Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические подходы к повышению информативности серологической диагностики сифилиса

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические подходы к повышению информативности серологической диагностики сифилиса"

На правах рукописи

ФЕДОСЕЕВА Светлана Владимировна

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ИНФОРМАТИВНОСТИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

СИФИЛИСА

03.00.23 - биотехнология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Санкт-Петербургасий государственный Технологический инстигуг (Технический университет) и Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург)

Научные руководители:

доктор химических наук профессор Гарабаджиу Александр Васильевич кандидат медицинских наук Иванов Андрей Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Иванов Сергей Дмитриевич доктор медицинских наук профессор Королюк Александр Михайлович

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пас-тера

Защита диссертации состоится ¿М/_ 2005 г. в часов на засе-

дании диссертационного совета Д 212.230 04 при Санкт-Петербургском государственном Технологическом институте (Техническом университете) (190013, Санкт-Пегербург, Московский пр., 26)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургскою государственного Технологического института (Технического университета). Замечания и отзывы по работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу 190013, Санкт-Петербург, Московский ир, 26, Ученый Совеч.

Авторефера! разослан "otf" 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.т.н.

Т.Б. Лисицкая

■{SlS^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Согласно исследованиям, в России продолжается рост заболеваемости сифилиса с измененной клинической картиной, его атипичных и скрытых форм (Лковбян В.А., 1998; Привалова Н.К., Тихонова ЛИ., 2000). Сложная ситуация сложилась в отношении серорезистентности - длительно сохраняющиеся положительные результаты серологических реакций после проведенного лечения Особенную тревогу вызывает тот факт, что данное явление зачастую регистрируется среди беременных женщин, что приводит, в ряде случаев, к необоснованному дополнительному лечению, неблагоприятно влияющему на плод (Гусева С.Н., 1999; Аравийская К Р., 2001; Гаевская О.В., 2001). В таких условиях все большее значение приобретает эффективная лабораторная диагностика данного заболевания.

На сеюдняшний день, традиционные методы серодиагностики, и в первую очередь реакция связывания комплемента, не могут служить источником высоко достоверной информации о наличии сифилитической инфекции и не обеспечивают необходимую верификацию выше перечисленных форм сифилиса. Поэтому сохраняется актуальность разработки и внедрения новых и усовершенствования уже существующих методов (Larsen S.A. et al., 1995; Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е, 1996).

Для повышения информативности методов серологической диагностики необходимо учитывать последние достижения медицинской биотехнологии: возможность получения искусственных аналогов микробных антигенов и их использования в диагностических препаратах (Гражданцева A.A. с соавт., 1998; Обрядина А.П. с соавг., 1999), раздельное выявление классов и подклассов специфических иммуноглобулинов (Климович В.Б., 1996; Кузснкова A.B.. 1998). Возможным подходом к повышению информативности может являться и изменение трактовки результатов серологического тестирования в свете новейших достижений фундаментальной иммунологии.

Несомненно, метод ИФА позволяет наиболее широко и полно использовать достижения биотехнологии, перечисленные выше Наряду с этим, он обладает такими достоинствами как простота постановки, короткое время анализа возможность автоматизации, высокая чувствительность, инструментальный учет результата, исключающий субъективизм.

Возможным решением проблемы улучшения качества диагностики сифилиса, может стать усовершенствование реакции иммунофлуоресценции (РИФ). В данном методе в качестве антигена используется цельноклеточная пашгенная трепонема, содержащая полный набор антигенных структур микроорганизма. Соответственно данным методом можно регисгрировать антитела к антигенам, не использующимися другими диагностическими методами. Например, к таким антигенам следует отнеа и липополисахаридный компонент внешней мембраны 1 pallidum.

"1 аким образом, цель настоящего исследования заключалась в разработке методов на основе ИФА и РИФ, позволяющих констатировать наличие или ог-су1сгвие сифилитической инфекции в диагностически сложных ситуациях.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи-

1. Разработать и оптимизировать ИФА с использованием искусственных аналогов трепонемных антигенов для исследования сывороток крови и слюны на сифилис, а также изучить с его помощью динамику и спекгр антител в процессе лечения заболевания и при серорезистентности после проведенной терапии;

2. Изучить возможность использования для серодиашостики сифилиса культурального и кардиолипинового антигенов в ИФА-

3. Изучить возможность использования и оптимизирования процесса аффинной хроматографии с целью элиминации иммуноглобулинов класса G из сывороток крови;

4 Обосновать алгориш усыновления серорезшпентности после ранее перенесенной сифилитической инфекции с исполыованием разрабо!анных модификаций серологических методов.

Научная новизна работы.

- Впервые получены данные о биотехнологических свойствах иммуно-сорбента на основе синтетического трепонемного пептида из области линопро-теинаТрр41.

- Впервые предпринята попытка конструирования модификаций ИФА, предназначенных для выявления антитрепонемных секреторных слюны и для выявления антикардиолипиновых антител сыворотки.

- Впервые адаптирован процесс аффинной хроматофафии с рекомби-нантныч аналогом стрептококкового белка Б для конструирования модификации метода РИФ-абс, с целью высокоэффективного одномоментного удаления всех субизотипов иммуноглобулинов класса в из исследуемых сывороток крови.

Практическая значимость.

Биотехпологические параметры разработанных авторских вариантов серологической диагностики сифилиса могут быть использованы при проведении научных исследований, а также в практической работе медицинских лабораторий для повышения качества диагностики сифилиса.

Разработанный алгоритм дифференциальной диагностики серологической резистентности позволяет улучшить качество медицинской помощи в дерматовенерологических учреждениях.

Апробация результатов исследования.

Результаты работы доложены на Конференции молодых ученых Смоленской государственной медицинской академии (Смоленск, 2002), Заседании Общества дерматовенерологов \. Смоленска (Смоленск, 2003), Юбилейной конференции, посвященной 80-летию кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2003), Заседании Санкг-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (Санкт-Петербург, 2004), Конференции Российско-Шведского проекта «Контроль и профилактика инфекций, передаваемых половым путем» (Санкт-Петербург,

2004), Научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиа1Носшки, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004).

Результаты исследований внедрены в учебный процесс и диагностическую работу кафедр кожных и венерических болезней и микробиоло1 ии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова, а !аюке на кафедре дерматоненероло; ии Смоленской государственной медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Установленные параметры ИФА для выявления антитрепонемных им-мунтлобулинов к белковым липопротсинам моут использоваться для повышения информативности серологической диагаостики сифилиса;

2. Диагностическая эффективность ИФА с кардиолининовым антигеном, авторского варианта РИФабе.-^М, а гакже обнаружения специфических секре-юрныч IgA слюны при сифилисе (ребус 1 дополнительною изучения.

3. Применение линейно-дискриминантной функции позволяет дифференцировать наличие инфекционного процесса при сифилисе от длительно сохраняющихся положительных результатов гречонемных серологических тесшв.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 печашых работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 184 страницах машинописного текста и включает введение, 6 глав, заключение, выводы, приложение, благодарности, а также список использованной литературы, содержащий 116 источников на русском языке и 91 на иностранных языках В текст включены 37 таблиц и 15 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика использованных антигенов.

Для выполнения поставленных целей и задач использовались стедуюшие антигены.

1. Цельноклсточный трепонемный антиген - взвесь патогенных T.pallidum штамма Никольс из 7-сутсчного орхита кролика (получен из лаборатории КВД№3. зав. лаб. к.м н Исмагулова Г Д.)

2. Два вида искусственных аналогов липопротеипов: рекомбинантные и синтетические. Рекомбинантные аналоги антигенов Г .pallidum были получены в научно-производственной фирме "Диапроф-Мед'" (Киев, Украина). Антшены представляют собой белки, полученные генно-инженерным способом на основе культуры E.coli. Использовались исследованные ранее (Иванов А.М, 2000, Голованова Е.А., 2002) антигены, соответствующие природным антигенам возбудителя сифилиса с молекулярной массой 15, 17 и 47 кД (рабочее обозначение р15, р17 и р47 соответственно). Синтетический аналог - Sifl3 - был представлен химически синтезированной антшенной детерминантой из peí иона аминокислотной последовательности 23-51, трелонемного антигена с молекулярной массой 41 кД. Синтез был осуществлен в лаборатории химии пептидов НИИ особо чистых биопрепаратов (ОЧБП), г. С.-Пегербург (заведующий лабораюрией д.х.н., профессор О.А.Кауров) ведущим научным сотр>дником к.х.н. A.A. Колобовым. Использовался метод твердофазною синтеза с последующей очисткой продукта высокоэффективной жидкое шой хромат01рафией.

3. Культуральный трепонемный антиген - взвесь смешанных культур сапрофитных бледных трепонем штаммов VII, VIII, IX и Рейтера, разрушенные ультразвуком. Использовали промышленно выпускаемый препарат, лиофильно высушенный, во флаконах по 5 мл (ФГУ11 «Аллерген» г. Ставрополь).

4. Кардиолипиновый антиген - смесь трех высокоочищенных липидов. кардиолипина, лецитина и холестерина. Использовали промышленно выпускаемый в ампулах по 2 мл (НПО «Биомед» г. Пермь)

Иммуноферментный анализ.

Для определения специфических антитрепонемных антител использовался непрямой метод твердофазного иммуноферментною анализа:

|-АГ-АТх-К

где: |- - твердая фаза (полистирол): А1 - иммобилизованный трепо-немный антиген; АТХ - антитела, выявляемые в сыворотке крови; К - конъюгат: антитела к иммуноглобулинам человека, меченные ферментом.

Описание реагентов:

- 0,02 М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор с рН-9,6 использовался для приготовления рабочего раствора антигена и последующей сорбции планшетов;

- для промывки планшетов в перерывах между основными этапами реакции, разведения сывороток и приготовления рабочего раствора конъюгата использовался фосфатпо-солевой буфер, содержащий 0,15 М хлористой) натрия и с добавлением 0,1% твин-20 (ФСЬ);

- субстратный раствор включал 0,05 М цитратный буфер (рН-5,0), перекись водорода (0,035%) и тетраметилбензидин (ТМБ);

- для выявления специфического комплекса антиген-антитело использовались пероксидазные конъюхаш на основе моноклональных анштел, направленных к изотипепецифичным эпигонам 1§Ст1, ^ОЗ, 1§Ст4, ^О, IgM и секреторных 1§А иммуноглобулинов.

Все из использованных моноклональных конъюгатов были получены из лаборатории гибридомных технологий ЦНИ рентгенорадиологического инсти-1ута МЗ РФ (руководитель д.м.н. профессор Климович В.Б.)

Реакция иммунофлюоресценции.

Данный метод проводился по стандартной методике, согласно регламентирующему документу (приказ № 87 МЗ РФ, 2001). Принцип метода заключается в соединении специфического комплекса антиген-антитело с иммунной анти-яидовой сывороткой, меченной флуорохромом, и выявление его с помощью лю-минесцентно1о микроскопа

Описание реагентов:

- антиген - це шюклеючная патогенная бледная трепонема, фиксированная химически чистым ацетоном на стекле;

- сорбет - взвесь кулыуральных сапрофитных трепонем штаммов VII, VIII, IX и Рейтера, разрушенные ультразвуком. Данный антиген выпускают лиофильно высушенным, во флаконах по 5 мл (ФГУП «Аллерген» г. Ставрополь);

антивидовая люминеспируюшая сыворотка - меченная флуорохромом -флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), сыворотка крови животных, иммунизированных сывороточным иммуноглобулином человека (ПО НИИ им.Н.Ф.Гамалеи);

- 0,01 М фосфатно-солевой буфер с рН 7,3 использовался для промывки стекол между основными этапами реакции.

Исследование препаратов производили в люминесцентном микроскопе МЛД-1 с ртугно-кварцевой лампой ДРШ-250, фильтрами СЗС-7, при помощи иммерсионной системы. Учет резулыаюв исследования проводили в соответствии с рекомендациями С.И Данилова (1996).

Аффинная хроматография.

Для истощения исследуемых образцов сывороток крови от иммуноглобулинов класса G использовалась аффинохроматографическая колонка с носи1е-лем сефароза 4В стрептококковый белок G (проводилась в НИИ ИЭМ РАМН, отдел генетики микроорганизмов, совместно с д.б н Гупаловой Т В.).

- забуференцый физиологический раствор (рН 7,0) - для обеспечения продвижения сыворотки по колонке. Данный буфер также использовался для промывания колонки после десорбции IgG глициновым б\ фером;

- 0,1 М глициновый буфер с рН 2,0 - для процесса элюирования иммуноглобулинов класса G, сорбировавшихся на лиганде.

Момент отбора сыворотки определяли по показаниям ультрафиолетового детектора (Х=280 нм) и самописца Сыворотку отбирали фракциями но 400 мкл.

Характеристика исследованного материала.

В работе использовали сыворотки крови и образцы слюны людей с подтвержденным диагнозом сифилиса, с анамнестической инфекцией и здоровых доноров. Диагноз сифилиса был уставлен на основе анамнеза, данных клиниче-

ского и лабораторного обследования, и подтвержден положительными реакциями в стандартных серологических тестах.

Сыворотки крови были получены из специализированных лабораторий ГорКВД, КВД№3 (г. С Петербур1), ОблКВД и Смоленской Государственной Медицинской Академии (г Смоленск) Образцы слюны были получены с кафедры кожных болезней ВМедА им. С.М.Кирова (г Санкт-Петербург).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Оптимизация иммуноферментного анализа на основе синтетическою трепонемною антигена.

Для конструирования иммуноферменгных тест-систем по диашостике сифилиса, уже были предложены и изучены такие искусственные аналоги тре-понемных антигенов как pi 5, р17, Sifl3 и р47. Однако если для иммуносорбен-тов на основе рекомбинантных антигенов уже было изучено влияние различных факторов, влияющих на результаты ИФА, то для синтетического антигена подобная информация недостаточна. Поэтому, в процессе конструирования иммуносорбента на основе ангигена Si Л 3 решались следующие задачи: установление оптимальной концентрации анш1ена; выбор планшета с наибольшими показателями сорбции для данного вида антигена: влияние дополнительного времени контакта исследуемого образца с сенсибилизированной поверхностью твердой фазы при комнатной температуре на результаты ИФА, установление разведения исследуемого материала, а также возможные сроки хранения сенсибилизированных планшетов.

В результате было установлено, что для конструирования на основе Sifl3 сенсибилизированной твердой фазы, оптимальная концентрация данного антигена составляет 5 mki/m.t, а наилучшими сорбционными свойствами обладают планшеты марок «Nunc» и «Costar». Показали, что время контакта иммуносорбента с исследуемым материалом при комнатной температуре не должен превышать 10 минут, устойчивость сенсибилизированной твердой фазы сохраняется на протяжении 6 месяцев Определи ми. что оптимальное разведение исследуемой сыворотки крови составляет ПО, а образцов стюны - 1 81

На основании полученною иммуносорбента было проведено изучение динамики антител к липопротеиновым антигенам Т.раШс1шп в процессе лечения сифилиса По результатам исследования можно сказать, что при проведении успешной противомикробной терапии при сифилисе уровни антител класса к антигену 41 кД по сравнению с антшелами к антигенам 15, 17 и 47 кД снижаются в более ранние сроки. Сохранение позитивности результатов ИФА в отдален ные после лечения сроки чаще всего связано с антителами к антигену 17 кД. Антитела ^03 и ^М, направленные к антшенам 15, 17, 41 и 47 кД после лечения элиминируются в течение трех месяцев. Позитивность результатов ИФА с тре-понемными типопротеинами в более поздние сроки обусловлена антитела ^01 подкласса.

Установленные особенности динамики антител к Т.раШёит при проведении специфической терапии различных форм сифилиса позволили спрогнозировать успешное использование ИФА для установления причины серологической резистентности после специфической терапии данной инфекции Анализ результатов ИФА показал, что у пациентов с активной инфекцией, как клинически проявляющейся, так и скрытой, обнаруживались антитела как минимум к трем трепонемным антшенам В значительном числе случаев (1 1,5%+30,8%) в сыворотке крови обследуемых с серорезистентностью выявились антитела не более чем к двум трепонемным антигенам (Таблица 1).

Таблица 1.

Доля проб сывороток крови, реагирующих с трепонемными ан I ш енами, %

диагноз Количество антигенов

1 2 3 4

Вторичный сифилис 0 0 16.7 83,3

Ранний скрыт ый сифилис 0 0 33,3 66,7

Серорезистен 1 ноет ь 11,5 30,8 42,3 _I5'4

Причем во всех подобных случаях данными антигенами были липопр01еи-ны с молекулярной массой 17 и 47 кД, а выявляемые антитела принадлежали к

подклассу IgGl, таким образом, мы предполагаем отсутствие у указанной группы пациентов активного инфекционного процесса.

С помощью полученного иммуносорбснта была произведена оценка диагностической значимости определения секреторных IgA в слюне. Полученные результаты ИФЛ отличались выраженной вариабельностью, что происходит, вероятно, из-за белковой фракции слюны, концентрация которой по сравнению с сывороткой крови, варьирует в большем диапазоне. Соответственно, подобранное выше оптимальное рабочее разведение, не являлось единым для всего исследуемого материала. Как выяснилось, сопоставимость результатов анализа в большой степени зависит от физических свойств исследуемого материала, в частности от вязкости слюны. Поэтому, для выявления секреторных IgA-антител и получения сопоставимых результатов серологических реакций, может быть целесообразным определение оптимального значения вязкости слюны, что может значительно затруднюь повседневную работу диагностической лаборатории и вызовет дополнительные сложности

2. Разработка ИФА на основе кардиолипинового аитигеца.

С целью качественной оценки возможностей ИФА в выявлении антифос-фолипидных антител и для upoi нозирования дальнейших исследований в этой области, нами была определена рабочая концентрация ангшена как 75 мкг/мл, без окончательной оптимизации процедуры анализа.

Для изучения антителсвязываюшей способности иммуносорбента на основе кардиолипинового антигена в исследование были включены две панели сывороток крови: от здоровых доноров и больных сифилисом. Дополнительным подтверждением наличия и отсутствия инфекции служили резулыаш исследования в ИФА с трепонемным антшеном. продемонстрировавшие 100% присутствие антител к возбудителю сифилиса в материале от больных сифилисом и их отсутствие в донорских образцах.

Результаты выявления антифосфолипидных иммуноглобулинов позволяют говорить о достоверно более частом их присутствии в образцах от больных сифилисом (57,2%) по сравнению с донорами (28,6%) (р<0,05). Факт отсутствия

в 42,8% сывороток крови от больных сифилисом антител к кардиолипиновому антигену можно объяснить возможной анамнестической инфекцией, когда на фоне эффективного лечения продолжают сохраняться антитрепонемные иммуноглобулины при элиминации аутоантител к кардиолипину. Кроме того, нельзя исключить принадлежность некоторых из указанных образцов сывороток крови пациентам в раннем периоде заболевания, в котором аутоиммунные процессы еще не развились.

Факт обнаружения у трети здоровых лиц антикардиолигшновых реагинов объясняется возможностью формирования в организме человека аутоиммунных процессов, не связанных с заболеванием сифинисом и приводящих к появлению антифосфолипидных иммуноглобулинов.

Обобщение данных от образцов, положительных с кардиолипиновым ан-тш еном, с применением статистических методик позволили выявить достоверно более высокие значения ОП сывороток положительных но определению анти-кардиолипиновых и атггатрепонемных антител над ОП образцов давших положительные результаты обнаружения антикардиолипиновых антител, но отрицательных в реакциях с трепонсмным антигеном (р<0,05) (Рис 1). Данный факт определяет перспективность дальнейших работ в этом направлении.

группы сывороток «ром по рез/ 1ьтагам ИФА V трелонемяым

Рис !. Уровни оптической плотности в ИФА с кардиолипиновым антигеном

3. Разработка серологических методов с использованием нашаных трепо-немных антигенов.

Разработка модифицированной реакции иммунофлюоресценции включала в себя процедуру аффинохроматографического разделения сывороточных антител Использующийся в качестве лшанда рекомбинантный аналог стрептококкового белка О, характеризующийся высокой специфичностью связывания всех подклассов иммуноглобулинов класса в (Гупалова Т.В., 1998), позволяет исследовать возможное наличие антител класса М к тимус-независимым, липополиса-харидным антигенам внешней мембраны Т.ра1Нс1иш.

Изучение спектра анппел к культуральному трепонемному антигену, с использованием сывороток крови с положительными результатами РСК с куль-турадьным трепонемным антигеном и отрицагельными результатами специфических трепонемиых серологических реакций выявило (в 2-х случаях) наличие антител. Таким образом, проведение данного опыта показало, что аффинная хроматография не обеспечш удаление всех перекрестно-реагирующих антител из исследуемых сывороток и постановку процедуры абсорбции исключать нельзя.

В процессе проведения аффинной хроматографии решались вопросы оптимизации объема наносимой исследуемой сыворотки крони и скорости подвижной фазы при прохождении пробы через хроматографическую колонку. При изучении скорости подвижной фазы большее внимание уделяли низким значениям, поскольку в работах посвященных теории и практике аффинной хроматографии подчеркивается их важность (Туркова Я., 1980). Установили, что минимальное влияние различных видов диффузии, наблюдается при скорости потока 0,6 мл/мин, без снижения эффективности связывания ^О-антител с лигандом, как показал контроль иммуноблотингом и ИФА, без размывания хроматографи-ческих зон. Определение объема наносимой пробы, выявило, что оптимальным является 1 мл: не затрудняется процедура отбора пика сыворотки при выходе ее из колонки, вследствие этого не снижается чувствительность РИФ, нет необоснованного перерасхода материала.

Результаты клинического испытания разработанною меюда обнаружения 1(»М-антител к антигену патогенной Т.раШс1ит демонстрируют необходимость

продолжения работы по окончательной оптимизации протокола постановки реакции. Основное внимание необходимо уделить факторам, влияющим на разбавление исследуемых биологических образцов, а также методам их контроля.

Фракционирование культурального антигена, с целью выделения компоненты, обуславливающей неспецифичность результатов, проводилось с применением метода комбинированной гель-хроматографии на сефадексе Г-50 и сефа-розе 4В. Клинические испытания полученных трех фракций трепонинов выявили крайне низкую специфичность результатов тестирования сывороток крови от здоровых доноров

4. Обоснование алгоритма серодиагностики сифилиса на основе разработанных методов.

Для формирования алгоритма серологической диагностики сифилиса нами был применен дискриминаншый анализ.

Для дифференциальной диагностики сифилиса, но данным историй болезни пациентов с диагнозами вторичный сифилис, ранний скрытый сифилис, серологическая резистентность, была сформирована информационная матрица, содержащая значения в баллах 13 отобранных клинико-лабораторных признаков и 14-ый - фугашровочный признак, указывающий к какой группе относится больной Группа с диагнозом вторичный сифилис состоит из 13 больных, ее группи-ровочный признак - 1. Больные с ранним скрытым сифилисом - 13 человек -объединены в группу с признаком 2. Группа больных с серологической резистентностью содержит 43 наблюдений, ее фунлировочный признак - 3.

В ходе статистического анализа требовалось определить. 1) информативность симптомов, включенных и не включенных в линейную дискриминантную функцию (ЛДФ); 2) вклад ЛДФ в дисперсию признаков; 3) коэффициенты канонических ЛДФ; 4) факторную структуру ЛДФ: 5) координаты центроидов трех групп; 6) график положения объектов трех групп; 7) классификационную матрицу с оценками чувствительности диагностики групп информационной матрицы

Решение статистических задач выполнялось с использованием Шш STA-TiSTICA 5.0. В результате было выявлено, что наиболее информативными показателями (с уровнями значимости р<0,05) являются:

Х9 - Уровни IgG I -антител к антш ену 41 кД (ед. ОП);

Х2 - Количество серологических маркеров в ИФА (всего 16);

Х7 - Уровни IgGl-антител к антигену 17 кД (ед. ОП);

Х4 - Динамика комплекса серологических реакций (при исследовании парных сывороток крови с интервалом 3 мес.);

XI0 - Уровнй IgGi-aHTHieJi к антигену 41 кД (ед. ОН).

Таким образом, для решения задачи дифференциальной диагностики следует применять две канонические ЛДФ, рассчитываемые по формулам:

F, = - 0,67*9 - 0.32х2 + 0,5Х7 - 0,43*4 - 0,33хш;

F2 = - 0,47х9 + 1,05*2 - 0,24*7 - 0,21х4 - 0,29х!0.

Решение диагностической задачи выполняется по цэафику на рисунке

(Рис.2).

35 30 25 20 1.5 10 05

I 00

■05 10 1 <i 20 25 30

.. ....

. ,:я . . * .

1*.

о G_11 0 G_2 2 • G 33

Рис.2 Положение объектов трех групп в координатах первой и второй канонических ЛДФ. ■

На график нанесены центроиды трех диагностируемых ipyim. Нациста, для которого по его диецносшческим признакам определены F) и F2 (Rootl и Root2), следует отнести к группе по минимальному расстоянию от соогвегсг-вующег о центроида

Принципиально ценным является возможность использования рассчитанных ЛДФ с целью назначения целенаправленного и обоснованного лечения: так часть пациентов с диагнозом «серорезистеншосгь» по резулыатам статистического анализа распределилась в группе больных с активными формами сифилиса (вторичный и ранний скрытый сифилис), что указывает на необходимость проведения специфической терапии. Окончательно о соеюятельности представленной диагност ической процедуры можно будет судить после ее широкого клинического испытания.

ВЫВОДЫ

1. Оптимальными условиями постановки ИФА для выявления субизоти-пов антител к белковым антигенам возбудителя сифилиса являются"

а) При получении иммуносорбента - полистироловые планшеты «Costar» и «Nunc»; конценфация антигенов р 15 - 4 мкг/мл; р17 4 мкг/мл; sifl3 5 мкг/мл, р47 - 4 ми/мл, длительное 1ь сорбции 24 часа при 4°С, рН сорбирующе го карбонатно-бикарбонатног о буферно1 о раствора 9,6;

б) При взаимодействии исследуемой пробы с иммуносорбентом - разведение исследуемой сыворотки крови 1:10; разведение образцов слюны 1/81; результаты изучения специфических секреторных IgA слюны отличаю к-я выраженной вариабельностью и зависимостью от показатстя вязкости биологического материала, что не позволяет рекомендовать данную пропедуру для испо п> ю-вания в клинической практике;

2. Антитела IgG3 и IgM, направленные к антигенам 15, 17, 41 и 47 кД посте лечения элиминируются в течение трех месяцев Уровни антител класса IgG к антигену 41 кД по сравнению с антителами к антшенам 15, 17 и 47 кД спижа-

ются в более ранние сроки. Сохранение позитивности результатов ИФА в отдаленные после лечения сроки чаще всего связано с антителами к антигену 17 кД.

3. Использование культуралыюго трепонемного антигена в ИФА отличается значительным числом ложноположительных результатов, обусловленных перекрестнореагирующими иммуноглобулинами, что исключает успешность его использования на практике;

Выявление антикардиолшшновых иммуноглобучинов в ИФА позволяет дифференцировать сифилитическую инфекцию и другие состояния, предпола-1 ающие образования аугоатител к фосфолипидам, но уровням оптической плотности. Возможность качествешюй дифференцировки вышеназванных состояний требует дальнейшего изучения;

4. Оптимальными режимами проведения аффинной элиминации сыворо-ючных иммуноглобулинов класса G являются, скорость подвижной фазы во время прохождения сыворотки крови 0,6 мл/мин, объем наносимой на колонку сыворотки - ] мл. Результаты клинического испытания разработанного метода демонстрируют необходимость продолжения работы по окончательной оптимизации протокола пост ановки IgM-РИФ-абс.

5. Применение ЛДФ с использованием следующих показателей: уровень IgGl-антител к антшену 41 кД, количество серологических маркеров в ИФА, уровень IgGl-антител к антигену 17 кД, динамика комплекса серологических реакций, уровень ¡gG3-aniHieji к антигену 41 кД, может использоваться для установления причины серологической резистентности.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ IЮ ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов A.M., Колобов A.A., Климович В.Б., Кочанова М.Ф., Исмагуло-ва Т.Д., Федосеева C.B., Беспалова Г.И., Раздольская II.B. Изучение динамики трепонемоснецифичных антител в процессе лечения сифилиса И Материалы научной конференции и VIII съезда Российско-Итальянского общества по инфек-

ционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине», Санкт-Пегербург, 3-5.12.2002. - С.135-136

2. A.M.Ivanov, V.N. Verbov, I.N. Telichko, V.B. Klimovich, M.V. Kochanova, I V Rose, G.J. Tsmagulova, S.V Fedoseeva. Possibilities of immunoenzyme assay for diagnostics of early neurosyphilis H 1 з"1 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Glasgow, 10-13.05.2003. - P.656

3. Иванов A.M., Вербов B.H., Колобов A.A., Климович В.Б., Ходосевич Е.В., Федосеева C.B., Исмагулова Г.Д., Волков И.И. Возможности ингерприта-ции результатов ИФА на сифилис // Материалы третьей международной конференции, посвященной 80-летшо института имПастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 4-5.09.2003. - С.55

4 Иванов A.M., Теличко И.Н., Федосеева C.B., Ходосевич Е.В., Климович В.Б. Современные подходы к повышению информативности серологической диагностики раннего нейросифилиса // Труды научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург, ВМедА, 22-23.04.2004.-С. 207

5. Иванов A.M., Ходосевич Е.В., Федосеева C.B., I упалова Т.В , Исмагулова Г.Д., Литвиненко И.В., Смирнова Т.С., Кочанова М.В. Проблемные вопросы серологической диагностики сифилиса у беременных // Труды научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиашо-стики, имм>но- и экстренной профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург, ВМедА, 22-23.04.2004. - С. 207-208

6 Иванов А.М , Ходосевич Е.В., Теличко И.Н., Федосеева C.B., Исмагулова Г.Д. Серологическая диагностика сифилиса' возможности повышения информативности // Журнал акушерства и женских болезней - т U1. специальный выпуск. - 2004. - С. 126-127

7 Иванов A M. Ходосевич Е.В.. Федосеева С В., Исмагулова Г.Д, Кочанова М.В. Современные подходы к повышению эффективности серологической диагностики сифилиса // Махериалы всероссийской конференции дерматовене-

€ 8 3 6 4

рологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики И1ШП и дерматозов», Нижний Новгород, 2

РНБ Русский фон;;

2006-4 15255

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федосеева, Светлана Владимировна

СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика возбудителя сифилиса.

1.2. Инфекционная иммунология сифилиса.

1.3. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса.

1.4. Иммуноферментный анализ в диагностике сифилиса.

1.5. Реакция иммунофлюоресценции в диагностике сифилиса.

1.6. Методы разделения иммуноглобулинов.

1.6.1. Физико-химические методы.

1.6.2. Бактериальные Fc-рецепторы.

1.7. Аффинная хроматография.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика использованных антигенов.

2.1.1. Характеристика цельноклеточного антигена патогенной трепонемы.

2.1.2. Искусственные аналоги антигенов T.pallidum.

2.1.3. Характеристика культурального трепонемного антигена.

2.1.4. Характеристика кардиолипинового антигена.

2.2. Характеристика конъюгатов.

2.3. Иммуноферментный анализ.

2.4. Реакция иммунофлюоресценции.

2.5. Аффинная хроматография.

2.6. Метод иммуноблотинга.

2.7. Характеристика контрольных панелей сывороток.

2.8. Характеристика контрольной панели слюны.

2.9. Стандартные серологические реакции.

2.9.1. Реакция микроприципитации.

2.9.2. Быстрый плазмореагиновый тест (RPR-тест).

2.9.3. Реакция связывания комплемента.

2.9.4. Реакция пассивной гемагглютинации.

2.10. Общеклинические лабораторные исследования.

2.11. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА III. Разработка и оптимизация ИФА на основе искусственных аналогов трепонемных антигенов.

3.1. Изучение искусственных аналогов трепонемных антигенов.

3.2. Сравнительная характеристика полистироловых планшетов.

3.3. Изучение зависимости результатов ИФА от разведения исследуемого материала.

3.3.1. Изучение влияния разведения сыворотки крови на результаты ИФА.

3.3.2. Изучение влияния разведения слюны на результаты ИФА.

3.4. Изучение влияния на результаты ИФА длительности контакта исследуемого материала с иммуносорбентом при комнатной температуре.

3.5. Изучение влияния сроков хранения иммуносорбентов на результаты ИФА.

ГЛАВА IV. Разработка и применение ИФА на основе кардиолипинового антигена.

4.1. Выявление рабочей концентрации кардиолипинового антигена для его сорбции на твердую фазу.

4.2. Результаты исследования кардиолипинового антигена в ИФА.

ГЛАВА V. Разработка и оптимизация методов серологической диагностики сифилиса на основе нативных трепонемных антигенов.

5.1. Разработка модифицированного метода IgM-РИФ-абс.

5.1.1. Сравнительное характеристика конъюгатов на основе белка

А и G.

5.1.2. Исследование культурального трепонемного антигена в

5.1.3. Оптимизация условий проведения аффинной хроматографии.

5.2. Изучение фракций культурального трепонемного антигена.

ГЛАВА VI. Апробация разработанных серологических методов и обоснование алгоритмов диагностики сифилиса.

6.1. Оценка диагностической значимости определения специфических сывороточных антител к белковым антигенам T.pallidum методом ИФА.

6.2. Оценка диагностической значимости выявления методом ИФА противотрепонемных секреторных IgA-антител к белковым антигенам T.pallidum.

6.3. Оценка диагностической значимости выявления IgM-антител модифицированным методом РИФ-абс.

6.4. Построение линейных дискриминантных функций для решения задач дифференциальной диагностики скрытого сифилиса и серорезистентности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические подходы к повышению информативности серологической диагностики сифилиса"

Актуальность работы. Сифилис, как и другие инфекции, передаваемые половым путем, имеет медико-социальную значимость. Это связано с тем, что помимо экономического ущерба для общества, связанного с нарушением трудоспособности человека, заболевание таит в себе "отсроченную опасность", в виде нарушения репродуктивного здоровья больного. Заболевание может привести к рождению потомства, неполноценного как физически, так и умственно, тяжелых поражений нервной системы и различных внутренних органов и т.д. [4, 6,18, 35, 143,168, 202].

В последние годы существенно изменилась клиника сифилиса: увеличилось число атипичных, малосимптомных, скрытых форм заболевания, а также серорезистентности после лечения сифилиса, что создает значительные трудности для диагностики инфекции [21, 28, 36, 97, 108].

В таких условиях большое значение приобретает эффективная диагностика данной инфекции. В связи с этим в настоящее время наиболее актуальной проблемой является внедрение в практику высокочувствительных и специфичных методов, позволяющих выявить заболевание, как на ранних сроках его развития, так и скрытое его течение.

Традиционные методы серодиагностики сифилиса (MP, РВ, РПГА), используемые в настоящее время, к сожалению, не могут служить источником истинной информации о наличии инфекции, а также надежным критерием излеченности. Даже применение таких высокочувствительных методов как иммуноферментный анализ и реакции флюоресценции, по-прежнему являющейся «золотым стандартом» лабораторной диагностики сифилиса, не гарантирует достоверной постановки диагноза, поскольку результаты нескольких стандартных реакций, поставленных одновременно, могут оказаться противоречивыми^, 28, 36].

В связи с этим, в настоящее время наиболее острой проблемой является разработка и внедрение в практику тестов и методов, позволяющих выявить заболевание на ранних сроках его развития, скрытое течение инфекционного процесса, а также корректной и обоснованной интерпретации результатов, полученных с их помощью.

Развитие биотехнологии сделало возможным получение искусственных аналогов микробных, в том числе и трепонемных, антигенов и их использование для диагностических целей и моноклональных антител, которые позволяют выявлять различные классы и подклассы иммуноглобулинов. Именно эти два направления (применение искусственных аналогов антигенов и выявление различных классов антител), в настоящее время, являются наиболее перспективными в решении проблем совершенствования диагностики сифилиса [47, 48, 51].

Несомненно, метод иммуноферментного анализа позволяет наиболее широко и полно использовать достижения, перечисленные выше. При этом "метод обладает такими достоинствами, как: позволяет проводить массовые обследования, возможность автоматизации процесса, простота в постановке, короткое время анализа.

Другим возможным решением проблемы улучшения качества диагностики сифилиса, может стать усовершенствование реакции иммунофлюоресценции. В данном методе в качестве антигена используется цельноклеточная патогенная трепонема, что является полным набором антигенных структур микроорганизма. Соответственно данным методом можно регистрировать антитела к антигенам, не использующимися другими диагностическими методами. Например, к таким антигенам следует отнести липополисахаридный компонент внешней мембраны T.pallidum.

Таким образом, основываясь на вышеизложенном, целью нашего исследования стала разработка методов на основе ИФА и РИФ, позволяющих констатировать наличие или отсутствие сифилитической инфекции в диагностически сложных ситуациях.

В рамках этой цели мы ставили перед собой следующие задачи:

1. Разработать и оптимизировать ИФА с использованием искусст венных аналогов трепонемных антигенов для исследования сывороток крови и слюны на сифилис, а также изучить с его помощью динамику и спектр антител в процессе лечения заболевания и при серорезистентности после проведенной терапии;

2. Изучить возможность использования для серодиагностики сифилиса культурального и кардиолипинового антигенов в ИФА;

3. Изучить возможность использования и оптимизирования процесса аффинной хроматографии с целью элиминации иммуноглобулинов класса G из сывороток крови;

4. Обосновать алгоритм установления серорезистентности после ранее перенесенной сифилитической инфекции с использованием разработанных модификаций серологических методов.

Научная новизна работы определяется следующими положениями:

- Впервые получены новые данные о биотехнологических свойствах иммуносорбента на основе синтетического трепонемного пептида из области липопротеина Трр41.

- Впервые предпринята попытка конструирования авторских вариантов ИФА, предназначенных для выявления антитрепонемных секреторных IgA слюны и для выявления антикардиолипиновых антител сыворотки.

- Впервые адаптирован процесс аффинной хроматографии с рекомби-нантным аналогом стрептококкового белка G для конструирования модификации метода РИФ-абс, с целью высокоэффективного одномоментного удаления всех субизотипов иммуноглобулинов класса G из исследуемых сывороток крови.

• Практическая значимость работы.

Биотехнологические параметры разработанных авторских вариантов серологической диагностики сифилиса могут быть использованы при проведении научных исследований, а также в практической работе медицинских лабораторий для повышения качества диагностирования сифилиса.

Разработанный алгоритм дифференциальной диагностики серологической резистентности позволяет улучшить качество медицинской помощи категории пациентов с данной патологией в дерматовенерологических учреждениях.

Апробация результатов исследования.

Результаты работы доложены на Конференции молодых ученых Смоленской государственной медицинской академии (Смоленск, 2002), Заседании Общества дерматовенерологов г. Смоленска (Смоленск, 2003), Юбилейной конференции, посвященной 80-летию кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2003), Заседании Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (Санкт-Петербург, 2004), Конференции Российско-Шведского проекта «Кон* троль и профилактика инфекций, передаваемых половым путем» (Санкт

Петербург, 2004), Научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004).

Результаты исследований внедрены в учебный процесс и диагностическую работу кафедр кожных и венерических болезней и микробиологии Военно-медицинской академии, а также на кафедре дерматовенерологии Смоленской государственной медицинской академии.

Положения выносимые на защиту.

1. Установленные параметры ИФА для выявления спектра антитрепо-немных иммуноглобулинов к белковым липопротеинам могут использоваться для повышения информативности серологической диагностики сифилиса;

2. Диагностическая эффективность ИФА с кардиолипиновым антигеном, авторского варианта РИФабс.-IgM, а также обнаружения специфических секреторных IgA слюны при сифилисе требует дополнительного изучения.

3. Применение линейно-дискриминантной функции позволяет дифференцировать наличие инфекционного процесса от длительно сохраняющихся положительных результатов тестов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 184 страницах машинописного текста и включает введение, 6 глав, заключение, выводы, приложение, благодарности, а также список использованной литературы, содержащий 116 источников на русском языке и 91 на иностранных языках. В текст включены 37 таблиц и 15 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Федосеева, Светлана Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Оптимальными условиями постановки ИФА для выявления субизотипов антител к белковым антигенам возбудителя сифилиса являются: а) при получении иммуносорбента - полистироловые планшеты «Costar» и «Nunc»; концентрация антигенов р15 - 4 мкг/мл; р17 - 4 мкг/мл; sifl3 - 5 мкг/мл; р47 - 4 мкг/мл, длительность сорбции 24 часа при 4°С, рН сорбирующего карбонатно-бикарбонатного буферного раствора 9,6; б) при взаимодействии исследуемой пробы с иммуносорбентом — разведение исследуемой сыворотки крови 1:10; разведение образцов слюны 1/81; результаты изучения специфических секреторных IgA слюны отличаются выраженной вариабельностью и зависимостью от показателя вязкости биологического материала, что не позволяет рекомендовать данную процедуру для использования в клинической практике;

2. Антитела IgG3 и IgM, направленные к антигенам 15, 17, 41 и 47 кД после лечения элиминируются в течение трех месяцев. Уровни антител класса IgG к антигену 41 кД по сравнению с антителами к антигенам 15, 17 и 47 кД снижаются в более ранние сроки. Сохранение позитивности результатов ИФА в отдаленные после лечения сроки чаще всего связано с антителами к антигену 17 кД.

3. Использование культурального трепонемного антигена в ИФА отличается значительным числом ложноположительных результатов, что исключает успешность его использования на практике;

Выявление антикардиолипиновых иммуноглобулинов в ИФА позволяет дифференцировать сифилитическую инфекцию и другие состояния, предполагающие образования аутоантител к фосфолипидам, по уровням оптической плотности. Возможность качественной дифференцировки вышеназванных состояний требует дальнейшего изучения;

4. Оптимальными режимами проведения аффинной элиминации сывороточных иммуноглобулинов класса G являются: скорость подвижной фазы во время прохождения сыворотки крови - 0,6 мл/мин, объем наносимой на колонку сыворотки - 1 мл. Результаты клинического испытания разработанного метода демонстрируют необходимость продолжения работы по окончательной оптимизации протокола постановки IgM-РИФ-абс.

5. Применение ЛДФ с использованием следующих показателей: уровень IgGl-антител к антигену 41 кД, количество серологических маркеров в ИФА, уровень IgGl-антител к антигену 17 кД, динамика комплекса серологических реакций, уровень ^ОЗ-антител к антигену 41 кД, может использоваться для установления причины серологической резистентности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день, на практике все большее внимание уделяется проблеме внедрения новых методов серологической диагностики сифилиса. При этом, в научной литературе подчеркивается необходимость усовершенствования уже существующих и известных на практике методов. Не вызывает сомнений потребность уточнения подходов к корректной интерпретации результатов исследований, полученных с их помощью.

Это связано с тем, что используемые в настоящее время методы серодиагностики, в первую очередь РСК, не могут служить источником высоко достоверной информации о наличии сифилитической инфекции и носят зачастую противоречивый характер [6, 28, 36, 168]. В особенности данный факт, проявляется при диагностике таких форм заболевания как скрытый сифилис, врожденный сифилис, серорезистентность, количество которых в силу различных причин, как экономических, так и социальных, в последнее время увеличивается [21, 35, 62, 84].

В современной инфекционной иммунологии существуют несколько подходов к повышению информативности серологической диагностики. Во-первых, с развитием биотехнологии стало возможным получение искусственных аналогов микробных антигенов и их использование в диагностических препаратах [29, 49, 73]. Во-вторых, дополнительного преимущества позволяют добиться методы раздельного выявления классов и подклассов специфических иммуноглобулинов при различных инфекционных заболеваниях [32, 51, 58, 157, 162]. В третьих, отдельное внимание уделяется изменению трактовки результатов серологического тестирования в свете новейших достижений в фундаментальной иммунологии.

В целях реализации вышеперечисленных подходов нами были сформулированы основные задачи исследования. В качестве антигенов для конструирования авторских вариантов методов серологической диагностики использовался представительный перечень трепонемных антигенов, включающий патогенных и культуральных трепонем, рекомбинантные и синтетические аналоги трепонемных липопротеинов.

Для разработки более информативных модификаций тестов в серологической диагностике сифилиса, были выбраны два базовых метода - ИФА и РИФ. Процедуры оптимизации авторских модификаций серологических методов и их практическая апробация проводились с использованием клинического материала, полученного от пациентов ведущих дерматовенерологических стационаров Санкт-Петербурга и Смоленска. С целью объективизаV ции выводов при анализе фактических результатов экспериментов использовались многочисленные методы статистического анализа, включая методы многомерной статистики.

Приоритет, который был предоставлен ИФА, достаточно очевиден: простота постановки, короткое время анализа, реальная возможность автоматизации, потенциально более высокая чувствительность, инструментальный учет результата, исключающий субъективизм. Метод ИФА позволяет наиболее широко и полно использовать достижения биотехнологии, к которым стоит отнести такие как получение искусственных аналогов природных антигенов возбудителей, фракционирование и очистка нативных антигенов, моноклональные антитела против различных классов и подклассов иммуноглобулинов человека.

В качестве одного из путей совершенствования данной методики для серодиагностики сифилиса, мы избрали использование различных по природе антигенов (искусственные аналоги антигенов патогенной трепонемы, нативный антиген культуральной трепонемы, кардиолипиновый антиген) с изучением диагностических свойств иммуносорбентов на их основе. Помимо этого, проводилось исследование специфических секреторных иммуноглобулинов класса А слюны, как вариант возможного повышения информативности серологической диагностики данного заболевания.

Ранее в работах по совершенствованию ИФА-диагностики сифилиса уже была проведена оценка иммунореактивности и диагностической значимости четырех рекомбинантных белков, соответствующих природным антигенам возбудителя сифилиса молекулярной массой 15, 17, 41 и 47 кД, а также девятнадцати синтетических пептидов, имитирующих иммунодоминантные участки данных антигенов. В результате этого эксперимента был выявлен наиболее иммунореактивный пептид - Sifl3 из области естественного антигена молекулярной массой 41 кД, как обеспечивающий наилучший показатель P/N. Для синтетических пептидов из области антигенов 15, 17 и 47 кД была получена меньшая иммунореактивность, чем для их рекомбинантных аналогов, поэтому в работе мы использовали рекомбинантные аналоги трепонемных антигенов 15 кД (р15), 17 кД (р17) и 47 кД (р47) и синтетический аналог антигена 41 кД - Sifl3.

Аргументацией пристального изучения синтетического пептида является тот факт, что в целом данная разновидность аналогов природных антигенов практически не исследована. На сегодняшний день лишь показана высокая иммунореактивность в ИФА синтезированного антигена Sifl3, но исследования свойств твердофазного иммуносорбента на его основе не проводилось.

Для конструирования на основе Sif 13 сенсибилизированной твердой фазы нами была определена оптимальная концентрация данного антигена, которая составила 5 мкг/мл.

Для исследования диагностических возможностей полученного иммуносорбента, мы изучили влияние следующих факторов: сорбционные свойства планшетов; дополнительное время контакта исследуемого образца с сенсибилизированной поверхностью твердой фазы при комнатной температуре; разведение исследуемого материала, а также сроки хранения сенсибилизированных планшетов при различных температурных условиях.

Результаты изучения позволили выявить оптимальные параметры использования иммуносорбента на основе Sifl3: установили наилучшие марки твердой фазы («Nunc» и «Costar»), оптимальное разведение исследуемой сыворотки крови (1:10), показали, что время контакта иммуносорбента с исследуемым материалом при комнатной температуре не должен превышать 10 мин, что по срокам хранения не уступают иммуносорбентам на основе рекомбинантных антигенов (6 месяцев). Данные факты позволили прогнозировать дальнейшее изучение и успешное применение синтетических антигенов.

Особенно ценными представляются результаты использования авторских вариантов ИФА в области изучения динамики трепонемоспецифических антител в процессе антибиотикотерапии сифилиса. В частности обнаружено, что при первичном сифилисе в результате лечения удается добиться снижения реактивности парных сывороток крови в ИФА. При обнаружении антител подкласса IgG3 и класса IgM к антигенам 15, 17, 41 и 47 кД наблюдается полная негативация результатов ИФА через три месяца с момента окончания лечения. IgGl подкласс антител, в особенности к антигенам 17 и 47 кД, продолжает сохраняться на диагностически значимых уровнях и в более поздние сроки.

При вторичном свежем сифилисе после назначения противомикробного лечения полной негативации результатов ИФА не происходит. В течение трех месяцев от момента окончания лечения наблюдается отрицательная динамика уровней антител, в первую очередь к антигену 41 кД (количество положительных образцов снижается с 89,9 до 17,4%). Из числа противотрепо-немных антител, направленных к антигенам 15, 17 и 47 кД эффективно элиминируются после лечения только IgG3 и IgM. IgGl подкласс иммуноглобулинов продолжает обуславливать позитивность исследуемых образцов в трехмесячные сроки после завершения терапии (к антигену 15кД в 24,6% случаев, к антигену 17 кД в 55,1%, к антигену 47 кД в 30,4%).

Группа больных вторичным рецидивным сифилисом характеризуется относительной консервативностью при выявлении специфических антител в динамике и после лечения. Закономерными являются различия в темпах не-гативации при определении антител, представленных различными подклассами. IgG3 и IgM-антитела, направленные к антигенам 15, 17, 41 и 47 кД, перестают определяться уже с третьего месяца после окончания терапии. IgGl-антитела, в ряде случаев, продолжают выявляться и после лечения (к антигену 15кД в 40,3% случаев, к антигену 17 кД в 61,1%, к антигену 47 кД в 40,3%). Наиболее заметна отрицательная динамика иммуноглобулинов, специфичных антигену 41 кД. Только 5,6% пациентов выявляются как позитивные в ИФА с антигеном 41 кД после лечения.

При раннем скрытом периоде сифилиса наиболее выраженным было снижение доли положительных проб, реагирующих с антигеном 41 кД (с 94,4% при первичном исследовании до 3.7% через три месяца после окончания лечения). Сохранение после лечения иммунореактивности сывороток крови с антигенами 15, 17 и 47 кД (к антигену 15кД в 14,8% случаев, к антигену 17 кД в 42,6%, к антигену 47 кД в 18,5%) связано с иммуноглобулинами IgGl.

Больные поздним скрытым сифилисом отличаются обнаружением в их сыворотке крови антител исключительно IgGl подкласса. К антигенам 17 и 47 кД IgGl-антитела определяются в 100% случаев. В результате лечения добиться эффективного снижения специфических иммуноглобулинов, направленных к антигенам 17, 41 и 47 кД, не удается. Кроме того, к антигену 47 кД в 66,7% образцов при позднем скрытом сифилисе присутствуют антитела IgG4 подкласса, что позволяет дифференцировать заболевание в этот период от раннего скрытого сифилиса. ;

На основе сведений о динамике различных по антигенной направленности и класс-принадлежности иммуноглобулинов, предпринята попытка дифференциальной диагностики серологической резистентности. Так как, наиболее остро проблема верификации причины серорезистентности проявляется в группе беременных, для первоначальных экспериментов был отобран клинический материал от данной категории пациентов.

Показано, что пациенты с диагнозом вторичный и ранний скрытый сифилис проявляют выраженную иммунологическую реактивность в ИФА с искусственными аналогами трепонемных антигенов. В сыворотке крови больных присутствуют специфические иммуноглобулины как минимум к трем липопротеинам из числа белков с молекулярной массой 15, 17, 41 и 47 кД. Группа беременных с клиническим диагнозом «серорезистентность» отличается гетерогенностью по результатам исследований в ИФА. В 42,3% случаев в сыворотке крови пациентов определяются антитела не более чем к двум трепонемным антигенам (17 и 47 кД), что позволяет исключить возможность сохранения в их организме жизнеспособного возбудителя.

С целью большей объективизации фактических данных был выполнен расчет линейных дискриминантных функций, позволяющих с высокой степенью вероятности определить целесообразность назначения дополнительной специфической терапии, при сохранении положительных серологических реакций в отдаленные, после проведения первоначального лечения сифилиса, сроки.

Как оказалось при исследовании специфических IgA-антител слюны, результаты ИФА отличались выраженной вариабельностью, по сравнению с сывороткой крови, белковой фракции слюны, концентрация которой варьирует в большом диапазоне. Соответственно, подобрать оптимальное рабочее разведение, единое для всего исследуемого материала, практически невозможно. Как выяснилось, сопоставимость результатов анализа в большой степени зависит от физических свойств исследуемого материала, в частности от вязкости слюны. Для проведения исследования слюны на выявление IgA-антител может быть целесообразным определение оптимального значения ее вязкости для получения сопоставимых результатов серологических реакций.

Определение вязкости взятых на анализ образцов может значительно затруднить повседневную работу диагностической лаборатории, поскольку данная методика достаточно трудоемка и при массовом поступлении материала на исследование вызовет дополнительные сложности. По всей видимости, исследование слюны на специфические секреторные иммуноглобулины класса А, преждевременно рекомендовать для применения в рутинной диагностике сифилиса. v

Раздел работы, посвященный изучению возможности конструирования ИФА-тест-системы на основе кардиолипинового антигена, обоснован необходимостью переформатирования неспецифических трепонемных реакций, которые используют данный вариант антигена, для проведения массового скринингового обследования.

Как выяснилось, данный подход перспективен для последующего его изучения и определения его оптимальных характеристик. В тоже время стоит подчеркнуть, что для достижения возможности максимально специфично прогнозировать наличие сифилитической инфекции, опираясь на результаты, полученные данным методом, необходим расчет наиболее корректной ОП крит. С этой целью целесообразно проведения исследования большого количества образцов, как от здоровых людей, так и от пациентов с самой различной патологией, чтобы достоверно выявить, в каких случаях возможно продуцирование клетками организма аутоантител.

Попытка разработки нового диагностического метода (ИФА) на основе цельноклеточного культурального трепонемного антигена выявила серьезные недостатки при клинической апробации. Наиболее существенным негативным свойством являлась крайне низкая специфичность результатов тестирования сывороток крови от здоровых доноров.

Другим возможным решением проблемы улучшения качества диагностирования сифилиса, может стать усовершенствование реакции иммунофлюоресценции. Длительное время, неоспоримым доказательством наличия заболевания считался положительный результат постановки высокоспецифичной РИФ-абс. Но возникли проблемы, связанные с длительно сохраняющимися положительными результатами реакции. Как доказали последующие исследования, они обусловлены наличием IgG антител, которые способны продуцироваться в организме, годами после проведенного лечения. Применяющаяся в качестве антигена цельноклеточная патогенная трепонема является уникальным набором антигенных структур, антитела к которым могут не учитываться другими диагностическими методами и «маскироваться» имеющимися IgG антителами. В частности, к таковым следует отнести иммуноглобулины класса М к ЛПС антигену внешней мембраны T.pallidum.

Возможность верификации врожденной инфицированности возбудителем сифилиса большинством исследователей ассоциируется с необходимостью детекции специфических иммуноглобулинов класса М. На практике при выявлении антител класса М могут возникать сложности, связанные с конкуренцией в серологических реакциях данных иммуноглобулинов с антителами класса G (IgG). Для исключения подобных явлений на предварительном этапе исследуемые сыворотки крови истощают от иммуноглобулинов G. Все из предложенных на сегодняшний день методов удаления IgG не могут быть адаптированы для практического использования в связи с крайней методической сложностью, трудоемкостью и дороговизной. Перечисленные трудности могут быть устранены путем внедрения в практику методов обнаружения IgM-антител, направленных к липополисахаридным антигенам T.pallidum, и отражающих наличие Т-независимого иммунного ответа. Предлагается модификация метода РИФабс.-IgM, предполагающая исследование сывороток крови с предварительно истощенной фракцией IgG. Для удаления иммуноглобулинов из сыворотки крови используется рекомбинантный аналог Fc-рецептора стрептококка группы G.

Наибольшее внимание привлекли данные о наличии противотрепонем-ных иммуноглобулинов в сыворотках крови больных с доказанной сифилитической инфекцией (вторичный и ранний скрытый сифилис). Доказательство наличия специфического инфекционного процесса основывалось на комплексе клинико-лабораторных данных, полученных при стационарном обследовании. Исходя из наших предположений (глава 5), все из данных пациентов должны были давать в РИФ положительные результаты. Тем не менее, в одном случае вторичного сифилиса (25%) и двух случаях раннего скрытого сифилиса (29%) специфические иммуноглобулины класса М не выявлялись. Наиболее вероятной причиной выявленных фактов, мы считаем возможность неконтролируемого разведения исследуемых образцов в процессе жидкостной хроматографии, которое приводит к снижению концентрации искомых антител за пределы разрешающей способности использованного метода детекции. В этой связи корректный анализ результатов использования IgM-РИФ-абс. в группе пациентов с серорезистентностью не представлялся возможным.

Таким образом, результаты фактического клинического испытания разработанного метода обнаружения IgM-антител к антигену патогенной T.pallidum демонстрируют необходимость продолжения работы по окончательной оптимизации протокола постановки реакции. Основное внимание необходимо уделить факторам, влияющим на разбавление исследуемых биологических образцов, а также методам их контроля.

Последняя глава работы посвящена обоснованию алгоритма серодиагностики сифилиса с учетом разработанных методов и полученных результатов после их апробации.

В целом результаты работы свидетельствуют о преимуществах разработанных методов серологической диагностики сифилиса и перспективности их использования для решения трудных диагностических задач в дерматовенерологической практике.

150

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федосеева, Светлана Владимировна, Санкт-Петербург

1. Аберкромби Д и др. Аффинная хроматография: Методы. М.: Мир, 1988. -205 с.

2. Алленмарк С. Хроматографическое разделение энантиомеров. М.: Мир, 1991.-268 с.

3. Аковбян В.А., Тихонова Л.И., Машкиллейсон А.Л. и др. Заболеваемость сифилисом: опыт истории, эпидемиологический анализ, прогнозы // Заболевания передаваемые половым путем. 1995. - № 4. - С. 22 -25.

4. Аковбян В.А., Прохоренков В.И., Новиков А.И. и др. Сифилис. Иллюстрированное руководство / Под ред. проф. В.И. Прохоренкова. М.: Медицинская книга, 2002. - 300 с.

5. Аковбян В.А., Резайкина А.В., Тихонова Л.И. Характеристика эпидемиологических закономерностей распространения ЗППП // Вестн. дерматологии и венерологии. 1998. - №1. - С. 4-8

6. Аравийская Е. Р. Приобретенный сифилис: медико социальные вопросы: Дисс. . д-ра мед. наук. - СПб, 2001. - 333 с.

7. Аствацатуров К. Р. Сифилис, его диагностика и лечение. М.: Медицина, 1971.-431 с.

8. Аствацатуров К. Р. Ошибки в диагностике сифилиса. М., 1952. - 192 с.

9. Беднова В. Н. Иммунолюминисцентный анализ в диагностике сифилиса // Иммунолюминисценция в медицине. М.: Медицина, 1977. - С. 72-79

10. П.Беднова В. Н., Дмитриев Т. А., Бабий А.В. и др. Новая тест-система иммуноферментного анализа для серодиагностики сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1995. - №1. - С. 19-20.

11. Беднова В.Н., Коляденко В.Г., Павлова Е.В. и др. Новый сорбент для постановки РИФ- абс на сифилис // Вестн. дерматологии и венерологии. -1992.- №6.-С. 37-39

12. П.Беднова В.Н., Милонова Т.И., Дмитриев Г.А., Бабий А.В. Новая тест-система ИФА на сифилис // Вестн. дерматологии и венерологии. 1994. -№4.-С. 51

13. М.Безвершенко И.А. Аффинная хроматография. Киев: Наук, думка, 1978. -205 с.

14. Беляков В.Д., Ходырев А.П., Тотолян А.А. Стрептококковая инфекция. -М.: Медицина, 1978. 294 с.

15. Бессонова Е.А. Хроматографическое и электрофоретическое определение стероидов и биогенных аминов в биологических объектах: Дисс. .к-та хим. наук. СПб, 2004. 201 с.

16. Борисенко К.К., Лосева O.K., Доля О.В. Современная тактика ведения беременных и детей, больных сифилисом // Инфекции передаваемые половым путем. 1999. - №2. - С. 14-17.

17. Борисенко К.К., Лосева O.K., Доля О.В., Туманова Е.Л. Ранний врожденный сифилис: клиника, патоморфология, диагностика, лечение, профилактика // Рус. мед. журн. 1998. - т.6, №15. - С. 985-993

18. Борисенко К.К., Цераиди Н.Ф. Серологические и иммунологические аспекты сифилиса и СПИДа // Вестн. дерматологии и венерологии. 1991. - №11.-С. 30-34

19. Борисенко К.К., Шепаренко М.В., Яцуха М.В. О классификации врожденного сифилиса // Заболевания передаваемые половым путем. -1995.- №4.-С. 33-36

20. Брико Н.И., Иваненко И.П., Громыко А.И., Тихонова Л.И. Современная ситуация по болезням, передающимся половым путем в России и тенденции ее развития // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. - № 1.-С.4-7

21. Виха И.В., Смирнова В.Г., Орлина Э.А. и др. Диагностическая тест-система для выявления антител к возбудителю сифилиса // Клин. лаб. диагностика. 1997. - №4. - С. 24, 33-36

22. Гаевская О.В. Оценка современных методик лечения сифилиса у беременных: Автореф-т дисс. .канд. мед. наук. М., 2001. - 25 с.

23. Галактионов В.Г. Иммунология: Учебник. М.: Нива России, 2000. - 488 с.

24. Гарнетт Дж. П., Арал С.О., Хайл Д.В. и др. Естественное течение сифилиса. Изучение динамики передачи и контроля инфекции // Заболевания передаваемые половым путем. 1998. - №5. - С. 3-17

25. Гедвилене А.П. Реакция иммунофлюоресценции в ликвордиагностике сифилиса и значение количественного метода реакции иммунофлюоресценции при сифилисе // Вестн. дерматологии и венерологии. 1980. - №9. - С. 62-65

26. Глозман В.Н., Кирмане Р.Э., Первушина Н.В., Шур А.А. Некоторые клинико-иммунологические аспекты серо^езистентного сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1991. - №9. - С.32-33

27. Гражданцева А.А., Кочнева Р.В., Сиволобова Г.Ф. и др. Исследование сывороток больных сифилисом методом иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантных антигенов // Иммунология. 1998. -№4.-С. 20-23

28. Грязева И.В. Получение моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека и их использование в иммунодиагностике: Автореф-т дисс. .канд. биол. наук. СПб, 1996. - 21 с.

29. Гупалова Т.В. Рецепторные белки стрептококков: клонирование генов, характеристика и практическое использование белков, экспрессируемых в Е. coli: Дисс. д-ра биол. наук. СПб, 1998. - 251с.

30. Гусева С.Н. Особенности течения и исходы беременности у женщин, больных сифилисом: Дисс.канд. мед. наук. СПб, 1999. - 148 с.

31. Данилов С.И. Критерии диагностики, иммунокоррекция и реабилитация больных с серорезистентностью после лечения сифилиса: Автореф-т дисс.д-ра. мед. наук. СПб, 1996. - 38 с.

32. Дин П., Джонсон У., Мидл Ф. Аффинная хроматография: методы. М.: Мир, 1988.-278 с.

33. Дмитриев Г.А. Тест-системы в лабораторной диагностике сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1996. - №6. - С. 34-36

34. Дмитриев Г. А., Брагина Е.Е. Современные методы лабораторной диагностики сифилиса: ч.1 // Вестн. дерматологии и венерологии. 1996. -№2. - С. 29-32

35. Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е. современные методы лабораторной диагностики сифилиса: ч.2 // Вестн. дерматологии и венерологии. 1996. -№3. - С. 34-38

36. Довжанский С.И. Сифилис. Саратов, 1993. - 68 с.

37. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллегология. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. - 604 с.

38. Жибурт Е.Б., Бельгесов Н.В., Тихменева И.Б. и др. Обследование доноров крови в профилактике сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. -1996.-№3.-С. 39-40

39. Иванов A.M. Совершенствование диагностики сифилиса на основе модифицированного иммуноферментного анализа: Дисс. к-та мед. наук. -СПб, 2000.-202 с.

40. Иванов A.M., Колобов А.А., Федосеева С.В. и др. Изучение динамики трепонемоспецифичных антител в процессе лечения сифилиса // Материалы научной конференции и VIII съезда Российско-Итальянского общества по инфекционным болезням, СПб. 2002 - С. 135-136

41. Иванов A.M., Ходосевич Е.В., Теличко И.Н. и др. Серологическая диагностика сифилиса: возможности повышения информативности // Журнал акушерства и женских болезней. т. LII, специальный выпуск, 2004.-С. 126-127

42. Иванова М.А., Лосева O.K., Коробейникова Э.А. и др. Сифилис и беременность // Вестн. дерматологии и венерологии. 2000. - №6. - С. 6366

43. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, пер. с нем. А.П. Тарасова. М.: Медицина, 1987. - 472 с.

44. Иммуноферментный анализ для диагностики сифилиса (пособие для врачей-серологов) // сост. Дмитриев Г.А., Беднова В.Н., Киселева Г.А. и др. -М.,1998. 16 с.

45. Карцова А.А. Жидкостная хроматография v в медицине // Соросовский образовательный журнал. -2000. т.6, №11. - С. 35-41

46. Каур С., Сильм X., Виндеревских Г., Шевчук О. Усовершенствование методов диагностики сифилиса при помощи определения антител к специфическим белкам возбудителя // Заболевания передаваемые половым путем. 1998. - №4. - С. 21-22

47. Киселев А.В. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии.- М.: Химия, 1986.-272 с.

48. Климович В.Б. Моноклональные нтитела против иммуноглобулинов человека: Дисс.д-ра мед. наук. СПб, 1996. - 296 с.

49. Климович В.Б., Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю. и др. Моноклональные антитела к подклассам IgG человека: получение и исследование специфичности // Иммунология. 1998. - № 4. - С. 27-31

50. Котровский А.В. Разработка и клиническая оценка методики постановки иммуноферментного анализа на поверхности твердофазного носителя для серодиагностики сифилиса: Автореф-т дис. к-та.мед.наук. М., 1986. - 16 с.

51. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Учеб. Пособие. М.: Высш. Школа, 1971. - 352 с.

52. Красносельских T.B. Определение спектра и соотношения антитрепонемных антител в диагностике приобретенного сифилиса: Дисс.к-та мед. наук. СПб, 1997. - 230 с.

53. Ложкина О.В. Изучение аффинных свойств поверхностного рецепторного белка стрептококка группы G методом высокоэффективной монолитной хроматографии: Дисс.к-та хим. наук. СПб, 2003. - 157 с.

54. Любавина А.Е., Зубжинская Л.Б., Белянин В.Л. Некоторые иммуноморфологические изменения в плаценте при сифилисе у беременных // Инфекции передаваемые половым путем. 2001. - № 1. -С. 23-25

55. Ляхов В.Ф., Борисенко К.К., Потекаев Н.С. и др. Динамика трепонемоспецифической иммуноглобулинемии при ранних формах сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1990. - №8. - С. 38-42

56. Манолов А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1985. - № 4. - С. 100107

57. Мануйлова Л.А., Федотов В.П., Логунов В.П. Т-звено иммунитета у больных сифилисом // Вестн. дерматологии и венерологии. 1983. - № 3. -С. 23-27

58. Масеткин И.П., Резникова Л.С. и др. Серодиагностика сифилиса. Пермь, 1977.-196 с.

59. Милич М.В. Эволюция сифилиса. М.: Медицина, 1987. - 157 с.

60. Милявская И.Р., Горланов И.А. О поражении внутренних органов при раннем врожденном сифилисе // Материалы XXXVIII научно-практическая конференция: «Актуальные проблемы дерматовенерологии». Санкт-Петербург, 2003. - С. 29-30

61. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишенев: Штиница, 1982.-304 с.

62. Пожарская В.О., Беднова В.Н., Угримов С.А., Дадалка С.Ф. Новый специфический сорбент для РИФ-абс при серодиагностике сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. -1995. №2. - С. 15-16

63. Петухова И.И. Возможности полимеразной^ цепной реакции в детекции бледной трепонемы у больных сифилисом: Автореф-т дисс. к-та мед. наук. -М., 2002. 18 с.

64. Привалова Н.К., Тихонова Л.И. Заболеваемость сифилисом в Российской Федерации: анализ тенденций и прогноз развития эпидемической ситуации // Инфекции передаваемые половым путем. 2000. - №5. - С. 35-40

65. Пьяцца А. Анализ иммунологических данных // Методы исследования в иммунологии: Пер. с англ. М., 1981. - С. 428-461

66. Разнатовский И.М., Соколовский Е.В., Красносельских Т.В. и др. Причины и факторы, способствующие развитию серологической резистентности после современного лечения сифилиса // Журн. дерматологии и косметологии. 1996. - № 1. - С. 60-66

67. Рассказов Н.И., Ермолин Г.А., Чалов В.В. и др. Применение иммуноферментного анализа для регистрации специфичных Ig-M-антител у больных сифилисом // Вестн. дерматологии и венерологии. 1990. -№11.-С. 12-16

68. Резайкина А.В. РИФ-абс с сывороткой крови, РИФ-ц и РСК на холоде с ликвором в выявлении сифилиса среди соматических больных и декретированных контингентов. Автореф-т дисс. к-та мед. наук. М, 1979. -20 с.

69. Романенко Г.Ф., Вербенко Е.В., Петрова И.Л. и др. К вопросу о серорезистентном сифилисе // Вестн. дерматологии и венерологии. 1983. - №6.-С. 25-27

70. Руководство по индикации и идентификации бактериальных (биологических) средств // Под ред. Р.Б. Гольдина. М.: Воен. Издат., 1989.-235 с.

71. Самцов А.В. Заразные дерматозы и венерические болезни. Современные методы лечения. СПб.: Спец. лит-ра, 1997. - 141 с.

72. Сбойчаков В.Б. Применение твердофазного иммуноферментного анализа для диагностики псевдотуберкулеза: Дисс.к-та мед. наук. Ленинград, 1986.-180 с.

73. Сбойчаков В.Б., Вербов В.Н. Применение иммуноферментного анализа для диагностики инфекционных заболеваний. СПб, 1997. - 24 с.

74. Сидорова Е.В., Ляхов В.Ф. Значение определения противотрепонемных IgM-антител в серодиагностике сифилиса // Заболевания передаваемые половым путем. 1995. - №4. - С. 11-14

75. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. — 279 с.

76. Соколовский Е.В. Серологическая резистентность после лечения сифилиса (причины и факторы развития, профилактика и лечение): Автореф-т дисс. .д-ра мед. наук. СПб, 1995.-40 с.

77. Старченко М.Е., Гракович М.И., Данилов С.И. и др. Значение определения фракции IgM в диагностике сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1994. - №1.-С. 9-11

78. Столяров Б.В., Савинов И.М., Виттенберг А.Г. и др. Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: Изд-во С.-Петербург, ун-та, 1998. -610 с.

79. Твердофазный иммуноферментный анализ // Сборник научных трудов. -JL: Изд-во Института им. Пастера, 1988. 160 с

80. Теория и практика иммуноферментного анализа // A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. М.: Высш.шк., 1991. - 288 с.

81. Тихонова Л.И. Обзор ситуации с ИППП. Анализ заболеваемости сифилисом в Российской Федерации // Инфекции передаваемые половым путем.- 1999.- №1.-С. 15-20

82. Ткачев В.К. ИФА диагностика сифилиса: Информационно-методическое пособие. - Изд. 2-ое. - Кольцово, 1998. — 57 с.

83. Топорский Л.И., Глебова Л.И. Ошибки в диагностике сифилиса // Вестн. дерматологии и венерологии. 1986. - №10. - С. 75-76

84. Туркова Я. Аффинная хроматография / Пер. с англ. А.В. Козлова. -М.: Мир, 1980.-472 с.

85. Урсов P.P. Перспективы применения белковых фракций трепонемного антигена для диагностики и комплексной терапии сифилиса. СПб, 1995. -24 с.

86. Франджоне Б. Иммуноглобулины. М., 1981. - С. 342-358

87. Фришман М.П. О серологической устойчивости после лечениябольных сифилисом // Вестн. дерматологии и венерологии. 1984. - №7.-С. 33-34

88. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология: Учебник. М.: Медицина, 2000. - 432 с.

89. Ходосевич Е.В., Смирнова Т.С., Дудко В.Ю. К вопросу об особенностях течения сифилиса у беременных// Материалы XXXVIII научно-практической конференции: «Актуальные проблемы дерматологии». Санкт-Петербург, 2003. - С. 28-29

90. Хурадо Р.Л. Серология сифилиса: практический подход // Заболевания передаваемые половым путем. 1997. - №3. - С. 3-10

91. Шувалова Т.М., Борисенко К.К. К вопросу о клинике и диагностике раннего врожденного сифилиса // Инфекции передаваемые половым путем. 1999.- №4.-С. 13-17

92. Чеботарев В.В., Павлик JI.B. и др. О врожденном сифилисе // Вестн. дерматологии и венерологии. — 1997. №1. - С. 41-44

93. Черняева В.И., Ушакова Г.А., Шуйкина Е.Г. Особенности течения беременности, родов, исход для матери и плода у больных сифилисом // Журн. акушерства и женских болезней. 1998. - №2. - С. 129-130

94. ИЗ. Элгстоун С.И., Тернер А.Дж. Серологическая диагностика сифилиса // Инфекции передаваемые половым путем. 2001. - №3. - С. 4-9

95. Юнкеров В.И. Основы математико-статистического моделирования и применения вычислительной техники в научных исследованиях: лекции для адъюнктов и аспирантов / Под ред. В.И. Кувакина. СПб, 2000. - 140 с.

96. Янг X. Рекомендации по серологической диагностике сифилиса // Инфекции передаваемые половым путем. 2001. - №3. - С. 10-12

97. Яцуха М.В. Противоэпидемическая работа и заболеваемость венерическими болезнями // Вестн. дерматологии и венерологии. 1990. -№9.-С. 33-36

98. Abrahmsen L., Moks Т., Nilsson В. et al. Analysis of the secretion in the staphylococcal protein A gene // EMBO J. 1985. - Vol.4, №6. - P. 3901-3906

99. Abu-Zeid Y.A. Protein G ELISA for detection of antibodies against Toxoplasma SAG1 in dromedaries// J. Egypt. Soc. Parasitol. 2002. - Vol.32, №1.-P. 247-257

100. Akerstrom В., Bjorck L. Physicochemical study of protein G, a molecule with unique immunoglobulin G binding properties. //J. Biol. Chem. 1986. -Vol. 261, №7. - P. 10240-10247

101. Akerstrom В., Brodin Т., Reis К., Bjorck L. Protein G a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies // J. Immunol. -1985.-Vol. 135, №4. -P. 2589-2592

102. Akerstrom В., Nielsen E., Bjorck L. Definition of IgG- and albumin-binding regions of streptococcal protein G // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262, №8.-P. 13388-13391

103. Arshady R. Microcpheres for biomedical applications: preparetion of reactive and labelled microspheres // Biomaterials. 1993. - Vol.14, №1. - P. 5-15

104. Baker-Zander S.A., Hook E.W., Bonin P. et al. Antigens of Tr. pallidum recognised by IgG and IgM antibodies during syphilis in humans // J. Infect. Dis.-1985.-Vol. 151, №2.-P. 264-272

105. Barbara J.A., Hewitt P., Engright S. Routine blood donor screening for syphilis can reveal recent infection // Vox. Sang. 1993. - Vol. 65, №3. - P. 243

106. Baughn R.E, Jorizzo J.L. Adams C.B., Musher D.M. Ig class and IgG subclass response to T. pallidum in patient with syphilis // J. Clin. Immunol. -1988. Vol.8, №2. - P. 128-129

107. Bjorck L., Kronvall G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent // J. Immunol. 1984. - Vol. 133, № 2. - P. 969-974

108. Bjorck L., Kastern G., Kronvall G. et al. Streptococcal protein G, expressed by streptococci or by Escherichia coli, has separate binding sites for human albumin and IgG // Mol. Immunol. 1987. - Vol. 24, №4. - P. 1113

109. Blanco D.R., Champion C.L. Miller J.N., Lovett M.A. Antigenic and structural characterisation of T. pallidum (Nichols strain) endoflagella // Infect. Immun. 1986. - Vol. 56, № 1. - P. 168-175

110. Blanco D.R., Miller J.N., Lovett M.A. Surface antigens of the syphilis spirochete and their potential as virulence determinants // Emerg. Infect. Dis. -1997. Vol. 3, №1. - P. 11-20

111. Boyle M.D.P., Reis K.J. Bacterial Fc receptors. // Biotechnology. 1987. -Vol. 5, №2. - P. 697-703

112. Borobio M.V., Martin E., Perea E.J. Specificity of three serological tests for syphilis: VDRL, FTA-abs and TPHA in healthy people, pregnant women and diabetics // Eur. J. Sex. Transmit. Dis. 1984. - Vol. 1, №3-4. - P. 155-158

113. Bromberg K., Rawstrom S., Tannis G. Diagnosis of congenital syphilis by combining T. pallidum-specific IgM detection with immunofluorescent antigen detection for T. pallidum // J. Infect. Dis. 1993. - Vol. 168, №1. - P. 238-242

114. Carlsson В., Hanson H.S., Wassermann J., Brauner A. Evalution of the fluorescent antibody-absorption (FTA-abs) test specifity // Acta Dermatovenerol.- 1991.- Vol. 71, №4.-P. 306-311

115. Coffman L.J., Roper D.K., Lightfoot E.N. High-resolution chromatography of proteins in short columns and adsorptive membranes // Bioseparetion. 1994. -Vol. 4, №1. - P. 183-200

116. Colman G., Tanna A., Efstration A. The serotypes of streptococcus pyogenes present in Britain during 1980-1990 and their association with disease.//J. Med. Microbiol. 1993.- Vol.39, №1.- P. 165-178

117. Cummings M.C., Lukehart S.A., Marra C. et al. Comparison of methods for detection of T. pallidum in lesions of early syphilis // Sex. Transm. Dis. 1996. -Vol. 23, №5.-P. 366-369

118. Dobson S.R., Taber L.H., Baughn R.E. Recognition of T. pallidum antigens by IgM and IgG antibodies in congenitaly infected newborns and their mothers // J. Infect. Dis. 1988. - Vol. 157, №5. - P. 903-910

119. Dukamel R.C., Schur P.H., Brendel K. pH gradient elution of human IgGl, IgG2 and IgG4 from protein A sepharose. // J. Immunol. 1989. -Vol. 122, №4. -P. 1468-1472

120. Elliasson M., Olsen A., Palmkrautz E. et al. Chimeric IgG binding receptors engineered from Staphylococcal protein A and streptococcal protein G.// J. Biol. Chem. 1988. - Vol.263, №6. - P. 4323-4327

121. Fahnestock S.R., Alexander J., Filpula D. Gene for an immunoglobulin-binding protein from a group G streptococcus // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 167, №3. - P. 870

122. Frick J.M., Kerstrom P., Cooney J. Protein G, surface protein of Streptococcus pyogenes with separate binding sites for IgG and albumin // Mol. Microbiol.- 1994.-Vol. 12, №1.-P. 143-151

123. Gene M., Ledger W.J. Syphilis in pregnancy // Sex. Transm. Inf. 2000. -Vol.76, №2. - P. 73-79

124. Goward C.R., Murphy Т., Atkinson Т., Barstow D. Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G // Biochem. J. -1990.-Vol. 267, №1.-P. 171-177

125. Graham D.A., Foster J.C., German A. et al. Evolution of an immunofluorescent antibody test to detect bovine herpesvirus 1-specific IgM // J. Vet. Diagn. Invest. 1999. - Vol.11, № 4. - P. 324-329

126. Griemberg G., Ravelli M.R., Etcheves P.O. et al. Syphilis and pregnancy. Prenatal control, seroprevalence and false biological positives // Medicina (B. Aires). 2000. - Vol. 60, №3. - P. 343-347

127. Green Т., Talbot M.D., Morton R.S. The control of syphilis, a contemporary problem: a historical perspective // Sex. Transm. Inf. 2001. -Vol. 77, №3.-P. 214-217

128. Gronenbom A.M., Clore G.H. Identification of the contact surface of a streptococcal protein G domain complexed with human Fc fragment// J. Mol. Biol. -1993. Vol. 223, №2. - P. 331-335

129. Guamer J., Greer P.W., Bartlett J. et al. Congenital syphilis in a newborn an immunopathologic study // Med. Pathol. 1999. - Vol. 12, №1. - P. 82-87

130. Gupalova T.V., Lojkina O.V., Palagnuk V.G. et al. Quantitative investigation of the affinity properties of different recombinant forms of proteins G by means of high-performance monolithic chromatography // J. Chromatogr. -Vol. 949, №2.-P. 185-193

131. Hage D.S. Affinity chromatography: a review of clinical applications // Clin. Chem. 1999. - Vol. 45, №5. - P. 593-615

132. Hjerten S., Mohammad J. A simple and inexpensive chromatographic method for the purification of y-globulin from human serum // J. Biochem. Biophys. Methods. 1994. - Vol.28, №3. - P. 321-327

133. Hjerten S., Nakazato K. et. al. Reversed-phase chromatography of proteins and peptides on compressed continuous beds.// Chromatogr. 1993. - Vol. 37. -P. 287-294.

134. Hunter E.F. Direct fluorescent antibody tissue test for T. pallidum (DFAT

135. TP), p. 69-75. In S.A. Larsen, E.F. Hunter and S.J. Kraus (cd), A manual of tests tbfor syphilis; 8 cd. American Public Health Association, Washington, D.C.

136. Hunter E.F., Greer R.W. et al. Immunofluorescent staining of Treponema in tissues fixed with formalin // Arch. Pathol. Lab. Med. 1984. - Vol. 108, №10. -P. 878-880

137. Ijsselmuiden O.E., van der Suis J.J., Mulder A. et al. An IgM capture-enzyme-linked immunosorbent assay to detect IgM antibodies to treponemes in patient with syphilis // Genitourin. Med. 1989. - Vol. 165, №2. - P. 79-83

138. Ito F., George R.W. et al. Specific immunofluorescent staining of pathogenic treponemes with a monoclonal antibody // J. Clin. Microbiol. 1992. -Vol. 30, №8.-P. 831-838

139. Kasper C., Freitag R., Tennikova Т., Meringova L. Evalution of affinity filters for protein isolation.// Bioseparetion. 1997. - Vol. 6, №3. - P. 373-382

140. Kato K., Lian L.Y., Barsukov I.L. et. al. Model for the complex between protein G and an antibody Fc-fragment in solution // Faculty pharm. Sciences. -1995.-Vol. 3, №1. P. 79-85

141. Kehoe M.A. Cell-well associated proteins in Gram-positive bacteria // New Сотр. Biochem. 1994. - Vol. 27, №2. - P. 217-261

142. Kim D.K., Lee M.G., Lee J.B. Changes of serum IgG antibody reactivity to protein antigens of T. pallidum in syphilis patients after treatment // J. Korean. Med. Sci. 1989. - Vol. 4, №2. - P. 63-69

143. Kitsiouli E., Lekka M.E., Nakos G. et \al. Lipids are co-eluted with immunoglobulins G during purification by recombinant streptococcal protein G affinity chromatography // J. Immunol. Methods. 2002. - Vol.271, №2. - P. 107111

144. Kronvall G. A surface component on group А, С and G streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin G// J. Immunol. 1973.- Vol. Ill, №4.-P. 1401-1406

145. Larkin J.A., Lit L., Toney J., Haley J.A. Recognizing and treating syphilis in pregnancy // Medscape Womens Health. 1998. - Vol.3, №1. - P.5

146. Larsen S.A., Farshy C.E., Pender B.J. et al. Staining intensities in the fluorescent treponemal antibody absortion (FTA-abs) test: association with the diagnosis of syphilis // Sex. Transm. Dis. 1986. - Vol. 13, №3. - P. 221-227

147. Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis // Clin. Microbiol. Rew. 1995. - Vol. 8, №1. - P. 1-21

148. Lee S.M., Essing N.Z., Lee Т.К. Process development for the recovery and purification of recombinant protein G.// J. Biochem. 1992. - Vol. 26. - P. 213-219

149. Lefevre J.C., Bertraud M.A., Bauriand K. Evaluation of the captia enzyme immunoassays for detection of immunoglobulins G and M to T. pallidum in syphilis // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, №8. - P. 1704-1707

150. Lewis L.L., Taber L.H., Bauglin R.F. Evaluation of immunoglobulin M Western-blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, №2. - P. 296-302

151. Macter-Boehm H., Hoenla R. The significance of serology tests to diagnose the activity of syphilis. The 19S-IgM-FTA-abs-test compared with the syphilis-IgM-ELISA // Laboratorimsmedizin. 1994. - Vol. 18, №5. - P. 205-208

152. Marangoni A., Sambri V., Storni E. et al. Treponema pallidum surface immunofluorescence assay for serologic diagnosis of syphilis // Clin. And Diagn. Lab. Immunol. 2000. - Vol. 7, №3. - P. 417-421

153. Marin C.M., Alonso-Urmeneta В., Moriyon I. et al. Comparison of polyclonal, monoclonal and protein G peroxidase conjugates in an enzyme-linkedimmunosorbent assay for the diagnosis of Brucella ovis in sheep // Vet Rec. -1998. Vol.143, №14. - P.390-394

154. Mavrov G.I., Gaubenko J.V. Clinical and epidemiological features of syphilis in pregnant women: the course and outcome of pregnancy // Gynecol. Obstet. Invest.-2001.-Vol. 52, №2.-P. 114-118

155. Morrison-Plummer J., Aldrete J.F., Baseman J.B. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of serum antibody to outer membrane proteins of Treponema pallidum // British J. Ven. Dis. 1983. - Vol.59, №2. - P. 75-79

156. Meyer M.R., Baughn R.E. Whole-blood hemagglutination inhibition test for venereal disease research laboratory (VDRL) antibodies // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38, №9. - P. 3413-3414

157. Myhre E.B., Kronvall G. Heterogenity on non-immune immunoglobulin Fc reactivity among Gram-positive cocci: description of three major types of receptor for human immunoglobulin G // Infect. Immunol. 1977. - Vol. 17, №3. - P. 475-482

158. Obisesan K.L., Ahmed Y. Routine antenatal syphilis screening a case against // Afr. J. Med. Sci. - 1999. - Vol. 28, №3-4. - P. 185-187

159. Olsson A., Eliasson M., Guss B. et al. //Europ. J. Biochem. 1987. - Vol. 168, №2:-P.319-324

160. Qi Y., Yan Z., Huang J. Chromatography on DEAE ion-exchange and protein G affinity columns in tandem for the separation and purification of proteins// J. Biochem. Biophys Methods. 2001. - Vol. 49, №3. - P.263-273

161. Rawston S.A., Mehta S., Marcellino L. et al. Congenital syphilis and fluorescent treponemal antibody test reactivity after the age of 1 year // Sex. Transm. Dis. -2001. Vol. 28, №7. - P. 412-416

162. Reis K.J., Ayoub E.M., Boyle M.D.P. Streptococcal Fc receptors. Isolation and partial characterization of the receptor from a group С streptococcus // J. Immunol. 1984.-Vol. 132,№5.-P.3091

163. Reis K.J., Hansson F., Bjorck L. Extraction and characterization of IgG Fc receptors from group С and group G steptococci // Molec. Immunol. 1986. -Vol. 23, №2.-P. 425-431

164. Sanchez P.J., McCracken G.H., Wendel G.D. et al. Molecular analysis of the fetal IgM response to T. pallidum antigens: implications for improved serodiagnosis of congenital syphilis // J. Infect. Dis.- 1989. Vol.159, №3. - P. 508-517

165. Sanchez P.J., Wendel G.D. Jr., Norgard M.V. IgM antibodies to Treponema pallidum in cerebrospinal fluid of infants with congenital syphilis // Am. J. Dis. Child. 1992. - Vol. 146, №10. - P.l 171-1175

166. Sanchez P.J. Laboratory test for congenital syphilis // Pediatr. Infect. Dis. J. 1998. - Vol. 17, №1. - P. 70-71

167. Sheffield T.S., Wendel G.D. Jr. Syphilis in pregnancy // Pediatr. Infect. Dis. J. 1999. - Vol. 42, №1. - P. 97-106

168. Schmidt B.L., Luder A., Duschet P. et al. Specific IgM tests in syphilis diagnosis // Hautar. zt. 1994. - Vol. 45, №10. - P. 685-689

169. Schmitz J.L., Gertis K. S. Laboratory diagnosis of congenital syphilis by immunoglobulin M (IgM) and IgA immunoblotting // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1994. - Vol. 1, №1. - P. 32-37

170. Sheedy С., Hall J.C. Immunoaffinity purification of chlorimuron-ethyl from soil extracts prior to quantitation by enzyme-linked immunosorbent assay // J. Agric. Food Chem. 2001. - Vol. 49, № 3. - P. 1151-1157

171. Sjobring U. Isolation and molecular characterization of a novel albumin-binding protein from group G streptococci // Infect. Immunol. 1992. - Vol. 60, №7.-P. 3601-3608

172. Sjobring U., Bjock 1., Kastern W. Streptococcal protein G: gene structure and protein binding properties // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266, №3. - P. 399405

173. Sjobring U., Falkenberg C., Nielson E. et al. Isolation and characterization of 14-kDa albumin-binding fragment of streptococcal protein G // J. Immunol. -1988. Vol.140, №5. - P. 1595-1599

174. Stahl D., Kreft H., Hack H. et al. Serum affinity chromatography for the detection of IgG alloantibodies in a patient with High-titer IgM cold agglutinins // Vox. Sang. 1998. - Vol. 74, № 4. - P. 253-255

175. Sugiura Т., Imagawa H., Kondo T. Purification of horse immunoglobulin isotypes based on differential elution properties of isotypes from protein A and protein G columns.// J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 2000. - Vol. 742, №2.-P. 327-334

176. Sundberg L., Porath J. Preparation of adsorbents for biospecific affinity chromatography. Attachment of group-containing ligands to insoluble polymers by means of bifunctional oxines // J. Chromatogr. 1974. - Vol. 90, №1. - P. 8798

177. Vieker S., Siefert S. Lemke J, Pust B. Congenital syphilis after reactivation of "healed" material primary infection // Clin. Pediatr. 2000. - Vol.212, №6. -P. 336-339

178. Verdoliva A., Pannone F., Rossi M. et al. Affinity purification of polyclonal antibodies using a new all-D synthetic peptide ligand: comparison with protein A and protein G // J. Immunol. Methods. 2002. - Vol.271, № 1. - P. 77-88

179. Wilkinson D. Screening for syphilis in pregnant woman // Trop. Doct. — 1998.-Vol. 28, №2.-P. 120

180. Yamamoto Y. PCR in diagnosis of infection: detection of bacteria in cerebrospinal fluids // Clin. And Diagn. Laboratory Immunology. Vol. 9, №3. -P.508-514

181. Yan Z., Huang J. Cleaning procedure for protein G affinity columns// J. Immunol. Methods. 2000. - Vol.237, №2. - P.203-205

182. Yan Z., Huang J. Chromatographic behavior of mouse serum immunoglobulin G in protein G perfusion affinity chromatography // J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 2000. - Vol.738, № 1. - P. 149-154

183. Young H. Syphilis. Serology // Dermatol. Clin. 1998. - Vol. 16, №4. - P. 691-698

184. Young H. Guidelines for serological testing for syphilis // Sex. Transm. Inf. 2000. - Vol. 76, №5. - P. 403-405175