Получение атипичных форм Treponema pallidum и детекция антител к ним в эксперименте

Беличенко, Андрей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение атипичных форм Treponema pallidum и детекция антител к ним в эксперименте
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение атипичных форм Treponema pallidum и детекция антител к ним в эксперименте"

На правах рукописи

БЕЛИЧЕНКО АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ АТИПИЧНЫХ ФОРМ TREPONEMA PALLIDUM И ДЕТЕКЦИЯ АНТИТЕЛ К НИМ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.00.23-Биотехнология 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь - 2006

Работа выполнена в Ставропольской государственной медицинской академии и Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Тюменцева Ирина Степановна доктор медицинских наук Базиков Игорь Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ивашев Михаил Николаевич кандидат медицинских наук Брюханов Александр Фирсович

Ведущая организация - МЗ ГОУ ВПО Пермский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «21» февраля 2006 года в 10 часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212.256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул.Пушкина, д.1, корпус 2., аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул.Пушкина, д.1, корпус 1.

Автореферат разослан «18» января 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ,

доктор биологических наук Т.И. Джандарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ежегодно в России регистрируется более 1 млн. инфекций , передаваемых половым путем, из них более 270 тыс. составляют больные сифилисом. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. При этом произошло увеличение числа ежегодно регистрируемых больных сифилисом (все формы) в 37,7 раза, из них первичным - в 33,2 раза, вторичным - в 34,2 раза, ранним скрытым - в 57,1 раза, а прочими формами в - 4,6 раза, в том числе ранним врожденным с симптомами - в 47,7 раза (Онищенко Г.Г., 2002; Яцуха М.В., Козырева Л.Т., Бобкова И.Н. и др., 2002).

Известно, что Т.ра1Шпт при определенных условиях, благодаря действию защитных сил организма, трансформируется в формы выживания (цисты и Ь-формы), что обусловливает развитие серорезистентности у больных, получавших специфическое лечение. Важное теоретическое и практическое значение имеют наблюдения авторов о Ь-трансформирующем влиянии на возбудителя сифилиса соответствующих иммунных сывороток, особенно если помимо антител сыворотка крови содержит пенициллин. Здесь прежде всего нужно думать о детях, рожденных от больных сифилисом матерей - как не леченных, так и леченных пенициллином во время беременности, так как дети с кровью матери получают антитела и пенициллин, которые являются мощным Ь-трансформирующим фактором (Беднова В.Н., 2001; Яровинский Б.Г., Зурочка А.В., и др., 2001; Хамаганова И.В., Кошина М.В., Пивень А.П. и др., 2004). Результаты серологических исследований в данном случае помочь не могут, так как в настоящее время во всем мире антигены для всех специфических реакций на сифилис готовят из извитых форм возбудителя. В связи с этим, в последние десятилетия учеными неоднократно ставился вопрос о необходимости расширения экспериментальных исследований в отношении биологии возбудителя сифилиса как извитых, так и атипичных форм, в частности, совершенствовании его серодиагностики с разработкой антигенов из атипичных форм бледной трепонемы (Овчинников Н.М., 1970, 1974; Беднова В.Н., 2001; Дмитриев Г.А., Аковбян В.А., Тихонова Л.И., 2001).

Цель и основные задачи исследований

Цель диссертационной работы заключалась в получении Ь-форм бледной трепонемы и изучении возможности выявления антител к ним в экспрессных методах иммуноанализа в эксперименте.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

- подобрать рецептуру питательной среды, обеспечивающую стабильное образование Ь-форм бледной трепонемы и наращивание её биомассы;

- изучить процесс трансформации бледной трепонемы в Ь-форму методом электронной микроскопии;

- выделить специфические антигенные комплексы из типичной и Ь-форм Т.ра1Шиш и изучить их в сравнительном аспекте;

- разработать технологию получения высокоактивной кроличьей гипериммунной антисыворотки против Ь-формы бледной трепонемы;

- разработать модифицированный вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления трепонемных Ь-антител;

- разработать магноиммуносорбентный трепонемный Ь-антигенный диагностикум для количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА).

Научная новизна работы

Разработана рецептура питательной среды с композицией индукторов Ь-трансформации, обеспечивающая стабильное получение Ь-форм бледной трепонемы.

С помощью электронной микроскопии изучен процесс биотрансформации Т.ра1Шиш в Ь-форму.

Для изолирования специфических антигенных комплексов из извитых и Ь-форм бледной трепонемы разработан ряд последовательных манипуляций, позволивший получить антигенные компоненты клеточной стенки и цитоплазмы.

Разработан методический подход к получению высокоактивной гипериммунной кроличьей сыворотки против антигена Ь-формы бледной трепонемы.

Сравнительное изучение антигенной структуры родительской (извитой) и Ь-формы Т.ра1Шпш показало потерю части антигенов, связанных, по всей вероятности, с клеточной стенкой микроорганизма.

Предложен модифицированный метод постановки ИФА для выявления в сыворотке крови специфических Ь-антител к атипичной форме бледной трепонемы.

Впервые разработан экспрессный метод определения Ь-антител в количественном иммунофлуоресцентном методе с использованием иммуносорбентной биотехнологии.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение «Способ культивирования Л-форм бледных трепонем» (положительное решение о выдаче патента от 5.12.2005 г. по заявке №2004130018).

Теоретическая и практическая значимость диссертации

Разработанный комплекс последовательных лабораторных приемов с использованием предложенной питательной среды позволяет получать чистую биомассу Ь-форм бледной трепонемы в достаточном количестве для научных и практических целей.

Получены высокоактивные специфичные трепонемные

гипериммунные сыворотки в результате подбора эффективного способа иммунизации кроликов антигенным комплексом из Ь-форм Т.ра1Шпш, которые могут быть использованы в качестве положительного контроля при постановке серологических реакций.

Предложена модификация постановки иммуноферментного анализа на стекле для выявления Ь-антител, которая может способствовать совершенствованию серодиагностики сифилиса.

Использование трепонемных Ь-антигенных магноиммуносорбентов в количественной реакции иммунофлуоресценции позволило повысить диагностическую ценность этой реакции.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций «Получение Ь-форм бледной трепонемы и определение антител к ним в иммуноферментном анализе», которые были одобрены

Ученым советом ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол №9 от 27 октября 2005г.) и утверждены директором института 27 октября 2005 г.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на заседании Ставропольского краевого научного общества

дерматовенерологов (Ставрополь, 2003); XI Итоговой (межвузовской) научной конференции молодых ученых и студентов (Ставрополь, 2003); научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению

санэпидблагополучия и защиты прав потребителей» (Ставрополь, 2005); Ставропольского филиала Общероссийской общественной организаии «Российское общество дерматовенерологов» (Ставрополь, 2005).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработка рецептуры питательной среды для стабильного получения L-форм бледной трепонемы и изучение её изменчивости в процессе L-трансформации методом электронной микроскопии.

2. Получение антигенного комплекса из извитых и L-форм бледной трепонемы.

3. Технология получения специфичной гипериммунной кроличьей антисыворотки к L-форме бледной трепонемы.

4. Сравнительное изучение антигенной структуры извитой и измененной форм бледной трепонемы в некоторых серологических реакциях.

5. Модифицированный метод постановки ИФА для определения L-антител в сыворотке крови.

6. Магноиммуносорбентный L-антигенный диагностикум для КИФА.

Публикации

Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР «Получение и характеристика атипичных форм бледной трепонемы и их ревертантов» (№ ГР 01200311390) по Ставропольской государственной медицинской академии, отражено в 9 опубликованных научных работах (4 депонированные работы, 5 трудов в научных сборниках) .

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы.

Она изложена на 142 страницах, содержит 8 таблиц, 17 рисунков. Список литературы включает 212 отечественных и 118 зарубежных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. При выполнении работы был использован VII штамм «Ставрополь» культуральной бледной трепонемы (Treponema pallidum).

В опытах использовали 10 кроликов обоего пола породы «Шиншилла, весом 2,5-3 кг.

В работе использовали ультразвуковой трепонемный антиген (УЗТА) производства ФГУП «Аллерген», г.Ставрополь. Разрушение микробных клеток проводили на установке УЗДН - 2 т (Россия) при частоте колебаний 44 кГц и экструзией на Х-прессе (Швеция). Водорастворимые антигенные комплексы микробных клеток и тканей экстрагировали 2,5% раствором NaCl. Гипериммунные сыворотки получали по схеме И.С.Тюменцевой (1996). Сублимацию биопрепаратов проводили в камере TG-5 (Германия).

Количественное определение белка проводили по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравниванием поглощения белка при 260 и 280 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989). Спектр поглощения микробных антигенов определяли на спектрофотометре при длине волн X 210-300 нм.

Гельфильтрацию осуществляли на хроматографической установке «Minicoldlab» (LKB, Швеция). Реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (1% Difco, США) проводили по O.Ouchterlony (1949).

Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой по G.Steubuch, R.Andran (1969) c ФИТЦ («Sigma») проводи по H.Storz (1987). Прямой метод флуоресценции осуществляли по A.H.Coons,

M.H. Kaplan (1950). Количественный иммунофлуоресцентный анализ проводили по методу Е.Г.Стоева с соавт. (1981). Иммуноферментный анализ проводили согласно «Инструкции постановки ИФА на поверхности твердофазного носителя» (М., 1988).

Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики, изложенными в работах П.И.Сызранцева (1968), И.П. Ашмарина, А.А.Воробьева (1962), В.Ю.Урбах (1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение измененных форм бледной трепонемы и изучение процесса её биотрансформации. Известно, что T.pallidum при определенных условиях образует L-формы и цисты, которые могут длительно персистировать в организме и приводить к развитию резистентного бактерионосительства. Формирование в популяции прослойки носителей бледной трепонемы во многом обусловливает цикличность эпидемического процесса.

Так как в настоящее время повсеместно антигены для всех специфических реакций на сифилис производят из типичных извитых форм возбудителя, часто серологические исследования помочь не могут. В связи с этим, необходимость расширения исследований по изучению биологии антигенных форм бледной трепонемы, выделению их специфических антигенов и совершенствованию серодиагностики сифилиса, вызванного атипичными формами возбудителя, является своевременной и актуальной проблемой.

Культивирование бледной трепонемы на искусственных питательных средах представляет определенные трудности в силу её биологических свойств, тем более, если стоит задача получить L-формы этого микроба.

При отработке оптимальной рецептуры питательной среды в качестве основы мы использовали перевар Мартена, триптический гидролизат казеина, пептонный бульон из бычьих сердец, печеночную питательную среду, Китт-Тароцци, в состав которых в различных сочетаниях и количествах дополнительно входили: нормальная лошадиная сыворотка (1020 %), экстракт кормовых дрожжей (3-10 г/л), натрия хлорид (0,5-7,5 г/л),

сернокислая магнезия (0,2-0,5 г/л), сахароза, глюкоза (3-7 г/л), кислота тиогликолевая (0,3-0,7 г/л).

В сериях опытов было испытано 15 вариантов питательных сред, на которые высевали VII штамм культуральной бледной трепонемы II иммунологической группы (Ставрополь VII). Взятые в эксперимент варианты питательных сред, по своим ростовым качествам были неравнозначны. Наиболее благоприятной оказалась питательная среда на основе ферментативного (триптического) гидролизата казеина неглубокой степени расщепления следующего состава: триптический гидролизат казеина -15,0 г; экстракт кормовых дрожжей - 5,0 г; - экстракт пищевых дрожжей - 4,5 г; натрия хлорид - 7,5 г; глюкоза - 5,5 г; кислота тиогликолевая - 0,3 мл; цистин - 0,75 г; сыворотка лошадиная

нормальная - 20 %; вода дистиллированная до 1000 мл. После стерилизации рН среды (7,0±0,2). На этой среде прирост биомассы составил (1,55±0,27) г/л.

В качестве основного L-трансформирующего агента мы использовали пенициллин, так как он является наиболее совершенным, почти универсально действующим фактором, вызывающим превращение разнообразных видов бактерий в L-формы (Тимаков В. Д., Каган Г.Я., 1961, 1973). Этот индуктор был с успехом применен рядом авторов при получении L-форм бледной трепонемы (Вяселева С.М., 1954; Овчинников Н.М., Делекторски й В.В. и др., 1970; Устименко Л.М., 1975). Вторым индуктором L-трансформации служил глицин. Об эффекте сочетанного индуцирующего действия пенициллина и глицина имеются сообщения ряда исследователей (Тимаков В.Д., Каган Г.Я., 1973; Madoff S. et al., 1967).

Процесс трансформации бледной трепонемы в L-форму изучали при внесении различных доз натриевой соли бензил-пенициллина (25 ЕД/мл; 50 ЕД/мл; 100 ЕД/мл; 250 ЕД/мл; 500 ЕД/мл) и глицина (0,1 г/л - 2,0 г/л) в питательную среду после появления видимого роста исходной культуры.

Особенности биотрансформации бледной трепонемы изучали в электронном микроскопе JTM-100Ex(JE0L) с увеличением в 8000-10000 раз методом негативного контрастирования. Для электронной микроскопии культуру готовили по методике Н.М. Овчинникова с соавт. (1970).

В питательной среде, в которую добавляли пенициллин в концентрации 25 ЕД/мл и 50 ЕД/мл, а глицин - 0,1 г/л через 6-7 дней, наряду с типичными формами, появлялось небольшое количество измененных клеток со вздутиями и утолщениями в теле. При увеличении концентрации пенициллина до 250-500 ЕД/мл, а глицина - до 2,0 г/л происходили следующие трансформации микробной клетки бледной трепонемы. При внесении индукторов в период появления видимого роста на следующий день и в последующие 2-3 дня у исходных культур отмечалось изменение морфологии, соответствовавшее I фазе биотрансформации трепонем: освобождение клеток от значительной части наружных фибрилл, сопровождающееся уплотнением завитков спирали, и наличие свободно расположенных фибрилл, связанных с наружной оболочкой клетки трепонемы (рисунок 1 А,Б).

А Б

Рисунок 1А, Б. I фаза биотрансформации бледной трепонемы. х 10000

1 - уплотнение узелков; 2 - фибриллы

Далее в течение 3-14 дней наблюдали II фазу: образование единичных петель из завитков за счет сокращения внутренних и коротких фибрилл (рисунок 2 А), делающихся со временем контрастно непроницаемыми в виде узелков (рисунок 2 Б); на этом этапе фибриллы сохраняют свободное расположение и связь с клеткой.

III фаза характеризовалась постепенным скручиванием трепонемы в кольцеобразную структуру, наличием связанных с клеткой свободно расположенных фибрилл , а также фибрилл, связанных внутри

кольцеобразной структуры и формирующимся «концевым» отростком (рисунок 3А,Б). В III фазу на 16-18 день начинали появляться L-колонии, что свидетельствовало о переходе биотрансформации в IV фазу (завершающую): зрелые клетки представлены кольцеобразными структурами, уложенными в виде клубка с

А Б

Рисунок 2 А,Б. II фаза биотрансформации бледной трепонемы. х 10000

1 - единичные петли, 2 - узелки, 3 - фибриллы

нефрагментированным чехлом и сформировавшимся «концевым» отростком (рисунок 4А,Б), выраженными образованиями из фибрилл внутри клетки, отсутствием значительного количества свободно расположенных фибрилл снаружи клетки с сохранением свободных фрагментов (рисунок 4В).

Представленный процесс трансформации извитой формы бледной трепонемы иллюстрирует фазы образования цист-форм и переход к формированию Ь-формы бледной спирохеты. Ь-колонии - мелкие плотные непрозрачные образования крошкообразной консистенции, правильной или неправильной круглой формы. Диаметр колоний варьировал от 0,3 до 2,2 мм. При фазовоконтрастной микроскопии Ь-колонии состояли из шаровидных тел различных размеров с гомогенной протоплазмой неодинаковой оптической плотности, шаров с зернами в протоплазме (рисунок 5). При электронномик роскопическом исследовании срезов Ь-форм трепонем видны различной величины и электронной плотности шаровидные или округлые образования. Некоторые из них совершенно гомогенны, с мелкой зернистостью.

Внутреннее строение части из них сходно со строением ядра у бактерий и пронизано нитями, которые подобны ДНК.

Для получения биомассы Ь-форм бледной трепонемы исходную типичную культуру штамма Ставрополь VII высевали на полужидкую питательную среду предложенной нами рецептуры. При появлении видимого роста микроорганизмов добавляли индукторы Ь-трансформации (натриевую

А Б

Рисунок 3 А,Б. III фаза биотрансформации бледной трепонемы. х 10000

1 - кольцеобразная структура, 2 - фибриллы, 3 - формирующийся «концевой» отросток

А Б

Рисунок 4А,Б. IV фаза биотрансформации бледной трепонемы. х 10000.

1 - кольцеобразная структура, 2 - «концевой» отросток

Рисунок 4В. IV фаза биотрансформации бледной трепонемы. х 10000.

1 - кольцеобразная структура, 2 - фибриллы, 3 - «концевой» отросток

Рисунок 5. Ь-колонии бледной трепонемы.

Фазовый контраст. х 320

соль бензил-пенициллина и глицин). Биомассу L-форм бледной трепонемы получали по схеме, представленной на рисунке 6.

Сравнительное изучение антигенной структуры типичной и Ь-форм бледной трепонемы. Процесс L-трансформации микробной клетки при воздействии различных факторов приводит к структурным изменениям в клеточной стенке, протоплазме, ядерной субстанции. Эти изменения цитохимической структуры, химического состава и обменных процессов находят свое отражение в изменениях их антигенной структуры. Отличительной особенностью её является преобладание антигенных детерминантов цитоплазматической мембраны и цитоплазмы, которые иногда не выявляются у родительских бактериальных форм из-за преобладания у них антигенных компонентов клеточной стенки (Тимаков В.Д., Каган Г.Я., 1973).

За основу изолирования специфических антигенов из биомассы типичной и Ь-форм бледной трепонемы мы приняли водно-солевую экстракцию в комплексе с экструзией и ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток (рисунок 7). Лиофилизированные водорастворимые белковые антигенные комплексы и детриты служили иммуногенами при получении гипериммунных сывороток, а также для конструирования экспериментальных диагностических препаратов.

Способ гипериммунизации заключался в следующем: в первом цикле (грундиммунизация) кроликам-продуцентам пятикратно вводили водорастворимые антигены в повышающихся дозах от 1 до 3 мг на инъекцию в сме

Рисунок 6. Схема получения биомассы L-формы бледной трепонемы_

Биомасса бледной трепонемы

Суспендирование в ДВ. Замораживание при минус 50 0С 24

Суспендирование в У начального объема в 5%

Экструзия (5-6 кратная) на Х-прессе

Биомассв L-форм

Центрифугирование при 20000 об/мин (45±5) мин

сть

Розлив в ампулы. Диализ против ДВ 24

Стабилизация препарата часа

сублимацией

Рисунок 7. Схема получения антигенных комплексов Ь-форм бледной трепонемы

си с феракрилом. Первые две инъекции делали подкожно в подушечки задних лап и в подмышечные лимфатические узлы. Остальные три инъекции иммуноген вводили внутримышечно в бедра задних лап попеременно. После пятой инъекции животным давали отдых в (30±1) дней. На 30-й день от животных получали 3 мл иммунной сыворотки, добавляли половинную дозу антигена в каждую сыворотку. Полученный комплекс антиген-антитело вводили четырехкратно по 0,5 мл с промежутками в 3-4 дня в краевую вену

уха тому же животному, от которого получена иммунная сыворотка. Одновременно внутримышечно кроликам инъецировали в три-четыре точки бедра смесь водорастворимых антигенов и детритов с феракрилом.

Специфическую активность иммунных сывороток оценивали в реакции иммунодиффузии в агаровом геле по О. Оухтерлони (РИД). Пробное взятие крови проводили у всех животных через 7 дней (24 день) после грундиммунизации, перед третьей инъекцией второго цикла (54 день) и через 7 дней (66 день) после окончания второго цикла. Титры специфической активности гипериммунных сывороток в РИД у животных, иммунизированных антигенами из типичных форм бледной трепонемы, после взятия крови на 66 день от начала иммунизации достигали показателей 1:48,0±12,5, что вполне удовлетворяло поставленным нами задачам. У всех животных, иммунизированных антигенами из измененных форм Т.ра1Шпт в эти же сроки, развивалась ответная иммунологическая реакция, но титры специфических антител в сыворотках были невысокими 1:3,2±0,62.

Эти результаты диктовали нам необходимость проведения третьего цикла иммунизации. После отдыха (20±1) день была проведена

дополнительная иммунизация, состоящая из четырех инъекций смеси водорастворимого L-антигена (3 мг) с детритом (1 мг), при этом половину дозы вводили кролику внутривенно, вторую половину дозы смешивали с феракрилом и вводили внутримышечно. Через 7 дней после последней инъекции (98 дней) титры специфической активности L-антител у всех кроликов, оцененные в РИД, повышались в течение всей гипериммунизации и достигали 1:41,6±11,7.

Антигенную структуру L-вариантов бледной трепонемы и антигенные взаимоотношения с извитой формой изучали в РИД, прямой реакции иммунофлуоресценции и непрямом иммуноферментном анализе. Результаты серологических реакций с использованием антигенов и гипериммунных кроличьих сывороток к ним из извитых и L-форм бледной трепонемы свидетельствуют о потере, по крайней мере, двух антигенов и частично -одного. В связи с тем, что процесс L-трансформации в первую очередь затрагивает клеточную стенку микроорганизма, по всей вероятности, эти антигены могут быть локализованы именно в ней. Показано наличие тропности бледной трепонемы к некоторым тканям макроорганизма, что может играть определенную роль в патогенезе сифилиса и его серодиагностике.

Выявление трепонемных Ь-антител в экспрессных методах иммуноанализа в эксперименте. Высокоспецифичный водорастворимый антиген Т.ра1Шпш явился основой для конструирования трепонемного L-антигенного магноиммуносорбентного диагностикума для выявления антител в количественном иммунофлуоресцентном анализе (КИФА). В качестве твердой фазы использовали органокремнезем - алюмосиликат, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полимера-декстрана (полиглюкина) и поверхностно-активного вещества -вторичного алкилсульфата натрия.

Процесс получения МИС заключался в следующем: к 1 г алюмосиликатного наполнителя добавляли 40 мл 3 % водного раствора полиглюкина и 3 г магнитного порошка (БегОг), перемешивали и проводили гелеобразование при температуре (22±4) иС 2 часа. Полученный сорбент высушивали при 100-110 0С в течен*ие 30 мин, измельчали и методом

рассева выделяли фракции с размером частиц 80-120 микрон. Активирование твердофазного носителя вторичным алкилсульфатом натрия проводили следующим образом: к 1 г полученного алюмосиликатного МС примешивали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 мл вторичного алкилсульфата натрия. Смесь инкубировали 1-2 часа при температуре (37±1) 0С, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9 % раствора хлорида натрия и 100 мл дистиллированной воды. Для придания сорбенту аффинных свойств к 0,1 г активированного сорбента приливали 1 мл Ь-антигена с содержанием белка (3,5±0,1) мг/мл, рН 7,0-7,2. Смесь оставляли при (20±2) 0С в течение одного часа. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель промывали 0,15 М раствором хлористого натрия до 0 экстинции на спектрофотометре.

Для проведения КИФА к исследуемой сыворотке добавляли 300-500 мкл 10 % Ь-трепонемного антигенного магноиммуносорбента. Экспонировали 1-2 часа при температуре (24±1) иС, перемешивая. После тщательной промывки гранул физиологическим раствором окрашивали их иммуноглобулинами флуоресцирующими против глобулинов кролика (коммерческий препарат НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи) в их рабочем разведении. Для регистрации уровня свечения магнитных гранул использовали люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный типа В7-76.

Таким образом, нами впервые разработан трепонемный магноиммуносорбентный Ь-антигенный диагностикум для количественного иммунофлуоресцентного анализа , который позволяет при контакте со специфическими Ь-антителами осуществлять динамическое селективное их концентрирование, образуя иммунные комплексы, определяемые в дальнейшем соответствующей меткой, при этом реакцию возможно учитывать не только визуально, но и инструментально в условных единицах по показателям вольтметра.

Кроме этого, для выявления Ь-антител в сыворотках крови нами апробирован способ постановки ИФА на предметном стекле. На

фиксированные в ацетоне мазки из Ь-форм Т.ра1Шиш наносили двойное разведение испытуемой сыворотки. Отрицательным контролем служил мазок с нанесенным на него ЗФР. Мазки инкубировали при 37 0С 30 мин во влажной камере, затем последовательно отмывали в ЗФР и дистиллированной воде, подсушивали и наносили конъюгат

иммунопероксидазный антикроличий в его рабочем разведении. Инкубировали и отмывали при вышеуказанных условиях, посушивали и наносили субстрат-индикаторный раствор (10 мл цитратного буферного раствора, 5 мг ортофенилендиамина и 0,05 % перекиси водорода). Инкубировали при 37 0С без доступа света в течение 10 мин. Для остановки реакции использовали 2 М раствор серной кислоты, который наносили на мазки в объеме 50 мкл. Результаты реакции учитывали визуально. На отрицательном контрольном мазке реакционная смесь оставалась неокрашенной, на опытных (положительных) субстрат окрашивался в оранжево-желтый цвет разной интенсивности в зависимости от разведения исследуемой сыворотки. Для количественного определения результатов ИФА продукт реакции переносили в лунки микроплаты и регистрировали оптическую плотность на вертикальном фотометре «МиШБкап» (Флоу Лаб, Англия), считая анализ положительным, если ОП исследуемого образца в 2 и более раз превосходила среднее значение ОП отрицательного контроля.

Предлагаемый нами способ постановки ИФА значительно упрощает, ускоряет и удешевляет проведение анализа. Прочная адгезивная фиксация корпускулярного Ь-антигена на стекле исключает недостатки и последствия десорбционных процессов. Вследствие чего такие стекла можно заготавливать заранее и применять для постановки ИФА, по крайней мере, не менее двух лет (срок наблюдения), что немаловажно при проведении большого количества исследований.

Таким образом, нами показана возможность определения Ь-антител в сыворотках крови в модифицированном методе ИФА. Дальнейшие клинические испытания будут способствовать совершенствованию серодиагностики, в первую очередь, больных врожденным, поздними и серорезистентными формами сифилиса.

ВЫВОДЫ

1. Подобран состав полужидкой питательной среды на основе триптического гидролизата казеина неглубокой степени расщепления, при введении в которую композиции индукторов Ь- трансформации ( натриевой соли бензилпенициллина 100-500 ЕД/мл и глицина 1,0 - 2,0 г/л ) она обеспечивает стабильное получение Ь-форм бледной трепонемы.

2. По данным электронной микроскопии, биотрансформация типичной бледной трепонемы проходит через несколько фаз: освобождение клеток от значительной части наружных фибрилл; формирование единичных петель, переходящих со временем в узелки; формирование Ь-колоний; появление зрелых Ь-форм, представляемых кольцеобразными структурами.

3. Разработан комплекс последовательных манипуляций, позволяющий получить чистую биомассу Ь-форм Т.ра1Шпт в достаточном количестве для решения биотехнологических задач.

4. Методами физической деструкции микробных клеток (экструзия-УЗ - воздействие) и водно-солевой экстракции получен специфический антигенный комплекс Ь-форм бледной трепонемы.

5. Результаты сравнительного изучения водорастворимых антигенных комплексов в некоторых серологических реакциях (РИД, ИФА, РИФ) родительской и Ь-формы Т.ра1Шпт свидетельствуют о потере, по крайней мере, двух антигенов и частично - одного, связанных с её клеточной стенкой.

В РИД показано наличие тропности бледной трепонемы к тканям сердца, печени, лимфоузлов и легкого человека, что может играть определенную роль в патогенезе сифилиса.

6. Разработана высокоэффективная схема гипериммунизации кроликов, позволившая получать иммунный ответ у 100 % животных -продуцентов на введение Ь-антигена бледной трепонемы. Такая иммунная сыворотка может служить положительным контролем при выявлении Ь-антител в серологических реакциях.

7. Для выявления Ь-антител в сыворотках крови разработан модифицированный метод постановки ИФА на стекле, а также трепонемный Ь-антигенный магноиммуносорбентный диагностикум для количественного иммунофлуоресцентного анализа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для получения L-форм бледной трепонемы использовать 0,3% питательную среду следующего состава: триптический гидролизат казеина

- 15,0 г; экстракт кормовых дрожжей - 5,0 г; экстракт пищевых дрожжей

- 4,5 г; натрия хлорид - 7,5 г; глюкоза - 5,5 г; кислота тиогликолевая

- 0,3 мл; цистин - 0,75 г; сыворотка лошадиная нормальная - 20 %; натриевая соль бензилпенициллин - 100-500 ЕД/мл; глицин - 1,0 - 2,0 г/л; вода дистиллированная до 1000 мл.

2. Для наиболее полного извлечения водорастворимых L-антигенов из биомассы атипичной T.pallidum в нативном виде проводить водно-солевую экстракцию в комплексе с экструзией и ультразвуковой дезинтеграцией.

3. Для получения высокого иммунного ответа на L-антиген T.pallidum необходима гипериммунизация, включающая не менее трех циклов иммунизации не только водорастворимыми изолятами, но и клеточными детритами на фоне введения иммунокорректора - феракрила.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Базиков, И. А. Конструирование питательной среды для культивирования L-форм бледной трепонемы / И.А.Базиков, А.В.Беличенко, О.А.Латышев //Актуальные вопросы венерологии и дерматологии. -Ставрополь, 2003. - С.92-93.

2. Беличенко, А.В. Цистообразование культуральных бледных трепонем / А.В.Беличенко, О.А.Латышев //Тез. докл. XI итоговой (межвузовской конф. молодых ученых и студентов. - Ставрополь, 2003. - С. 56-57.

3. Беличенко, А.В. Получение L-форм бледной трепонемы / А.В.Беличенко, О.А.Латышев //Там же. - 2003. - С.56.

4. Bazikov, I.A. Obtaining morphological characteristics of L-forms of the treponema pallidum /I.A.Bazikov, A.V.Belichenko, O.A. Latyshev //Europеan Academy oa Dermatology and Venerology JEÄDV. - 2003.- V.17 (Suppl.1). -P.63.

5. Беличенко, А.В. Опыт получения специфических антигенов из антительных форм бледной трепонемы и иммунных сывороток к ним / А.В.Беличенко //Материалы науч.-практ. конф. «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и зищите прав потребителей». - Ставрополь, 2005. -С.183-186.

6. Беличенко, А.В. Сравнительное изучение антигенной структуры типичной и Ь-форм бледной трепонемы в некоторых серологических реакциях /А.В. Беличенко, И.С.Тюменцева //Ставрополь, 2005. - 10 с. - Деп. в ВИНИТИ, №1434-В2005.

7. Беличенко, А.В. Выявление трепонемных Ь-антител в модифицированном иммуноферментном анализе / А.В.Беличенко, И.С.Тюменцева //Ставрополь, 2005. - 11 с. - Деп. в ВИНИТИ, №1435-В2005.

8. Беличенко, А.В. Биотехнология получения водорастворимых антигенных комплексов типичной и Ь-форм бледной трепонемы и гипериммунных сывороток к ним / А.В.Беличенко // Ставрополь, 2005. - 15 с. - Деп. в ВИНИТИ, №1436-В2005.

9. Беличенко, А.В. Получение измененных форм бледной трепонемы и изучение их биологических свойств /А.В.Беличенко // Ставрополь, 2005. - 15 с. - Деп. в ВИНИТИ, №1437-В2005.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Беличенко, Андрей Викторович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1, Современное состояние заболеваемости и эпвдемиологическая ситуация но сифилису 1.2 L-формы бактерий, особенности биотрансформа- 15 пни в L-формы T.palludum

U. Методы лабораторной диагностики сифилиса

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, нчятыс в работу'

2.2. Питательные среды

2.3. Основные химические реактивы и оборудование

2.4. Получение антигенных комплексов микроорганизмов

2.5. Лабораторные животные, использованные в опытах

2.6. Получение гнпериммушшх сывороток

2.7. Физико-кнмнческне н иммунологические методы

2.8. Получение нммунофлуореецнруютнх конъюга- 42 тов

2.9. Иммунофлуоресцентный анализ

2-10. Иммунофсрментный анализ

2.11, Сублимация МИБП

2.12. Статистическая обработка материала

Глава 3« ПОЛУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕННЫХ ФОРМ

БЛЕДНОЙ ТРЕПОМ ЕМЫ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ££ БИОТРАНСФОРМАЦИИ

3.1. Подбор оптимальной питательной среды

3.2. Особенности бнотрансформацнк культурал ьнон 44 бледной трепонемы in vitro по данным электронной микроскопии

3-3. Получение биомассы L-форм бледной трепонемы

Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕН- 29 НОЙ СТРУКТУРЫ ТИПИЧНОЙ И L-ФОРМ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ В НЕКОТОРЫХ СЕРОЛОГ И ЧЕСКИX PEAКЦИЯ X

4,1, Выделение специфических антигенов hi типнч- 60 ной и L-форм бледной трепонемы

4.2. Получение гипериммунных сывороток крови

4.3- Сравнительное изучение антигенных взаимоот- 67 ношений L-вариантов бледной трепонемы с нэ-витой формой Т.pallidum

Глава?. ВЫЯВЛЕНИЕ ТРЕПОНЕМНЫХ L-АНТИ- 81 ТЕЛ В ЭКСПРЕССНЫХ МЕТОДАХ И.ММУ-НО АН АЛ ИЗ А В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 5Л Модифицированный нммуноферментный анализ 81 5.2. Количественный нымунофлуоресцентный анализ 88 с применением магнонммуиосорбеитоа

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение атипичных форм Treponema pallidum и детекция антител к ним в эксперименте"

Актуальность проблемы

Ежегодно в России регистрируется более I млн. инфекций , передаваемых половым путем, из них более 270 тыс. составляют больные сифилисом. По сравнению с i 989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. При этом произошло увеличение числа ежегодно регистрируемых больных сифилисом (все формы) в 37,7 раза, из них первичным - в 33,2 раза, вторичным - в 34,2 раза, ранним скрытым - в 57,1 раза, в прочими формами в ■ 4.6 раза, в том числе ранним врожденным с симптомами я 47,7 paja (Оннщекко ГГ., 2002, 2002а; Яцуха MB., Козырева Л Т. Бобкова И.Н. и др., 2002).

Известно, что Т.pallidum при определенных условиях, благодаря действию защитных сил организма, трансформируется в формы выживания (цисты и L-формы), что обусловливав! развитие серорезистеитностн у больных, получавших специфическое лечение. Важное теоретическое и практическое значение имеют наблюдения авторов о L-трансформнрующем влиянии на возбудителя сифилиса соответствующих иммунных сывороток, особенно если помимо антител сыворотка кроен содержит пенициллин Здесь прежде всего нужно думать о детях, рожденных от больных сифилисом матерей как не леченных, так и леченных пенициллином во время беременности, так как дети с кровью матери получают антитела и пенициллин, которые являются мощным L-траисформнрующим фактором (Бедиова В. И. 2001; Яро-аинекий Б.Г., Зурочка А.В., и др., 2001; Хамаганова И.В. Кошина М.В., Пн-вень А.П. и др., 2004), Результаты серологических исследований в данном случае помочь не могут, так как в настоящее время во всем мире антигены для всех специфических реакций на енфнлне готовят нз извитых форм возбудителя. В связи с этим, в последние десятилетня учеными неоднократно ставился вопрос о необходимости расширения экспериментальных нселедований в отношении биологии возбудителя сифилиса как извитых, так и атипичных форм, в частности, совершенствовании его серодиагностики с разработкой антигенов из атипичных форм бледной трепонемы (Овчинников U.M., 1970. 1974; Бед нова ВН., 2001; Дмитриев Г.А., Акоабян В.А. Тихонова Л.И, 2001),

Цель н основные задачи исследовании

Цель диссертационной работы заключалась в получении L-форм бледной грепонемы н изучении возможности выявления антител к ним в экспрессных метлах кммуноаналнза в эксперименте.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

- подобрать рецепт)ру питательной среды, обеспечивающую стабильное образование L-форм бледной трспонсмы и наращивание сс биомассы;

- изучить процесс трансформации бледной трспонсмы в L-форму методом электронной микроскопии;

- выделить специфические антигенные комплексы нт типичной и L-форм Tpalhdum и изучить их в сравнительном аспекте; разработать технологию получения высокоактивной кроличьей гнпе-риммунной антисыворотки против L-формы бледной трспонсмы;

- разработать модифицированный вариант иммуноферментиого анализа (ИФА) для выявления трепонемных L-аитител;

- разработать малiоиммуносорбентный трепонемный L-антигенный дн-агностикум для количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА).

Научная новизна pa&utbi

Разработана рецептура питательной среды с композицией индукторов L-1трансформации, обеспечивающая стабильное получение L-форм бледной трепонемы.

С помощью электронной микроскопии изучен процесс биотрансформации Тpallidum в L-форму.

Для изолирования специфических антигенных комплексов из извитых и [.-фор« бледной трепонемы разработан рял последовательных манипуляций, позволивший получить антигенные компоненты клеточной стенкн н цитоплазмы,

Разработан методический подход к получению высокоактивной гипериммунной кроличий сывороткн против антигена I,-формы бледной трс-понемы.

Сравнительное изучение антигенной структуры родительской (извитой) и [,-формы Т.ра!кс1шп показало потерю части антигенов, связанных, по всей вероятности, с клеточной стенкой микроорганизма.

Предложен модифицированный метод постановки ИФА для выявления в сыворотке крови специфических Ь-антнтел к атипичной форме бледной трепонемы.

Впервые разработан экспрессный метод определения I.-антител в количественном иммунофлуоресцентном методе с использованием иммуно-сорбентной биотехнологии.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение «Способ культивирования Л-форм бледных трспонем» {положительное решение о выдаче патента от 5.12,2005 г. по заявке №2004130018),

Практический значимость диссертации

Получены высокоактивные специфичные трепонемные гипериммунные сыворотки в результате подбора эффективного способа иммунизации кроликов антигенным комплексом из Ь-форм Тра(Шит, которые могут быть использованы в качестве положительного контроля при постановке серологических реакций.

Предложена модификация постановки иммунофсрмснгного анализа на стекле для выявления [.-антител, которая может способствовать совершенствованию серодиагностики сифилиса.

Использование трепонемных I,-антигенных магнонымужюорбентов в количественной реакции иммунофлуоресиенини позволило повысить диагностическую ценность этой реакции.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций «Получение (.-форм бледной трспонемы к определение антител к ним в нммуноферментном анализе», которые были одобрены Ученым советом ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол №9 от 27 октября 2005г.) н утверждены директором института 27 октября 2005 г.

Л п роба пия работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на заседании Ставропольского краевого научного общества дерматовенерологов (Ставрополь, 2003); XI Итоговой (межвузовской) научной конференции молодых ученых н студентов (Ставрополь, 2003); научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэнндблагополучня н зашиты тграв потребителей» (Ставрополь, 2005); Ставропольского филиала Общероссийской общественной органнзанн «Российское общество дерматовенерологов» (Ставрополь, 2005).

Основные положении, выносимые на защнгу

1. Разработка рецептуры питательной среды для стабильного получения !-форм бледной трспонемы и изучение её изменчивости в процессе I-трансформацни методом электронной микроскопии.

2. Биотехнология получения специфического антигенного комплекса из извитых н Ь-форм бледной трспонемы.

3. Особенности технологии получения специфичной гипериммунной кроличьей актисыноротки к извитой и (.-форме бледной трепонсмы.

4. Результаты сравнительного изучения антигенной структуры извитой и измененной форм бледной трспонемы в некоторых серологических реакциях,

5. Модифицированный метод постановки ИФА для определения L-антнтел в сыворотке крови,

6. Биотехнология изготовления магноиммуносорбентного L-анти-генного лнагностикума дляКИФА

Дширшши личного участия автора

Экспериментальные исследования выполнялись лично автором нлн при непосредственном участии в составе научных групп в период с 2002 по 2005 гг. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора 50-70 %,

Публикации

Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР «Получение и характеристика атипичных форм бледной трепонсмы и их ревср-тантов» (№ ГР 01200311390) по Ставропольской государственной медицинской академии, отражено в 9 опубликованных научных работах (4 депонированные работы, 5 трудов в научных сборниках).

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Беличенко, Андрей Викторович

выводы Подобран состав полужидкой питательной среды на основе грнптнчсского гндролнзата казеина неглубокой степени расщепления, при введении в которую композиции индукторов трансформации ( натриевой соли бензнлленицнллнна 100-500 ЕД/мл и глнцина 1,0-2,0 г/л ) она обеспечивает стабильное получение Ь-форм бледной трепонемы,

2. По данным электронной микроскопии, биотрансформацня типичной бледной трегюнемы проходит через несколько фаз: освобождение клеток от значительной части наружных фибрилл; формирование единичных петель, переходящих со временем в узелки; формирование Ь-колоннй; появление зрелых 1,-форм, представляемых кольцеобразными структурами.

3. Разработан комплекс последовательных манипуляций, позволяющий получить чистую биомассу 1,-форм Т.ра1Мит в достаточном количестве для решения биотехнологии есхнх задач.

4. Методами физической деструкции микробных клеток (экструзня-УЗ - воздействие) и водно-солевой экстракции получен специфический антигенный комплекс (.-форм бледной трепонемы.

5. Результаты сравнительного изучения водорастворимых антигенных комплексов в некоторых серологических реакциях (РИД, ИФА, РИФ) родительской и 1--формы ТрЫШит свидетельствуют о потере, по крайней мерс, двух антигенов и частично - одного, связанных с ей клеточной стенкой.

В РИД показано наличие тропности бледной трепонемы к тканям сердца, печени, лимфоузлов н легкого человека, «по может играть определенную роль в патогенезе сифилиса.

6. Разработана высокоэффективная схема гипериммунизапни кроликов, позволившая получать иммунный ответ у 100 % животных - продуцентов на введение Ь-антигена бледной трепонемы. Такая иммунная сыворотка может служить положительным контролем при выявлении Ь-антител в серологических реакциях.

7. Для выявления L-антнтел в сыворотках крови разработан модифицированный метод постановки ИФА на стекле, а также трепонсмный L-антн генный магнонм муносорбентный диагностикум для количественного иммунофлуорссиентного анализа.

IlРЛКТНЧЕСКИE РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для получения L-форы бледной трспонемы использовать 03% питательную среду следующего состава;

- триптнческнй гидролизат казенна - 15,0 п

- экстракт кормовых дрожжей - 5,0 г,

- экстракт шнцевых дрожжей - 4,5 п

- натрия хлорид - 7,5 п

- глюкоза • 5,5 г,

- кислота тноглкколевая ■ 0,3 мл;

- цисткн - 0,75 г,

• сыворотка лошадиная нормальная ■ 20 %; натриевая соль бензнлпеииинллнн - 100-500 ЕД/мл;

- глиинн - 1,0-2,0 г/л;

- вода дистиллированная до 1000 мл.

2, Для наиболее полного извлечения водорастворимых L-антигенов нз биомассы атипичной T.pattidum в нативном виде проводить водно-солевую экстракцию в комплексе с -экструзией и ультразвуковой дезинтеграцией,

3, Для получения высокого иммунного ответа на L-антнген Tpalfidutn необходима гипериммуиизация, включающая не менее трех циклов иммунизации не только водорастворимыми изолягами. но и клеточными детритами на фоне введения нммугокорректора - феракрила.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эпидемия сифилиса последних лет вызывает серьезные опасения в связи с её лавинообразным ростом, трансформацией «классического» течения. вовлечением незащищенных слоев населения - детей, подростков, а также женшни детородного возраста, что является не только медицинской, но и социальной проблемой. При этом участились случаи развития нейроси-филнса. клинической и серологической резистентности, изменилось соотношение вторичного рецидивного сифилиса и свежих форм; происходит рост числа детей с врожденным и приобретенным бытовым сифилисом (Родионов A.M., 2000; Оннщенко Г-Гч 2002; Петрншнна С.В., 2004 и др.)

Известно, что Т.pallidum при определенных условиях образует L-формы и цисты, которые могут длительно псренстнроватъ в организме и приводить к развитию резистентного бактерионосительства- Формирование в популяции прослойки носителей бледной трепонемы во многом обусловливает цикличность эпидемического процесса.

Так как в настоящее время повсеместно антигены для всех специфических реакций на сифилис производят из типичных извитых форм возбудителя, часто серологические исследования помочь не MOiyr. В связи с этим, необходимость расширения исследований по изучению биологии атипичных форм бледной трепонемы, выделению их специфических антигенов и совершенствованию серодиагностики сифилиса, вызванного атипичными формами возбудителя, является своевременной н актуальной проблемой.

Культнвкрованнс бледной трепонемы на искусственных питательных средах представляет определенные трудности в силу её биологических свойств, тем более, если стоит задача получить L-формы этого микроба,

При отработке оптимальной рецептуры питательной среды в качестве основы мы использовали перевар Мартена, триптическнй гндролнздт казеина, пептонный бульон из бычьих сердец, печеночную питательную среду.

Кнгг-Тарощщ, в состав которых в различных сочетаниях и количествах дополнительно входили; нормальная лошадиная сыворотка (10-20 %), экстракт кормовых дрожжей (3-10 г/л), натрия хлорид (0,5-7,5 г/л), сернокислая магнезия (0,2-0,5 г/л), сахароза, глюкоза (3-7 г/л), кислота тноглнколеная (0.3-0,7 г/л).

В сериях опытов было испытано 15 вариантов питательных сред, на которые высевали VII штамм культу рал ьной бледной трепонемы II иммунологической группы (Ставрополь VII).

Взятые в эксперимент варианты питательных сред, но своим ростовым качествам были неравнозначны. Наиболее благоприятной оказалась питательная среда на основе ферментативного (тритггнческого) гнлролнзата казенна неглубокой степени расщепления следующего состава; трнптнческнн гидролизат казенна -15,0 г, экстракт кормовых дрожжей - 5,0 г, - экстракт пищевых дрожжей - 4,5 г. натрия хлорид - 7,5 Г; глюкоза - 5Т5 п кислота тиогликолевая - 0,3 мл; цистнн - 0,75 г; сыворотка лошадиная нормальная - 20 %; вода дистиллированная до 1000 мл. После стерилизации рН среда (7,0±0,2). На этой среде прирост биомассы составил (1,55*0,27) г/л.

Вторым индуктором L-трансформации служил глнцин. Об эффекте со-четвнного индуцирующего действия пенициллина и глицина имеются сообщения ряда исследователей (Тнмаков В,Д., Каган Г.Я. 1973: Madoff S. et al., 1967).

Процесс -трансформации бледной трепонемы в Ь-форму изучали при внесении различных доз натриевой соли бензил-пенициллина (25 ЕД'мл; 50 ЕД/мл; I 00 ЕД/мл; 250 ЕД/мл; 500 ЕД/мл) н глнцннв (0Л г/л - 2,0 г/л) в питательную среду после появления видимого роста исходной культуры

Особенности биотрансформацнн бледной трепонемы изучали электрон номнкроскопнческнм методом. Для электронной микроскопии культуру готовили следу ющим образом (Овчинников Н.М„Делекторскнй В.В. Усти-менко Л.М„ 1970): колонии извлекали из среды пастеровской пипеткой и последовательно осторожно отмывали от агара 3-4 раза в 5% растворе сахарозы, При наличии диффузного роста на полужидкой среде культуры тщательно смешивали с равным объемом 5% раствора сахарозы, центрифугировали сначала при 3000 об/мин в течение 20 мин, а затем отсасывали надосадочную жидкость и снова центрифугировали ее для осаждения трепонем при 6000 об/мни в течение (45±5) мни. Полученный осадок микробной массы исследовали в электронном микроскопе ]ТМ-]ООЕх(|ЕОЕ) с увеличением в 8000 -10000 раз методом негативного контрастирования.

В питательной среде, в которую добавляли пенициллин в концентрации 25 ЕД/мл И 50 ЕД/мл, а глицин - 0,1 г/л через 6-7 дней, наряду с типичными формами, появлялось небольшое количество измененных клеток со вздутиями и утолщениями в теле, При увеличении концентрации пенициллина до 250-500 ЕД/мл, а глицина - до 2,0 г/л происходили следующие трансформации микробной клетки бледной трепонемы. При внесении индукторов в период появления видимого роста на следующий день и в последующие 2-3 дня у исходных культур отмечалось изменение морфологии, соответствовавшее I фазе биотрансформации трепонем: освобождение клеток от значительной части наружных фибрилл, сопровождающееся уплотнением завитков спирали, и наличие свободно расположенных фибрилл, связанных с наружной оболочкой клетки трепонемы,

Далее в течение 3-И дней наблюдали 11 фазу; образование единичных петель из завитков за счет сокращения внутренних и коротких фибрилл, делающихся со временем контрастно непроницаемыми в виде узелков; на этом этапе фибриллы сохраняют свободное расположение и связь с клетхой,

11 фаза характеризовалась постепенным скручиванием трепонемы в кольцеобразную структуру, наличием связанных с клеткой свободно расположенных фибрилл , а также фибрилл, связанных внутри кольцеобразной структуры н формирующимся «концевым» отростком. В III фазу на 16-18 день начинали пояачяться L-колоиии, что свидетельствовано о переходе биотрансформацин в IV фазу (завершающую): зрелые клетки представлены кольцеобразными структурами, уложенными в виде клубка с нефрагмен-гированным чехлом и сформировавшимся «концевым» отростком, выраженными образованиями из фибрилл внутри клетки, отсутствием значительного количества свободно расположенных фибрилл снаружи клетки с сохранением свободных фрагментов.

Представленный процесс трансформации извитой формы бледной трепонемы иллюстрирует фазы образования цист-форм и переход к формированию L-формы бледной спирохеты. L-колонин - мелкие плотные непрозрачные образования крошхообразкон консистенции, правильной или неправильной круглой формы. Диаметр колоний варьировал от 0,3 до 2,2 мм. При фазовоконтрастной микроскопии I.-колонии состояли из шаровидных тел различных размеров с гомогенной протоплазмой неодинаковой оптической плотности, шаров с зернами в протоплазме- При элсктронномнкроскопнчс-ском исследовании срезов L-форм трепонсм видны различной величины и электронной плотности шаровидные нлн округлые образования. Некоторые из них совершенно гомогенны, с мелкой зернистостью. Внутреннее строение части из ннх сходно со строением ядра у бактерий и пронизано нитями, которые подобны ДНК.

Для получения биомассы 1,-форм бледной трепонемы исходную типичную культуру штамма Ставрополь VII высевали на полужидкую питательную среду предложенной нами рецептуры. При появлении видимого роста микроорганизмов добавляли индукторы Е-трансформацин (натриевую соль бензил-пенициллина 100 ЕД/мл и глицин - 1,0 г/л), инкубировали при 37 °С в течение 6-7 суток. Далее отбирали Ь-колон и и стерильной пастеровской пипеткой и вносили в полужидкую среду, в которую после появления видимого роста микробов добавляли 250 ЕД/мл пенициллина н 2,0 г/л глицина, Инкубировали аналогично 1 пассажа, После этого отобранные Ь-колонии вносили в полужидкий агар с добавлением Е-нндикаторов (500 ЕД/мл пенициллина и 2,0 г/л глниина), в те же сроки, при этом среду с посевным материалом тщательно перемешивали для получения диффузного роста. По истечении срока инкубации питательную среду с выросшими Ь-формамн бледной трепонемы центрифугировали при 3000 об/мин 20 минут. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость повторно центрифугировали при 10000 об/мин в течение (45±5) минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а её осадок клеток суспендировали в половине начальною объема в 5% растворе сахарозы. Эту манипуляцию повторяли 2-3 раза, в результате получая отмьггую от питательной Среды и продуктов метаболизма микробных клеток биомассу [.-форм бледной трепонемы в количествах, достаточных для изучения биологических свойств, антигенной структуры и конструирования диагностических тест-систем для выявления антител к измененным формам бледной трепонемы,

Процесс -трансформации микробной клетки при воздействии различным факторов приводит к структурным изменениям в клеточной стенке, протоплазме, ядерной субстанции. Эти изменения цитохимической структуры, химического состава и обменных процессов находят свое отражение в измс-нениях их антигенной структуры. Отличительной особенностью её является преобладание антигенных детерминантов цитоплазматической мембраны и цитоплазмы, которые иногда не выявляются у родительских бактериальных форм из-за преобладания у них антигенных компонентов клеточной стенки (Тимаков В.Д., Каган ГЛ., 1973).

За основу изолирования специфических антигенов мы приняли водно-солевую экстракцию и комплексе с экструзией и ультразвуковой дезинтеграцией микробных клеток.

Биомассы типичной н (.-форм бледной трепонемы суспендировали в дистиллированной воде и замораживали при 50 °С в течение 24 часов. После чего подвергали их 5-6 кратной экструзии на Х-прсссе. Затем центрифугировали при 20000 об/мин (45±5) мин. Надосадочную жидкость декантировали, а осадок клеток экстрагировали 3 % раствором хлорида натрия с добавлением цетавлона в течение 24 часов, предварительно подвергнув ультразвуковому воздействию при 44 кГц в течение 15 минут. После экстракции повторно центрифугировали при 20000 об'мин (45±5) минут. Осадок суспендировали в дистиллированной воде в соотношении I '5. Надосадочныс жидкости после 1-го и 2-го центрифугирования объединяли, помещали в диализную трубку и диалнзнровалн против дистиллированной воды в течение 24 часов. Детрит и объединенные надосадочныс жидкости разливали в ампулы (раздельно) ШПВ-6 по I мл и сублимировали.

Лиофнлизированные водорастворимые белковые антигенные комплексы н летрнты служили нммуногенами при получении гнпернммунных сывороток, а также для конструирования экспериментальных диагностических препаратов.

Для получения высокоактивных и специфичных антисывораток типичной и Ь-форм бледной трепонемы мы применили разработанную производственную схему иммунизации животных-продуцентов гнпернммунных сывороток с нммуномодуяятором феракрнлом (Тюменцева И.С., 1996),

Для получения более полного спектра антител нами при иммунизации кроликов, кроме растворимых антигенных комплексов, введены клеточные детриты типичных н измененных форм Т.pallidum.

Способ гипернммуннзацни заключался в следующем: в первом цикле (грундиммунизация) кролнкам'продуцентам пятикратно вводили водорастворимые антигены в повышающихся дозах от 1 до 3 мг на инъекцию в смеси с феракрнлом, Первые две инъекции делали подкожно в подушечки задних лап и в подмышечные лимфатические умы. Остальные три инъекции иммуноген вводили внутримышечно в бедра задних лап попеременно- После пятой инъекции животным давали отдых в <30±1) дней. На 30-й день от животных получали 3 мл нмл1унной сыворотки, добавляли половинную дозу ангигена в каждую сыворотку. Полученный комплекс антиген-антитело вводили четырехкратно по 0,5 мл с промежутками в 3-4 дня в краевую вену уха тому же животному, от которого получена иммунная сыворотка. Одновременно внутримышечно кроликам инъецировали в три-четыре точки бедра смесь водорастворимых антигенов и детритом с феракрнлом.

Специфическую активность иммунных сывороток оценивали в реакции иммунодиффущи в агаровом теле по О- Оухтерлони, Пробное взятие крови проводили у всех животных через 7 дней (24 день) после грундиммуннзации, перед третьей инъекцией второго цикла (54 день) и через 7 дней (66 день) после окончания второго цикла.

Титры специфической активности гнпериммунных сывороток в РИД у животных, иммунизированных антигенами из типичных форм бледной тре-понемы, после взятия крови на 66 день от начата иммунизации достигали показателей 1:48,0±12,5, что вполне удовлетворяло поставленным нами задачам. V всех животных, иммунизированных антигенами из измененных форм T.pallidum в эти же сроки, развивалась ответная иммунологическая реакция, но титры специфических антител в сыворотках были невысокими 1:3,2±0,62.

Эгн результаты диктовали нам необходимость проведения третьего цикла иммунизации. После отдыха (20±|) день была проведена дополнительная иммунизация, состоящая из четырех инъекций смеси водорастворимою Ь-антигена (3 мг) с детритом (1 мг), при зтом половину дозы вводили кролику' внутривенно, вторую половину дозы смешивали с феракрилом и вводили внутримышечно Через 7 дней после последней инъекции (98 дней) титры специфической активности Ь-антител у всех кроликов, оцененные в РИД, повышались в течение всей гинернммунизаиии и достигали 1:41,6± 11,7.

Антигенную структуру Ь-варнантов бледной трепонемы и антигенные взаимоотношения с извитой формой изучали в реакции иммунодиффузин в агаровом геле по О.ОисЬ1ег1опу, прямой реакции нммунофлуоресценцни (РИФ) и непрямом иммуноферменшом апатите

Результаты серологических реакций с использованием антигенов и ги-лернммунных кроличьих сывороток к ним из извитых и Ь-форм бледной трепонемы свидетельствуют о потере, по крайней мере, двух антигенов и частично одного. В связи с тем, что процесс Ь-трансформации в первую очередь затрагивает клеточную стенку микроорганизма, по всей вероятности, эти антигены могут быть локализованы именно в ней.

Показано наличие тропностн бледной трепонемы к некоторым тканям макроорган изма, что может играть определенную роль в патогенезе сифилиса и его серодиагностике,

Высокоспецифнчный водорастворимый антиген Т.раПШит явился основой для конструирования трепоиемного Ь-антигенного магнонммуносор-бентного диагностикума для выявления антител в количественном иммуноф-луоресцентиом анализе. В качестве твердой фазы использовали органокрем-незем - алюмосиликат, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полимера-декстрана (полиглюкнна) н поверхностно-активного вещества - вторичного алкнлсульфата натрия.

Процесс получения МИС заключался в следующем: к I г алюмосн-лнкатного наполнителя добавляли 40 мл 3 % водного раствора полиглюкина и 3 г магнитного порошка (РегОз), перемешивали и проводили гелеобраэова-ние при температуре (22±4) °С 2 часа. Полученный сорбент высушивали при 100-110 С в течение 30 мин, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц 60-120 микрон.

Активирование твердофазного носителя вторичным алкнлсульфатом натрия проводили следующим образом: к ] г полученного алюмоснлнкатно-го МС примешивали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 мл вторичного алкилсульфата натрия, Смесь инкубировали 1-2 часа при температуре (37±1) °С, затем сорбент отмывали 100 мл 0+9 % раствора хлорида натрия и 100 мл дистиллированной воды, Для придания сорбенту аффинных свойств к 0,1 г активированного сорбента приливали I мл Ь- антигена с содержанием белка (3,5±0,1) мг/мл, рН 7.0-7,2, Смесь оставляли при (20±2) °С в течение одною часа, Далее надосадочиую жидкость удаляли, а носитель промывали 0,15 М раствором хлористого натрия до 0 экстницнн на спектрофотометре.

Для проведения количественного нммунофлуоресцентного анализа использовали люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Ф-8, регистрирующий уровень свечения магнитных «ранул , оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. К насадке подсослииялн источник тиса УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный типа В7-76, Рабочее напряжение составляло 800-900 В, увеличение объектива и окуляра хЮ- Применяли возбуждающие светофильтры БС-8-2,СЗС-7-2, ФС-1-6, диаметр зонда фотометрической насадки 0,5 мм.

К исследуемой сыворотке добавляли 300-500 мкл 10 % Ь-трепонемиого антигенного магнонммуносорбента. Экспонировали 1-2 часа при температуре (24±1) °С перемешивая. По истечении времени контакта гранулы МИС собирали магнитной палочкой и переносили во флакон с фибиологическим раствором для отмывания, При погружении стеклянного чехла, в который вставлена магнитная палочка (длинный металлический шток с постоянным магнитом на конце), в жидкую фазу, где находились гранулы МИС, последние примагничивались к погруженному конусу стеклянного чехла. При переносе устройства в другую жидкость с целью промывки МИС выдвигали постоянный магнит, при этом гранулы сорбента свободно рассеивались в объеме жидкости, Для тщательной промывки МИС эту процедуру повторяли несколько раз (Вфременко В.И., Тюменцева И.С., Пушкарь В.Г.,1997). Из флакона сливали физиологический раствор, фиксируя гранулы постоянным магнитом, вносили 300-500 мкл иммуноглобулинов против глобулинов кролика флуоресцирующих сухих (коммерческий препарат НИИЭМ им. Н.Ф.Гамапеи) в их рабочем разведении и экспонировали 20-30 минут при температуре (24±1) "С. После контакта [ранулы сорбента отмывали переносом с помощью магнитной палочкн в стеклянном чехле 5-6 раз физиологическим раствором и I раз дистиллированной водой. Отрицательным контролем служили гранулы МИС. неконтактировавшие с исследуемой сывороткой.

Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 20 мкл наносили на предметное стекло и помещали на столик микроскопа. После обнаружения а поле зрения гранул сорбента закрывали полевую диафрагму и снимали цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Определяли среднеарифметические значения величины флуоресценции опытных и контрольных гранул и пространства между ними - фона. Интенсивность люминесценции МИС (М) представляла собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона:

М) - Мгранул - М фона. За положительные принимали результаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в 2,5 и более раз превышал аналогичный показатель контрольных гранул.

Таким образом, нами впервые разработан трепонемный магноиммуно-сорбентный Ь-анти генный лнагностнкум для количественного нммунофлуо-рссцентиого анализа . который позволяет при контакте со спссЕифнчсскнмн I,-антителами осуществлять динамическое селективное их концентрирование, образуя иммунные комплексы, определяемые в дальнейшем соответствующей меткой.

Кроме этого, для выявления Ь-актнтел в сыворотках крови намн апробирован способ постановки ИФА на предметном стекле.

Из биомассы Ь-форм бледной грепонемы готовили суспензию. Последнюю в количестве 50 мкл наносили дозатором на обезжиренное предметное стекло. Мазки высушивали на воздухе, после чего фиксировали в ацетоне в течение 5 мин На фиксированный мазок антигена наносили двойное разведение испытуемой еыворотки, Параллельно ставили отрицательный контроль: на мазок наносили эабуференный физиологический раствор (рН 7,2±0,1). Мазки инкубировали в течение 30 мин в термостате при температуре 37 °С во влажной камере, затем последовательно отмывали по 1 мин в ЗФР и дистиллированной воде, подсушивали на воздухе и наносили конъю-гат нммуноперокендазный антикроличий в его рабочем разведении. После инкубации в течение 30 мин при температуре 37 °С отмывали ЗФР и дистиллированной водой, подсушивали н наносили субстрат-ннлнкаторный раствор (10 мл шпратного буферного раствора рН (5,0±0,05), 5 мг орто-фениленднамина н 0,05 % перекиси водорода), Инкубировали при 37 °С без доступа света в течение 10 мин. Для остановки реакции использовали 2 М раствор серной кислоты, который наносили на мазки в объеме 50 мкл. Результаты реакции учитывали визуально. На отрицательном контрольном мазке реакционная смесь оставалась неокрашенной, на опытных (положительных) субстрат окрашивался в оранжево-желтый цвет разной интенсивности в зависимости от разведения исследуемой сыворотки. Для количественного определения результатов ИФА продукт реакции переносили в лунки микроплаты и регистрировали оптическую плотность на вертикальном фотометре «Multiskan» (Флоу Лаб, Англия), считая анализ положительным, если ОП исследуемого образца а 2 и более раз превосходила среднее значение ОП отрицательного контроля.

Предлагаемый нами способ постановки ИФА значительно упрощает, ускоряет и удешевляет проведение анализа. Прочная адгезивная фиксация корпускулярного L-антнгена на стекле исключает недостатки и последствия десорбцнонных процессов. Вследствие нею такие стекла можно заготавливав заранее и применять для постановки ИФА. по крайней мерс, не менее двух лет (срок наблюдения), что немаловажно при проведении большого количества исследований.

Таким образом, нами показана возможность определения L-актнтел в сыворотках крови в модифицированном методе ИФА. Дальнейшие клинические испытания будут способствовать совершенствованию серодиагностики, в первую очередь, больных врожденным, поздними и серорезистснткыми формами сифилиса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Беличенко, Андрей Викторович, Ставрополь

1. Азнзов Л. Получение н серологическая оценка контрольных сывороток для лабораторной диагностики сифилиса. Дне. . канд. мед. наук. -Алма-Ата, 1989. 211 с.

2. Аковбял В. А., Резайкнпа А. В., Тихонова Л, И. Характеристика эпидемиологических закономерное гей, определяющих распространение заболеваний, передаваемых половым путём в России // Вести, дермаго-венерол. 1998. К - С. 4-6.

3. Александров М В. Пиратннская В, А., Соколовский В. 8. Циклический характер заболеваемости сифилисом и i ^специфическая резистентность макроорганнзма // Вести, дерматол. 1997. - № 3. - С. 48-51.

4. Аравийская Е. Р, Социально-психологические особенности и их взаимосвязи с рискованным сексуальным поведением больных с приобретенным сифилисом И Рос. журн. кожи, и венер. болезней 1999. - № 4. - С. 17-19.

5. Афанасьев Е.Н Сравнительная характеристика антигенной структуры рода Brucella. Дисканд, мед, наук, Саратов, 1984, - 173 с.

6. Афанасьев ЕЛ. Научно-методические аспекты экспреес-лиагностнкн возбудителей особо опасных эоонозных инфекций (чума, бруцеллез. сибирская язва). Дне. .доктора мед. наук. Ставрополь, 20Q0. -307 с.

7. Афонин Л.В., Молочков В.А., Буеверов А.О- Гепатиты как причина серорсзнстентности при сифилисе и ложноположнтельных серореак-ций И Рос. журн. кожн. и венер. болезней 2003. - № 2. - С. 48-50.

8. Ашмаркн И. П., Воробьев А. А^ Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962. - 180 с.

9. Бабий А. В. Клиник о-ссрологнчее кая оценка моднфиннрванного иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса: : Днсс. кайл мел- наук. М., 1990, - 127 с,

10. Базнков И,А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов диагностики сифилиса. Дис, доктора мед, шук. - Ставрополь, 2000.-200 с.

11. Батыршин Р. Ф Совершенствование организационных форм активного выявления больных сифилисом: Днсс. ,. канд. мед. наук. М,,1993. - 234 с,

12. Белнова В.Н. Значение зерен-гранул культуральиой бледной трепонемы для развития этой трепонемы. Дис. ,. канд, мед, наук. - Ставрополь, 1956.- 168 с.

13. Белнова В, Н, Реакция иммунофлюорссиенини //Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путйм, М,, 1987. -С.126-133,

14. Беднова В Н. Им.муиоферментиый анализ //Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. М: Медицина, 1987. С. 133-138.

15. Беднова В. Н. Лосева О. К. Исторические аспекты серодиагностики сифилиса II Вести, дерматол. 1985. - № 2. - С. 14-20.

16. Вельская H.A., Митина B.C., Вейнблат В.И. Мнкромстод фракционирования и идентификации белков бактерий //Материалы СевероКавказской бнохим. конф. Махачкала, 1970- С.270-271.

17. Белнченко A.B. , Латышев O.A. Получение 1,-форм бледной трепонемы //Там же. 2003. - С56.

18. Белнчскко A.B., Тюмснцева И.С, Сравнительное изучение антигенной структуры типичной и L-форм бледной трепонемы в некоторых серологических реакциях //Ставрополь, 2005. 10 с. - Деп. в ВИНИТИ, J&1434-В2005.

19. Белнчскко A.B., Тюменцева И.С. Выявление трепонемных L-антител в модифицированном нммуиоферментном анализе // Ставрополь, 2005. II с. Деп в ВИНИТИ, №1435-В2005.

20. Вельская H.A., Митина B.C. и др, Микрометод фракционирования и идентификации белков //Лэб. дело. 1972, - №10. - С.514-516.

21. Бендикене В,Г,, Юодка Б,А,, Казлаускас P.M. и др. Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих магнитными свойствами. Получение и характеристика магнитных производных хитина -"'/Прикладная биохимия и микробиология, 1995. - Т.31, № 4. - С.393-400.

22. Богомаз В,И, Синтез, свойства и применение новых видов модифицированных лирогенкых кремнеземов. Автореф. дне. . канд. хим. наук.1. Киев. 1982.-21 с.

23. Бухарин О.В. Механизм переметенцин бактериальных патогенов //Вести. Рос. акад. мед. наук. 2000. - №2. - С.43-49.

24. Бухарович А. М. Особенности эпидемиологии сифилиса у жителей сельской местности. // Актуальные вопросы бесплодн. браков, обусл. БППП: Тез. докл. респ. научно-нракт. конф. дерм.-вен. и акуш.-гннек. 1-2 дек. 1989. Свердловск. - 1989. - С. 14.

25. Ванеева Л.И., Грндчина И.Ю., Пантелеев О-Н. и др. Изучение сорбинонной способности полнетирольных планшетов, используемых в иммуноферменгном анализе // ЖМЭИ. X? 9, - 1989. - С86-89.

26. Вейнблот В.И., Каминский В В. и др. Иммуноднскэлектрофорез антигенов чумного микроба //Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1972. - Вып. 26. - С. 196-200.

27. Вирусные гепатиты: Сборник нормативно-методических материалов. М„ 1998. С. 126.

28. Волкославская В. Н. Заболеваемость сифилисом на Украине в XX веке (обзор литературы и собственные данные) it Врачебное дело. -1998. I. С. 197-202.

29. Воробьёва 3. Г. Фокина Е. Н. Экспериментальные основы реакции латекс-агглютинации (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. 1992. - № 7-8, - С- 60-62,

30. Вясслева С. М. Действие различных препаратов пенициллина на бледную трепонему Дне. доктора мед. наук. Казань, 1954. 378 с.

31. Вяселева С.М., Устименко М.М. Получение L-форм бледной тренонемы под влиянием сывороток больных сифилисом //ЖМЭИ. 1964. -№12.-С.104-109.

32. Гамалея 11.Ф. Гетероморфизм бактерий под влиянием солей лития //Врач. 1894. - Т.15-, Na 19. - С.541 -543.

33. Гельтцер Р. Р. О культивировании патогенных спирохет // Анналы Мечннковского института. 1936, - Т. 4. - Вып.2. - С. 359-364.

34. Гельтцер P.P., Тутова Л.И, Серологические свойства различных культур бледной спирохеты в опытах с сыворотками крови больных сифилисом //Ученые записки: сб. науч. тр, Ставропольского мед. нн-та, Ставрополь, 1949.-TX-CI37-14I

35. Дмитриев Г. А. Тест-системы в лабораторной диагностике сифилиса // Вестн. дерматол. 1996. - № 6. - С. 34-37.

36. Дмитриев Г.А., Аковбян В.А.» Тихонова Л.И. Эволюция лабораторной диагностики еифилнеа //ИППП. - 2002.- С. 35-37.

37. Дмитриев Г.А.Г Афонин А.В. О возможной причине возникновения ссрорезистенгностн при сифилитической инфекции // Вестник дерматол.- 2003. Яг 2, - С. 47-48,

38. Дмитриев Г. А., Брагина Е. Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса // Вестник дерматол. 1996. - № 2,3. - С. 29-38.

39. Дмитриев ГЛ. Галншников Ю.А., Зверева Н.С- Опыт применения нммуноферментного анализа для лаборатоной диагностики сифилиса //Вестн. дерматол. 2000. - № I. С. 6 - 8.

40. Дмитриев Г. А.т Киселева Т. А. Применение ИФА для серодиагностики сифилиса // Актуал- вопр. дерм, и Венер.: Сб. тр. юбил. конф. поев. 5-летию каф. кож. и вен. болезней педиатр, фак. РГМУ, 5-6 нюня. М., 1997.- С. 36-37,

41. Дьяченко Д.А., Оловянннков О.В. Количественная постановка мнкрореакиии преципитации с карднолнпиновым антигеном // Вестн, лерма-то-венерол, -1988. 12. С, 44-46.

42. EpfMKH 8-Ф-. Барабонов Л.Ш., Гаснч ЕЛ. н др. Серологическая и молекулярно-бнологнческая диагностика инфекций, передаваемых половым путем // Вести, дермато-венерол. 2002. - № 2, - С 22-29,

43. Ефременко В,И, Магносорбенты в микробиологических исследованиях Из-во «Ставрополье». - Ставрополь, 1996- - 131 с.

44. Ефременко В-И-, Пушкарь В.Г., Трофимов Е,Н„ Перов В.Ю. Получение и применение магннтых сорбентов в методах нммуноанапиза микроорганизмов //ЖМЭИ. 1989, - № 12. - С Л 00-1 Об,

45. Жарннкова И.В. Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей. -Автореф, дне ,, доктора бнол. наук. Ставрополь, 2004. - 39 с.

46. Заболотный Д.К. Спирохеты при сифилисе //Русский врач. 1905.-№23.-С. 741-742.

47. Заболотный Д.К. Сифилис, его патогенез и этнология СПб.,1909.-СЛ-17.

48. Завьялов А.И„ Оркнн Б.Ф., Бакулев АЛ-, Румянцева Е,В, Антибиотики резерва в терапии ранних форм сифилиса //Рос. журн. кож, и вен. болезней. 2001. - №1C.58-6J.

49. Ильин М.И. Метод получения гетерогенных протнвоорганных сывороток с высоким тигром комплемент-связывающих антитет //Лабораторное дело, 1991, - №5- - С.З15.

50. Инструкция по лечению и профилактики сифилиса, М., 1976.

51. Инструкция по постановке иммуноферментного анализа (ИФА) на поверхности твердофазного носителя серо- и ликвороднагностикн сифилиса М ,1988 - С.18.

52. Информационное письмо МЗ РФ от 01.02,1955. №2510/3139 9527. М„ 1995,

53. Ирлатова Г.Р., Абдулаев А Х. Изучение динамики уровня иммуноглобулинов классов G, М, А при экспериментальном сифилисе кроликов //Вест- дерматол. -1976, №6, - С 30-32.

54. Каган Г.Я. О природе L-форм бактерий. В, кн.: «Изменчивость микроорганизмов и батериофагня», - М: «Медгиз». 1960. -С. 182-189.

55. Каган Г.Я., Левашев B.C. О методике получения L-форм гемолитического стрептококка группы А и их реверсии в бактериальные культуры //Жури, микробнол. 1959. - №2. - С68-71.

56. Каган Г.Я., Савенкова В.Т. Методика получения и морфологические особенности L-форм C.diphieriae //Жури, микробнол. I960. - №3. С.55-58.

57. Kaj-зн Г.Я., Щеголев А.Г., Прозоровский С-В. О патогенных и нммуногенных свойствах L-форм Styphimurium. полученных пол влиянием псишшллнна //Антибиотики. 1964. - №8. - С.722-726.

58. Калинина О. А., F-мельянова И- В., Лактионова М- А. ИФА в серодиагностике сифилиса // Современные вопросы дермато-венерологии: Сб. юбил. науч. тр., посвящ,70-летню обл. кож.-вен. дисп. г- Курска, Курск- -1997,-С 65-67,

59. Катаев Р.А, Проблемы БППП в условиях перехода к рыночной экономике //Новости лераматол, и венерол, 1998. - № 3, - С,9-12,

60. Каральннк Б.В-, Денисова Т.Г., Кешнлсва З.Б. Актнгенсвязы-вающие лимфоциты (АСА) и антитела а диагностике сифилиса //ИППП. -1999 №5, -С

61. Карпенко В,В., Сачков В,И. Обезболивание животных в эксперименте Методические рекомендации - М-, 1985, - 53 с.

62. Карышсва Л.Л, Разработка и апробация технологии промышленного производства бактериологического пептона in мясо-костных бульонов побочных продуктов мясоперерабатывающих предприятий //Bien. Пол-тав. Дсрж. Аграр. Акад. 2002. - Jfel, - С.66-69.

63. Ким Э, Г, Особенности нммуногснстнкн и иммуногенеза при сифилисе (клнннко-экспериментальныс условия); Дне, ,,. докт. мед, наук. -Ташкент. 1992. - 282 с.

64. Киселёва Г. А., Беднова В, Н„ Дмитриев Г, А, Постановка ИФА для серодиагностики сифилиса // Вестн дерматол, 1998. - № I С. 39-42.

65. Коробкова Е,И., Котельников Г Ф. Цитологические наблюдения над В,paratyphi В в процессе диссоциации //Вестн. мнкробнол., эпндемнол. и паразнтол. 1934. - T.XIÎL ЯаЗ. - CI 75-187,

66. Короткий Н. Г. Чиненова F. Г. Современные особенности течения врождённого сифилиса // Педиатрия. 3998. - № 3, - С. 61-64,

67. Котлярова Г.А. Биологические свойства Listeria monocytogenes. -Дне,,, канд. мед. наук. М.( 1970, - 175 с.

68. Котлярова Г.А.+ Прозоровский С,В., Бакулов И.А., Чевелев С.Ф Биологические свойства L-форм Listeria monocytogenes //Вестн. АМН СССР. 1969 -№5.-С. 84-90.

69. Котровскнй А- В. Разработка и клиническая оценка методики постановки нммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса: Дис. . канд, мед. наук. М., 1986. 195 с.

70. Котровсккй А- В., Бсдновз В, Н. Значение иммунных нарушений н патогенезе распространенных н тяжелопротекаюших лерматомикоюв н методы их терапевтической коррекции. М„ 1982. - С. 167-170.

71. КрнчсвскнЙ И.Д., Рубинштейн ПЛ. О плеоморфизме бактерий Сообщение III. О плеоморфизме у В .paratyphi abdomoinalis в связи с условиями, определяющими его выращивания //ЖМЭИ. 1936. - Вып. 16, №5. С.564-575.

72. Кругских Е. С-, Яиуха М- В., Шевченко А. А. Ко1гтроль сифилитической инфекции с помощью чомлыотерного моделирования И Вести, дер-матол. 1998, - №1,-С. 18-20.

73. Кулагин В.И., Селисский Г.Ж., Богуш П1~. и др. Проблема сифилиса центральной нервной системы И Вести, дермато-венерол. 2003. - № 2. -С.63-66,

74. Куфлина С .А. Павлова Т.Н. Эвтаназия экспериментальных животных: Методические рекомендации по выведению животных из экспериментов. М. 1985. - 9 с.

75. Левашов В.С, Генетические механизмы образования L-форм бактерий и перспективы дальнейших исследований //Вести, АИН СССР, 1965, -№ -С39-45.

76. Левашов В,С. Генетическая характеристика L-форм бактерий, процессов их образования н реверсии. Дне. .доктора мед, наук, М„ 1966, -315с.

77. Ломоносов К М, Актуальное шгтервыо Главное в диагностике н терапии сифилиса// Рос, жури, кожн, и вен болезней. 2002. -№5. С.56-60.

78. Лечение и профилактика сифилиса. Метод, реком. - М., 1993.

79. Лечение и профилактика сифилиса (метод, указания). М., 1999.

80. Лосева О. К. Сексуальное поведение больных енфнлнеом (эпи-демиолошческие и медико-социальные проблемы): Дне, , докт, мед. наук. М., 1991 -280 с.

81. Лосева О. К., Бабкова И. Н- Изучение сексуального поведения мужчин и женщин, заболевших сифилисом (панельное исследование) //Вести, дерматол- 1999. - № 1. - С. 43-45.

82. Лосева О. К., Доля О. В., Чиханатова А. Г. Трансфузнонный сифилис // Новое в трансфузиологии- 1997. - № 18. - С, 55-58.

83. Лосева О, К,. Нашхосв М, Р. Социальное происхождение, сексуальное поведение, потенциал в распространении инфекций, передающихся половым путём у женщин, представляющих платные сексуальные услуги //Вестн. дерматол. -1999. Яг 2. - С 20-24.

84. Лосева О,К,, Тактамышева ЭЖ, Штульман Д.Р, Современный нейроенфилне: диапюстика, лечение н тактика ведения больных // Рос. журн, кожи, вен, болезней, 999, - №4, - С.39-44.

85. Лузан Н, В. Концепция первичной профилактики ИППП у несовершеннолетних II Вести, дерматол, 999, ■ № 4. - С. 16-18.

86. Лямперг И.М. Этиология, иммунология н иммунопатология ревматизма //М-, 1972,

87. Мавров Г. И., Гебенко Т. В. Сифилис во второй половине беременности: особенности диагностики и лечения // Педиатрия, акушерство и гниекол. 1998. - № 3. - С. 88-92.

88. Мешанднн А.Г., Ванеева Л.И., Даргеева Tj\. Проблемы потерн активности сорбированых лнгандов в гетерогенном нммуноферментном анализе // ЖМЭИ. Ni 4. - 1994. - С.52-55.

89. Методические рекомендации по контролю пептидного состава гидролизатов для выращивания бактериальных культур //Вссрос. гос. НИИ контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов. М„ 1994. - 7 с.

90. Миракян M. Е,, Бабаян К, Р. Реакция РИГА в серологической диагностике сифилиса // Современные проблемы клинической и теоретической медицины: Сб. научи. Трудов. 1998. - С. 152-154,

91. Нанашнн С.Б., Фомина И.П. Рациональная антибнотнкогерапшг -М., 1982.

92. Навроцкий А. П, Медико-социальная профилактика венерических заболеваний среди несовершеннолетних; Дис. канд. мед. наук. -Минск. 1989. - 170 с,

93. Назаров П. Г., Старченко M, Е., Касаткин Е. В,, Данилов С. И. Новая концепция формирования серорезистентностн при сифилисе // Вести, дерматол. 1999. - № 6. - С. 17-19.

94. ES. Овчинников И. М., Беднова В. Н., Делекторский В. В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путём. М., 1987. - 303 с.

95. Овчинников Н.М., Делекторский В.В,, Устименко Л.М.Ь-формы бледной трепонемы (Электронном нкроскопнчес кис исследования) //Вести, дермагол и венерол. 1970. - №8. -С. 53-57.

96. Овчинников Н. М„ Резникова Л. С, Стоянова О.А, Специфические и неспсцифнческие факторы иммунитета при экспериментальном сифилисе у кроликов //Вест, дерматол, -1980. №6, - С. 27-28.

97. Оке май Г. А. Смоловский К., Ном Дж, Математическое моделирование распространения эпидемического сифилиса. // ЗППП.- 1996. -№ З .-С, 21-32.

98. Олнсов А. О., Комлев М.В., Левина Т В. и др. Эпидемиология и профилактика сифилиса у Детей //Рос. жури. кожи, н вен. болезней. 2005- -№1 -С.35-37,

99. Олифсрова Э.В, Влияние стимулятора роста микроорганизмов ТС-1 на основные свойства знтеробактернй //Диагностика, лечение н профилактнка заболеваний сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр, -СтавропольгГСХА, 1998. С.55-58.

100. Ометов В- К., Авилов Е. II . Капустюк Л. П. Влияние сезонности на распространен не венерических заболеваний в Ростовской области // Вести, дерматол. 1998. - № I. - С. 21-23.

101. Ометов В.К. Моргуль МЛХ. Уразовская Е.В., Крушинекая И.А. О применении нммуноферментного анализа в диагностике сифилиса //Вестн, дерматол. 1997. - № 3. - С.46-47.

102. Онншенко Г.Г. Контроль н ликвидация инфекционных заболеваний стратегическое направление здравоохранения //Журн, мнкробнол, -2002а. - №4. - С.3-16.

103. Оркни В.Ф., Бакулев АЛ., Румянцева Е.В. и др. Резистентность клинических проявлений вторичного сифилиса и специфической терапии //Рос, журн. кож. н вен. болезней. /1999. - №2. - С. 44-45.

104. Петрншина С,В, Лабораторная диагностика сифилиса //Российский журнал кожных и венерических болезней. -№2, 2004, - С.46-49.

105. Патрушева Н,Б,, Рогачей Л.Н., Дегтярева Г.Н., Бсйкин Я,Б. Скри-нннговый КСР для диагностики сифилиса // Клин. лаб. диагност. 1997, - N« 6. - С. 66-67,

106. Пожарская В.О, Особенности иммунного ответа кроликов на введение антигенов из бледных трепонем //Тез. докл.7 Всерос. съезда дерма-тол. и венер. Казань. - 1996, - Т. 3, - С. 73-74.

107. Покровский В. И. Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития // Медицинская генетика н иммунология. -М., 1986 С. 4-5.

108. Потекаев Н.С., Потекаев СЛ. Заметки к этнологии и патогенезу сифилиса /.'Этнология н патогенез сифилиса 2002. №1. - С.63-68.

109. Практическая химия белка: М,; Мир, 1989, С.300-301,

110. Приказ Хз 1179 от 10 октября 3983 г, «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения, М„ 1983.

111. Приказ Министерства Российской Федерации X? 87 от 26,03.01 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» 51 с,

112. Прозоровский С.В, Бактериологические свойства 1.-форм патогенных стафилококков. Дне. канд. мед. наук. - М.„ 1959. - 135с,

113. Прозоровский С.В. Проблема патогениости Ь-форм бактерий н миконлазм. Дне. ♦♦♦ доктора мед. наук. - М.+ 1970. - 320 с,

114. Прокопов И. И. Синтез моноднсперсных функциональных полимерных микросфер для нммуноднагностнчсскнх исследований. // Успехи химии 1996.-Т. 65.-№2--С. 178-192.

115. Родионов А.Н. Сифилис,- Руководство для врачей, С.-Г16.: «Питер», 2000,-184 с.

116. Родионов Ш1„ Третьяков В-В. Колларгол и протаргол , свойства // Препринт: коллоидное серебро. Физнко-хнмнчсскнс свойства. Применение в медицине. Новосибирск, (992- -С.5-14,

117. Роуз Н. Р, Основные аспекты аутоиммунного заболевания. Механизмы иммунопатологии,-М„ 1989, С. 165-180

118. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней /Под ред, К.И.Матвеева. М.: Медицина, 1973. - 623 с.

119. Санофи Диагностике Пастер. Стандартизация методов исследования сифилиса // Информацнонно-мегодичеекое пособие.- М., 1998. - 23 с.

120. Сафронова A.B., Маликов В.Е., Бурова A.A. и др. Аспекты использования иммуноферментного анализа в серологической диагностике сифилиса //Клиническая лабораторная диагностика . 1999. - №11. - С,22-23.

121. Семенов С.М. Пептоны используемые в микробиологии (Использование в качестве компонентов питательных сред). М.,1988. - 33 с,

122. Серегин С В., Бедавнн П.Б., Бабкина И-Н- и др. Получение ре-комбннантных антигенов Trponema pallidum и их применение в нммукофер-ментной диагностику сифилиса // Веста, дерматол, 1979. - № 8. - С, 48-51

123. Серегин С.В., Белавин П.Б., Бабкина И.Н. и др. Получение ре-комбинантных антигенов Treponema pallidum и их применение в иммуиоферментной диагностике сифилиса, // Вести, дерматол 2000. ■ № 2. С. S 8.

124. Сержантова Т. И Опыт культивирования бледных трепонем ив тиогликолевой среде H Вести, дермам«. 1979. - Ns 8. - С. 48-51.

125. Сивак В.В., Чеботарев В.В., Чеботарева Н.В. Сифилис в пенитенциарной системы //Ставрополь, 2003. 166 с.

126. Сидорова Е. В., Ляхов В. Ф. Значение определения гфотивотре-лонемных IgM-антител в серодиагностике сифилиса. //Бюллетень ассоциации САНАМ «Инфекции, передаваемые половым путем». 1995. - № 4. — С, II* 13.

127. Скичко IL Д. Гидролнзаты животных белков основа питательных сред для промышленного производства биопрепаратов: Авторсф. дне.доктора биол. наук. М.т 1992. - 49 с.

128. Скрнпкин (O.K., Курбаиова A.A., Шарапова Г.Я, СелникнЙ Г.Д. Инфекции, передаваемые половым путем. Практическое руководство //М.; «МЕДиресс». 1999, - 361 с.

129. Скрипкнн Ю, К,, Резайкння А, В, Иммунопатологические механизмы патогенеза хронических дерматозов: М,, 1997, С. 94-98.

130. Соколовский Е, В. Серологическая резистентность после лечения сифилиса: (причины и факторы развития, профилактика н лечение): Автореф. дис., докт, мед. наук. С-Пб. - 1996. - 40 с.

131. Стоев К.Г., Чибнсова В. А,, Ш ахании а К.А., Походзей И,В, Новый количественный нммуноферментный метод определения IgE с помощью специфического сефарозного иммуиосорбента н люминесцентного микроскопа //ЖМЭИ 1931, - № I - С.85-88.

132. Суханов Е. С., Смстанина С. Е., Максимов В. А. Прямая детекция ДНК Tr.pallidum в клиническом материале и крови доноров методом ПНР с гарантией достоверности отрицательного результата // Вести, службы крови России 1998. - Ne 3--C.18-2I.

133. Сухова Л,П., Машеро В.В., Войнова H.H. Опыт применения ИФА-тест-систем с использованием рекомбннантных белков в диагностике сифилиса //Бюллетень ассоциации САНАМ «Инфекции, передаваемые половым путем». ■ 999 № 1. - С.34-35.

134. Сухоруков A.M., Пономарева А.М. Изучение сорбцнонных свойств полнстироловых планшетов, используемых в нммунофермснтном анализе //ЖМЭИ. 1987. - Jit 9. - С. 18-22.

135. Сызраниев П И, Простые способы вычисления основных статистических величин. // Социалистическое зерновое хозяйство. 1938. № 3- -С, 185-203.

136. Тертых В.А. Химические реакции с участием поверхности кремнезема //Кремнеземы в медицине и биологии: Сб. науч. тр. Киев-Ставрополь, 1993. - С.41-51.

137. Тнмаков В.Д. Изменчивость микроорганизмов и бактериофагов.1. М. I960. -С/Мб.

138. Тнмаков В.Д,, Каган ГЛ. Биология L-форм бактерий //М.: «Мед-гнз», 196I.-C.67.

139. Тнмаков В,Д., Каган ГЛ. Семейство Mycoplasmataceae и L-формы бактерий // М. «Медицина», 1967. 335 с.

140. Тнмаков В.Д., Каган Г.Я, L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии //М.: «Медицина», 1973. -С. 18-19.

141. Тимченко Г.Ф. РПГА в серодиагностике сифилиса: Днсс. докт. мед. наук. М. - 170с.

142. Тихонова Л. И. Общий обзор ситуацни с инфекциями, передаваемыми половым путём // Вести, дерматол. 1999. № 2. - С, 4-7.

143. Ткачев В.К. ИФА диагностика сифилиса. - Информационно-методическое пособие. - Кольцове, 999. - 30 с.

144. Тургиев Б. С. Клинико-эпндемиологнческая н социально-личностная характеристика больных сифилисом а Северной Осетии. // Вестн. дерматол. 1995. - № 6. - С, 24-25.

145. Тюмснисва И. С,, Жданова Е. В., Афанасьев Е. Н. Усовершенствование производственной схемы иммунизации животных моно- н полнком-понентнымн антигенами // Рукопись деп. в ВИНИТИ № 2507 В 94 от 04. 11. (994.

146. Тюмснисва И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тсст-снстсм для выявления возбудителей особо опасных н других инфекций: Автореф. лис. . доктора мед. наук, - Саратов, 1996. -57 с.

147. Тюмениева И.С., Базикоа И.А. Белнченко A.B. Получение L-форм бледной трепонемы и определение антител к ним в нммуноферментном анализе //Методические рекомендации. Ставрополь, 2005, - 15 с.

148. Урбах В, Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях: М., 1975. 296 с.

149. Устименко Л.М, Получение L-форм бледной трепонемы. -Дне. . канд. мед. наук. Казань, 1964, - 187с.

150. Устименко Л.М, Факторы, ведущие к L-трансформацнн бледной трепонемы // ЖМЭИ. -1965, №1. - С.107-111.

151. Устименко Л.М. Резистентность культуральной бледной трепонемы к пенициллину //Материалы Всесоюз. конф. по химиотерапии инфекционных болезней, Ереван, - 1969. - С. 129-130,

152. Устименко Л.М. Влияние сывороточного фактора на чувствительность культуральной бледной трепонемы к пенициллину и на et способность к L-трансформацнн //ЖМЭИ 1972. - №5. - С, 116-119

153. Устимснко Л.М. Особенности морфогснеллеза L-форм бледной трепонемы //Актуальные вопросы теоретической н практической медицины: Тез. докл, науч, конф. ни-та. Казань, 1983, -С.20 3-204,

154. Устименко Л.М. Особенности морфогенеза L-форм бледной трепонемы н зталы нх реверсии //Вести, дерматол н венерол, 1975. - №2. - С, 36-40.

155. Федерольф А-Е. Влияние хлористого натрия на бактерии //Врач.1995. Выл 16,№39.-С.3084-1086.

156. Фриш Н.Ф Современные критерии дифференциальной диагностики сифилиса и ложиоположительных результатов стандартных серологических реакций на сифилис. Дне-. - - доктора мед. наук. - М., 2001.

157. Фриго Н.В., Комарова В.Д., Обряднна А.П,, Бурков А.Н, Сравнительные результаты иммупофермеггтного анализа, реакции пассивной гсмагтлютннаини и микрореакцнн в серодиагностике сифилиса // Вести, дермато-венерол 2000. - № 4, - С.34-36,

158. Фриго H.B., Никулин H.K. Клиническая интерпретация результате!! иммуноферментного анализа н мнкрорсакини преципитации в серодиагностике сифилиса //Вести, дерматол. и венерол. 2004. - KïI, -С.28-29,

159. Хамаганова И.В,, Коишна М.В., Пивеиъ ИЛ, Розанова Р,Ю. Структура заболеваемости сифилисом на примере случайной выборки в Москве //Российский журнал кожных н вен. болезней. №6, - 2004. - С,58-60,

160. Хамидов Щ.Ф., Внлнханов У.А., Балтабасв М К. Особенности эпидемиологии, современного течения к лечения раннего приобретенного сифилиса // Вести, дермато-венерол, 2004, - Кч 2, - С. 55-57.

161. Церанди Н- Ф., Мажннков А. Г., Короткое Н. В, Актуальные аспекты серорсзнстентности у больных сифилисом, // Бюллетень ассоциации САНАМ «Инфекции передаваемые половым путем» 1998. - № 4. - С. 23-26.

162. Чеботарев В. В, Индустрия секса, нравственно-этическое, половое воспитание нерешённые проблемы, // Вести, дерматол. 3999. - №3. С. 29-30.

163. Чеботарев В В. Земцов М-А., Павлик Л.В., Лукьяненко Н.В. К выходу Методических указаний №98/273 от 28.12-98 «Лечение и профилактика сифилиса» //Рос. журн. кож. н вен. болезней. 2000. - Ns2. - С-61 -64.

164. Чеботарев В, В., Иванисова О.П., Чеботарева Н.В. Фармвкокинс-тическне профили пенициллина в сыворотке кровн при лечении больных сифилисом различными препаратами пеницнллинового ряда // Рос, журн, кож, и вен, болезней, -2003. -№3,-С.58-61.

165. Чеботарев В,В„ Павлик Л.В, Повторные заражения сифилисом //Вести, дерматол. 1996, 4. - С,46-49,

166. Чеботарев В.В., Павлик Л.В,, Гуджиева О.Д, Экстрагенитальные и биполярные шанкры казуистика нлн повседневность ? // Вести, дерматол, - 1999. -№3,- С. 56-58.

167. Чеботарев В.В,, Павлик Л.В., Земцов М.А. Особенности течения сифилиса в период эпидемии //Вести, дерматол. 1999. - №6. - С.56-58.

168. Шахашша KJL, Соколенко A.A., Павлова И.П. и др. Выбор критериев пригодности твердофазных носителей на основе полистирола для проведения нммуноферментного анализа // ЖМЭИ. № 9. - 1987, - С .8-11,

169. Шннекий Г. Э., Протопопова Н, Е„ Юмикова В. В К проблеме ложноположнтелькых результатов серологических реакций на сифилис // Актуальные вопросы венерологии: эпидемиолога, клиника, лечение и профилактика: Тез, конф. Горький, 1986, -С. 45-49.

170. Юлдашев К.Л. Магрунов Б.Л., Парпнев З.А., Реймназароиа Т.Д. Беременность и сифилис И Вестн. дермато-венерол. 2003, - №3. - С.34-35.

171. Яровинскнй Б.Г., Зурочка A.B., Биргер Л.А.Г Егорова В.А. Частота рековалесцснтного hoch!ельства у больных ранним скрытым сифилисом после пенициллинотерапии //ИППП, №1. - 2001. - С,33-35,

172. Яцуха М, В„ Аковбян В, А. Эпидемическое значение активного выявления больных сифилисом в соматических стационарах //Современные проблемы дермато-венерологнн: Сб, науч, тр. Курск. - 1994. - С, 16-18.

173. Яцуха М. В„ Кодырева Л.Д., Бобков И.Н., Аверина В.И. Сифилитическая инфекция в России в пернол бурного развития и угасания эпидемического процесса //ИЛИ №1. -2002, - С.4МЗ.

174. Alderete G. T.t Freeman-Shade L., Baseman G. B. Immuno diagnostic test for detection of serum antibody to treponema pallidum (Syphilis): fi-bronection as a capture vechicle for treponemal adhesins U J. Immunol. Meth. -1985. Vol. 84. 1-2.-P. 365-373.

175. Antom G., Dal Maso G., Berti B. et al. Detection of antigenic determinants in the Treponema pallidum membrane protein Tmp A using overlapping synthetic peptides // I. I mmunol. Meth. 1996. - Vol. 189. - № I. - P, 137-140,

176. Augenbraun M., Rolfs R„ Johnson R.L. Treponemal specific tests for the serodiagnosis of syphilis. Syphilis and HIV Study Group // Sex. Transm, Dis, -1998. VoL25(lO). - P. 549-552.

177. Backhouse J. L-, Hudson B. J. Evalution of immunoglobulin G enzyme immunoassay for serodiagnosis of yaws Hi, Clin. Microbiol. 1995. -Vol. 33, - № 7. - p. 1875-1878.

178. Bailey M- G,T Penrv C- N„ Cockayne A. Evodcncc for the presence of lipo poly sac hantle in Treponema phagedena (biotype Reiter) bat not m Treponema pallidum (Nichols)// FEMS Microbiol Lett 1985. - Vol. 27. - № I. - P. 117-121.

179. Bazikov I.A., Belicbenko A.V.r Latysbev O.A. Obtaining morphological characteristics of L-forms of the treponema pallidum //European Academy oa Dermatology and Venerology JEADV 2003.- V.I7 (Suppl.l). P.63.

180. Balic-Winter A., Kansky A. Scrolo.ska dijagnostika sifilisa //Lijecji.vjens, 1985. - Vol. 107. - № 1-2. - P. 92-94.

181. Bayer M.E. The locations of defective synthesis in the wall of Escherichia coli after penicillin treatment // International Cungress for microbiology Jth Abstracts of Papers' Oxford^-1966, -PJ7-86.

182. Bayer M.E, Response pf cell walls of E.cotli to a sudden rcductiom of (he cnviromctal osmotic pressure //J. Bad. 1967. - V.93, - P.I 104-1112.

183. Bccbc G. L-, Nouri N. G, Comparative évaluation of commercial fluorescent treponemal antibody-absorbent test kits // J, Clin. Microbiol. 1984. -Vol, 19.-№6 -P 789-793.

184. Berg R. N. Duncan W. P., Thornton C. G. Antigen analysis of cultivable Reiter and Nichols treponcms H Br, J, Vencr, Dis.- 1972. Vol. 48. - № 6. -P. 489-495.

185. Canne fax 0. R,, Garson W. Reiter protein complement fixation test for syphilis // Publ, Health. Rep. 1957. - № 72. - P. 335-340.

186. Chermesky M-A. Nucleic axid tes-ths foediagnosis of sexually translated deseasis //FEMS Immun. Med. Microbiol. -1999.- N24. P.437-44S.

187. Christiansen A, H. Studies on the antigenic structure of trcpcncmcs cspccial ly the polysaccharide fraction // Danich. Med. Bulletin. ■ 1967. № 14-P.! 03-109.

188. Cohen M,, Panos C. Membrane lipid composition pf streptococcus pyogenes and derived L-form //Byochemestry. (966. N 5. - P. 2385.

189. Coons A.H., Kaplan M.H, Localisation of antigen in tissue celts 1/ J. Exp.Med. 1950.-V,9l,N 1.-P.81-89,

190. Cox D.L. Culture of Treponema pallidum / /Methods-Enzymol. -1994. Vol. 236. - P. 390-405.

191. Cox D.L. Akins D.P., Poreella S.F. et al.Treponema pallidum in gel microdroplets: a novel strategy for investigation of treponemal molecular architecture // Mol. Microbiol. 1995. * Vol. 15. - № 6. - P. 115M164.

192. Cnstian C. L., De Simore A. R. Abru&sof L. Anti-DNA antibodies in hyperimmunised rabbits tt J. of exp. Med. 1965. - Vol. 121. - № 2. - P. 309321.

193. Czaja A.J. Autoimmune hepatitis //Handbock of liver diseases 1998. -P.63-83.

194. Dischc Z. Uber uniae пегт characteristische Farben reactionen der Thismonuelein Saure und ecne mikromethod zur Bestimmung der selben in tierischen Oroanen mit Hilpcdieser Reaktionen // Hikrochem. 1930. - № 8. - P. 432.

195. Dicncs L., Weinberger Ш, MasolTS. The transformation of typhoid bacilli into L-forms under various conditions It J.Bactenol. 1950. V.59. P.755-760.

196. Dienes L., Weinberger HJ. The L-forms of bacteria'/BacL Rev.1951- V.15.-P.245-258.

197. Dimowa E. Nikolowa S., Gousterova A.rNedkov P. Enzyme peptone for microbiological purposes, obtained from extracted eacf skin //Biotechnol. biotechnol. Equipm, 2001, - T, 15 - №1 - Р.99-Ю2.

198. Dörnach A. Autoantibodies in syphilis and chromic biologic false positive reactions // Sex, Transmit. Dis. London: Academic Press. - 1976, - P. 210-214.

199. Egglcsttone S.L. Turner AJ.L, (Эгглстоун С.И„ Тернер АД^кЛ. Серологическая диагностика сифилиса //ИПГ1Г1, 2001, - №3, - С.4-9.

200. Edward D.G.Thc pleuropneumonia grop of organisms: a review togeter with some new observations //J. gen, Microbiol, 1954, - №10, - C.27.

201. Eislcr M. Uber Wirkungen von Salzen auf Bakterien //ZbLf. Bact,, I AbL Orig. 1909.-V, 51. V 5, - P, 546-564,

202. Engvali E.t Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAy HI. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labelled antnmmunoglobulin in antigen-coated lubes H J. Immunol. 1972. - V. I009T № 9. - P. 129135.

203. Farchy C.E., Hunter E.F„ Larscn S.A. « al. Double conjugate enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulins Gand Maganst Treponema pallidum. // J. din. Microbiol. 1984, - Vol. 20. - № 6. - P. 1109-1113.

204. Fostrom L. Reiter protein complement fixation (RPCF) test as a serological test for syphilis//Acta dermalo-vcncrologica. 1967. - Vol. 47, ■ P. 165171.

205. Fromm G, Spirochatcn Antigene in der Serolog, diagrvostik der Syphilis //Arzt. Wochcnschr. - 1954. -№9. - P. 639-641.

206. Gasponi A., Nedosant M. Fostî A. ei al. Valutasione di unnuovo mc-todo immunoenznnatico per la dimonstrazione dellc IgM-trcponcma specifiche nella sifilidc umana // J. of Hal. Dermatol, -1988. Vol. 123. 3, - P 113-1(6

207. Godzeski C.W. In vivo pctsistacnce of L-phasc Bactena //В кн.; L.Guzc Microbiol protoplasts and L-fotms Baltimore,- (968. P. 39, 379.

208. Goodhort G.L. Use and Interpretation of serologic Tests for the Diagnosis of Syphilis // Suoth met. J. (983. - Vot, 76. - P. 373- 379.

209. Grob J J., Boncrand Y ,J, Anli phospholipid antibodies and anti phospholipid antibody sindrom !t Ann. Dermatol. Vencrol. (986. - Vol. 113. - X? 9. -P 811-818.

210. Hayaski K., Seino A. Bacteriolytic enzyme produced by streptomyccs sp //I. Termcuf. Technol/ 1981. - Vol. 59. - №4, P.319-323,

211. Hardi P. H. Fredericks W. R, Nell E. E Isolation and Antigenic characteristics of axial filements from the Retter Treponema // Infect Immun. -1975.11.- P. 380-386

212. Hijmans V., van Bovem C.P., Clasener H.A. L. Fundamental Biology of the L-phase of Bacteria II B kii.: L.Hayflic. The mycoplasmatalcs and L-phase of baclcria/ New York. 1969. P.68.

213. Horvath I., Puskas Et Horvath A. et al. Autoantibodies in immune defense agamts cholisterol // Orv. Hetil. 1994. - Vol . 135. - № 5. - P. 965-968.

214. Hofschneider P.N. Über Phadenadsotption hi "large bodies" von E.coli Die L.FoTme Bacterien //Mtschr.Dtech Acad. Wiss. (Berlin) I960. V,21.1. P. 36,

215. Ito F., Hunter E.F., George R.W. et al. Specific immunoiluorcsccnt staining of pathogenetic lreponc»nes with a monoclonal antibody // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - № 4,- P. 831-838.

216. Kagan B.M. Antibiotic sensitivities of staphylococcal L-forms //B kk.: Cuze L. Microbial Protoplasts, Sferoplasts and L-form Baltimore ■ 1968. -P.314.

217. Kagan B.M. Role of L-iorms in staphylococcal iufection //B km.: Cuze L. Microbial Protoplasts. Sferoplasts and L-form Baltimore 1968a. -P.372.

218. Kagan G.Ja. Comparative study of the patogemxity of bacterial L-forms and tmcoplasma organisms II Proceedings mtcrobiolisf Budapest - 1964.-P375.

219. Kell P.D., Barton S.E„ Sammerbeil C.D. et al. Sexually transmitted diseases in HIV-1 seropositive mof.cn at presentation U Int. J, STD AIDS. -1991. Vol. 2. - Ns 3. - P. 204-206.

220. Klicncberger E, The natural occurence of pleuropncumonia-Uke organisms its apparent symbiosis with Streptobacillus moniliformis and other bacteria Hi. Pathol, Bad. 1935. - V. 40. - P 93-105

221. Kliencberger E. Further studies on Streprobacillus moniliformis and its symbiont //J. Pathol. Bact. 1936. - V.75, N I - P. 587-592.

222. Krembell J., Deluzarche A-, Minck R, Sur les lipids des formes L.stable du Proteus p. 18. G.R.//Acad Svi. (Paras). -1961. V.25, - P.2005.

223. Landman O.E. Ginoza H.S. Genetic nature of stable L-forms of salmonella paratyphi //J.Bact. 1969.- V. 99. P.579

224. Lapmski E.M., Flakas E.D. Induction of L--forms of Haemophilus influenzae in culture and their demonstration in human bronchial sécrétions //J. Bact 1967 - V.93 - P. 1438.

225. Larscn S. A., Steiner B. M. Rudolph A, N. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis // Clin Microbiol Rcf 1995. - Vol. 8, - № I, -P. 21-22.

226. Lee Y.B., Farshy C.E., Hunter E.F. et al. Detection of immunoglobulin M in cerebrospinal fluid from syphilis patients by enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol. 21. - Ns S. - P. 736-744.

227. Lefevre G.C., Prere M.F., Abba! M. Learvng M B. Quantitative evaluation of the FTA-abs IgM rntrcated and untreated syphilis // Ann, Dermatol. Venerol. -1983 . Vol. 110(5). - P. 426-430.

228. Levaditi C, Schoen R., Sanchis-Bayarn M.V. Ijë cyste évolutif du "Treponema paltidim" //Bull. Acad. Pc Medicine. 1927, - V 97m N 30, P.I49-I52.

229. Levaditi C,, Vaisman A. Cycle évolutif du Trcponened psllifum //Comptrend. Soc,boil. 193S.-V.t57. tri. - P. 194-197

230. Levaditi C,t Vaisman A., Schocn R., Mezgcr J.C. Nouvelles recherches expcnmcmtales sur la sy syphilis, Cycle évolutif du virus syphilique, Neurosyphilis. Virulence du "Treponema pallidum"//Ann, Insr, PasL 1933. - V. 50, N 2. - P.222-269

231. Levaditi C-, Vaisman A„ Schoen R, Rexherches expérimentales sur la syphilis. E ludc palhogcniquc de la neurosyphilis (Troisième me'moire) // Ann. Insr, Past. 1936.- V .56, N 5. - P.481-510,

232. Madofî S. Dicncs L. L-forms pncumococci //L Bact. 1958. -V.76. P 245-250.

233. MadofFSn, Burke M.E., Dicncs L, Induction and mdentiflcation of L-forms of bacteria //Ann. N.Y Acad, Sci, 1967, V.143. - P. 755.

234. Mattman L.H., Mattman P,E. L-formes of Streptococcus faeealis in septicemia //Arh. Intern, Med 1965. - V. 115. - P.315.

235. Matzuschita T. Die Emvirkunf des Kochsakgemaltes des Nahrbodens //2ml, Hyg' 1900. - V.35, - P.495-508.

236. Mink R. Organisms du type de la peripneumonia des bovidés wet formes : des bactenea //Rev. Immunol. (Paris), 1955. - №9. - P. 86.

237. MoldayR-S., Jen S.P.S., Renbaum A. Application of magnetic microspheres tn label ind and separation of cell // Nature. 1977. V.268. - P.43 7-438.

238. Morrison-Plumier T., Aldcrtc Y.F., Bascmon J.B. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of scrum antibody to on the membrane protein of T.pallidum // BriL J. Vener Dis, -1983. Vol. 59. - P. 75-79.

239. Ncrmut M.V. L-cyclus baclern, jene biologisky lekarsky vyznam. -Praha, I960.

240. Ouchtcrlofly O. Antigen-antibody reactions in gel // Acta Path. Microbiol, Med. 1949 - Vol26, - P 507-515.

241. Panos C, A microbial enigma mycoplasma and bacterial L-forms, Cleveland. 1967

242. Pans-Hamclin A,, Loupy G.„ Vaisman A., Deregnancourt G- Recherche et dosage des IgM trcponemiqucs par unc mcthodc immunoenzymctogiquc (ELISA), Comparaison avec 1c FTA-Abs-IgM et Ic SPHA modific // Fcuiil. biol. -1985. Vol. 26. - № 145. - P. 13-19.

243. Petersen C, S. Pedersen N. S„ Axelscn N. H. A simple method for the isolation of flagella from Treponema Reiter // Acta pathol et microbiol. scand -1981. Vol. 89. -№6. - P. 379-385,

244. Peterson C. S., Pedersen N. S., Axclsen N. H. Purification of a Reiter treponemal protein antigen that is immunologically related to an antigen in Treponema pallidum (DNA) // Infect. Immun. -1982. Vol. 35. - № 3. - P. 974-978.

245. Pokrovskaja M. Zytotogischc Bcibachtungcn über den Dissoziation-sprocess def PestbaziHen //Zbl. Bakter. 1931. - V. 10, N 119. - P 353.

246. Pucilow K.r Zajac W Biologisch falschpositive seren in der diagnosis // Derm. Moschr. 1980. - Bd.166. - X° II. - P. 713-721.

247. Quinn T.c. Recent advanced in diagnosis of sexually transmited diseases // Sex. Trans. Dis, 1994,- N 21. - P. 19-27.

248. Radolf J. D. Treponema pallidum and quest for outer membrane proteins // Moll, Microbiol. -1995. Vol, 16. - P. 1067-1073.

249. Radolf J.D., Robinson EJ-, Burcll K.W ct al. Characterization of outer membranes isolated from Treponema pallidum, the syphilis spirochete //Infect Immun 1995. - Vol. 63. X? 11,- P. 4244-4252.

250. Rossemh O.L. Arese N.L, Boschiroli M.L., Cravcro S.L. Colomng of Brucella abortus gene and characterization of expressed 26-kilodalton peripasmic protein: potential use for diagnosis //J.Clin, Microbiol -1996, Vol.34, N 1. -P. 165-169.

251. Rubio-Hucrtas M-, GonzalesVazques C. Morphology and patoge-nccity of L-forms of Clostridium teiani induced by glycine //Ann N.Y. Acad.Sci. I960. -V. 79, - P.629-703,

252. Saiton M R., The Bacterial Cell Wall. Amsterdam. 1964.

253. Sehaudinn F., Hoffman F. Vorläufigen Bericht über das vorkommen von Spirochcalcn in syphilitischen krankjcils produeten und dei Rupp Papilloncn //Arb. a. Kaiserl, Gerund, 1905, - № 22, - P, 527-534,

254. Scvars A. H,t Schasfoart R. B,f Salden M H An immunosensor for syphilis screening Based on surfacc plasmon rcsonans // Bioscns, Bioclectron, -1993. Vol. 8. - № 3-4 - P. 185'189,

255. Simon M„ Milward F„ Lcfebvcrc R ct al. Spirochetes: vaccines, animal models and diagnostics // Res. Microbiol- 1992, - Vol. 143, ■ P.641.647.

256. Simon M„ Molincdo R. Diagnostic de la Syphilis par la recherche du granule spirochitogme //La Presse Mcdicalc 3940. - N 48. - P. 513-516.

257. Smith P,F. Comparative physiology of plcuropncunonia like and L-type organisms //Bact. Rev. ,1964. - N 28. - P.97.

258. Smith P.F. The Physiologi of Mycoplasma // B kh,; C.Panos A mi-crobiol enigma mycoplasma and bacterial L-forms Cleveland. 1967, - P. 74.

259. Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanahon scrra with the acid of capnhc // Arch. Biochem. Stray and Btophys. 1969. - Vol.139. -P. 279-284.

260. Stienstra S., Peelers T., Van der Straaten A.M. Kadir N. Treponema pallidum membrane protein A ELISA: a new test for screening and diagnosis of syphilis // Beitr. Infusionsther. 1992. Vol.30, - P.85-91.

261. Starz H. (IllTopu X.) ILMMyMOtJj;iyopecueHUMS /Mmm>ho-jiorhhcck'hc mctojuj M-: Mean unna, 1987. - C. 128-148.

262. Tanaka K-, Shinoda, Takai N. et al. The preparation of mesoporous silica gel and the nattrc of Chcm //Soc. Jap. 1980. - Vol.53. - №5. - P. 12421246,

263. Tulasnc R. Bilan de nos connaissances sur les cycles bactcnens du Type L el sur les formes L des bacteries //Biol. Med. 1955 - V.45 - P. 391

264. Tulasne R-. Lavillaureix J. Sur une variante microbienne géante go-mogenc et stable issue de hactcnes du genre vibrion //Swcir Z allg. Path. -1957. N 20. - P.608.

265. Tulasne R. Lavillaureix J, Fitration et ulrafiltration d'une souche de forme L.fixées C.B. //Acad. Sei (Paris). 1958. - V 246. - P.2396.

266. Vaisman A., Hamelm A. Les antigènes treponemiques dans le sérodiagnostic de la syphilis // Presse med, 1958. - № 66. - P. 1357-1358.

267. Vavrova M,, Shalopka J. Regeneration of cell wall at Bacillus spheroplasts//International Congress for M trobiology 9* Abstract of Papers, Oxword. 1966. - P.95-115.

268. Vendrelly R. La notion d' cspece a travers de quelques données biochimiques recentes et le cycle L. //Ann. Inst Pasteur, 1958. V. 94. P. 142.

269. Vendrelly R., Tulasne R. Chemical constution of the L-formes of bacteria //Nature London. 1953. N 171, - P. 262.

270. Vila P., demander M.C, Lopez-Fernandez M.F. et al.Prevalenee, follow-up and clinical significance of the anticardiohpm antibodies in normal subjects // Thromb-Hemoctr. 1994. - Vol.72. - № 2. - P. 209-213.

271. Wächter M.S., Johnson R.C. Treponeme outer envelope:Chemical analysis//Proe. Soc. Exp. Biol, and Med. 1976. - Vol. 151. - Xa 1. - P. 97-100.

272. Warburg O., Christian W. Isolierung and Kristallisation des Garug-stcrmcnls Enolase // Biochem, J. 1941. - V 310. - P.I 120-1122,

Информация о работе

Беличенко, Андрей Викторович
кандидата медицинских наук
Ставрополь, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Получение атипичных форм Treponema pallidum и детекция антител к ним в эксперименте - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы