Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Treponema pallidum как основа гемагглютинационного диагностикума

Чепурченко, Наталья Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Treponema pallidum как основа гемагглютинационного диагностикума
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Treponema pallidum как основа гемагглютинационного диагностикума"

На правах рукописи

rlsJj-

ЧЕПУРЧЕНКО Наталья Валерьевна

РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНАЛОГИ ИММУНОДОМИНАНТНЫХ БЕЛКОВ TREPONEMA PALLIDUM КАК ОСНОВА ГЕМАГГЛЮТИНАЦИОННОГО

ДИАГНОСТИКУМА

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 2006

Работа выполнена в ООО НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Блинова Т.В.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Воробьева З.Г.

доктор биологических наук,

профессор

Анастасиев В.В.

ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Росздрава

Защита состоится в ЧО часов на заседании

диссертационного совета К.212.166.06 при ФГОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского (603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23).

e-mail: dec@bio.unn.ru fax: (8312) 34-50-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Н.Ф. Александрова

Основные сокращения и обозначения .

ИФА — иммуноферментный анализ, КСР — комплекс серологических реакций, КЭ - контрольные эритроциты, ЛПР — ложноположительный результат, РИБТ — реакция иммобилизации бледных трепонем, РИФ — реакция иммунофлюоресценции, РМП - реакция микропреципитации, РПГА - реакция пассивной гемагглютинации, РСК - реакция связывания комплемента, СЭ — сенсибилизированные эритроциты.

Общая характеристика работы . Актуальность проблемы. В настоящее время 'сифилис 'является важной проблемой здравоохранения во всем мире. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется 12 млн. новых случаев заболевания (Hook et al., 2004). Последнее десятилетие XX века охарактеризовалось в России вспышкой заболеваемости сифилиса с максимумом в 1997 году - 277 случаев на 100 тыс. населения. Рост общей заболеваемости сифилисом вызвал значительное увеличение случаев нейросифилиса. За последние пять лет (1999-2005) число зарегистрированных случаев нейросифилиса в РФ увеличилось в 10,5 раз - с 51 до 538 (Лосева, Аншуков, 2006). Среди них отмечено преобладание стертых и скрытых форм инфекции, что затрудняет диагностику данной стадии сифилиса. В последние годы наметилась тенденция к снижению заболеваемости сифилисом,. но^ среднероссийский показатель заболеваемости еще слишком высок — 68,6 случаев на 100 тыс. населения в 2005 году (Иванова и др!, 2006). В связи'с этим'возрастает необходимость совершенствования лабораторной j диагностики, сифилиса, внедрение в практику новых диагностических тестов.

Прямая детекция возбудителя сифилиса {Treponema pallidum subsp. pallidum) на некоторых стадиях заболевания затруднена. Культивирование бледных трепонем на искусственных питательных средах сопряжено с большими трудностями и связано, как правило, Г С. потерей патогенности (Овчинников.и др., 1987)..Использование рекомбинантных антигенов — один из способов изучения полной аминокислотной последовательности белков патогенных штаммов Т. pallidum. Кроме того', рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков бледной трепонемы стандартны и безопасны.

Основную роль в постановке диагноза при сифилисе играет серодиагностика. Социальная значимость данного заболевания предъявляет ряд требований к современным иммунологическим • тестам. Данные препараты должны иметь высокие показатели диагностической эффективности на всех стадиях заболевания. Диагностику мы., должны быть просты в постановке, иметь короткое время проведения анализа, что дает возможность быстрого получения результата.' Ценность диагностикума значительно возрастает, если с его помощью можно осуществлять контроль за проводимой терапией. В этом случая динамика титров специфических антител, выявляемых с помощью диагностикума, должна четко коррелировать с клиническими и лабораторными данными, свидетельствующими об эффективности терапии. Отвечающего всем этим

требованиям теста в диагностике сифилиса в настоящее время не существует, поэтому серодиагностика сифилиса носит комплексный характер (Дмитриев, Брагина, 1996).

Широко применяемая для диагностики сифилиса реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) обладает одновременно качествами отборочного и подтверждающего теста: высокие показатели чувствительности, специфичности и воспроизводимости, простота постановки, возможность автоматизации, быстрота получения результатов. Используемые в настоящее время во всем мире гемагглютинационные диагностикумы для серодиагностики сифилиса созданы на основе лизатов сапрофитных и патогенных трепонем. Однако, отличаясь высокой специфичностью и чувствительностью при позднем сифилисе, РПГА тесты, основанные на трепонемных лизатах, уступают в чувствительности при первичном сифилисе тестам РИФ и ИФА (Johnston, 1972, Alessi, Scioccati, 1977, Jaffe et al., 1978, Luger et al., 1981, Pope et al., 1982). Известно, что после успешно проведенной терапии результаты РПГА, ИФА и РИФ диагностикумов длительное время остаются положительными, поэтому данные тесты не используют для оценки эффективности проводимого лечения и при посттерапевтическом контроле (Chambón et al., 1978, Hunter, 1979, Monsiorska-Borowska, 1983).

Накоплен большой опыт по повышению диагностической эффективности иммуноферментных тест-систем и иммуноблоттинга путем использования рекомбинантных аналогов антигенов возбудителя сифилиса (Гражданцева и др., 1980, Zrein et al., 1995, Каур и др., 1998, Young et al., 1998, Иванов, 2000, Sambri et al., 2001, Rostopira et al., 2003, Sato et al., 2004). Высокие показатели чувствительности и специфичности отмечены для диагностикума на основе реакции агглютинации латекса с применением рекомбинантных аналогов протеинов бледной трепонемы (Young et al., 1998).

Данные, касающиеся изучения РПГА на основе рекомбинантных антигенов для выявления антител в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больных сифилисом в литературе отсутствуют. Появление альтернативного серологического теста, пригодного для серо- и ликвородиагностики, обогатит возможности клиницистов и иммунологов для постановки точного диагноза заболевания.

Перспективным представляется изучение динамики титров специфических антител, определяемых гемаглютинационным диагностикумом, и оценка возможности использования данного теста для контроля эффективности терапии.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение иммунохимических свойств рекомбинантных аналогов основных иммунодоминантных белков ТшрА, 47 кДа, 17 кДа , 15 кДа Т. pallidum в реакции пассивной гемагглютинации на разных стадиях сифилиса, выбор рекомбинантных белков с высокой антигенной активностью и создание на их основе гемагглютинационного диагностикума.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков — аналогов основных мембранных протеинов ТтрА, 47 кДа, 17 кДа , 15 кДа Т. pallidum в РПГА и ИФА на разных стадиях сифилитической инфекции;

2. Выбрать рекомбинантные аналоги белков Т. pallidum с высокой антигенной активностью и разработать на их основе технологию получения стабильного гемагглютинационного диагностикума для выявления специфических антител;

3. Провести сравнительный анализ гемагглютинационных диагностикумов на основе рекомбинантных и лизатных трепонемных антигенов на разных стадиях сифилиса;

4. Сравнить динамику титров антител к кардиолипину и к белку ТтрА Т. pallidum в процессе проведения противосифилитической терапии;

5. С использованием рекомбинантных белков методами РПГА и ИФА исследовать особенности антителопродукции в образцах ликвора и определить возможность использования гемагглютинационного теста для диагностики нейросифилиса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методом РПГА в образцах сывороток крови больных сифилисом определяются в основном антитела к рекомбинантному аналогу антигена ТшрА Т. pallidum, а в образцах ликвора больных нейросифилисом - к белкам ТтрА и Тр 17.

2. Рекомбинантные антигены - аналоги иммунодоминантных белков Т. pallidum обладают высокой диагностической значимостью, что позволяет использовать их для создания иммунодиагностикумов.

3. Высокая корреляция динамики титров специфических и антикардиолипиновых антител позволяет использовать

гемагглютинационный диагностикум на основе рекомбинантного ТтрА антигена для мониторинга проводимого противосифилитического лечения и контроле в посттерапевтический период.

Научная новизна исследования.

Впервые методом РПГА исследованы иммунохимические свойства четырех рекомбинантных антигенов — аналогов иммунодоминантных белков ТтрА, 47, 17 и 15 кДа Т. pallidum.

Установлено, что гемагглютинационными диагностикумами в образцах сывороток крови больных сифилисом на разных стадиях инфекции определяются преимущественно антитела к белку ТтрА.

Показано, что гемагглютинационный диагностикум, основанный на использовании рекомбинантного белка — аналога иммунодоминантного эпитопа ТтрА антигена Т. pallidum, может использоваться для ликвородиагностики при нейросифилисе.

Впервые показана возможность использования гемагглютинационного диагностикума на основе рекомбинантного аналога белка ТтрА для оценки эффективности противосифилитического лечения и при контроле в посттерапевтический период.

Практическая значимость. На основе формалинизированных куриных эритроцитов, сенсибилизированных рекомбинантным антигеном ТтрА, сконструирован РПГА тест для диагностики сифилиса. Разработанная тест-система «ДС-РПГА-анти-Люис» может применяться в комплексной диагностике заболевания в качестве скринингового и подтверждающего теста. Данный гемагглютинационный диагностикум адаптирован для тестирования образцов ликвора, что позволяет использовать его для выявления поражений ЦНС при сифилисе. Созданный гемагглютинационный диагностикум может использоваться для подтверждения динамических изменений титров антикардиолипиновых иммуноглобулинов, определяемых РМП, при проводимом лечении и в посттерапевтический период.

Разработан проект технологической документации на гемагглютинационный диагностикум для определения специфических антител к Т. pallidum «ДС-РПГА-анти-Люис». В ООО НПО «Диагностические системы» налажен выпуск производственно-экспериментальных серий данной тест-системы.

Подана заявка № 2006112226 на патент РФ на изобретение.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Барнаул, 1999 г., на VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2001 г., на Первом Российском конгрессе дерматовенерологов, Санкт-Петербург, 2003 г., на Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов», Нижний Новгород, 2004 г., на 15-м Европейском Конгрессе клинической микробиологии и инфекционных заболеваний, Копенгаген, Дания, 2005 г., на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2005 г., на Курсах информации для врачей курируемой зоны по лабораторной диагностике ИППП, Нижний Новгород, 2005 г., на Областной научно-практической конференции «Итоги деятельности дерматологической службы Нижегородской области в 2005 г.», Нижний Новгород, 2006 г., на Областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматологии», Тюмень, 2006 г., на V съезде дерматологов и венерологов Республики Беларусь, Минск, 2006 г., на VI Научно-практической конференции «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика», Москва, 2006 г.

Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 226 источников на русском языке и на иностранных языках. В текст включены 22 таблицы и 10 рисунков.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе одна в центральной печати.

Материалы и методы исследования

Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Т. pallidum.

Для конструирования гемагглютинационного диагностикума использовались рекомбинантные антигены - аналоги иммунодоминантных белков 42-44,5 кДа (ТтрА), 15 кДа (Тр15), 17 кДа (Тр17) и 47 кДа (Тр47) Т. pallidum, полученные в ООО НПО «Диагностические системы». Каталожные номера рекомбинантных антигенов: Тр17 - ASIF 101; ТтрА - ASIF 102; Тр47 - ASIF 103; Тр15 — ASIF 105.

Исследуемый материал. Для исследования иммунохимических свойств рекомбинантных белков в рамках двух методов диагностики сифилиса РПГА и ИФА и для оценки чувствительности гемагглютинационных тестов были использованы 643 образца сывороток крови больных сифилисом разных стадий и 233 образца сывороток крови пациентов, получивших специфическое лечение по поводу сифилиса, любезно предоставленные Нижегородским научно-исследовательским кожно-венерологическим институтом — НИКВИ (зав. лабораторией к.б.н. Комарова В.Д.), Сормовским кожно-венерологическим диспансером, г. Н.Новгорода (зав. лабораторией Моржина Е.В.), Областной больницей для осужденных при ГУИН МЮ Нижегородской области (зав. лабораторией Серпухова О.Н.). На наличие противотрепонемных антител были исследованы образцы сывороток крови 87 человек, направленных на обследование на сифилис.

Образцы сывороток крови больных активными формами заболевания включали 150 образцов от больных первичным сифилисом (23,3%), 252 образца от больных вторичным сифилисом (39,2%), 221 — от больных скрытым сифилисом (34,4%), 20 - от больных поздним сифилисом (3,1%). Группу больных поздним сифилисом в свою очередь составили 10 больных с поздним скрытым сифилисом, 1 больной сифилисом сердечно-сосудистой системы и 9 больных нейросифилисом. Диагноз «сифилиса» у всех больных был установлен на основе анамнеза, данных клинического и лабораторного обследования, а также подтвержден положительными реакциями в стандартных серологических тестах (РМП, РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами, РИБТ, РИФ). Возраст больных составил от 14 до 69 лет. Значительная часть больных (69,2%) находилась в возрасте наибольшей половой активности (до 30 лет). Среди обследованных больных было 326 мужчин и 317 женщин.

У 44 пациентов исследовалась динамика титров специфических антител в сыворотке крови в процессе проводимого лечения (23 больных с диагнозом сифилис вторичный, 13 - сифилис скрытый и 8 - сифилис поздний). Лечение больных сифилисом проводилось с использованием бензилпенициллина по рекомендованным МЗ РФ схемам. Титры противотрепонемных антител также определялись в парных образцах сывороток 4 больных с диагнозом серорезистентность, получающих дополнительное лечение. Первый образец сыворотки у каждого больного

брался перед началом терапии, а второй — через 2-8 недель после начала лечения. Динамика титров специфических антител была изучена у 5 пациентов, находящихся на сероконтроле после проведенной противосифилитической терапии, с периодичностью взятия образца сыворотки крови через 1-5 месяцев.

Для оценки возможности использования гемагглютинационного теста на основе рекомбинантных антигенов для диагностики нейросифилиса были исследованы предоставленные Нижегородским НИКВИ 13 парных образцов (сыворотка — ликвор) от больных сифилисом с поражением нервной системы,

9 парных образцов от больных сифилисом без поражения нервной системы и 2 парных образца от лиц, получивших лечение по поводу нейросифилиса и находящихся на сероконтроле. Кроме того, анализировались 3 образца ликвора от больных сифилисом с поражением нервной системы, 4 образца ликвора от больных сифилисом без поражения нервной системы и 1 образец ликвора от пациента, получившего лечение по поводу нейросифилиса. Диагноз нейросифилиса устанавливался на основе клинических данных и результатов серологических тестов РИФ, ИФА, РМП, РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами. Для оценки специфичности РПГА тестов использовались 2478 образцов сывороток крови от лиц, не страдающих сифилитической инфекцией, среди них: образцы сывороток 1918 здоровых доноров (предоставлены Нижегородской областной станцией переливания крови, зав. отделением Кощеева H.A. и Дзержинской станцией переливания крови, Нижегородская обл., зав. отдела заготовки крови Окатышева H.A.), 96 больных ВИЧ-инфекцией, 54 больных острым гепатитом А, 47 больных гепатитом В, 143 больных гепатитом С (коллекция сывороток крови НПО «Диагностические системы»), 48 больных лейкозом детей (предоставлены Областной детской больницей, г. Н.Новгород, зав. кафедрой детских инфекций д.м.н. Краснов В.В.), 8 больных клещевым энцефалитом (предоставлены Алтайским краевым центром СПИД, г. Барнаул, зав. лабораторией Белых С.И.), 52 беременных (предоставлены Семеновской районной больницей, Нижегородская обл., зав. лабораторией Комарова O.A.), образцы сывороток 54 лиц с неспецифическими результатами тестирования в КСР и ИФА тестах, 48 больных хламидиозом,

10 больных генитальным герпесом (предоставлены Сормовским КВД и Нижегородским НИКВИ). Все образцы сывороток здоровых доноров не содержали антител к Т. pallidum, к ВИЧ -1,2, к вирусу гепатита С и HBsAg.

Тест-системы_сравнения. Сравнение диагностической

эффективности гемагглютинационного теста проводилось со следующими тест-системами:

1. «Syphilis ТРНА test» - «Human», Германия, кат. № 50101; с. 2348, годен до 10.2006;

2. «Serodia-TP-PA» - «Fujirebio Inc.», Япония, кат. № 6391, с. 51207, годен до 12.2006;

3. «Люис РПГА тест» - ООО «Ниармедик Плюс», г. Москва, кат. № 7-02-3, с. 230704, годен до 06.2005;

4. «Сифилис РПГА-тест» - ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск, кат. № 0306, с.8, годен до 06.2005;

5. «ИФА-анти-Люис» - НПО «Диагностические системы», г. Н.Новгород, кат. № L — 154, с.5, годен до 18.11.06;

6. «Люис-тест» - НПО «Диагностические системы»; г. Н.Новгород, кат. № L - 332, с.4, годен до 06.06.07.

Результаты РИФ, РИБТ, РСК с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, РМП любезно предоставлены Нижегородским НИКВИ.

Гемагглютинационный тест, основанный на рекомбинантных антигенах. При разработке технологии производства гемагглютинационного теста были использованы куриные эритроциты, полученные из крови бойлеров Линдовской птицефабрики Нижегородской обл. Реакция проводилась на круглодонных планшетах фирмы ВНИИМедПолимер, г. Санкт-Петербург.

Применялись методы:

1. Стабилизация эритроцитов формалином.

2. Сенсибилизация эритроцитов в присутствии хлорного хрома.

3. Сенсибилизация эритроцитов в присутствии риванола.

4. Сенсибилизация эритроцитов в присутствии глутарового альдегида.

5. Стабилизация СЭ и КЭ в защитной среде.

6. Лиофильная сушка СЭ и КЭ.

7. Определение стабильности СЭ ускоренным методом.

Иммуноферментный анализ. Для выявления антител к возбудителю

сифилиса была использована модель твердофазного, неконкурентного, двустадийного ИФА, где на поверхность полистиролового планшета иммобилизованы рекомбинантные аналоги антигенов Т. pallidum, в качестве коньюгата использованы меченные пероксидазой хрена моноклональные антитела к иммуноглобулинам IgG и IgM человека (ООО «Сорбент», г. Москва). В качестве хромогена применялся тетраметилбензидин (ТМБ). Твердой фазой во всех вариантах ИФА служили 96-луночные плоскодонные планшеты фирмы Nunc Polysorp F8, Дания.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики (Гланц, 1998). Для оценки межгрупповых различий применяли t-критерий Стьюдента. При сравнении качественных признаков пользовались двусторонним вариантом точного критерия Фишера и критерием у? с поправкой Йейтса для четырехпольных таблиц и критерием х2 Для произвольной таблицы сопряженности. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05. Если значения вероятности р находились в интервале от 0,05 до 0,1, то данная ситуация рассматривалась как тенденция к значимому изменению параметров и показателей.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Изучение иммунохимических свойств рекомбинантных антигенов — аналогов иммунодоминантных белков Т. pallidum. Сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков в РПГА и ИФА.

Используя известные методики сенсибилизации белковыми сенситинами эритроцитов при изготовлении гемагглютинационных диагностикумов, были испытаны следующие коньюгирующие агенты: глутаровый альдегид, риванол и хлорный хром. Сенсибилизация формалинизированных куриных эритроцитов рекомбинантными аналогами антигенов Т. pallidum в присутствии 0,33% раствора хлорного хрома была наиболее эффективной. Только с помощью эритроцитов, сенсибилизированных в присутствии хлорного хрома, результаты реакции можно было разделить на положительные и отрицательные в соответствии с поставленным диагнозом, спонтанной агглютинации при этом не наблюдалось. Сенсибилизация в присутствии раствора хлорного хрома проводилась при 42 °С в течение 60 минут.

Формалинизированные куриные эритроциты были сенсибилизированы отдельными рекомбинантными белками, воспроизводящими основные иммунодоминантные протеины ТгпрА, 47, 17 и 15 кДа Т. pallidum (диапазон концентраций 0,1 - 8 мг/мл). Для рекомбинантных антигенов были подобраны оптимальные концентрации: ТтрА — 0,25 мг/мл, Тр47 — 0,24 мг/мл, Тр17 — 0,29 мг/мл, Тр15 - 0,25 мг/мл.

Сравнительное изучение иммунохимических свойств рекомбинантных белков методом РПГА проводилось с использованием сывороток крови больных сифилисом и здоровых доноров. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Чувствительность РПГА диагностикумов с использованием отдельных рекомбинантных антигенов

Стадии сифилиса Рекомбинантные антигены

ТтрА Тр47 Тр17 Тр15

первичный, п = 74 94,6% 59,5% 40,5% 56,8%

вторичный, п = 109 99,1% 94,5% 92,7% 94,5%

скрытый, п = 120 99,2% 97,5% 97,5% 97,5%

леченый, п = 112 68,7% 83% 88,4% 74,1%

Из приведенных результатов видно, что при тестировании образцов сывороток больных сифилисом максимальный показатель чувствительности был получен в РПГА тесте, где в качестве сенситина использовался рекомбинантный ТтрА белок, причем в шести пробах обнаружены антитела только к данному антигену. Полученные результаты совпадают с данными

других исследователей (Ijsselmuiden et al., 1989, Stienstra et al., 1992, Гражданцева, 2000, Иванов, 2000), показавших высокую антигенную активность ТтрА белка Т. pallidum.

В трех образцах с клинически и серологически подтвержденным диагнозом сифилис первичный в РПГА не было обнаружено противотрепонемных антител ни к одному антигену, и в одном образце присутствовали антитела только к Тр47 и Тр15. Если для сифилиса первичного чувствительность теста на основе ТтрА была значительно выше чувствительности остальных РПГА тестов (р<0,05), то для стадий вторичного, скрытого и позднего сифилиса уровень антител к данному антигену соотносился с высокими уровнями специфических иммуноглобулинов ко всем трепонемным антигенам (р>0,05). Тестирование образцов сывороток пациентов, находящихся на контроле в посттерапевтичий период, показало, что процент положительных результатов был минимальным в ТтрА-РПГА, но достоверно не отличался от процента положительных результатов, полученных в Тр15-РПГА (р>0,05), уступая тестам Тр47-РПГА и Тр17-РПГА (р<0,05). Это может свидетельствовать о том, что антитела к белку ТтрА первыми исчезают в сыворотке крови больных после адекватно проведенной терапии, что согласуется с данными нескольких авторов (Ijsselmuiden et al., 1989, Schouls et al., 1989, Кочанова, 2002, Иванов и др., 2005). Учитывая, что помимо создания высокочувствительного диагностикума ставилась задача конструирования теста, пригодного для контроля за эффективностью лечения, был выбран белок ТтрА, показавший результаты, отвечающие заявленным требованиям.

Все РПГА тесты с использованием отдельных антигенов показали высокую специфичность: ТтрА - 99%, Тр47 - 96,7%, Тр17 - 99,3%, Тр15 -98,2% (р>0,05).

Учитывая, что каждый диагностический формат имеет свои ограничения, был проведен сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков — аналогов основных мембранных протеинов ТтрА, 47 кДа, 17 кДа , 15 кДа Т. pallidum в РПГА и ИФА на разных стадиях сифилитической инфекции.

Рекомбинантные антигены были индивидуально сорбированы в лунки иммунологического планшета. Диапазон концентраций антигенов составил от 1 до 10 мкг/мл. Для рекомбинантных белков были выбраны следующие оптимальные концентрации: ТтрА — 5 мкг/мл, Тр47 — 4 мкг/мл, Тр17 — 5,25 мкг/мл, Тр15 — 5,75 мкг/мл. Концентрация IgG-коньюгата составила 0,5 мкг/мл и IgM-коньюгата — 2 мкг/мл. В табл. 2 приведены данные по чувствительности ИФА тестов, основанных на отдельных рекомбинантных антигенах.

При исследовании спектров антител, соответствующих различным стадиям сифилитической инфекции, иммуноферментными методами наблюдалась несколько иная картина, чем в РПГА. Особенно отчетливо разница в детекции антител к отдельным рекомбинантным антигенам

(р<0,05) проявилась при первичном и леченом сифилисе, когда количество специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови незначительно.

Большинство больных с первичной стадией заболевания имело антитела к белку Тр47. Разница в чувствительности Тр47-ИФА и ТтрА-ИФА тестов была недостоверной (р>0,05). Число образцов сывороток с антителами к Тр17 и Тр15 антигенам было минимальным на стадии первичного сифилиса как при тестировании в РПГА, так и в ИФА (р<0,05). Среди образцов сывороток больных первичным сифилисом найдены 3 сыворотки, в которых методом ИФА выявлены антитела только к Тр47, и 1 сыворотка с антителами только к ТгпрА. Это подтверждает необходимость присутствия Тр47 и ТгпрА в комплексе антигенов, используемом в ИФА диагностикумах. В спектре специфических антител в образцах сывороток больных активным сифилисом, начиная со вторичной стадии, как правило присутствуют иммуноглобулины ко всем четырем рекомбинантным антигенам, с небольшим преимуществом к Тр17 (р>0,05).

Если расположить рекомбинантные антигены в порядке убывания процента определяемых к ним антител во всех положительных образцах от больных активным сифилисом, то для РПГА эта последовательность будет следующей: ТтрА - 98%, Тр47 - 87,1%, Тр15 - 86,5%, Тр17 - 81,9%; для ИФА: Тр47 - 95,6%, ТгпрА - 95,3%, Тр17 - 92,2%, Тр15 - 89,3%. Разница в частоте детекции антител к антигенам Тр47 и Тр17 методами ИФА и РПГА оказалась достоверной (р<0,05), практически одинаково выявлялись антитела к антигенам ТтрА и Тр15 (р>0,05). Последовательность показателей чувствительности тестов при исследовании образцов от лиц, находящихся на сероконтроле после проведенной терапии, имела вид - для РПГА: Тр17 - 88,4%, Тр47 - 83%, Тр15 - 74,1%, ТтрА - 68,7%; для ИФА: Тр17 — 100%, Тр15 — 86,2%, Тр47 - 56,1%, ТтрА - 48,8%. Чаще всего обоими методами у больных, получивших лечение, определялись антитела к белку Тр17 (чувствительность Тр17-ИФА достоверно отличалась от чувствительности ИФА тестов на основе других антигенов (р<0,05); чувствительность Тр17-РПГА недостоверно отличалась от чувствительности Тр47-РПГА (р>0,05)). Реже всего определялись антитела к рекомбинантному антигену ТтрА (разница между показателями чувствительности ТтрА-ИФА и Тр47-ИФА, а также между ТтрА-РПГА и Тр15-РПГА была недостоверной (Р>0,05)).

Таблица 2.

Чувствительность ИФА-тестов с использованием отдельных рекомбинантных антигенов

Стадии сифилиса Рекомбинантные антигены

ТтрА Тр47 Тр17 Тр15

первичный, п = 84 88,1% 91,7% 71,4% 62,5%

вторичный, п = 128 99,2% 99,2% 100% 99,2%

скрытый, п = 107 96,3% 94,4% 99,1% 97,8%

леченый, п = 41 48,8% 56,1% 100% 86,2%

Возможной причиной разницы спектров антител к рекомбинантным антигенам, определяемых ИФА и РПГА, могли быть особенности экспозиции рекомбинантных белков на поверхности твердых носителей в иммуноферментном и гемагглютинационном диагностикумах. В зависимости от связи белка с носителем развиваются конформационные изменения, сопровождающиеся появлением новых, либо экранированием имеющихся детерминант или, напротив, усилением их реакционной способности. От конформации белка зависит какие классы антител будут связываться с доступными антигенными детерминантами.

Результаты нашей работы подтверждают полученные ранее данные (Гражданцева, 2000, Иванов, 2000, Кочанова, 2002, Rostopira, 2003) о том, что вероятность обнаружения специфических иммуноглобулинов к исследованным антигенам возрастает с увеличением остроты инфекционного процесса и длительности заболевания. Наши исследования подтвердили данные других авторов, что антитела к белку ТшрА первыми исчезают после успешно проведенной терапии сифилиса (Иванов и др., 2005). Число образцов сывороток, содержащих преимущественно антитела к Тр17, от лиц, получивших полноценное лечение по поводу сифилиса, было максимальным. Это согласуется с данными, приведенными в работах A.A. Гражданцевой (2000) и М.В. Кочановой (2002).

2. Разработка технологии производства гемагглютинационного

диагностикума_«ДС-РПГА-анти-Люис»,_основанного_на

рекомбинантном антигене ТшрА. Характеристики теста «ДС-РПГА-анти-Люис».

Для создания гемагглютинационного диагностикума были выбраны формалинизированные куриные эритроциты, сенсибилизированные рекомбинантным аналогом ТшрА антигена бледной трепонемы (концентрация 0,25 мг/мл) в присутствии хлорного хрома.

Постановка реакции осуществлялась в оптимальном режиме для проведения РПГА на формалинизированных куриных эритроцитах: в качестве реакционной смеси выбран физиологический раствор, рабочее разведение образца сыворотки крови 1:80, температура проведения реакции от 20 до 24 °С, время проведения реакции 30-40 минут. Образец сыворотки тестировался параллельно в двух лунках планшета с СЭ и КЭ.

Введение в раствор для разведения образцов 0,05% концентрата клеточного лизата Е. coli (СОП-ТП-ГИБ-009.01., ООО НПО «Диагностические системы») и концентрирование суспензии СЭ с 1% до 1,25% позволило сократить число ЛПР при тестировании образцов сывороток здоровых доноров до 1,2%, а число неспецифических реакций до 1,5% при сохранении высоких показателей чувствительности гемагглютинационного диагностикума.

В раствор для разведения образцов был введен краситель-индикатор бромфеноловый синий в концентрации 0,002%, что позволило облегчить постановку реакции.

Оценка чувствительности гемагглютинационного диагностикума, получившего рабочее название «ДС-РПГА-анти-Люис», проводилась на панели из 467 образцов сывороток крови больных сифилисом. Чувствительность тест-системы составила 98,7% (при первичном сифилисе — 95,2%, при вторичном - 99,3%, при скрытом - 99,5%, при позднем - 100%).

Специфичность тест-системы «ДС-РПГА-анти-Люис», оцененная на 1918 образцах сывороток крови здоровых доноров, составила 98,8%.

Оценка воспроизводимости диагностикума проводилась на восьми образцах сывороток. Результаты исследований представлены в табл. 3. Воспроизводимость теста «ДС-РПГА-анти-Люис» составила 100%.

Таблица 3.

Воспроизводимость теста «ДС-РПГА-анти-Люис»

Сыворотки больных

Число повторов постановки образцов, показавших реактивность 4+_3+_2+_1+ слабопол. отриц.

Первичный сифилис образец N1 образец N2 Вторичный сифилис образец N3 образец N4 Скрытый сифилис образец N5 образец N6

Сыворотка с ЛПР в РМП образец N7

образец N8_

10 10

Исследовались группы сывороток больных инфекционными заболеваниями, онкозаболеваниями и сывороток беременных женщин. Проводилось определение числа ЛПР при использовании нового гемагглютинационного диагностикума. Результаты исследований представлены в табл. 4.

Минимальные показатели специфичности были получены при исследовании образцов сывороток больных острым гепатитом А, это касалось как числа ЛПР, так и числа неспецифических реакций одновременно с СЭ и КЭ. Возможно, характерная для острой фазы гепатита А повышенная концентрация билирубина в сыворотке крови, гомологичного по строению с гемоглобином, является причиной неспецифических взаимодействий в РПГА.

Таблица 4.

ЛПР и неспецифические реакции в тест-системе «ДС-РПГА-анти-Люис»

Диагноз Число образцов Число неспецифических реакций с СЭ и КЭ ЛПР

Гепатит А острый 54 25 (46,3%) 6(11,1%)

Гепатит В хронический 47 0 4 (8.5%)

Гепатит С хронический 143 0 7 (4,9%)

Лейкоз 48 0 1 (2,1%)

ВИЧ инфекция 96 1 (1%) 6 (6,2%)

Хламидиоз 48 0 1 (2,1%)

Генитальный герпес 10 0 0

Клещевой энцефалит 8 0 0

Беременность 52 0 1 (1,9%)

Здоровые доноры 1918 19(1,5%) 23 (1,2%)

Из полученных данных видно, что ЛПР и неспецифические реакции в гемагглютинационном диагностикуме, основанном на рекомбинантном антигене, при хламидиозе, генитальном герпесе, клещевом энцефалите, беременности и у больных лейкозом детей либо отсутствуют, либо их число достоверно не отличалось от числа неспецифических результатов при тестировании образцов сывороток здоровых доноров (р>0,05). Частота встречаемости ЛПР в гемагглютинационном диагностикуме при остром и хроническом гепатите согласуется с данными других исследователей (Балашов, 1981). Число ЛПР в гемагглютинационном диагностикуме при ВИЧ инфекции составило 6,2%.

Известно, что РПГА диагностикумы, благодаря своей высокой специфичности, используются для исключения биологических ложноположительных результатов (БЛПР) отборочных кардиолипиновых тестов. Проводились исследования возможности использования гемагглютинационного диагностикума на основе рекомбинантного антигена ТгпрА для исключения ЛПР нетрепонемных (РМП, РСК с кардиолипиновым антигеном) и трепонемных тестов (РСК с трепонемным антигеном, ИФА). Результаты исследований приведены в табл. 5. Число исключенных с помощью гемагглютинационного диагностикума ЛПР, полученных как в кардиолипиновых, так и в трепонемных тестах, достоверно не отличались друг от друга (р>0,05). Представленные результаты подтверждают высокую специфичность разработанного гемагглютинационного диагностикума.

Сравнение чувствительности тест-систем «ДС-РПГА-анти-Люис» и «ИФА-анти-Люис» проводилось на панели образцов сывороток крови от больных сифилисом на разных стадиях: первичный — 52, вторичный — 96, скрытый — 159 образцов. Совпадение положительных результатов, полученных в РПГА и ИФА, составило 99,7%. Образец сыворотки от одного

больного первичным сифилисом имел позитивный результат только при тестировании в ИФА.

Таблица 5.

Сравнение числа ЛПР в тестах для диагностики сифилиса и в тест-системе «ДС-РПГА-анти-Люис»

Тест Число образцов с ЛПР «ДС-РПГА-анти-Люис»

Положительный результат Отрицательный результат

РМП 33 12 (36,4%) 21 (63,6%)

РСКкард. 21 8 (38,1%) 13 (61,9%)

РСКтреп. 38 12(31,6%) 26 (68,4%)

«ИФА-анти-Люис» 40 16 (40,0%) 24 (60,0%)

В качестве образцов для сравнения чувствительности диагностикумов «ДС-РПГА-анти-Люис» и «Люис-тест» (аналог RPR) были отобраны сыворотки больных: первичным сифилисом — 4, вторичным — 33, скрытым — 29 и поздним — 7 образцов. Тесты совпали по числу выявленных положительных образцов в 98,6%. Один образец сыворотки от больного скрытым сифилисом имел позитивный результат только при тестировании в РПГА диагностикуме.

Установлено, что тест-системы «ДС-РПГА-анти-Люис», «ИФА-анти-Люис» и «Люис-тест» сопоставимы по чувствительности (р>0,05).

В настоящее время частью практических лабораторий для диагностики сифилиса используется КСР, включающий в себя РМП, РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами. Проводилось сравнение чувствительности теста «ДС-РПГА-анти-Люис» и тестов, входящих в КСР. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6.

Сравнение чувствительности теста «ДС-РПГА-анти-Люис» и КСР

Стадии сифилиса «ДС-РПГА-анти-Люис» КСР

РМП РСКкард. РСКтреп.

первичный, п=36 97,2% 58,3% 63,9% 83,3%

вторичный, п=78 100% 98,9% 98,9% 100%

скрытый, п=138 100% 96,2% 97,4% 98,7%

Полученные результаты подтверждают данные ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ (Приказ МЗ РФ № 327 от 25.07.2003.) о более высокой чувствительности РПГА по сравнению с реакциями КСР при диагностике сифилиса. Особенно наглядно преимущество гемагглютинационного диагностикума проявилось при тестировании образцов сывороток больных первичным сифилисом

(р<0,05 при сравнении РПГА с РМП и РСК с кардиолипиновым антигеном.; 0,05<р<0,1 при сравнении РПГА с РСК с трепонемным антигеном).

С целью определения сроков хранения препарата проводилось изучение стабильности СЭ методом термодеградации по Методическим рекомендациям ГИСК им. Л.А.Тарасевича «Определение стабильности Отраслевых Стандартных Образцов (ОСО) и других МИБП ускоренным методом». Предполагаемая температура хранения диагностикума «ДС-РПГА-анти-Люис» - 4°С. СЭ хранились в жидком виде с добавлением консерванта 0,1% раствора азида натрия. В качестве повышенных температур были выбраны температуры 37°С, 42°С и 47°С. В качестве контролируемого параметра был выбран титр специфических антител в тестируемом образце сыворотки больного сифилисом скрытым. Титр специфических антител в образце сыворотки - 1:5120 (в четырех повторах) был принят за исходный 100% уровень. В каждой контрольной точке исследовались по три образца СЭ, хранящихся при разных температурах. С анализируемыми образцами СЭ определялся титр противотрепонемных антител в образце сыворотки (в четырех повторах), выраженный в процентах от исходного уровня.

Если в качестве критерия стабильности препарата принять падение титра антител в исследуемом образце сыворотки на 1 титр (14,3%), то время хранения СЭ, определенное методом термодеградации, составило 478 дней или 1 год 4 месяца.

В реальном времени при температуре 4°С оценивалось хранение компонентов тест-системы «ДС-РПГА-анти-Люис» в жидком и сухом виде. Хранение в жидком виде оценивалось на трех производственно-экспериментальных сериях препарата. Снижение титров специфических антител для четырех сывороток больных сифилисом из шести в производственно-экспериментальной серии №1 произошло к одному году хранения. Критический уровень антител — падение титра на один во всех образцах к 1 году и 4 месяцам хранения, спрогнозированному методом термодеградации СЭ, не был достигнут.

В качестве альтернативного было оценено хранение СЭ и КЭ в лиофилизированном виде при температуре 4°С. Полученные результаты хранения лиофилизированных СЭ и КЭ в течение двух, пяти, восьми и двенадцати месяцев показали 100% сохранения активности препарата.

Результаты исследований свидетельствуют о хорошей стабильности теста «ДС-РПГА-анти-Люис». (

3. Сравнительный анализ гемагглютинационных диагностикумов на основе рекомбинантных и лизатных трепонемных антигенов на разных стадиях сифилиса.

«ДС-РПГА-анти-Люис» - первый в мире гемагглютинационный тест для диагностики сифилиса, основанный на рекомбинантном аналоге иммунодоминантного антигена ТшрА Т. pallidum. Было проведено сравнение диагностической эффективности данного диагностикума и агглютинацинных

диагностикумов, построенных на лизатах сапрофитных и патогенных трепонем. Сравнение чувствительности проводилось с двумя отечественными гемагглютинационными диагностикумами «Люис РГТГА тест» (ООО «Ниармедик Плюс», г. Москва) и «Сифилис РПГА-тест» (ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск), немецким гемагглютинационным тестом «Syphilis ТРНА test» («Human», Германия) и японским агглютинационным тестом на желатиновых частицах «Serodia ТР-РА» («Fujirebio Inc.», Япония).

Результаты сравнения гемагглютинационных диагностикумов, полученные при тестировании образцов сывороток больных разными стадиями сифилиса, представлены на рис. 1-3. При исследовании 39 образцов сывороток больных сифилисом тесты «ДС-РПГА-анти-Люис» и «Serodia ТР-РА» показали совпадающие результаты - 100% чувствительность.

Статистический анализ полученных данных показал, что если чувствительность разрабатываемого нами теста для первичной стадии сифилиса значительно превышает чувствительность теста ООО «Ниармедик Плюс» (р<0,01), то между показателями чувствительности теста «ДС-РПГА-анти-Люис» и тестами «Сифилис РПГА-тест», «Syphilis ТРНА test» и «Serodia ТР-РА» нет достоверной разницы (р>0,05). Но диагностикум «ДС-РПГА-анти-Люис» позволил подтвердить диагноз первичного сифилиса у нескольких человек, которых пропустили гемагглютинационные диагностикумы других производителей. Принимая во внимание важность ранней серодиагностики данного заболевания, связанной с повышенной контагиозностью больных первичным сифилисом и эффективностью во время начатого лечения, можно сделать предварительное заключение, что гемагглютинационный диагностикум, основанный на рекомбинантном антигене, имеет преимущество в детекции специфических

иммуноглобулинов в начале сифилитической инфекции перед гемагглютинационными тестами, основанными на лизатах трепонем.

Сравнительная оценка специфичности тест-систем «ДС-РПГА-анти-Люис» (99%) и «Люис РПГА тест» (99,5%), проведенная на 187 образцах сывороток здоровых доноров, показала отсутствие достоверной разницы (р>0,05).

Окончательную оценку диагностической эффективности теста «ДС-РПГА-анти-Люис» можно будет дать только после его клинического испытания в условиях практического здравоохранения в течение некоторого времени.

4. Сравнение динамики титров антител к кардиолипину и к белку ТтрА Т. pallidum в процессе проведения противосифилитической терапии.

Основываясь на результатах, полученных ранее при сравнении ИФА и РМП тестов, где была отмечена хорошая корреляция динамики титров антител против кардиолипина и белка TmpA (Ijsselmuiden et al., 1989, Schouls et al., 1989), была проведена оценка возможности использования гемагглютинационного диагностикума на основе рекомбинантного антигена

TmpA для мониторинга проводимого противосифилитического лечения и контроле в посттерапевтический период.

□ "ДС-РПГА-анти-Люис" (НПО "ДС") В"Люис РПГА тест" (ООО "Ниармедик Плюс")

Стадии сифилиса

Рис. 1. Сравнение чувствительности тестов «ДС-РПГА-анти-Люис» и «Люис РПГА тест» (ООО «Ниармедик Плюс», Россия).

□ "ДС-РПГА-анти-Люис" (НПО"ДС") В "Сифилис РПГА-тест" (ЗАО "ЭКОлаб")

S V* t- i4 х

первичный, вторичный, скрытый, п*14 п-36 п-12

Стадии сифилиса

Рис. 2. Сравнение чувствительности тестов «ДС-РПГА-анти-Люис» и «Сифилис РПГА-тест» (ЗАО «ЭКОлаб», Россия).

□ "ДС-РПГА-анти-Люис" (НПО"ДС") В "Syphilis ТРНА test" ("Human", Германия)

первичный, вторичный, скрытый, пж22 п-7 п—22

Стадии сифилиса

Рис. 3. Сравнение чувствительности тестов «ДС-РПГА-анти-Люис» и «Syphilis ТРНА test» («Human», Германия).

Проведено сравнение исходных уровней антител, определяемых тест-системами «ИФА-анти-Люис», «ДС-РПГА-анти-Люис» и РМП тестом в 37 образцах сывороток крови больных сифилисом и лиц, находящихся на контроле после лечения. В гемагглютинационном диагностикуме титры специфических антител определялись в диапазоне от 1:80 до 1:10240, в иммуноферментной тест-системе - от 1:10 до 1:2560, в РМП - от 1:2 до 1:32. Чтобы сравнить титры антител, определяемые разными методами, они были представлены как число двукратных разведений образца от исходного титра (К). Результаты сравнения представлены на рис. 4.

Рис. 4. Сравнение титров антител (выраженных через число двукратных разведений образца, Ы) в образцах сывороток крови, определяемых тестами «ИФА-анти-Люис», РМП и «ДС-РПГА-анти-Люис».

Проведенный анализ результатов сравнения трех тестов показал, что самые длинные ряды титрования образцов сывороток крови получены для иммуноферментной тест-системы (И среднее = 8), а самые короткие — для РМП (И среднее = 3), для РПГА — N среднее = 5, что, возможно, отражает чувствительность разных методов. Результаты, полученные по индивидуальным образцам в «ДС-РПГА-анти-Люис», достоверно отличались от результатов в ИФА и РМП (р<0,05).

Гемаггютинационным диагностикумом, основанном на рекомбинантном белке ТшрА, и РМП тестом исследовалась динамика титров специфических антител в парных образцах сывороток у 53 пациентов.

После проведенной терапии титры антител в сыворотках больных изменились в РМП в 22,6% случаев, в РПГА в 41,5% случаев. Совпадающие результаты по динамике титров антител в гемагглютинационном диагностикуме и РМП были получены в 56,6 % случаев. В 30,2% случаев наблюдалось изменение титров антител в гемагглютинационном диагностикуме без изменения в РМП, и лишь в 13,2% случаев отмечалась положительная динамика титров антител в РМП при постоянстве титров в РПГА тесте. Полученные предварительные данные позволяют говорить о

корреляции динамики титров антикардиолипиновых иммуноглобулинов и антител против рекомбинантного антигена ТтпрА при проводимом лечении и контроле в посттерапевтический период.

Проводилось сравнение числа положительных результатов в тестах для диагностики сифилиса, полученных при исследовании образцов сывороток пациентов, стоящих на контроле после проведенной терапии (табл. 7, 8).

Таблица 7.

Сравнение числа положительных результатов в тесте «ДС-РПГА-анти-Люис» с тестами РМП, «ИФА-анти-Люис» при исследовании образцов сывороток пациентов, получивших полноценное противосифилитическое лечение

«ДС-РПГА-анти-Люис» РМП «ДС-РПГА-анти-Люис» «ИФА-анти-Люис»

п= 138 п = 171

79,7% 1 65,9% 78,9% 1 98,2%

Таблица 8.

Сравнение числа положительных результатов в тесте «ДС-РПГА-анти-Люис» с агглютинационными тестами, основанными на лизатах трепонем, у пациентов, получивших лечение по поводу сифилиса

«Д.С-РПГА-анти-Люис» «Люис РИГА тест» «Д.С-РПГА-анти-Люис» «Сифили с РПГА-тест» «Д.С-РПГА-анти-Люис» «Syphilis ТРНА test» РПГА-анти-Люис» «Serodia — ТР-РА»

п = 25 п = 8 п= 18 п = 20

68% 1 76% 87,5% 1 100% 94,4% 1 100% 90,0% 1 100%

Процент образцов сывороток с детектируемыми противотрепонемными антителами в гемагглютинационном диагностикуме был выше чем в основанном на кардиолипиновом антигене тесте РМП (р<0,05) и достоверно ниже чем в иммуноферментной тест-системе (р<0,05). Полученные результаты исследований показывают, что чувствительность метода отражается на сроках «негативации» результатов в трепонемных и кардиолипиновых тестах.

Наблюдаемая разница числа положительных результатов, полученных в агглютинационных тестах, может быть объяснена разной скоростью элиминации специфических антител к отдельным трепонемным антигенам при проводимом лечении.

Установлено, что гемагглютинационный диагностикум, основанный на рекомбинантном белке ТтрА, может использоваться для контроля за мониторингом проводимого лечения и при посттерапевтическом контроле.

5. Оценка возможности использования теста «ДС-РПГА-анти-Люис» для диагностики нейросифилиса.

Определено оптимальное разведение образца ликвора в гемагглютинационном диагностикуме, основанном на рекомбинантном антигене ТгпрА, - 1:40. В 15 образцах ликвора от больных сифилисом с специфическими поражениями ЦНС и 3 образцах от лиц, получивших лечение по поводу нейросифилиса, проводилось сравнение спектров противотрепонемных антител в цереброспинальной жидкости методами РПГА и ИФА. Результаты исследований представлены в табл. 9.

Таблица 9.

Чувствительность РПГА и ИФА тестов с использованием отдельных рекомбинантных антигенов при диагностике нейросифилиса

Рекомбинантный антиген ТшрА Тр47 Тр17 Тр15

Чувствительность РПГА тестов 86,7% 80% 86,7% 60%

Чувствительность ИФА тестов 69,2% 53,8% 84,6% 46,2%

Исследование спектров антител к белкам бледной трепонемы в ликворе больных и переболевших нейросифилисом лиц методом ИФА продемострировало преобладание иммуноглобулинов к антигену Тр17 (р<0,05), гемагглютинационный диагностикум выявлял преимущественно специфические антитела к ТгпрА и Тр17 антигенам, но достоверная разница на такой небольшой выборке была только с РПГА тестом на основе протеина Тр15. Полученные данные подтверждают правильность выбора рекомбинантного белка ТшрА для создания гемагглютинационного теста для диагностики сифилиса. Показано, что для конструирования ИФА диагностикума в антигенный комплекс должен быть включен рекомбинантный белок Тр17.

Специфичность РПГА тестов при исследовании 13 образцов ликвора от больных сифилисом без поражения нервной системы составила: ТшрА — 84,6%, Тр47 - 84,6%, Тр17 — 76,9%, Тр15 - 100%.

Проанализированы уровни специфических антител к отдельным рекомбинантным трепонемным антигенам в парных образцах (сыворотка — ликвор), полученных от 9 больных нейросифилисом и 1 больного сифилисом без поражений ЦНС, но с выявленными специфическими антителами в образце ликвора в РПГА.

Результаты свидетельствуют о том, что титры антител, определяемые гемагглютинационным тестом при поражениях ЦНС при сифилисе в образцах ликвора, ниже титров антител в соответствующих образцах сывороток крови (р<0,05), что совпадает с данными других авторов (Hagedorn, 1980,Young, 1998, Luger et al., 2000). Показано отсутствие

корреляции между соотношениями титров антител к отдельным антигенам в парных образцах у больных нейросифилисом. В то время как у больного сифилисом без поражений ЦНС соотношения между титрами антител в образцах сыворотки и ликвора совпадали. Равенство соотношений титров антител в биологических жидкостях в данном образце может свидетельствовать о пассивном переносе иммуноглобулинов через гематоэнцефалический барьер. Отсутствие корреляции в соотношениях титров антител к отдельным антигенам в ликворе и сыворотке у больных нейросифилисом может служить косвенным подтверждением активного интратекального синтеза антител в ответ на инвазию Т. pallidum в центральную нервную систему. Необходимы дополнительные масштабные исследования, чтобы подтвердить достоверность этих данных.

С использованием образцов ликвора от больных нейросифилисом (п =18) и от больных сифилисом без поражения нервной системы (п = 13) проведено сравнение чувствительности и специфичности тестов РИФ, РИБТ, РМП, РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами, «ИФА-анти-Люис» и «ДС-РПГА-анти-Люис». Результаты приведены в табл. 10.

Таблица 10.

Чувствительность и специфичность разных тестов при диагностике нейросифилиса

Тест Чувствительность Специфичность Диагностическая эффективность

РИФ 76,9% 84,6% 80,8%

РИБТ 61,5% 81,8% 70,8%

РМП 61,5% 100% 80,8%

РСКкард. 50% 100% 74,1%

РСКтреп. 64,3% 100% 81,5%

«ИФА-анти-Люис» 80% 84,6% 82,1%

«ДС-РПГА-анти-Люис» 86,7% 84,6% 85,7%

Результаты исследований показали, что при использовании ликвора в качестве диагностической среды тесты РИФ, ИФА и гемагглютинационный диагностикум, основанный на рекомбинантном антигене, превосходят по чувствительности тесты РИБТ, РМП, РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами. При тестировании образцов ликвора реакции КСР отличаются 100% специфичностью по сравнению с трепонемными тестами (специфичность 81,8 - 84,6%). Из приведенных данных видно, что иммуноферментный и гемагглютинационный тесты, основанные на рекомбинантных антигенах, сопоставимы по чувствительности и специфичности с признанной в нашей стране для диагностики нейросифилиса РИФ. Значения диагностической эффективности отдельных тестов варьировали в пределах от 70,8 до 85,7 и достоверно не отличались

друг от друга. Под диагностической эффективностью подразумевалось среднее значение между чувствительностью и специфичностью. Показано, что диагностичекую эффективность ликвородиагностики можно повысить до 90,3% путем использования комбинации тестов РИФ + ИФА + РПГА и РИФ + ИФА + РМП (критерий совпадения — минимум в двух тестах из трех положительный результат). Т.о. гемагглютинационный тест на основе рекомбинантного антигена ТшрА может использоваться для диагностики нейросифилиса в комбинации с тестами РИФ и ИФА.

Выводы

1. Установлена высокая диагностическая значимость четырех рекомбинантных антигенов - аналогов иммунодоминантных белков ТшрА, 47, 17 и 15 кДа Т. pallidum. Для создания эффективного диагностикума на основе РПГА достаточно использования одного антигена ТшрА, для ИФА тест-систем необходим комплекс рекомбинантных антигенов.

2. Разработана и внедрена в практику технология производства гемагглютинационного диагностикума, основанного на использовании рекомбинантного антигена — аналога иммунодоминантного белка ТшрА Т. pallidum. Созданный гемагглютинационный диагностикум обладает высокими показателями чувствительности, специфичности и воспроизводимости.

3. Гемагглютинационный диагностикум на основе рекомбинантного белка ТшрА имеет преимущество перед аналогами на основе лизатных антигенов Т. pallidum при детекции специфических иммуноглобулинов в первичной стадии сифилитической инфекции и не уступает по специфичности и чувствительности при диагностике вторичной и скрытой стадии заболевания.

4. В процессе лечения сифилиса динамика титров антител к кардиолипину и к белку ТшрА совпадает, что позволяет использовать новый гемагглютинационный диагностикум для оценки эффективности лечения и контроля в посттерапевтический период.

5. Показана возможность использования гемагглютинационного диагностикума на основе рекомбинантного антигена, воспроизводящего иммунодоминантные домены ТшрА белка Т. pallidum, для ликвородиагностики нейросифилиса.

Список публикаций по теме диссертации

1. Обрядина А.П., Чепурченко Н.В., Поздышева Л.А., Вязьмина Е.С., Абалкина Л.М., Бурков А.Н. Скрининговый комплекс для диагностики сифилиса.// Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы инфекционной патологии». Барнаул, 1999. С.220-221.

2. Обрядина А.П., Фриго Н.В., Комарова В.Д., Чепурченко Н.В., Абалкина Л.М., Бурков А.Н. Использование ультроозвученных белков Т. pallidum и их рекомбинантных аналогов в иммуноферментной диагностике сифилиса. // ИППП. 1999. №1. С.25-28.

3. Чепурченко Н.В., Гладышева М.В., Бурков А.Н., Комарова В.Д., Фриго Н.В., Новикова С.И. Предварительные результаты апробации иммуноферментной тест-системы для определения трепонемоспецифических IgM.// Тезисы научных работ VIH-oro Всероссийского съезда дерматовенерологов. Ч.И. Москва, 2001. С. 113-114.

4. Чепурченко Н.В., Гладышева М.В., Пьявкина A.A., Обрядина А.П. Новый способ определения титра специфических антител в иммуноферментной диагностике сифилиса. // Тезисы научных работ Первого Российского конгресса дерматовенерологов. Том II. Санкт-Петербург, 23-26 сент. 2003 г. С. 38-39.

5. Чепурченко Н.В., Гладышева М.В., Фриго Н.В. Диагностическая значимость поверхностных антигенов Т. pallidum при детекции специфических антител в различные стадии и формы сифилиса. // Тезисы научных работ Первого Российского конгресса дерматовенерологов. Том II. Санкт-Петербург, 23-26 сент. 2003 г. С. 39-40.

6. Обрядина А.П., Чепурченко Н.В., Фриго Н.В., Никулин Н.К., Комарова В.Д. Диагностика сифилиса.// Информационные материалы. Нижний Новгород, НПО «Диагностические системы», 2004. 42С.

7. Гладышева М.В., Уланова Т.И., Пузырев В.Ф., Бугрова H.A., Чепурченко Н.В., Обрядина А.П. Использование нового синтетического антигена в иммуноферментной диагностике сифилиса.// Тезисы научных работ Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов». Нижний Новгород, 27-28 мая 2004 г. С. 86-87.

8. Чепурченко Н.В., Уланова Т.И., Пузырев В.Ф., Логинова Л.Н., Бурков А.Н., Обрядина А.П. A new recombinant antigen haemagglutination test for the serological diagnosis of syphilis.// Материалы 15-ого Европейского конгресса клинической микробиологии и инфекционных заболеваний. Копенгаген, Дания. 2-5 апр. 2005. С.247.

9. Иванова Н.И., Пекшева О.Ю., Чепурченко Н.В., Обрядина А.П., Залеских Н.В. Оценка готовности лабораторий центров по профилактике и борьбе со СПИД Приволжского федерального округа к осуществлению диагностики сифилиса.// Российская научно-практическая конференция, посвященная 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-

Медицинской академии им. С.М. Кирова. Санкт-Петербург, 22-24 марта 2006г. С.135.

10. Чепурченко Н.В., Гладышева М.В., Обрядина А.П. Новые возможности использования рекомбинантных антигенов в серодиагностике сифилиса. // Клин, дерматол. и венерол. 2006. №2. С. 28-31.

11. Кувшинов М.В., Чепурченко Н.В., Обрядина А.П. Комплексный подход к серологической диагностике сифилиса. // Материалы V съезда дерматовенерологов Республики Беларусь «Актуальные вопросы деоматологии, венерологии и дерматокосметологии». Минск, 20-21 сентября 2006 г. С.68-71.

Отпечатано в типографии ООО НПО «Диагностические системы» Тираж 100 экземпляров Бесплатно

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чепурченко, Наталья Валерьевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Возбудитель сифилиса - Treponema pallidum.

1.2. Антигенные свойства белков Treponema pallidum.

1.3. Эритроцитарные белковые диагностикумы.

1.4. РПГА в серодиагностике сифилиса.

1.5. Место РПГА в диагностике нейросифилиса.

1.6. Ложноположительные реакции в РПГА. Применение рекомбинантных антигенов как способ повышения специфичности серодиагностики.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Т. pallidum.

2.2. Исследуемый материал.

2.3. Тест-системы сравнения.

2.4. Получение сенсибилизированных куриных эритроцитов.

2.5. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

2.6. Иммуноферментный анализ.

2.7. Определение стабильности СЭ ускоренным методом.

2.8. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение иммунохимических свойств рекомбинантных антигенов -аналогов иммунодоминантных белков Т. pallidum. Сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков в РПГА и ИФА.

3.2. Разработка технологии производства гемагглютинационного диагностикума «ДС-РПГА-анти-Люис», основанного на рекомбинантном антигене ТтрА. Характеристики теста «ДС-РПГА-анти-Люис».

3.3. Сравнительный анализ гемагглютинационных диагностикумов на основе рекомбинантных и лизатных трепонемных антигенов на разных стадиях сифилиса.

3.4. Сравнение динамики титров антител к кардиолипину и к белку ТшрА Т. pallidum в процессе проведения противосифилитической терапии.

3.5. Оценка возможности использования теста «ДС-РПГА-анти-Люис» для диагностики нейросифилиса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Treponema pallidum как основа гемагглютинационного диагностикума"

Актуальность проблемы.

В настоящее время сифилис является важной проблемой здравоохранения во всем мире. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется 12 млн. новых случаев заболевания (Hook et al., 2004). Последнее десятилетие XX века охарактеризовалось в России вспышкой заболеваемости сифилиса с максимумом в 1997 году - 277 случаев на 100 тыс. населения. Рост общей заболеваемости сифилисом вызвал значительное увеличение случаев нейросифилиса. За последние пять лет (1999-2005) число зарегистрированных случаев нейросифилиса в РФ увеличилось в 10,5 раз - с 51 до 538 (Лосева, Аншуков, 2006). Среди них отмечено преобладание стертых и скрытых форм инфекции, что затрудняет диагностику данной стадии сифилиса. В последние годы наметилась тенденция к снижению заболеваемости сифилисом, но среднероссийский показатель заболеваемости еще слишком высок - 68,6 случаев на 100 тыс. населения в 2005 году (Иванова и др., 2006). В связи с этим возрастает необходимость совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, внедрение в практику новых диагностических тестов.

Прямая детекция возбудителя сифилиса (Treponema pallidum subsp. pallidum) на некоторых стадиях заболевания затруднена. Культивирование бледных трепонем на искусственных питательных средах сопряжено с большими трудностями и связано, как правило, с потерей патогенности (Овчинников и др., 1987). Использование рекомбинантных антигенов - один из способов изучения полной аминокислотной последовательности белков патогенных штаммов Т. pallidum. Кроме того, рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков бледной трепонемы стандартны и безопасны.

Основную роль в постановке диагноза при сифилисе играет серодиагностика. Социальная значимость данного заболевания предъявляет ряд требований к современным иммунологическим тестам. Данные препараты должны иметь высокие показатели диагностической эффективности на всех стадиях заболевания. Диагностикумы должны быть просты в постановке, иметь короткое время проведения анализа, что дает возможность быстрого получения результата. Ценность диагностикума значительно возрастает, если с его помощью можно осуществлять контроль за проводимой терапией. В этом случая динамика титров специфических антител, выявляемых с помощью диагностикума, должна четко коррелировать с клиническими и лабораторными данными, свидетельствующими об эффективности терапии. Отвечающего всем этим требованиям теста в диагностике сифилиса в настоящее время не существует, поэтому серодиагностика сифилиса носит комплексный характер (Дмитриев, Брагина, 1996).

Широко применяемая для диагностики сифилиса реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) обладает одновременно качествами отборочного и подтверждающего теста: высокие показатели чувствительности, специфичности и воспроизводимости, простота постановки, возможность автоматизации, быстрота получения результатов. Используемые в настоящее время во всем мире гемагглютинационные диагностикумы для серодиагностики сифилиса созданы на основе лизатов сапрофитных и патогенных трепонем. Однако, отличаясь высокой специфичностью и чувствительностью при позднем сифилисе, РПГА тесты, основанные на трепонемных лизатах, уступают в чувствительности при первичном сифилисе тестам РИФ и ИФА (Johnston, 1972, Alessi, Scioccati, 1977, Jaffe et al., 1978, Luger et al., 1981, Pope et al., 1982). Известно, что после успешно проведенной терапии результаты РПГА, ИФА и РИФ диагностикумов длительное время остаются положительными, поэтому данные тесты не используют для оценки эффективности проводимого лечения и при посттерапевтическом контроле (Chambon et al., 1978, Hunter, 1979, Monsiorska-Borowska, 1983).

Данные, касающиеся изучения РИГА на основе рекомбинантных антигенов для выявления антител в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больных сифилисом в литературе отсутствуют. Появление альтернативного серологического теста, пригодного для серо- и ликвородиагностики, обогатит возможности клиницистов и иммунологов для постановки точного диагноза заболевания.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось изучение иммунохимических свойств рекомбинантных аналогов основных иммунодоминантных белков ТшрА, 47 кДа, 17 кДа , 15 кДа Т. pallidum в реакции пассивной гемагглютинации на разных стадиях сифилиса, выбор рекомбинантных белков с высокой антигенной активностью и создание на их основе гемагглютинационного диагностикума.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков - аналогов основных мембранных протеинов ТгпрА, 47 кДа, 17 кДа , 15 кДа Т. pallidum в РПГА и ИФА на разных стадиях сифилитической инфекции;

4. Сравнить динамику титров антител к кардиолипину и к белку ТшрА Т. pallidum в процессе проведения противосифилитической терапии;

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Высокая корреляция динамики титров специфических и антикардиолипиновых антител позволяет использовать гемагглютинационный диагностикум на основе рекомбинантного ТшрА антигена для мониторинга проводимого противосифилитического лечения и контроле в посттерапевтический период.

Научная новизна исследования.

Впервые методом РПГА исследованы иммунохимические свойства четырех рекомбинантных антигенов - аналогов иммунодоминантных белков ТгпрА, 47, 17 и 15 кДа Т. pallidum.

Показано, что гемагглютинационный диагностикум, основанный на использовании рекомбинантного белка - аналога иммунодоминантного эпитопа ТшрА антигена Т. pallidum, может использоваться для ликвородиагностики при нейросифилисе.

Впервые показана возможность использования гемагглютинационного диагностикума на основе рекомбинантного аналога белка ТшрА для оценки эффективности противосифилитического лечения и при контроле в посттерапевтический период.

Практическая значимость.

На основе формалинизированных куриных эритроцитов, сенсибилизированных рекомбинантным антигеном ТшрА, сконструирован РПГА тест для диагностики сифилиса. Разработанная тест-система «ДС-РПГА-анти-Люис» может применяться в комплексной диагностике заболевания в качестве скринингового и подтверждающего теста. Данный гемагглютинационный диагностикум адаптирован для тестирования образцов ликвора, что позволяет использовать его для выявления поражений ЦНС при сифилисе. Созданный гемагглютинационный диагностикум может использоваться для подтверждения динамических изменений титров антикардиолипиновых иммуноглобулинов, определяемых РМП, при проводимом лечении и в посттерапевтический период.

Подана заявка № 2006112226 на патент РФ на изобретение.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на Научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Барнаул, 1999 г., на VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2001 г., на Первом Российском конгрессе дерматовенерологов, Санкт-Петербург, 2003 г., на Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов», Нижний Новгород, 2004 г., на 15-м Европейском Конгрессе клинической микробиологии и инфекционных заболеваний, Копенгаген, Дания, 2005 г., на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2005 г., на Курсах информации для врачей курируемой зоны по лабораторной диагностике ИППП, Нижний Новгород, 2005 г., на Областной научно-практической конференции «Итоги деятельности дерматологической службы Нижегородской области в 2005 г.», Нижний Новгород, 2006 г., на Областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматологии», Тюмень, 2006 г., на V съезде дерматологов и венерологов Республики Беларусь, Минск, 2006 г., на VI Научно-практической конференции «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика», Москва, 2006 г.

Структура и объем диссертации.

Материал диссертации изложен на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 226 источников на

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Чепурченко, Наталья Валерьевна

выводы

1. Установлена высокая диагностическая значимость четырех рекомбинантных антигенов - аналогов иммунодоминантных белков ТтрА, 47, 17 и 15 кДа Т. pallidum. Для создания эффективного диагностикума на основе РПГА достаточно использования одного антигена ТтрА, для ИФА тест-систем необходим комплекс рекомбинантных антигенов.

2. Разработана и внедрена в практику технология производства гемагглютинационного диагностикума, основанного на использовании рекомбинантного антигена - аналога иммунодоминантного белка ТтрА Т. pallidum. Созданный гемагглютинационный диагностикум обладает высокими показателями чувствительности, специфичности и воспроизводимости.

3. Гемагглютинационный диагностикум на основе рекомбинантного белка ТтрА имеет преимущество перед аналогами на основе лизатных антигенов Т. pallidum при детекции специфических иммуноглобулинов в первичной стадии сифилитической инфекции и не уступает по специфичности и чувствительности при диагностике вторичной и скрытой стадии заболевания.

4. В процессе лечения сифилиса динамика титров антител к кардиолипину и к белку ТтрА совпадает, что позволяет использовать новый гемагглютинационный диагностикум для оценки эффективности лечения и контроля в посттерапевтический период.

5. Показана возможность использования гемагглютинационного диагностикума на основе рекомбинантного антигена, воспроизводящего иммунодоминантные домены ТтрА белка Т. pallidum, для ликвородиагностики нейросифилиса.

107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя результаты проведенных исследований, можно заключить, что рекомбинантные антигены - аналоги иммунодоминантных белков ТтрА, 47, 17 и 15 кДа Т. pallidum обладают высокой антигенной активностью.

В результате проведенного анализа иммунохимических свойств четырех рекомбинантных аналогов белков бледной трепонемы для конструирования нового гемагглютинационного диагностикума был выбран антиген ТшрА, обладающий наиболее высокой антигенной активностью на всех стадиях заболевания. Предложенный гемагглютинационный диагностикум имеет высокие показатели чувствительности, специфичности, воспроизводимости, стабилен при хранение в течение 1 года. В комбинации с диагностикумами РИФц и ИФА разработанный гемагглютинационный тест может использоваться для ликвородиагностики нейросифилиса.

Созданный на основе рекомбинантного белка гемагглютинационный диагностикум сопоставим по специфичности и чувствительности с агглютинационными диагностикумами, основанными на лизатах трепонем, при вторичном и скрытом сифилисе, но имеет преимущество в детекции специфических иммуноглобулинов к Т. pallidum в первичной стадии сифилитической инфекции.

Установлено, что в процессе лечения сифилиса динамика титров антител к кардиолипину и к белку ТшрА совпадает. Это позволяет использовать новый гемагглютинационный диагностикум для оценки эффективности лечения и контроля в посттерапевтический период.

Осуществление выпуска коммерческого диагностического препарата и его внедрение в практику лечебно-профилактических учреждений расширит выбор эффективных тестов и будет служить усовершенствованию специфической серодиагностики сифилиса.

106

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чепурченко, Наталья Валерьевна, Нижний Новгород

1. Архангельская Е.И., Дьяченко Л.А., Оловяшников О.В. Актуальные вопросы дерматовенерологии. Ч.Ш: Серологические исследования в дерматовенерологии. Горький, 1981.-С. 107-112.

2. Балашов М.П. Реакция пассивной гемагглютинации для серодиагностики сифилиса, // Вестн. дерматол. и венерол., 1981. № 9. -С. 36-39.

3. Беднова В.Н., Тимченко Г.Ф. Сравнительное изучение РПГА с диагностикумами из патогенных и культуральных бледных трепонем при различных формах сифилиса. // Вестн. дерматол. и венерол., 1987. -№4.-С, 43-45.

4. Борисенко К.К., Винокуров И.Н., Топоровский Л.М. Особенности течения скрытых форм сифилиса. // Вестн. дерматол. и венерол., 1989, -№ 11.-С. 25-29.

5. Вязьмина Е.С., Пименов В.К., Фриго Н.В., Новиков В.В. Особенности иммунного ответа организма на инфицирование возбудителем сифилиса. // Клин. лаб. диагностика, 2002. № 10. - С. 36.

6. Вербов В. Н., Колобов А. А., Иванов А. М. Эпитопное картирование антигена 17 кДа Т. pallidum с помощью синтетических пептидов. // http://www.biomed.spb.ru/cgi-bin/sort.pl?ses=4&abs.

7. Горина Л.Г., Оловников A.M. Использование глютаральдегида в методе агрегат-агглютинации для определения антигенов. // Лаб. дело, 1975.-№4.-С. 247.

8. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. -459с.

9. Гражданцева А.А. Рекомбинантные антигены в развитии иммуноферментного анализа для диагностики сифилиса: Автореф. дис.канд. биол. наук. Кольцово, 2000. - 37 с.

10. И. Гражданцева А.А., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Цивковский Р.Ю., Серпинский О.И. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов.// Иммунология, 1980. № 4. - С. 20-23.

11. Дмитриев Г.А. Общественный прогресс остановить невозможно. // Клин, дерматол. и венерол., 2004. № 1. - С. 92-93.

12. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. 4.1 // Вестн. дерматол. и венерол., 1996 № 2. -С. 29-33.

13. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса. 4.2 // Вестн. Дерматол. Венерол., 1996. № 3. -С. 33-38.

14. Дмитриев Г.А., Фриго Н.В. Сифилис. Дифференциальный клинико-лабораторный диагноз. М.: Мед. книга, 2004. - 364 с.

15. Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем. М.: Мед. лит., 2004. - 272с.

16. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

17. Иванов A.M. Совершенствование диагностики сифилиса на основе модифицированного иммуноферментного анализа: Автореф. дис.канд. мед. наук. СПб, 2000.-22 с.

18. Иванова М.А., Шевченко А.Г. Эпидемиологическая ситуация по инфекциям, передаваемым половым путем, в Российской Федерации в 2005 году.: Материалы V съезда дерматол. и венерол. Республики Беларусь, 20-21 сент. 2006г. Минск, 2006. - С. 18-20.

19. Исаков С.А., Ивлева Е.А., Эрдман Ю.С. Значение ТРНА-теста в подтверждении ложноположительных реакций на сифилис. В кн.: Вопросы диагностики, лечения и профилактики 3111111 и дерматозов. Сб н.-практ. конф. Рязань, 1995. С. 28.

20. Каральник Б.В. Научные основы изготовления эритроцитарных диагностикумов. // ЖМЭИ, 1977. № 4. С. 29.

21. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. М.: Медицина, 1976.- 164с.

22. Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы. Алма-Ата: Наука, 1982. - 150с.

23. Каур С., Сильм X., Виндиревских Г., Шевчук О. Усовершенствование методов диагностики сифилиса при помощи определения антител к специфическим белкам возбудителя. // ЗППП, 1998. № 4. - С. 21-22.

24. Кочанова М.В. Повышение информативности серологической диагностики сифилиса на основе комплексного изучения специфических факторов иммунитета: Автореф. дис.канд.мед.наук. -С-Пб, 2002.-25 с.

25. Леви М.И., Басова Н.Н., Сучков Ю.Г. Реакция пассивной гемагглютинации и реакция нейтрализации антител при некоторых инфекциях. // ЖМЭИ, 1962. № 10. - С. 40.

26. Люггер А. Диагностика сифилиса. // Бюлл. ВОЗ, 1981. т.59, № 5. -С. 529-535.

27. Медицинская микробиология. Гл. ред. Покровский В.И., Поздеев O.K. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998. - 1200 с.

28. Овчинников Н.М. Иммунитет при сифилисе. // Вестн. дерматол. и венерол., 1973. № 4. - С. 38-42.

29. Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передаваемых половым путем. -М.: Медицина, 1987. 304 с.

30. Овчинников Н.М., Милонова Т.И., Тимченко Г.Ф. со авт. Сравнительное изучение РПГА, иммунофлюоресценции с адсорбцией и микропреципитация с активной сывороткой крови на сифилис.// Вестн. дерматол. и венерол., 1983. № 5. - С. 17-20.

31. Овчинников Н.М, Тимченко Г.Ф. Реакция гемагглютинации в серодиагностике сифилиса. // Вестн. дерматол. и венерол., 1975. № 2. -С. 22-26.

32. Определение стабильности Отраслевых Стандартных Образцов (ОСО) и других МИБП ускоренным методом./ Метод, рекомендации ГИСК им.Л.А.Тарасевича М., 2003.- 7с.

33. Павлик Jl.B., Кондратенко Л.А. Ликвородиагностика ранних форм нейросифилиса. // Вестн. дерматол. и венерол., 1983. № 6. - С. 71-75.

34. Перламутров Ю.Н., Василенко Т.И, Быстрицкая Е.А., Пивоварова В.И., Колбнева Л.В. Комплекс РПГА и ИФА в диагностике и контроле лечения больных сифилисом.: Тез. докл. IX Всерос. съезда дерматовенер., М., 2005. С.49.

35. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Филатов П.В., Рыбаков А.Н. Изучение динамики гуморального иммунного ответа на белки р17, р41 и р47 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса.// Иммунол., 2005.-№2.-С. 101.

36. Приказ МЗ РФ № 87 от 26.03.2001. О совершенствовании серологической диагностики сифилиса. М., 2001. - 46 с.

37. Приказ МЗ РФ № 327 от 25.07.2003. Об утверждении протокола ведения больных "Сифилис".- М., 2003. 33 с.

38. Руководство по диагностике и лечению инфекций, передаваемых половым путем. (CDC) // Клин, дерматол. и венерол., 2002. № 2. -С. 51-55.

39. Родин Ю.А., Родин АЛО. Персистенция бледных трепонем и иммунитет при сифилисе. // Вестн. дерматол. и венерол., 2000. № 6. -С. 23-24.

40. Тимченко Г.Ф. Реакция пассивной гемагглютинации в серодиагностике сифилиса: Автореф. дис .д-ра мед. наук. М.,1991.- 16с.

41. Тимченко Г.Ф., Беднова В.Н., Басова Н.Н., Володина М.Р., Гнучева С.Е., Пермякова Э.А. Чувствительность и специфичность РПГА с эритроцитарными диагностикумами из культуральных и патогенных трепонем.// Вестн. дерматол. и венерол., 1988. № 3. - С. 20-21.

42. Тацкая Л.С. Ложная позитивность серологических реакций на сифилис и ее диагностическая оценка. // В кн.: Дерматология и венерология. Респ. межвед. сб. Вып. 26. - Киев, 1991. - С. 85-88.

43. Устименко J1.M. Особенности морфогенеза L-форм бледной трепонемы и этапы ее реверсии. // Вестн. дерматол. и венерол., 1975. № 2. -С. 36-40.

44. Хурадо Р.Л. Серология сифилиса: практический подход. // ЗППП, 1997. -№3.-С. 3-11.

45. Черешнев В.А., Патрушева Н.Б., Бейкин Я.Б., Медведская Д.Р., Марченко Н.В. Сифилис: Иммунитет и лабораторная диагностика. -Екатеринбург: УРО РАН, 2006. 388 с.

46. Шапошников O.K. Венерические болезни. М., 1991. - 281 с.

47. Штульман Д.Р., Лосева O.K., Тактамышева Э.Ш. Клиника, диагностика и лечение современного нейросифилиса. 4.2. // ИППП, 1999. №3 -С. 12-15.

48. Яковлева Н.И. Реакция иммунофлюоресценции с неразведенной спинномозговой жидкостью в ликвородиагностике сифилиса: Дис.канд.мед.наук.-Ульяновск,1978. 122с.

49. Adler M.W. ABC of sexually transmitted diseases. Syphilis: diagnosis and management. //Br. Med. J., 1984. V.288, N 6416. - P. 551-553.

50. Aktas G., Young H., Moyes A., Badur S. Evaluation of the serodia Treponema pallidum particle agglutination, the Murex Syphilis ICE and the Enzywell TP tests for serodiagnosis of syphilis. // Int. J. STD. AIDS, 2005 -V.16,N4-P. 294-298.

51. Alderete J.F., Baseman J.B. Surfase-associated host proteins on virulent Treponema pallidum. II Infect. Immun., 1979. N 26. - P. 1048-1056.

52. Alessi E., Cusini M. Methodological problems in the study of antitreponemal IgM.// G. Ital. Dermatol. Venereol., 1985. V.120, N 2. -P.153-157.

53. Alessi E., Scioccati L. Treponemal hemagglutination test (TPHA). Validity of the micromethod using dilutions of sera 1/20-1/40. // Boll. 1st. Sieroter. Milan., 1977. V.56, N2.-P. 102-107.

54. Antoni G., dal Maso G., Berte В., Soldatini C., Cocola F. Detection of antigenic determinants in the Treponema pallidum membrane protein TmpA using overlapping synthetic peptides. // J. Immun. Methods, 1996. V.189, N l.-P. 137-140.

55. Baker-Zander S.A., Hook E.W. 3rd, Bonin P., Handstfield H.H., Lukehart S.A. Antigens of Treponema pallidum recognized by IgG and IgM antibodies during syphilis in humans. // J. Infect. Dis., 1985. V. 151, N 2.-P. 264-272.

56. Baker-Zander S.A., Lukehart S.A. Antigenic cross-reactivity between Treponema pallidum and other pathogenic members of the family Spirochaetaceae.// Infect. Immun., 1984. V. 46, N 1 - P. 116-121.

57. Baughn R.E., Demecs M., Taber L.H., Musher D.M. Epitope mapping of B-cell determinants on the 15-kilodalton lipoprotein of Treponema pallidum (Tppl5) with synthetic peptides. // Infect. Immun., 1996. V. 64, N 7. -P. 2457-2466.

58. Blanco D.R, Champion C.I, Miller J.N, Lovett M.A. Antigenic and structural characterization of Treponema pallidum (Nichols strain) endoflagella.//Infect. Immun, 1988.-V. 56, N l.-P. 168-175.

59. Blanco D.R, Miller J.N, Lovett M.A. Surface antigens of the syphilis spirochete and their potential as virulence determinants. // Emerg. Infect. Dis, 1997.-V. 3,N l.-P. 11-20.

60. Blanco D.R, Reimann K, Skare J, Champion C.I, Foley D, Exner M.M, Hancock R.F, Miller J.N, Lovett M.A. Isolation of the outer membranes from Treponema pallidum and Treponema vincentii. II J. Bacteriol, 1994. -V. 176, N 19.-P. 6088-6099.

61. Bollensen E, Albrecht S, Beuche W, Mader M, Prange H.W. Reactivity of locally produced CSF antibodies in patients with neurosyphilis against antigens of Treponema pallidum. II J. Neurol, 1993. V. 240, N 8. -P. 471-474.

62. Bourell K.W, Schulz W, Norgard M.V, Radolf J.D. Treponema pallidum rare outer membrane proteins: analysis of mobility by freeze-fracture electron microscopy. //J. Bacteriol, 1994. V. 176, N 6. - P. 1598-1608.

63. Brade V, Beuscher H.U. Results with the IgM-FTA-Abs and IgM-TPHA tests in the study of seropositive syphilitic sera. // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A., 1983. V. 254, N 4. - P. 521-527.

64. Brito Moreno A.I, Acosta Bas C, Rodriguez M, Baluja Conde I.B, Feal Carballo S, Martinez L. Monoclonal antibodies to the recombinant protein TmpA of the Treponema pallidum. II Hybrid. Hybridomics, 2003. V. 22, N6.-P. 393 -396.

65. Byrne R.E, Laska S, Bell M, Larson D, Phillips J, Todd J. Evaluation of a Treponema pallidum western immunoblot assay as a confirmatory test for syphilis. // J. Clin Microbiol, 1992. V. 30, N 1. - P. 115-122.

66. Cameron C.E. Identification of a Treponema pallidum laminin-binding protein. // Infect. Immun., 2003. V. 71, N 5. - P. 2525-2533.

67. Cameron C.E., Castro C., Lukehart S.A., Van Voorhis W.C. Function and protective capacity of Treponema pallidum subsp. pallidum glycerophosphodiester phosphodiesterase. // Infect. Immun., 1998. V. 66, N 12.-P. 5763-5770.

68. Centurion-Lara A., Castro C., Castillo R., J.M., Van Voorhis W.C., Lukehart S.A. The flanking region sequences of the 15-kDa lipoprotein gene differentiate pathogenic treponemes. // J. Infect. Dis., 1998. V. 177, N 4. -P. 1036-1040.

69. Chamberlain N.R., DeOgny L., Slaughter C., Radolf J.D., Norgard M.V. Acylation of the 47-kilodalton major membrane immunogen of Treponema pallidum determines its hydrophobicity. // Infect. Immun., 1989. V. 57, N9.-P. 2878-2885.

70. Christiansen S. Protective layer covering pathogenic treponemata. // Lancet. I., 1963.-N12.-P. 423-425.

71. Coates S.R., Sheridan P.J., Hansen D.S., Laird W.J., Erlich H.A. Serospecificity of a cloned protease-resistant Treponema pallidum--specific antigen expressed in Escherichia coli. // J. Clin. Microbiol., 1986. V. 23, N 3. - P. 460-464.

72. Coffey E.M., Bradford L.L., Naritomi L.S., Wood R.M. Evaluation of the qualitative and automated quantitative microhemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum. II Appl. Microbiol., 1972. V. 24, N 1. -P. 26-30.

73. Coombs R.R., Scott M.L., Cranage M.P. Assays using red cell-labelled antibodies. //J. Immunol. Methods, 1987. -V. 101, N 1. P. 1-14.

74. Cox D.L., Chang P., McDowall A.W., Radolf J.D. The outer membrane, not a coat of host proteins, limits antigenicity of virulent Treponema pallidum. II Infect. Immun., 1992. V. 60, N 3. - P. 1076-1083.

75. Cox P.M., Logan L.C., Norms L.C. Automated, quantitative microhemagglutination assay for Treponema pallidum antibodies. // Appl. Microbiol., 1969. V. 18, N 3. - P. 485-489.

76. Dai Y.L. Treponema pallidum specific 19S-IgM haemagglutination test and its clinical significance. // Zhonghua. Yi. Xue. Za. Zhi., 1992. V. 72, N 10. -P. 616-618.

77. Dallas W.S., Ray P.H., Leong J., Benedict C.D., Stamm L.V., Bassford P.J. Identification and purification of a recombinant Treponema pallidum basic membrane protein antigen expressed in Escherichia coli. II Infect. Immun., 1987.-V. 55,N5.-P. 1106-1115.

78. Deka R.K., Goldberg M.S., Hagman K.E., Norgard M.V. The Tp38 (TpMglB-2) lipoprotein binds glucose in a manner consistent with receptorfunction in Treponema pallidum. II J. Bacterid., 2004. V. 186, N 8. -P. 2303-2308.

79. Deka R.K., Machius M., Norgard M.V., Tomchick D.R. Crystal structure of the 47-kDa lipoprotein of Treponema pallidum reveals a novel penicillin-binding protein. // J. Biol. Chem., 2002. V. 277, N 44. - P. 41857-41864.

80. Dobson S.R.M., Taber L.H., Baughn R.E. Recognition of Treponema pallidum antigens by IgM and IgG antibodies in congenitally infected newborns and their mothers. // J. Infect. Dis., 1988. N 157. - P. 903-910.

81. Dyckman J.D., Storms S., Huber T.W. Reactivity of microhemagglutination, fluorescent treponemal antibody absorption, and venereal disease research laboratory tests in primary syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1980. V. 12, N4.-P. 629-630.

82. Faulk W.P., Houba V. Immunological reactions with chromic chloride-treated erythrocytes. // J. Immunol. Methods., 1973. V. 3, N 1. - P. 87-98.

83. Fears M.B., Pope V. Syphilis fast latex agglutination test, a rapid confirmatory test. // Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2001. V. 8, N 4. -P. 841-842.

84. Feuerhake K., Frohlich E., Meyer-Rohn J. Usefulness of the TPHA-test as a search-reaction in the current serology of lues. // Z. Hautkr., 1978. V. 53, N5.-P. 150-158.

85. Fieldsteel A.H. Genetics. // In Schell R.F., Musher D.M. Patogenesis and immunology of treponemal infection. Marcel. Dekker, Inc., New York, 1983.-P. 39-54.

86. Fitzgerald T.J., Johson R.C. Surfase mucopolysaccarides of Treponema pallidum. II Infect. Immun., 1979. N 24. - P. 244-251.

87. Frick E., Scheid-Seydel L. Untersuchungen mit J,3I-markiertem Albumin uber Austauschvorgange zwischen Plasma und Liquor cerebrospinalis. // Klin.Wschr.,1958. N 36. - P. 66.

88. Frick E., Scheid-Seydel L. Untersuchungen mit J131-markiertem y-Globulin zur Frage der Abstammung der Liquoreiweipkorper. // Klin.Wschr., 1958. -N36.-P. 857.

89. Friedly G., Zartarian M.V., Wood J.C., Floyd C.M., Peterson E.M., de la Maza M. Hemagglutination treponemal test for syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1983.- V. 18, N4.-P. 775-778.

90. Gall H. Modern lues serology. // Z. Hautkr., 1980. V. 55, N 18. -P. 1221-1225.

91. Garner M.F., Backhouse J.L., Daskalopoulos G., Walsh J.L. The Treponema pallidum haemagglutination (TPHA) test in biological false positive and leprosy sera. // J. Clin. Pathol., 1973. V. 26, N 4. - P. 258-260.

92. George R., Pope V., Fears M., Morrill В., Larsen S. An analysis of the value of some antigen antibody interactions used as diagnostic indicators in a treponemal Western blot (TWB) test for syphilis. // J. Clin. Lab. Immunol., 1998.-N50.-P. 27-44.

93. Gerber A., Krell S., Morenz J. Recombinant Treponema pallidum antigens in syphilis serology. // Immunobiol., 1996. N 196. - P. 535-549.

94. Gibowski M., Machonko Т., Bowszyc J. Evaluation of Treponema pallidum hemagglutination test based on the specimens from patients of the Dermatological Clinic, Medical Academy in Poznan. // Przegl. Dermatol., 1985.-V. 72,N2.-P. 158-163.

95. Glickman L., Schantz P., Dmroske R., Gypess E. Evaluation of serodiagnosis test for visceral larva migrants. // Ann. J. Trop. Med. Hyg., 1976.-V. 27, N3.-P. 492-498.

96. Hagedorn H.J. Syphilis antibodies in the cerebrospinal fluid and their diagnostic significance. // Dtsch. Med. Wochenschr, 1980. V. 105, N 5. -P. 155-161.

97. Hambie E.A., Larsen S.A., Perryman M.W., Pettit D.E., Feeley J.C. Heated versus unheated sera in the hemagglutination treponemal test for syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1982.-V. 15,N2.-P. 337-338.

98. Hanff P.A., Fehniger Т.Е., Miller J.N., Lovett M.A. Humoral immune response in human syphilis to polypeptides of Treponema pallidum. II J. Immunol, 1982.-V. 129, N3.-P. 1287-1291.

99. Hanff P.A., Miller J.N, Lovett M.A. Molecular characterization of common treponemal antigens. // Infect. Immun, 1983. V. 40, N 2. - P. 825-828.

100. Hazlett K.R, Sellati T.J, Nguyen T.T, Cox D.L, Clawson M.L, Caimano M.J, Radolf J.D. The TprK protein of Treponema pallidum is periplasmic and is not a target of opsonic antibody or protective immunity. // J. Exp. Med, 2001.-V. 193, N9.-P. 1015-1026.

101. Heard D.H. Factors influencing the agglutinability of red cells; variation of the red cells of the rabbit in susceptibility to agglutination by homologous iso-antisera.// J. Hyg. (Lond), 1955. V. 53, N 4. - P. 408-419.

102. Hensel U, Wellensiek H.J, Bhakdi S. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis immunoblotting as a serological tool in the diagnosis of syphilitic infections. // J. Clin. Microbiol, 1985. V. 21, N l.-P. 82-87.

103. Hollander H. Cerebrospinal fluid normalities and abnormalities in individuals infected with human immunodeficiency virus. // J. Infect. Dis, 1988.-N 158.-P. 855.

104. Hook III E.W. Editorial respons: diagnosing neurosyphilis. // Clin. Infect. Dis., 1994.-N18. P. 295-297.

105. Hook III E.W., Marra C.M. Acquired syphilis in adults. // N. England. J. of Med., 1992. -N 16.-P. 1060-1069.

106. Hook III E.W., Peeling N. Syphilis control a continuing challenge. // N. Engl. J. Med., 2004. - V. 351, N 2. - P. 122-124.

107. Horvath I., Marschalko M., Racz I. Serological examinations with TPHA antigen prepared from T. pallidum Budapest strain. // Zentralbl. Bakteriol. A., 1980. V. 246, N 3. - P. 423-427.

108. Hsu P.L., Qin M., Norris S.J. Isolation and characterization of recombinant Escherichia coli clones secreting a 24-kilodalton antigen of Treponema pallidum. // Infect. Immun., 1988. V. 56, N 5. - P. 1135-1143.

109. Hunter J.M. The effect of treatment on the Treponema pallidum Haemagglutination test in early syphilis. // Scott. Med. J., 1979. V. 24, N4.-P. 307-312.

110. Jaffe H.W., Larsen S.A., Jones O.G., Dans P.E. Hemagglutination tests for syphilis antibody. // Am. J. Clin. Pathol., 1978. V. 70, N 2. - P. 230-233.

111. Johnston N.A. Treponema pallidum haemagglutination test for syphilis. Evaluation of a modified micro-method. // Br. J. Vener. Dis., 1972. V. 48, N 6. - P. 474-478.

112. Kasatiya S., Birry A. Further evaluation of the microhaemagglutination test to determine treponemal antibodies in CSF. // Br. J. Vener. Dis., 1980. -V. 56, N 2. P. 77-80.

113. Kiraly K., Prerau H. Evaluation of the T. pallidum haemagglutination (TPHA) test for syphilis on "problem sera". // Acta. Derm. Venereol., 1974. -V. 54, N4.-P. 303-310.

114. Kofler R., Wick G. Some methodologic aspects of the chromium chloride method for coupling antigen to erythrocytes. //J. Immunol. Methods, 1977. -V. 16, N3.-P. 201-209.

115. Larsen S.A, Cruce D.D, Farshy C.E, Feeley J.C. Heated versus unheated sera in a microhemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum. II J. Clin. Microbiol, 1978. V. 8, N 4. - P. 468.

116. Larsen S.A, Steiner B.M, Rudolph A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. // Clin. Microbiol. Rev, 1995. N 8. -P. 1-21.

117. Lee J.B, Farshy C.E, Hunter E.F, Hambie E.A, Wobig G.H, Larsen S.A. Detection of immunoglobulin M in cerebrospinal fluid from syphilis patients by enzyme-linked immunosorbent assay. // J. Clin. Microbiol, 1986. -V. 24,N5.-P. 736-740.

118. Lefevre J.C, Dabernat H, Galtier M, Lemozy J, Puel J, Auberdiac G. Serologic diagnosis of syphilis by the passive hemagglutination test. // Nouv. Presse. Med, 1975. V. 4, N 35. - P.2511-2513.

119. Lefevre J.C, Prere M.F, Lareng M.B. Limitations of passive treponema haemagglutination test (TPHA) in the detection of early syphilis. // Nouv. Presse. Med, 1981.-V. 10,N21.-P. 1703-1705.

120. Lesinski J., Krach J., Kadziewicz E. Specificity, sensitivity, and diagnostic value of the TPHA test. // Br. J. Vener. Dis., 1974. V. 50, N 5. -P. 334-340.

121. Ling N.R., Bishop S., Jefferis R. Use of antibody-coated red cells for the sensitive detection of antigen and in rosette tests for cells bearing surface immunoglobulins. // J. Immunol. Methods, 1977. V. 15, N 3. - P. 279-289.

122. Logan L.C., Cox P.M. Evaluation of a quantitative automated micro-hemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum. II Am. J. Clin. Pathol., 1970. V. 53, N 2. - P. 163-166.

123. Luger A.F., Schmidt B.L., Kaulich M. Significsnce of laboratory findings for the diagnosis of neurosyphilis.// Int. J. STD. AIDS, 2000. N 11. -P. 224-234.

124. Luger A., Schmidt B.L., Spendlingwimmer I., Steyrer K. Specificity of the Treponema pallidum haemagglutination test. Analysis of results. // Br. J. Vener. Dis., 1981.-V. 57, N3.-P. 178-180.

125. Luger A.F., Schmidt B.L., Steurer K. Diagnosis of neurosyphilis by examination of the cerebrospinal fluid. // Br. J. Vener. Dis., 1981. N 57. -P. 232-237.

126. Luger A.F., Spendlingwimmer I. Automatic microhemagglutination test with Treponema pallidum antigen. // Hautarzt., 1974. V. 25, N 5. -P. 238-244.

127. Lukehart S.A., Baker-Zander S.A., Gubish E.R. Jr. Identification of Treponema pallidum antigens: comparison with a nonpathogenic treponeme.// J. Immunol., 1982. V. 129, N 2. - P. 833-888.

128. Lukehart S.A., Baker-Zander S.A., Sell S. Characterization of the humoral immune response of the rabbit to antigens of Treponema pallidum after experimental infection and therapy. // Sex. Transm. Dis., 1986. V. 13, N 1. -P. 9-15.

129. Machado Ade В., Bassi G.E., Da Silva S.M., Guglielmo S. Passive microhemagglutination reaction to Treponema pallidum in the cerebrospinalfluid in the diagnosis of neurosyphilis. // Arq. Neuropsiquiatr., 1988. -V. 46,N4.-P. 369-373.

130. MacLean S., Luger A. F. Findings neurosyphilis without the Venereal Disease Research Laboratory test. // Sex. Transm. Dis., 1996. N 23. -P. 392.

131. Manikowska-Lesinska W., Linda В., Szymska K. The TPHA test. Methods.// Przegl. Dermatol., 1975. V. 62, N 5 . - P. 663-669.

132. Marchitto K.S., Selland-Grossling C.K., Norgard M.V. Molecular specificities of monoclonal antibodies directed against virulent Treponema pallidum. II Infect. Immun., 1986. V. 51, N 1. - P. 168-176.

133. Marra C.M., Critchlow C.W., Hook E.W. 3rd., Collier A.C., Lukehart S.A. Cerebrospinal fluid treponemal antibodies in untreated early syphilis. // Arch. Neurol., 1995. V. 52, N 1. - P. 68-72.

134. Marra C.M., Maxwell C.L., Smith S.L. Cerebrospinal fluid abnormalities in patients with syphilis: association with clinical and laboratory features. // J. Infect. Dis., 2004. V. 189, N 3. - P. 369-376.

135. Miao R.M., Fieldsteel A.H. Genetics of Treponema: relationship between Treponema pallidum and five cultivable treponemes. // J. Bacteriol., 1978. -N 133.-P. 101-107.

136. Michalska E., Ruczkowska J. Treponema pallidum passive hemagglutination test with reagents of our production. // Przegl. Dermatol., 1978. V. 65, N 3. -P. 273-276.

137. Monsiorska-Borowska Z. Sensitivity of the serum TPHA reaction and its diagnostic usefulness in late syphilis. // Przegl. Dermatol., 1983. V. 70, N2.-P. 169-175.

138. Morgan C.A., Lukehart S.A., Van Voorhis W.C. Protection against syphilis correlates with specificity of antibodies to the variable regions of Treponema pallidum repeat protein K. // Infect. Immun., 2003. V. 71, N 10. -P. 5605-5612.

139. Moskophidis M, Muller F. Immunology of neurosyphilis: intrathecal synthesis of Treponema pallidum-specific IgG and IgM antibodies. // Immun. Infekt, 1985. V. 13, N 3. - P. 91-98.

140. Moskophidis M, Muller F. Molecular analysis of immunoglobulins M and G immune response to protein antigens of Treponema pallidum in human syphilis. // Infect. Immun, 1984. -V. 43, N 1. P. 127-132.

141. Moyer N.P, Hudson J.D, Hausler W.J. Evaluation of the hemagglutination treponemal test for syphilis. // J. Clin. Microbiol, 1984. V. 19, N 6. -P. 849-852.

142. Muller F, Moskophidis M. Estimation of the local production of antibodies to Treponema pallidum in the central nervous system of patients with neurosyphilis. // Br. J. Vener. Dis, 1983. V. 59, N 2. - P.80-84.

143. Muller F, Moskophidis M. Local production of antibiotics in the CNS as a specific parameter in the immunologic diagnosis of neurosyphilis. // Z. Hautkr, 1983.-V. 58,N16.-P. 1191-1199.

144. Muller F, Oelerich S. Correlations between immunological parameters and the stage of clinical apparent or latent syphilis. // Dermatol. Monatsschr, 1979.-V. 165,N6.-P. 385-395.

145. Norgard M.V, Chamberlain N.R, Swancutt M.A, Goldberg M.S. Cloning and expression of the major 47-kilodalton surface immunogen of Treponema pallidum in Escherichia coli. II Infect. Immun, 1986. V. 54, N 2. -P. 500-506.

146. Norris S.J. Polypeptides of Treponema pallidum: progress toward understanding their structural, functional, and immunologic roles. Treponema Pallidum Polypeptide Research Group. // Microbiol. Rev, 1993. -V. 57, N3.-P. 750-779.

147. Norris S.J., Weinstock G.M. The genome sequence of Treponema pallidum, the syphilis spirochete: will clinicians benefit? // Curr. Opin. Infect. Dis., 2000.-V. 13, N l.-P. 29-36.

148. Pedersen N.S., Kam-Hansen S., Link H., Mavra M. Specificity of immunoglobulins synthesized within the central nervous system in neurosyphilis. // Acta. Pathol. Microbiol. Immunol. Scand., 1984. N 90. -P. 97.

149. Peter C.R., Thompson M.A., Wilson D.L. False-positive reactions in the rapid plasma reagin-card, fluorescent treponemal antibody-absorbed, and hemagglutination treponemal syphilis serology tests. // J. Clin. Microbiol., 1979.-V. 9, N3.-P. 369-372.

150. Picerno G., Fiocca S. Value of TPHA in the serological screening of lues. // Quad. Sclavo. Diagn., 1975.-V. 11,N3.-P. 661-668.

151. Pope V., Hunter E.F., Feeley J.C. Evaluation of the microenzyme-linked immunosorbent assay with Treponema pallidum antigen. // J. Clin. Microbiol., 1982. V. 15, N 4. - P. 630-634.

152. Radolf J.D., Norgard MV, Schulz WW. Outer membrane ultrastructure explains the limited antigenicity of virulent Treponema pallidum. II Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1989. V. 86, N 6. - P. 2051-2055.

153. Rathlev T. Haemagglutination test utilizing pathogenic Treponema pallidum for the sero-diagnosis of syphilis. // Br. J. Vener. Dis., 1967. V. 43, N 3. -P. 181-185.

154. Remy В., Lomsky K., Gillert K.E. TPHA test. Comparison with classical lues reactions and the FTA-ABS test. // MMW. Munch. Med. Wochenschr., 1976.-V. 118,N2.-P. 39-42.

155. Rostopira N., Tkacikova L., Rayevska G., Pylypenko V., Mikula I., Spivak M. Elaboration of enzyme immunoassay based on recombinant antigens and intended for diagnostics of syphilis. // Folia. Microbiol. (Praha)., 2003. V. 48,N4.-P. 549-553.

156. Rudolph A.H. The microhemagglutination assay for Treponema pallidum antibodies (MHA-TP), a new treponemal test for syphilis: where does it fit 111 J. Am. Vener. Dis. Assoc., 1976. V. 3, N 1. - P. 3-8.

157. Sato T, Kubo E, Yokota M, Kayashima T, Tomizawa T. Treponema pallidum specific IgM haemagglutination test for serodiagnosis of syphilis. // Br. J. Vener. Dis, 1984. V. 60, N 6. - P. 364-370.

158. Sato N.S, Suzuki T, Ueda T, Watanabe K, Hirata R.D., Hirata M.H. Recombinant antigen-based immuno-slot blot method for serodiagnosis of syphilis. // Braz. J. Med. Bio. Res, 2004. V. 37, N 7. - P. 949-955.

159. Schouls L.M, Eds. D. Wright, L. Archard. Molecular and cell biology of sexually transmitted diseases. London, 1992. P. 85 - 129.

160. Sequeira P.J. Serological diagnosis of untreated early syphilis. Importance of the differences in THA, TPHA, and VDRL test titres. // Br. J. Vener. Dis., 1983.-V. 59, N3.-P.145-150.

161. Shore R.N. Hemagglutination tests and related advances in serodiagnosis of syphilis. // Arch. Dermatol., 1974. V. 109, N 6. - P. 854-857.

162. Stamm L.V., Parrish E.A. Characterization of the low-molecular-mass proteins of virulent Treponema pallidum. II Infect. Immun., 1994. V. 62, N l.-P. 271-279.

163. Stienstra S., Peeters Т., van der Straaten A.M., Kadir N. Treponema pallidum membrane protein A ELISA: a new test for screening and diagnosis of syphilis. // Beitr. Infusionsther., 1992. N 30. - P.85-91.

164. Sun E.S., Molini B.J., Barrett L.K., Centurion-Lara A., Lukehart S.A., Van Voorhis W.C. Subfamily I Treponema pallidum repeat protein family: sequence variation and immunity. // Microbes. Infect., 2004. V. 6, N 8. -P. 725-737.

165. Swancutt M.A., Radolf J.D., Norgard M.V. The 34-kilodalton membrane immunogen of Treponema pallidum is a lipoprotein. // Infect. Immun., 1990. -V. 58, N2.-P. 384-392.

166. Thornburg R.W., Morrison-Plummer J., Baseman J.B. Monoclonal antibodies to Treponema pallidum: recognition of a major polypeptide antigen. // Genitourin. Med., 1985. V. 61, N 1. - P. 1-6.

167. Tomberlin M.G., Holtom P.D, Owens J.L, Larsen R.A. Evaluation of neurosyphilis in human immunodeficiency virus-infected individuals. // Clin. Infect. Dis., 1994. N 18. - P.288.

168. Tomizawa Т., Kasamatsu S. Haemagglutination test for diagnosis of syphilis. // Jpn. J. Med. Sci. Biol., 1966. N 19. - P. 305-308.

169. Tomizawa Т., Kasamatsu S., Yamaya S.I. Usefulness of the hemagglutination test using Treponema pallidum antigen (TPHA) for the serodiagnosis of syphilis. // Jpn. J. Med. Sci. Biol., 1969. V. 22, N 6. -P. 341-350.

170. Tringali G. The passive hemagglutination test in the diagnosis of syphilis. Rev. Ig Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiol. Pneumoftiziol., 1978. -V. 23, N2.-P. 101-106.

171. Uete Т., Fukazawa S., Ogi K., Takeuchi Y. Clinical evaluation of the T. pallidum haemagglutination test. // Br. J. Vener. Dis., 1971. V. 47, N 2. -P. 73-76.

172. Vartdal F., Vandvik В., Michaelsen Т.Е., Loe R., Norrby E. Neurosyphilis: intrathecal synthesis of oligoklonal antibodies to Treponema pallidum. II ANN. Neurol, 1982. N 11. - P. 35.

173. Walker E.M, Zampighi G.A, Blanco D.R, Miller J.N, Lovett M.A. Demonstration of rare protein in the outer membrane of Treponema pallidum subsp. pallidum by freeze-fracture analysis. // J. Bacteriol, 1989. V. 171, N9.-P. 5005-5011.

174. Weigel L.M, Brandt M.E, Norgard M.V. Analysis of the N-terminal region of the 47-kilodalton integral membrane lipoprotein of Treponema pallidum.!! Infect. Immun, 1992.-V. 60,N4.-P. 1568-1576.

175. Weigel L.M, Radolf J.D, Norgard M.V. The 47-kDa major lipoprotein immunogen of Treponema pallidum is a penicillin-binding protein with carboxypeptidase activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1994. V. 91, N24.-P. 11611-11615.

176. Weinstock G.M, Hardham J.M, McLeod M.P, Sodergren E.J, Norris S.J. The genome of Treponema pallidum: new light on the agent of syphilis. // FEMS. Microbiol. Rev, 1998. V. 22, N 4. - P. 323-332.

177. Wentworth B.B, Thompson M.A, Peter C.R, Bawdon R.E, Wilson D.L. Comparison of a hemagglutination treponemal test for syphilis (HATTS) with other serologic methods for the diagnosis of syphilis. // Sex. Transm. Dis, 1978.-V. 5,N3.- P. 103-114.

178. Young H. Syphilis. Serology. // Dermatol. Clin, 1998. V. 16, N 4. -P. 691-698.

179. Young H. Syphilis, new diagnostic directions. // Int. J. STD. AIDS, 1992. -N3.-P. 391-413.

180. Young H., Moyes A., Seagar L, McMillan A. Novel recombinant-antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis. // J. Clin. Microbiol., 1998. V. 36, N 4. - P. 913-917.

181. Young H, Moyes A, de Ste Croix I, McMillan A. A new recombinant antigen latex agglutination test (Syphilis Fast) for the rapid serological diagnosis of syphilis. // Int. J. STD. AIDS., 1998. V. 9, N 4. - P. 196-200.

182. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. // J. Clin. Microbiol, 1995. V. 33, N 3. - P. 525-527.

Информация о работе

Чепурченко, Наталья Валерьевна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Treponema pallidum как основа гемагглютинационного диагностикума - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы