задач, необходимых для эпидемиологического мониторинга (усовершенствование методик обнаружения возбудителя в пробах почвы, воды и т.д.), ПЦР является важным инструментом для получения информации о способах поддержания жизнеспособности микроорганизмов вне связи с организмом животного или человека (Гинцбург

А.Л.,1998; Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., 2002; Жемчугов В.Е., 2004).

В настоящее время доказана способность многих патогенных бактерий существовать и размножаться в объектах внешней среды (Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л. Пушкарева И.В., и др., 1998). Установлено также, что, попадая в неблагоприятные условия среды неспорообразующие бактерии способны переходить в особое состояние (покоящееся, некультивируемое состояние -НС), при котором клетки, сохраняя метаболическую активность, не способны к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста на жидких и плотных питательных средах (Xu H.-Sh., Roberts N., 1982; Roszak D.B., Colwell R.R., 1987). При смене условий существования на благоприятные клетки могут быть рекультивированы, т.е. могут вновь приобрести способность к размножению и росту на обычных питательных средах. Феномен перехода в НС привлекает пристальное внимание исследователей, поскольку существование таких покоящихся форм у патогенных бактерий имеет прямое отношение к закономерностям резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды, обеспечивая сохранение патогенных бактерий в межэпизоотический и межэпидемический периоды. Существование жизнеспособных бактерий в НС имеет серьезное значение в инфекционной патологии людей и животных, так как установлено, что НФ патогенных бактерий сохраняют свои вирулентные свойства. В связи с этим проблема некультивируемых форм чрезвычайно актуальна как в теоретическом, так и в практическом аспекте. До нашего исследования данные литературы по этому вопросу в отношении туляремийного микроба отсутствовали.

Возможность перехода в НС исследовали на шести штаммах туляремийного микроба: Schu (неарктический подвид), 543 (среднеазиатский подвид), 503 (голарктический подвид), а также штаммах F.novicida, F. novicida-like и F.philomiragia. Обнаружено, что для индукции НС у клеток различных штаммов туляремийного микроба необходимо присутствие в воде хлористого натрия, так как в деионизованной воде без соли уже через сутки происходит резкое, «обвальное» снижение числа жизнеспособных клеток независимо от испытуемого штамма и температуры инкубации колб (микрокосмов).

Установлено, что высеваемость клеток различных штаммов туляремийного микроба на плотных питательных средах прекращалась при инкубации при различных температурах и в разные сроки наблюдения по-разному. Так, рост клеток туляремийного микроба на Т-агаре из флаконов, инкубируемых при 37 С, прекращался уже на 3-5 сутки, при 28 °С- 8-14 сутки, а для колб, содержащихся при 4 °С, на 40-45 сутки. В дальнейшем (срок наблюдения 150 суток) роста на плотных питательных средах не наблюдали, хотя ПЦР давала положительный сигнал. Для штаммов F.novicida, F.novicida-like и F.philomiragia эти сроки растягивались вдвое, а при инкубации при 4 °С высеваемость микроорганизмов наблюдалась весь срок наблюдения. По-видимому, штаммы F. novicida, F.novicida-like и F. philomiragia более адаптированы к резко меняющимся условиям существования в воде.

Необходимые для роста туляремийного микроба аминокислоты не влияли на скорость перехода возбудителя в НС. Отмечено возрастание включения метки на 23 и 43 сутки наблюдения, что свидетельствовало о жизнеспособности клеток, хотя культура на плотных питательных средах уже не высевалась. Это заключение подтвердилось и результатами радиоавтографии гелей после электрофоретического разделения белков лизатов этих же клеток.

Осуществлено электронно-микроскопическое изучение НФ туляремийного микроба. Обнаружено, что при индукции НФ образуются так называемые формы несбалансированного роста, относящиеся, вероятно, к начальным этапам L-трансформации.

Получить ревертанты туляремийного микроба из НФ простым посевом на богатые питательные среды (фетальная сыворотка, температурная индукция и т.д.) не удалось. Реверсию НФ F.tularensis удалось получить при использовании модели чувствительных животных только для вариантов, перешедших в некультивируемое состояние при 4 °С и 28 °С. При заражении белых мышей 92-х и 110-х - суточной культурой вирулентного штамма ¥Ли1агет1з животные погибали на 10-25 сутки после заражения (соответственно). При последующих пассажах (органы павших мышей) сроки падежа биопроб сократились до 3-5 суток.

Подтверждением нашей гипотезы о существования туляремийного микроба в окружающей среде в виде «некультивируемых» форм могут также служить результаты исследования полевого материала (вода, солома, органы животных, кровососущие насекомые и др.), собранные при плановом обследовании природных очагов туляремии в Ростовской области в весеннее-летний и осеннее-зимний период 1996-1999 гг. и проведенных под контролем ПЦР. Всего было исследовано более 4000 проб, из них положительными в ПЦР оказалось от 17 до 34% (в зависимости от сезона). Заражение белых мышей такими пробами не вызывало гибели животных в течение 14-28 дней. Однако положительный результат в ПЦР забитых биопроб послужил ориентиром для продолжения пассажей. После 3-5 пассажей удалось выделить культуры из 25 проб. Полученные результаты логично объяснить персистированием туляремийного микроба в окружающей среде в виде НФ, детекция которых традиционными способами оказывается затруднительной.

Таким образом, исследования показали, что в результате вызванного голоданием и при низкой температуре стресса туляремийный микроб может переходить в «некультивируемое» состояние, в котором он, видимо, персистирует в окружающей среде в межэпидемический период. Следует подчеркнуть, что для возбудителя туляремии его адаптация к неблагоприятным условиям и адекватная перестройка метаболизма лучше происходит в условиях низкой температуры.

Любой вид бактерий имеет более или менее широкие, но вполне определенные оптимальные для роста параметры среды: температура, рН, i соленость, концентрация питательных веществ и другие. При попадании в окружающую среду микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию различных стрессов. Ими могут быть острый дефицит питательных веществ, колебания температуры, влажность, рН, осмотическое давление и т.д. Очевидно, что подобные, часто резкие, изменения условий окружающей среды могут иметь самые серьезные последствия для выживания организма, даже если эти изменения были кратковременными. В ответ на изменения окружающей среды бактериальные клетки включают адаптационные механизмы, которые позволяют им выжить в экстремальных условиях. Поэтому изучение адаптации живых организмов к экстремальным условиям обитания является одной из основных проблем клеточной биологии, биохимии и медицины.

Клетки про- и эукариот отвечают на повышение температуры и другие неблагоприятные воздействия остановкой синтеза ряда белков и включением или стимуляцией синтеза специфического набора белков, названных стрессовыми белками (Neidhardt F.S., Van Bogelen R.A., 1987; Weissraan J.S., Holl C.H., Kovalenko O. et al., 1995; Rockabrand D., Livers K., Austin T. et al., 1998). К ним относятся и белки теплового шока. Особенно подвержены стрессу бактерии, приспособленные к внутриклеточному существованию. Возбудитель туляремии представляет собой грамотрицательный внутриклеточный паразит, который при попадании в организм восприимчивого животного способен преодолевать воздействие целого ряда неблагоприятных факторов, составляющих защитные силы макроорганизма (повышение температуры, увеличение концентрации перекиси, снижение рН). Известно, что в условиях стресса бактерии F. tularensis экспрессируют ряд белков, аналогичных GroEL, DnaK и GroES Е. coli (Nano F.E., 1988; Потоцкая И.П., Жиленков Е.Л., 1991; Ericsson М., Tarnvik A., Kuoppa К. et al., 1994; Ericsson M, Golovliov I.,

Sandstrom G. et al., 1997). В связи с этим мы провели исследование по изучению особенностей стрессового воздействия разных температур в условиях in vivo и in vitro, а также выделили и охарактеризовали белок теплового стресса F.tularensis. Установлено, что возбудитель туляремии способен к индукции стрессового ответа in vivo и in vitro, сопровождаемого заметной перестройкой его метаболизма. Повышение температуры приводит к индукции синтеза типичных для стрессового ответа полипептидов, один из которых по ряду признаков (индукция в условиях стрессового ответа, масса субъединиц, полиморфное строение, морфология при электронной микроскопии) можно идентифицировать как стрессовый белок - шаперон GroEL(CpnóO). Данные, полученные нами, позволяют сделать вывод о способности туляремийного микроба приспосабливаться к воздействию окружающей среды. Не исключено, что эта способность обеспечивает возможность возбудителю существовать в некультивируемом состоянии.

Далее мы исследовали стресс-устойчивость (солетолерантность) различных штаммов возбудителя туляремии (неарктический, среднеазиатский и голарктический подвиды). Найдено, что клетки возбудителя туляремии выдерживают значительную концентрацию хлористого натрия (до 4М NaCl). При этом отмечено, что солевой стресс сопровождается изменением содержания общих Сахаров (увеличение содержания в 3-4 раза у стрессированных клеток штаммов Schu , 543 и в 2-3 раза у штамма 503 по сравнению с контрольными клетками), причем увеличение содержания Сахаров наблюдали как в результате выращивание клеток в среде с различным содержанием хлористого натрия в течение длительного времени, так и через 3 часа после приложения стрессовых условий (собственно солевой стресс). При помещении клеток в условия высокого содержания соли отмечали увеличение накопления глицинбетаина. В первые 4 часа инкубации в условиях стресса наблюдали увеличение содержания бетаина в пробах в 5,5 раз для штамма Schu и в 4,8 раз для штамма 503 (концентрация соли 2,0-4,0 М). Через 8 часов инкубирования содержание бетаина было примерно одинаковым для обоих подвидов, а затем начинало снижаться. Экзогенное внесение коммерческого препарата глицинбетаина несколько замедляло (до одной недели) сроки перехода клеток возбудителя туляремии в некультивируемое состояние. При электронномикроскопическом изучении стрессированных клеток туляремийного микроба по сравнению с контрольными выявили определенные различия. Существенную часть популяции составляли клетки с той или иной степенью нарушений цитоплазматических структур. Изучены белковые спектры стрессированных клеток туляремийного микроба. Отмечены различия в профилях белков стрессированных клеток возбудителя туляремии по сравнению с контрольными (ингибирование синтеза некоторых высокомолекулярных белков). Исследовали влияние осмотического стресса на антифагоцитарную активность клеток возбудителя туляремии. Фагоцитоз туляремийного микроба проводили на перитониальных макрофагах белых мышей. О фагоцитарной активности макрофагов судили по следующим показателям: % активных фагоцитов (%АФ), индексу завершенности фагоцитов (ИЗФ) и % поврежденных макрофагов (% ПМ-цитопатическое действие штамма). Обнаружено, что солевой (осмотический) шок влияет на ИЗФ штаммов возбудителя туляремии. Отмечали усиление антифагоцитарного действия в отношении макрофагов, цитопатическое действие (% ПМ) также возрастало. Все это свидетельствует о повышении патогенных свойств F.tularensis в условиях стресса.

При генотипическом изучении ДНК клеток туляремийного микроба в ОП-ПЦР с праймером №15 отмечены отличия в геноме стрессированных клеток по сравнению с интактными, что выражалось в изменении характера распределения полос ДНК-ампликонов (в силу природной пластичности возбудителя). Осмотический шок, сопровождающийся перестройками хромосомы, может явиться одной из причин генотипического разнообразия ¥Ли1агет{$ (.ТоНуег-Оо^еоп А., Бау1(1-1оЬе11 8., Татагш 8Ь. е1: а1. 2000; Бельков В.В. 2002).

Таким образом, возбудитель туляремии обладает устойчивостью (солетолерантностью) к присутствию в среде повышенных концентраций хлористого натрия. В ответ на солевой стресс туляремийный микроб включает генотипические и фенотипические адаптационные механизмы, что позволяет ему приспособиться к неблагоприятным условиям окружающей среды и персистировать в почвенных и водных экосистемах в межэпидемические (межэпизоотические) периоды.

Итак, нам впервые удалось описать феномен некультивируемого состояния у возбудителя туляремии. Показано, что ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба сохраняют свои основные свойства, в том числе и вирулентность. Это может иметь значение в природных условиях в межэпизоотический период и явиться механизмом запуска начала эпизоотии среди чувствительных животных. Существование некультивируемых форм имеет прямое отношение к резервации возбудителей и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Определено, что возбудитель туляремии наделен адаптивной пластичностью, важной для персистенции, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Изучение механизма адаптационной изменчивости туляремийного микроба, роли в этом процессе стрессовых условий, возможность перехода возбудителя в некультивируемое состояние значительно расширило наши представления об экологии возбудителя туляремии. Проведенные исследования легли в основу совершенствования принципов лабораторной диагностики и специфической индикации возбудителя туляремии. Использованный нами впервые метод ПЦР-диагностики при обследовании природных очагов туляремии включен в приказ Минздрава РФ, посвященный усилению мероприятий по профилактике туляремии (1999), что явилось основой для последующего обоснования введения молекулярно-биологических методов в методические указания по эпидемиологическому надзору за туляремией (1999, 2005). Разработанный новый комплекс информативных методов обнаружения и идентификации туляремийного микроба, усовершенствование тактики лабораторной диагностики при эпизоотологическом надзоре за природными очагами туляремии позволили лучше понять паразитарную систему возбудителя, его экологию вообще и в стрессовых условиях, в частности, выявить факторы окружающей среды, вызывающие индукцию некультивируемого состояния у туляремийного микроба, что позволяет по-новому и объективно подходить в прогнозированию состояния природных очагов туляремии и планировать объем профилактических мероприятий, необходимых для предупреждения возникновения эпизоотических и эпидемических осложнений.

Впервые описанное нами явление некультивируемого состояния у F.tularensis, которое ранее не принималось исследователями в расчет, в значительной мере внесло свой вклад в понимание экологии туляремийного микроба и механизмов сохранения возбудителя в природе. Дальнейшее изучение путей адаптации туляремийного микроба к экстремальным условиям окружающей среды с использованием протеомного анализа (Twine S.M., Mykytczuk N.C.S., Petit M.D. et al., 2006) позволит лучше понять биологию возбудителя и, возможно, ' ответить на риторический вопрос R.Titball с соавторами (2003) «Скоро ли будет решена тайна вирулентности Francisella tuîarensis ?».

В своих исследованиях в качестве индуцирующих НС мы использовали абиотические факторы. Остается неизученной возможность перехода возбудителя в НФ при антибиотикотерапии зараженных экспериментальных животных, у животных с хроническим течением заболевания, в организме кровососущих членистоногих, представляющих, по мнению П.А. Петрищевой (1967), своеобразный микропаразитоценоз представителей симбионтов, паразитов и прочих сообитателей.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Романова, Людмила Васильевна, Ростов-на-Дону

1. Аксенов, М.Ю. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью полимеразной цепной реакции / М.Ю. Аксенов, А.Л. Гинцбург // Мол. генет., микробиол. и вирусол. -1993. -№4. С. 3-9.

2. Алексеев, Е.В. Природный очаг туляремии, как биоценотическая функциональная система / Е.В. Алексеев // Эпизоот. природн. очагов, инф.-Саратов, 1985. - С. 68-74.

3. Андреещева, Е. Н. Адаптация клеток солетолерантного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica к солевому стрессу / Е. Н. Андреещева, Е. П. Исакова, Н. Н. Сидоров и др. // Биохимия. 1999. - Т. 64. - Вып.9. - С. 1259-1266.

4. Антонов, В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Группоспецифический ДНК-зонд для идентификации патогенных псевдомонад / В.А. Антонов, B.C. Замараев, В.И. Илюхин // Биотехнология. -1998. №5. - С. 75-84.

5. Антонов, В.А. Использование ПЦР для идентификации Burkholderia mallei / В.А. Антонов, Г.А. Ткаченко, В.В. Алтухова и др. // Мол. генет., и микробиол., и вирусол. 2004. - №1. - С. 12-17.

6. Балахонов, C.B. Методические рекомендации по детекции бруцелл методом полимеразной цепной реакции / C.B. Балахонов, М.Ю. Шестопалов, А.И. Калиновский //Журн. инф. патологии. 1998. - Т.5, №4. - С. 87.

7. Басканьян, И.А. Стресс у бактерий / И.А. Басканьян М., 2003. - 215 с.

8. Басканьян, И.А. Менингококк в состоянии стресса перекрестно реагирует с антигенами других бактерий и человека / И.А. Басканьян, H.H. Алексахина, Н.Е. Ястребова, Н.П Ванеева // Эпидемиология и инф. процесс. 2005. - №3. -С. 9-14.

9. Басканьян, И.А. Голодоние бактерий стресс, обусловленный лимитом субстрата /И.А. Басканьян, В.А. Мельникова // Журн. микробиол., эпидимиол. и иммунобиол. -2001. - №1. - С. 99-103.

10. Батюк, JI.JI. Применение ПЦР как экспресс-метода диагностики туляремии в Сахалинской области / Л.Л. Батюк, C.B. Балахонов, В.Л. Бурый // Актуал. аспекты природноочаг. болезней: Матер, межрегион, науч. практ. конф, Омск. -2001.-С. 160-161.

11. Башаров, М.А. Роль шаперонинов в сворачивании белка. Новая модель строения GroEL/GroES комплекса / М.А. Башаров // Биохимия. 1997. - Т. 62. -Вып. 4. - С. 489-498.

12. Беляков, В.Д. Эпидемиология / В.Д. Беляков, Р.Х. Яфаев. М. Медицина. -1986. -416 с.

13. Березин, И.Ф. Туляремия у работников консервного завода г. Кургана / И.Ф. Березин // Казан, мед. журн. 1931. - Т. 47, №7. -С. 742-747.

14. Бородин, A.M. Детекция Mycoplasma pneumoniae и Chamydophila pneumoniae у больных внебольничной пневмонией в закрытых коллективах / A.M. Бородин, Е.В. Королева, C.B. Хвостова // Журн. микробиол. 2005. - №1. - С. 65-67.

15. Бошнаков, Р.Х. Дифференциальная экспрессия генов в культивируемых и некультивируемых формах Salmonella typhimurium / Р.Х. Бошнаков, Ю.М. Романова, H.A. Зигангирова, A.JI. Гинцбург // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2001. - №3. - С. 8-12.

16. Бузолева, JI.C. Динамика размножения патогенных бактерий в зависимости от трофических и температурных условий культивирования / JI.C. Бузолева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №2. - С. 15-18.

17. Булат, С.А. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов / С.А. Булат, O.K. Кабоев, Н.В. Мироненко // Генетика. -1992.-Т. 28, №5.-С. 19-28.

18. Бухарин, О.В. Экологическая детерминированность внутривидового разнообразия патогенных бактерий / О.В. Бухарин, В.А. Гриценко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №1. - С. 103-106.

19. Бухарин, О.В. О некоторых механизмах персистенции Helicobacter pylori / О.В. Бухарин, В.А. Кириллов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2002. №2. - С. 89-94.

20. Бельков, В.В. Новые представления о молекулярных механизмах эволюции: стресс повышает генетическое разнообразие / В.В. Бельков // Мол. биология. -2002. Т. 36, № 2. - С. 277-285.

21. Викторов, Д.В. Молекулярное типирование штаммов Burkholderia pseudomallei с различной чувствительностью к антибиотикам / Д.В. Викторов, И.Б. Захарова, JI.K. Меринова, В.В. Алексеев // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2006. -№ 1. - С. 7-11.

22. Водопьянов, A.C. Вариабельные тандемные повторы, выявление при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae / A.C. Водопьянов, С.О. Водопьянов, М.Б. Мишанькин и др. // Биотехнология. 2001. - №6. - С. 85-88.

23. Водопьянов, A.C., Вариабельные тандемные повторы у Francisella tularensis: компьютерный анализ генома и использование для молекулярного типирования / A.C. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Н.В. Павлович и др. // Биотехнология. -2003. -№1.- С. 73-78.

24. Водопьянов, A.C. Мультилокусное VNTR типирование штаммов Francisella tularensis / A.C. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2004. - №2. - С. 21-25.

25. Водопьянов, С.О. Стрессовый ответ у возбудителя чумы / С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Б.Н Мишанькин // Биотехнология. 1993. - №11. - С. 26-28.

26. Водопьянов, С.О. Выделение и очистка стрессового белка GroEL у Yersinia pestis / С.О. Водопьянов, И.П. Олейников, Б.Н Мишанькин, С.Р. Саямов // Биотехнология. -1996. №8. - С. 22-55.

27. Воробьев, A.A. Оценка вероятности использовании биоагентов в качестве биологического оружия / A.A. Воробьев // Эпидемиол. и инф. болезни. 2001. -№6. - С. 54-56.

28. Габрилович, Н.М. Практическое пособие по бактериофагии / Н.М. Габрилович -Минск. 1968. - С. 10.

29. Гаер, Г. Электронная гистохимия / Г. Гаер М. - Мир, 1974. - 488 с.

30. Гамова, H.A. Сравнение диагностической ценности различных сред для выделения из клинического материала U.urealiticum и M.hominis / H.A. Гамова, В.М. Безруков // Клин. лаб. диагностика. 2005. - №9. - С. 32-33.

31. Гинцбург, А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний / А.JT. Гинцбург // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - №3. - С. 86-95.

32. Гинцбург, A.JI. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии / A.JI. Гинцбург, H.A. Зигангирова, Ю.М. Романова // Журн. микробиол., эпидимиол. и иммунобиол. 1999. - №5. - С. 22-26.

33. Гинцбург, A.J1. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов в природе / A.JI. Гинцбург, Ю.М. Романова // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1997. - №3. - С. 78-80.

34. Гинцбург, A.JI. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде / A.JI. Гинцбург, Ю.М. Романова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - №3. - С. 116-121.

35. Гинцбург, A.JI. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний / A.JI. Гинцбург, Ю.М. Романова // Клин, лаб. диагностика. 1998. - №2. - С. 35-39.

36. Гинцбург, A.JI. Механизм действия и природа факторов, индуцирующих образование некультивируемых форм у Salmonella typhimurium / A.JI. Гинцбург, Ю.М. Романова, Н.В. Алексеева и др. // Микробиология. 1999. -№6. - С. 3-8.

37. Голубинский, Е.П. Особенности окислительного метаболизма Francisella tularensis при низкотемпературном культивировании / Е.П. Голубинский, Э.Е.

38. Тафелыитейн, Ю.В. Мирончук и др. // Пробл. особо опас. инфекций. Саратов,2000.-Вып. 80.-С. 113-117.

39. Головлев, E.JI. Другое состояние неспорулирующих бактерий / E.JI. Головлев // Микробиология. 1998. - Т. 67, №6. - С. 727-735.

40. Головлев, E.JI. О старых проблемах новой систематики бактерий / E.JI. Головлев // Микробиология. 1998. - Т. 67, №2. - С. 281-286.

41. Гордейко, В.А. Цепь циркуляции иерсиний в агроценозе и эпидемическое ее проявление / В.А. Гордейко // Потенциально патогенные бактерии в природе.-М, 1991. С. 75-85.

42. Грижебовский, Г.М. Обнаружение некультивируемых форм холерного вибриона в окружающей среде / Г.М. Грижебовский, Е.В. Четина, А.Ф. Брюханов и др. // ЗН и СО. 1994. - №4 (13). - С. 13-14.

43. Гусева, Е.Д.-Туляремия / Е.Д. Гусева, Н.С. Дудникова.- Владимир, изд-во ОКНИИ и MC ВНИИЗЖ 2001. 40с.

44. Дебабов, В.Г. Жизнь бактерий за стенами лабораторий / В.Г. Дебабов // Мол. биология. 1999. - Т. 33, №6. - С. 1074-1084.

45. Дентовская, C.B. Генотипированние бруцелл /C.B. Дентовская, А.Н. Куличенко //Пробл. особо опас. инфекций. Саратов, 2000. - Вып. 80. - С. 133-136.

46. Деренко, М.В. Однопраймеровый вариант ПЦР-амплификации участков главной некодирующей области митохондриальной ДНК человека / М.В. Деренко, В.А. Малярчук // Генетика. 1994. - Т. 30. - №11. - С. 1535-1537.

47. Домарадский, И.В. Проблемы патогенности франсиселл / И.В. Домарадский // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - №1. - С. 106-110.

48. Дунаева, Т.Н. О механизме изменений реактивности животных к туляремии при смешанной инфекции / Т.Н. Дунаева, Е.В. Ананова, К.Н. Шлыгина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1978. - №1. - С. 57-61.

49. Дунаева, Т.Н. Изменения фагоцитарной активности к возбудителю туляремии у высокочувствительных животных при смешанной инфекции / Т.Н. Дунаева, К.Н. Шлыгина//Журн.микробиол.,эпидемиол.и иммунобиол.-1977.-№1 .-С.80-91.

50. Дятлов, А.И. О непаразитарном механизме эпизоотии чумы / А.И. Дятлов // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. - С. 105-116.

51. Елфимова, Л.И. Активация аммонием галофильной аланиндегидрогеназы из Halobacterium salinarium / Л.И. Елфимова, Е.А. Сабурова, Л.Н. Чекулаева // Микробиология. 1998. - Т.67, №3. - С. 313-319.

52. Емельяненко, E.H., Полимеразная цепная реакция как метод изучения некультивируемых форм иерсиний в окружающей среде / E.H. Емельяненко, М.Ю. Аксенов, А.Л. Гинцбург, В.Ю. Литвин // Патогенные бактерии в сообществах. М., 1994. - С. 135-139.

53. Емельянова, О.С. Некоторые вопросы микробиологии туляремии / О.С. Емельянова Емельянова О.С. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1946.-№11.-С. 10-16.

54. Ерошенко, Г.А. Молекулярные аспекты изучения возбудителей особо опасных бактериальных инфекций / Г.А. Ерошенко, В.В. Кутырев // Проблемы особо опасных инфекций. 2003. - вып. 86. - С. 54-116.

55. Жемчугов, В.Е. Механизм сохранения и распространения патогенных микроорганизмов (гипотеза) / В.Е. Жемчугов // Эпидемиол. и инф. болезни. -2004. №5. - С. 54-58.

56. Зотина, Т.А. Влияние солености среды на рост и биохимический состав цианобактерий Spirulina platensis / Т.А. Зотина, А.Я. Болсуновский, Г.С. Калачева // Биотехнология. 2000. - №1. - С. 85-86.

57. Иванов, Д.И. Некоторые итоги исследования в очагах туляремии Алтая / Д.И. Иванов, Л.И. Асташина, И.И. Ешелкин // Пробл. природно.-очагов, и зоонозн. инф. в Сибири и на Дальнем Востоке: Тез. докл. к регион, науч. практ. конф. -Чита, 1993.-С. 60-62.

58. Инструкция по лабораторной диагностике туляремии у людей М., 1961. - 26с.

59. Инце, С.А. Инаппаратная туляремия обезьян (клинико-лабораторная характеристика) / С.А. Инце, Г.П. Шумилов, Г.П Ильин и др // Актуал. пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюз. конф. Симферополь, 1991. -С. 76-77.

60. Калабухов, H.A. Периодические (сезонные и годичные) изменения в организме грызунов, их причины и последствия / H.A. Калабухов Л.:Наука, 1969. - 95с.

61. Карпузиди, К.С. Об «атипичных» штаммах туляремийного микроба / К.С. Карпузиди // Труды РПЧИ. Т.7. - Туляремия. - Ростов-на-Дону, 1947.- С. 107118.

62. Константинова, Н.Д. Ультраструктурные особенности взаимодействия Francisella tularensis с Tetrohymena pyriformis / Н.Д. Константинова, М.И. Кормилицина, Л.Л. Диденко, И.С. Мещерякова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №1. - С. 10-15.

63. Кормилицина, М.И. Ассоциация франциселл в эксперименте / М.И. Кормилицина, П.М. Барановский, Е.В. Ананова и др. // Патогенные бактерии в сообществах (механизмы и формы существования): Сб. науч. трудов. М., 1994.-С. 65-70.

64. Кормилицина, М.И. Влияние температурного стресса на вирулентность и синтез белков наружной мембраны Francisella tularensis / М.И. Кормилицина,

65. И.В. Родионова, И.С. Мещерякова // Актуал. аспекты природно очагов, болезней: Матер, межрегион, науч. - практ. конф. - Омск, 2001. - С. 150-152.

66. Коротяев, А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиол. иммунолог, и вирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. Санкт-Петербург, 1998. -580 с.

67. Куличенко, А.Н. Оптимизация способа детекции штаммов чумного микроба при помощи полимеразной цепной реакции / А.Н. Куличенко, О.В. Норкина, А.Л. Гинцбург, Ю.А. Попов и др. // Генетика. 1994. - Т. 30.- С. 167-171.

68. Кунтиков, Е.И. Взаимозависимость гало и термотолерантности у аноксигенных фототрофных бактерий / Е.И. Кунтиков, В.М. Горленко // Микробиология. -1998. Т.67, N23. - С. 298-304.

69. Литвин, В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах / В.Ю. Литвин // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. - С. 20-34.

70. Литвин, В.Ю. Случайный паразитизм микроорганизмов /В.Ю. Литвин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. - №1. - С. 52-55.

71. Литвин, В.Ю. Механизмы устойчивого сохранения возбудителя чумы в окружающей среде (новые факты и гипотезы) / В.Ю. Литвин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - №4. - С. 26-31.

72. Литвин, В.Ю. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий / В.Ю. Литвин,

73. A.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева и др. М., 1998. - 256с.

74. Литвин, В.Ю. Обратимый переход потогенных бактерий в покоящееся (некультивируемое) состояние: экологические и генетические механизмы /

75. B.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева, Ю.М. Романова // Вестник РАМН. 2000. - №1. - С. 7-13.

76. Литвин, В.Ю. Интегративные процессы в современной эпидемиологии / В.Ю., Литвин, А.Л. Гинцбург // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №4. - С. 63-72.

77. Литвин, В.Ю. Эколого-генетические механизмы перехода Salmonella typhimurium в покоящееся состояние в окружающей среде / В.Ю. Литвин, В.И. Пушкарева, Л.В. Солохина и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. - №6. - С. 32-36.

78. Лобзин, Ю.В. Некоторые аспекты биотерроризма / Ю.В. Лобзин, Е.П. Лукин, А.И. Усков // Мед. акад. журн. 2001. - Т. 3, №1. т С. 3-11.

79. Лукин, Е.П. Молекулярно-генетическое разнообразие риккетсий / Е.П. Лукин, A.A. Воробьев, В.В. Малеев, A.C. Быков // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - №1. - С. 92-99.

80. Майский, В.Г. Питательные потребности Francisella tularensis / В.Г. Майский, И.Н. Шишов, Г.И. Басилова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1984. №6.-С. 20-23.

81. Мазепа, A.B. Гидробиологические факторы в эпидемиологии туляремии / A.B. Мазепа: Автореф. дис. канд. мед. наук. Иркутск, 2004. - 22 с.

82. Макаров, A.A. Форма и размеры клеток голодающих микроорганизмов по данным компьютерного анализа образов / A.A. Макаров, А.Г. Дорофеев, Н.С. Паников // Микробиология. 1998. - Т.67, №3. - С. 320-327.

83. Максимов, A.A. Природные очаги туляремии в СССР / A.A. Максимов М. -Д., 1960. - 290с.

84. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Пер. с анг. - М., 1984. - 458 с.

85. Мартин, И. Фолдинг белка, протекающий с участием шаперониновой системы GroEL-GroES / Й. Мартин // Биохимия. 1998. - Т. 63. - Вып.4. - С. 444-452.

86. Маценко, Н.Ю. Анализ дозы гена Нег-2 методом ПНР с использованием внутреннего стандарта в образцах опухолей молочной железы человека / Н.Ю. Маценко, С.П. Коваленко // Мол. генет., микробиол. вирусол. 2006. - №1. - С. 34-38.

87. Мезенцев, В.М. Результаты исследований пастбищных клещей на туляремию в Западно-Казахской области в 1990-1993 годах / В.М. Мезенцев, О.Н. Мезенцева, И.М. Григорьева и др. // Сб. науч. трудов причерноморской ПЧС. -1994.-№1.-С. 227-228.

88. Мезенцева, О.Н. Совершенствование лабораторной диагностики туляремии при эпизоотологическом обследовании / О.Н. Мезенцева, В.М. Мезенцев //

89. Меркулов, А.Э. Популяционная динамика легионелл в водных экосистемах и факторы ее определяющие / А.Э.Меркулов: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1990.-45с.

90. Методические указания по проведению эпидразведки при туляремии. Под ред. И.С.Тинкера. Ростов-на-Дону, 1960. - 13с.

91. Методические указания по лабораторным методам диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии.-М.,1983.-37с.

92. Методические рекомендации по обнаружению туляремийного микроба иммуноферментным методом. Иркутск, 1983. - 7с.

93. Методические рекомендации по обеспечению биологической безопасности технологии криоконсервирования патогенных биоматериалов. Утвержд. Уч. Советом РНИПЧИ прот. №7 от 30.07.1998.

94. Методические указания. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Эпидемиологический надзор за туляремией. МУ 3.1. 2007 -05. -2005. - 24с.

95. Мещерякова, И.С. Актуальные проблемы профилактики туляремии / И.С. Мещерякова//ЗНиСО. 1999. - №11. - С. 17-19.

96. Мещерякова, И.С. Туляремия: современная эпидемиология и эпидемиологический надзор / И.С. Мещерякова // Матер.УШ Всерос. съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т. 1. - С .361-362.

97. Мещерякова, И.С. Характеристика новых видов патогенных микроорганизмов рода Francisella / И.С. Мещерякова, М.И. Кормилицина, И.В. Родионова, Н.Б. Константинова //Журн.микробиол.,эпидемиол.и иммунобиол.-1995.-№5.-С.З-8.

98. Мещерякова, И.С. Иммунобиологическая диагностика туляремии и пути ее совершенствования / И.С. Мещерякова, И.П. Павлова //Актуал.пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всес. конф. Симферополь, 1991. - С. 118120.

99. Мещерякова, И.С. Вопросы патогенности возбудителя туляремии / И.С. Мещерякова, И.В. Родионова // Профилакт. Природно очагов, инф. -:Тез. докл. - Всесоюз. конф. - Ставрополь, 1983. - С. 30-31.

100. Мещерякова, И.С. Патогенные микроорганизмы рода Francisella / И.С. Мещерякова, И.В. Родионова, М.И. Кормилицина // Матер, науч. практ. -конф., посвящ. 100-лет. образов, противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т.2. - С. 84-85.

101. Мирончук, Ю.В. Жизнеспособность и вирулентность Francisella tularensis subsp. holarctica в водных экосистемах (экспериментальное изучение) / Ю.В.

102. Мирончук, A.B. Мазепа // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №2. - С. 9-13.

103. Мирончук, Ю.В. Гидробиологические факторы в экологии Francisella tularensis holarctica ois / Ю.В. Мирончук, A.B. Мазепа, С.Г. Саппо // Журн. инф. -патологии. 1998. - Т.5, №4. - С. 58-62.

104. Михайлова, А.Е. Факторы сохранения холерных вибрионов в водоемах / А.Е. Михайлова, А.Б. Хайтович // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2000.-№6.-С. 99-104.

105. Мишанькин, Б.Н. Туляремия / Б.Н. Мишанькин, Н.В. Павлович, Л.В. Романова и др // Лаб. диагностика возбудителей особо опас. инф. болезней. -Саратов, 1998. Т.1. - С. 111-143.

106. Мишанькин, Б.Н. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипирование / Б.Н. Мишанькин, Л.В. Романова, Ю.М. Ломов и др. // Журн. микробиол., эпидемиол.и иммунобиол. -2000.-№3.-С. 3-7.

107. Монахова, Е.В. Видоспецифический ДНК зонд для идентификации холерных вибрионов / Е.В. Монахова, В.П. Власов. В.И. Вуцан и др. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1993. - №4. - С. 8-11.

108. Налетов, В.Г. Природный очаг туляремии дельты реки Дон в условиях интенсивного хозяйственного освоения территории / В.Г. Налетов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Ставрополь, 1991. - 25с.

109. Некипел ob, H.B. Об эпизоотии туляремии / Н.В. Некипел ов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1946. - №11. - С. 41-46.

110. Нельзина, E.H. К роли гамазовых клещей (Gamasoidoidea parasiticormes) в эпизоотологии туляремии / E.H. Нельзина, Е.И. Линец // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. 1952. - Т.21, №6. - С. 554-559.

111. Норкина, О.В. Детекция возбудителя чумы с использованием ПЦР / О.В. Норкина : Автореф. дис. канд. мед. наук Саратов, 1993. - 25 с.

112. Новикова, Г.В. Белковые сенсоры и передатчики холодового и осмотического стрессов у цианобактерий и растений / Г.В. Новикова, И.Е. Мошков, Д.А Лось. // Молекулярная биология. 2007. - Т.41, № 3. - С. 478-490.

113. Об усилении мероприятий по профилактике туляремии. Приказ Минздрава РФ № 125 от 14.04.1999 г.

114. Об утверждении перечня социальнозначимых заболеваний, представляющих опасность для окружающих. Постановление Правительства РФ № 715 от 01.12.2004 г.

115. Олсуфьев, Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии / Н.Г. Олсуфьев. М., 1975. - 192 с.

116. Олсуфьев, Н.Г. Современное состояние и перспективы развития исследований по природной очаговости туляремии / Н.Г. Олсуфьев // Природно очаговые болезни человека. - М., 1979. - С. 41-46.

117. Олсуфьев, Н.Г. География природно-очаговых болезней в связи с задачами их профилактики / Н.Г. Олсуфьев, Б.П. Доброхотов. М., 1969. - 169 с.

118. Олсуфьев, Н.Г. Природная очаговость эпидемиология и профилактика туляремии / Н.Г. Олсуфьев, Т.Н. Дунаева. М.: Медицина, 1970. - 272 с.

119. Онищенко, Г.Г. Эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации в период с 1991-1996 гг. по заболеваемости социально обусловленными инф. заболеваниями / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - №1. - С. 24-35.

120. Онищенко, Г.Г. Об эпидемической ситуации и заболеваемости природно-очаговыми инфекциями в Российской Федерации и мерах по их профилактике / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. - №3. -С.22-28.

121. Онищенко, Г.Г. Контроль и ликвидация инфекционных заболеваний -стратегическое направление здравоохранения / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №4. - С. 3-16.

122. Онищенко, Г.Г. Инфекционные болезни важнейший фактор биоопасности / Г.Г. Онищенко // Эпидемиол. и инф. болезни. - 2003. - №3. - С. 4-16.

123. Онищенко, Г.Г. Меры по противодействию биологическому терроризму в Российской Федерации / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - №4. - С. 33-37.

124. Онищенко, Г.Г. Заболеваемость антропонозными и природноочаговыми инфекциями и меры их профилактики / Г.Г. Онищенко, JI.C. Сандахчиев, C.B. Нетесова, C.B. Щелкунов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2000.-№6.-С. 83-85.

125. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита. и др.-М., Мир, 1997.-С. 86,112,147.

126. Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2010 года и дальнейшую песпективу. Указ Президента Р.Ф. №2194 от 4.12.2003.

127. Павлович, Н.В. Прозрачная питательная среда для культивирования Francisella tularensis / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Антибиотики и мед. биотехнология. -1987. №2. - С. 133-137.

128. Павлович, Н.В. Фосфатазная и пенициллиназная активности, как стабильные признаки для дифференциации расовой принадлежности Francisella tularensis / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1992. №11-12. - С. 5-7.

129. Павлович, Н.В., Получение бескапсульных вариантов Francisella tularensis / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Г.И. Данилевская и др. // Журн. микробиол. -эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - №2. - С. 7-11.

130. Павлович, H.B. Характеристика биологических свойств бескапсульных вариантов Francisella tularensis / H.B. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Н.Я. Шиманюк и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - №3. -С. 21-27.

131. Пичурина, H.JL Эпидемиологические аспекты туляремии и совершенствование методов лабораторной диагностики (на примере Ростовской области) / H.JI. Пичурина: Автореф. дис. канд. мед. наук. Ростов-на-Дону. - 1999. - 25 с.

132. Плосконосова, И.И. Определение поврежденности и репараций ДНК тканей у-облученных животных методом полимеразной цепной реакции / И.И. Плосконосова, В.И. Баранов, А.И. Газиев // Биохимия. 1999. - Т.64. - Вып.11. -С. 1563-1569.

133. Плотников, А.О. Персистентные свойства бактерий-ассоциантов простейших / А.О. Плотников, Н.В. Немцева, О.В. Бухарин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - №4. - С. 60-62.

134. Погорелов, В.И. Изучение взаимодействия холерных вибрионов с инфузориями Tetrahymena pyriformis / В.И. Погорелов, А.Ф. Пинигин, A.C. Марамович и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. - №2. - С. 22-26.

135. Покровский, В.И. Актуальные проблемы инфекционной патологии / В.И. Покровский, В.К. Малеев // Эпидемиол. и инф. болезни. 1999. - №2. - С. 17-20.

136. Попов, Ю.А. Детекция бактерий Yersinia pestis в органах животных и блохах методом генетического зондирования / Ю.А. Попов, Э.А. Федотов, A.M. Кокушкин //Журн.микробиол.,эпидемиол.и иммунобиол.- 1994. №2. - С. 80-82.

137. Потоцкая, И.В. Белки теплового шока туляремийного микроба / И.В. Потоцкая, E.JI. Жиленков // Актуал. пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всесоюз. конф. Симферополь, 1991. - С. 150.

138. Прозоровский, C.B. L-формы бактерий / C.B. Прозоровский, JI.M. Кац, Г.Я. Каган.-М.: Медицина, 1981.- С. 238.

139. Пушкарева, В.И. Burkholderia cepacia в разных экологических условиях: численность и изменчивость бактериальной популяции / В.И. Пушкарева, В.В. Величко, A.A. Каминская и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - №3. - С. 39-44.

140. Пушкарева, В.И. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: переход в некультивируемое состояние / В.И. Пушкарева, E.H. Емельяненко, В.Ю. Литвин и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997.№3.-С. 3-10.

141. Пушкарева, В.И. Потенциальные хозяева и пути циркуляции Yersinia pseudotuberculosis в водной экосистеме / В.И. Пушкарева, В.Ю. Литвин, Н.М. Шустрова, JI.B. Осернова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1994.-№3.-С. 52-57.

142. Романова, В.П. Пиявки, как возможные хранители возбудителя туляремии / В.П. Романова // Ростовский ПЧИ. Рефераты научно исследовательских работ.- 1949. T.VIII. - С. 124-126.

143. Романова, Ю.М. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели: Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль / Ю.М. Романова: Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 1997.-45 с.

144. Романова, Ю.М. Влияние фактора некроза опухоли на размножение вегетативных и некультивируемых форм сальмонелл / Ю.М. Романова, Н.В. Алексеев, Т.В. Степанова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2002. №4. - С. 20-25.

145. Романова, Ю.М. Механизм активации патогенных бактерий в организме хозяина / Ю.М. Романова, Р.Х. Бошнаков, Т.В. Баскакова, A.JI. Гинцбург // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - № 4 (прил.) - С. 7-11.

146. Романова, Ю.М. Есть ли сходство в механизмах образования «некультивируемых» форм у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? / Ю.М. Романова, A.JI. Гинцбург // Мол. генет., микробиол. и вирус. 1993. - №6.- С. 34-37.

147. Романова, Ю.М. Цитокины-возможные активаторы роста патогенных бактерий / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург// Вестн. РАМН. 2000. - №1. - С. 13-17.

148. Романова, Ю.М. Идентификация генов, нарушающих процесс перехода в некультивируемое состояние у Salmonella typhimurium / Ю.М. Романова, М.Ю. Кириллов, А.А. Терехов и др. //Генетика.- 1996. -Т.32, №9. С. 1150-1157.

149. Рыбакова, Н.А. Эпидемиологическая характеристика природно-очаговых зоонозов в Вологодской области / Н.А. Рыбакова, В.В. Сочнев, Е.Н. Агиевич и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. - №4. - С. 8-11.

150. Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях в Российской Федерации за январь-ноябрь 20006г. // ЗНиСО. 2006. - №12. - С. 60-61.

151. Сергиев, В.П. Реальное место инфекционной патологии в общей заболеваемости населения / В.П. Сергиев, И.Д. Дрынов, Н.А. Малышев // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1999. - №5. - С. 12-15.

152. Соколенко, А.В. Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов / А.В. Соколенко: Автореф. дис. канд. биол. наук. -Саратов, 2000. 21с.

153. Солдаткин, И.С. Эпизоотический процесс в природных очагах чумы (ревизия концепции) / И.С. Солдаткин, Ю.В. Руденчик // Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. - С. 117-130.

154. Сомов, Т.П. Биохимический механизм энергообеспечения клеток Yersinia pseudotuberculosis при низкой температуре культивирования / Г.П. Сомов,

155. Т.И. Бурцева, JI.C. Бузолева // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2000.-№1.-С. 3-6.

156. Сомов, П.В. Вода как новый эпидемиологический фактор туляремии / П.В. Сомов // Известия Ростовского обл. научно исслед. ин-та микробиологии и эпидемиологии. - Ростов н/Д, 1939. - Вып. 18. - 30с.

157. Сосницкий, В.И. Туляремия на севере Европейской части России. Сообщение I. Эпидемиологические особенности туляремии в Архангельской области / В.И. Сосницкий, Р.В. Бузинов // ЗНиСо. 2003. - №12 (129). - С. 27-31.

158. Сосницкий, В.И. Туляремия на севере Европейской части России. Сообщение 2. Характеристика природных очагов туляремии в Архангельской области / В.И. Сосницкий, Р.В. Бузинов // ЗНиСо. 2004. - №6 (135). - С. 27-31.

159. Султанов, Г.В. Современные взгляды на изучение эпизоотии чумы: гипотезы и факты / Г.В. Султанов, М.П. Козлов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - №3. - С. 115-119. '

160. Сучков, И.Ю. Генотипирование Yersinia pestis: вариабельность локуса (СААА)п у природных штаммов, выделенных на территории бывшего СССР / И.Ю. Сучков, Б.Н. Мишанькин, С.О. Водопьянов и др. // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2002. - №4. - С. 18-21.

161. Сучков, Ю.Г. Современное состояние проблемы чумной эпизоотии / Ю.Г. Сучков, М.И. Леви, Б.Н. Мишанькин и др. // Проблемы биомедицины на рубеже XXI века.- М., 2000. С. 180-196.

162. Сучков, Ю.Г. О возможности сохранения возбудителя чумы в почве в покоящейся (некультивируемой) форме / Ю.Г. Сучков, И.В. Худяков, E.H.

163. Емельяненко и др. // Журн. Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. -№4. - С. 42-46.

164. Тинкер, И.С. Бациллоносительство при экспериментальной туляремии / И.С. Тинкер, М.С. Дрожевкина // Ростовский ПЧИ. Рефераты научно исследовательских работ. - 1949. - T.YIII. - С. 115-117.

165. Ткаченко, А.Г. Роль транспорта путресцина и калия в адаптации Escherichia coli к голоданию по аммонию / А.Г. Ткаченко, О.Я. Салахетдинова, М.Р. Пшеничнов // Микробиология. 1996. - Т.65, №6. - С. 740-744.

166. Токарева, В.И. Длительное сохранение покоящихся форм Yersinia pestis (EV) в цистах инфузорий / В.И. Токарева, В.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург // Генная диагностика особо опас. Инфекций: Матер. I Всерос. науч. практ. конф. -Саратов, 2000. - С. 20-21.

167. Троицкая, В.В. Некультивируемые формы Yersinia pseudotuberculosis в почвах природного очага псевдотуберкулеза / В.В. Троицкая, Е.В. Четина, Ю.С. Аляпкина и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - №5. -С. 13-15.

168. Трухачев, А.Л. Способы диагностики и дифференциации возбудителя чумы: детекция атипичных штаммов Yersinia pestis молекулярно-биологическими методами (часть 1) / А.Л. Трухачев, С.А. Лебедева // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2006. - №1. - С. 3-6.

169. Фролова, Г.И. Эпидемиологическая ситуация по туляремии на территории Волгоградской области / Г.И. Фролова, В.Н. Чайка, А.И. Худяков и др. // Природно очаговые инфекции в Нижнем Поволжье. - Волгоград, 2000. - С. 304-307.

170. Хатеневер, Л. Опыты по изучению жизнеспособности B.tularensis / Л. Хатеневер, Л. Левченко // Журн. микробиолог., эпидемиол. и иммунобиол. -1938. Т.20. - Вып. 3-4. - С. 10-14.

171. Хесин, Р.Б. Непостоянство генома /Р.Б. Хесин. М.: Наука, 1985. - 471с.

172. Хлебников, B.C. Превентивная активность моноклональных антител, специфических к липополисахариду Francisella tularensis / B.C. Хлебников, С.С. Ветчинин, Г.К. Гречко и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. - №9-10. - С. 67-70.

173. Цыганкова, О.И. Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации Bacillus anthracis / О.И. Цыганкова, Е.И. Еременко, А.Г. Рязанова, Е.А. Цыганкова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - №3. - С. 69-74.

174. Черкасский, Б.Л. Научные и организационные основы эпизоотолого эпидемиологического надзора за зоонозами / Б.Л. Черкасский // Эпидемиология и инф. болезни. 1997. - №1. - С. 4-8.

175. Чеснокова, М.В. Применение полимеразной цепной реакции для ранней лабораторной диагностики спорадического псевдотуберкулеза / М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, Н.В Бренева и др. // Эпидемиология и инф. болезни. -2001.-№6.-С. 22-26.

176. Четина, Е.В. Влияние некоторых физиологических и генетических факторов на процесс перехода энтеротоксигенных штаммов Escherichia coli в некультивируемое состояние / Е.В. Четина // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1997. - №1. - С. 8-14.

177. Четина, Е.В. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae Ol) / Е.В. Четина, Г.М. Грижебовский, А.Ф. Брюханов и др. // Мол. генет. микробиол. вирус. 1993. - №6. - С. 18-22.

178. Шагинян, И.А. Геномный полиморфизм в решении фундаментальных и прикладных проблем микробиологии и иммунобиологии / И.А. Шагинян // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - №3. - С. 21-24.

179. Шагинян, И.А. Основные типы эпидемически значимых штаммов возбудителей бактериальных инфекций, выявляемые молекулярно-генетическими методами /

180. И.А. Шагинян // Матер. YII съезда Всерос. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 1997. - Т.1. - С. 395-396.

181. Шагинян, И.А. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов / И.А. Шагинян, Гинцбург А.Л. // Генетика. 1995. - Т.31, №5. - С. 600-610.

182. Шагинян, И.А. Генетическое типирование штаммов рода Francisella с помощью универсальных зондов / И.А. Шагинян, Л.В. Комисарова, Г.И. Алешкин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - №6. - С. 76-81.

183. Шагинян, И.А. Исследование геномного полиморфизма штаммов Mycobacterium tuberculosis / И.А. Шагинян, Л.И. Нестеренко, Т.Д. Гришина и др. // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - №3. - С. 65-68.

184. Шевченко, А.И. Характеристика коротких повторяющихся последовательностей ДНК семейства MSAT-160 у полевки Microtus arvalis (Rodentia, Cricetidae) / А.И. Шевченко, С.Я. Слободнюк, С.М. Закиян // Мол. биология. 1998. - Т.32, №4. - С. 603-608.

185. Шеенко, Н.В. Факторы персистенции Francisella tularensis / Н.В. Шеенко, Э.Ф. Опочинский, А.В. Валышев и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - №1. - С. 63-66.

186. Шемякин, И.Г. Конструирование и экспрессия в клетках E.coli гена гибридного белка дифтерийный токсин стрептавидин / И.Г. Шемякин, В.А. Анисимова, П.Х. Копылов и др. //Мол. биология. - 1997. - Т.31, №5. - С. 790-794.

187. Шлыгина, К.Н. Персистенция Francisella tularensis в организме высокочувствительных животных / К.Н. Шлыгина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - №2. - С. 50-53.

188. Шустрова, Н.М. Иерсинии в растениях / Н.М. Шустрова, В.А. Гордейко, Е.Н. Мисуренко, В.Ю. Литвин // Потенциально патогенные бактерии в природе. -М., 1991.-С. 86-92.

189. Шустрова, Н.М. Природные резервуары условно-патогенных бактерий / Н.М. Шустрова, Ю.А. Дубровский // Потенциально патогенные бактерии в природе. -М., 1991.-С. 30-42.

190. Яшечкин, Ю.И. ПЦР -тест -система для детекции возбудителя туляремии / Ю.И. Яшечкин, А.Н. Куличенко, Л.Н. Ивашенцева и др. // Пробл. особо опасн. инфекций. 2003. - Вып.86. - С. 159-163.

191. Abd, Н. Survival and growth of Francisella tularensis in Acanthamoeba castellani / H. Abd, T. Johanson, I.Golovliov et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. -Vol. 69, N.l.-P. 600-606.

192. Adair, D.M. Diversity in variable number tandem repeat from Yersinia pestis / D.M. Adair, P.J. Worsham, K.K. Hill et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, N. 4. -P. 1516-1519.

193. Allardet-Servent, A. DNA polymorphism in strains of the genus Brucella / A. Allardet-Servent, G. Bourg, M. Ramuz, M. Pages et al. // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170,N10.-P. 4603-4607.

194. Albright, L.M. Procariotic signal transduction mediated by sensor and regulator protein pairs / L.M. Albright, E. Huala, F.M. Ausubel //Annu. Rev. Genet. 1989. -Vol. 23.-P. 311-336.

195. Alcala Minagorre, P.J. Francisella tularensis infection transmitted by prairie dog / P J. Alcala Minagorre, A. Fernandez Bernal, A. Scachez Bautista, C. Loeda Ozorez // An Pediatr. (Bare). 2004. - Vol. 60, N. 6. - P. 583-584.

196. Alonso, R. Rapid detection of toxigenic Clostridium difficile strains by a nested PCR of the toxin B gene / R. Alonso, C. Munoz, T. Pelaez, E. Cercenado // Clin. Microbiol. Infect. 1997. - N.3. - P. 145-147.

197. Anda, P. Waterborne outbreak of tularemia associated with crayfish fishing / P. Anda, J.S. del Pozo, J.M.D. Garcia et al. // Emer. Infect. Dis. 2001. - Vol.7, N.3 supp. - P. 575-582.

198. Apte, S.K. Relationship between sodium influx and salt tolerance of nitrogen-fixing cyanobacteria / S.K. Apte, B.R. Reddy, J.Thomas // Appl. Environ. Microbiol. -1987.-Vol.53.-P. 1934-1939.

199. Apte, S. K. Salinity-stress-induced proteins in two nitrogen-fixing Anabaena strains differentially tolerant to salt / S. K. Apte, A.A. Bhagwat // J. Bacteriol. 1989. -Vol.171, N.2.-P. 909-915.

200. Arana, J. Role of hydrogene peroxide in loss of culturability mediated by visible light in Eschirichia coli in a freshwater ecosystem / J. Arana, A. Muela, J. Iriberri et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol.58. - P. 3903-3907.

201. Argaw, T. Development of a real time quantitative PCR assay for detection porcine endogenous retrovirus / T. Argaw, A. Ritzhaupt, C.A. Wilson // J. Virol. Meth. -2002. -Vol.106, N1. P. 97-106.

202. Avashia, S. Prairie dog to human tularemia transmission, Texas 2002 / S. Avashia, J.M. Petersen, C. Lindly et al. // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol.10. - P. 483-486.

203. Back, E. Recent epidemiology of tularemia in Sweden / E. Back, H. Eliasson // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biologilal Laboratoiy.USA. 2006. - P.224 A.

204. Baltazard, M. La conservation de la peste en foyer invetere / M. Baltazard // Med. et Hygiene. 1964. - Vol.22. - P. 1-15.

205. Baltazard, M. La conservation interepizootique de la peste en foyer invetere. Hypotheses de travail / M. Baltazard, J. Karimi, M. Eftekhari e.a. // Bull. Soc. -Pathol. Exot. 1963. - Vol.56. - P. 1230-1241.

206. Bardwell, C.A. Ancient heat gene is dispensable / C.A. Bardwell, E.A. Graig // J. Bacteriol. 1988. - Vol.170, N.7. - P. 2977-2983.

207. Barns, S.M. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples / S.M. Barns, C.C. Grow, R.T. Okinaka, P.Keim, C.R. Kuske // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - Vol.71, No.9. - P. 5494-5500.

208. Bassam, B.J. DNA amplification fingerprinting of bacteria / B.J. Bassam, G. Caetano-Anolles, P.M. Gresshoff // Appl. Microbiol. 1992. - Vol.38. - P. 70-76.

209. Bebbington, K.J. A role for DNA supercoiling in the regulation of the cytochrome bd oxidase of Escherichia coli / K.J. Bebbington, H.D. Williams //Microbiology. 2001. -Vol. 147.-P. 591-598.

210. Bej, A. Molecular based methods for the detection of microbial pathogenes in the environment / A. Bej // J. Microbiol. Methods. 2003. - Vol.53. - P. 139-140.

211. Bej, A.K. Application of the polymerase chain reaction in environmental microbiology / A.K. Bej, M.H. Mahbubani // PCR Meth.Appl.- 1992. Vol.1. -P. 151-159.

212. Ben-Amotz, A. The role of glycerol in the osmotic regulation of the halophilic alga Dunaliella parva /A. Ben-Amotz, M. Avron // Plant Physiol. 1973. - Vol. 51. - P. 875-878.

213. Berche, P. The novel epidemic strain 0139 is closely related to the pandemic strain 01 of Vibrio cholerae / P. Berche, C. Poyart, E. Abachin et al. // J. Infect. Dis. -1994. Vol.170. - N.3. - P. 701-704.

214. Berdal, B.R. Field investigation of tularemia in Norway / B.R. Berdal, R. Mehl, N.K. Meidell et al. //FEMS Immun. Med. Microbiol. 1996. - Vol.13. - P. 191-195.

215. Berdal, B.R. Field detection of Francisella tularensis / B.R. Berdal, R. Mehl, H. Haakeim et al. // Scand. J. Infect. Diseases. 2000. - Vol.32. - N.3. - P. 287-291.

216. Berhander, S. A nested polymerase chain reaction for detection of Legionella pneumophila in clinical specimens / S. Berhander, H.S. Hanson, B. Johansson, L.V. Von Stedigk // Clin. Microbiol. Infect. 1997. - Vol.3, N.4. - P. 95-101.

217. Berg, G.R. Stress proteins and thermotolerance in psychrotrophic yeasts from arctic environments / G.R. Berg, W.E. Inniss, J. Heikkila// Can. J. Microbiol. 1987. - Vol. 33.-P. 383-389.

218. Berlin, D.L. Response of pathogenic Vibrio species to high hydrostatic pressure / D.L. Berlin, D.S. Herson, D.T. Hicks, D.G. Hoover // Appl. Environ. Microbiol. -1999. Vol.65, N.6. - P. 2776-2780.

219. Bhatnagar, N.B. Heat stress alters the virulence of a rifampin-resistant mutant of Francisella tularensis LVS / N.B. Bhatnagar, K.L. Elkins, A.H. Fortier // Infect. Immun. 1995. - Vol.63, N.l. - P. 154-159.

220. Bliska, J.B. Signal transduction in the mammalian cell during bacterial attachment and entry / J.B. Bliska, J.E. Galan, S.Falkow // Cell. 1993. - Vol.73. - P. 903-920.

221. Bossi, P. Biotrrrorism management of vajor biological agents / P. Bossi, D. Garin, A. Guihot, F. Gay et al. // Cell Mol. Life Sei. 2006. - Vol.63. - P. 2196-2212.

222. Braig, K. The crystal structure of bacterial chaperonin GroEL at 2,8 A / K. Braig, Z. Otwinowski, RHegde et al. //Nature. 1994. - Vol.371. - P. 578-586.

223. Bridges, B.A. Hypermutation in bacteria and other cellular systems / B.A. Bridges // Philos. Trans. Roy. Soc. London. B. Biol. Sei. 2001. - Vol. 356. - P. 29-39.

224. Brown, A.D. Microbial water stress physiology. Principles and perspectives / A.D. Brown.- Chichester. U. K., 1990. 120 p.

225. Brown, T. Northern hybridization of RNA fractionated by agarose-formaldehyde gel electrophoresis / T. Brown // Current protocols in molecular biology/ Eds. Ausebel F.M., Brent R., Kingston R.E. et al. -New York, 1993. P. 491-496.

226. Buchmeir, N.A. Induction of Salmonella stress proteins upon infection of macrophages /N.A. Buchmeir, F. Heffron // Science. 1990. - V.248. - P. 730-732.

227. Buchner, J. Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones / J.Buchner // FASEB J. 1996. -N.10. - P. 10-19.

228. Bukau, B. Cellular defects caused by detection of the Escherichia coli dnaK gene indicated roles for heat shock protein in normal metabolism / B. Bukau, G.C. Walker // J .Bacteriol. 1989. - Vol.172, N.5. - P. 2337-2346.

229. Caetano-Anolles, G. Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers /G. Caetano-Anolles // PCR Meth. Appl. 1993. - N.3. - P. 85-94.

230. Caetano-Anolles, G. DNA amplification fingerprinting using arbitrary oligonucleotide primer / G. Caetano-Anolles, B.J. Bassam // Appl. Biochem. Biotech. 1993. - Vol.43. - P. 189-200.

231. Caetano-Anolles, G. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers / G. Caetano-Anolles, B.J. Bassam, P.M. Gresshoff // Bio/Technology. 1991. - Vol.9. - P. 553-557.

232. Caetano-Anolles, G. DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition / G. Caetano-Anolles, BJ. Bassam, P.M. Gresshoff// Bio/Technology. 1992. - Vol.10. -P. 937-942.

233. Calamita, G. Regulation of the Escherichia coli water channel gene aqpZ / G. Calamita, B. Kempf, M. Bonhivers et al. // Proc. Nalt. Acad. Sei. 1998. - Vol 95, №7.-P. 3627-3631.

234. Caro, A. Viability and virulence of experimentally stressed nonculturable Salmonella typhimurium / A. Caro, P. Got, J. Lesne et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -Vol.65, N.7. - P. 3229-3232.

235. Cellini, L. Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro reverts in mice / L. Cellini, N. Allocati, D. Angelucci et al. //Microbiol.Immunol.-1994.-Vol.38.-P. 834.

236. Center for Disease Control and Prevention. Tularemia United States, 1990-2000 // Morb. Mortal Wkly Rep. - 2002. - Vol.51. - P. 182-184.

237. Center for Disease Control and Prevention. Outbreak of tularemia among commercially distributed prairia dogs, 2000 // Morb. Mortal Wkly Rep. 2002. -Vol.51.-P. 688-689.

238. Chakroborty, S. Assembly of type IV pili in Francisella tularencis and role in virulence / S. Chakroborty, M. Monfett, D. Maier et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biologilal Laboratory. USA. 2006. - P. 9C.

239. Christensen, J.J. New diagnostic methods for bacterial infections after the introduction of increased bioterrorism preparedness / J.J. Christensen, K. Andresen, M. Kemp // Ugeskr. Laeger. 2005. - Vol.167. - N.36. - P. 3416-3417.

240. Christman, M.F. Positive control of regulon for defences against oxidative stress and some heat shock proteins in Salmonella typhimurium / M.F. Christman, R.W. Morgan, F.S. Jacobson B.H. Ames // Cell. 1985. - Vol.41. - P. 753-762.

241. Colwell, R.R. Vibrio cholerae and related vibrions in the aquatic environment an ecological paradigm / R.R. Colwell // Perspect. Microbiol. Ect.: Proc. 4th Int. Symp. -Ljubljana. - 1986. - P. 426-434.

242. Colwell, R.R. Nonculturable but still viable and potentially pathogenic / R.R. Colwell // Zbl. Bakt. 1993. - B.279, N.2. - S. 154-156.

243. Colwell, R.R. Viable but nonculturable Vibrio cholerae 01 revert to a culturable state in the human intestine / R.R. Colwell, P. Brayton, D. Herrington et al. // World J. Microbiol. Biotechnol. 1996. - Vol.12. - P. 2831.

244. Colwell, R.R. Vibrio in the environment: Viable but nonculturable Vibrio cholerae / R.R. Colwell, A. Huq // Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives Eds. Wachsmuth I.K., Blake P.A., Olsvik O. -Washington, 1994. P. 117-133.

245. Conter, A. Plasmid DNA supercoiling and survival in ling-term cultures of Escherichia coli: role ofNaCl / A. Conter //J.Bacteriol.-2003.-Vol. 175. P. 5324-27.

246. Conter, A. Survival of Escherichia coli during long-term starvation effects of aeration, NaCl, and the rpoS and osmC gene products / A. Conter, C. Gagneux, M. Suzanne, C.Gutierrez // Res. Microbiol. 2001. - Vol. 152. - P. 17-26.

247. Conter, A. Role of DNA supercoiling and RpoS sigma factor in the osmotic and growth phase-dependent induction of the gene osmE of Escherichia coli K-12 / A. Conter, C. Menechon, C. Gutierrez // J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 273. - P. 75-83.

248. Craig, E. Chaperones: helpers along the pathways to folding / E. Craig // Science. -1993. Vol.260. - P. 1902-1903.

249. Cronquist, S.D. Tularemia: the diseases and weapon / S.D. Cronquist // Dermatol. Clin. 2004. - Vol.22. - N.3. - P. 313-320.

250. Csonka, L.N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress / L.N. Csonka//Microbiol. Rev. 1989. -Vol. 53, N.l.-P. 121-147.

251. Csonka, L.N. Procaryotic osmoregulation: genetics and physiology / L.N. Csonka, A.D. Hanson // Annu. Rev. Microbiol. 1991. - Vol.45. - P. 569-606.

252. De La Puente-Redondo, V.A. Comparison of different PCR approaches for typing of Francisella tularensis strains / V.A. De La Puente-Redondo, N.G. Del Blanco, C.B. Gutierres et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38. - P. 1016-1022.

253. De Wit, D. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens by DNA amplification / D. De Wit, L. Steyn, S. Shoemaker, M. Sogin // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol.27. - N.ll. - P. 2437-2441.

254. Deutz, A. Sero-epidemiological studies of zoonotic infections in hunters-comparative analysis with veterinarians, farmers and abattoir workers / A. Deutz, K. Fuchs, N. Nowotny et al. // Wien Klin. Wochenschr. 2003. - Vol.115. - suppl 3. - P. 61-67.

255. Dubois, M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / M. Dubois, K.A. Gilles, J.K. Hamilton et al. // Anal. Chem. 1956. - Vol.28, N.3. -P. 350-356.

256. Dukan, S. Recovery of culturability of an MOCI-stressed population of Escherichia coli after incubation in phosphate buffer: resuscitation or regrowth? / S. Dukan, Y. Levi, D.Touati // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol.63, N.l 1. - P. 4204-4209.

257. Duncan, S. Luminescence-based detection of activity of starved and viable but nonculturable bacteria / S. Duncan, L.A. Glover, H. Killham et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol.60. - P. 1308-1316.

258. Durand, S.V. Quantitative real time PCR for the measurement of white stop syndrom virus in schrimp / S.V. Durand, D.V. Lightner // J. Fish Diseases. 2002. - Vol.25, N.7.-P. 381-389.

259. Eigelsbach, H.T. Genus Francisella / H.T. Eigelsbach, V.G.McGann // Bergey s manual of systematic bacteriology. Eds.Krieg N.R., Holt J.G - Baltimore, 1984. -Vol.1.-P. 394-399.

260. Eisenstaek, A. Escherichia coli genes involved in all survival during dormancy role of oxidative stress / A. Eisenstaek, C. Miller, J. Jones, S. Leven // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1992. - Vol.188. - P. 1054-1059.

261. Eliasson, H., Lindback J., Nuorti J.P. et al. The 2000 tularemia outbreak: a case-control study of risk factors in disease-endemic and emergent areas, Sweden // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol.8, N.9. - P .956-960.

262. Eliasson, H. Clinical use a diagnostic PCR for Francisella tularensis in patients with suspected ulceroglandular tularemia / H. Eliasson, A. Sjostedt, E. Back // Scand. J. Infect. Dis. 2005. - Vol.37. - P. 833-837.

263. Ellis, J. Proteins as molecular chaperons / J. Ellis // Nature. 1987. - Vol.328. - P. 378-379.

264. Ellis, J. Tularemia / J. Ellis, C.F. Oyston, M. Green, R.W. Titball II Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol.25. - P. 631-646.

265. Ellis, R. Folding and Desing / R.Ellis -1996.-I, R9-R15.

266. Ericsson, M. Increased synthesis of DnaK, GroRL and GroES gomologs by Francisella tularensis LVS in response to heat and hydrogen peroxide / M. Ericsson, A. Tarnvik, K. Kuoppa et al. // Infect. Immun. 1994. - Vol.62. - P. 178-183.

267. Erlich, H.A. Recent advances in the polymerase chain reaction / H.A. Erlich, D. Gelfand, J.J. Sninsky// Science. 1991. - Vol.252. - P. 1643-1651.

268. Epstein, P.R. Cholerae and the environment / P.R.Epstein // Lancet. 1992. -Vol.339, N.8802. - P. 1167-1168.

269. Esposito, D. Interaction with natural polyamines and thermal stability of DNA. ADSC stude and theoretical reconsideration / D. Esposito, P. Del Vecchio, G. Barone // J. Amer. Chem. Soc. 1997. - Vol.119. - P. 2606-2613.

270. Fanning, S. PCR in genom analysis / S. Fanning, R.A.Gibbs // Genom Analysis. -1997.-Vol.1.-P. 249-299.

271. Farlow, J. Francisella tularensis strain typing using multiple-locus, variable-number tandem repeat analysis / J. Farlow, K.L. Smith, J.Wong et al. // J. Clin. Microbiol. -2001.-Vol.39.-P. 3186-3192.

272. Farlow, J. Francisella tularensis in the United States / J. Farlow, D.M. Wagner, M. Dukerick et al. // Emerg. Inf. Dis. 2005. - Vol.11, No. 12. - P. 1835-1841.

273. Fayet, O. The groES and groEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperature / O. Fayet, Th. Ziegelhoffer, C. Georgopoulos // J. Bacteriol. 1989. - Vol.171, N.3. - P. 1379-1385.

274. Fekete, A. Preliminary development of diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction / A. Fekete, J.A. Bantle, S.M. Hailing, M.R. Sanborn // J. Appl. Bacteriol. 1990. - Vol.69, N.2. - P. 216-227.

275. Fekete, A. Amplification fragment length polymorphism in Brucella strains by use of polymerase chain reaction with arbitrary primer / A. Fekete, J.A. Bantle, S.M. Hailing, R.W.Stich // J. Bacteriol. 1992. - Vol.174, N.23. - P. 7778-7783.

276. Felts, R.L. Crystallization of Acp A, a respiratory burst- inhibiting acid phosphatase from Francisella tularensis / R.L. Felts, T.J. Reilly, J.J. Tanner // Biochim. Biophys. -Acta. 2005. - Vol.1752, N.l. - P. 107-110.

277. Fleming, D.E. Studies on the physiology of virulence of Pasteurella tularensis. I. Citrulline-ureidase and deamidase activity / D.E. Fleming, L.Foshay // J. Bacteriol. -1955. Vol.70. - P. 345-349.

278. Fields, P.J. A Salmonella locus that controls resistance to microbicidal proteins from phagocytic cells / P.J. Fields, E.A. Groisman, F. Heffron // Science. 1989. -Vol.243.-P. 1059-1063.

279. Fohlman, J. Microbial diagnosis with PCR will become clinically beneficial with a faster analysis / J. Fohlman, J. Blomberg, G. Froman et al. // Lakartidningen. 2004. -Vol.101, N.17.-P. 1488-1492.

280. Forsman, M. Recent insights into ecology of tularemia in Sweden / M. Forsman,

281. A.Ch. Andersson, T. Broman et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biologilal Laboratory. USA. 2006. - P. 2D.

282. Forsman, M. Francisella tularensis does not manifest virulence in viable but non-culturable state / M. Forsman, E.W. Hennington, E. Larson et al. // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - Vol.31, N.3. - P. 217-224.

283. Forsman, M. Use of RNA hybridization in the diagnosis of a case of ulceroglandular tularemia / M. Forsman, K. Kuoppa, A. Sjostedt, A. Tarnvic // Eur. J. Clin. -Microbiol. Infect. Dis. 1990. - Vol.9. - P. 784-785.

284. Forsman, M. Identification of Francisella tularensis in natural water by the polymerase chain reaction / M. Forsman, A. Norqvist, G.Sandstrom // Sci. Conf. Chem. and Biol. Def. Res. Aberdeen. - 1994. - P. 15.

285. Forsman, M. Identification of Francisella tularensis in natural water samples by PCR / M. Forsman, A. Niren, A. Sjostedt et al. // FEMS Microbiol. Ecol. 1995. -Vol.16.-P. 83-92.

286. Forsman, M. Identification of Francisella species and discrimination of type A and type B strains of F. tularensis by 16S rRNA analysis / M. Forsman, G. Sandstrom,

287. B.Jaurin // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol.56. - P. 949-955.

288. Foster, P.L. Adaptive mutation: implication for evolution / P.L. Foster // BioEssays. -2000. Vol. 22, N. 12. - P. 1067-1074.

289. Foster, P.L. Stress responses end genetic variation in bacteria / P.L. Foster // Mutation Research. 2005. - Vol.569. - C. 3-11.

290. Francis, F. Tularemia / F.Francis // JAMA. 1925. - Vol.84. - P. 1243-1250.

291. Fry, J.C. A method for estimating viability of aquatic bacteria by slide culture / J.C. Fry, T. Zia // J. Appl. Bacteriol. 1982. - Vol.53. - P. 189-198.

292. Fujita, O. Development of real-time PCR assay for detection and quantification of Francisella tularensis / O. Fujita, M. Tatsumi, K. Tanabayashi, A. Yamada // Jpn. J. Infect. Dis. 2006. - Vol.59. - P. 46-51.

293. Fulop, M. A rapid, highly sensitive method for the detection of Francisella tularensis in clinical samples using the polymerase chain reaction / M. Fulop, D. Leslie, R.Titball // Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1996. - Vol.54. - P. 364-366.

294. Galan, J.E. Expression of Salmonella typhimurium genes required for invasion is regulated by changes in DNA supercoiling / J.E. Galan R.III Curtiss // Infect. Immun. 1985. - Vol.58. - P. 1879-1885.

295. Gallagher-Smith, M. Francisella tularensis: possible agent in bioterrorism / M. Gallagher-Smith, J. Kim, R. Al-Bawardy, D. Josko // Clin. Lab. Sci. 2004. -Vol.17, N.l. - P. 35-39.

296. Garcia del Blabco, N. Biochemical characterisation of Francisella tularensis strains isolated in Spain / N. Garcia del Blabco, C.B. Gutierrez Martin, V.A. de la Puente Redondo, E.F. Rodriguez Ferri // Vet. Rec. 2004. - Vol.154, N.2. - P. 55-56.

297. Gentry, D.R. Synthesis of the stationary phase sigma factor sS is positively regulated by ppGpp / D.R., Gentry V.J., Hernandez L.H. Nguyen et al. // J. Bacteriol. 1993. -Vol.175.-P. 7982-7989.

298. Georgopoulus, C., Role of the major heat shock protein as molecular chaperones / C. Georgopoulus, W.J. Welch // Annu. Rev. Cell Biol. 1993. - Vol.9. - P. 601-634.

299. Giaever, H.M. Biochemical and genetic characterization of osmoregulatory trehalose synthesis in Escherichia coli / H.M. Giaever, O.B. Styrvold, I. Kaasen, A.R Strom // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170. - P. 2841-2849.

300. Gil, H. Presence of pili on the surface of Francisella tularensis / H. Gil, J.L. Benach, D.G. Thanassi // Infect. Immun. 2004. - Vol.72. - P. 3042-3047.

301. Gilett, J.D. Direct and indirect influences of temperature on the transmission of parasites from insects to man / J.D. Gilett // Symp. Brit. Soc. Parasitol. 1974. -Vol.12.-P. 79-95.

302. Gillings, M. Repetitive element PCR fingerprinting (rep-PCR) using enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) primers is not necessarity directed at ERIC element/M. Gillings, M.Holley //Lett. Appl. Microbiol. 1997. - Vol.25. - P. 17-21.

303. Gilson, E. A family of interspersed extragenic palindromic DNA sequences in E. coli / E. Gilson, J.M. Clement, D. Brutlag, D. Hofnung // EMBO J. 1984. - Vol.3. -P. 1417-1421.

304. Goodman, M.F. Error-prone repair DNA polymerases in prokariotes and eukariotes / M.F. Goodman // Annu. Rev. Biochem. 2002. - Vol.71. - P. 17-50.

305. Gorovits, B.M. The molecular chaperonin cpn 60 displays local flexibility that is reduced after binding with an unfolded protein / B.M. Gorovits, P.M. Horowitz // J. Biol. Chem. 1995. - Vol.270, N.22. - P. 13057-13062.

306. Greub, G. Microorganisms resistant to free-living amoebae / G. Greub, D. Raoult // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol.17, N.2. - P. 413-433.

307. Grimes, D.J. The fate of enteric pathogenic bacteria in estuarine and marine environment / D.J. Grimes, R.W. Atwell, B.R. Brayton et al. // Microbiol. Sei. -1986.-Vol.3.-P. 324-329.

308. Grimont, F. Molecular typing of Brucella with cloned DNA probes / F. Grimont, J.M. Verger, P.Cornelis et al. // Res. Microbiol. 1992. - Vol.143. - P. 55-65.

309. Grunow, R. Detection of Francisella tularensis / R. Grunow, H. Meyer, E-J. Finke // Medizinische B Schutz - Tagung des BMVg - München, 1997. - P. 18.

310. Gurcan, S. An outbreak of tularemia in Western Black Sea region of Turkey / S. Gurcan, M.T. Otkun, M. Otkun et al. // Gonsei Med. J. 2004. - Vol.29. - P. 17-22.

311. Gurycova, D. First isolation of Francisella tularensis subsp. tularensis in Europe / D. Gurycova // Eur. J. Epidemiol. 1998. - Vol.14. - P. 797-802.

312. Hames, B.D. Nucleic acid hybridization: a practical approach / B.D. Hames, S.J. Higgins. IRL Press. - Oxford. - 1985.

313. Hartley, M.G. Protection afforded by heat shock protein 60 from Francisella tularensis is due to copurified lipopolysacaride / M.G. Hartley, M. Green, G. Choules et al. // Infect. Immun. 2004. - Vol.72. - N.7. - P. 4109-4113.

314. Helvaci, S. Tularemia in Bursa, Turkey: 205 cases in ten years / S. Helvaci, S. Gedikoglu, H. AkalinH.B. Oral // Eur. J. Epidemiol. 2000. - Vol.16. - P. 271-276.

315. Hendrick, Y.P. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins / Y.P. Hendrick, F.U. Hartl // Annu. Rev. Biochem. 1993. - Vol.62. - P. 349-384.

316. Hobbie, J.E. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy / J.E. Hobbie, R.J. Daley, S. Jasper// Appl. Environ. Microbiol. 1977. -Vol.33.-P. 1225-1228.

317. Hoff, K.A. Survival of Vibrio salmonicida at different salinities / K.A. Hoff // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - Vol.55. - P. 1775-1786.

318. Hopper, B.R. Detection of Brucella abortus in mammalian tissue using biotinylated whole genomic DNA as a molecular probe / B.R. Hopper, M.R. Sanborn, J.A. Bantle // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1989. - Vol.50. - P. 2064-2070.

319. Hoyer, B.H. Homologies deoxyribonucleic acids from Brucella ovis, canis, abortus and other Brucella / B.H. Hoyer, N.B. McCullough // J. Bacteriol. 1986. - Vol.96. -P. 1783-1790.

320. Hsieh, L. Bacterial supercoiling and ATP/ADP changes associated with a transition to anaerobic growth / L. Hsieh, R.M. Burger, K Drica // J. Mol. Biol. 1991. - Vol. 219.-P. 443-450.

321. Hsieh, L. Bacterial DNA supercoiling and ATP./[ADP] ratio: channels associeted with salt shock / L. Hsieh, J. Rouviere-Yaniv, K. Drica // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173.-P. 3914-3917.

322. Hulton, C.S.J. ERIC sequences: family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria / C.S.J. Hulton, C.F. Higgins, P.M. Sharp // Mol. Microbiol. 1991. - Vol.5. - P. 825-834.

323. Huq, A. Colonization of the gut of the blue crab (Callinectes sapidus) by Vibrio cholerae / A. Huq, Sh. Huq, D. Grimes et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1986. -Vol.52, N.3.-P. 586-588.

324. Hussong, D. Viable Legionella pneumophila not detectable by culture on agar medium / D. Hussong, R.R. Colwell, H. O'Brien et al. // Bio/Technology. 1987. -Vol.5.-P. 947-950.

325. Innis, M. PCR strategies / M. Innis, D. Gelfand, J.Sninsky.- Acad.Press.-San Diego, 1995. 153p.

326. Ireland, Ah. Biofllm formation by Francisella tularensis / Ah. Ireland, M.S. Lever, R.W. Titball et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biologilal Laboratory. USA. 2006.-P. 219A.

327. Islam, M.S. Survival of toxigenic Vibrio cholerae 01 with a common ducweed, lemma minor, in artificial aquatic ecosystems / M.S. Islam, B.S. Drasar, D.J. Bradley // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. - Vol.84, №3. - P. 422-424.

328. Iton, H. Mamalian 60 kDa stress protein (chaperonin homolog) / H. Iton, R. Kobayashi, H.Wakui et al. //J.Biol.Chem. 1995. - Vol.270, N.22. - P. 13429-13435.

329. Iyer, V. A role for osmotic stress induced proteins in the osmotolerance of nitrogen-fixing cyanobacterium, Anabaena sp. Strain L31 /V. Iyer, T. Fernandes, S.K.Apte // J. Bacteriol. - 1994. - Vol.176, N.18. -P. 5868-5870.

330. Jeffreys, A.J. Hypervariable «minisatellite» gerios in human DNA / A.J. Jeffreys, V. Wilson, S.L.Thein //Bio/Technology. 1992. - Vol.24. - P. 467-472.

331. Jishage, M. Regulation of sigma factor competition by the alarmone ppGpp / M. Jishage, K. Kvint, V. Shingler, T. Nystrom //Genes Dev.-2002.-Vol.l6.-P.1260-1270.

332. Johansson, A. Comparative analysis of PCR ressus culture for diagnosis of ulcerglandular tularemia / A. Johansson, L.Berglund, U. Eriksson et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38, N.l. - P. 22-26.

333. Johansson, A. Worldwide genetic relationship among Francisella tularensis isolated determined by multiple-locus-variable-number tandem repeat analysis / A. Johansson, J. Farlow, P. Larsson et al. // J. Bacteriol. 2004. - Vol.186, N.17. -P. 5808-5818.

334. Johansson, A. The development of tools for diagnosis of tularemia and typing of Francisella tularensis / A. Johansson, M. Forsman, A. Sjostedt // APMIS. 2004. -Vol.112, N.l 1-12. - P. 898-907.

335. Johansson, A. Extensive allelic variation among Francisella tularensis strains in a schort sequence tandem repeat region / A. Johansson, I. Goransson, P. Larsson, A. Sjostedt// J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol.39, N.9. - P. 3140-3146.

336. Jones, S.W. DNA assays for detection, identification and individualization of select agent microorganisms / S.W. Jones, M.E. Dobson, S.C. Francesconi et al. // Croat Med. J. 2005. - Vol.46, N.4. - P. 522-529.

337. Kantor, G.J. Effect of nalidixic acid and hydroxyurea on division ability of Escherichia coli Fil+ and Lon" strains / G.J. Kantor, R.A. Deering // J. Bacteriol. -1968.-Vol.95.-P. 520-530.

338. Kappes, R.M. Three transport systems for the osmoprotectant glycine betaine operate in Bacillus subtilis: characterization of OpuD / R.M. Kappes, B. Kempf, E.Bremer // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 5071-5079.

339. Kaprelyants, A.S. Dormancy in non-sporulating bacteria / A.S. Kaprelyants, J.C. Gottschal, D.B. Kell // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - Vol.140. - P. 271-286.

340. Karhukorpi, E.K. Rapid laboratory diagnosis of ulceroglandular tularemia with polymerase chain reaction / E.K. Karhukorpi, J. Karhukorpi // Scand. J. Infect. Dis. -2001. Vol.33, N.5. - P. 383-385.

341. Karlsson, K.A. Studies of the diagnosis of tularemia / K.A. Karlsson, O. Soderlund // Contrib. Microbiol. Immunol. 1973. - Vol.2. - P. 224-230.

342. Kashiwagi, K. Apparently poliamine transport by proton motive in force in polyamine-deficient Escherichia coli / K. Kashiwagi, H. Kobayashi, K. Igasashi // J. Bacteriol. 1986. - Vol.165. - P. 972-977.

343. Keim, P. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis reveals genetic relationship within Bacillus anthracis / P. Keim, L.B. Price, A.M. Klevytska et al. // J. Bacteriol. 2000. - Vol.182. - P. 2928-2936.

344. Khan, A.S. Preparation sanitaire face an terrorisme biolohigue aux Etats Unis / A.S. Khan, S. Morse, S. Lillibridge // Energ-sante. 2001. - Vol.12, N.2. - P. 239-240.

345. Khan, A.S. Precaution against biological and chemical terrorism directed at food and water supplied /A.S. Khan, D.L. Swerdlow D.D. Yuranek // Public Health Rept. -2001.-Vol.116, N.l.-P. 3-14.

346. Kimura, M. A simple model for estimating evolutionary rates of base substitution through comparative studies of nucleotide sequences / M. Kimura // J. Mol. Evol. -1980.-Vol.16.-P. 111-120.

347. Klevytska, A.M. Identification and characterization of variable number tandem repeats in the Yersinia pestis genome /A.M. Klevytska, L.B. Price, J.M. Schupp et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39, N.9. - P. 3179-3185.

348. Kolter, R. The stationary phase of the bacterial life cycle / R. Kolter, J.A. Siegele, A. Torino // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - Vol. 47. - P. 855-874.

349. Kondo, K. Morphology of the viable but nonculturable Vibrio cholerae as determined by the freeze fixation technique / K. Kondo, A. Takede, K. Amako // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol.123, N.l-2. - P. 179-184.

350. Kragelund, L. Culturability and expression of outer membrane proteins during carbon, nitrogen, or phosphorus starvation of Pseudomonas putida DF14 / L. Kragelund, O.Nibroe // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol.60. - P. 2944-2948.

351. Kugeler, K.J. Discrimination between Francisella tularensis and Francisella like endosymbionts when screening ticks by PCR / K.J. Kugeler, N. Gurfield, J.G. Creek et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol.71, N.l 1. - P. 7594-7597.

352. Kurokawa, M. Resuscitation from the viable but nonculturable state of Helicobacter pylori / M. Kurokawa, M. Nukina, N. Nakanishi // Kansenshogaku Zasshi. 1999. -Vol.73,N.l.-P. 15-19.

353. Kvint, K. RpoS-dependent promoters require guanosine tetraphosphate for induction even in the presence of high levels of sigma(s) / K. Kvint, A. Farewell, T. Nystrom // J. Biol. Chem. 2000. - Vol.275. - P. 14795-14798.

354. Lamps, L.W. Histologic and molecular diagnosis of tularemia: a potential bioterrorism agent endemic to North America / L.W. Lamps, J.M. Havents, A.Sjostedt et al. // Mod. Pathol. 2004. - Vol.17, N.5. - P. 489-495.

355. Langer, T. Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding / T. Langer, C. Lu, H. Echois, J, Flanag et al. // Nature. 1992. - V.356. - P. 683-689.

356. Larsen, P.I. Osmoregulation Escherichia coli by accumulation of organic osmolytes: betaines, glutamic acid, and trehalose / P.I. Larsen, L.K. Sydnes, B. Landfald, A.R. Strom // Arch. Microbiol. 1987. - Vol. 147. - P. 1-7.

357. Larsson, P. The comlete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia / P. Larsson, P.C.F. Oyston, P. Chain et al. // Nat. Genet. 2005. -V.37.-N.2.-P. 153-159.

358. Ledus, M. Interactions of Escherichia coli membrane lipoproteins with the murein sacculus / M. Ledus, K. Ishidate, N. Shakibai L.I. // Rothfield J. Bacteriol. 1992. -Vol.174.-P. 7982-7988.

359. LeRudulier, D. Molecular biology of osmoregulation / D. LeRudulier, A.R. Strom, A.M. Dandekar et al. // Science. 1984. - Vol. 244. - P. 1064-1068.

360. Ligon, B.L. Monkeypox: a review of the histo and emergence in Western hemisphere / B.L. Ligon // Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2004. - Vol. 15, N4. - P. 280-287.

361. Lin, M. Intraspecific divercity of Vibrio vulnificus in Galveston Bay wate and Ouster as determined by randomly amplified polymorphic DNA PCR / M. Lin, D.A. Payhe, J.R. Schwaez // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol.69, N.6. - P. 3170-3175.

362. Linder, K. Membrane Fatty acid and virulence changes in the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus / K. Linder, J.D.Oliver // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - Vol.55. - N.l 1. - P. 2837-2842.

363. Linguist, S. The heat-shock proteins / S. Linguist, E.A. Graig // Annu. Rev. Biochem. 1988. - Vol.22. - P. 631-677.

364. Lleo del, M.M. Nonculturable Enterococcus faecalis cells are metabolically active growth / M.M. Lleo del, M.C. Tafi, P. Canepari // Syst. Appl. Microbiol. 1998. -Vol.21.-P. 333-339.

365. Lleo del, M.M. Competitive polymerase chain reaction for quantification of nonculturable Enterococcus faecalis cells in lake water / M.M. Lleo del, M.C. Tafi, C. Signoretto //FEMS Microbiol. Ecol. 1999. - Vol.30. - P. 345-353.

366. Long, G.W. Detection of Francisella tularensis in blood by polymerase chain reaction / G.W. Long, J.J. Oprandy, R.B. Narayanan et al. // J. Clin. Microbiol. 1993. -Vol.31,N.l.-P. 152-154.

367. Loudon, K.W. The polymerase chain reaction as means of typing Aspergillus fumigatus / K.W. Loudon, A.P. Coke, J.P. Burnie // J. Med. Microbiol. 1992. -Vol.37, N.l.-P. 3.

368. Lowder, M. The use modified GFP as a reporter for metabolic activity in Pseudomonas putida / M. Lowder, J.D. Oliver // Microb. Ecol. 2001. - Vol.41, N.4. -P. 310-313.

369. Macario, A.J.L. Stress genes and proteins in the archaea / A.J.L., Macario, M. Lange, B.K. Ahring, E.C. De Macario // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - Vol.63, N.4. -P. 923-967.

370. Mahillon, J. Insertion sequences / J. Mahillon, M. Chandler // Microb. and Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol.62, N.3. - P.725-773.

371. Markham, A.F. The polymerase chain reaction: A tool for molecular medicine / A.F. Markham // Brit. Med. J. 1993. - Vol.306. - P. 441-446.

372. Marmur, J. A procedure for the isolation DNA from microorganisms / J. Marmur // J. Mol. Biol. 1961. - Vol.3. - P. 208-218.

373. Martin, J. Chaperon-assisted protein folding / J. Martin, F.U. Hartl // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. - Vol.7. - P. 41-52.

374. Martin, J. Clinicopathologic aspects of bacterial agents / J. Martin, A.M. Marty // Clin. Lab. Med. 2001. - Vol.21, N.3. - P. 513-546.

375. Mary, P. Starvation survival and viable but nonculturable state in Aeromonas hydrophila / P. Mary, N.E. Chihib, O. Charafeddine et al. // Microbiol. Ecol. 2002. -Vol.43, N.2. - P. 250-258.

376. Matthews, K.R. Genomic fingerprintings of Staphylococcus aureus of bovine origin by polymerase chain reaction-based DNA fingerprinting / K.R. Matthews, S.J. Kumar, S.A. Oconner et al. // Epidemiol. Infect. 1994. - Vol.112, N.l. - P. 177-186.

377. Maxam, A.M. A new method for sequencing DNA / A.M. Maxam, W. Gilbert // Proc. Natl. Acad. Sci. 1977. Vol.74. - P. 560-564.

378. Mazars, E. High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Micobacterium tuberculosis molecular epidemiology / E. Mazars, S. Lesjean, A.L. Banuls et al. // Proc. Natl. Acad.sci. 2001. - Vol.98. - P.1901-1906.

379. McAvin, J.C. Identification of Francisella tularensis using real-time fluorescence polymerase chain reaction / J.C. McAvin, M.M. Morton, R.M. Roudabush et al. // Mil. Med. 2004. - Vol.169, N.4. - P. 330-333.

380. McCabe, E.R. DNA techniques for screening of metabolism / E.R. McCabe // Eur. J. Pediatr. 1994. - Vol.153. - P. 84-85.

381. McClelland, M. DNA fingerprinting by arbitrary primed PCR / M. McClelland, J.Welsh // PCR methods and application manual supplement. Cold Spring Harber Laboratory, 1994. - 56p.

382. McCoy, G.W. Turther observation on a plague-like diseases of rodents with a preliminary note on the causative agent Bacterium tularensis / G.W. McCoy, C.W. Chapin // J. Infect. Dis. 1912. - Vol.10. - P. 61-72.

383. Measures, J.C. Role of amino acids in osmoregulation of nonhalophilic bacteria J.C. Measures // Nature (London). 1975. - Vol. 257. - P. 398-400.

384. Mesheryakova, I. A history of the tularemia outbreake and the experience of live vaccine use in Russia / I. Mesheryakova // Fourth International conference on Tularemia. The Assembly Roome City of Bath, U.K. 2003. - S. 01.

385. Miller, K.J. Osmoadaptation by rhizophere bacteria / K.J. Miller, J.M. Wood // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - Vol. 50. - P. 101-136.

386. Miller, V.L. A two-component regulatory system (phoP/phoQ) controls Salmonella typhimurium virulence / V.L. Miller, A.M. Kukral, J.J. Mekalanos // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. - Vol.86. - P. 5054-5058.

387. Milner, J.L. Proline porter II is activated by a hyperosmotic shift in both whole cells and membrane vesicles of Escherichia coli K-12 / J.L. Milner, S. Grothe, J.M. Wood // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 263. - P. 14900-14905.

388. Miriihoe, Y. Isolation and characterization of rugose form of Vibrio cholerae 0139 strain / Y. Miruhoe, S.N. Wai, A. Takade, Sh.Yoshida // Infect. Immun. 1999. -Vol.67, N.2. - P. 958-963.

389. Mizunoe, J. Restoration of culturability of starvation-stressed and low-temperature-stressed Escherichia coli 0157:H7 cells by using H202-degrading compounds / J. Mizunoe, S.N. Wai, A. Takeda, S. Josheda //Arch.Microbiol.- 1999. Vol.172. -P. 63-67.

390. Mizunoe, J. Resuscitation of viable but nonculturable cells of Vibrio parahaemolyticus induced at low temperature under starvation / J. Mizunoe, S.N. Wai, T. Ishikawa //FEMS Microbiol Lett. 2000. - Vol.186, N.l. - P. 115-120.

391. Mollaret, H.H. Conservation experimentale de la peste dans le sol / H.H. Mollaret // Bull. Soc. Pathol. Exot. 1963. -Vol.56, N.6. - P. 1168-1182.

392. Mollaret, H.H. Les causes de l'inveteration de la peste dans ses foyers naturels / H.H. Mollaret//Bullsoc. pathol. Exot. 1971. - Vol.64, N.5. - P. 716-717.

393. Morgan, J.A.W. Survival of Aeromonas salmonicida in lake water / J.A.W. Morgan, P.A. Cranwell, RW. Pickup //Appl. Environ.Microbiol.-1991.-Vol.57.-P. 1777-1782.

394. Muela, A. The effect of simulated solar radiation of Escherichia coli: the relative role of UV-B, UV-A and photosynthetically active radiation / A. Muela, J.M. Garcia-Bringas, I.I. Arana, I.I. Barcino//Microb. Ecol. 2000. - Vol.39, N.l. - P. 65-71.

395. Mullis, K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. 1987. - Vol.155. - P. 335-350.

396. Munro, F.M. Fate of Vibrio cholerae 01 in seawater microcosms / F.M. Munro, R.R. Colwell // Water Res. 1996. - Vol.30. - P. 47-50.

397. Nalin, D.R. Absorption and growth of Vibrio cholerae on chitin / D.R. Nalin, V. Daya, R.Reid et al. // Infect. Immun. 1979. - Vol.25. - P.768-770.

398. Nano, F.E. Identification of a heat-modifiable protein of Francisella tularensis and molecular cloning of the encoding gene / F.E. Nano // Microb. Pathogen. 1988. -N.5.-P. 109-119.

399. Narberhaus, F. Negative regulation of bacterial heat shock genes / F. Narberhaus // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31. - P. 1-8.

400. Nelson, S.M. The effect of temperature on viability of carbon- and nitrogen-starved Escherichia coli / S.M. Nelson, R.W. Attwell, M.M. Dawson, C.A. Smith // Microb. Ecol. 1996. - Vol.32, N. 1. - P. 11 -21.

401. Neumann, R. Biotinylated DNA probes: sensitivity and application / R. Neumann, P. Rudioff, H.J. Eggers //Naturwissenschaften. 1986. - Vol.73. - P. 553-555.

402. Nilsson, H.O. Cold starvation, acid stress and nutrients on metabolic activity of Helicobacter pylori / H.O. Nilsson, J. Blom, W. Abu-Al-Soud et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol.68, N.l. - P. 11-19.

403. Nilsson, L. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state / L. Nilsson, J.D. Oliver, E.S. Kjelli // J. Bacteriol. -1991. V.173. - N.16.- P. 50545059.

404. Nisson, P.E. Rapid and efficient cloning of Alu-PCR products using uracil DNA glyosylase / P.E. Nisson, A. Raschtian, P.C. Watkins // PCR Methods Appl. 1991. -Vol.1.-P. 120-123.

405. Ogahara, T. Accumulation of glutamate by osmotically stressed Escherichia coli is dependent on pH / T.Ogahara, M. Ohno, M.Takayama et al. // J. Bacteriol. 1995. -Vol.177, N.20. - P. 5987-5990.

406. Ohara, Y. Clinical manifestation of tularemia in Japan- analysis of 1355 cases observed between 1924 and 1987 / Y. Ohara, T. Sato, H. Fujitta et al. // Infection. -1991.-Vol.19, N.I.-P. 14-17.

407. Olive, D.M. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms / D.M. Olive, P.Bean // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37. -P. 1661-1669.

408. Oliver, J.D. The viable but non-culturable state in the human pathogen Vibrio vulnificus / J.D. Oliver // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol.133. - P.203-208.

409. Oliver, J.D. In vivo resuscitation and virulence towards mice of viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus / J.D. Oliver, R. Bockian // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol.61. - P. 2620-2623.

410. Oliver, J.D. Formation of nonculturable Vibrio vulnificus cells and its relationship to the starvation state /J.D. Oliver, L. Nilsson, S. Kjelleberg // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol.57. - P. 2640- 2664.

411. Oyston, P.C. Tularemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis / P.C. Oyston, A. Sjostedt, R.W. Titball //Nat. Rev. Microbiol. 2004. - Vol.2, N.12. - P. 967-978.

412. Pace, J.L. Effect of bile on Vibrio parahaemolyticus / J.L. Pace, T.J. Chai, H.A. Rossi, X.Yiang // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol.63, N.6. - P. 2372-2377.

413. Parsell, D.A. The function of heat shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins /D.A. Parsell, S. Lindquist // Annu. Rev. Genet. -1993.-Vol. 27.-P. 437-496.

414. Perroud, B. Glycine betaine transport in Escherichia coli: osmotic modulation / B. Perroud, D. LeRudulier // J. Bacteriol. 1985. - Vol. 161. - P. 393-401.

415. Petersen, J.M. Laboratory analysis of tularemia in wild-trapped, commercially traded prairie dogs, Texas, 2002 / J.M. Petersen, M.E. Schriefer, L.Carter et al. // Emerg. Infect. Dis. -2004. Vol.10, N.3. - P. 419-425.

416. Petersen, J.M. Methods for enhanced culture recovery of Francisella tularensis / J.M. Petersen, M.E. Schriefer, L.Carter et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - Vol.70, N6.-P. 3733-3735.

417. Petersen, J.M. Tularemia: emergence/re-emergence / J.M. Petersen, M.E. Schriefer // Vet. Res. 2005. - Vol.36, N.3. - P. 455-467.

418. Pikula, J. Ecological cjndition of natural foci tularemia in the Czech Republic / J. Pikula, F. Treml, M. Bekluva et al. //Eur.J.Epidemiol.-2003. Vol.18. - P. 1091-1095.

419. Pollice, M. Use of nonradioactive DNA probes for the detection of infectious bacteria / M. Pollice, H.-L.Yang // Clin. Lab. Science. 1985. - Vol.5. - P. 463-473.

420. Radman, M. Evolution-driving genes / M. Radman, F. Taddei, I.Matic // Res. Microbiol. 2000. - Vol. 151. - P. 91-95.

421. Rafaeli-Eshkol, D. Studies on halotolerance in a moderately halophilic bacterium. Effect of betaine on salt resistance of the respiratory system /D. Rafaeli-Eshkol, Y. Avi-Dor// Biochem. J. 1968. - Vol. 109. - P. 687-691.

422. Rahalison, L. Diagnosis of bubonic plague by PCR in Madagascar under field condition / L. Rahalison, E. Vololonirina, M. Ratsitorahina, S. Chanteau // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38, N.l. - P. 260-263.

423. Rahman, L. Methionine uptake and cytopathogenicity of viable but nonculturable Shigella dysentheriae type I /1. Rahman, M. Shahamat, H.A. Kichman et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol.60, N.10. - P. 3573-3578.

424. Rahman, M.H. Formation of viable but nonculturable state (VBNC) of Aeromonas hydrophila and its virulence in gold fish, Carassius auratus / L. Rahman, M. Shahamat, P.A. Kichman et al. // Microbiol. Res. 2001. - Vol.156, N.l. - P. 103-106.

425. Ralph, D. Leptospirae species categorized by arbitrarily primed polymerase chain reaction (PCR) and by mapped restriction polymorphisms in PCR-amplified rRNA genes / D. Ralph, M. McClelland, J. Welsh // J. Bacteriol. 1993. - Vol.175. - P. 973-981.

426. Ramagopal, S. Salinity stress induced tissue specific proteins in barley seedling /S. Ramagopal //Plant Physiol. 1987. - Vol. 84. - P. 324-331.

427. Ramaiah, N., Ravel J., Straube W.L. et al. Entry of Vibrio harveyi and Vibrio fischeri into the viable but nonculturable state // J. Appl. Microbiol. 2002. - Vol.93, N.l. -P. 108-116.

428. Rameckers, J. Haw many cycles does a PCR need? Determinations of cycle numbers depending on the number of targets and the reaction efficiency factor / J. Rameckers, S. Hummel, B.Herrman // Naturwissenschaften. 1997. - Vol.84. - P. 259-262.

429. Rault, D. Cross-reaction with Borrelia burgdorferi antigen of sera from patients with human immunodeficiency virus infection, syphylis and leptospirosis / D. Rault, K.E. Hechemy, G. Baranton // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol.27, N10. - P. 2152-2155.

430. Ravel, J. Temperature-induced recovery of V.cholerae from the viable but nonculturable state: growth or recuscitation? / J. Ravel, J.T. Knight, C.E. Monahan et al. //Microbiology. 1995. - Vol.141. - P. 377-383.

431. Reilly, T.J. Characterization and sequencing of respiratory burst-inhibiting acid phosphatase from Francisella tularensis / T.J. Reilly, G.S. Baron, F. Nano, M.S. Kuhlenschmidt // J. Biol. Chem. 1996. - Vol.271, N.18. - P. 10973-10983.

432. Reilly, T.J. Characterization of recombinant Francisella tularensis acid phosphatase A / T.J. Reilly, R.L. Felts, M.T. Henzl et al. // Protein Expr. Purif. 2006. - Vol45. - P. 134-141.

433. Reintjes, R. Tularemia outbreak investigation in Kosovo: case control and environmental studies / R. Reintjes, I. Dedushaj, A.Gjini et al. // Emerg. Infect. Dis. -2002. Vol.8. - P. 69-73.

434. Robert, F. Use of random amplified polymorphic DNA as a typing method for Candida albicans in epidemiologycal surveillance of a burn unit / F. Robert, F. Lebreton, M.E. Bougnoux et al. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.2366-2371.

435. Rollins, D. Viable but nonculturable state of Campilobacter jejueni and its role in survival in the natural aquatic environment / D. Rollins, R.R. Colwell // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - Vol.52. - P. 531-538.

436. Rosenberg, S.M. Evolving responsively: adaptive mutation / S.M. Rosenberg // Nature Rev. Genetics. 2001. - Vol. 2. - P.504-515.

437. Roszak, D.B. Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count / D.B. Roszak, R.R. Colwell // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - Vol.53. - P. 28892893.

438. Roszak, D.B. Survival strategies of Bacteria in the natural environment / D.B. Roszak, R.R. Colwell // Microbiol. Rev. 1987. - Vol.51, N.3. - P. 365-379.

439. Roszak, D.B. Viable but nonrecoverable state of Salmonella enteritidis in aquatic systems / D.B. Roszak, DJ. Grimes R.R. Colwell // Can. J. Microbiol. 1984. -Vol.30.-P. 334-338.

440. Roth, B.J. Bacterial viability and antibiotic sensitivity testing with SYTOX green nucleic acid strain / B.J. Roth, M. Poot, S.T. Jue, P.J. Millard // Appl. Environ. -Microbiol. 1997. - Vol.63. - P. 2421-2431.

441. Rotz, L.D. Public health assesment of potential biological terrorism agents / L.D. Rotz, A.S. Khan, S.R. Lillibridge et al. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol.8. - P. 225-230.

442. Russell, N.J. Membranes as a target for stress adaptation / N.J. Russell // Int. J. Food Microbiol. 1995. - Vol. 28. - P. 255-261.

443. Saier, M.N., Jr. Computer-aided analyses of transport protein sequences: gleaning evidence concerning function, structure, biogenesis, and evolution / M.N.Saier, Jr. // Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 58. - P. 71-93.

444. Saiki, R.K. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel et al. // Science. 1988. -Vol.239.-P. 487-491.

445. Saiki, R.K. Enzymatic amplification of /3-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / R.K. Saiki, S.R. Scharf, F.Faloona et al. // Science. 1985. - Vol.230. - P. 1350-1354.

446. Sakaguchi, K. Betaine as a growth factor for Pediococcys soyae. VIII. Studies on the activities of bacteria in soy sauce brewing / K. Sakaguchi // Bull. Agric. Chem. Soc. Jpn. 1960. - Vol. 24. - P. 489-496.

447. Sanger, F. Determination of nucleotide sequences in DNA / F. Sanger // Science. -1981. Vol.214. - P. 1205-1210.

448. Sanderson, P.W. The Hofmeister effect in relation to membrane lipid phase stability / P.W. Sanderson, L.J. Lis, P.J. Quinn, W.P. Williams // Biochim. Biophys. Acta.1991.-Vol. 1067.-P. 43-50.

449. Sheehan, C. Genomic fingerprinting Acinetobacter baumanii: amplification of multiple interrepetitive extragenic palindromic sequences / C. Sheehan, M. Lynch, C.Cullen et al. // J. Hosp. Infect. 1995. - Vol.31. - P.33-40.

450. Shi, V. L. Viable but non-culturable (VBNC) microorganisms: A misnomer or a whistle-blower? / V. L. Shi // Logical Biology. 2000. - N.l. - P. 17-20.

451. Shieh, Y.S.C. Method to remove inhibitors in sewage and other fecal wastes for enterovirus detection by the polimerase chain reaction / Y.S.C. Shieh, D. Wait, L. Tai, M.D. Sobsey // J. Virol. Methods. 1995.- Vol.54. - P. 51-66.

452. Shin, Y.Ch. Variable number of TTC repeats in Mycobacterium leprae DNA from leprosy patients and use in strain differentiation / Y.Ch. Shin, H. Lee, H.J. Lee et al. // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol.38, N.12. - P. 4535-4538.

453. Shleeva, M.O. Formation and resuscitation of nonculturable cell of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis prolonged stationary phase / M.O. Shleeva, K. Bagramyan, M.V. Telkov // Microbiology. 2002. - Vol.48. (Pt 5)-P. 1581-1591.

454. Signoretto, C. Modification of the peptidoglycan of Escherichia coli in the viable but nonculturable state / C. Signoretto, M.H. Lleo, P.Canepari // Curr. Microbiol. 2002.- Vol.44, N.2. P. 125-131.

455. Sjostedt, A. Family XVII Francisellaceae. Genus I Francisella / A.Sjostedt // G.M/Garrity (ed) Bergeys manual of systematic bacteriology.-2ed V.2.-Springer-Verlag.-New York, NY, 2003. P. 111-113.

456. Sjostedt, A. Detection of Francisella tularensis in ulcers of patients with tularemia by PCR / A. Sjostedt, U. Eriksson, L. Berglund, A.Tarnvik // J. Clin. Microbiol. 1997. -Vol.35, N.5.-P. 1045-1046.

457. Sjostedt, A. Molecular cloning and expression of a T-cell stimulating membrane protein of Francisella tularensis / A. Sjostedt, G. Sandstrom, A. Tarnvik, B.Jaurin // Microb. Pathogen. 1989. - Vol.6. - P. 403-414.

458. Sokolovic, Z. Synthesis of species-specific stress proteins by virulent strains of Listeria monocitogenes / Z. Sokolovic, A. Fuchs, W.Goebel // Infect. Immun. -1990.- Vol.58, N.l 1. P. 3582-3587.

459. Sorokin, V.M. Lipopolysaccharide structure of Francisella tularensis mutant strain / V.M. Sorokin, L.A. Prozorova, N.V. Pavlovich // Abstr. 2st Int.Conf. on tularemia. Czech.Republic, Hradec Kralove. 1997. - P. 19.

460. Southern, E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis / E. Southern // J. Mol. Biol. 1975. - Vol.98. - P. 503-515.

461. Spector, M.P. Starvation stress response (SSR) of Salmonella typhimurium / M.P. Spector, J.W. Foster //Starvation in Bacteria (ed.S. Kjelleberg). Plenum. Press.,New York, 1993.-P. 201-220.

462. Spring, S. Phylogenetic diversity and identification of nonculturable Magnetotatic bacteria / S. Spring, R. Amann, F.Ludwig et al. // Syst. Appl. Microbiol. 1992. -Vol.15.-P. 116-122.

463. Stackebrandt, E. The genetic diversity of culturable bacterial species and uncultured strains detected in the environment / E. Stackebrandt, W. Liesack, N. Ward, B.Goebel // 6th. Int. Symp. Microb. Ecol. (ISME-6) Barcelona, 1992. - P. 40.

464. Steinert, M. Resuscitation of viable but nonculturable Legionella pneumophila Philadelphia JR32 by Acanthamoeba castellani / M. Steinert, L. Emody, R. Amam, J.Hacker//Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol.63. - P. 2047-2053.

465. Staples, J.E. Molecular and epidemiologilal analysis of human tularemia caused by type A and type B in the United States / J.E. Staples, K.A. Kubota, L.G. Chalcraft et al. // Tularemia Meeting Abstract. MBL Marin biol. Laboratory. USA. 2006. -P. 2E.

466. Strom, A.R. Genetics of osmoregulation in Escherichia coli: uptake and biosynthesis of organic osmolytes / A.R. Strom, P. Falkenberg, B.Landfald // FEMS Microbiol. Rev. 1986. - Vol. 39. - P. 79-86.

467. Stulik, J. Stress response induced after in vivo F.tularensis infection in mice / J. Stulik, H. Kovarova, L.Hernychova et al. //Medizinische B-Schutz-Tagung des BMVg-Munchen, 1997.-P.115.

468. Suggs, S.V. Using purified genes / S.V. Suggs, T. Hirose, E.H. Myake et al. // ICN-UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1981. - Vol.23. - P. 683-693.

469. Svensson, K. Evolution of subspecies of Francisella tularensis / K. Svensson, P. Larsson, D. Johansson et al. // J. Bacteriol. 2005. - Vol.187, N.l 1. - P. 3903-3908.

470. Talibart, R. Survival and recovery of viable but noncuturable forms of Campylobacter in aqueous microcosm / R. Talibart, M. Denis, A.Castillo // Int. J. Food Microbiol. 2000. - Vol.55, N.l-3. - P. 263-267.

471. Tarnvik, A. Tularemia in Europe: an epidemiological overview / A. Tarnvik, H.S. Priebe, R. Grunow // Scand. J. Infect. Dis. 2004. - Vol.36, N.5. - P. 350-355.

472. Taylor, G.R. The polymerase chain reaction: New variation on old theme / G.R. Taylor, W.P. Logan // Curr. Opin. Biochechnol. 1995. - Vol.6. - P. 24-29.

473. Tholozan, J.L. Phisiological characterization of viable but noncuturable Campylobacter jejuni cell / J.L. Tholozan, J.M. Capplier, J.P. Tissier // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol.65, N.3. - P. 1110-1116.

474. Thomas, R. Discrimination of human pathogenic subspecies of Francisella tularensis by using restriction fragment length polymorphism / R. Thomas, A. Jahansson, B.Nelson et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41, N.l. - P. 50-57.

475. Thomson, N. Massive attack / N. Thomson, A. Cerdeno-Tarraga, S. Bentley // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol.3, N.8. - P. 586-587.

476. Titball, R.W. Will the enigma of Francisella tularensis virulence soon be solved? / R.W. Titball, A. Johansson, M. Forsman // Trends in Microbiology. 2003. -Vol.11, N.3.-P. 118-123.

477. Tomaso, H. Antimicrobial susceptibilities of Austrian Francisella tularensis holarctica biovar II strains / H. Tomaso, S. Al Dahouk, E. Hofer et al. // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2005. - Vol.26, N.4. - P. 279-284.

478. Tomioka, K. A multiplex polymerase chain reaction microarrays assay to detect bioterror pathogens in blood / K. Tomioka, M. Peredelchuk, X. Zhu et al. // J. Mol. Diagn. 2005. - Vol.7, N.4. - P. 486-494.

479. Tomaso, H. Antimicrobial susceptibilities of Austrian Francisella tularensis holarctica biovar II strains / H. Tomaso, S. AlDahouk, E.Hofer et al. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2005. - Vol.26, N.4. - P. 279-284.

480. Trebesius, K. Rapid and specific detection of Helicobacter pylori macrolide resistance in gastric tissue by fluorescent in situ hybridisation / K. Trebesius, K. Panthel, S. Strobel // Gut. 2000. - Vol.46, N.5. - P. 608-614.

481. Trevisanato, S.I. Did an epdemic of tularemia in Ancient Egypt affect the course of world history / S.I. Trevisanato // Med. Hypotheses. 2004. - Vol.63, N.5.-P.905-910.

482. Trevisanato, S.I. The "Hittite plague", an epidemic of tularemia and the first record of biological warfare / • S.I. Trevisanato //Med Hypotheses (2007), doi:10. 1016/j.2007.03.012.

483. Twine, S.M. In vivo proteomic analysis of intracellular bacterial pathogen, Francisella tularensis, isolated from mouse speen / S.M. Twine, N.C.S. Mykytczuk, M.D. Petit et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. -Vol.345.-P. 1621-1633.

484. Vaissaire, J. Tularemia. The disease and its epidemiology in France / J. Vaissaire, C. Mendy, C. LeDoujet, A. LeCoustumia // Med. Mai. Infect. 2005. - Vol.35, N.5. -P. 273-280.

485. Van Belkum, A. DNA fingerprinting of medically important microorganisms by use of PCR / A.Van Belkum // Clin. Microbiol. Res. 1994. - Vol.7. - P. 174-184.

486. Van Belkum, A. The role of schort sequence repeats in epidemiologic typing / A.Van Belkum // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - Vol.2. - P. 306-311.

487. Van Belkum, A. Non-siotopic labeling of DNA by newly developed hapten-containing platinum compounds / A. Van Belkum, E. Linkers, T. Jeisma, F.M. Van den Berg, W.Quint//Bio Techniques. 1994. - Vol.16. - P. 148-153.

488. Van Belkum, A. Short-sequence DNA repeats in prokaryotic genomes / A. Van Belkum, S. Scherer, L. Van Alphen, H.Verbrugh // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1998. Vol.62.-P. 275-293.

489. Van Belkum, A. Typing of Legionella pneumophila strains by polymerase chain reaction mediated DNA fingerprinting / A. Van Belkum, M. Struelens, W.Quint // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31, N.8. - P. 2198-2200.

490. Van Dyk, T.K. Synergistic induction of the heat shock response in Escherichia coli by simultaneous treatment with chemical inducers / T.K. Van Dyk, T.K. Reed, A.C. Vollmer, R.A. La Rossa // J. Bacteriol. 1995. - Vol.177, N.20. - P. 6001-6004.

491. Ventosa, A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria / A. Ventosa, J.J. Nieto, A. Oren // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 504-544.

492. Verheul, A. Betaine and L-carnitine transport by Listeria monocytogenes Scott A in response to osmotic signals / A. Verheul, E. Glaasker, B. Poolman, T.Abee // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 6979-6985.

493. Versalovik, J. DNA fingerprinting of pathogenic bacteria by fluorophore enhanced repetitive sequence-based polymerase chain reaction / J. Versalovik, V. Kapur, T.Koeuth et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. 1995. - Vol.119. - P. 23-29.

494. Versalovik, J. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes / J. Versalovik, T. Koeuth, J.R. Lupski // Nucl. Acids Res. 1991. - Vol.19. - P. 6823-6831.

495. Wagner, J. The dinB gene encodes a novel E.coli DNA polymerase, DNA Pol IV, involved in mutagenesis / J. Wagner, P. Gruz, S.R. Kim et al. // Mol. Cell. 1999. -Vol.4.-P. 281-286.

496. Wai, S.V. Resuscitation of Vibrio cholerae 01 strain TSI-4 from a viable but nonculturable state by heat shock / S.V. Wai, T. Moriya, K. Kondo // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol.136, N.2. - P. 187-191.

497. Wang, J.J. DNA twist as transcriptional changes / J.J. Wang, M. Syvanen // Mol. Microbiol. 1992. - Vol.614. - P. 1861-1866.

498. Wang, R.-F. A universal protocol for PCR detection of 13 species of footborn pathogens in foods / R.-F. Wang, W.-W. Cao // J. Appl. Microbiol. 1997. - Vol.83. -P. 727-736.

499. Wagner, J.M. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of clinical and environmental isolates of Vibrio vulnificus and other Vibrio species / J.M. Wagner, J.D. Oliver // Appl. Environ. Microbiol.1999. Vol.65, N.3. - P. 1141-1144.

500. Weber-Ban, E.U. Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA / E.U. Weber-Ban, B.G. Reid, A.D. Miranker, A.L. Horwich // Nature. 1999. -Vol.401.-P. 90-93.

501. Weiss, L.M. Bradyzoite development in Toxoplasma gondii and the hsp 17 stress response / L.M. Weiss, Y.E. Ma, P.M. Takvorian et al. // Infect. Immun. 1998. -Vol.66, N.7. - P.3 295-3302.

502. Weissman, J. Mechanism of GroEL action: productive release of polypeptide from a sequestered position under GroES / J. Weissman, C.M. Hohl, O. Kovalenco et al. // Cell. 1995. - Vol.83, N.17. - P. 577-587.

503. Whipp, MJ. Characterization of a novicida-like subspecies of Francisella tularensis isolated in Austalia / M.J. Whipp, G.M. Davis, G.Lum et al. // J. Med. Microbiol. -2003.-Vol.52.-P. 839-842.

504. Whitehouse, Ch.A. Comparison of five commercial DNA extraction kits for the recovery of Francisella tularensis DNA from spiked soil samples / Ch.A. Whitehouse, H.E. Hottel // Mol. Cell. Probes. 2007. - Vol.21. - P. 92-96.

505. Whitfield, C. Regulation of expression of group IA capsular polysaccharides in Escherichia coli and related extracellular polysaccharides in other bacteria / C. Whitfield, WJ. Keenleyside // J. Ind. Microbiol. 1995. - Vol. 15. - P. 361-371.

506. Whitesides, M.D. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state / M.D. Whitesides, J.D. Oliver // Appl. Environ. Microbiol. -1997. Vol.63. - P. 1002-1005.

507. Williams, J.G.K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livak et al. // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol.18. - P. 6531-6535.

508. Wilson, J.G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification / J.G. Wilson // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol.63, N.10. - P. 3741-3751.

509. Wintersberger, U. On the origins of genetic variants / U. Wintersberger // FEBS Letters. 1991. - Vol.285, N.2. - P. 160-164.

510. Wood, J.M. Osmosensing by bacteria: signals and membrane-based sensors / J.M. Wood // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - Vol. 63, N.l. - P. 230-262.

511. Wynn, R.M. Moleculer chaperones: heat-shock proteins, foldases and matchmakers / R.M. Wynn, Y.R. Davie, R.D. Cox, D.T.Chuang // J. Lab. Clin. Med. 1994. -Vol.124.-P. 31-36.

512. Xu, H.Sh. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment / H.Sh. Xu, N. Roberts, F.L.Singleton et al. // Microb. Ecol. 1982. - N.8. - P. 313-323.

513. Yaqub, S. Tularemia from a cat bite / S. Yaqub, J.V. Bjornholt, A.E. Enger // Tidsskr.Laegeforen. 2004. - Vol.124, N.24. - P. 3197-3198.

514. Young, W.P. DNA methylation and AFLP marker distribution in the soybean genome / W.P. Young, J.M. Schupp, P. Keim // Theor. Appl. Genet. 1999. -Vol.99. - P. 785-790.

515. Yura, T. The heat shock response: regulation and function / T. Yura, M. Kanemori, M.T. Morita in: Storz G., Hengge-Aronis R. (Eds.). Bacterial Stress Responses. -ASM Press. - Washington. - 2000. - P. 3-18.

516. Zimmerman, R. Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number there of involved in respiration / R. Zimmerman, R. Ituriada, J. Becker-Brick // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - Vol.36. - P. 926-935.

517. Zuber, M. Analysis of the DnaK molecular chaperone system of Francisella tularensis / M. Zuber, T.A. Hoover, M.T. Dertbaugh, D.L. Court // Gene. 1995. - Vol.164. -P. 149-152.

Информация о работе

Романова, Людмила Васильевна
доктора биологических наук
Ростов-на-Дону, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Романова, Людмила Васильевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Романова, Людмила Васильевна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Романова, Людмила Васильевна, Ростов-на-Дону

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология