Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные свойства клеточных структур культуральных бледных трепонем и научно-производственная разработка новых специфических диагностических препаратов на сифилис

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональные свойства клеточных структур культуральных бледных трепонем и научно-производственная разработка новых специфических диагностических препаратов на сифилис"

На правах рукописи

-"5 Л1 ^ I О V- "

а з оез да

ПОЖАРСКАЯ Виктория Олеговна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР КУЛЬТУРАЛЬНЫХ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ И НАУЧНО - ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ РАЗРАБОТКА НОВЫХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА СИФИЛИС

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Ставропольской государственной медицинской академии МЗРФ.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Беднова В.Н,

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Быков A.C.

доктор биологических наук, профессор Дмитриев Г.А.

доктор медицинских наук Меньшиков Д.Д.

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток

им.И.И.Мечникова РАШ

Защита диссертации состоится " в 1 Y часов на заседании Диссертационного совета Д.074.05.10 при ММА им.И.М.Сеченова (II988I, Москва, Г-435, Б.Пироговская ул., 2-6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им.И.М.Сече-нова по адресу: 119, Москва, Зубовский бульвар, 37/1

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета

Миронов А.Ю.

список сокращений

Ат-Треп-ИФТС - нммуноферментная тест-система, разработанная на

основе КСТ-антигена с определением в сыворотке крови человека антитрепонемных ¡аМ, антител для серодиагностики сифилиса (условно ИФТС)

ВС - внешняя среда

гжх - газожидкостная хроматография

ИФА - пммуноферментный анализ

КА - кардиолипиновый антлген

КБТ - культуральные бледные трелоиемы

ККВД - Краевой кожно-венерологический диспансер

КСР - комплекс стандартных реакций на сифилис

кст - клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем

(условно клеточные стенки трепонем)

мтпс - модифицированная тиоптиколепая питательная среда

ПББС - пептонный бульон из бычьих сердец

ПБТ - патогенные бледные трепонемы

ППС - печеночная питательная среда

Пер - питательная среда

РИТ - реакция иммобилизации трепонем

РИФ-абс - реакция иммунофтооресценции с абсорбцией

РСК - реакция связывания комплемента

СИ - средства измерения

СИН - степень иммунной недостаточности

ТПС - тиогликолепая питательная среда

УЗТА - ультраозпученный трепонемный антиген

УЗТАС - УТГА-сорбент для РИФ-абс

ФГУГТ - Федеральное государстаенное унитарное предприятие

ЦНИКВИ - Центральный научно-исследовательский кожно-пене-

рологическнй институт

ЦТ - содержимое цитоплазматпчсского цилиндра трепонем

(условно цитоплазма трепопем)

ЦТС - ЦТ-сорбент дат РИФ-абс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время к числу актуальных и сложных медицинских и социальных проблем, на решение которых направлены значительные усилия и средства здравоохранения, относится проблема борьбы с сифилисом. Отмечается рост числа заболеваний сифилисом Лак у нас в стране, так н за рубежом. Общепризнанно, что одним из направлений борьбы с сифилитической инфекцией, является повышение эффективности ее лабораторной диагностики, ведущее место в которой занимает серодиагностика.

Результаты исследований в области серодиагностики сифилиса на данный период проанализированы в целом ряде работ как отечественных (Беднова В.Н., Лосева А.К., 1985; Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекгорский В.В., 1987; Дмитриев ГА., Брагина Е.Е., 1996), так и зарубежных (Johonson P.C.,Famie MA., 1994; Larsen S.A. et ai., 1995,и др.) авторов. Полученные данные позволили, с одной стороны, определить комплекс диагностических тестов, предназначенных для массовых обследований на сифилис и диагностики различных клинических форм сифилитической инфекции, а, с другой стороны, использовать в тестах все более специфические трепонемные антигены.

Так в Российской Федерации регламентирован комплекс стандартных реакции (КСР) серодиагностики сифилиса, в который входит РСК со специфическим ультраозвученным трепонемным (УЗТА) и неспецифическим кардиолнпиновым (КА) антигенами. Известным ограничением РСК с УЗТА является недостаточные специфичность и чувствительность при ранних и поздних формах сифилиса, а достоинством - широкое ее использование в лабораториях любого уровня и возможность количественной оценки результатов (Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делектор-ский В.В., 1987).

Диагностика ранних, поздних и латентных форм сифилиса, а также дифференцирование неспецифических положительных результатов КСР обеспечиваются за счет постановки РИФ-абс, ее модификации с определением в сыворотке крови людей IgM, а также реакции иммобилизации трепонем (РИТ) (Борисенко К.К., Беднова В.Н. с соавт., 1990; Дмитриев Г.А., Брашна Е.Е., 1996; Oranne G., D'Hallwyn М.А., Larsen S.A., 1993).

Вместе с тем недостатком данных реакций являются технологическая сложность их обеспечения и высокая стоимость реализации. Кроме того, в настоящее время для данных тестов в нашей стране отсутствует решение задачи производственного выпуска антигенов (Дмитриев Г.А., Брапша Е.Е., 1996).

В последние годы разрабатываются, разработаны и применяются, как дополнительные, новые специфические тесты на сифилис - иммуно-ферментный анализ (ИФА) и его модификации с определением в сыворотке крови людей антитрепонемных IgM или IgG антител и реакция пассивной гемагглютинации (РИГА). Достоинством данных тестов является гюстаточная их чувствительность и специфичность, а к числу недостатков следует отнести отсутствие количественной оценки результатов реакций (ИФА, РПГА), сложность выделения и клонирования биохимических комплексов трепонем с различной молекулярной массой и высокая стоимость ИФА теста (Paris - Hamelin A. el al., 1985; Silletti R.P., 1995; Дмитриев Г.А., 1996; Беднова В.Н. с соавт., 1985). Выше перечисленные тесты в качестве антигена используют достаточно хорошо изученные дезинтеграты ПБТ, КБТ, выделенные из них химические фракции и биохимические комплексы с различной молекулярной массой.

Таким образом, решение задачи совершенствования серодиагностики сифилиса может быть получено на уровне использования трепонем-ных антигенов с известными функциональными свойствами в новых модифицированных тестах, на уровне использования новых трепонемных антигенов в известных, широко используемых тестах на сифилис и на уровне использования новых трепонемных антигенов в новых тестах на сифилис.

История развития серодиагностики сифилиса показывает, что наиболее значительные результаты были получены на последних двух уровнях. В этом направлении нами (Пожарская В.О., 1986) были проведены предварительные исследования по изучению антигенных свойств клеточных структур кулыуральных бледных трепонем, которые показали более высокую по сравнению с разрушенными клетками антигенность клеточных стенок и наружных фибрилл и перспективность их использования в РСК. Однако они не носили системного характера, были направлены на решение частной научной задачи и не доведены до уровня разработки препарата.

Актуальность дальнейшего изучения функциональных свойств клеточных структур КБТ подтверждается также результатами последних работ, в которых показана перспективность применения для серодиагностики сифилиса биохимических комплексов с различной молекулярной массой, выделенных из фибрилл (Petersen C.S. et al., 1981; Penn C.W. ei al., 1985) и наружных оболочек (Radoir Y.D., 1995; Antoni G. et al., 1996; Blanko D.R. ei al., 1995) патогенных трепонем. Выполненные исследования также носят предварительный характер, направлены на решение частных научных задач, связаны с использованием патогенных трепонем и не доведены до уровня реализации в диагностических тестах, при этом технология выделения биохимических фракций отличается сложностью и высокой стоимостью.

Изучение функциональных свойств культуральных бледных ipeno-нем с позиций методологии системного анализа позволяет дифференцировать их функциональные свойства и на этой основе, за счет полученной на новом уровне научной информации, теоретически обосновать, экспериментально и практически подтвердить диагностическую ценность разработанных специфических препаратов на сифилис. Решение задачи производственного выпуска, отличающегося простотой технологии получения и низкой стоимостью новых, более эффективных антигенов из клеточных'структур трепонем, обеспечит их широкое использование в практике серодиагностики сифилиса - в РСК, ИФА и РИФ-абс.

Многоплановые исследования функциональных свойств клеточных структур культуральных бледных трепонем являются актуальными не только для совершенствования серодиагностики, но и для определения перспективных направлений совершенствования лечения сифилиса.

Цель исследования - научно-производственная разработка новых, более эффективных диагностических препаратов на сифилис на основе использования установленных функциональных свойств клеточных структур культуральных бледных трепонем.

Задачи исследования:

1. Разработать методики производственного получения клеточных структур трепонем и определения их биохимического состава.

2. Определить функциональные свойства клеточных струюур трепонем при взаимодействии их с сыворотками крови людей, больных си-фшисом и свободных от сифилитической инфекции, и разработать на этой основе технологию безотходного производства новых диагностических препаратов на сифилис с использованием антигена из клеточных стенок и наружных фибрилл для РСК и ИФА тест-системы с определением в сыворотке крови людей антитрепонемных IgM и IgG антител с визуальным учетом результатов, а также сорбента из содержимого цитоплазма-тического цилиндра трепонем - дня РИФ-абс.

3.Изучить функциональные свойства клеточных структур трепонем при взаимодействии их с организмом здоровых животных и животных с экспериментальным сифилисом и разработать на этой основе технологию получения иысокоппражных контрольных положительных кроличьих сывороток на сифилис.

4.0ценить влияние in vitro клеточных стенок с фибриллами трепонем на Е-рецепторную активность лимфоцитов крови люден, больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции, и сравнить полученные результаты с влиянием известных иммунопрепаратов.

Научная новизна. В работе, с позиций системного анализа, теоретически обоснованы схемы изучения функциональных свойств клеточных «рукгур трепонем, реализация которых обеспечила получение новых научных результатов.

Разработана методика получения новой тиогликолевой питатель-нон среды на основе использования в ней экстракта пищевых дрожжей. Установлено, что данная среда активизирует функции роста и размножения бледных трепонем, обеспечивает одинаковый выход биомассы различных штаммов при сохранении стабильных антигенных свойств уль-траозвученного трепонемного антигена (УЗТА) и выделенных клеточных структур трепонем в процессе их производственного выпуска. Установлена зависимость стабильности антигенных свойств клеточных структур от способа разрушения клеток трепонем. Показано, что в условиях производственного выпуска, использование ультразвука для разрушения биомассы трепонем в разведении влажного осадка 1:10 обеспечивает высокую технологичность процесса, а выделенные из дезинтеграта клеточные структуры обладают высокой антигенной активностью и стабильностью характеристик.

Разработана новая методика определения моносахаров в клеточных структурах бактерий способом газожидкостной хроматографии, которая позволила определить как качественный и количественный состав, так и процентное соотношение моносахаров в клеточных структурах трепонем. Выявлено отсутствие в клеточных структурах трепонем галактозы и арабинозы, а наибольший процент Сахаров составили глюкоза и манноза. Это позволяет предположить их преимущественное содержание в гликолипндопротеиновых комплексах, что и может являться причиной низкой гетерогенности трепонем, определяя этим особенности клинического течения заболевания и иммунитета при сифилисе.

Доказано, что клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем, по сравнению с разрушенными клетками, обладают следующими функциональным» свойствами: меньшей антикомплементарностью и большими чувствительностью и специфичностью; при введении в организм здоровых кроликов - не вызывать выработку неспецифических антикардио-липиновых антител, а при введении в организм кроликов с экспериментальным сифилисом - активизировать его течение как в части развития специфического орхнта, так и в части выработки специфических и неспецифических (антикардиолшшновых) антител. Установлено функциональное свойство клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем повышать in vitro Е-рецепторную активность лимфоцитов крови людей, больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции.

Содержимое цитоплазматического цилиндра трепонем обладает функциональным свойством в большей мере по сравнению с разрушенными клетками абсорбировать групповые неспецифические антитела в сыворотке крови людей; при его введении в организм здоровых кроликов - не вызывать выработку неспецифических антикарднолнпиновых акт-тел, а при совместном введении с КСТ - подавлять выработку специфических антитрепонемных антител.

Практическая значимость.

!. Разработанные на основе системного анализа схемы изучения функциональных свойств клеточных структур КБТ могут быть использованы для изучения и других трепонемных антигенов.

2. Изученные функциональные свойства клеточных структур КБТ открывают новые возможности для дальнейшего совершенствования серодиагностики сифилиса, подхода к лечению и коррекции иммунного статуса,больных сифилисом.

3. Установленные более высокая чувствительность и специфичность клеточных структур и наружных фибрилл трепонем по сравнению с ультраозвученным трепонемным антигеном обосновали применение КСТ для повышения диагностической ценности РСК на сифилис, широко используемой в практике лабораторий различного уровня.

4. Впервые установлено функциональное свойство содержимого ци-топлазматнческого цилиндра трепонем абсорбировать групповые неспецифические антитела в сыворотке крови человека. Доказана большая абсорбционная емкость ЦТ по сравнению с УЗТА-сорбентом, что позволило предложить новый способ серодиагностики сифилиса, а использование нового сорбента в РИФ-абс на сифилис - повысить чувствительность и специфичность теста. Разработанная методика стандартизации нового сорбента при производственном выпуске позволила унифицировать постановку реакции и снизить трудозатраты.

5. Разработанный способ получения антигенов из культуральных бледных трепонем обеспечил решение задачи безотходного производства двух новых препаратов из клеточных структур трепонем.

6. Установленное наличие в клеточных стенках и наружных фибриллах трепонем групповых неспецифических антигенов позволило повысить специфичность КСТ-антигена с помощью аффинной очистки и разработать новую, более эффективную ИФА тест-систему с определением в сыворотке крови человека антитрепонемных 1§М, антител с визуальным учетом результатов. Обосновано применение новой ИФА тест-системы при диагностике и массовых обследованиях на сифилис в лабораториях любого уровня.

7. Методика получения новой модифицированной питательной среды для выращивания бледных трепонем снизила на 20% производственные затраты за счет увеличения выхода биомассы трепонем различных штаммов при сохранении их функциональных свойств.

8. Разработанный способ получения гнпериммунной положительной контрольной кроличьей сыворотки на сифилис обеспечил повышение рентабельности ее производства. Установленное функциональное свойство КСТ-антигена активизировать течение сифилитической инфекции теоретически обосновывает разработку нового подхода к лечению сифилиса.

9. Установленное функциональное свойство КСТ-антигена повышать in vitro Е-рецепторпую активность лимфоцитов крови больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции лиц обосновывает разработку нового иммунокорректора.

10. Диссертационная работа направлена па выполнение Общесоюзной программы 0.69.09 "Микроанализ" (1989-1993 г.г.), раздела "Усовершенствование лабораторной диагностики сифилиса, путем использования в качестве антигена клеточных структур культуральных бледных трепонем" (договор 39 "а", шифр 0.48/02, тема 3/131 /39"а"), Государственного заказа промышленным отраслям народного хозяйства на изделия медицинского назначения (1990-1995 г.г.) - на антиген из клеточных стенок трепонем (утв. МЗ РФ от 02.11.1989 г., шифр 20/10/75).

Внедрение в практику результатов научных исследований. Результаты проведенных исследований апробированы и внедрены в утвержденные на уровне ЦНИКВИ (г. Москва) "Регламент производства на антиген Пожарской из клеточных структур трепонем (КСТ) сухой дня РСК (N1), на сорбент сухой шш РИФ-абс на сифилис (N2)" (по заявке на патент N 96106615), "Регламент производства на тест-систему иммуноферментную для качественного выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека (АТ-'Греп-ИФТС), "Изменение к Регламенту производства сыворотки контрольной положительной, сухой для РСК (сыворотка положительная сухая)" (по заявке на патент N 95121709). Фармакопейные статьи н Инструкции но применению на выше перечисленные препараты находятся па утверждении в Фармакопейном Комитете РФ.

На ФГУП "Аллерген" (г.Ставрополь) осуществляется научно-производственный выпуск АТ-Треп-ИФТС, контрольных положительных сывороток для диагностики сифилиса по новой технологии.

Новая модифицированная питательная среда используется на ФГУП "Аллерген" при выпуске ультраозвученного трепонемного антигена для РСК в соответствии с Регламентом производства (по заявке на патент N 96103048).

Способ серодиагностики сифилиса по авторскому свидетельству N1650098 внедрен в Регламент производства на сорбент сухой для РИФ-абс па сифилис (N2) и его Фармакопейную статью.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клеточные стенки и наружные фибриллы культуральных бледных ¡репонем обладают следующими функциональными свойствами: более высокой по сравнению с разрушенными клетками чувствительностью, специфичностью и меньшей антикомплементарностыо, позволившими в РСК на сифилис повысить вдвое чувствительность, а при первичном се-ропегативпом сифилисе на 12,5% - диагностическую ценность (в среднем на 1,3%) и па 0,7% - специфичность теста. Применение КС'Г-антигена в

АГ-Треп-ИФТС с определением в сыворотке крови людей антитрепо-немных IgM и IgG антител с визуальным учетом результатов обеспечивает 100% специфичность теста, в то время как выпускаемые в Российской Федерации тест-системы IgG-ИФА и ИФА-анти-Люис имеют специфичность (96...97)%.

2. Клеточные сгенки и наружные фибриллы кулыуральных бледных трепонем при введении их в организм здоровых кроликов обладают функциональным свойством не вызывать выработку неспецифических антикардиолипиновых антител. При введении их в организм кроликов с экспериментальным сифилисом активизировать его течение, что теоретически обосновывает новый способ получения высокотитражной контрольной положительной кроличьей сыворотки на сифилис.

3. Содержимое цитоплазматичесхого цилиндра культуральных бледных трепонем обладает функциональным свойством в большей мере, по сравнению с разрушенными клетками, абсорбировать групповые неспецифические антитела в сыворотке крови людей. Это позволило при использовании ЦТ в качестве сорбента в РИФ-абс на сифилис повысить на 8,3% чувствительность теста при первичном серонегативном сифилисе и на 18.2% - специфичность неспецифических ложноположительных в КСР сывороток крови людей.

На введение ЦТ структур в организме кроликов не вырабатываются неспецифические антнкардиолипиновые антитела. При совместном введении их с КСТ-антигеном подавляется выработка специфических ан-титрепонемных антител, что теоретически обосновывает более высокую антигенность клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем по сравнению с разрушенными клетками.

4. Клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем обладают функциональным свойством повышать in vitro Е-рецепторную активность лимфоцитов крови людей, больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции, что позволяет обосновать гипотезу об иммунокоррек-тирующем влиянии КСТ на иммунную систему человека и определить перспективное направление совершенствования схем лечения сифилиса.

5. Научно-производственная разработка новых специфических да-: агностических препаратов на сифилис, которая включает методику получения новой искусственной питательной среды для выращивания трепонем, использование которой повысило рентабельность производства УЗТА на 20%; методики получения КСТ и ЦТ структур, их стандартизации, определения углеводного профиля; получение на основе КСТ высокотитражной положительной контрольной сыворотки на сифилис, позволившей повысить рентабельность их производства на (80...90)%.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы в центральных журналах, материалах съезда, международных конгресса, симпозиума и конференций, а также в сборниках научных трудов институтов и в одном авторском свидетельстве на изобретение.

Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании научно-координационного совета Ставропольском государственной медицинской академии при участии представителей кафедр иммунологии и вирусологии, дермато-веперологии, предетавшелей Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, ФГУП "Аллерген" (протокол N 3 от 19 ноября 1996 года). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на съезде, конгрессе, симпозиуме, международных, всероссийских и др. конференциях, перечень которых приведен в автореферате в разделе "Список работ, опубликованных по теме диссертации".

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 247 страницах машинописного текста, состоит из введения, девяти глав, заключения и списка литературы, включающего 355 источников (208 отечественных и 147 зарубежных авторов). Работа содержит 35 рисунков и 35 таблиц.

Основные теоретические и экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены автором. Исследования проводились также в соавторстве с соискателями ученой степени кандидата наук, работающими под научным руководством диссертанта. Техническое обеспечение экспериментальных исследований осуществлялось сотрудниками ФГУП "Аллерген", Краевого кожно-венерологического диспансера, иммунологической лаборатории Краевой клинической больницы (г.Ставрополь).

содержание работы

Материалы и методы исследования. Для получения клеточных структур использованы V, Vil, VIII, IX и Рейтер штаммы культураль-ных бледных трепонем, являющиеся представителями трех различных иммунологических групп (Гельцер P.P., Зебницкая Л.В., 1950). Для культивирования трепонем применяли как известные жидкие питательные среды различного происхождения, так и разработанную модифицированную тиогликолевую среду.

Клинико-лабораторные исследования проводились с 1729 сыворотками крови больных различными формами сифилиса и 1944 - лиц, свободных от сифилитической инфекции, а также с 185 образцами крови людей, из них 55 получены от больных с активными формами сифилиса.

В эксперименте на животных использовались 135 здоровых кроликов породы шиншилла, 296 кроликов с экспериментальным сифилисом. Клинико-лабораторные исследования проводились с 732 кроличьими антисыворотками, полученными к клеткам трепонем и их структурам.

В процессе научно-производственной разработки новых специфических диагностических препаратов на сифилис получены и исследованы 59

серий КСТ-aimircna для PC К и АТ-Треп-ИФТС, 21 серия ЦТ-сорбента для РИФ-абс, 10 серий КСТ-антигена для получения высокотитражных контрольных положительных сывороток, 9 серий КСТ и ЦТ для определения их биохимического состава, 5 серий КСТ для изучения их в нагрузочных тестах in vitro с лимфоцитами крови людей.

Изготовлено на ФГУП "Аллерген" 12 производственных серий 4-х новых препаратов (КСТ-антиген для РСК и АТ-Треп-ИФТС, ЦТ-сорбент для РИФ-абс и положительная контрольная сыворотка на сифилис, полу-ченная'по новой технологии).

Культивирование трепонем на разных питательных средах проводилось в соответствии с известными для каждой среды методиками (Овчинников Н.М. и др., 1970; Устименко Л.М., 1962; Сержантова Т.И., 1969; Пожарская В.О., 1995). Для получения клеточных структур КБТ проводили разрушение клеток биомассы трепонем методами баллистической и ультразвуковой дезинтеграции в соответствии с разработанными автором режимами в механическом гомогенизаторе Л-17 с "бусами" и с помощью ультразвукового генератора ULА-1000 (Чехословакия). Дез-инте1рированные клетки разделяли на структуры методом аналитического центрифугирования в режиме iO4 g в течении 30 мин. Содержимое ци-топлазматического цилиндра трепонем находилось в сулернатанте, а клеточные стенки и наружные фибриллы - в осадке центрифугата. Биохимический состав клеточных структур трепонем определяли: белок - по методу Лоури с модификацией Марквелла (1978), пентозы - по методу Биоля с использованием орцина (1967), нуклеиновые кислоты - методом Спирина с модификацией Цанаева (1961) и Майбаума (1983) и методом Дисше (1930), липиды - по унифицированной методике (1982), распределение фракций молекулярных масс дезинтеграта КБТ и их структур -методом хроматографии между двумя фазами в элементарном пространстве на Сефодексе - G-200 с регистрацией на LK.B (Швеция) по известной методике (Вуд В., 1983), моносахара - методом газожидкостной хроматографии по методике, разработанной автором (Пожарская В.О., 1996).

Определение чувствительности и специфичности антигенов проводили методом непосредственной оценки в реакциях РСК, РИФ-абс, ИФА по известным методикам (Овчинников Н.М., 1987; Беднова В.Н., 1987) с сыворотками крови людей, больных сифилисом и свободных от сифилитической инфекции.

Экспериментальный сифилис кроликов получали методом интратес-тикулярного заражения ПБТ по известной методике (Овчинников Н.М. и др., 1987),, иммунизация кроликов клеточными структурами КБТ стандартизировалась и проводилась по методике, разработанной автором (Пожарская В.О., 1995).

Определение субпопуляций лимфоцитов крови люден осуществляли по известной методике (Гришина Т.Н., 1980), изменение Е - розеткооб-

разования при иикубации лимфоцитов крови людей с КСТ н другими пммунопрепаратами - по известной методике (Лебедева К.А., Понякина ИД., 1990), а степени иммунной недостаточности - по методике (Земсков A.M., Земсков В.М., 1994).'

Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с требованиями ГОСТа 8.207-76 и рекомендациями (Мерков A.M. и Полякова Л.Е.,1974; Малета Ю.С.,Тарасов В.В., 1981).

Результаты исследований и их обсуждение. Впервые определение функциональных свойств клеточных структур трепонем проведено с использованием методологии системных исследований. Исходя из основных положении обшей теории систем, решена задача построения исследуемой системы. Определены цель функционирования системы, структура и взаимодействие ее с факторами внешней среды. Подсистема серодиагностики сифилиса и ее взаимосвязь с другими элементами системы представлена на рис.1.

Схемы изучения функциональных свойств клеточных структур трепонем и использования антигенов для научно-производственной разработки новых специфических диагностических препаратов на сифилис получены в результате решения задачи синтеза изомеров подсистемы организма человека (04), ПБТ, клеточных структур культуральных бледных трепонем и их моделей. Они явились структурной основой диссертационного исследования.

Установлено, что при культивировании бледных трепонем на искусственной питательной среде, активизация их функции роста и размножения обеспечивается композицией экстрактов различных дрожжей, в частности, за счет добавления в тиогликолевую питательную среду экстракта пишевых дрожжей. На этой основе была разработана мегодика получения новой, модифицированной тиогликолевой питательной среды (МТПС).

Сравнительный анализ выхода биомассы трепонем V, VII, VIII, IX и Рейтер штаммов из 1 дм3 культуры (табл.1) показал достоверно (Р<0,05) больший выход биомассы Рейтер штамма при выращивании его па печеночной питательной среде (ППС), V штамма - на пептонном бульоне из бычьих сердец (ПББС), достоверно (Р<0,01) меньший выход биомассы всех штаммов трепонем - на тиогликолевой питательной среде (ТПС) по сравнению с ППС.

Использование МТПС для выращивания трепонем обеспечило достоверно (Р<0,01) больший выход биомассы из 1 дм3 культуры всех штаммов по сравнению с ТПС, а VII, VIII, IX и Рейтер штаммов - по сравнению с ПББС. В отличие от ППС и ПББС, разработанная МТПС дает достоверно (Р<0,01) одинаковый выход биомассы всех исследуемых штаммов.

Применение новой питательной среды при производственном выпуске ультраозвученного трепонемного антигена и антигенов из клеточ-

Рнс.1. Подсистема серодиагностики сифилиса и ее взаимосвязь с другими элементами системы. (ИРР - индикатор результата реакции, НСА - нссиецнфичсский антиген, СА - специфический антиген, СКЧ - сыворотка крови человека, СКЖ-сыворотка крови животного).

Таблица 1

Выход биомассы исследуемых штаммов бледныхтрепонем ш 1 дм3 культуры при выращивании на различных искусственных питательных средах

NN п/п Штанин КБТ ИПС

ПББС ППС шс КГГПС

Число серии Культура КБТ в дм! Выход биомассы, г г ш±Д Число серий Культура КБТ в им3 Выход биомассы, в г т±Д Число серий Культура КБТ в гш! Выход биомассы, в Г т±Д Число серий Культура КБТ в зм! Выход биомассы, в г т±Д

1 V 9 34 1,43+0,29 р>0,01 6 11 1,55 ±0,43 р>0,01 6 11 1,00+0,14 р<0,01 13 28 1,45 ±0,28

2 VII 9 30 1,32+0,24 р<0,05 6 и 1,24 ±0,28 р<0,05 б 11 1,08 ±0,14 р<0,01 13 27 1,55 ±0,33

3 VIII 9 32 1,26± 0.24 р>0,01 6 11 1,40+0,45 р>0,01 6 11 1,1310,12 р<0,01 13 28 1,48 ±0,34

4 IX 9 38 0,9410,24 р<0,01 6 10 1,45 + 0,45 р>0,01 6 И 1,06 ±0,14 р<0,01 13 27 1,35 ±0,33

5 Рейтер 9 39 0,82+0.22 р<0,01 6 12 1,97 ±0,61 р>0,01 6 11 1,04 ±0,08 р<0,05 13 29 1,33+0,18

б Итого 45 173 1,16+0.22 р<0,01 30 55 1,64 ±0,30 Р>0,01 30 55 1,06 ±0,10 р<0,01 65 139 1,43 ±0,14

р - достоверность существенности различи модифицированной тиоглюсолевой среды

яых структур трепонем обеспечивает больший выход биомассы по сравнению с питательной средой из бычьих сердец и тиогликолевой средой, соответственно в 1,23 и 1,35 раза, н снижает затраты при производстве соответственно на 153% и 20% с сохранением антигенных свойств полученных препаратов.

Модифицированная питательная среда защищена заявкой на патент N 96103048 и внедрена в производство на ФГУП "Аллерген" г.Ставрополь.

Для изучения функциональных свойств клеточных структур трепонем впервые разработаны методики их получения и стандартизации в условиях производственного выпуска.

Установлено, что при баллистической дезинтеграции клеток, КСТ-антиген обладает нестабильностью антигенных характеристик. Так, при исследовании 5-ти экспериментально-производственных серий КСТ-антигена в РСК с сыворотками крови больных сифилисом получено 1,8% частичного и 0,5% случаев полного расхождения, а с сывортками крови людей, свободных от сифилитической инфекции, - 0,69% случаев полного расхождения результатов. В то же время при использовании ультразвуковой дезинтеграции в 5-ти сериях расхождений не выявлено. Кроме того, при ультразвуковой дезинтеграции выход КСТ-антигена из 1 грамма биомассы клеток на 12,5% выше, а его титр на 5,1% ниже, чем при баллистической дезинтеграции клеток. Это обусловлено потерей биомассы при выделении разрушенных клеток из механического гомогенизатора с "бусами". Предложенный в методике режим ультразвуковой дезинтеграции биомассы трепонем в разведенйи 1:10 в б раз сократил временные затраты на технологический процесс разрушения клеток.

Впервые разработана методика определения моносахаров в структурах бактерий способом газожидкостной хроматографии, которая была применена для определения моносахаров в клеточных структурах трепонем-

К новым научным данным относятся качественные и количественные характеристики моносахаров в клеточных структурах трепонем и определение процентного соотношения химических веществ в одном грамме сухого веса, которые представлены на рис.2 и 3. Так установлено, что в углеводный профиль трепонем не входят галактоза и арабино-за, а глюкоза и манноза находятся в наибольшем количестве и составляют в клеточных стенках и наружных фибриллах 74,8%, а в содержимом иитоплазматического цилиндра - 72,1 %.

Это обусловливает их преимущественное содержание в гликолипи-допротеиновых комплексах и может являться причиной низкой гетерогенности трепонем, определяющей особенности течения заболевания и иммунитета при сифилисе.

43,4

1 • пировиноградная кислота

2 - глюкоза

3 -манноза

4 - общие

неидентифицированные сахара

5 - отличающийся

неидентифицированный сахар

1 2 3 4 5

ит

Рнс. 2. Процентное соотношение Сахаров в клеточных структурах КСТ и ЦТ культуральных бледных трепонем.

50%

40%

30%

49,5

20%

10% - —

1 2 3 4 5 6 7 1 КСТ 2 3 4 5 ит 67 1234567 КБТ

■ белки 5- РНК

2- • общие липиды 6 ■ ДНК

3- лентоза 7- суммарные моносахара

4- • суммарные нуклеиновые

Рис. 3. Процентное соотношение химических веществ в 1 г. сухого веса структур КСТ, ЦТ и клеток КВТ.

Установлено, что низкая, по сравнению с клеточными стенками ан-тигенность цитоплазмы обусловлена, в том числе, большим в 1,6 раза отношением в ней липидов и моносахаров к белкам и наличием - ДНК.

Показано, что групповые неспецифическне антигены, удаленные из клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем путем аффинной очистки, содержат около 10% неспецифическнх белков и 90% липидов и полисахаридов. Полученные данные позволили обосновать пути дальнейшего совершенствования серодиагностики сифилиса на основе использования более эффективных антигенов из клеточных стенок трепонем.

Функциональные свойства КСТ-ангигена по сравнению с УЗТА в РСК характеризуются в 7 раз более низкой антикомплементарностью, вдвое большей чувствительностью при постановке количественной РСК (средние титры антител 1:73, 1:36 соответственно). КСТ-антиген в РСК с сыворотками крови больных сифилисом характеризуется (табл.2) большей в среднем на 1,3%, а при первичном серонегативном на 12,5% диагностической ценностью. Специфичность КСТ-антнгена составила 98,2%, что больше специфичности УЗТА на 0,7%.

Полученные новые научные данные о функциональных свойствах клеточных стенок и наружных фибрилл позволили разработать научно-техническую документацию на новый антиген из клеточных структур для РСК на сифилис. Регламент производства, Фармакопейная статья, Инструкция по применению и производственные серии препарата апробированы и утверждены ЦНИ'КВИ (г.Москва).

Впервые установлено функциональное свойство содержимого ци-топлазматического цилиндра трепонем связывать групповые неспецифические антитела в сыворотке крови людей. Доказано, что цитоплазма трепонем обладает большей, по сравнению с ультраозвученным трепо-немным антигеном-сорбентом, сорбционной емкостью и обеспечивает в качестве сорбента в РИФ-абс вдвое большую чувствительность, на 8,3% большую диагностическую ценность при первичном серонегативном сифилисе и на 7,9% большую степень позитивности теста (табл.3).

Специфичность РИФ-абс с ЦТ-сорбентом (табл. 4) больше в среднем на 0,6%, чем с УЗТА-сорбентом, а при исследовании неспецифически ложноположительных в КСР сывороток крови людей - на 18,2%. Большая сорбционная емкость ЦТ по сравнению с УЗТА-сорбентом объясняется более низкой ее антигенкостью, а, следовательно, и меньшим соотношением в ней специфических и неспецифическнх антигенов.

Полученные новые научные данные позволили предложить новый способ серодиагностики сифилиса, защищенный авторским свидетельством N 1650098, 1991 г. Разработана научно-техническая документация на получение нового сорбента для РИФ-абс на сифилис по безотходной технологии. Регламент производства, Фармакопейная статья, Инструк-

Таблица 2

Чувствительность КСТ-антигена в РСК с сыворотками крови больных сифилисом до лечения

Диагноз Число исследованных сывороток Совпадение результатов с КСР* Специфические антигены в РСК Эффективность в %

Расхождение резуль-т атов КСТ УЗТА КСТ УЗТА

по степени позитивности полное расхождение по степени позитивности полное расхождение по степени позитивности полное расхождение по степени позитивности полное расхождение

1. Сифилис первичный серонега-тивный 24 21 3 - 3 - - - 12,5 - -

2. Сифилис первичный серопози- 1 цтттлтт 88 15 10 6 2 1 1 6,8 2,3 1.1 1.1

3. Сифилис вторичный рецидив выв 149 149 - - - - - - - - -

4. Сифилис скрытии ранний 76 24 2 2 - - - 2,6 - - -

5. Сифилис скрытый поздний 33 32 1 1 - - 3,0 - - -

6. Нейро- сифилис 10 5 5 - - - - - - - - -

7. ИТОГО 380 338 26 16 9 " 5 1 1 2,4 1,3 0,26 0,26

8. Процента, соотношение 100 95,3 4,2 2,4 1,3 0,26 0,26

* Числитель - положительные результаты РСК, знаменатель - отрицательные результаты РСК

Таблица 3

Сравнительная оценка сорбентов ЦТ и УЗТА в РИФ-абс с сыворотками крови

больных сифилисом до лечения

Диагноз Число сывороток крови Сорбенты в РИФ-абс* Эффективность ЦТС в РИФ-абс, %

ЦТС УЗТАС

повышение позитивности сыворотки, ставшие положительными совпадение результатов расхождение результатов По степени позитивности теста Диагностики

1. Сифилис первичный серо-негативный 24 4 2 14 4 4 2 16,7 8,3

2. Сифилис первичный сер опознтивкыи 73 5 - М _5 6,8 -

3. Сифилис вто-ричзьш, свежий, ряттп ИНН 1ЛЛТ 114 4 - 110 _4 3,5 -

4. Сифилис скрытый, ранний 55 5 - 9.1 -

5. Сифилис скрытый ДЮЗДШ1Й 28 4 - .24 _4 14,3 -

6. Неиросифилис 10 ' 2 - 8 _2 20 -

7. ИТОГО 304 24 2 274 4 24 2 7.9 0,7

Числитель - положительные результаты Знаменатель - отрицательные результаты

Сравнительная оценка сорбентов ЦТ и УЗТА в РИФ-абс с сыворотками крови людей, свободных от сифилитической инфекции

Результаты РИФ-абс и КСР Исследования в РИФ" Специфичность , %

NN п/п Обследованные Число сывороток совпадение расхождение РИФ-5 РИФ-абс с сорбентами РИФ-5 РИФ-абс с сорбентами

ЦТС УЗТАС ЦТС УЗТАС

1. Беременные 48 "46 _2 1 1 ~2 1 97,9 100 100

2. Доноры 57 57 - - - - 100 100 100

3. Больные гонореей и обследуемые на сифилис 35 35 - - - - 100 100 100

4. Кожные больные 72 67 _5 4 1 ~5 1 4 94,5 100 98,6

5. Терапевтические больные 38 38 _ _ 100 100 100

б. Онкологические и инфекционные больные 69 65 _4 _3 1 ~4 1 3 95,7 100 98,6

7. ИТОГО 319 308 л 8 3 ~П 2 9 97,5 100 99,4

* Числитель - положительные результаты , знаменатель - отрицательные результаты

шш по применению к производственные серии препарата апробированы и утверждены ЦНИКВИ (г.Москва).

Предложенный автором способ получения КСТ-антигена и ЦТ-сорбента по безотходной технологии защищен заявкой на патент N96106615, отличается простотой производства и стандартизацией выпуска нового сорбента.

Доказано, что использование клеточных стенок и наружных фибрилл в И ФА тест-системе с определением в сыворотках крови людей ан-титрепойемных ^М, антител с визуальным учетом результатов повышает по сравнению с УЗТА в РСК диагностическую ценность теста при первичном сифилисе на 4,9% (табл.5) и обеспечивает 100% специфичность теста. Применение АТ-Треп-ИФТС на сифилис обеспечивает определение в сыворотке крови людей высокоспецифичных антитрепонемных антител, а визуальный учет результатов делает ее доступной для клинических и серологических лабораторий любого уровня, сокращая временные и трудозатраты. На новую АТ-Треп-ИФТС разработана научно-техническая документация - Регламент производства. Фармакопейная статья, Инструкция по применению препарата, которые утверждены ЦНИКВИ (г.Москва). Государственные испытания 3-х производственных серий новой АТ-Треп-ИФТС на базах ККВД и ЦНИКВИ установили при хорошей воспроизводимости 100% чувствительность и специфичность теста. Выпуск экспериментально-производственных серий АТ-Треп-ИФТА на сифилис осуществлен на ФГУП "Аллерген" в 1996 году.

Впервые установлено функциональное свойство культуральных бледных трепонем и их клеточных структур, а также инактивированных патогенных трепонем не вызывать при введении в организм здоровых кроликов выработку неспецифических - антикардиолипиновых антител (табл. 4).

Клеточные стенки и наружные фибриллы (табл. 6) обладают достоверно (Р< 0,01) большей антигенной активностью по сравнению с клетками и цитоплазмой трепонем при введении в организм здоровых кроликов (средние титры антител 1:100 ± 18, 1:80 ± 45, 1:27 ± 12 соответственно). Доказано, что цитоплазма трепонем при совместном введении с КС'Г (УЗТА) обладает функциональным свойством подавлять выработку специфических антител в организме здоровых кроликов (табл. 6).

При совместном введении клеточных стенок трепонем и кардиоли-пинового антигена в организме кроликов не вырабатываются антикар-днопипиновые антитела, но в то же время кардиолипиновый антиген является фактором, подавляющим выработку специфических антител в большей степени, чем цитоплазма трепонем (средние титры антител 1:16,0 ± 6,5 и 1:80 ± 45 соответственно). Полученные новые научные данные позволяют объяснить особенности иммунного ответа при первичном сифилисе, которые характеризуются более поздней, по сравненшо с дру-

Сравнительные данные по чувствительности новой ИФТС и РСК с сыворотками крови

больных сифилисом до лечения

Диагноз Число сывороток крови Число совпадения результатов * Расхождение результатов * Эффективность ИФТС с КСТ, %

Число случаев ИФТСсКСГ РСКеУЗТА

по степени позитивности полное расхождение по степени позитивности полное расхождение по степени позитивности диагностики

1. Сифилис первичный серо-недикБныи 24 "23 - - - - 4,1

2. Сифилис первичный серопозипгвный 120 115 _5 _4 - - 3,3 0,8

3. Сифилис вторичный свежил, рецидивный 233 ж - - - - - - -

4. Сифилис срытый ранний 106 106 - - - - - - - -

5. Сифилис скрыти поздний 64 ¿1 - - - 1.6 -

6. Нейросифилис 10 5 5 - - - - - - -

7. ВСЕГО 557 Ш 28 _7 _5 _2 - - 1,8 0,4

8. Процентное соотношение 100 - 2,2 1,8 0,4 - - - -

* Числитель - положительные результаты, знаменатель - отрицательные результаты РСК и ИФТС

Таблица б

Результаты количественной РСК с иммунными сыворотками крови кроликов

NN пЛ1 Антигены трепокем Число кроликов в опыте Количество введенного антигена, в (г, ыл) Дни исследования после последней имыунюацин

15 I 22

Средние титры антител в РСК

сУЗТА, х±А с КА, х±Д сУЗТА, х+Д сКА,

1. Клеточные стенки (КСТ)гыти шташоэ 38 0.031г 1:8(Ш8 - 1:!00±18 -

2. Содержимое цито-плазнатичесюэго (ЦТ) цилиндра пяти штаммов 15 0.031г 1:16±11 Р<0,001 - 1:27±12 Р<0,001 -

3. Клеточные стенки (КСТ) пяти штаммов С кардиолипиноы (КА) 13 0.031 +0.0004г (1,4 ыл) 1:11,0 ±9.7 Р<0.001 - 1: 16,0 ±6,5 Р<0.001 -

4. Ультраозвученные КБТ пяти шташов 19 0.056г 1:70±34 Р<0.05 - 1:80±45 Р<0.001 -

5. Живые клетки КБТ пяти шташов 20 0.056г 1:70±34 Р<0.001 - 1:Б0±45 р<0.001 -

6. Зернистые формы КБТ VII,IX, Рейтер штатов 12 7.5 (мл) 1:8.0±3.3 Р<0.001 - 1:13.0 ±6.8 Р<0.001 -

7. ПБТ шташа Ниюольса ин активированные 18 7.5 (ил) 1:26±П Р<0.001 - 1:43±34 Р<0.001 -

р- достоверность существенности различия КСТ-антигена

гимн инфекциями, выработкой достаточного количества антител для выявления их в РСК.

Новые знания могут быть использованы для уточнения развития иммунологических изменений в организме при сифилитической инфекции.

Впервые доказано функциональное свойство клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем при введении их кроликам с экспериментальным сифилисом активизировать процесс как в части развития сифилитического орхита, так и в части выработки большего количества специфических и неспецифических антител (табл.7).

Теоретически обосновано и экспериментально доказано положение о том, что контрольные положительные кроличьи сыворотки для РСК на сифилис могут быть получены только от кроликов с экспериментальным сифилисом, а получение гипериммунных сывороток обеспечивается дополнительным введением им клеточных стенок с наружными фибриллами культуральных трепонем.

На основании полученных данных разработан метод получения высокотиртажных положительных сывороток на сифилис (табл. 7,8), позволивший повысить рентабельность производства на (80..90)%. Новизна способа защищена заявкой на патент N 95121709. Разработана научно-техническая документация на новый метод получения контрольных положительных сывороток на сифилис. Изменения к Регламенту производства, Фармакопейной статье и производственные серии препарата, полученного по новой технологии, апробированы и утверждены ЦНИ'КВИ (г.Москва). В настоящее время научно-производственные серии препарата выпускаются на ФГУП "Аллерген" (г.Ставрополь).

Впервые установлено, что клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем обладают функциональным свойством акпгаизировать in vitro Е-рецепторы лимфоцитов крови людей, свободных от сифилитической инфекции, и корректировать степень иммунной недостаточности (рис. 4).

Доказано in vitro достоверно (Р< 0,05) не различимое влияние клеточных стенок трепонем и известного бактериального иммуномодулятора Кодивак на рецепторную активность лимфоцитов крови людей, свободных от сифилитической инфекции, что позволило впервые сформулировать гипотезу об иммунокорректирующих свойствах клеточных стенок трепонем в организме людей, не больных сифилисом.

Получены новые научные данные о функциональном свойстве клеточных стенок трепонем активизировать in vitro спонтанные Т-лнмфоцнты крови (образование Е-РОК) больных активными формами сифилиса. Установлено, что клеточные стенки трепонем обладают равными способностями корректировать степень иммунной недостаточности in vitro при первичном сифилисе с бактериальным иммуномодулятором -Кодивак (рис. 4), при вторичном рецидивном сифилисе до лечения с им-муноактиватором - тималнном (рис. 5). При вторичном рецидивном си -

Таблица 7

Результаты количественной РСК с сыворотками крови кроликов опытной и контрольной групп

Дни контроля

22/7 » 28/14 *

NN п.п Кролики с экспериментальным сифилисом Число серий Количество кроликов Средние титры с УЗТА Средние титры с КА Средние титры с УЗТА Средние титры сКА

1. Опытам группа с введением КСТ 5 100 1:34±22 1:14,4±6,8 1:30127 1:31±14

2, Контрольная группа 5 100 1:12,5±б,8 Р< 0,00! 1:5,8±2,3 Р< 0,001 1:22Ы4 Р< 0,001 1:14,0±6,8 Р< 0,001

* Числитель - после заражения кроликов сифилисом; знаменатель - после последнего введения КСТ кроликам; Р- достоверность существенности различия при введении КСТ.

Таблица 8

Результаты количественной РСК контрольных положительных сывороток на сифилис, полученных по разной технологии

NN п/п Технология полунения положительных сывороток Число серии Кол-во кроликов Количество введенного КСТ, (в г) Средние титры положительных сывороток Объем производства (в'/.)

с УЗТА. Х±Д сКА, Х±Д

1. С вэедениен КСТ В 262 0,005 1:52128 1:37±14 240

2. Без введения КСТ 8 200, - 1:20±13 Р< 0,01 1:15,0±7,1 Р< 0,01 100

Р - достоверность существенности различия при введении КСТ

Обследуемая группа фоновое

61%

Сифилис первичный фоновое

30%

100%

Рис. 4.

Оценка иммунного статуса по степени иммунной недостаточности Т-лнмфоцнтов у обследуемой группы и при первичном сифилисе и его изменения под влиянием КСТ, Кодивака и тималина в нагрузочных тестах in vitro.

Сифияс вторичный КСТ Кодивак Тималин

рецидивный (до лечения)

Сифилис вторичный решеяивный (в прошесс лечения)

фонэвос

60%

КСТ

Кодивак

90%

Тималин

20%

69 нет иммунной недостаточности 01 степень иммунной недостаточности □ 2 степень иммунной недостаточности

Рис. 5.

Оценка иммунного статуса по степени иммунной недостаточности Т-лимфоцитов у больных вторичным рецидивным сифилисом до лечения и в процессе лечения и его изменения под влиянием КСТ, Кодивака и тималина в нагрузочных тестах in vitro.

филнсе на фоне лечения клеточные стенки обладают достоверным (Р< 0,05) преимуществом в этом тесте по сравнению с обоими иммуно-препаратами (рис. 5).

Проведенная оценка влияния предварительной сенсибилизации лимфоцитов крови патогенными бледными трепонемамн на увеличение Е-рецепторной активности лимфоцитов крови больных сифилисом под воздействием клеточных стенок кулыуральных трепонем in vitro показала, что на долю сенсибилизации приходится около (15—19)% степени активации лимфоцитов крови (по числу Е-РОК).

Полученные данные являются основанием для исследований функциональных свойств клеточных стенок и наружных фибрилл куль-туральных бледных трепонем в направлении создания эффективного им-мунокорректора для использования его в процессе лечения сифилиса.

ВЫВОДЫ

1. Разработаные научные положения относительно функциональных свойств клеточных структур культуральных бледных трепонем являются теоретическими предпосылками для решения на новом уровне проблемы совершенствования серодиагностики сифилиса.

2. Использование методологии системных исследований позволило синтезировать схемы научной разработки производственного выпуска новых специфических диагностических препаратов на сифилис.

3. Доказано, что клеточные стенки и наружные фибриллы культуральных бледных трепонем характеризуются более высокой, по сравнению с дезинтегратом хлетох, антигенной активностью. Это позволило при их использовании в РСК в 2 раза повысить чувствительность, на 1,3% -диагностическую ценность и на 0,7% - специфичность теста, а при использовании в новой АТ-'Греп-ИФТС - на 4,9% диагностическую ценность при первичном сифилисе и обеспечить 100% специфичность теста.

4. Впервые установлено, что содержимое цигоплазматнческого цилиндра трепонем обладает функциональным свойством связывать групповые неспецнфические антитела в сыворотке крови людей, а его использование в качестве сорбента идя РИФ-а б с повысило на 8,3% чувствительность теста при первичном серонеютивном сифилисе и на 18,2% - специфичность с неспецифическими положительными в КСР сыворотками крови людей.

5. Клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем характеризуются более высокими, по сравнению с дезинтегратом клеток, иммуноген-ными свойствами при введении в организм здоровых кроликов, а цитоплазма трепонем - свойством подавления у них функции выработки специфических антител.

6. Клеточные структуры трепонем обладают функциональным свойством не вызывать выработку ангикардиолипиновьа антител при введении в организм здоровых кроликов.

7. Клеточные стенки и наружные фибриллы трепонем при введении в организм кроликов с экспериментальным сифилисом обладают функциональным свойством активизировать его течение как в части развития сифилитического орхита, так и в части выработки специфических и неспецифических антител, что позволило разработать методику получения вы-сокотитражной контрольной положительной кроличьей сыворотки на сифилис, повысившей рентабельность ее производства на (80...90)%.

8. Впервые доказанное функциональное свойство клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем повышать in vitro Е-рецепторную активность лимфоцитов крови людей, больных сифилисом, и лиц, свободных от сифилитической инфекции, разрешило сформулировать гипотезу об их иммунокорректирующем влиянии на иммунную систему человека.

9. Доказана активизация функции роста бледных трепонем V, VII, VIII, IX и Рейтер штаммов за счет наличия в тиогликолевой питательной среде композиции эксгратов кормовых и пищевых дрожжей, что послужило основой разработки новой модифицированной тиогликолевой среды, обеспечившей увеличение на 20% производственного выхода биомассы трепонем.

10. Выявленная в условиях производства зависимость антигенных характеристик клеточных структур трепонем от способа разрушения клеток позволила разработать методики получения структурных антигенов из ультраозвученного дезинтеграта трепонем, отличительной особенностью которых является высокая технологичность и безотходностъ производства.

11. Впервые разработанная методика определения моносахаров в клеточных структурах бактерий способом газожидкостной хромотогра-фии позволила выявить в клеточных структурах трепонем отсутствие галактозы и арабинозы и наибольшее содержание глюкозы и маннозы, которые составили в цитоплазме - 72,1%, а в клеточных стенках и наружных фибриллах трепонем - 74,8%. В групповых неспецифических антигенах, выделенных из клеточных стенок и наружных фибрилл трепонем способом аффинной очистки, содержится около 10% неспецифических белков и около 90% неспецифических липидов и полисахаридов.

12. Установленные функциональные свойства клеточных структур культуральных бледных трепонем определили разработку производственного выпуска новых специфических препаратов на сифилис: антигена из клеточнь« стенок и наружных фибрилл для РСК и новой АТ-Треп-ИФТС , сорбента из содержимого цитоплазматического цилиндра трепонем для РИФ-абс , а также высокотитражной контрольной положительной сыворотки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Об антигенностн некоторых клеточных компонентов культураль-ных бледных трепонем в эксперименте на кроликах (предварительное сообщение) // Актуальные вопросы иммунологии и аллергологии: Тезисы докл. IV науч. конф. - Ставрополь, 1978. - С. 23-25 I в соавт. с О.П.Крыловой/.

2. К вопросу изучения отдельных антигенных комплексов куль-туральных бледных трепонем // Микробиология, иммунология, клиника и эпидемиология инфекционных заболеваний: Сб. науч. работ СГМИ. -Ставрополь, 1979. - С. 56-57.

3. Об антигенных свойствах клеточных структур культуральных бледных трепонем в опытах с сыворотками крови больных сифилисом // Реактивность и аллергия в клинике внутренних болезней: Сб. науч. трудов СГМИ. - Ставрополь, 1981. - С. 70-71.

4. Некоторые аспекты совершенствования лабораторной диагностики сифилиса // Науч.конф., посвященная 60-летию СССР: Тезисы докл. СГМИ. - Ставрополь, 1982. - С. 127-128 /в соавт. с О.П.Крыловой, Т.М. Жижинои и др./.

5. Получение некоторых клеточных структур культуральных бледных трепонем и изучение их антигенных свойств в РСК II Вест, дерма-тол, и венерол. - 1985. - N 9. - С. 16-18.

6. Некоторые биохимические исследования и антигенные свойства изолированных клеточных структур культуральных бледных трепонем // Актуальные проблемы медицины: Тезисы краевой науч. конф. - Ставрополь, 1985. - С. 91-93.

7. Способ серодиагностики сифилиса//Авт. свид. N 1650098, 1991 /в соавт. с В.Н.Бедновой, С.А.Угрнмовым, С.Ф.Падалка/.

8. Immunol status of syphylitic patients during the use of specific immuno-modulator in exprerimental tests // International J. of Immunorehabilitation. - Moskow, Russia, 1994. - N1. - P. 283.

9. Особенности изменения Т-лнмфоцитов в нагрузочных тестах с биологическими иммуномодуляторамн у больных сифилисом II Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний: Материалы науч.- пракг.конф., посвящ. 60-летию противочумной службе Кавказа. - Ставрополь, 1995. - С. 189-291.

10. Антигенные свойства структурных детерминант трепонем, выращенных на искусственной питательной среде // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Материалы международного симпозиума. - Уфа, 1995. -4.2. - С. 217-218.

11. Особенности течения экспериментального сифилитического ор-хита кроликов на фоне иммунизации их структурными антигенными детерминантами трепонем // Эпидемиологические аспекты краевой патало-

гии Ставрополья: Материалы науч.- практ. конф. - Ставрополь, 1995. -N 2. - С. 155-156 /в соавт. с Е.А.Гуртовым/.

12. ИФА-тест визуальный с использованием структурных антигенных детерминант культуральных бледных трепонем для экспресс диагностики сифилиса // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Материалы международного симпозиума. -Уфа, 1995. - 4.2. -С. 195-196 /в соавт. с В.П.Тельбух, М.В.Шавыриной/.

13. Новая технология производства положительных сывороток для диагностики сифилиса // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: Материалы международного симпозиума. - Уфа, 1995. - 4.2. - С.194 /в соавт. с Е.А.Гуртовым/.

14. Особенности иммунного ответа кроликов на структурные антигенные детерминанты культуральных бледных трепонем II Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний: Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 60-летию противочумной службы Кавказа.- Ставрополь, 1995.-С. 191-192.

15. Новый специфический сорбент для РИФ-абс при серодиагностике сифилиса II Вестн. дерматол. и венерол. - 1995. - N 2. - С. 15-16 /в соавт. с В.Н.Бедновой, СА.Угримовым/.

16. Влияние способов дезинтеграции на антигенные свойства клеточных структур бледных трепонем // Вестн. дерматол. и венерол. - 1995. -N З.-С. 14-15.

17. Особенности иммунного ответа кроликов с экспериментальным сифилисом при иммунизации структурными антигенными детерминантами культуральных бледных трепонем II III итог. науч. конф. молод. учен, и спуд.: Сб. науч. работ СГМА. - Ставрополь, 1995. - С. 63-64 /в соавт. с Е.А.Гуртовым/.

18. Сравнительный анализ результатов ИФТС с сыворотками крови людей при серодиагностике сифилиса II III итог. науч. конф. молод. учен, и студ.: Сб. науч. работ СГМА. - Ставрополь, 1995. - С. 242 /в соавт. с М.В.Шавыриной/.

19. Газожидкостно-хроматографический метод определения Сахаров в клеточных структурах бактерий II Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиники капельных и кишечных инфекций: Сб.науч.трудов МНИИЭМ. - М., 1996. - Т. 1. - С. 172-176 /в соавт. с И.ПЛепурным, Е.А. Шмелевой/.

20. Определение моносахаров и нуклеиновых кислот в клеточных структурах культуральных бледных трепонем II Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиника капельных и кишечных инфекций: Сб. науч. трудов МНИИЭМ.-М., 1996.-ТЛ. - С. 176-181.

21. Получение и сорбция высокоочищенного антигена Treponema Pallidum для использования в ИФА // Современные достижения биотехнологии: Материалы Всеросс. конф. -Ставрополь, 1996. - С.309/в соавт. с М.В.Шавыриной, Н.А.Иллютавич/.

22. Особенности иммунного ответа кроликов на введение антигенов из бледных трепонем II 7-й Российск. съезд дерматол. и венерол.: Тез. докл. - Казань, 1996. - 4.3. - С. 72.

23. Системно-функциональный анализ свойств культуральнь!х бледных трепонем на уровне клеточных структур // 7-й Российск. съезд дерматол. и венерол.: Тез. докл. - Казань, 1996. - 43. - С. 169.

24. Научно-производственная разработка новых специфических диагностических препаратов на сифилис по безотходной технологии// Го-меосгаз и инфекционный процесс: Материалы международной конф. -Саратов, 1996.-4.2.-С. 216.