Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя"
ив - 1 1308
На правах рукописи
ТАРАН Александр Владимирович
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА И ДЕТЕКЦИИ ЕГО ВОЗБУДИТЕЛЯ
03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Ставрополь - 2(Щ
Работа выполнена в ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный руководитель: Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
доктор биологических наук Жарникова Ирина Викторовна
доктор медицинских, наук Ляпустина Лариса Вениаминовна
доктор медицинских наук, профессор Пожарская Виктория Олеговна
ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»
Защита диссертации состоится «¿3 » г.
в_часов на заседании регионального диссертационного совета
ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г, Ставрополь, ул. Пушкина д 1, корпус 2, аудитория 506.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.
Автореферат разослан «_»_2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
И.В.Ржепа ковский
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Патогенные лептоспиры распространены практически на всей территории Российской Федерации, урожая здоровью и жизни человека. Ежегодно в России регистрируется в среднем от 1,5 до 2,5 тысяч заболеваний лептоспирозами. Результаты лабораторного исследования являются решающими для подтверждения леп-тоспирозной этиологии заболевания [Онищенко Г.Г., 2001; Онищенко Г.Г., 2007; WHO, 2003; Савченко С.Т. с соавт., 2007]. В диагностике легггоспирозов ведущая роль принадлежит серологическим методам. Общепринятым стандартным тестом при исследовании сывороток крови является реакция микроагглютинации (РМА) [Малахов Ю.В. с соавт., 2001], использование которой связано с необходимостью поддержания на дорогостоящих сывороточных средах большого количества штаммов лептоспир. Учет результатов реакции осуществляется путем микроскопии в темном поле. Эти факторы ограничивают возможность внедрения РМА в широкую практику. С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используется также имму-ноферментный анализ (ИФА) [МУ 3.1.1128-02]. Генетические методы могут осуществляться только в специализированных лабораториях, отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и поэтому широкого практического распространения не получили.
Среди способов диагностики инфекционных заболеваний особое место занимают иммуносорбционные, в основе которых лежит принцип аффинности [Егорова Т.А. с соавт., 2006]. Этапом усовершенствования общепринятых методов диагностики является разработка препаратов на основе магноиммуносорбентов (МИС), которые позволяют селективно концентрировать микробы на поверхности сорбента, применять специальные технические средства, упрощающие проведение анализов [Саяпина JI.B. с соавт., 2007].
Стабильно напряженная эпидемиологическая обстановка по лептоспирозу в ЮФО на протяжении последних лет, трудность постановки диагноза, неудовлетворительное состояние лабораторной диагностики послужили основанием для проведения исследований с це-
лью совершенствования диагностических препаратов. Внедрение в схему лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов лептоспироза недорогих, экспрессных, чувствительных и специфичных тест-систем и методов позволит проводить быструю детекцию возбудителя в биологическом и полевом материале, будет способствовать своевременному проведению адекватных противоэпидемических мероприятий.
Цель работы - повышение чувствительности и специфичности методов выявления лептоспир и антител к ним с использованием диагностических тест-систем на основе иммобилизованных препаратов.
Основные задачи исследования:
1. Усовершенствовать лабораторную диагностику лептоспироза путем использования высокоспецифичных сывороток крови, полученных методом иммуносорбции;
2. Разработать методы селективного концентрирования лептоспир на магноиммуносорбентах на основе полифепана, оксида железа с иммобилизованными антителами и технические средства для микробиологического мониторинга объектов внешней среды;
3. Усовершенствовать диагностические тест-системы для ИФА с использованием полученных липосомально-пероксидазных конъю-гатов;
4. Разработать экспресс-методы и системы для выявления лептоспир с использованием суспензионного комплекса на основе алюмосиликата и флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ);
5. Изучить диагностическую ценность разработанных препаратов, технических средств и методов на экспериментальном, полевом и клиническом материале.
Научная новизна работы. Получены специфичные препараты путем проведения иммуносорбции неспецифических антител из иммунных лептоспирозных сывороток с использованием аффинных МИС, что позволило сохранить их первоначальную активность, упростить процесс сорбции. Усовершенствованы методы экспресс-диагностики (ИФА и количественного иммунофлуоресцентного ана-
лиза — КИФА) при выявлении лептоспир с применением разработанных высокочувствительных иммуносорбентных диагностикумов, превосходящих подобные препараты по доступности, экологической чистоте сырья, позволяющих сократить трудовые и материальные затраты при их изготовлении и постановке реакций.
Унифицированы методы исследования биологического материала, проб из объектов внешней среды большого объема (до 103 л), с высокой степенью загрязнения, низкой концентрацией возбудителя с применением разработанных технических средств и методических приемов по сочетанному применению селективного концентрирования лептоспир на МИС с последующим проведением экспрессных методов (ЙФА, КИФА). На установку для микробиологического мониторинга объектов водной среды получен патент РФ на полезную модель.
Осуществлена научная разработка получения липосомальных лептоспирозных иммуноферментных конъюгатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью. Впервые проведена научно-методическая разработка суспензионно-флуоресцентного диагности-кума для выявления лептоспир в экспрессной реакции суспензионной агглютинации (РСА).
Научно-методические разработки сочетанных методов использования МИС с ИФА и КИФА дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции лептоспир в объектах внешней среды и биологическом материале.
Практическая значимость работы. Усовершенствованные ИФА и КИФА с применением полученных лептоспирозных МИС в сочетании с разработанными техническими средствами позволяют выявить лептоспиры в объектах внешней среды, повысить чувствительность метода, сократить время анализа до 3 ч за счёт ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что в конечном итоге обеспечивает своевременное проведение адекватных противоэпидемических мероприятий. Применение разработанных аф-
финных сорбентов с магнитными свойствами обеспечивает эффективную иммуносорбцию неспецифических антител из сыворотки крови для получения высокоспецифичных препаратов.
Разработанные методологические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и лептоспироз-ных иммуноглобулинов позволяют повысить стабильность и в два раза увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.
Предложен метод РСА на стекле с суспензионным диагности-кумом, обладающий экономической эффективностью, экспрессностью и простотой, показано его преимущество перед традиционными методами детекции возбудителя при апробации в лабораторных и полевых условиях.
Материалы научных разработок легли в основу 3 методических документов, утвержденных на учрежденческом уровне внедрения: «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.05 г.); «Лабораторная детекция лептоспироза» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 11 от 30.11.06 г.); «Конструирование липосом различного липидного состава для их направленной доставки в ткани и органы-мишени экспериментальных животных, оценка результатов с помощью радиоизотопного метода по удельной радиоактивности» (протокол Учёного совета СтавНИПЧИ № 4 от 03.05.07 г.).
Утверждена нормативная документация (лабораторный регламент, инструкция по применению) на диагностикум суспензионный для выявления лептоспир в РСА (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №1 от 25.01.07 г.). Материалы диссертации используются на курсах специализации врачей по экспресс-диагностике лептоспироза в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанные научно-методические подходы получения высокоспецифичных иммунных лептоспирозных сывороток для диагностических препаратов с применением аффинных МИС на основе
полифепана и оксида железа обеспечивают сохранение их первоначальной активности, сокращение и упрощение всех этапов сорбции.
2. Селективное концентрирование лептоспир путем применения разработанных магноиммуносорбентных диагностических препаратов, тест-систем и технических средств увеличивает чувствительность методов на 2-3 порядка по сравнению с традиционными ИФА и реакцией иммунофлуоресценции (РИФ).
3. Метод ИФА с липосомально-иммунопероксидазным конъю-гатом позволяет выявлять лептоспиры в концентрации 5х104-1х105 микробных клеток (м.к.)/мл при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Стабильность и срок годности конъюга-та увеличены в 2 раза по сравнению с традиционным иммуноперокси-дазным конъюгатом [Nakane Р.К., Kawaoi А.,1974] за счет иммобилизации на мембране липосом фермента и лептоспирозных иммуноглобулинов.
4. Высокая эффективность обнаружения антигена лептоспир в РСА достигнута при использовании суспензионно-флуоресцентного алюмосиликатного диагностикума. Разработанный диагностикум по чувствительности аналогичен традиционному методу РНГА, но превосходит по простоте изготовления и экспрессности (РСА 1-3 мин, а РНГА (макрометод) - 24 ч).
5. Разработанные диагностические тест-системы могут использоваться в ходе мониторинга объектов внешней среды с целью выявления и изучения циркуляции лептоспир, а также для лабораторной диагностики лептоспироза.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (г. Новосибирск, 2006), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (г. Санкт-Петербург, 2006), на ежегодных научно-практических конференциях в СтавНИПЧИ (20052007), на IX съезде Всероссийского научно-практического общества
эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах - участниках СНГ» (г. Саратов, 2007).
Публикации Основные положения диссертации отражены в 17 опубликованных научных работах, в том числе одна работа - в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников; изложена на 150 страницах компьютерного текста; содержит 16 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 159 отечественных и 76 зарубежных источников.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы и методы исследований. Для получения антигенных комплексов лептоспир использованы штаммы 6 серогрупп: Leptospira Pomona, L. Tarassovi, L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorrhagiae, L. Canicola, L, Hebdomadis, входящие в типовой диагностический набор штаммов для РМА и имеющие наибольшее эпидемиологическое значение. Кроме того, использовали культуру листерий - 7 штаммов, возбудителя псевдотуберкулеза - 2 штамма, кишечной палочки - 2 штамма, возбудителей туляремии и бруцеллеза - по 3 штамма. Леп-тоспиры выращивали на среде Ферворта-Вольфа при (29±1) °С в течение 7-10 суток. В опытах использованы 20 кроликов обоего пола породы «Шиншилла», 30 беспородных белых мышей, 20 морских свинок. Изучены 105 сывороток крови людей, болевших лептоспирозом и контактных. В качестве матриц при производстве сорбентов использовали полифепан - сорбент на основе древесного лигнина, оксид железа, алюмосиликат. Водорастворимые антигены лептоспир получали по методу В.В. Бинатовой [1999]. Иммунизировали кроликов по схеме И.С. Тюменцевой [1994]. Иммуноглобулины выделяли каприловой
кислотой [Steibuch G., Andran R., 1969]. Качество полученных водорастворимых антигенов и иммунных сывороток оценивали в реакции иммунодиффузии в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по О. Ouchterlony [1949]. Титр специфических антител в сыворотках определяли в НРИФ по Т.Н. Weller, А.Н. Coons [1954]. Конъюгацию иммуноглобулинов с ФИГГЦ (Sigma)» проводили по X. Шторц [Stortz X., 1987]. Окраску препаратов осуществляли по А.Н. Coons, М.Н. Kaplan [1950]. Формирование липосом контролировали на электронном микроскопе Hol (Япония) JEM-100SX. Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.К. Nakane, A. Kawaoi [1974] в модификации Е.А. Ткаченко с соавт. [1982]. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике М. Clark, A. Adams [1977] в «сэндвич»-варианте ИФА. Количественное определение белка проводили при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 [Практическая химия белка, 1989]. Очистку конъюгатов осуществляли методом восходящей хроматографии на бумаге [Носков Ф.С., 1985]. Микроструктуру поверхности магносорбентов (MC) оценивали по методу Д. Фрайфелдера [1980]; удельную поверхность MC - по методу A.A. Клячко-Гурвича [1961]; объем и радиус пор - по методу Н.В. Кельцева [1984]. Лиофилизацию проводили в камере LZ-9c (Чехословакия).
Для подтверждения воспроизводимости и достоверности результатов исследований использовали статистические методы [Там-бовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д., Уэст Д., 1979; программа MS Office Excel ХР].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Усовершенствование экспресс-диагностики лептоспирозной инфекции путем разработки иммобилизованных препаратов с магнитными свойствами и конструирования технических средств.
Условием получения качественных препаратов для выявления лептоспир является наличие высокоспецифичных сывороток, так как специфичность иммунологических реакций находится в прямой зави-
симости от специфичности антител, используемых в препаратах.
Для получения иммобилизованных препаратов использованы носители на основе органической (полифепан) и неорганической (оксид железа) природы. Полифепан из древесного лигнина обладает высокой адсорбционной активностью и содержит до 20 % целлюлозы [Машковский М.Д., 2006]. Благодаря оксиду железа образуется жёсткий остов, повышается микробиологическая устойчивость, механическая прочность, ускоряются и упрощаются этапы исследований. Для придания матрице, состоящей из полифепана и оксида железа, достаточно высокой связывающей способности проведено активирование её поверхности. На первой стадии сорбент окисляли перйодатом натрия до появления альдегидных групп, затем белок соединяли с активированной матрицей и, наконец, для придания большей устойчивости связь между белком и носителем восстанавливали боргидридом натрия. Структуру матрицы и концентрацию иммобилизованного ли-ганда подбирали таким образом, чтобы исключить внешние и внутренние диффузионные затруднения и стерические препятствия.
Наиболее оптимальные параметры в модельной системе обнаружены при использовании соотношения оксида железа и полифепана 3:1, времени гелеобразования при синтезе сорбентов -2 ч, активирования носителя -2 ч.
Контроль специфичности лептоспирозных сывороток на гетеро-логичных штаммах и штаммах-сапрофитах установил наличие перекрёстных реакций с Ь. вг/1еха серогруппы Бетагаща, штамм Рмос I. Из бакмассы данной культуры выделяли водорастворимый антиген и использовали в качестве лиганда при получении аффинных сорбентов. Для иммобилизации водорастворимого антигена к 0,2 мл 10 % взвеси активированных МС приливали 1 мл антигена с концентрацией 2 мг/мл, инкубировали 2 ч при температуре (22±4) °С.
Смесь иммунной сыворотки с МС инкубировали при (22±4) °С в течение 14-16 ч, затем, используя постоянный магнит для фиксации МИС, сыворотку сливали. Сорбент регенерировали 3 М раствором калия роданистого и отмывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером
(ФСБ) рН (7,2±0,1). МС после процедур регенерации можно использовать до 10 раз. Магнитные свойства иммуносорбента позволили упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле, снизить титр неспецифических реакций за счет удаления гетерологичных антител и сохранить первоначальную активность нативных сывороток. Полученные сыворотки использовали при конструировании диагностических препаратов.
Титры специфических антител, определяемые в ИФА в сорбированных иммунных сыворотках, представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Результаты контроля специфичности сыворотки
лептоспирозной в ИФА.
Взвеси культур Чувствительность ИФА
До сорбции После сорбции
C-l С-2 С-3 С-1 С-2 С-3
L. Sejroe 3705, L. Pomona Pomona 1:8000 1:8000 1:16000 1:8000 1:8000 1:16000
L. Canicola Hond Utrecht IV 1:32000 1:16000 1:16000 1:16000 1:16000 1:8000
L, Tarassovi LT 1:8000 1:8000 1:16000 1:8000 1:8000 1:8000
L. biflexa Patoc I (штамм-сапрофит) 1:500 1:250 1:1000 1:50 1:50 1:100
L. biflexa Doberdo RPE (штамм-сапрофит) Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.
L. monocytogenes 1-7 серовар Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.
Y. pseudotuberculosis I-II серовар Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.
E. coli 0-10, 0-11,018 Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.
F. tularensis Miura, 15 НИИЭГ Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.
Br. melitensis REV I, Br. abortus 19 В A, B. wis 61. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр.
При разработке лептоспирозных МИС на поверхность МС иммобилизовали белковый лиганд. Для получения иммуноглобулиново-го МИС использовали иммуноглобулины лептоспирозные (2,0 мл с концентрацией белка 2 мг/мл), выделенные из гипериммунных лептоспирозных адсорбированных сывороток. При получении антигенного МИС - водорастворимые лептоспирозные антигены (2,0 мл с концентрацией белка 2 мг/мл).
При постановке ИФА с МИС апробирован «сэндвич» метод, описанный А.Б.Орловым [1981], установлены оптимальные параметры ИФА, определена чувствительность и специфичность метода. В качестве иммунопероксидазного лептоспирозного конъюгата и антивидового использовали полученные конъюгаты с рабочим титром 1:200-1:800.Чувствительность ИФА с МИС иммуноглобулиновым при выявлении возбудителя лептоспироза была не ниже 1х102 м.к. в пробе при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами бактерий. Титр ИФА с МИС антигенным при выявлении лептоспирозных антител - не ниже 1:25600 в пробе при отсутствии перекрёстных реакций с гетерологичными сыворотками.
В КИФА в качестве МС и антигенов применяли те же материалы, что и в ИФА. Иммуноглобулины флуоресцирующие лептоспирозные и антивидовые получены с рабочим разведением в РИФ 1:16-1:32, концентрацией белка 10 мг/мл, молярным соотношением краситель/белок - 4. На основе магноиммуносорбентных диагностикумов разработаны диагностические тест-системы для детекции возбудителя лептоспироза в экспресс-анализах, отработаны условия проведения анализа.
Для обеспечения надежной системы микробиологического мониторинга лептоспир в объектах внешней среды нами сконструированы модели плавающих установок («Аквадиамаг») для селективного концентрирования возбудителя (рис. 1).
Рис. 1 Установка «Аквадиамаг» для селективного концентрирования лептоспир на МИС.
Предложенные модели обладают преимуществами перед традиционными методами исследования объектов внешней среды [МУ 3.1.1128-02] за счет возможности проведения непрерывного мониторинга и селективного концентрирования возбудителя на МИС, прикрепленных к четырем магнитным ловушкам, позволяющим в дальнейшем исследовать пробы в нескольких реакциях: ПНР, ИФА, КИФА.
При работе с установкой заправляют магнитные ловушки МИС лептоспирозными; помещают на необходимое расстояние от берега исследуемого водоема на 18-24 ч. Ручкой регулировки оборотов центробежного насоса устанавливают необходимый поток воды. Объем воды, пропущенный через установку, в среднем составляет 1-2 тыс. л. МИС снимают с ловушек с помощью цангового магнита для транспортировки проб, отмывают, освобождая МИС от контаминирующей микрофлоры и загрязнений, и исследуют в экспресс-анализах.
Твердые пробы традиционно суспендируют в объеме воды с последующей фильтрацией для отделения твердых частиц без освобождения от контаминирующей микрофлоры. Для селективного концентрирования лептоспир нами сконструирована система, состоящая из стеклянных, силиконовых трубок и постоянного магнита. Пробу пропускали через МИС в магнитном поле для концентрации антигена на
МИС за счёт реакции антиген-антитело. Извлекали МИС и помещали во флакон, промывали 100 мл 0,9 % раствора хлорида натрия, рН 7,2, обеспечивая отмывание МИС от посторонних примесей, контамини-рующей микрофлоры, и исследовали в экспресс-анализах. В опытах на чистых культурах лептоспир получены положительные результаты в ИФА при наличии в объеме пробы (1-5000 мл) 1х102 м.к. и более.
Получение и тестирование лнпосомально-иммуноперокси-дазного конъюгата для выявления лептоспир
Таж как ферменты из-за слабожёсткой структуры имеют ограниченный срок хранения (1 год), нами разработан иммобилизованный препарат - липосомально-иммунопероксидазный конъюгат для диагностики лептоспироза. В качестве «твёрдой» фазы использовали ли-посомы, в качестве лиганда - иммуноглобулины лептоспирозные. На первом этапе определяли оптимальные условия получения препарата, на втором - оптимизировали постановку анализа. Для получения ди-агностикума предварительно активировали пероксидазу хрена по методу Р .К.. Шкапе, А. Калуао! [1974], затем на наружной мембране ли-посом последовательно фиксировали пероксидазу хрена и лептоспирозные иммуноглобулины класса О.
Установлено, что наиболее чувствительный липосомальный иммунопероксидазный диагностикум был получен при концентрации белка иммуноглобулинов 4 мг/мл и времени инкубации с липосомаль-ным ферментным конъюгатом 2 ч. Ковалентно фиксируясь на поверхности мембраны липосом, фермент и иммуноглобулин снижают способность к конформационным изменениям структуры молекул под воздействием факторов внешней среды. Указанные приемы способствовали повышению стабильности и увеличению срока годности диагностической системы с одного года до двух лет.
В таблице 2 представлены результаты оценки активности, специфичности и чувствительности полученных коньюгатов.
Таблица 2.
Результаты по определению активности, чувствительности и специфичности лентоспирозиых иммунопероксидазных коньюгатов.
№№ пп Наименование микроорганизмов Серии иммунопероксидазных коньюгатов
C-l С-2 С-3
рабочий титр чувствительность, м.к./мл рабочий титр чувствительность, м.к./мл рабочий титр чувствительность, м.к./мл
1-4 L. Sejroe, L. Pomona, L. Canicola, L. Tarassovi 1/600 5х104 1/800 1хЮ5 1/600 5*104
5-6 L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorrha giae 1/600 1 х 105 1/400 5хЮ4 1/600 1хЮ5
7 L. Semaranga - Отр. - Отр. - Отр.
8 L. Doberdo - Отр. - Отр. - Отр.
9-10 Y. pseudotuberculosis I, II серовар - Отр. - Отр. - Отр.
11-13 L. monocytogenes 1,2,3 - Отр. - Отр. - Отр.
14-16 Br. abortus 19 В A, Br. suis 61, Br. melitensis Rev-1 - Отр. - Отр. - Отр.
17-19 Fr.tularensis Schu, ЖТВ 15НИИЭГ - Отр. - Отр. - Отр.
20-22 E. coli 0,18; 0,11 - Отр. - Отр. - Отр.
Рабочий титр разработанных иммунопероксидазных коньюгатов всех изготовленных серий составил 1:400-1:800 со штаммами серог-рупп L. Pomona, L. Tarassovi, L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorrhagiae, L. Canicola, L. Hebdomadis. Чувствительность коньюгатов по водорастворимым антигенам составила 50-100 нг/мл; по корпускулярным антигенам - 5х104-1 х105 м.к./мл. Все серии полученных коньюгатов для ИФА дали отрицательные результаты с гетерологичными штаммами, что свидетельствовало о высокой специфичности. Таким образом, по-
лучены высокоактивные (до 1:800), специфичные (отсутствие перекрёстных реакций с гетерологичными штаммами) иммобилизованные иммунопероксидазные конъюгаты, позволяющие выявлять лептоспи-ры в концентрации 5x104 - 1 х 105 м.к./мл, стабильные в течение двух лет хранения (срок наблюдения).
Детекция лептоспир в реакции суспензионной агглютинации
Нами разработаны суспензионные лептоспирозные диагности-кумы для РСА. В качестве носителя использован неорганический компонент - алюмосиликат, для которого характерна высокая реакционная способность поверхностных групп. В качестве красителя применили ФИТЦ, соединяющийся с матрицей за счёт физической сорбции с участием электростатических взаимодействий с кислотными центрами алюмосиликата, а его активный центр соединен с аминогруппой лизина и концевыми аминогруппами белковой молекулы. От непрореагировавших компонентов освобождались путем диализа. Ли-гандом служили антитела, выделенные из агглютинирующих иммунных лептоспирозных сывороток, адсорбированных от гетерологичных антител.
Установлено, что для оптимальной иммобилизации достаточной является концентрация белка 2,0 мг/мл, температура 37 °С, количественное соотношение красителя и алюмосиликата (1:50), рН (9,5±0,1), время иммобилизации - 2 ч. Указанные параметры обеспечивают получение препарата для последующего эффективного выявления лептоспир.
РСА осуществляли на обезжиренном предметном стекле. В качестве положительного контроля служила взвесь лептоспир в концентрациях: 1х108;1х107; 1 х 106; 1x105 м.к./мл, отрицательного - 0,9% раствор натрия хлорида. Специфичность реакции контролировали на гетерологичных штаммах, включая лептоспирозные штаммы-сапрофиты. В отрицательном контроле агглютинация отсутствовала, в то время как на стёклах с взвесями лептоспир наблюдалось полное просветление жидкости с зернистыми хлопьями, т.е. чёткая агглюти-
нация (рис. 2). Чувствительность суспензионных диагностикумов составила 1 * 106-1 х 105 м.к./мл по корпускулярным антигенам, при отсутствии агглютинации с гетерологичными штаммами. РСА доступна для любой лаборатории, освобождает от работы с живыми культурами лептоспир и учета реакции под микроскопом. Учет результатов РСА на стекле возможен через 1-3 мин, что позволяет использовать ее в качестве скрининг-теста. Испытано 3 серии лептоспирозного диагно-стикума в 5 повторах в РСА на стекле с гомо- и гетерологичными штаммами. При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт. [1969] в серии опытов чувствительность РСА составила 0,99x106 м.к./мл (+7,2 %;- 6,7 %).
Рис. 2 Реакция суспензионной агглютинации на стекле с суспензионным лептоспирозным диагностикумом.
1 - без контакта с антигеном; 2-i. Sejroe;, 3 -L. Pomona; 4-Х. Camcola; 5 - L. Tarassovi; 6-1. Grippotyphosa; 7 - L. Icterohaemor-ragiae; 8 - L. biflexa Patoc (сапрофит,), 9-1. biflexa Doberdo (сапрофит}.
Разработанные диагностикумы позволили создать тест-систему диагностическую лептоспирозную для РСА с использованием иммобилизованных препаратов, включающую суспензионный диагности-кум лептоспирозный, лиофилизированную взвесь лептоспирозного микроба (положительный контроль), сухую навеску натрия хлорида.
Исследование клинического и полевого материала на наличие антител и антигена лептоспир
Проведена апробация предложенных диагностикумов при выявлении лептоспироза у людей (клинический материал) и обнаружении лептоспир в объектах внешней среды (полевые испытания). Сыворотки крови людей исследовали в РМА, традиционном ИФА «сэндвич»-варианте, разработанном модифицированном ИФА с МИС антигенными и коныогатом имунопероксидазным против глобулинов человека.
Наиболее эффективным оказался метод ИФА с МИС. ИФА является видовым методом диагностики, выявляющим все серогруппы вида L. interrogans, т.е. определяет вид возбудителя, а не его серо-вар.Тем не менее, иммунопероксидазный конъюгат не реагирует с взвесями штаммов-сапрофитов L. biflexa и гетерологичными штаммами. ИФА с МИС доступен для любой лаборатории, освобождает от работы с живыми культурами лептоспир, учета реакции под микроскопом.
В октябре 2005 г. были исследованы три пробы, полученные из г. Новопавловска Ставропольского края от людей с подозрением на лептоспироз. Установлено, что титр ИФА с МИС при выявлении леп-тоспирозных антител был не ниже 1:25600-1:409600 в пробе, а при постановке традиционного ИФА - 1:3200-1:51200 (р<0,05). Более низкий титр традиционного ИФА по сравнению с разработанными методами связан с нестандартностью адсорбционной поверхности планшет из полистирола, что приводит к непрочному связыванию антител и их десорбции на этапах ИФА.
В Чеченской республике в августе 2005 г. возникла вспышка лептоспироза. Нами были исследованы сыворотки крови 49 больных (100 %) с подозрением на лептоспироз и 56 человек (100 %), находящихся в контакте с заболевшими или связанными с источником заражения (водоемом) (табл. 3).
Таблица 3.
Результаты исследования на лептоспироз сывороток крови
больных и контактировавших из Гудермесского района __Чеченской республики
Серологические реакции Кол-во положительных проб, больн./ контакт. Соотношение в%, больн./ контакт. Титры реакций Средний геометрический титр
РМА 49/19 100/33,9 1:100- 1:400 249 (+24,0; -19,4 %)
ИФА 49/22 100/39,3 1:800- 1: 640Q 2850,7(4-24,8; -19,9%)
ИФА +Мис 49/37 100/66,1 1:8001:51200 21 L30,9(+23,l; -18,7%)
В PMA у 49 больных (100 %), подозрительных на лептоспироз, и у одного (1,8 %) контактировавшего определены антитела к лептос-пирам серогруппы Grippotyphosa в титрах от 1:100 до 1:400, средний геометрический титр антител составил 240 (+24,0; -19,4 %), у 17 (30,4 %) контактных лиц выявлены антитела к лептоспирам этой серогруппы в титре 1:20, у одного человека (1,8 %) в титре 1:20 - к лептоспирам Icterohaemorrhagiae. В «сэндвич»-варианте ИФА специфические антитела определялись у всех больных (100 %) и у 22 контактировавших лиц (39,3 %) в среднем геометрическом титре 2850,7 (+24,8; -19,9 %) (р<0,05), а в ИФА с МИС положительные результаты получены у всех больных (100 %) и у 32 контактировавших людей (57,1 %) в среднем геометрическом титре 21130,9 (+23,1; -18,7 %) (р<0,05).
Итак, метод ИФА с разработанными МИС антигенными позволил выявить специфические лептоспирозные антитела не только у лиц с выраженной клинической картиной, но и у людей, вероятно, перенесших лептоспирозную инфекцию в легкой или стертой форме, у которых антитела к лептоспирам другими методами не выявлялись. Средний геометрический титр специфических антител в ИФА с МИС в 7,4 раза превысил титр антител в традиционном ИФА и в 88 раз -титр антител в РМА (табл. 3).
В дальнейшем нами были проведены исследования по выявлению возбудителя лептоспироза в объектах внешней среды. В сентяб-
19
ре-декабре 2006 г. в Андроповском и Красногвардейском районах Ставропольского края имели место водные вспышки лептоспироза у людей. В связи с этим обследование открытых водоемов приобрело первостепенное значение. Были апробированы разработанные технические средства (магнитные ловушки, установка «Аквадиамаг», лабораторная установка для работы с МИС) и тест-системы магноиммун-носорбентные иммуноглобулиновые с иммунопероксидазным лептос-пирозным конъюгатом на 18 пробах воды открытых водоемов. Число положительных проб в предложенном ИФА с МИС составило 80 %. Традиционными методами выявить патоген в данном объекте не удалось из-за низкой концентрации лептоспир.
Проведенные лабораторные и полевые испытания лептоспироз-ной магноиммуносорбентной тест-системы (в том числе в составе разработанных технических средств) свидетельствуют о высокой надежности и чувствительности при использовании ее в качестве скрининг-теста для микробиологического мониторинга внешней среды и лабораторной диагностики.
ВЫВОДЫ
1. Качественный мониторинг объектов внешней среды на наличие лептоспир возможен путем использования разработанных препаратов на основе высокоспецифичных лептоспирозных сывороток, полученных с применением МИС, которые позволяют значительно снизить титр неспецифических антител и сохранить первоначальную активность иммунных сывороток,
2. В процессе совершенствования экспресс-диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя удалось увеличить чувствительность иммуноферментного и иммунофлуоресцентного анализов в 100-1000 раз в сравнении с традиционными ИФА и РИФ, сократить время постановки анализов с сохранением стабильности препаратов в течение 2 лет (срок наблюдения) путем использования магноиммуно-сорбентов (активированный полифепан с оксидом железа) с иммобилизованными лептоспирозными иммуноглобулинами и антигенами.
3. Получены диагностические лептоспирозные тест-системы
для ИФА, обладающие высокой чувствительностью (5х104-1х10 м.к./мл) и специфичностью (отсутствие перекрестных реакций с гете рологичными штаммами). Иммобилизация на мембране липосом фер мента и лептоспирозных иммуноглобулинов обеспечила сохранен» исходной активности и каталитических свойств фермента и лептоспи розных иммуноглобулинов, увеличила в 2 раза стабильность и cpoi годности системы по сравнению с традиционным ИФА.
4. Усовершенствованная РСА на стекле с применением разра ботанного алюмосиликатно-флюоресцентного лептоспирозного диаг ностикума позволяет выявлять лептоспиры в концентрации 1х105 1х10б м.к./мл при учете результатов реакции через 1-3 мин, что даё возможность использовать его в качестве скрининг-теста. Применена в качестве матрицы алюмосиликата обеспечивает получение стабиль ных при хранении суспензионных препаратов. Использование ФИТ1 позволяет исключить процесс активирования матрицы.
5. Впервые созданы мобильные рабочие установки («Аквадиа маг») для проведения микробиологического мониторинга воды откры тых водоемов на наличие возбудителя, обладающие высокой эффек тивностью, надежностью и возможностью селективного фиксирова ния на поверхности МИС лептоспир из большого объема жидкости.
6. Комплекс разработанных препаратов и методов был апроби рован при исследовании клинического материала и показал их высс кую диагностическую ценность. Специфические антитела при исслё довании сывороток крови больных (49) и контактировавших с ним людей (56) обнаружены в PMA у 64,8 %, в традиционном ИФА н планшетах - у 67,6 %, в ИФА с МИС - у 81,9 % людей (р<0,05). Сре^ ний геометрический титр специфических антител в ИФА с МИС в 7, раза превысил титр антител в традиционном ИФА и в 88 раз - тит антител в РМА, что подтверждает высокую диагностическую цег ность разработанных препаратов.
7. При выявлении лептоспир в полевом материале (вода открь того водоема) эффективным (80 % положительных проб) являете ИФА, где в качестве твердой фазы использованы сконструированны
МИС с иммобилизованными антителами, выгодно отличающийся высокой чувствительностью и непродолжительным сроком проведения анализа (1,0-1,5 ч). Традиционными методами выявить лептоспиры в данном объекте не представляется возможным из-за низкой концентрации патогена.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Таран, A.B. Анализ эпидемиологической обстановки по леп-тоспирозу и его диагностики (обзор литературы) / A.B. Таран, И.В. Жарникова // Деп. в ВИНИТИ 20.03.06. - № 278-В2006. - 40 с.
2. Таран, A.B. Разработка и получение тест-систем диагностических липосомальных иммуноферментных для выявления возбудителей лептоспироза, туберкулеза / A.B. Таран, И.В. Жарникова, Д.В. Ефременко // Деп. в ВИНИТИ 20.03.06. - № 279-В2006. - 15 с.
3. Таран, A.B. Выявление возбудителей лептоспироза с помощью современных иммунодиагностических препаратов / A.B. Таран, Е.В. Жданова, И.Ю. Юркина, И.В. Самарина и др. // Естествознание и гуманизм: Сб. научн. работ. - Томск, 2006. - Т. 3. - № 1. - С. 92-93.
4. Самарина, И.В. Лептоспироз в Ставропольском крае (проблемы и перспективы) / И.В. Самарина, Г.М. Грижебовский, М.П. Григорьев, A.B. Таран и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. научн. трудов. - М. - 2006. - вып. 8. - С. 306-309.
5. Самарина, И.В. Особенности эпидемиологии лептоспироза в Ставропольском крае на современном этапе / И.В. Самарина, В.М. Мезенцев, Ю.М. Евченко, A.B. Таран и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: Сб. научн. трудов. - вып. 8.-М.-2006, С. 289-292.
6. Жарникова, И.В. Разработка и применение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих для выявления возбудителей кампилобактериоза, лептоспироза / И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева, Е.В. Алиева, A.B. Таран и др. // Медицинский Вестник Северного Кавказа. - Ставрополь, 2006. - С. 12-14.
7. Алиева, E.B. Унификация и разработка тест-систем диагностических для мониторинга возбудителей бактериальной (кам-пилобактериоз, туляремия, лептоспироз) и вирусной (лихорадка Западного Нила) природы / Е.В. Алиева, A.B. Таран, Е.Е. Афанасьева, Т.В. Жарникова и др. // Вестник Ставропольского государственного университета. -Ставрополь, 2006. - Вып. 47. - С. 292-298.
8. Таран, A.B. Получение липосом для конструирования лечебных и диагностических препаратов / A.B. Таран // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тезисов к научно-практической конференции (19 мая 2006 г.). - Санкт-Петербург, 2006.-С. 260-261.
9. Жарникова, И.В. Разработка препаратов для экспресс-диагностики лептоспироза / И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева,
A.B. Таран // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины:. Сб. тезисов к научно-практической конференции (19 мая 2006 г.). - Санкт-Петербург, 2006. - С. 261-262.
10. Жарникова, Т.В. Применение сорбционных материалов при получении диагностических флуоресцирующих препаратов / Т.В. Жарникова, Д.В. Ефременко, И.В. Жарникова, A.B. Таран и др. // Материалы научно-практической конферешдии «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России» (Ставрополь, 21-22 марта 2007 г.). - Ставрополь, 2007.-Ч. 1.-С. 139-141.
11. Таран, A.B. Экспресс-диагностика лептоспироза / A.B. Таран, Т.В. Жарникова, И.В. Самарина, Б.И. Левченко // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-27 апреля 2007 г.). — М.: Изд-во Санэпидмедиа, 2007. - Т. 3. - С. 85-86.
12. Жилченко, Е.Б. Конструирование модифицированных липосом для преодоления гематоэнцефалического барьера / Е.Б. Жилченко,
B.И. Ефременко, Т.В. Таран, A.B. Таран и др. // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-27 апреля 2007 г.). -М.: Изд-
во Санэпидмедиа, 200?. - Т. 1. - С. 63.
13. Таран, Т.В. Изучение возможности направленной доставки липосомальных форм препаратов через желудочно-кишечный барьер./ Т.В. Таран, В.И. Ефременко, Е.Б. Жилчешсо, A.B. Таран и др. // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-27 апреля 2007 г.). - М.: Изд-во Санэпидмедиа, 2007. - Т. 2. - С. 85-86.
14. Таран, A.B. Лептоспироз в Карачаево-Черкесской Республике / A.B. Таран, И.В. Самарина, В.А. Петрюк, Т.В. Жарникова и др. // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тезисов к научно-практической конференции молодых ученых. -Санкт-Петербург, 2007. - С. 163-165.
15. Пат. на полезную модель №64784 G01N 33/553 С 12М 1/100. Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды / В.И. Ефременко, [А.Л. Столяров!, A.M. Игуменов, A.B. Таран и др. (РФ) - Опубл. 10.07.2007. - Бюл. № 19.
16. Методические рекомендации по лабораторной диагностике возбудителя лептоспироза /Сост. A.B. Таран, Т.В. Жарникова, И.В. Самарина, И.С. Тюменцева и др. Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2007. - С. 20.
17. Жарникова, Т.В. Получение аффинного сорбента для очистки лептоспирозной сыворотки от неспецифических антител / Т.В. Жарникова, Д.В. Ефременко, И.В. Самарина, A.B. Таран // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ. -Саратов, 2007. - С. 208-210.
ТАРАН Александр Владимирович
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
ЛР № 020326 от 20 января 1997 г.
Сдано в набор 11.01.08. Подписано в печать 11.01.08. Формат 60x84 '/,6 Бумага типогр. № 1. Печать офсетная. Гарнитура офсетная. Усл. печ. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7. Заказ 1945. Тираж 100 экз.
Ставропольская государственная медицинская академия, 355017, г. Ставрополь, ул. Мира, 310.
Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Таран, Александр Владимирович
Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов 4 Введение
Глава 1 Современное состояние лабораторной диагностики и пути расширения арсенала методов идентификации лептоспир (обзор литературы)
1.1 Распространение лептоспир, взаимодействие с факторами внешней среды и живыми организмами
1.2 Лабораторные методы выделения, культивирования и идентификации лептоспир
1.3 Методы получения и применения иммуносорбционных систем для выявления бактерий 34 Собственные исследования
Глава 2 Материалы и методы
2.1 Материалы 42 2.1.1 Штаммы микроорганизмов 42 2.1.2.Питательные среды и условия культивирования
2.1.3 Лабораторные животные
2.1.4 Клинический материал
2.1.5 Характеристика реагентов, используемых для получения иммуно-сорбентов
2.2 Методы исследования
2.2.1 Микроскопия лептоспир
2.2.2 Получение антигенных комплексов микроорганизмов
2.2.3 Иммунизация животных
2.2.4 Выделение иммуноглобулинов
2.2.5 Методы контроля специфичности и активности антигенов и сывороток
2.2.6 Получение иммунофлуоресцирующих конъюгатов
2.2.7 Экстракция фосфолипидов (ФЛ)
2.2.8 Получение и контроль липосом
2.2.9 Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов
2.2.10 Физико-химические методы
2.2.11 Иммунохимические методы анализа
2.2.12 Лиофилизация биологического материала
2.2.13 Методы математической и статистической обработки материалов
Глава 3 Усовершенствование экспресс-диагностики лептоспирозной инфекции путем разработки иммобилизованных препаратов с магнитными свойствами и конструирования технических средств
3.1 Получение высокоспецифичной лептоспирозной сыворотки
3.2 Разработка лептоспирозных магноиммуносорбентных препаратов для выявления лептоспирозных антител, антигенов и компоновка тест-систем для выявления лептоспир
3.3 Мониторинг объектов внешней среды на наличие лептоспир с применением технических средств
Глава 4 Выявление лептоспир с использованием липосомально-иммунопероксидазного конъюгата и суспензионного диагностикума , »
4.1 Получение и тестирование лептоспирозного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата
4.2 Получение суспензионного диагностикума и проведение анализа суспензионной агглютинации лептоспир
4.2.1 Получение суспензионного диагностикума
4.2.2 Проведение анализа суспензионной агглютинации лептоспир
Глава 5 Исследование клинического и полевого материала на наличие антител и антигена лептоспир
5.1 Изучение диагностической ценности предложенных тест-систем при исследовании клинического материала
5.2 Апробация разработанных тест-систем и технических устройств при исследовании полевого материала
Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя"
Актуальность проблемы
Наибольшую опасность в эпидемиологическом плане представляют, прежде всего, особо опасные и опасные инфекции, относящиеся преимущественно к карантинным и природно-очаговым болезням, такие как чума, сибирская язва, лептоспироз и др. [Онищенко Г.Г., 1999; 2001; 2002; 2006; 2007; Савченко С.Т. с соавт., 2007].
Обстановка по лептоспирозу в мире продолжает оставаться неблагополучной, что обусловлено наличием природных и антропоургических очагов, а также формированием новых стойких очагов инфекции как в сельской местности, так и в городах [Ананьина Ю.В., 2001; Spenser L., 1992; Hansen G.R., Woodall J., Brown С., et al., 2001]. Ежегодно в России регистрируется до 2,5 тысяч заболеваний лептоспирозом [МУ 3.1.1128—02].
Проблема лептоспироза далека от своего окончательного решения, и нельзя исключить неожиданное обострение эпидемической обстановки на тех или иных внешне благополучных территориях. Лептоспирозы выделены комитетом экспертов ВОЗ из большого числа зоонозов как наиболее значимые в социально-экономическом отношении нозологические формы. Они наносят значительный материальный ущерб сельскому хозяйству и постоянно угрожают здоровью и жизни человека. Это связано с широкой распространенностью лептоспир на всех континентах, длительной выживаемостью их в абиотической среде и свойством поражать различные виды домашних и диких животных, которые затем служат источниками инфицирования людей. г
Лептоспирозная инфекция занимает одно из первых мест среди зоонозов по тяжести клинического течения, частоте летальных исходов и отдаленных клинических последствий. При средних показателях летальности в стране 34,5 % на отдельных территориях, эндемичных по наиболее тяжелым формам, вызываемым лептоспирами серогрупп Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают, а иногда и превышают 20 %.
Реальный уровень заболеваемости лептоспирозами значительно превышает регистрируемые показатели вследствие гиподиагностики, обусловленной низкой клинической выявляемостью больных и несовершенством методов и средств лабораторной диагностики [Онищенко Г.Г., 2006; Савченко С.Т. с соавт., 2007].
Сохраняющаяся активность очагов лептоспирозов в Ставропольском крае [Ковалев Н.Г. с соавт., 2006] требует постоянного внимания со стороны санитарно-эпидемиологических служб и лечебно-профилактических учреждений, проведения комплекса профилактических и противоэпидемических мероприятий и обеспечения своевременной дифференциальной диагностики лептоспирозов у людей. В связи с тем, что клиническая дифференциальная диагностика лептоспирозов представляет значительные трудности из-за полиморфизма клинической картины, результаты лабораторного исследования являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания.
В диагностике лептоспироза ведущее место принадлежит серологическим методам. Общепринятым стандартным тестом при исследовании сывороток крови является реакция микроагглютинации (РМА), использование которой связано с необходимостью поддержания большого количества штаммов лептоспир, относящихся к медленнорастущим и труднокультивируемым микроорганизмам. Выращивание лептоспир производится на дорогостоящих сывороточных средах.
Учет результатов реакции осуществляется путем микроскопии агглютинировавших живых культур в темном поле. Эти факторы ограничивают возможность внедрения РМА в широкую практику. С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используется также реакция слайд-агтлютинации, иммуноферментный анализ (ИФА) с родоспецифиче-скими антигенами лептоспир.
Существуют препараты для ПЦР-диагностики, но они отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и поэтому широкого распространения не получили.
Среди способов диагностики инфекционных заболеваний особое место занимают иммуносорбционные, в основе которых лежит принцип аффинности, базирующийся на специфическом связывании антигенов с комплементарными антителами. Новым этапом усовершенствования общепринятых методов диагностики является разработка, освоение производства диагностических препаратов на основе магноиммуносорбентов [Саяпина Л.В. с соавт., 2007]. Их использование позволяет селективно концентрировать инфекционные агенты на поверхности сорбента, применять специальные технические средства, упрощающие проведение анализов, автоматизировать исследования.
В связи с этим, актуальным является совершенствование диагностических препаратов для быстрого выявления лептоспир, обладающих высокой специфической активностью, экспрессностыо и информативностью. Внедрение в схему лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов лептоспи-роза недорогих, чувствительных, специфичных препаратов и методов будет способствовать быстрой детекции возбудителя в биологическом и полевом материале, ранней постановке диагноза, организации и своевременному проведению адекватных противоэпидемических мероприятий.
Цель работы - повышение чувствительности и специфичности методов выявления лептоспир и антител к ним с использованием диагностических тест-систем на основе иммобилизованных препаратов.
Основные задачи исследования:
1. Усовершенствовать лабораторную диагностику лептоспироза путем использования высокоспецифичных сывороток крови, полученных методом иммуносорбции;
2. Разработать методы селективного концентрирования лептоспир на магноиммуносорбентах на основе полифепана, оксида железа с иммобилизованными антителами и технические средства для микробиологического мониторинга объектов внешней среды;
3. Усовершенствовать диагностические тест-системы для ИФА с использованием полученных липосомально-пероксидазных конъюгатов;
4. Разработать экспресс-методы и системы для выявления лептоспир с использованием суспензионного комплекса на основе алюмосиликата и флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ);
5. Изучить диагностическую ценность разработанных препаратов, технических средств и методов на экспериментальном, полевом и клиническом материале.
Научная новизна работы
Получены специфичные препараты путем проведения иммуносорбции неспецифических антител из иммунных лептоспирозных сывороток с использованием аффинных МИС, что позволило сохранить их первоначальную активность, упростить процесс сорбции. Усовершенствованы методы экспресс-диагностики (ИФА и количественного иммунофлуоресцентного анализа - КИФА) при выявлении лептоспир с применением разработанных высокочувствительных иммуносорбентных диагностикумов, превосходящих подобные препараты по доступности, экологической чистоте сырья, позволяющих сократить трудовые и материальные затраты при их изготовлении и постановке реакций.
Унифицированы методы исследования биологического материала, 3 проб из объектов внешней среды большого объема (до 10 л), с высокой степенью загрязнения, низкой концентрацией возбудителя с применением разработанных технических средств и методических приемов по сочетанному применению селективного концентрирования лептоспир на МИС с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИФА). На установку для микробиологического мониторинга объектов водной среды получен патент РФ на полезную модель.
Осуществлена научная разработка получения липосомальных лептос-пирозных иммуноферментных конъюгатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью. Впервые проведена научно-методическая разработка суспензионно-флуоресцентного диагностикума для выявления леп-тоспир в экспрессной реакции суспензионной агглютинации (РСА).
Научно-методические разработки сочетанных методов использования МИС с ИФА и КИФА дополняют новыми научными данными сведения о возможности применения иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции лептоспир в объектах внешней среды и биологическом материале.
Практическая значимость работы
Усовершенствованные ИФА и КИФА с применением полученных лептоспи-розных МИС в сочетании с разработанными техническими средствами позволяют выявить лептоспиры в объектах внешней среды, повысить чувствительность метода, сократить время анализа до 3 ч за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что в конечном итоге обеспечивает своевременное проведение адекватных противоэпидемических мероприятий. Применение разработанных аффинных сорбентов с магнитными свойствами обеспечивает эффективную иммуносорбцию неспецифических антител из сыворотки крови для получения высокоспецифичных препаратов.
Разработанные методологические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и лептоспирозных иммуноглобулинов позволяют повысить стабильность и в два раза увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.
Предложен метод РСА на стекле с суспензионным диагностикумом, обладающий экономической эффективностью, экспрессностью и простотой, показано его преимущество перед традиционными методами детекции возбудителя при апробации в лабораторных и полевых условиях.
Материалы научных разработок легли в основу 3 методических документов, утвержденных на учрежденческом уровне внедрения: «Магноимму-носорбенты в микробиологических и клинических исследованиях» (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 9 от 27.10.05 г.); «Лабораторная детекция лептоспироза» (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 11 от 30.11.06 г.); «Конструирование липосом различного липидного состава для их направленной доставки в ткани и органы-мишени экспериментальных животных, оценка результатов с помощью радиоизотопного метода по удельной радиоактивности» (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ № 4 от 03.05.07 г.).
Утверждена нормативная документация (лабораторный регламент, инструкция по применению) на диагностикум суспензионный для выявления лептоспир в РСА (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №1 от 25.01.07 г.). Материалы диссертации используются на курсах специализации врачей по экспресс-диагностике лептоспироза в ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанные научно-методические подходы получения высокоспецифичных иммунных лептоспирозных сывороток для диагностических препаратов с применением аффинных МИС на основе полифепана и оксида железа обеспечивают сохранение их первоначальной активности, сокращение и упрощение всех этапов сорбции.
2. Селективное концентрирование лептоспир путем применения разработанных магноиммуносорбентных диагностических препаратов, тест-систем и технических средств увеличивает чувствительность методов на 2-3 порядка по сравнению с традиционными ИФА и реакцией иммунофлуорес-ценции (РИФ).
3. Метод ИФА с липосомально-иммунопероксидазным конъюгатом позволяет выявлять лептоспиры в концентрации 5х104-1><105 микробных клеток (м.к.)/мл при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Стабильность и срок годности конъюгата увеличены в 2 раза по сравнению с традиционным иммунопероксидазным конъюгатом [Nakane Р.К., Kawaoi А.,1974] за счет иммобилизации на мембране липосом фермента и лептоспирозных иммуноглобулинов.
4. Высокая эффективность обнаружения антигена лептоспир в РСА достигнута при использовании суспензионно-флуоресцентного алюмосили-катного диагностикума. Разработанный диагностикум по чувствительности аналогичен традиционному методу РИГА, но превосходит по простоте изготовления и экспрессности (РСА 1-3 мин, а РНГА (макрометод) - 24 ч).
5. Разработанные диагностические тест-системы могут использоваться в ходе мониторинга объектов внешней среды с целью выявления и изучения циркуляции лептоспир, а также для лабораторной диагностики лептоспироза.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (г. Новосибирск, 2006), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (г. Санкт-Петербург, 2006), на ежегодных научно-практических конференциях в ФГУЗ СтавНИПЧИ (2005-2007), на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах - участниках СНГ» (г. Саратов, 2007).
Публикации
Основные положения диссертации отражены в 17 опубликованных научных работах, в том числе одна работа - в издании, рекомендованном ВАК РФ, две - депонированы в ВИНИТИ.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 159 отечественных и 76 зарубежных источников.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Таран, Александр Владимирович
выводы
1. Качественный мониторинг объектов внешней среды на наличие леп-тоспир возможен путем использования разработанных препаратов на основе высокоспецифичных лептоспирозных сывороток, полученных с применением МИС, которые позволяют значительно снизить титр неспецифических антител и сохранить первоначальную активность иммунных сывороток,
2. В процессе совершенствования экспресс-диагностики лептоспироза и детекции его возбудителя удалось увеличить чувствительность иммунофер-ментного и иммунофлуоресцентного анализов в 100-1000 раз в сравнении с традиционными ИФА и РИФ, сократить время постановки анализов с сохранением стабильности препаратов в течение 2 лет (срок наблюдения) путем использования магноиммуносорбентов (активированный полифепан с оксидом железа) с иммобилизованными лептоспирозными иммуноглобулинами и антигенами.
3. Получены диагностические лептоспирозные тест-системы для ИФА, обладающие высокой чувствительностью (5х 104-1 х105 м.к./мл) и специфичностью (отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными штаммами). Иммобилизация на мембране липосом фермента и лептоспирозных иммуноглобулинов обеспечила сохранение исходной активности и каталитических свойств фермента и лептоспирозных иммуноглобулинов, увеличила в 2 раза стабильность и срок годности системы по сравнению с традиционным ИФА.
4. Усовершенствованная РСА на стекле с применением разработанного алюмосиликатно-флюоресцентного лептоспирозного диагностикума позволяет выявлять лептоспиры в концентрации 1><105-1х106 м.к./мл при учете результатов реакции через 1-3 мин, что дает возможность использовать его в качестве скрининг-теста. Применение в качестве матрицы алюмосиликата обеспечивает получение стабильных при хранении суспензионных препаратов. Использование ФИТЦ позволяет исключить процесс активирования матрицы.
5. Впервые созданы мобильные рабочие установки («Аквадиамаг») для проведения микробиологического мониторинга воды открытых водоемов на наличие возбудителя, обладающие высокой эффективностью, надежностью и возможностью селективного фиксирования на поверхности МИС лептоспир из большого объема жидкости.
6. Комплекс разработанных препаратов и методов был апробирован при исследовании клинического материала и показал их высокую диагностическую ценность. Специфические антитела при исследовании сывороток крови больных (49) и контактировавших с ними людей (56) обнаружены в PMA у 64,8 %, в традиционном ИФА на планшетах - у 67,6 %, в ИФА с МИС - у 81,9 % людей (р<0,05). Средний геометрический титр специфических антител в ИФА с МИС в 7,4 раза превысил титр антител в традиционном ИФА и в 88 раз — титр антител в РМА, что подтверждает высокую диагностическую ценность разработанных препаратов.
7. При выявлении лептоспир в полевом материале (вода открытого водоема) эффективным (80 % положительных проб) является ИФА, где в качестве твердой фазы использованы сконструированные МИС с иммобилизованными антителами, выгодно отличающийся высокой чувствительностью и непродолжительным сроком проведения анализа (1,0-1,5 ч). Традиционными методами выявить лептоспиры в данном объекте не представляется возможным из-за низкой концентрации патогена.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
При конструировании суспензионных диагностикумов в качестве матрицы использовать алюмосиликат, в качестве'красителя и сшивающего «мостика» — флуоресцеинизотиоцианат, тщательно подбирать нагрузку лиганда, временные и температурные параметры опытным путем.
При разработке МС использовать полифепан и оксид железа, благодаря чему препарат приобретает положительные свойства органических и неорганических матриц. При иммобилизации использовать нагрузку белка 2-2,5 мг/мл.
Для повышения специфичности сывороток проводить их иммуносорб-цию от гетерологичных антител с помощью аффинных МИС, полученных иммобилизацией с гетерологичными антигенами, что упрощает и ускоряет процесс очистки.
При микробиологическом мониторинге объектов водной среды проводить селективное концентрирование на МИС лептоспирозных антигенов, используя магнитные ловушки, лабораторную установку с постоянным магнитом, плавающую установку «Аквадиамаг» с последующей постановкой ИФА, КИФА.
При исследовании клинического материала на выявление антител проводить постановку ИФА и КИФА, используя МИС лептоспирозные антигенные, иммунопероксидазный конъюгат против глобулинов человека (в ИФА) и иммуноглобулины флуоресцирующие против глобулинов человека (в КИФА).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Таран, Александр Владимирович, Ставрополь
1. A.c. N 264369. Способ приготовления аэросилогелей / A.B. Киселев, Т.Л. Кустова (РФ). 1976. - 4 с.
2. Абелян, В.А. Иммобилизация циклодекстрин-гликозилтрансферозы и характеристика полученного биокатализатора / В.А. Абелян, Э.Г. Африкян // Журн. прикладная биохимия и микробиол. 1992. - Том 28. - №2. - С. 205-209.
3. Авдеева, М. Г. Причины летальных исходов лептоспироза / М.Г. Авдеева // Эпидемиология и инф. болезни. 2003. - № 3. - С 46-47.
4. Авдеева, М.Г. Факторы риска тяжелого течения лептоспироза и основные причины летальных исходов / М.Г. Авдеева, О.В. Стриханова // Инфекц. болезни: пробл. здравоохр. и воен. мед. СПб, 2006. С. 15-16.
5. Адамов, А.К, Об адсорбциях иммунных антител на частицах суспензий / А.К. Адамов, В.Т. Бердиков //Журн. микробиол. 1964. - № 12. - С.83-89.
6. Адамов, А.К. Свойства антител, фиксированных на частицах, и перспективы применения их в микробиологии. Сообщение VI / А.К.Адамов // Журн. микробиол. 1965. - № 2. - С. 100-105.
7. Адамов, А.К. Суспензионные антитела и иммуносорбенты / А.К. Адамов, В.И. Агафонов М. - 1969. - 175 с.
8. Алексеев, П. Названы социально значимые заболевания / П. Алексеев, // Мед. газета. 17.12. 2004. -№100.
9. Алиева, Е.В. Опыт применения новой тест-системы для экспресс-диагностики возбудителей кампилобактериоза в условиях чрезвычайной ситуации / Е.В.Алиева // Реф. журн. 2006. Св. том № 5. С. 23-24.
10. Ананьин, В.В. Лептоспирозы людей и животных / В.В. Ананьин, И.Л. Коковин, Е.В. Карасева, Л.Н. Кац и др. М.:Медицина, 1971. - 352 с.
11. Ананьина, Ю.В. Штутгартская болезнь возвращающийся лептоспи-роз? / Ю.В. Ананьина // Материалы IX Московского Межд.ветеринарного конгресса. М.2001. - С. 40-41.
12. Афанасьев, E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва) / E.H. Афанасьев: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Ростов, 2000. — 45 с.
13. Базиков, И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диагностики сифилиса / И.А. Базиков: Дис. .докт. мед. наук. Ставрополь, 2000.-200 с.
14. Басель, Бадра, Некоторые эпизоотические и эпидемические аспекты лептоспироза / Бадра Басель, A.B. Святковкий, В.А. Кузьмин, П.И. Огарков и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. 1(15). — 2006. -С. 157-159.
15. Беднова, В.Н. Новая тест-система ИФА на сифилис / В.Н. Беднова, Г.А. Дмитриев, A.B. Бабий // Вестн. дермат. 1994. - №4. - С.5 1-53.
16. Березин, И.В. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы / И.В. Березин М.: МГУ, 1976. - Т.1. - С. 106-113.
17. Бернасовская, Е.П. Лептоспироз / Е.П. Бернасовская, Б.Л. Угрюмов, А.Д. Вовк-К.: Здоровье, 1989.- 151 с.
18. Бинатова, В.В. Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза / В.В. Бинатова. Автореф. дис. канд. биол. наук. Ставрополь: СтавНИПЧИ, 1999. 29 с.
19. Биологические мембраны. Методы. / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. Изд-во Москва «Мир», 1990. 423 с.
20. Богомолов, Б.Д. Химия древесины и основы химии высокомолекулярных соединений / Б.Д. Богомолов. М., 1973. - 245 с.
21. Брыкалов, A.B. Получение биопрепаратов на основе методов аффинной сорбции и иммобилизации: Дисс. . докт. химич. Наук / A.B. Брыкалов. -Санкт-Петербург, 1993. 330 с.
22. Брыкалов, A.B. Сорбенты на основе кремнеземов и активированных углей в биотехнологии и медицине / A.B. Брыкалов // Материалы конф. химиков Сев.Кавказа. Нальчик, 1991.-С. 185-186.
23. Бударина, H.A. ПЦР-диагностика HGV-инфекции у детей / H.A. Буда-рина, С.Г. Пак, В.П. Чуланов //Клиническая лабораторная диагностика. — 2002.-№9.-С. 31-32.
24. Владимцева, И.В. Изучение моноклонального сапного магноиммуно-сорбента методом количественной иммунофлуоресценции / И.В. Владимцева, Н.П. Храпова, В.И. Ефременко // Сб. науч. работ. Волгоград, 1989. -Вып.4. - С. 206-209.
25. Владимцева, И.В. Конструирование диагностической тест-системы на основе магносорбентов и липосом / И.В. Владимцева, Н.Г. Плеханова, В.И. Смирнова, В.И. Закревский // ЖМЭИ. 1990. -№10. - С. 103-106.
26. Гаврилова, Е.М. Иммуноферментный анализ / Е.М. Гаврилова, Б.В. Дзантиев, A.M. Егоров // Тез. докл. 3-го Всес. науч. симпоз. "Получение иммобилизованных ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине" Л., 1980. - С. 37-38.
27. Гинзбург, A.JI. Генодиагностика / A.JI. Гинсбург // Журн. микробиол. -1998.-№3.-С. 86-95.
28. Гинзбург, A.JI. Генодиагностика инфекционных заболеваний / A.JI. Гинсбург // Журн. микробиол. 1998. - №3. - С.96-102.
29. Головлева, JI.A. Биохимия разложения лигнина микроорганизмами: Проблемы биоконверсии растительного сырья /JI.A. Головлева, О.В. Мальцева/Под ред. Г.К.Скрябина. 1986. - С. 272-273.
30. Гонтарь, И.П. Иммуномодулирующий эффект магносорбентов в терапии реавматических заболеваний / И.П. Гонтарь, И.А. Зборовский, A.B. Александров // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тез. докл. 1998,-С.З5
31. Дентовская, C.B. Использование молекулярно-генетических подходов для лабораторной диагностики бруцеллеза / C.B. Дентовская, А.Н. Куличенко // Проблемы ООИ. Саратов, 1999. - С. 3- 11.
32. Дмитриев, Г.А. Применение ИФА для серодиагностики сифилиса / Г.А. Дмитриев, Т.А. Киселева // Актуальные вопросы дерм, и венер.: Сб.тр. юбил конф., посвящ. 5-летию созд.кож. и вен. болезней педиатр, фак. РГМУ -М., 1997.-С. 36-37.
33. Дюга, Г. Биоорганическая химия /Г. Дюга, К. Пенни М.,1983. — С. 348, 352.
34. Егоров, A.M. Аналитическое применение ферментов: Биотехнология / A.M. Егоров / под ред. A.A. Баева. Изд-во «Наука»., М., 1984. - С. 149-154.
35. Елистратов, Г.Д. Способ получения сорбента / Г.Д. Елистратов, М.И. Волчанова, И.В. Малыгин, А.П. Шолошов, В.П. и др. // БИПМ.-№ 3. -2004. 629 с.
36. Ефременко, В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине) / В.И. Ефременко.- Ставроп. н.-и. противочум. ин-т. Ставрополь, 1999. - 236 с.
37. Ефременко, В.И. Магнитный иммуноферментный анализ антигенов чумного микроба / В.И. Ефременко, И.М. Климова, E.H. Трофимов // Журн. микробиол. 1989. - № 7. - С. 62-66.
38. Ефременко, В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней / В.И. Ефременко // Журн. микробиол. 1997. - №2. - С. 102-106.
39. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях / В.И. Ефременко. Ставрополь, 1996. - 131 с.
40. Ефременко, В.И. Новые препараты для диагностики и ветеринарно-санитарного мониторинга / В.И. Ефременко, A.B. Брыкалов, И.В. Жарникова // Пища. Экология. Человек: Тез.докл. междун. научн.-технич. конф. — Москва, 1995.-С. 206-207.
41. Ефременко, В.И. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов / В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь, E.H. Трофимов //Журн. микробиол. 1989. -№ 12. - С. 100-105.
42. Ефременко, В.И. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов / В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь, E.H. Трофимов, В.Ю. Перов // ЖМЭИ. 1989. -№ 12. - С. 100-106.
43. Ефременко, В.И. Разработка технологической линии производства в методах иммуноанализа микроорганизмов / В.И. Ефременко, И.С. Тюменце-ва, Н.Ф. Василенко: Заключительный отчет о НИР, инв. № 02.9.70001181. -Ставрополь, 1996. 96 с.
44. Жарникова, И.В. Носители биотической и абиотической природы для иммобилизации антител и конструирования диагностикумов / И.В. Жарникова // Биотехнология. 2005. - №1. - С. 27-33.
45. Иммуноферментный анализ / Под редакцией Т.Т. Нго, Г.М. Ленхоффа. -М., 1988.-С. 25-167.
46. Инструктивно-методические указания по лабораторной диагностике холеры. -М., 1984.- 112 с.
47. Калашников, И.А. Особенности лептоспироза в Краснодарском крае / И.А. Калашников, В.М. Мезенцев, М.О. Мкртчан, Г.М. Грижебовский и др. // Реф. журн. 2006. - Св. том № 5. - С. 5.
48. Калинин, А. В. Социально-экономическая оценка лептоспироза и геморрагической лихорадки с почечным синдромом во Владивостоке / A.B. Калинин И.Л. Шаханина, С.А. Сокотун, P.A. Слонова // Эпидемиология и инф. болезни. -2002.-№ 1.-С. 32-35.
49. Калюжин, О.В. Производные мурамилпептида в эксперименте и клинике /О.В. Калюжин // Журн. микробиологии 1998. - № 1. - С. 104-108.
50. Карпов, С.П. Гипериммунные сыворотки / С.П. Карпов, С.М. Прегер, Г.Е. Синельников Томск, 1976. - 378 с.
51. Кейтс, М.Техника липидологии / М. Кейтс. М. Мир, 1975. -С. 68-82.
52. Кельцев, Н.В. Основы адсорбционной техники / Н.В. Кельцев. М: Химия, 1984.-С. 280.
53. Киселева, И.Н. Постановка ИФА для серодиагностики сифилиса / И.Н.Киселева, В.Н. Беднова, Г.А. Дмитриев // Вестн. дерматол. — 1998. -№ 1.-С. 36-42.
54. Климова, В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений / В.А. Климова // 2-е изд. доп. М., 1975. - 223 с.
55. Клячко-Гурвич, A.A. Методы определения удельной поверхности / A.A. Клячко-Гурвич. Из-во АН СССР, 1964. - № 10. - С. 1885.
56. Коваленко, Г.А. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов / Г.А. Коваленко, О.В. Комова, A.B. Симаков // Биотехнология. -2002.-№3.-С. 55-66.
57. Костенко Ю.Г. К проблеме губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота / Ю.Г. Костенко // Ветеринария. 1995. - № 5. - С. 7-9.
58. Котровский, A.B. Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса: Дис.канд.мед.паук / A.B. Котровский. — М., 1986.- 195 с.
59. Крюченников, В.Н. Простой тест для серологической верификации боррелиоза / В.Н. Крюченников // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1998. - № 4. - С. 35-36.
60. Кузякова, JI.M. Методологические подходы и разработка технологии липосомальных лекарственных и лечебно-профилактических препаратов: Дис. д-ра фармац. наук / JI.M. Кузякова Пятигорск, 2000. - 326 с.
61. Кулаков, Ю.К. Молекулярные основы вирулентности бруцелл / Ю.К. Кулаков, М.М. Желудков // Молекуляр. генетика, микробиол. и вирусол. — 2001.-№4.-С. 8-12.
62. Кунижев, С.М. Научные основы биотехнологии получения антибактериального ранозаживляющего средства / С.М. Кунижев, С.Ф. Аполохова // Биотехнология состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Международного Конгресса. - М., 2002. - С. 73.
63. Кунижев, С.М. Разработка способа получения универсальной матрицы для энтеросорбентов / С.М. Кунижев, О.В. Воробьева, Е.В. Денисова // Биотехнология- состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Международного Конгресса. — М., 2002. С. 75.
64. Ласкорина, Б.Н. Сорбенты на основе силикагеля в радиохимии. Химические свойства. Применение / Б.Н. Лакорина. М. Атомиздат, 1977. - 304 с.
65. Лебедев, В.В. Иктерогеморрагический лептоспироз / В.В. Лебедев, М.Г. Авдеева, М.Г. Шубич, Ю.В. Ананьина. Краснодар. Советская Кубань. -2001.-209 с.
66. Лептоспироз животных. / Ю.В. Малахов, А.Н. Панин, Г.Л. Соболева. -2001. ДИА-Пресс, Ярославль. - С. 584.
67. Лептоспироз. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сборник санитарных и ветеринарных правил / Госкомсанэпиднадзор России, Минсельхозпрод России. Москва, 1996. — С. 136-147.
68. Лисичкин, Г.В. Достижения, проблемы и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ / Г.В. Лисичкин // Журн. Всесоюз. хим. общества им. Менделеева. 1989. - Т.34. - № 3. - С. 291-297.
69. Масько, A.A. Иммобилизация трипсина на углеволокнистых носителях, различающихся структурой, пористостью и химией поверхности / A.A. Масько, A.A. Морозова, Л.К. Лыга // Прикладная биохимия и микробиология. М., Наука, 1992. - Том 28. - №2. - С. 211-216.
70. Машковский, М.Д. Лекарственные средства. / М.Д. Машковаский. — Т 2. -2005. -751 с.
71. Мельник, Г. В. Особенности центральной и периферической гемодинамики у больных лептоспирозом / Г.В. Мельник, P.E. Андреев // Эпидемиология и инф. болезни. 2003. - № 3. - С. 43 -45.
72. Мельник, Г. В., Жукова Л. И. Особенности поражения печени при лептоспирозе // Эпидемиология и инф. болезни. 2001. - № 3. — С. 42-44.
73. Методические рекомендации «Обезболивание животных в эксперименте» / Сост. В.В. Карпенко, В.И. Сачков; М., 1985. 53 с.
74. Методические рекомендации «Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов» /Сост. В.Г. Пушкарь, И.М. Климова, В.И. Ефременко. Волгоград, 1984. - 15 с.
75. Методические указания от 03.07.2002 N МУ 3.1.1128-02.- 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами. М, 2002. - 38 с.
76. Методические указания. Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами. -М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. -44 с.
77. Муромец, В.И. Иммобилизованные олигомерные ферменты / В.И. Муромец, Н.К. Наградова. М: Наука, 1984. - С. 10.
78. Нагорнов, Д. В. Лептоспироз в Ярославской области: эпидемиологические и эпизоотологические аспекты / Д.В. Нагорнов, Г.В. Ющенко, Т.А. Дружинина, Т.Т. Сироткина и др. // Эпидемиология и инф. болезни. 2002. -№5.-С. 28-32.
79. Нафеев, А. А. Лептоспироз в антропургических очагах в Ульяновской области / A.A. Нафеев // Эпидемиология и инф. болезни. 2001. - № 2. С. 35-39.
80. Нафеев, A.A. Значение иммунолабораторных исследований в диагностике природноочаговых инфекционных болезней / A.A. Нафеев // Журн. Клиническая лабораторная диагностика. — М., Медицина, 2006. — № 1. С. 36-37.
81. Никитин, В.М. Химия древесины и целлюлозы. / В.М. Никитин, A.B. Оболенская, В.П. Щеголев. М., 1978. - С. 145-148.
82. Никишина, Н. М. Лептоспирозы в Ульяновской области / Н.М. Никишина, A.A. Нафеев, В.М. Краснов, Л.Л. Степанова и др. // Эпидемиология и инф. болезни. 2002. -№ 1. - С. 48-52. •
83. Носков, Ф.С. Очистка конъюгатов от непрореагировавшего флюоро-хрома: Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Ф.С. Носков / Под ред. Т.В.Перадзе, П.Халонена. М., 1985.- С. 254.
84. Олсуфьев, Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. / Н.Г. Олсуфьев. М: Медицина, 1975. — 192 с.
85. Ометов, В.К. О применении иммуноферментного анализа в диагностике сифилиса / В.К. Ометов, М.П. Моргуль, Е.В. Уразовская // Вестн. дермат.-1997. -№3.- С. 24-35.
86. Онищенко, Г.Г Заболеваемость зооантропонозными и природноочаго-выми инфекциями и меры по их профилактике / Г.Г. Онищенко, A.A. Монисов, Л.П. Гульченко, Ю.М. Федоров // Журн.микробиол. 1999. - № 4. -С. 14- 18.
87. Онищенко, Г.Г. Контроль за инфекционными заболеваниями -стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке / Г.Г. Онищенко // Эпидемиология и инф. болезни. 2002. - № 6. - С. 4-15.
88. Онищенко, Г.Г. Об эпидемиологической ситуации и заболеваемости природно-очаговыми инфекциями в Российской Федерации и мерах по их профилактике / Г.Г. Онищенко // Журн. микробиол. 2001. — № 3. - С. 22-28.
89. Онищенко, Г.Г. Проблемы эпидемиологии ской безопасности в регионе Южного федерального округа России. / Г.Г. Онищенко, Г.М. Грижебов-ский, В.И. Ефременко. М., 2003. - 446 с.
90. Онищенко, Г.Г. Санитарно-противоэпидемическое обеспечение населения в чрезвычайных ситуациях. / Г.Г. Онищенко, С.Д. Кривуля, Ю.М. Федоров Ю.М. Москва, 2006. - С. 551.
91. Онищенко, Г.Г. Эпидемиология и профилактика лептоспирозов. / Г.Г. Онищенко, Н.М. Благовещенская, Ю.М. Ломов. Ростов-на-Дону, 2004.-148 с.
92. Пат. № С1 2192265 РФ, МКИ А61К35/30. Способ получения комплекса фосфолипидов / В.И. Ефременко, В.В. Оверченко, E.H. Мисетова, Т.В. Таран и др. (РФ) Заявка № 2192265; Заявлено 12.04.2000; Опубликовано 10.11.2002;-5 с.-Бюл. № 31.-2002.-С. 114.
93. Пат. № 2153173. Способ микробиологического мониторинга стоячих водоемов / В.И. Ефременко, И.С. Тюменцева, В.В. Бинатова, Д.В. Сергеев и др. (РФ) Бюл. № 20 от 20.07.2000.
94. Першина, JI.A. Модификация лигнина смешанными ангидридами ал-килфосфористых и карбоновых кислот / Л.А. Першина, Н.И. Царев // Изв. Томского политехнического института, Томск, 1995, Т. 190. — С. 20-28.
95. Першина, Л.А. Свойства лигнина, выделенного с помощью ультразвуковых колебаний / Л.А. Першина, Б.А. Янковский // Изв. Томского политехнического института. Томск, 1969, — Т. 196. - С. 160.
96. Плаксин, Г. В. Способ получения пористого углеродного материала. / Г.В. Плаксин, В.А. Левицкий, А.К. Чернышев, Д.В. Шипицын и др. RU БИПМ № 30 от 27.10.2005. - 130 с.
97. Подзолкова, Г.Г. Применение количественной иммунофлуоресценции для определения адсорбционной способности магнитных иммуносорбентов / Г.Г. Подзолкова, И.М. Климова, В.И. Ефременко // Журн. микробиол. 1988. -№ 5. - С. 56-58.
98. Полтавченко, А.Г. Использование золей серебра как маркеров имму-ноанализа на микротитровальных планшетах / А.Г. Полтавченко, B.C. Караваев, Ф.В. Тузиков // Журн. микробиол. 1998. - № 2. - С. 108-111.
99. Практическая химия белка. М. Мир, 1989. - С. 300-301.
100. Рахманов, А.И. Проблема бродячих собак в городах / А.И. Рахманов // Ветеринарная патология. № 1. — 2002. - С. 136-140.
101. Регистр лекарственных средств России. / Гл. ред. Ю.Ф.Крылов, 1993. — 698 с.
102. Родина, JI.B. Состояние природных очагов лептоспирозов на территории Москвы в 1995-2004 годах / JI.B. Родина, В.В. Тимошков, JI.A. Цвиль, Г.В. Маненкова и др. // ЖМЭИ. 2006. - № 2. - С. 78-81.
103. Рыбаков, С.С. Диагностика и мониторинг губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота / С.С. Рыбаков, A.A. Рябоконь, A.A. Егоров и др. //Ветеринария. 1993. -№2. - С. 17-21.
104. Салдан, И. П. Вспышки лептоспироза на территории Алтайского края / И.П. Салдан, Г.Б. Евдокимова, C.B. Гулай, Е.И. Рехов и др. // Эпидемиология и инф. болезни.-2001.-№2.-С. 41-45.
105. Самсоноваа, С.А. Методы ПЦР для паспортизации и классификации микроорганизмов / С.А. Самсонова, В.В. Самсонов, М.Ю. Гудима // Биотехнология состояние и перспективы развития: Материалы 1-го Междунар. Конгресса.-М., (14-18 октября) 2002.-С. 176-177.
106. Смирнов, В.В. Научные основы производства диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) /В.В. Смирнов, В.Я. Чаплинский, З.М. Андреева. Киев: Наукова Думка, 1980. - 195 с.
107. Стоев, К.Г. Новый количественный иммунофлуоресцентный метод определения IgE с помощью специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа / К.Г. Стоев, В.А. Чибисова, К.А. Шаханина // Журн. иммунология. М, 1981. -№ 1. - С. 85-88.
108. Сухоруков, A.M. Изучение сорбционных свойств полистироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анализе / A.M. Сухоруков, A.M. Пономарева// Журн. микробиол. 1987. - № 9. - С. 18-22.
109. Тамбовцев, Е.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций / Е.П. Тамбовцев, С.Г. Ахметкалиев, Н.П. Пятницкий // Журн. микробиол. 1969. -№ 10. - С. 26-31.
110. Темишевская, Л.Я. Использование техники иммобилизации клеток для непрерывного культивирования токсинообразующих анаэробов / Л.Я. Темишевская // Журн. микробиол. 1995. - № 6. - С. 21-22.
111. Тимошков, В.В. Результаты двадцатилетнего мониторинга природных и антропургических очагов лептоспирозов в Москве / В.В. Тимошков, Г.М. Маненкова, Л.В. Родина, М.Г. Ляпина // Дезинфекц. Дело. 2004. № 1. -С. 39-43.
112. Тишин, A.M. Пористый магнитный сорбент / A.M. Тишин, Ю.И. Спич-кин // БИПМ. № 9. - 2004. -643 с.
113. Тривен, М.И. Иммобилизованные ферменты. / М.И. Тривен. М:Мир, 1983.-23 с.
114. Тюменцева, И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций: Дисс. . доктора мед. наук / И.С. Тюменцева. Ставрополь, 1996. - 327 с.
115. Тюменцева, И.С. Усовершенствование производственной схемы иммунизации животных моно- и поликомпонентными антигенами / И.С. Тюменцева, Е.В. Жданова, E.H. Афанасьев Ставрополь, 1994. - -Деп. в ВИНИТИ 04.11.94, № 2507. - В94. - 15 с.
116. Фрайфелдер, Д. Физическая биохимия. / Д. Фрайфелдер. М: Мир, 1980-73 с.
117. Хмельницкий, Р.А. Физическая и коллоидная химия. / Р.А. Хмельницкий. -Изд. Высшая школа. -М., 1988. С. 342-343.
118. Хохлова, Т.Д. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах / Т.Д. Хохлова, Л.Г. Гаркавенко, Ю.С. Никитин // Прикладная биохимия и микробиология. М., Наука. 1991. - Т. 27. -№ 5. - С. 720-724.
119. Черкасов, А.Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А.Н. Черкасов, В.А. Пасечник. Л., 1991.-239 с.
120. Честнова, Т. В. Два случая листериоза, диагностированных в Тульской области / Т.В. Честнова // Эпидемиология и инф. болезни. — 2002. — № 2. -С. 39-42.
121. Шаршунова, М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической медицине // М. Шаршунова, В. Щварц, Ч. Михалец В 2 х ч. — М.: Мир, 1980.-4.2.-379 с.
122. Шаханина, К.Л. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистирола для проведения иммуноферментного анализа / К.Л. Шаханина, А.А. Соколенко, И.П. Павлова // Журн. микробиол. 1987. -№9-С. 86-89.
123. Шаханина, К.Л. Приготовление люминесцирующих антител: Имму-нофлуоресценция в медицине. / К.Л. Шаханина. М. ¡Медицина, 1977. -С. 23-46.
124. Шаханина, К.Л. Приготовление сефарозных пневмококковых диагно-стикумов и их использование в клинике легочных заболеваний / К.Л. Шаханина, И.В. Походзей // Журн. микробиол. 1978. - № 3. - С. 75-79.
125. Швец, В.И. Липиды в лекарственных препаратах / В.И. Швец, Ю.М. Краснопольский // Вестн. АМН СССР. -1990. № 6. - С. 19-28.
126. Anaokar, S. Solid-phase enzyme immunoassay for serum ferritin / S Anaokar, P.J. Garry, J.C. Standefer //Clin.Chem. 1979. - Vol.25. - P. 14261431.
127. Bricker, B.J. Molecular Characterization of Brucella Strains Isolated from Marine Mammals / B.J. Bricker, D.R.Ewalt, A.P. MacMillan et al. // J. Clin Microbiol. 2000. - Vol.38(3). - P.1258-1262.
128. Bushway, R.J. / R.J. Bushway, L.B.Perkins, H.L. Hurst, B.S.Ferguson // Food chemistry. 1992. - Vol. 43. - P. 283.
129. Camargo, Z. Magnetic enzyme-linked immunosorbent assay (Melisa) for determination of specific IgG in paracoccidiodomycosis / Z. Camargo, J.L. Guesdon, E. Drouhet // Sabouraudia. 1984. - Vol.22, №4. - P.291-299
130. Clark, M.F. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus / M.F. Clark, A.N. Adams // J. Gen. Virol. 1977. - Vol.36, №3. - P.475-483.
131. Coons A.H. The demonstration of pneumococcal antigens in tissue for the use of fluorescent antibody / A.H. Coons, H.G. Greech, A.N. Gones et al. // J.Immunol.- 1942. -Vol. 45, №3.-P. 159-170
132. Effler, P.V. Evaluation of the indirect hemagglutination assay for diagnosis of acute leptospirosis in Hawaii / P.V. Efiler, H.Y. Domen, S.L. Bragg, Aye Tin et al. //Journal of Clinical Microbiology. -2000. -№38. P. 1081-1084
133. Engvall, E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G / E. Engvall, P. Perlmann // Immunochemistry. 1971.-Vol.8., №9. - P. 871-879.
134. Eremenko, E.I. Scheme for solation and identification of Bacilus anthracis / E.I. Eremenko, N.P. Buravtseva, O.I. Tsygancova et al. // Proceds of the 1st European Conference on Dangerous Pathogeus. — Wiuchester (England), 1999. — P. 43.
135. Faine, S. / S. Faine, B. Adler, C. Bolin, P. Perolat. Leptospira and leptospi-rosis. 2nd ed. MediSci Melbourne, 1999.
136. Fairbroter, J.M. Serologic interrelationship of Leptospira serovar and genus-specific antigens by enzyme-linked immunosorbent assay / J.M. Fairbroter // J. Clin Microbiol. 1984.-Vol. 20.-№6.-P. 1089-1093.
137. Ficapal, A. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate / A. Ficapal, B. Alonso-Urmeneta, J. Velasco et al. // Vet. Ree. 1995.-Vol. 5137, №6.-P. 145-147.
138. Gangadhar, N.L. A modified silver impregnation staining for leptospires / N.L. Gangadhar, M. Rajasekhar // Indian Veterinary Journal. 1998. - №75. -P. 349-351.
139. Hansen, G.R. Emerging Zoonotic Diseases / G.R. Llansen, J. Woodall, C. Brown, et al. // Emerging Infect.Diseases. 2001. - Vol. 7(3) P. 537.
140. Harding, N. Laboratory equipment digest / N. Harding // J. immunol. Meth.- 1982.-Vol.20.-№4.-P. 89-93.
141. Hayes, M.A. Flow-baased microimmunoassay / M.A.Hayes, T.N. Poison, A.N. Phayre et al. // Anal.Chem. 2001. - Vol. 73(24). - P. 902.
142. Hornung, M. A New Technology for an optimised supply of emerged microbial cultures / M. Hornung, M. Ludwic, H.P. Schmauder // 1-st International congress. Biotechnology state of the art and prospects of development. - Russia. -Moscow, 2002.-P. 202.
143. Janowski, F. Adsorbenzien and ratalistager / F. Janowski, W. Heger Porose et al. // Z.Cyem., 1979.-Vol. 19, №1.-P. 1-11.
144. Karlsson, K. Studies on the immunofluorescent technique as a diagnostic tool in bacteriology with special referense to the genera Francisella, Salmonella and Yersinia / K. Karlsson. Stockholm. - 1975. - 48 p.
145. Kiselev, M.V. Determination of cyclosporin A in 20 % ethanol by a magnetic beads-based immunofluorescence assay / M.V. Kiselev, Gladdilin, A.K. Melik, N.S. Nubarov et al. // Anal.Biochem. 1999. - Vol. 269 (2). - P. 393.
146. Kriz, K. Advancementstoward magneto immunoassays / K. Kriz, J. Gerhrke, D. Kriz // Biosens Biolectron. 1998. - Vol. 13 (7-8). - P. 817-823.
147. Kronick, P.L. Magnetic microspheres prepared by redox polymerization used in a cell separation based on gangliosides / P.L. Kronick, G.L. Campbell, K. Joseph // Science. 1978. - Vol.200. - P. 1074-1076.
148. Lea, T. Ugelstad J. Magnetic monosired polymer pasticles for fast and specific fractionation of human mononuclear cells / T. Lea, F. Vartdal, C. Davies //Scand. J. Immunol. 1985. - Vol.22, №2. - P. 207-216.
149. Levett, P.H. Leptospirosis / P.H. Levett // Clinical Microbiology Reviews, №14.-P. 296-326.
150. Levett, P.H. Two methods for rapid serological diagnosis of acute leptospi-rosis / P.H. Levett, S.I. Branch, C.U. Whittington, C.N. Edwards et al. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001. - №8. - P. 349-351.
151. Lowe, C.R. Affinity Chromatography / C.R. Lowe, D.G. Dean // London-New-York-Toronto: Wiley-Intersci. Publ., 1974.-P. 135.
152. Lu, Q. Study on double antigens sandwich enzyme immunoassay for detection of Brucella specific antibodies in human and animals / Q. Lu, W. Zhang, Z. Hao // Chung. Hua. Liu. Hsing. Ping. Hsueh. Tsa. -Chih. 1999. - Vol. 20 (2). - P. 21-118.
153. Marshall, J.D. Superiority of fluoresceinisothiocyanate (Riggs) for fluorescent antibody technic with a modification of its application / J.D. Marshall, W.C. Eveland, S.W. Smith // Proc.Soc. exp. Biol. Med. 1958. - Vol. 98, №4. -P. 898-900.
154. Maruyama, S. Seroprevalence of Bartonella henselae and Toxoplasma gondii amond healthy individuals in Thailand / S. Maruyama, S. Boonmar, Y. Morita // J. Vet.Med.Ski. 2000. - Vol. 62, №6. - P. 635-637
155. Matar, G.M. Rapid laboratory confirmation of human brucellosis by PCR analysis of a target sequence on the 31-kilodalton Brucella antigen DNA / G.M. Matar, I.A. Khneisser, A.M. Abdelnoor // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34 (2).-P. 477-478.
156. Matsunaga, T. Chemiluminescence enzyme immunoassays using protein A-bacterial magnetite cjmplex / T. Matsunaga, H. Takeuyama, S Kamiya. et al. // J. Of Magnetism and magnetic Materials, 1999.-Vol. 1-3.-P. 126-131.
157. Moreno, E. Purification and characterization of smooth and rouh lipopo-lisaccharides from Brucella abortus / E. Moreno, M.W. Pitt, L.M. Jones et al. // J. Bacterid. 1979. - Vol.138, №2. - P. 361-369.
158. Molday, R.S. Application of magnetic microspheres in labelind and separation of cells / R.S. Molday, S.P.S. Jen, A. Rembaum // Nature. 1977. - Vol. 268. -P. 437-438.
159. Morner, T. The use of FA-technique for detection Francisella tularensis in formalin fixed material. A method useful in routing post morton work / T. Morner //Acta Veterinaria Scand. 1981. - Vol. 22. - P. 296-306.
160. Muller, J. Factors affecting the activity of immobilized enzymes. Diffusional limitation / J. Muller, G. Pfleiderer // Hoppe-Seylers Ztschr.physiol. Chem. 1980. -Vol. 361, №5.-P. 675-680.
161. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22. - №4. -P. 1084-1092.
162. Nielsen, K. Standartization of smooth lipopolysaccharide preparations for use in diagnostic serological tests for bovine antibody Brucella abortus / K.Nielsen, L.Kelly, M. Mallory // J. Immunoassay 1998. - Vol. 19, №4. -P. 239-250.
163. Nielsen, K.H. Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis / K.H. Nielsen, L. Kelly, D. Gall et al. // Vet. Immunol. Im-munopathol. 1995. - Vol. 46(3-4). - P. 285-291.
164. Ocholi, R.A. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for screening cattle for Brucella antibodies in Nigeria / R.A. Ocholi, C.D. Ezeokoli, O.O. Akerejola et al. // Vet. Q. 1996. - Vol. 18(1). - P. 22-24.
165. Ouchterlony, O. Antigen-antibody reactions in gel / O. Ouchterlony //Acta path, microbiol. med. 1949. - Vol. 26. - P. 507-515.
166. Paulo, P.S. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in argentina / P.S. Paulo, A.M. Vigliocco, R.F. Ramondino et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - Vol. 7(5). - P. 31-828.
167. Pick, U. Liposomes with a large trapping capability prepared by freezing / U. Pick//Arch. Biochem. andBiophys, 1981. Vol. 212. - P. 186-194.
168. Ramadass, P. A rapid latex agglutination test for detection of leprospiral an-tibodis / P. Ramadass, B. Samuel, K. Nachimuthu // Vet. Microbiol, 1999. Vol. 70, №1-2.-P. 137-139.
169. Richardson, J. The use of coated paramagnetic particles as a physical labels for use in magetj-immunossays / J. Richardson, P. Hawcins, R. Luxton // Biosens Bioelectron, 2001.-Vol. 16.-P. 989.
170. Richardson, J. A novel measuring system for the determination of para-magnttic particles labels for use in magetj-immunossays / J. Richardson, A. Hill, R. Luxton et al. // Biosens Bioelectron, 2001. Vol. 16. - P. 1127.
171. Riggs, J.L. Isothiocyanate compounds as fluorescent labelling agents for immune serum / J.L. Riggs, R.J. Sciwald, J.H. Burckhalter et al. //Am.J.Path. -1958.-Vol. 34, №6.-P. 1081-1097.
172. Sehgal, S.C. Evaluation of Leptospira Micro Capsular Agglutination Test (MCAT) for sero-diagnosis of leptospirosis / S.C. Sehgal, P. Vijayachari, Vol. Subramaniam// Indian Journal of Medical Research, 1997. №106. - P. 504-507.
173. Singh, S.V. Comparative evaluation of a field-based dot-ELISA kit with three other serological tests for the detection of Brucella antibodies in goats / S.V. Singh, Vol.K. Gupta, N. Singh // Trop. Anim. Health. Prod. 2000. -Vol. 32(3).-№155.-P. 63.
174. Smits, H.L. Lateral-flow assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis / H.L. Smits, C.K. Eapen, S. Sugathan, M. Kuriakose et al. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2001. -№8 P. 166-169.
175. Spenser, L. Study explores health risks and the human animal bond / L. Spenser// J.Am.Vet.Assoc., 1992.-№201. P. 1669.
176. Staak, С. Comparison of the results from commercially available Brucella ELISA test kits for the investigation of bovine sera / C. Staak, A. Draeger, P.Bahn, C. Dorn et al. // Berl. Munch Tierarztl. Wochenschr. 1997. -Vol. 110(6).-P. 206-210.
177. Steibuch, G. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of ca-prilic / G. Steibuch, R. Andran // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. 1969. -Vol.139.-P. 279-284.
178. Шторц, X. Иммунофлуоресценция / X. Шторц // Иммунологические методы. -М., Изд-во Медицина, 1987. С. 128-148.
179. Tanaka, T. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity immunoassay using bacterial magnetic particles / T. Tanaka, T. Matsunaga // Biosens Bioelectron. -2001.-P. 1089.
180. Taylor, D. The thermal expansion behaviour of the framework silicates / D. Taylor // Mineral.Mag. 1972. - Vol. 38, №297. - P. 593-604.
181. Tcherneva, E. Differentiation of Brucella species by random amplified polymorphic DNA analysis / E. Tcherneva, N. Rijpens, B. Jersek et al. // J. — Appl. -Microbiol. 2000. - Vol. 88 (1). - P. 69-80.
182. Torchilin, Vol.P. Coating liposomes with protein decreases their capture by macrophages / Vol.P. Torchilin, Vol.R. Berdichevsky, A.A. Barsukov, Vol.N. Smirnov // FEBS Lett. 1980. - Vol.111, №1. — P. 184-188.
183. Turkova, J. Leakage of the coupled affinant / J. Turkova // J. Chromatogr. -1978.-Vol. 12.-P. 189.
184. Udomsakdi, S. The diagnosis of leptospirosis by fluorescent antibody technique using saprophytic leptospira as a genus-specific antigen / S. Udomsakdi, U. Potha // Journal of the Medical Associaion of Thailand, 1972. -№55. P. 101-104.
185. Voller, A. A microplate enzyme immunoassay for toxoplasma antibody / A. Voller, D.E. Sidwell, A. Bartlett et al. // J. Clin. Pathol. 1976. - Vol. 29, №2. -P. 150-153.
186. Warburg, O. Isolierung und Kristallisation des Garugsterments Enolase / O. Warburg, W Christian. //Biochem. J. 1941.-Vol. 310.-P. 384-421.
187. Recommended Surveillance Standards. // WHO, 1999.
188. Human leptospirosis: guidance for diagnosis, surveillance and control. // WHO, 2003.
189. Williams, J.E. Use of ELISA to reveal rodent infections in plafue surveillance and control programmes / J.E. Williams // Bull. World Health Organ 1990. -Vol. 68(3).-P. 341-345
190. Woo, T.H. Identification of pathogenic Leptospira by TaqMan probe in a LightCycler / T.H. Woo, B.K. Patel, L.D. Smythe, M.L. Symondset al. // Annals of Biochemistry, 1998.-№256.-P. 132-134.
191. Yu, H. Comparative studies of magnetic particle-based solid phase fluorogenic and electrochemiluminescent immunoassay / H. Yu //J. Immunol. Methods. 1998. - Vol. 218 (1-2). - P. 1-8.
192. Zochowski, W.J. The use of ELISA in the diagnosis of human leptospirosis / W.J. Zochowski, S.A. Waitkins, M.F. Palmer // Israel Journal of Veterinary Medicine, 1987. -№43. -P. 330-337.
193. Zuerner, R.L. Differentiation of Leptospira interrogans by IS 15 00 hybridization and PCR assays / R.L. Zuerner, C.A. Bolin // Journal of Clinical Microbiology, 1997.-№35.-P. 2612-2617.
- Таран, Александр Владимирович
- кандидата медицинских наук
- Ставрополь, 2008
- ВАК 03.00.07
- Функционирование инфекционной паразитарной системы
- Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем
- Латексная тест-система для экспресс-диагностики лептоспирозной инфекции у собак
- Совершенствование методов лабораторной диагностики лептоспироза
- Эпизоотологический надзор при инфекционных зоонозах (сибирская язва, лептоспироз, бешенство) в Чеченской и Ингушской Республиках