Генотипическое разнообразие Francisella tularensis: VNTR- анализ

Водопьянов, Алексей Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генотипическое разнообразие Francisella tularensis: VNTR- анализ
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генотипическое разнообразие Francisella tularensis: VNTR- анализ"

Напра рукописи

Водопьянов Алексей Сергеевич

ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ Р11АЫС18Е1-1-А ТииМЕЫЗЯ: \ZNTR - АНАЛИЗ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь - 2009

003469522

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Борис Николаевич Мишанькин.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Евгений Иванович Еременко;

доктор медицинских наук Ольга Ивановна Цыганкова.

Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский

противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора РФ.

Защита диссертации состоится 1(_/ июня 2009 г. в У ^ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан

Л9 » оЧ

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.В. Ржепаковский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Francisella tularensis - возбудитель туляремии, острого зоонозного природно-очагового инфекционного заболевания, поражающего многие виды млекопитающих, включая человека, грызунов и лагоморфов. Пути и механизмы передачи микроба многообразны: люди могут заражаться при прямом контакте с больными животными, при вдыхании инфицированного материала, употреблении зараженной воды или пищи, при укусе комарами, москитами и клещами. Природный резервуар чаще остается неизвестным, хотя показана возможность персистенции возбудителя более года в воде и иле (Parker R.R., Steinhaus Е.А., Kohls G.M. et al., 1951), в организме восприимчивых животных (Олсуфьев Н.Г., 1975), пребывания в окружающей среде в виде некультивируемых форм (Романова Л.В., Мишанькин Б.Н., Пичурина H.JI. и др., 2000).

Важность проблемы туляремии определяется исключительной стойкостью, цикличностью и нарастающей активностью природных очагов этой инфекции практически на всей территории северного полушария, включая Российскую Федерацию. Активные автономные природные очаги туляремии тундрового типа описаны даже на территории острова Врангеля на границе ВосточноСибирского и Чукотского морей Северного Ледовитого океана (Подобедова Я.С., Демидова Т.Н., Кормилицина М.И., Мещерякова И.С., 2006). В целом по стране с 1999 по 2006 год зарегистрировано 1427 случаев туляремии (Безсмертный В.Е., Горшенко В.В., Попов В.П., 2008).

Прослеживается четкая тенденция к расширению ареала обитания возбудителя: микроб обнаружен у больного в Австралии, считавшейся свободной от туляремии (Whipp M.J., Davies J.M., Lum G. et al., 2003). В Словакии от мышевидных грызунов выделены два штамма F. tularensis subsp. nearctica (Gurycova D., 1998), что является первым случаем регистрации высоковирулентного подвида в Европе. И если до 2004 года неэндемичными по туляремии в Европе оставались лишь Великобритания, Португалия и Исландия (Tarnvik A., Priebe H., Grunow R„ 2004), то de I.L.Carvalho et al. (2007) уже сообщили о положительных в ПЦР пробах на ДНК F. tularensis от человека и клещей северной провинции Португалии.

После 60-летнего затишья зарегистрированы вспышки туляремии в европейской части Турции (Gurcan S., Eskiocak M., Varol G., 2006; Willke A., Meric M., Grunow R. et al., 2009), показано существование активных природных очагов в соседней Болгарии, в которых возбудитель обнаруживали вместе с боррелиями и Anaplasma phagocytophilum (Christova J., Gladnishka T., 2005; Marinov K.T., Georgieva E.D., Ivanov I.N., Kantardjiev T.V., 2009), в ряде провинций Китая (Zhang F., Liu W., Chu M.C. et al., 2006).

общественное мнение (Кондрик Е.К., Волков В.В., Кавызина Л.И., 2003), то биотерроризм превратился в одну из реальных угроз национальной безопасности любой страны. Ведь многие из современных биотехнологических разработок с использованием опасных патогенов бактериальной и вирусной природы являются сложными технологиями двойного применения. В случае сознательного использования биологических (генетических) агентов для поражения людей, животных и растений они «классифицируются как биологическое оружие» (Спирин A.C., 1997). Поэтому не удивительно, что и Центры по контролю за заболеваемостью (CDC) США отнесли F. tularensis к категории А потенциальных агентов биотерроризма (Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al., 2002), a сам возбудитель в рамках программы BioWatch подвергли постоянному мониторингу на случай возможной биотеррористической атаки (Barns S.M., Grow С.С., Okinaka R.T. et al., 2005).

Известен высокий консерватизм фенотипа (антигенная однородность, однотипность биологических свойств, невысокая биохимическая активность и др.) штаммов F. tularensis при исследовании традиционными методами (Олсуфьев Н.Г., 1975), поэтому оперативное расследование вспышек заболевания для вьивления источника инфекции и путей передачи возбудителя в настоящее время затруднительно без комплекса молекулярно-биологических методов, способных быстро и четко дифференцировать различные подвиды и штаммы возбудителя, что исключительно важно на фоне требований практики жизни и реальной угрозы биотерроризма. Только благодаря использованию приема VNTR (Variable Number Tandem Repeat, Вариабельные Тандемные Повторы) - типирования удалось в короткие сроки установить происхождение штамма Bacillus anthracis, распыленного членами религиозной секты Аум Синреке в Японии в 1993 году (Keim P., Smith K.L., Keys С. et al., 2001), и справиться с почтовым терроризмом в США, когда погибло пять и заболело кожной формой сибирской язвы несколько человек (Hoffmaster A.R., Fitzgerald С.С., Ribot Е.Е. et al., 2002). В этой связи представлялось актуальным использование активно разрабатываемого в последние годы в интересах молекулярной эпидемиологии VNTR-анализа для дифференциации штаммов F. tularensis, неразличимых рутинными методами диагностики и типирования, тем более что однородность возбудителя не укладывается в фундаментальное положение эпидемиологии, согласно которому основной характеристикой популяции является гетерогенность (неоднородность) составляющих ее особей, обусловленная разнообразием генотипов в пределах генофонда и определяющая в совокупности с другими факторами устойчивость паразитарной системы в целом.

Цель исследования. Изучение генотипического разнообразия среди штаммов представительной коллекции возбудителя туляремии, выделенных в 1941 -2004 годах в различных регионах мира, с помощью мультилокусного VNTR - анализа.

Поставленную цель предполагалось реализовать выполнением следующих задач:

- разработка программного обеспечения и проведения компьютерного анализа генома туляремийного микроба для выявления локусов, содержащих тандемные повторы;

- конструирование и синтез специфических праймеров, фланкирущих участки генома с тандемными повторами, отработка методики генотипирования;

- формирование коллекции штаммов всех подвидов К Магетк из различных регионов бывшего СССР, а также из-за рубежа;

- ^ЫТЯ-анализ подобранной коллекции штаммов и создание базы данных по выявленным УИТЯ- генотипам штаммов Р. 1и1агетк;

- анализ собранного материала с целью установления возможной связи между УЫТЯ- генотипом штамма и его происхождением, местом, временем и источником выделения;

- изучение стабильности аллелей выявленных локусов вариабельных тандемных повторов;

- подработка подходов к дифференциации подвидов рода РгапшеИа и количественному определению возбудителя туляремии с помощью ПЦР.

Научная новизна работы. Впервые с помощью методики генотипирования возбудителя туляремии, основанной на определении кратности вариабельных тандемных повторов, проведен УЫТЯ - анализ по четырем локусам обширной коллекции из 352 штаммов К 1и1агет1$, включавшей представителей всех четырех подвидов возбудителя туляремии. Показана генотипическая гетерогенность (разнообразие) штаммов возбудителя туляремии. Изучена стабильность наследования аллелей УЫТЯ-локусов у дефектных по ЛПС вариантов туляремийного микроба. Разработан алгоритм кластерного анализа распределения аллелей УЫТЯ- локусов. Дано возможное объяснение феномену возникновения штаммов с двойными аллелями. Впервые выявлены особенности географического распределения генотипов штаммов на территории Ростовской области, Южного Федерального округа, республик бывшего СССР, Америки и ряда стран Восточной Европы. Показано, что согласно генотипированию вызываемые туляремийным микробом вспышки можно разделить на поликлональные, моноклональные и кластерные. Изучена связь между активизацией природных очагов туляремии и солнечной активностью. Предложена упрощенная методика определения подвидов туляремийного микроба с использованием ПЦР. Разработан вариант количественного определения возбудителя туляремии в пробе помощью ПЦР в режиме реального времени.

Практическая ценность. Разработаны методические рекомендации «Способ приготовления смеси маркерных фрагментов (ладдеров) ДНК для тестирования аллелей вариабельных тандемных повторов у возбудителей чумы и туляремии». Рекомендации рассмотрены Ученым Советом и утверждены директором РПЧИ (протокол № 9 от 21.09.2004).

Депонирован штамм в Государственной коллекции патогенных бактерий института «Микроб» /гга«сие//а 1и1агетгя 503/840 в качестве тест - штамма для определения числа повторов по локусу Р1А у возбудителя туляремии. Получена справка о депонировании охраноспособного штамма РгапазеНа ш1агепт яиЬзр. Ьо1агсйса 503/840 в ГКПБ «Микроб» от 9 марта 2004 года.

Создана и зарегистрирована в ФГУ ФИПС База данных «Геоинформационная система «Туляремия». Получено свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2006620302 от 21 сентября 2006 года.

Создана и зарегистрирована в ФГУ ФИПС База данных «Коллекция штаммов туляремийного микроба». Получено свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2008620076 от 30 января 2008 года.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В геноме РгапсиеИа шЬгет'м содержится большое количество тандемных повторов, часть из которых являются вариабельными и пригодными для генотипирования штаммов возбудителя туляремии.

2. Анализ вариабельных тандемных повторов (УЫТЯ-анализ) в геноме 352 штаммов возбудителя туляремии всех четырех подвидов Ргапс1.че11а ш1агеп$'т выявил существование среди них генотипической гетерогенности, а также территориальной приуроченности изолятов определенных генотипов.

3. Ретроспективный анализ распределения генотипов позволил заключить, что в межэпидемический период в природных очагах одновременно циркулируют штаммы одного либо нескольких близкородственных генотипов.

4. Выделенные в разных географических регионах во время разлитой эпизоотии зимой 1988-89 гг. штаммы Franc7.Se//a /м/дгеиш являются резидентными и характерны для мест их постоянного пребывания в пределах устойчивых очагов.

5. Идентификация (дифференциация) подвидов РгапсЬеПа ш!агет1х возможна с помощью полимеразной цепной реакции.

Апробация работы

Результаты исследований неоднократно обсуждались:

- на научных конференциях молодых ученых Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института в 2003 -2006 гг.;

на IV Всероссийской научно - практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва, 22-24 октября 2002 г.;

на 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 30 сентября - 2 октября 2003 г.;

на VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств», Оболенск, 3-5 октября 2006 г.;

- на VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007», Москва, 28-30 ноября 2007 г.;

- 4 International Conference on Tularemia. The Assembly Rooms, City of Bath, United Kingdom, 2003.

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 5 в журналах, включенных в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных материалов диссертации на соискание искомой ученой степени, 2 свидетельства о государственной регистрации баз данных и подготовлен один методический документ.

План диссертационной работы был рассмотрен и утвержден Ученым Советом РостНИПЧИ 28.03.2007 года (протокол № 2). Исследование выполнено в рамках плановой научной темы «Генотипическое разнообразие Francisella tularensis» (№ 67-2-05), № гос. регистрации - 0120.0 507855, в которой автор являлся ответственным исполнителем.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, состоит из введения и пяти глав, включающих обзор литературы, результаты собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 22 рисунками. Указатель литературы включает 219 источников, из них 69 отечественных и 150 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Использованная в работе коллекция включала 352 штамма Francisella tularensis, выделенных в различных регионах мира в период с 1941 по 2004 годы и хранившихся в лиофилизированном состоянии в музее живых культур РПЧИ. Подавляющая часть штаммов (94%) была представлена F. tularensis subsp. holarctica, тогда как F. tularensis subsp. tularensis - четырьмя, a F.tularensis subsp. mediaasiatica - 14 штаммами, соответственно. Два штамма относились к F. tularensis subsp.holarctica var. Japónica. По одному штамму приходилось на F. tularensis subsp.novicida, F. tularensis subsp.novicida-like и F. philomiragia, любезно предоставленные д.м.н. Мещеряковой И.С. (Москва).

Идентификационный генотип каждого конкретного штамма выражали через составляющие его генотип аллели исследованных локусов FtA, FtB, FtC и FtD. Вариабельность VNTR-локусов оценивали с помощью индекса разнообразия Нея (diversity index, DI), рассчитываемого по формуле (Adair D.M. et al., 2000):

DI = 1 - £ (частота аллели2), а аллельную частоту находили отношением числа аллелей данного типа к общему числу аллелей изучаемого локуса во взятой выборке штаммов. Дискриминирующую способность выявленных аллелей исследуемого набора локусов определяли по формуле (Struelens M.J. et al., 1996):

D = \--í-Ynj(nj-\),

где D- индекс дискриминирующей силы, N-число различных штаммов, S -число типов и nj - количество штаммов] типа.

Кластерный анализ штаммов осуществляли построением дендрограммы с учетом полиморфизма аллельного состояния исследованных VNTR-локусов F. tularensis и использованием пакета собственных программ DNA, а также программного обеспечения Phylip 3.6.

Результаты исследований и их обсуждение

Поиск и изучение вариабельных тандемных повторов в геноме возбудителя туляремии

Встречаемость локусов тандемных повторов в геноме Francisella tularensis. Данные международного проекта, содержавшие расшифрованную структуру генома возбудителя туляремии штамма Schu, в виде большого числа фрагментов различной длины в формате «FASTA», были получены из сети INTERNET по адресу www.medmicro.mds.qmw.ac.uk/ft/ еще до появления данных Р. Larsson et al. (2005) о полной нуклеотидной последовательности генома того же штамма.

Для анализа генома возбудителя туляремии использовали пакет авторских программ «DNA», написанных на языке «Visual Basic 6.0».

В ходе проведения компьютерного анализа с помощью программы «Repeat» выявлено большое число локусов, содержавших тандемные повторы. Оказалось, что с увеличением кратности повтора их количество в геноме возбудителя логарифмически уменьшалось. Особое внимание было уделено повторам с' высокой кратностью из-за повышенной вероятности их вариабельности и присутствия большего числа нуклеотидов в повторе, что облегчало детекцию при последующем электрофорезе.

Были отобраны четыре таких повтора, обозначенных нами как FtA -последовательность из 9 нуклеотидов, повторяющуюся 21 раз (AAT AAG GAT)21, повтор FtB из 16 нуклеотидов - (ТТТ СТА CAA ATA ТСТ Т)4.7, повторы FtC из 21 нуклеотида - (TTG GTG А АС ТТТ СТТ GCT СТТ)3 и FtD из 6 нуклеотидов - (ТТА ATG)|3 повторяющиеся 3 и 13 раз, соответственно. Первый повтор FtA описан в литературе под аббревиатурой SSTR9E (Johansson A. et al., 2004), а второй VNTR-повтор (FtB) отличался от SSTR16 на 2 нуклеотида.

Два повтора - FtA и FtC - удалось локализовать на хромосоме штамма Schu S4 туляремийного микроба относительно открытых рамок считывания. Оказалось, что FtA располагается в нетранслируемой области между генами CDS 104 и CDS 105, тогда как FtC находится в составе структурного гена CDS 598, кодирующего АТФ - зависимую ДНК-геликазу.

Для определения вариабельности локусов тандемных повторов у различных штаммов F. tularensis были сконструированы праймеры, фланкирующие локусы тандемных повторов. Ожидаемый размер ПЦР - амплификата для повтора FtA

составил 298 нуклеотидов, что на 134 нуклеотида меньше, чем у А. Johansson et al. (2004). Конечно же, это облегчало разделение продуктов ПЦР при электрофорезе.

При исследовании с помощью полимеразной цепной реакции ДНК различных представителей рода Francisella со специфическими праймерами к локусу FtA было выявлено существование 10 аллелей, 9 из которых представлены на рис. 1. Молекулярная масса полученных амплифицированных фрагментов ориентировочно варьировала от 110 до 410 нуклеотидов. Это указывало, что локус FtA у различных штаммов содержал разное число вариабельных тандемных повторов. Для повтора FtC обнаружено 9 типов аллелей (2-8 повторов), а для FtD - всего 3 аллели (с 5, 7 и 13 повторами).

Таким образом, нами разработано оригинальное программное обеспечение, с помощью которого проведен поиск локусов с вариабельными тандемными повторами в составе генома F. tularensis. Анализ тандемных повторов (VNTR-анализ) штаммов туляремийного микроба и создание на этой основе системы типирования - важная задача, решение которой необходимо для молекулярного типирования коллекционных и свежевыделенных штаммов возбудителя.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Чэд. ■ • -■ .

Ив*™*' 7 ' Ь, ■ ■ 'fy > : ,

' » хзв*» - es

■i toii-fW; t

ищш щЯРЯНМР^^^к.

SMp

Рисунок 1 - Электрофорез в 8% полиакриламидном геле продуктов амплификации ДНК различных представителей рода Francisella со специфическими праймерами к локусу FtA. Лунки 5, 9 и 13 содержат суммарный препарат ладдеров локуса FtA. В лунках 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12 представлен амплификат с ДНК различных штаммов Francisella tularensis. Лунка 14 содержит препарат ладдеров локуса VcC возбудителя холеры (Водопьянов A.C. и др., 2001).

Изучение стабильности наследования VNTR-локусов на примере дефектных по ЛИС вариантов туляремийного микроба. Для изучения стабильности наследования аллельных вариантов VNTR- повторов в геноме F. tularensis была исследована коллекция, содержавшая исходные вирулентные штаммы трех основных подвидов F. tularensis subsp. tularensis -A-Cole, AE 261; F. tularensis subsp. mediaasiatica - 543, 240; F. tularensis subsp. holarctica - 503, 250, 117 и девять авирулентных cap- мутантов, полученых Н.В Павлович и др.(1993) по оригинальной методике. Исходные и мутантные штаммы в течение 10 лет хранили на среде Мак-Коя с периодическими пересевами. VNTR-анализ проводили методом полимеразной цепной реакции, используя сконструированные специфичные праймеры к локусам FtA, FtB и FtC. Установлено полное совпадение размеров аллелей локусов у всех взятых в исследование пар (родительский штамм - мутантные варианты). Полученные результаты в данном случае свидетельствуют о стабильном наследовании аллельных характеристик локусов вариабельных тандемных повторов у антиген-измененных вариантов штаммов разных подвидов F. tularensis, несмотря на длительные пересевы и мутационное воздействие.

Проблема двойных аллелей VNTR-локусов у Francisella tularensis. Одной из проблем VNTR-типирования является возможное появление на электрофореграмме при анализе штамма вместо одной нескольких полос (аллелей). Этот феномен был изучен на примере двух штаммов F. tularensis subsp. holarctica 14039 и 14054, содержавших по две аллели в локусе FtA. Исследование штаммов проводили двухкратно в течение одного года, при этом как первое, так и второе исследование подтвердило наличие сдвоенных аллелей. При втором исследовании штаммы были рассеяны на плотной среде Т с последующим произвольным отбором по 6 колоний каждого штамма. Исследование колоний в ПЦР с праймерами к локусу FtA показало, что в случае штамма 14039 из шести колоний три имели 11 вариабельных повторов и три - 12 повторов. Четыре колонии штамма 14054 имели пять повторов, а два -шесть. Для последующего изучения штамма 14054 были выбраны колония № 1 (6 повторов) и колония № 6 (5 повторов), из которых после рассева на плотной среде были вновь отобраны и исследованы по шесть изолированных колоний. Как оказалось, все дочерние колонии по числу повторов были идентичны исходным.

Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что наличие сдвоенных аллелей является следствием присутствия в популяции дикого штамма 14054 смеси двух клонов, содержавших каждый свою аллель. Причин тому, на наш взгляд, несколько. С одной стороны, это может быть обусловлено мутацией в составе VNTR-локуса штамма во время инфекционного процесса. С другой стороны, появление двух клонов в составе одного штамма теоретически может быть обусловлено одновременным инфицированием животного двумя разными переносчиками. Для проверки данного предположения мы заразили белых мышей двумя штаммами F. tularensis subsp holarctica 14039 и 14054. В одном случае при внутримышечном заражении смесью (соотношение 1: 1)

штаммов в «одном шприце» из гомогената печени была выделена культура Г. Ш1агет1Б, локус Р1А которой был предствлен несколькими аллелями, что подтверждает сделанное предположение.

У1ЧТК-анализ штаммов ¥гапс'ш11а Магепэгэ

Генотипирование штаммов, выделенных в Ростовской области. В

результате исследования ДНК 109 штаммов, выделенных исключительно на территории Ростовской области, для локуса Р1А зарегистрировано присутствие 12 типов аллелей, а для локуса РЮ - 3 аллеля. Локусы Р1В и РЮ в данном случае оказались не вариабельными. Локус Р1В у всех изученных штаммов был представлен аллелью с тремя повторами, а РЮ — 5, что можно рассматривать в качестве своеобразной генетической метки, характерной для нашей коллекции культур голарктического подвида. В зависимости от кратности повторов, все исследованные штаммы удалось сгруппировать в 19 вариантов генотипов, а при помощи кластерного анализа было построено филогенетическое дерево, позволившее распределить все генотипы на группы А и В (рис. 2)

Рисунок 2 - Филогенетическое дерево, построенное на данных распределения аллелей У1МТЯ штаммов К 1и1агетЬ, выделенных из природных очагов Ростовской области.

При анализе связи места выделения штаммов с генотипом (рис. 3) выделенные на территории Ростовской области штаммы К шЫгет'ю удалось разделить на две группы: к первой относятся штаммы, генотипы которых почти равномерно встречались на всей территории области, штаммы второй группы проявляли тенденцию к географической привязанности. Так, удалось выявить генотипы, характерные для каждого типа очагов.

Небезынтересно отметить, что, независимо от генотипа, штаммы, содержавшие кратность локуса ЬЧА, равную шести, встречались в исследуемом регионе на протяжении более 20 лет (с 1981 года). Причем, если первоначально эти штаммы были представлены генотипом АЗ с аллельной формулой 6, 5,3, 6, то во время эпизоотийных осложнений 1989 года появился генотип А7, отличавшийся на одну единицу повтора локуса Р1С. Он прослеживался также и в изолятах 2001-2002 годов. Последнее позволяет предположить, что культуры с одинаковыми (близкими) генотипическими характеристиками могут довольно долго циркулировать в эндемичных очагах туляремии. В пользу возможной персистенции в природе штаммов с одним и тем же генотипом свидетельствует и факт выделения от носителей штаммов генотипа А2 как в 1945, так и 1989 годах.

Рисунок 3 - Распределение генотипов штаммов РгапыяеНа 1и1агет1з на территории Ростовской области. Горизонтальной штриховкой обозначены районы с преобладанием очагов степного типа, вертикальной - поименно-

болотного.

Анализ штаммов, изолированных на территории Южного Федерального округа. Ретроспективный анализ распределения генотипов на территории Ростовской области показывает, что на исследуемой территории

одновременно циркулируют штаммы одного либо близкородственных генотипов. Так, штаммы, выделенные в 1981 году практически в пределах г. Ростова - на - Дону, принадлежали к генотипу АЗ, штаммы 1996 г. - к генотипу В6, а 2001-2002 гг. - генотипу А7. И хотя штаммы, выделенные в 1997 году, распределялись между тремя генотипами (В8, В11, В12), все они близкородственные, так как отличаются всего на одну аллель одного локуса. Это позволяет сделать вывод, что вызываемые туляремийным микробом эпизотические проявления среди чувствительных животных можно разделить на поликлональные, во время которых выделяли штаммы различных генотипов (например, эпизоотия 1988-89 годов), моноклональные, сопровождавшиеся выделением штаммов одного генотипа (эпизоотия 1981 года) и кластерные -вызываемые кластером близкородственных генотипов (эпизоотия 1997 года).

Ретроспективный анализ штаммов, выделенных во время зимней эпизоотии туляремии в СССР и других странах в 1988 - 89 годах. Анализ генотипов штаммов, выделенных во время разлитой эпизоотии 1988-89 годов, позволил сгруппировать их в 30 вариантов индивидуальных генотипов, а кластерный анализ - распределить среди шести кластеров. Доминирующим оказался генотип С1, на который приходилось всего лишь 37 штаммов (23,3%), выделенных в Ростовской, Иркутской областях, в Крыму и зоне деятельности Северо-Западной ПЧС.

В случае Ростовской области источниками выделения культур были объекты как биотической, так и абиотической природы, но на каждый генотип приходилось 4-6 штаммов, что прослеживается и при анализе штаммов, выделенных на Северном Кавказе (Калмыкии), Крыму и в Одесской области, свидетельствуя о стойкости существующих природных очагов. Так, в 1988-89 гг. в Ростовской области выделялись штаммы с генотипами 02, 08 и А5, с которыми исследователи сталкивались и в другие годы (1945, 1981, 1996, 2001, 2002 гг.), а, например, в Калмыкии доминировали штаммы генотипов А5 и ЭЗ, присутствие которых отмечалось позднее в 1996,2001 и 2002 годах.

Таким образом, согласно проведенному УМТ11-генотипированию можно заключить, что выделенные в разных географических регионах зимой 1988-89 гг. штаммы Р. ш1агет1$ являются резидентными, они характерны для мест их постоянного пребывания в пределах устойчивых очагов и являются отражением их регионального генезиса.

Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие коллекционных штаммов РгапахеЫа /и/агел«« по данным УЭТИ-анализа

их ДНК. Анализ вариабельных тандемных повторов 352 коллекционных штаммов ш1агет1з, выделенных в разных регионах мира в период с 1945 по 2002 годы показал, что и среди них сохраняется принцип генотипической и географической гетерогенности, а также территориальной приуроченности определенных типов штаммов.

Географическая информационная система «Туляремия». Данные, полученные при генотипировании 352 штаммов возбудителя туляремии, легли в основу созданной нами Геоинформационной системы «Туляремия» (ГИС «Туляремия»), Принципиальным отличием созданной ГИС является наличие географической привязки любых данных к координатной сетке. Когда различные данные имеют единую систему координат, это дает возможность наложения их друга на друга в виде отдельных слоев. При этом на композитной карте (рис. 4) отображается совокупная информация, что дает возможность анализировать взаимосвязи различных видов данных между собой. Причем в каждом конкретном случае отображаются только необходимые слои, что позволяет избежать информационной перегрузки.

Созданная ГИС «Туляремия» работает в двух основных режимах: «Туляремия - мир» и «Туляремия - Ростовская область». Так как почти треть всех исследованных штаммов (127 из 352) приходится на очаги Ростовской области, данное обстоятельство обеспечивает возможность проведения более детального анализа распределения генотипов в конкретном регионе. Разработанная геоинформационная система «Туляремия» зарегистрирована в Государственном реестре баз данных РФ.

Рисунок 4 - Принцип формирования композитной карты из нескольких слоев (модулей).

Внутривидовая идентификация и количественное определение возбудителя туляремии

Конструирование праймеров для внутривидовой дифференциации представителей Ргапа.чеНа Ш1агет'м. Полученный при генотипировании опыт был использован нами для дифференциации подвидов. На основе выявленной М. ВгоекИиЦБеп е! а1. (2003) дифференцирующей области в геноме ^ Магетм

нам удалось создать систему праймеров ({ША и КОВ), позволяющих эффективно дифференцировать подвиды возбудителя туляремии в полимеразной цепной реакции по размерам ампликонов. При необходимости идентификации Р. .тЬър. nov¡c¡da разработанная тест-система может быть легко дополнена описанными нами праймерами к локусу Р10. В целом, размеры получаемых при использовании в ПЦР новых праймеров фрагментов были в 34 раза короче, чем в работе М. ВгоекИи^еп е1 а1. (2003), что позволило значительно упростить получение и интерпретацию результатов.

Специфичность разработанных праймеров была проверена на коллекции 132 зашифрованных образцов, включавших 47 штаммов возбудителя туляремии разных подвидов, 9 образцов, содержавших Р. novicida, Р. по\чс1с!а-Ике и Р. philomiragia и 76 штаммов возбудителей, не относящихся к роду Ргапс1$е11а. Все образцы, содержавшие ДНК возбудителя туляремии, были идентифицированы правильно.

Количественное определение возбудителя туляремии с помощью ПЦР в реальном времени. Мы разработали свой вариант способа количественного определения ДНК Р. 1и1агеп.ч1.^ с помощью ПЦР в реальном времени при помощи флуоресцентно-меченного зонда. В качестве мишени амплификации был выбран участок хромосомальной ДНК, содержащий вариабельный тандемный повтор Р1А, присутствующий у всех подвидов возбудителя туляремии. Чувствительность ПЦР в режиме реального времени определяли путем исследования образцов, содержавших известное количество ДНК-матрицы. Положительный результат реакции был зарегистрирован при содержании в исследуемой пробе 10 3 и более микробных клеток в мл. Для изучения возможности количественного определения возбудителя исследовали пробы, содержавшие 10-кратные разведения взвеси вакцинного штамма РЛи1агет'и 15/10. Линейное нарастание интенсивности флюоресценции регистрировали в пробах, содержавших от 10 9 до 10 3 м. к./мл, что составляет примерно 4 геном-эквивалента на реакцию. При этом ПЦР можно было проводить в двух форматах: «классический» формат реакции включал постановку ПЦР в обычном ДНК-амплификаторе с последующим учетом «по конечной точке» в ПЦР-детекторе «Джин» (НПФ «ДНК-технология» г. Москва) и ПЦР в режиме реального времени (т.е. в ходе самой амплификации) на амплификаторе «ДТ 332» (НПФ «ДНК-технология», г. Москва). Учитывая универсальность и быстроту получения ответа, способ может найти применение в практике работы специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБов) противочумных институтов и в лабораториях других учреждений Ростпотребназора при ликвидации последствий разного рода эпидосложнений.

выводы

1. VNTR-анализ по четырем локусам обширной коллекции из 352 штаммов всех подвидов возбудителя туляремии позволил выявить 61 генотип и продемонстрировать генотипическую гетерогенность (разнообразие) исследованных штаммов.

2. С помощью разработанного компьютерного программного обеспечения для поиска тандемных повторов определено, что в геноме Francisella tularensis содержится большое количество повторов различной длины и кратности, часть которых являются вариабельными и могут быть использованы для генотипирования.

3. Метод анализа вариабельных тандемных повторов обладает высокой дискриминирующей силой и пригоден для генотипирования штаммов возбудителя туляремии из разных источников.

4. Выявлены особенности (территориальная привязанность) распределения VNTR- генотипов штаммов туляремийного микроба на территории Ростовской области, Южного Федерального округа, Америки и стран Восточной Европы.

5. Вызываемые возбудителем туляремии вспышки можно разделить на поликлональные, во время которых выделяют штаммы различных генотипов, моноклональные, сопровождающиеся выделением штаммов одного генотипа, и кластерные - вызываемые кластером близкородственных генотипов.

6. Активизация природных очагов туляремии, сопровождавшаяся разлитой эпизоотией зимой 1988-89 годов, не связана с выносом инфекции с одной территории на другую, а определяется факторами более общего плана -возможностью изменения сопротивляемости чувствительного хозяина или биологических свойств возбудителя под влиянием повышенной деятельности Солнца.

7. Сконструирован набор праймеров и разработана схема внутривидовой дифференциации в ПЦР всех 4 подвидов туляремийного микроба.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Водопьянов, A.C. Поиск вариабельных тандемных повторов путем компьютерного анализа генома Francisella tularensis / A.C. Водопьянов, С.О. Водопьянов, М.Б. Мишанькин, И.Ю. Сучков и др. // Естествознание на рубеже столетий: Тез. докл. междунар. конф. -М., 2001. - Т. 2.-С. 22.

2. Водопьянов, A.C. MLVA-типирование штаммов Francisella tularensis, выделенных в природных очагах туляремии Ростовской области с 1945 по 2002 годы / A.C. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин // Генодиагностика инфекционных болезней: IV Всероссийск. науч.-практ. конф. / Сб. тезисов под ред. акад. В. И. Покровского. - М., 2002. - С. 267-269.

3. Водопьянов, A.C. Вариабельные тандемные повторы у Francisella tularensis'. компьютерный анализ генома и его использование для молекулярного типирования / A.C. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Н.В. Павлович, И.П. Олейников и др. // Биотехнология. - 2003. № 1. - С. 73-78.

4. Водопьянов, A.C. Изучение стабильности исследования локусов VNTR у дефектных по ЛПС вариантов Francisella tularensis / A.C. Водопьянов, H.B. Павлович, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин // Успехи современного естествознания. - 2003. — № 8. - С. 43-44.

5. Vodopyanov, A. Multilocus VNTR analysis of Fr.tularensis strains isolated in North Caucasus / A. Vodopyanov, N. Pavlovich, N. Pichurina, S. Vodopyanov et al. // IV Internat. Conf. on tularemia. United Kingdom, Bath. - 2003. - P. P15.

6. Водопьянов, A.C. Мультилокусное VNTR- типирование штаммов Francisella tularensis / A.C. Водопьянов, C.O. Водопьянов, H.B. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2004,-№2.-С. 21-25.

7. Водопьянов, A.C. Генотипирование методом мультилокусного VNTR-анализа штаммов Francisella tularensis из природных очагов туляремии Ростовской области / A.C. Водопьянов, Н.В. Павлович, С.О. Водопьянов, И. Ю. Сучков и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2004,-№2.-С. 24-28.

8. Водопьянов, A.C. Проблема сдвоенных аллелей VNTR-локусов Francisella tularensis / A.C. Водопьянов, H.B. Павлович, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин // Генодиагностика инфекционных болезней: VI Всероссийск. науч.-практ. конф.: Сб. тезисов под ред. акад. В.И. Покровского. - М., 2004. -Т. 2.-С. 166-168.

9. Водопьянов, С.О. Перспективы метода molecular beacons для генной диагностики возбудителей особо опасных инфекций / С.О.Водопьянов, A.C. Водопьянов, И.Ю. Сучков, И.П.Олейников и др. // Генодиагностика инфекционных болезней: VI Всероссийск. науч.-практ. конф.: Сб. тезисов под ред. акад. В.И. Покровского. - М., 2004. - Т. 2. - С. 164-165.

10. Водопьянов, A.C. Генотипическая и эпидемиологическая характеристика штаммов Francisella tularensis, выделенных на территории Северного Кавказа. / А.С.Водопьянов, Н.В.Павлович, Б.Н.Мишанькин // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - № 2. - С. 21-24.

11. Водопьянов, A.C. VNTR-генотипирование штаммов Francisella tularensis, выделенных на территории бывшего СССР и некоторых стран Европы во время эпизоотий 1988-89 годов / A.C. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, Н.В. Павлович, С.О. Водопьянов и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 3. - С. 22-27.

12. Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2006620302. Геоинформационная система «Туляремия» / A.C. Водопьянов, Н.В. Павлович, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин. - 2006.

13. Водопьянов, A.C. Дифференциация подвидов возбудителя туляремии / А.С.Водопьянов, Н.В.Павлович, С.О.Водопьянов, Б.Н.Мишанькин // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств СНГ: Материалы VII Межгосударств, науч.-практ. конф. - Оболенск, 2006. - С. 9293

14. Водопьянов, A.C. Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие коллекционных штаммов F. tularensis по данным VNTR -анализа их ДНК / A.C. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, Н.В. Павлович, Н.Л. Пичурина // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2007. -№ 2. - С. 33-40.

15. Водопьянов, A.C. Возбудитель туляремии: дифференциация подвидов с помощью ПЦР / A.C. Водопьянов, Н.В. Павлович, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин // Биотехнология. - 2007. - № 6. - С. 82-85.

16. Водопьянов, A.C. Выявление Francisella tularensis с помощью ПЦР в реальном времени / A.C. Водопьянов, Н.В. Павлович, С.О. Водопьянов, Б.Н Мишанькин. // Генодиагностика инфекционных болезней: VI Всероссийск. науч.-практ. конф. - М., 2007. - Т. 1. - С. 358-359.

17. Арутюнов, Ю.И. Динамика туляремии в Южном Федеральном Округе: Ставропольский край и Карачаево-Черкесская республика (история вопроса) / Ю.И. Арутюнов, Б.Н. Мишанькин, A.C. Водопьянов, Н.Л. Пичурина // Научная мысль Кавказа. - 2007. - № 1. - С. 54-62.

18. Арутюнов, Ю.И. Некоторые особенности проявления туляремии в Южном Федеральном округе: Ростовская область (история вопроса) / Ю.И. Арутюнов, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, A.C. Водопьянов // Научная мысль Кавказа. - 2007. - № 2. - С. 43-51.

19. Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2008620076. Коллекция штаммов туляремийного микроба / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, М.В. Цимбалистова, A.C. Водопьянов. -2008.

20. Арутюнов, Ю.И. Туляремия в Южном федеральном округе: республики Северного Кавказа (история вопроса) / Ю.И. Арутюнов, Б.Н. Мишанькин, A.C. Водопьянов // Научная мысль Кавказа. - 2008. - № 2. - С. 47-56.

21. Арутюнов, Ю.И. Особенности проявления туляремии в Южном Федеральном округе: Волгоградская область (история вопроса) / Ю.И. Арутюнов, Б.Н. Мишанькин, A.C. Водопьянов // Научная мысль Кавказа. -2008,-№4.-С. 34-40.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 1221. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Водопьянов, Алексей Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Генотипирование штаммов микроорганизмов - составная часть эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями.

1.2. Методы, используемые при генотипировании микроорганизмов. 1.2.1. VNTR- анализ ДНК возбудителей бактериальных инфекций.

1.3. Возможная роль тандемных повторов ДНК в биологии клетки.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов.

2.2. Реактивы и питательные среды и лабораторные животные.

2.3. Выделение ДНК, постановка ПЦР и учет результатов.

2.4. Компьютерное обеспечение и поиск тапдемпых повторов.

2.5. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Поиск и изучение вариабельных тандемных повторов в геноме возбудителя туляремии.

3.1. Встречаемость локусов тандемных повторов в геноме Francisella tularensis.

3.2. Изучение стабильности наследования VNTR-локусов на примере дефектных по ЛПС вариантов туляремийного микроба.

3.3. Проблема двойных аллелей VNTR-локусов у Francisella tularensis.

Глава 4. VNTR- анализ штаммов Francisella tularensis.

4.1. Генотипирование штаммов, выделенных в Ростовской области.

4.2. Анализ штаммов, изолированных на территории Южного Федерального округа.

4.3. Ретроспективный анализ штаммов, выделенных во время зимней эпизоотии туляремии в СССР и других странах в 1988 - 89 годах

4.4. Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие коллекционных штаммов Francisella tularensis по данным VNTR-анализа их ДНК.

4.5. Географическая информационная система «Туляремия».

Глава 5. Внутривидовая идентификация и количественное определение возбудителя туляремии.

5.1. Конструирование праймеров для внутривидовой дифференциации представителей Francisella tularensis.

5.2. Количественное определение возбудителя туляремии с помощью ПЦР в реальном времени.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генотипическое разнообразие Francisella tularensis: VNTR- анализ"

Актуальность проблемы. Francisella tularensis — возбудитель туляремии, острого зоонозного природно-очагового инфекционного заболевания, поражающего многие виды млекопитающих, включая человека, грызунов и лаго-морфов. Пути и механизмы передачи микроба многообразны: люди могут заражаться при прямом контакте с больными животными, при вдыхании инфицированного материала, употреблении зараженной воды или пищи, при укусе комарами, москитами и клещами. Природный резервуар чаще остается неизвестным, хотя показана возможность персистенции возбудителя более года в воде и иле (Parker R.R., Steinhaus Е.А., Kohls G.M. et al., 1951), в организме восприимчивых животных (Олсуфьев Н.Г., 1975), пребывания в окружающей среде в виде некультивируемых форм (Романова JI.B., Мишанькин Б.Н., Пи-чурина H.JI. и др., 2000).

Важность проблемы туляремии определяется исключительной стойкостью, цикличностью и нарастающей активностью природных очагов этой инфекции практически на всей территории северного полушария, включая Российскую Федерацию. Активные автономные природные очаги туляремии тундрового типа описаны даже па территории острова Врангеля на границе Восточно-Сибирского и Чукотского морей Северного Ледовитого океана (Подобедова Я.С., Демидова Т.Н., Кормилицина М.И., Мещерякова И.С., 2006). В целом по стране с 1999 по 2006 год зарегистрировано 1427 случаев туляремии (Безсмертный В.Е., Горшенко В.В., Попов В.П., 2008).

Прослеживается четкая тенденция к расширению ареала обитания возбудителя: микроб обнаружен у больного в Австралии, считавшейся свободной от туляремии (Whipp M.J., Davies J.M., Lum G. et al., 2003). В Словакии от мышевидных грызунов выделены два штамма F. tularensis siibsp. nearctica (Gurycova D., 1998), что является первым случаем регистрации высоковирулентного подвида в Европе. И если до 2004 года неэндемичными по туляремии в Европе оставались лишь Великобритания, Португалия и Исландия (Tarnvik A., Priebe Н., Grunow R., 2004), то de I.L.Carvalho et al. (2007) уже сообщили о положительных в ПЦР пробах на ДНК F. tularensis от человека и клещей северной провинции Португалии.

После 60-летнего затишья зарегистрированы вспышки туляремии в европейской части Турции (Gurcan S., Eskiocak М., Varol G., 2006; Willke A., Meric M., Grunow R. et al., 2009), показано существование активных природных очагов в соседней Болгарии, в которых возбудитель обнаруживали вместе с боррелиями и Anaplasnia phagocy tophi him (Christova J., Gladnishka Т., 2005; Marinov K.T., Georgieva E.D., Ivanov I.N., Kantardjiev T.V., 2009), в ряде провинций Китая (Zhang F., Liu W., Chu M.C. et al., 2006).

Помимо контроля состояния природных очагов, определенное значение приобретает возможность использования возбудителя туляремии в террористических целях как агента II группы патогенности с высоким индивидуальным и низким общественным риском (Воробьев А.А., 2001). И если терроризм - это преднамеренное, политически мотивированное насилие, осуществляемое против граждан в невоенное время с целью воздействия на общественное мнение (Кондрик Е.К., Волков В.В., Кавызина Л.И., 2003), то биотерроризм превратился в одну из реальных угроз национальной безопасности любой страны. Ведь многие из современных биотехнологических разработок с использованием опасных патогенов бактериальной и вирусной природы являются сложными технологиями двойного применения. В случае сознательного использования биологических (генетических) агентов для поражения людей, животных и растений они «классифицируются как биологическое оружие» (Спирин А.С., 1997). Поэтому не удивительно, что и Центры по контролю за заболеваемостью (CDC) США отнесли F. tularensis к категории А потенциальных агентов биотерроризма (Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al., 2002), а сам возбудитель в рамках программы Bio Watch подвергли постоянному мониторингу на случай возможной биотеррористической атаки (Barns S.M., Grow С.С., Okinaka R.T. et al., 2005).

Известен высокий консерватизм фенотипа (антигенная однородность, однотипность биологических свойств, невысокая биохимическая активность и др.) штаммов F. tularensis при исследовании традиционными методами (Олсуфьев Н.Г., 1975), поэтому оперативное расследование вспышек заболевания для выявления источника инфекции и путей передачи возбудителя в настоящее время затруднительно без комплекса молекулярно-биологических методов, способных быстро и четко дифференцировать различные подвиды и штаммы возбудителя, что исключительно важно на фоне требований практики жизни и реальной угрозы биотерроризма. Только благодаря использованию приема VNTR (Variable Number Tandem Repeat, Вариабельные Тандем-ные Повторы) - типирования удалось в короткие сроки установить происхождение штамма Bacillus anthracis, распыленного членами религиозной секты Аум Синреке в Японии в 1993 году (Keim P., Smith K.L., Keys С. et al., 2001), и справиться с почтовым терроризмом в США, когда погибло пять и заболело кожной формой сибирской язвы несколько человек (Hoffmaster A.R., Fitzgerald С.С., Ribot Е.Е. et al., 2002). В этой связи представлялось актуальным использование активно разрабатываемого в последние годы в интересах молекулярной эпидемиологии VNTR-анализа для дифференциации штаммов F. tularensis, неразличимых рутинными методами диагностики и типирования, тем более что однородность возбудителя не укладывается в фундаментальное положение эпидемиологии, согласно которому основной характеристикой популяции является гетерогенность (неоднородность) составляющих ее особей, обусловленная разнообразием генотипов в пределах генофонда и определяющая в совокупности с другими факторами устойчивость паразитарной системы в целом.

Поставленную цель предполагалось реализовать выполнением следующих задач:

- конструирование и синтез специфических праймеров, фланкирущих участки генома с тандемными повторами, отработка методики генотипирова-ния;

- формирование коллекции штаммов всех подвидов F. tularensis из различных регионов бывшего СССР, а также из-за рубежа;

- VNTR-анализ подобранной коллекции штаммов и создание базы данных по выявленным VNTR- генотипам штаммов F. tularensis;

- анализ собранного материала с целью установления возможной связи между VNTR- генотипом штамма и его происхождением, местом, временем и источником выделения;

- изучение стабильности аллелей выявленных локусов вариабельных тандемных повторов;

- подработка подходов к дифференциации подвидов рода Francisella и количественному определению возбудителя туляремии с помощью ПЦР.

Научная новизна работы. Впервые с помощью методики генотипирова-ния возбудителя туляремии, основанной на определении кратности вариабельных тандемных повторов, проведен VNTR — анализ по четырем локусам обширной коллекции из 352 штаммов F. tularensis, включавшей представителей всех четырех подвидов возбудителя туляремии. Показана генотипическая гетерогенность (разнообразие) штаммов возбудителя туляремии. Изучена стабильность наследования аллелей VNTR-локусов у дефектных по ЛПС вариантов туляремийного микроба. Разработан алгоритм кластерного анализа распределения аллелей VNTR- локусов. Дано возможное объяснение феномену возникновения штаммов с двойными аллелями. Впервые выявлены особенности географического распределения генотипов штаммов на территории Ростовской области, Южного Федерального округа, республик бывшего СССР, Америки и ряда стран Восточной Европы. Показано, что согласно генотипированию вызываемые туляремийным микробом вспышки можно разделить на поликлональные, моноклональные и кластерные. Изучена связь между активизацией природных очагов туляремии и солнечной активностью. Предложена упрощенная методика определения подвидов туляремийного микроба с использованием ПНР. Разработан вариант количественного определения возбудителя туляремии в пробе помощью ПЦР в режиме реального времени.

Депонирован штамм в Государственной коллекции патогенных бактерий института «Микроб» Francisella tularensis 503/840 в качестве тест - штамма для определения числа повторов по локусу FtA у возбудителя туляремии. Получена справка о депонировании охраноспособного штамма Francisella tularensis subsp. holarctica 503/840 в ГКПБ «Микроб» от 9 марта 2004 года.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В геноме Francisella tularensis содержится большое количество тан-демных повторов, часть из которых являются вариабельными и пригодными для генотипирования штаммов возбудителя туляремии.

2. Анализ вариабельных тандемных повторов (VNTR-анализ) в геноме 352 штаммов возбудителя туляремии всех четырех подвидов Francisella tularensis выявил существование среди них генотипической гетерогенности, а также территориальной приуроченности нзолятов определенных генотипов.

4. Выделенные в разных географических регионах во время разлитой эпизоотии зимой 1988-89 гг. штаммы Francisella tularensis являются резидентными и характерны для мест их постоянного пребывания в пределах устойчивых очагов.

5. Идентификация (дифференциация) подвидов Francisella tularensis возможна с помощью полимеразной цепной реакции.

Апробация работы

Результаты исследований неоднократно обсуждались:

- на IV Всероссийской научно — практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва, 22-24 октября 2002 г.;

- на 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 30 сентября - 2 октября 2003 г.;

- на VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств», Оболенск, 3-5 октября 2006 г.;

- на VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007», Москва, 28-30 ноября 2007 г.;

- 4 International Conference on Tularemia. The Assembly Rooms, City of Bath, United Kingdom, 2003.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Водопьянов, Алексей Сергеевич

Заключение

Трудно не отметить тот факт, что за последние 10 лет интерес к возбудителю туляремии в мире резко возрос. Это особенно видно по регулярным международным тематическим конференциям (Швеция, 1995, 2000; Чехия, 1997; Англия, 2003; США, 2006), многочисленным публикациям сотрудников солидных научных центров США, Швеции, Англии, Германии, Китая и других, которые к тому же объединяют свои усилия при решении сложных научных проблем. Так, проведено секвенирование и сравнение полных геномов Francisella tularensis штаммов Schu S4 Al (Larsson P. et al., 2005) и WY96-3418 F.tularensis subsp. tularensis A.II (Beckstrom-Sternberg S.M. et al., 2007), Schu S4 и OSU18 F. tularensis subsp. holarctica (Petrosino J. et al., 2006), оперативно проанализировано сообщение D.Gurycova (1998) о выделении в Центральной Европе штаммов неарктического подвида, показана их близость лабораторному штамму Schu S4 (Chaudhuri R.R. et al., 2007), активно развиваются исследования механизмов вирулентности (Titball R.W. et al., 2003), а также вопросов индикации и идентификации штаммов с использованием методов высокого аналитического разрешения, включая приемы VNTR-анализа ДНК и ПЦР в реальном времени (Farlow J. et al., 2001; Johansson A. et al., 2004; Kuge-ler K. et al., 2006; Fujita O. et al., 2006). He отрицая широкого распространения туляремии во многих странах Северного полушария, все же следует признать, что внимание к ней отчасти носит конъюктурный характер из-за предполагаемой возможности использования возбудителя в террористических целях как агента II группы патогенности с высоким индивидуальным и низким общественным риском (Воробьев А.А., 2001).

Для нашей страны проблема туляремии традиционно остается актуальной. Занимая около 80% территории юга России, природные очаги туляремии часто вовлечены в сферу интересов и хозяйственной деятельности человека, они характеризуются исключительной стойкостью, циклическим проявлением активности и связанными с ними периодическими подъемами заболеваемости, заметной тенденцией к появлению новых эндемичных очагов, что объясняет необходимость проведения постоянного мониторинга за их состоянием с использованием всего комплекса бактериологических, серологических и генодиагностических методов исследования. Использование в практике эпи-зоотологического обследования природных очагов полимеразной цепной реакции не только позволило усвершенствовать тактику лабораторной диагностики при эпиднадзоре за очагами, обнаружить некультивируемые формы возбудителя, но и значительно расширить наши представления об экологии туляремийного микроба, его адаптационных возможностях (Романова JI.B., 2008). Как свидетельствуют приведенные в обзоре литературы данные (глава 1, раздел 1.3), основанный на принципе ПЦР VNTR- анализ из-за своей высокой чувствительности и сравнительно малой трудоемкости стал одним из наиболее применяемых методов генотипической характеристики штаммов микроорганизмов в интересах молекулярной эпидемиологии.

Толчком к началу нашего исследования в 2001 году явились 70- летняя история туляремии в Ростовской области, солидный перечень штаммов туляремийного микроба в музее живых культур Ростовского противочумного института, отработанная техника проведения VNTR- анализа и сложившееся стойкое мнение о фенотипическом однообразии возбудителя. Однако последний тезис не укладывался в фундаментальное положение эпидемиологии о том, что основной характеристикой популяции является гетерогенность (неоднородность) составляющих ее особей, обусловленная разнообразием генотипов в пределах популяционного генофонда и определяющая в совокупности с другими факторами устойчивость паразитарной системы в целом. Компьютерный анализ хромосомы F. tularensis Schu S4 среди большого числа тандемных повторов позволил нам с помощью разработанных программ «Repeat» и «Alligments» выделить четыре (FtA, FtB, FtC и FtD), оказавшихся пригодными для последующего использования при генотипировании штаммов. Два повтора - FtA и FtC - удалось локализовать на хромосоме штамма Schu S4 туляремийного микроба относительно открытых рамок считывания. Оказалось, что FtA располагается в нетранслируемой области между генами CDS 104 и CDS 105, тогда как FtC находится в составе структурного гена CDS 598, кодирующего АТФ - зависимую ДНК-геликазу. Показана стабильность наследования аллелей VNTR- локусов у дефектных по ЛПС вариантов туляремийного микроба. Разработан алгоритм кластерного анализа распределения аллелей VNTR-локусов. Дано возможное объяснение феномену возникновения штаммов с двойными аллелями.

Всю имеющуюся в музее живых культур института коллекцию штаммов туляремийного микроба мы удобства ради разделили на части, заложив в качестве основы региональный принцип: Ростовская область, Северный Кавказ, СССР, страны восточной Европы и Америка. Отдельно была исследована группа штаммов, выделенных в различных местах во время разлитой эпизоотии зимой 1988 - 89 годов.

Изучение распределения VNTR- аллелей у 109 штаммов F. tularensis позволило установить факт циркуляции на территории Ростовской области в период с 1945 по 2002 годы 19 генотипов возбудителя. Подобное генотипическое разнообразие свидетельствует как о генетической пластичности туляремийного микроба, обеспечивающей его экологию в естественных условиях, так и о возможности циркуляции на территории Ростовской области различных генотипов. Вызываемые микробом разлитые или локальные эпизоотии среди чувствительных хозяев можно разделить на поликлональные, во время которых выделяли штаммы различных генотипов (например, эпизоотия 1988-89 годов), моноклональные, сопровождавшиеся выделением штаммов одного генотипа (эпизоотия 1981 года) и кластерные — вызываемые кластером близкородственных генотипов (эпизоотия 1997 года).

Безусловно интересным является выделение в регионе штаммов одного и того же генотипа через большие промежутки времени, что может свидетельствовать как о повторных заносах, так и о том, что часть клонов F. tularensis может длительно находится в латентном состоянии (некультивируемые, но жизнеспособные формы возбудителя, резервация микроба в популяциях членистоногих норового комплекса).

При анализе связи места выделения штаммов с генотипом изолирование на территории Ростовской области штаммы F. tularensis удалось разделить на две группы: к первой отнесены штаммы, генотипы которых почти равномерно встречались на всей территории области, штаммы второй группы проявляли тенденцию к географической привязанности. Так, штаммы с генотипами А4, А7, В1,В10иВ12 выделялись только в очагах степного типа, причем В1, В10 и А4 - в северных районах области, а А1, А5, А7, В5, В8, В11 иВ12-в южных. Генотипы А8, В2, ВЗ, В4 и В9, наоборот, встречались только в очагах пойменно-болотного типа.

Территория Южного Федерального округа, включающая помимо Ростовской области Калмыкию, Дагестан, Краснодарский край и Волгоградскую область, была представлена 164 штаммами возбудителя. Изучение показало, что исследованная популяция штаммов туляремийного микроба из природных очагов Южного Федерального округа пойменно-болотного и степного типов носит гетерогенный характер: только на территории Ростовской и близлежащих областей циркулировали штаммы 5 кластеров, состоящих из 28 различ- ных генотипов. Обилие генотипов среди штаммов Ростовской области, скорей всего, объясняется ее географическим положением, характером природных очагов, путями миграции птиц, животных и людей.

Необходимо отметить, что события 1988 — 89 годов занимают особое место в истории изучения туляремии. Как по команде, осенью 1987 и 1988 годов начинается рост численности носителей на большом числе удаленных друг от друга административных территориях с природными очагами разного типа. В некоторых местах численность мышевидных грызунов достигала цифр так называемой «мышной напасти». Богатая кормовая база, теплая зима способствовали развитию эпизоотий, в которые вовлекались животные второй группы инфекционной чувствительности. Пик эпизоотической активности пришелся на зиму 1988-1989 года, что подтверждено выделением большого числа культур из разных объектов природных очагов. На фоне высокой эпизоотической активности, совпавшей с максимумом солнечной активности (Арутюнов Ю.И. и др., 2005), зарегистрированы больные с разными формами болезни и реализацией разных путей передачи. При исследовании полевого материала, собранного только в одной Ростовской области, было выделено 78 культур, в том числе в Северной Степной зоне - 14 (18%), Восточной Степной зоне - 4 (5,1%), Южной Степной зоне - 37 (47,4%), Доно-Маныческой зоне - 14 (18%) и Юго-Западной - 9 (11,5%). Источниками выделения культур были семь видов млекопитающих, их которых максимум приходится на мышь домовую (36,6%) и полевку обыкновенную (31,0%).В семи случаях возбудитель выделен из абиотических объектов (Пичурина H.JL, 1999). Согласно проведенному VNTR-генотипированию 156 изолятов можно заключить, что выделенные в разных географических регионах зимой 1988-89 гг. штаммы Francisella tularensis являются резидентными, они характерны для мест их постоянного > пребывания в пределах устойчивых очагов и яляются отражением своего регионального генезиса. Активизация очагов, видимо, может определяться СА, сопровождаясь при этом изменением инфекционной чувствительности хозяина или биологических свойств самого возбудителя.

Анализ вариабельных тандемных повторов у большого числа коллекционных штаммов возбудителя туляремии показал, что и среди них сохраняется принцип генотипической и географической гетерогенности, а также территориальной приуроченности определенных типов штаммов. Наиболее вариабельным оказался локус FtA (31 аллельный вариант), тогда как локусы FtC (9 типов аллелей), FtB (5 вариантов аллелей) и FtD (3 типа) оказались более консервативными, в связи с чем индекс разнообразия Нея (DI) колебался от 0,906 - 0,680 до 0.039 - 0.017. Анализ идентификационных генотипов штаммов позволил сгруппировать их в 61 вариант от А до I с частотой встречаемости от 0,002 до 0,142, а кластерный анализ - распределить среди 9 кластеров с разным числом составляющих. И если при исследовании 352 преимущественно голарктических штаммов по 4 VNTR- локусам нами был выявлен 61 генотип, то в сходном исследовании по 25 VNTR-локусам коллекции из 192 штаммов, наполовину представленной штаммами неарктического подвида, Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M. et al. (2004) удалось выявить 120 индивидуальных генотипов. Столь большое разнообразие VNTR-локусов у культур F. tularensis subsp. tularensis (type А) по сравнению с F. tularensis subsp.holarctica (type В), является, по мнению авторов, отражением длинной и сложной эволюции, которую прошли штаммы неарктического подвида исключительно на территории Северной Америки. Утрата ими ряда генов, снизивших вирулентный потенциал возбудителя, способствовало возникновению и широкому распространению по континентам голарктических штаммов (Larsson P., Oyston Р.С., Chain P., Chu M.C., 2005; Svensson К., Larsson P., Johansson D. et al., 2005). Высказанное предположение в известной степени подтверждается обнаружением геномных маркеров для дифференциации территориально приуроченных, отличающихся по патогенности популяций A.I и A.II штаммов F. tularensis subsp. tularensis (Molins- Schneekloth С. et al., 2008, 2009) и, в свою очередь, может оказаться направлением, в котором пойдет дальнейшее развитие генотипирования с целью углубленной характеристики выделяемых из внешней среды культур возбудителя.

Внедрение метода анализа вариабельных тандемных повторов по представительному числу локусов в практику генотипирования микроорганизмов привело экспериментаторов к мысли о необходимости разработки и использования мультиплексного варианта ПЦР для одновременного анализа геномов по нескольким локусам, что будет способствовать совершенствованию эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями (Kugeler К. et al., 2006; Versage J. et al., 2003). Конечно же, развитие генотипирования будет продолжаться и идти оно будет как в сторону увеличения числа анализируемых VNTR-локусов штаммов, повышения межштаммовых диффренцирующих возможностей каждого из них внутри подвида (Vogler A.J. et al., 2009), что должно повысить дискриминирующую способность метода в целом, так и инструментального совершенствования за счет использования ПЦР в реальном времени (Kugeler К. et al., 2006), приема автоматизированного капиллярного электрофореза, призванного сменить более доступный, но менее точный и сравнительно медленный метод агарозного геля (Lista F. et al., 2006; Vogler A J. et al., 2009) и других.

VNTR- типирование штаммов F. tularensis тесно связано с проблемой их идентификации и внутривидовой дифференциации, которая обычно базируется на трудоемком и времязатратном изучении особенностей роста на питательных средах, анализе культурально-морфологических и биохимических свойств, вирулентности для кроликов (Олсуфьев Н.Г., 1975). Нам удалось усовершенствовать структуру праймеров для предложенной М. Broekhuijsen et al. (2003) в целях дифференциации подвидов RD — области возбудителя, что выражалось в уменьшении размеров ПЦР-продуктов и использовании разработанного нами приема определения VNTR- локуса FtD при дифференциации F. tularensis subsp. novicida. Предложенный набор праймеров может быть востребован при экстренной диагностики случаев туляремии или таксономических исследованиях.

Появление и развитие новых молекулярно-генетических технологий позволяют исследовать вопросы, ранее остававшиеся труднорешаемыми. Использование приема «молекулярных маяков» (molecular beacon) для детекции ПЦР-продуктов VNTR- локуса FtA F. tularensis позволяет существенно сократить время проведения анализа за счет исключения этапа гель-электрофореза при сохранении прежней специфичности и чувствительности реакции на уровне 4 геном-эквивалентов на реакцию. Он облегчает обнаружение возбудителя в образцах почвы (Sellek R. et al., 2008), воды (Kaysser P. et al., 2008), крови и тканях человека (Hepburn М. et al., 2006).

Одним из результатов наших исследований, наряду с электронной базой данных «Коллекция штаммов туляремийного микроба», стала геоинформационная система (ГИС) «Туляремия», как отражение сформировавшихся в наши дни представлений о необходимости создания и использования современных систем динамического слежения за эпидемическим процессом. По мнению члена-корр. РАН В.В. Лебедева (2005), «как никакой другой стране в мире, России необходимо организованное геоинформационное пространство, то есть систематизированные знания о природных объектах, их пространственном расположении и процессах взаимодействия с обществом. Огромная территория с богатыми природными ресурсами, неравномерное социально-экономическое развитие регионов с их стремлением к экономической самостоятельности требуют полного владения информацией, чтобы комплексно оценивать степень устойчивости развития по всем составляющим, включая экономический потенциал, демографическую ситуацию, качество жизни населения, трудовые ресурсы. Без этого невозможно всесторонне взвешивать последствия принятых решений и разрабатывать стратегические сценарии».

В русле высказанных пожеланий и строилась наша ГИС, модульная структура которой дает возможность модифицировать систему к изменяющимся условиям эксплуатации, характеру и объему поступающей информации, требованиям пользователей. Цель ее — дать пользователю всю возможную важную информацию в максимально удобном, доступном виде для своевременного принятия решения. В нее вошли данные по генотипированию всех 352 исследованных штаммов возбудителя, источникам, времени и местам их выделения. Она сопрягается с форматом данных ВОЗ Epi-Info, благодаря чему может оказаться базовой для наполнения ее любой другой информацией по эпидемиологическому мониторингу за туляремией в связи с задачами по совершенствованию национальной системы биологической безопасности страны.

1. VNTR- анализ по четырем локусам обширной коллекции из 352 штаммов всех подвидов возбудителя туляремии позволил выявить 61 генотип и продемонстрировать генотипическую гетерогенность (разнообразие) исследованных штаммов.

5. Вызываемые возбудителем туляремии вспышки можно разделить на по-ликлональные, во время которых выделяют штаммы различных генотипов, моноклональные, сопровождающиеся выделением штаммов одного генотипа, и кластерные — вызываемые кластером близкородственных генотипов.

6. Активизация природных очагов туляремии, сопровождавшаяся разлитой эпизоотией зимой 1988-89 годов, не связана с выносом инфекции с одной территории на другую, а определяется факторами более общего плана - возможностью изменения сопротивляемости чувствительного хозяина или биологических свойств возбудителя под влиянием повышенной деятельности Солнца.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Водопьянов, Алексей Сергеевич, Ставрополь

1. Алексеев, А.Ф. Особенности эпизоотий туляремии в Крыму / А.Ф. Алексеев, В.И. Чирний, JI.M. Богатырева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. - № 6. - С. 28-32.

2. Арутюнов, Ю.И. Некоторые особенности эпидемических проявлений чумы / Ю.И. Арутюнов, Б.Н. Мишанькин, Ю.М. Ломов, A.M. Кокушкин // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - № 1. - С. 8-10.

3. Асваров, Б.М. Расположение природных очагов туляремии в восточной части Северо-Кавказского региона / Б.М. Асваров, Б.К. Омарова, М.С. Га-зиев, Б.А. Батырова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001. - №. 6. - С. 72-74.

4. Безсмертный, В.Е. К оценке эпидемической и эпизоотической ситуации по туляремии в Российской Федерации / В.Е. Безсмертный, В.В. Горшен-ко, В.П. Попов // Проблемы особо опасн. инфекц. Саратов, 2008. - Вып. 2 (96).-С. 8-12.

5. Беляков, В.Д. Эпидемиология / В.Д. Беляков, Р.Х. Яфаев // М.: Медицина, 1989.-416 с.

6. Березкин, М.В. Хронобиология и хрономедицина: руководство под ред. Ф.И. Комарова / М.В. Березкин // М.: Медицина, 1989. - С. 105-115.

7. Березкина, Г.В. Современное состояние природных очагов туляремии на территории Ямало-Ненецкого автономного округа / Г.В. Березкина, В.В. Якименко, М.Г. Малькова // Природноочаговые болезни человека. Омск, 2001. - С.123-127.

8. Бондарев, В.А. Характеристика современного состояния природных очагов туляремии в правобережье Астраханской области / В.А. Бондарев //

9. Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. Астрахань, 2001. - С. 94-96.

10. Водопьянов, А.С. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholerae / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, М.Б. Мишанькин, И.Ю. Сучков и др.// Биотехнология. 2001. - № 6. -С. 85-88.

11. Воробьев, А. А. Оценка вероятности использования биоагентов в качестве биологического оружия / А.А. Воробьев // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. - № 6. - С. 54-56.

12. Горбатов, Н.А. Новый очаг туляремии в Южном Приморье / Н.А. Горбатов, А.Я. Жиров, М.М. Дружинин // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы профилактики туляремии». -М, 1991. С. 41-42.

13. Жданов, В.М. Эволюция возбудителей инфекционных болезней / В.М. Жданов, Д.К. Львов // М.: Медицина, 1984. - С. 127-132.

14. Ильина, Е.И. Актуальные аспекты типирования микробов и вирусов / Е.И. Ильина // Генодиагностика инфекционных болезней. Сб. трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции. М., 2004. - Т.2. - С. 3233.

15. Карцев, А.Д. Цикличность заболеваемости некоторыми природно-очаговыми инфекциями в Российской Федерации / А.Д. Карцев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002. - № 1. - С. 23-27.

16. Кирьякова, JI.C. Холера как внутрибольничная инфекция / JI.C. Кирья-кова, А.Б. Хайтович // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. - № 5. - С. 48-50.

17. Козлов, Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии/ Ю.А. Козлов // М.: Медгиз, 1950. - 100 с.

18. Кондрик, Е.К. Аналитическое обоснование концепции биологической безопасности / Е.К. Кондрик, В.В. Волков, Л.И. Кавызина М., 2003. - 64 с.

19. Кормилицина, М.И. Характеристика природного аттенуированного изолята Francisella tularensis / М.И. Кормилицина, И.С. Мещерякова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. - №. 2. — С. 36.

20. Куница, Т.Н. Заболеваемость туляремией в Казахстане / Т.Н. Куница, Т.В. Мека-Меченко, Л.Ю. Лухнова // Проблемы особо опасных инфекций. -Саратов, 2001. № 1(81). - С. 52-55.

21. Лебедев, В.В. Геоинформационное пространство России / В.В. Лебедев // Вестник Российск. Акад. Наук. 2005. - Т. 75. - № 3. - С. 195-204.

22. Львов, Д.К. Проблема нерегистрируемых и непредсказуемых инфекций / Д.К. Львов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - № 5. - С. 104 - 109.

23. Максимов, А.А. Многолетние колебания численности животных, их причины и прогноз / А.А. Максимов // Новосибирск: Наука, 1984. - 251 С.

24. Максимова, Г.П. Эпидемиологический надзор за туляремией в Московской области / Г.П. Максимова, Л.П. Мосолов, B.C. Бельмаков // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы профилактики туляремии». — М, 1991.-С. 106-108.

25. Миллер, А.А. Эпидемиология туляремии зимой 1933-1934 гг. / А.А. Миллер // Изв. Азово-Черноморского НИИ микробиологии и эпидемиологии. Ростов-на-Дону, 1937. - С. 58.

26. Моисеева, А.В. Эпидемическая и эпизоотическая обстановка по туляремии на Украине на современном этапе и очередные задачи / А.В. Моисеева, > Н.Ф. Компанцев // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы профилактики туляремии». М., 1991. - С. 127-129.

27. Настюков, Н.З. Эпизоотии туляремии в Волго-Ахтубинской пойме в 1987-1990 годах / Н.З. Настюков, Н.В. Никулин, В.В. Базаров // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы профилактики туляремии». М., 1991. -С. 135-137.

28. Новикова, В.П. Туляремия и ее профилактика / В.П. Новикова // Астрахань: Волга, 1946. - 40 с.

29. Олсуфьев, Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии / Н.Г. Олсуфьев // М., 1975. - 192 с.

30. Павлович, Н.В. Получение бескапсульных вариантов Francisella tularensis I Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Г.И. Данилевская, В.А. Ходова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1993. - № 2.-С. 77-11.

31. Павлович, Н.В. Прозрачная питательная среда для культивирования Francisella tularensis / Н. В. Павлович, Б.Н. Мишанькин // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - № 2. - С. 133-137.

32. Павлович, Н.В. Сравнительная характеристика биологических свойств штаммов Francisella tularensis, выделенных на территории СССР / Н.В. Павлович, Б.Н. Мишанькин, Н.К. Тынкевич // Антибиотики и химиотерапия. -1991.-№. 10.-С. 23-25.

33. Писарчик, А.В. Простые повторяющиеся последовательности и экспрессия генов. / А.В. Писарчик, Н.А. Картель // Молекулярная биология. -2000. Т. 34. - №. 3. - С. 357-363.

34. Пичурина H.JI. Эпидемиологические аспекты туляремии и совершенствование методов лабораторной диагностики (на примере Ростовской области): Автореферат дисс. на соиск. ученой степени канд. мед. наук / H.JI. Пичурина. Ростов-на-Дону, 1999. - 22 с.

35. Подобедова, Я.С. Природные очаги туляремии на острове Врангеля / Я.С. Подобедова, Т.Н. Демидова, М.И. Кормилицина, И.С. Мещерякова // Медицинская паразитология. — 2006. — № 4. С. 32-34.

36. Подсвирова, В.В. Современное состояние природной очаговости туляремии в республике Калмыкия /В.В. Подсвирова, А.В. Подсвиров, Т.Б. Ка-лаева // Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности. Ставрополь, 2002.-С. 209-211

37. Пузанский, В.Н. Вспышка туляремии в Забайкальском национальном парке осенью 1990 года / В.Н. Пузанский, П.П. Горяинов // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы профилактики туляремии». М., 1991. - С. 156-157.

38. Романова, JI.B. ДНК-зонд для идентификации представителей рода Francisella / JI.B. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.В. Павлович // Биотехнология.- 1992.-№4.-С. 52-55.

39. Романова, JI.B. Полимеразная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Francisella tulalensis с использованием неспецифических праймеров / JI.B. Романова, Б.Н. Мишанькин, И.Ю. Сучков // Биотехнология.- 1993.-№6.-С. 8-9.

40. Романова, JI.B. Полимеразная цепная реакция: детекция и генотипиро-вание представителей рода Francisella / JI.B. Романова, Б.Н. Мишанькин, И.Ю. Сучков // Биотехнология. 1996. - № 3. - С. 27-32.

41. Романова, JI.B. Праймеры для родоспецифического обнаружения Francisella tularensis в полимеразной цепной реакции / JI.B. Романова, Б.Н. . Мишанькин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1995.-№5.-С. 77-80.

42. Романова, JI.B. Солетолерантность и осмотический (солевой) стресс у возбудителя туляремии / JI.B. Романова, Н.Я. Шиманюк, С.Р. Саямов, А.К. Киселева и др. // Биотехнология. 2004. - № 6. - С. 27-33.

43. Романова, JI.B. Francisells tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики: Автореферат дисс. на соиск. ученой степени доктора биол. наук / JI.B. Романова. Ростов-на-Дону, 2008. - 28 С.

44. Романова, JI.B. Некультивируемые формы Francisella tulalensis / JI.B. Романова, Б.Н Мишанькин., H.JI. Пичурина, С.О. Водопьянов и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2000. № 2. — С. 11-15.

45. Сельков, Ю.А. Туляремия в Коми ССР / Ю.А. Сельков // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы профилактики туляремии». — М., 1991. -С. 167-168.

46. Сосницкий, В.И. Туляремия на севере Европейской части России / В.И. Сосницкий, Р.В. Бузинов // ЗНиСО. 2004. - № 6. - С. 26-31.

47. Спирин, А.С. Современная наука и биологическая безопасность / А.С. Спирин //Вестник РАН. 1997. - № 7. - С. 579-601.

48. Тихенко, Н.И. Заболевания людей туляремией в природном очаге степного типа в Ставропольском крае / Н.И. Тихенко, Б.И. Левченко, А.Ф. Брюханов // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. - № 2. - С. 1516.

49. Тихенко, Н.И. Природный очаг туляремии на Ставрополье и сопутствующие инфекции / Н.И. Тихенко, Б.И. Левченко, А.Ф. Брюханов // Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности. — Ставрополь, 2002. С. 278-280

50. Устин-Петрова, Т.Ф. К эпидемиологии туляремии в природных очагах Краснодарского края. / Т.Ф. Устин-Петрова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1964. - № 4. - С. 117-122

51. Черкасский, Б.Л. Руководство по общей эпидемиологии / Б.Л. Черкасский // М.: Медицина, 2001. - С. 224-228.

52. Шагинян, И.А. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций / И.А. Шагинян, М.М. Першина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. - № 4. - С. 54-79.

53. Шагинян, И.А. Генетическое типирование штаммов рода Francisella с помощью универсальных зондов / И.А. Шагинян, Л.В. Комиссарова, Г.И. Алешкин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1997.- №6. -С. 76-81.

54. Шагинян, И.А. Геномный полиморфизм в решении фундаментальных и прикладных проблем микробиологии и эпидемиологии / И.А. Шагинян // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. - № 3. - С. 21- 24.

55. Шагинян, И.А. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций / И.А. Шагинян, А. Л. Гинцбург // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1991. - № 12. - С. 3-9.

56. Шагинян, И.А. Молекулярно-генетические технологии в изучении эволюции возбудителей инфекционных заболеваний / И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург // «Генодиагностика инфекционных болезней», М., 2004. - Том 2. -С. 145-149.

57. Шагинян, И.А. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов / И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург // Генетика. 1995. - № 5. - С. 600610.

58. Ягодинский, В.Н. Динамика эпидемического процесса / В.Н. Ягодин-ский // М.: Медицина, 1977. - 240 с.

59. Abd, H. Survival and growth of Francisella tularensis in Acanthamoeba castellanii / H. Abd, T. Johansson, I. Golovliov, G. Sandstrom et al. // Appl. Envir. Microbiol. 2003. - Vol. 69, N 1. - P. 600 - 606.

60. Adair, D.M. Diversity in variable number tandem repeat from Yersinia res-tis / D.M. Adair, P.I. Worsham, K.K. Hill // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, N 4.-P. 1516-1519.

61. Akopyanz, N. DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylory detected by PCR-based RAPD fingerprinting / N. Akopyanz, N.O. Bukanov, T.U. Westblom, S. Kresovich et al. // Nucleic Acids Res. 1992. - Vol. 20, N 19. - P. 5137-5142.

62. Anonymous. ГИС для борьбы с биотерроризмом / Anonymous // ArcRe-view. 2003. - N 3. - С. 9- 10.

63. Appuhamy, S. Genomic fingerprinting of Haemophilus somnus by a combination of PCR methods / S. Appuhamy, R. Parton, J.G. Coote, H.A. Gibbs // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, N 1. - P. 288-291.

64. Austin, B. Identification and typing Vibrio anguillarum: a comparison of methods./ B. Austin, M. Alsina , D.A. Austin, A.R. Blanch et al. // Syst. Appl. Microbiol. 1995. -Vol.18. - P. 285 - 302.

65. Barns, S.M. Detection of diverse new Francisella like bacteria in environment samples / S.M. Barns, C.C. Grow, R.T. Okinaka, P. Keim et al. // Appl. Environm. Microbiol. - 2005. - Vol. 71, N 9. - P. 5494-5500.

66. Beckstrom-Sternberg, S.M. Complete genomic characterization of a pathogenic All strain of Francisella tularensis subspecies tularensis / S.M. Beckstrom-Sternberg, R.K. Auerbach, S. Godbole, J.V. Pearson et al. // PLoS ONE. 2007. -Vol.2, N9.-P. 947.

67. Belkum van, A. Role of genomic typing in taxonomy evolutionary genetics and microbial epidemiology / A. van Belkum, M. Struelens, A. Visser, H. Verbrugh et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 14, N 3. - P. 547-560.

68. Belkum, van A. Short-sequence DNA repeats in prokaryotic genomes / A. van Belkum, S. Scherer, L. van Alphen, H. Verbrugh // J. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62, N 2. - P. 275 -293.

69. Belkum, van A. Typing of Legionella pneumophila strains by polymerase chain reaction-mediated DNA fingerprinting / A. van Belkum, M. Struelens, W. Quint // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31, N 8. - P. 2198-2200.

70. Berdal, B. P. Field investigators of tularemia in Norway / B.P. Berdal, R. Mehl, N.K. Meidell, A. Lorentzen-Styr et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol.1996.-Vol. 13, N3.-P. 191-195.

71. Bossi, P. Bioterrorosm: management of major biological agents. / P. Bossi, D. Garin, A. Guihot, F. Gay // Cell Mol. Life Sci. 2006. - Vol. 63. - P. 2196 -2212.

72. Burch, C. L. Antigenic variation in Neisseria gonorrhoeae: production of multuple polysaccharides. / C.L. Burch, R.J. Danaher, D.C. Stein // J. Bacteriol.1997. Vol. 179, N 2. - P. 982-986.

73. Caetano-Anolles, G. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers / G. Caetano-Anolles, В J. Bassam, P.M. Gresshoff // BioTechnology. 1991. - Vol. 9, N 6. - P. 553-557.

74. Carvalho, de I.L. Francisella tularensis, Portugal. / I.L. de Carvalho, R. Es-cudero, C. Garcia-Amil, H. Falcao et al. // Emerg. Infect. Dis. 2007. - Vol.13, N 4. - P. 666-667.

75. Caskey, C.T. Triplet repeat mutations in human disease. / C.T. Caskey, A. Pizzuti, Y. Fu // Science. 1992. - Vol. 256, N 5. - P. 784 -789.

76. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyatate-phenol-chlorophorm extraction / R. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. - Vol. 162, N 1.- P.156 - 159.

77. Clarridge, J. E. Characterization of two unusual clinically significant Francisella strains / J.E. Clarridge, TJ. Raich, A. Sjostedt, G. Sandstrom et al. // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34, N 8. - P. 1995-2000.

78. Dahouk, A.S. Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis / A.S. Dahouk, P.L. Fleche, K. Nockler, I. Jacques et al. // J. Microbiol. Methods. -2007. Vol. 69, N 1. - P. 137-145.

79. Davidson, F. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis С vims using RFLP of sequences amplified from the 5' non-coding region / F. Davidson, P. Simmonds, J.C. Ferguson, L.D. Jarvis // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76, N 5. - P. 1197-1204.

80. Eisen, R.J. Residence-linked human plague in New Mexico: a habitat- suitability model / R.J. Eisen, P. J.Reynolds, P. Ettestad, T. Brown et al.// Am. J. Trop. Med. Hyg.-2007.-Vol. 77, N 1.-P.121 -125.

81. Ellis, J. Tularemia / J. Ellis, C.F. Oyston, M.Green, R.W. Titball // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15, N 4. - P. 631-646.

82. Farlow, J.K. Francisella tularensis in the United States / J.K. Farlow, D.M. Wagner, M. Dukerich, M. Stanley et al. // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11. - P. 1835-1841.

83. Farlow, J. K. Francisella tularensis strain typing using multiple-locus, variable number tandem repeat analysis / J.K. Farlow, L. Smith, J. Wong, M. Abrams et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 9. - P. 3186-3192.

84. Fey, P.D. Molecular analysis of Francisella tularensis subspecies tularensis and holarctica / P.D. Fey, M.M. Dempsey, M.E. Olson, M.S. Chrustowski et al. // Am. J. Clin. Pathol. 2007 - Vol. 128. - N. 6. - P. 926-935.

85. Fleche, P. L. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus antracis / P.L. Fleche, Y. Hauck, L. Onteniente, A. Prieur et al. // BMC Microbiology. 2001. - N 3. - P. 1-2.

86. Fleming, G. Fuzzy expert systems and GIS for cholera health risk prediction in southern Africa // G. Fleming, M. van der Merve, G. McFerren // Environ. Modelling & Software. 2007. - Vol. 22. - P. 442 - 448.

87. Forsman, M. Identification of Francisella species and discrimination of type A and type В strains of F. tularensis by 16S rRNA analysis / M. Forsman, G. Sandstrom, B. Jaurin // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol. 56, N 4. - P. 949955.

88. Fouet K.L. Diversity among French Bacillus anthracis isolates / A. Fouet, K.L. Smith, C. Keys, J. Vaissaire et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40, N 12. - P. 4732-4734.

89. Frenay, H.M.E. Molecular typing of methicillin resistant Staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphisms. / H.M.E. Frenay, A.E. Bun-schoten, L.M. Schouls // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. . 1996. - Vol. 15, N l.-P. 60-64.

90. Frothingham, R. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats / R. Frothingham, W.A. Meeker-O'Connell // Microbiology. 1998. - Vol. 144, N 5. - P. 1189-1196.

91. Fujita, O. Development of a real-time PCR assay for detection and quanti-fiation of Francisella tularensis / O. Fujita, M. Tatsumi, K. Tanabayashi, A. Ya-mada // Jpn. Infect. Dis. 2006. - Vol. 59. - P. 46 - 51.

92. Gilson E. A family of interspersed of extragenic palindromic DNA sequences in E. coli / E. Gilson, J.M. Clement, D. Brutlag, D. Hofnung // EMBO J. -1984.-Vol. 3.-P. 1417-1421.

93. Greub, G. Microorganisms resistant to free-living amaebae / G. Greub, D. Raoult // Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17, N 2. - P. 413-433.

94. Gurcan, S. Tularemia re-emerging in European part of Turkey after 60 years / S. Gurcan, M. Eskiocak, G. Varol // Jpn. J. Infect. Dis. 2006. - Vol. 59, N 12. - P. 391 -393.

95. Gurycova, D. First isolation of Francisella tularensis subsp. tularensis in Europe / D. Gurycova // Eur. J. Epidemiol. 1998. - Vol. 14, N 12. - P. 797-802.

96. Haber, J. E. Minisatellite origins in yeast and humans / J.E. Haber, E.J. Louis // Genomics. 1998. - Vol. 48, N 2. - P. 132-135.

97. Hauge, X.Y.A study of the origin of'shadow bands' seen when typing dinu-cleotide repeat polymorphisms by the PCR. / X.Y. Hauge, M. Litt // Hum. Mol. Genet. 1993. - Vol. 2, N 4. - P. 411 - 415.

98. Hoffmaster, A.R. Molecular subtyping of Bacillus anthracis and the 2001 bioteiTorism-associated anthrax outbreak, United States / A.R. Hoffmaster, C.C. Fitzgerald, E. Ribot, L.W. Mayer et al. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 1111-1116.

99. Hulton, C.S.J. ERIC sequence: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria /

100. C.S.J. Hulton, C.F. Higgins, P.M. Sharp // Mol. Microbiol. 1991. - Vol. 5, N 4. -P. 825-834.

101. Kaysser, P. Re-emergence of tularemia in Germany: Presence of Francisella tularensis in different rodent species in endemic areas / P. Kaysser, E. Sei-bold, K. Matz-Renzing, M. Pfeffer et al. // BMC Infect. Dis. 2008. - Vol. 8. - P. 157

102. Keim, P. Dissection of Bacillus anthracis in to distinct type using MLVA / P. Keim, G. Zinser, D. Solomon // 4 Internat. Conf. on Anthrax. USA, 2001. - P. 16.

103. Keim, P. Molecular investigation of the Aum shinrikyo anthrax release in Kameido, Japan / P. Keim, K. L. Smith, C. Keys, H. Takahashi et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 12. - P. 4566-4567.

104. Kim, G.P. Prognostic role of microsatellite instability in colon cancer / G.P. Kim, L. Colangelo, C. Allegra et al. // Proc. Am. Soc Clin. Oncol. 2001. - Vol. 20.-P 1666.

105. Kimura, B. Multiple-locus variable-number of tandem-repeats analysis distinguishes Vibrio parahaemolyticus pandemic 03:K6 strains / B. Kimura, Y. Se-kine, H. Takahashi, Y. Tanaka et al. // J. Microbiol. Methods. 2008. - Vol 72, N 3. -P. 313-320.

106. Kitron, U. Geographic information system in malaria surveillance: mosquito breeding and imported cases in Israel, 1992 / U. Kitron, H. Pener, C. Costin, L. Orshan et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. - Vol. 50, N 5. - P. 550-556.

107. Klevytska, A. M. Identification and characterization of variable number tandem repeats in the Yersinia restis genome / A.M. Klevytska, L.B. Price, J.M. Schupp, P.L. Worsham et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 9. - P. 31793185.

108. Kugeler, K.J. Real-time PCR for Francisella tularensis types A and В / K.J. Kugeler, R. Pappert, Y. Zhou, J.M. Peterson // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12.-P. 1799- 1801.

109. Kwon, D.H. Rep-PCR fragments as biomarkers for differentiating gastro-duodenal disease- specific Helicobacter pylori / D.H. Kwon, F.A.K. El-Zaatari, J.S. Woo, C.I. Perng et al. // Dig. Dis. Sci. 1998. - Vol. 43.- P. 980 - 987.

110. Lai, P. C. Understanding the spatial clustering of severe acute respiratory syndrome (SARS) in Hong Kong / P.C. Lai, C.M. Wong, A.J. Hedley, S.V. Lo et al. //Environ. Health Perspect. 2004. - Vol. 112, N 11. - P. 1550-1556.

111. Laroucau, K. High resolution typing of Chlamydophila psittaci by multilo-cus VNTR analysis (MLVA) / K. Laroucau, S. Thierry, F. Vorimore, K. Blanco et al.//Infect. Genet. Evol. 2008. - Vol. 8, N 2.-P. 171-181.

112. Larsson, P. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia / P. Larsson, P.C. Oyston, P. Chain, M.C. Chu et al. // Nat. Genet. 2005. - Vol. 37, N 2. - P. 153-159.

113. Le Fleche, P. High resolution, on-line identification of strains from the Mycobacterium tuberculosis complex based on tandem repeat typing / P. Le Fleche, M. Fabre, F. Denoeud, J.L. Koeck et al. // BMC Microbiol. 2002. - Vol. 2:11.

114. Leach, F.S. Mutations of a MutS homolog in hereditaiy nonpolyposis colorectal cancer. / F.S. Leach, N.C. Nicolaides, N. Papadopoulos // Cell. 1993. - Vol. 75,N 12.-P. 1215-1225.

115. Lehmann, P.F. Protein and enzyme electrophoresis profiles of selected Candida species / P.F. Lehmann, C. Hsiao, I.F. Salkin // J. Clin. Microbiol. 1989. -Vol. 27, N3.-P. 400-404.

116. Li, H. Investigation of putative multisubtype hepatitis С virus infections in vivo by heteroduplex mobility analysis of core/envelope subgenomes/ H. Li, L.V. Thomassen, A. Majid, B.J. McMahon et al. // J. Virol. 2008. - Vol. 82, N 15. -P.7524 - 7532.

117. Li, Y.C. Microsatellites within genes: structure, function and evolution / Y.C. Li, A.B. Korol, T. Fahima, E. Nevo // Mol. Biol. Evol. 2004. - Vol.21, N 6. -P. 991-1007.

118. Li, Y.C. Microsatellites: Genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: review / Y.C. Li // Mol. Ecol. 2002. - N 11. - P. 2453 - 2465.

119. Lista, F. Genotyping of Bacillus anthracis strain based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis / F. Lista, G. Faggioni, S. Valjevac, A. Ciammaruconi et al. // BMC Microbiology. 2006. -Vol.6: 33

120. Liu, L. GAA trinucleotide repeat region regulates M9/pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum / L. Liu, K. Dybvig, V.S. Panangala, V.L. van Santen et al Л Infection and Immunity. 2000. - Vol. 68. - P. 271 - 276.

121. Marinov, K.T. Characterization and genotyping of strains of Francisella tularensis isolated in Bulgaria / K.T. Marinov, E.D. Georgieva, I.N. Ivanov, T.V. Kantardjiev // J. Med. Microbiol. 2009. - N 1. - P. 82 - 85.

122. Martin, B. A highly conserved repeated DNA element located in the chromosome of Streptococcus pneumoniae / B. Martin, O. Humbert, M. Camara, E. Guenzi et al. // Nucleic Acids Res. 1992. - Vol. 20, N 7. - P. 3479-3483.

123. McAvin, J.C. Identification of Francisella tularensis using real-time fluorescence polymerase chain reaction / J.C. McAvin, M.M. Morton, R.M. Roudabush, D.H. Atchley et al. // Mil. Med. 2004,- Vol. 169,N4.- P.330 - 333.

124. McClelland, M. Arbitrarily primed PCR fingerprints resolved on SSCP gels / M. McClelland, H. Arensdorf, R. Cheng, J. Welsh // Nucleic Acids Res. 1994. -Vol. 22,N9.-P. 1770-1771.

125. Metzgar, D. Selection against frameshift mutation limits microsatellite expansion in coding DNA / D. Metzgar, G. Bytof, C. Wills // Genome Res. 2000. -Vol. 10.-P.72 -80.

126. Morgante, M. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetive DNA in plants / M. Morgante, M. Hanafey, W. Powell // Nat. Genet. 2002. - Vol. 30.-P. 194 -200.

127. Moxon, E.R. Adaptive evolution of highly mutable loci in pathogenic bacteria / E.R. Moxon, P.B. Rainey, M.A. Nowak, R.E. Lenski // Curr. Biol. 1994. -Vol. 4.-P. 24-33.

128. Molins-Schneekloth, C.R. Genomic markers for differentiation of Francisella tularensis subsp. tularensis A.I and A.II strains / C.R. Molins-Schneekloth, J.T. Belisle, J.M. Peterson // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - Vol. 74, N 1. - P. 336-341.

129. Nakamura, Y. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping / Y. Nakamura, M. Leppert, P. O'Connell, R.H. Wolff // Science. 1987. - Vol. 27, N 5. - P. 1616-1622.

130. Noller, A. C. Multilocus variable number tandem repeat analysis distinguishes outbreak and sporadic Escherihia coli 0157:H7 isolates / A.C. Noller, M.C. McEllistrem, A.G.F. Pacheco // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, N 12. -P. 5389-5397.

131. Olive, D. M. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms / D. M. Olive, P. Bean // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N6.-P. 1661-1669.

132. Orti', G. Phylogenetic assessment of length variation at a microsatellite locus. / G. Orti, D. E. Pearse, J. C. Avise // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997. Vol. 94.-P. 10745- 10749.

133. Parker, R.R. Contamination of natural waters and mud with Pasteurella tularensis / Parker R.R., Steinhaus E.A., Kohls G.M., Jellison W.L. // Natl. Inst. Health Bull.-1951.-V. 193.-P. 7-33.

134. Pearson, T. VNTR analysis of selected outbreaks of Burkholderia pseu-domallei in Australia / T. Pearson, J.M. U'Ren, J.M. Schupp, G.J. Allan et al. I I Infect. Genet. Evol. 2007. - Vol 7, N.4. - P. 416-423.

135. Pedersen, S. Tularemia acquired in Danmark by an eight-year-old child / S. Pedersen, S. Bocher, P. Schiellerup, K. Andersen et al. // Ugeskr. Laeger. 2005. -Vol. 167,N7.-P. 773-774.

136. Petersen, J. M. Tularemia: emergence/re-emergence / J. M. Petersen, M. E. Schriefer // Vet. Res. 2005. - Vol. 36, N 3. - P. 455 -467.

137. Petrosino, J.F. Chromosome rearrangement and diversification of Francisella tularensis revealed by the type В (OSU18) genome sequence / J.F. Petrosino, Q. Xiang, S.E. Karpathy, H. Jiang et al. // J. Bacteriol. 2006. - Vol.188, N 19.-P. 6977-6985.

138. Pikula, J. Ecological conditions of natural foci of tularemia in the Czech Republic / T.F. Pikula, M. Beklova, Z. Holesovska, J. Pikulova // Eur. J. Epidemiol.- 2003. Vol. 18, N 11. - P. 1091-1095.

139. Rinaldi, L. Canine faecal contamination and parasitic risk in the city of Naples (southern Italy) / L. Rinaldi, A. Biggeri, S. Carbone, V. Musella et al. // BMC Veterinary Res. 2006. - Vol. 2.- p. 29 doi: 10.1186/1746-6148/2/29

140. Roche, R.D. Phentyping variation in H. influenzae: the interrelationship of colony opacity, capsule and lipopolysaccharide. / R.D. Roche, E.R. Moxon // Mi-crob. Pathog. 1995. - Vol. 18, N 2. - P. 129 - 140.

141. Rolfhamre, P. Implementing a public web based GIS service for feedback of surveillance data on communicable diseases in Sweden / P. Rolfhamre, K. Grabowska, K. Ekdahl // BMC Infect. Dis. 2004. - Vol. 4. - P. 17.

142. Rotz, L.D. Public health assessment of potential biological terrorism agents / L.D. Rotz, A.S. Khan, S.R. Lillibridge, S.M. Ostroff et al. // Emerg. Infect. Dis. -2002. Vol. 8. - P. 225-230.

143. Sellek, R. Recovery of Francisells tularensis from soil samples by filtration and detection by real-time PCR and cELISA / R. Sellek, O. Jimenez, C. Aizpurua, B. Fernandez-Frutoz et al. // J. Environ. Monit. 2008. - Vol. 10, N 3. - P. 362369.

144. Schlotterer, C. Genome evolution: are microsatellites really simple sequences? / C. Schlotterer. // Curr. Biol. 1998. - Vol.8, N 4. - P. R132-R134.

145. Schlotterer, С. Slippage synthesis of simple sequence DNA. / C. Schlot-terer, D. Tautz. //Nucleic Acids Res. 1992. - Vol.20, N 2. - P.211-215.

146. Sharpies, G. J. A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes / G.J. Sharpies, R.G. Lloyd //Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18, N 22. - P. 6503-6508.

147. Smith, K.L. Bacillus anthracis diversity in Kruger National Park / K.L. Smith, V. DeVos, H. Biyden // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, N 10. - P. 3780-3784.

148. Sorokin, V.M. Chemical composition and structure of Francisella tularensis lipopolysaccharide / V.M. Sorokin, L.A. Prozorova, N.V. Pavlovich // . 2000. The 3rd Intemat. Conf. on Tularemia .Umea, Sweden. - P. 34.

149. Stern, M. Repetitive extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome / M. Stern, G.F.I. Ames, N.H. Smith, E.C. Robinson et al. // Cell. 1984. - Vol.37. - P. 1015 - 1026.

150. Strand, M. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair / M. Strand, T.A. Prolla, R.M. Liskay, T.D. Petes // Nature. 1993. - Vol. 365. - P. 274 -276.

151. Staples, J. E. Epidemiologic and molecular analysis of human tularemia. United States, 1964 -2004 / J.E. Staples, K.A. Kubota, L.G. Chalcraft, P.S. Mead et al.// Emerg. Infect Dis. 2006. - Vol. 12. - P.l 113 -1118.

152. Struelens, M. J. Consensus guidelines for appropriate use and evaluation of microbial epidemiological typing system / M. J. Struelens, A. Bauernfeind, A. van Belkum // Clin. Microbiol. Infect. 1996. - Vol. 2, N 8. - P. 2-11.

153. Svensson, K. Evolution of subspecies of Francisella tularensis / K. Swens-son, P. Larsson, D. Johansson, M. Bystrom et al. // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, N 11. - P. 3903 -3908.

154. Tarnvik, A. Tularemia in Europe : an epidemiological overview / A. Tarn-vik, H. Priebe, R. Grunow // Scand. J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 36. 5. - P. 350-355.

155. Templeton, A.R. Recombinational and mutational hot spot within the human lipoprotein lipase gene/ A.R. Templeton, A.G. Clark, K.M. Weiss, D.A. Vick-erson et al. // Amer. J. Human Genet. 2000.- Vol. 66.- P. 69-83.

156. Thomas, R. Discrimination of human pathogenic subspecies of Francisella tularensis by using restriction fragment length polymorphism / R. Thomas, A. Johansson, B. Neeson // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, N 1. - P. 50-57.

157. Thompson, F.L. Biodiversity of Vibrio / F.L. Thompson, T. Iida, J. Swings // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. - Vol. 68, N 3.- P.403 - 431.

158. Titball, R.W. Will the enigma of Francisella tularensis virulence soon be solved? / R.W. Titball, A. Johansson, M. Forsman // Trends in Microbiol. 2003. -Vol. 11,N3.-P. 118-123.

159. Troesch, A. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays / A. Troesch, H. Nguyen, C.G. Miyada, S. Desvarenne et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 1. - P. 49-55.

160. Tyagi, S. Molecular beacon: probes that fluoresce upon hybridization / S. Tyagi, F.R. Kramer// Nat. Biotechnol. 1996. - N 14, 3. - P. 303 - 308.

161. Valenciano, M. Strengthening early warning function of surveillance in the Republic of Serbia: lessons learned after a year of implementation / M. Valenciano, I. Bergeri, D. Jankovic, N. Milic et al. // Euro. Surveill. 2004. - Vol. 9, N 5. - P. 24-26.

162. Varma-Bazil, M. Molecular beacons for multiplex detection of four bacterial bioterrorism agents / M. Varma-Bazil, H. El-Hajj, S.A. Man-as, M.H. Hazbon et al. // Clin. Chem. 2004. - Vol. 50. - P. 1060 - 1062.

163. Versalovic, J. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes / J. Versalovic, T. Koeuth, J.R. Lupski //Nucleic Acids Res. 1991. - Vol. 19, N 24. - P. 6823-6831.

164. Vodopyanov, A.S. Variable number tandem repeats revealed by computer analysis of the Vibrio cholerae genome / A.S. Vodopyanov, S.O. Vodopyanov, M. B. Mishankin, I.Y. Suchkov et al. // Russian J. Biotechnol. 2001. - Vol. 1, N 4. -P. 281-283.

165. Vogler, A.J. Effect of repeat copy number on variable number tandem repeat mutations in Escherichia coli 0157:H7. / A.J. Vogler, C. Keys, Y. Nemoto, R.E. Colman et al. // J. Bacteriol. 2006. - Vol.188, N 12. - P.4253-4263.

166. Vogler, A.J. An optimised, multiplexed multi-locus variable-number tandem repeat analysis system for genotyping Francisella tularensis / A.J. Vogel, D. Birdsell, D.M. Wagner, P.Keim // Letters Appl. Microbiol.- 2009. Vol. 148. - P. 140-144.

167. Weiser, J.N. Characterization of repetitive sequences controlling phase variation of Hemophilus influenzae lipopolysacharide. / J.N. Weiser, D.J. Maskell, PJ. Butler // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172, N 6. - P. 3304 - 3309.

168. Weiser, J. N. The molecular mechanism of phase variation of H. influenzae lipopolysaccharide. / J.N. Weiser, J.M. Love, E.R. Moxon // Cell. 1989. - Vol. 59, N11.-P. 657-665.

169. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18, N 24. - P. 72137218.

170. Whipp, M.J. Characterization of a novicida-like subspecies of Francisella tularensis isolated in Australia / M.J. Whipp, J.M. Davies, G. Lum, В J. de, Y. Zhou et al. // J. Med. Microbiol. 2003. - Vol. 52, N 52. - P. 839-842.

171. Whittaker, P. Evaluation of use of fatty acid profiles to identify Francisella tularensis / P. Whittaker, J.B. Day, S.K. Curtis, F.S. Fry // J. AOAC Int. 2007. -Vol. 90, N 2. - P. 465 -469.

172. Williams, J. G. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G. Williams, A.R. Kubelik, K.R. Livak // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18, N 22. - P. 6531-6535.

173. Willke, A. An outbreak of oropharyngeal tularaemia linked to natural spring water / A. Willke, M. Meric, R. Granow, M. Sayan et al. // J. Med. Microbiol. -2009. N 1. - P. 112- 116.

174. Yang, Y. DNA gyrase binds to the family of prokaryotic repetitive ex-tragenic palindromic sequences / Y. Yang, G.F.I. Ames // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 8850 - 8854.

175. Yother, J. Structural properties and evolutionary relationship of PspA, of surface protein of Streptococcus pneumoniae, as revealed by sequence analysis. / J. Yother, D.E. Briles // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174, N 2. - P. 601- 609.

176. Zhang, F. Francisella tularensis in rodents, China. / F. Zhang, W. Liu, M.C. Chu, J. He et al. // Emerg. Infect. Dis. 2006. - Vol. 12, N 6. - P. 994 -996.

Информация о работе

Водопьянов, Алексей Сергеевич
кандидата медицинских наук
Ставрополь, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генотипическое разнообразие Francisella tularensis: VNTR- анализ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы