Биотехнология получения лекарственных и иммуногенных липосомальных композиций, используемых в лечении экспериментальных особо опасных инфекций и получении сырья для производства медицинских иммунобиол

Таран, Татьяна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнология получения лекарственных и иммуногенных липосомальных композиций, используемых в лечении экспериментальных особо опасных инфекций и получении сырья для производства медицинских иммунобиол
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология получения лекарственных и иммуногенных липосомальных композиций, используемых в лечении экспериментальных особо опасных инфекций и получении сырья для производства медицинских иммунобиол"

На правах рукописи

ТАРАН Татьяна Викторовна

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И ИММУНОГЕННЫХ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ КОМПОЗИЦИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ПОЛУЧЕНИИ СЫРЬЯ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.23 -биотехнология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ставрополь - 2004

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Ефременко Виталий Иванович

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Еременко Евгений Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор, заслуженный деятель науки РФ Самойлова Любовь Владимировна

доктор медицинских наук Яговкин Эдуард Александрович

доктор медицинских наук Храпова Наталья Петровна

Ведущая организация: Иркутский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита диссертации состоится » декабря 2004 года в /V часов на заседании регионального диссертационного совета ДМ 212256.04 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г.Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 2, аудитория 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 1.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного / Л) /У.У/ ^ совета, доктор биологических наук УСу/А/''^ у ТИ. Джандарова

£Q0S-4 434S4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возрастающий интерес к разработке биотехнологий получения различных липосомальных форм биологически активных веществ (БАВ) обусловлен значительным расширением использования липосом во многих областях медицинской науки и практики. Существуют методы изготовления липосом, позволяющие получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема. Тем не менее, в зависимости от цели конструирования липосомальных форм биологически активных веществ необходима разработка технологий включения в липосомы конкретных препаратов. Важную роль также играет разработка биотехнологии получения и очистки сырья для производ-ствалипосом — фосфолипидов.

В специальной литературе достаточно широко представлены результаты лечения особо опасных зоонозных инфекций липосомальными антибиотиками [Ефременко В.И., Тихенко Н.И. с соавт., 1995; Гребенкина М.Б. с соавт., 1997; Поярков А.Я. с соавт., 1998; Романов В.Е. с соавт., 1998; Кузнецов СМ. с соавт., 1999; Кузякова Л.М., 2000; Ротов К.А. с соавт., 2000; Тихонов Н.Г., 2000; Оверченко В.В., 2002; Мисетова Е.Н., 2003]. Однако не удалось найти сведений о разработке унифицированной биотехнологии включения различных антибиотиков в липидные везикулы с проведением оценки включения материала, сохранения специфической активности и эффективности in vivo на модели экспериментальных инфекций. Кроме того, известно, что антибиотики с высокой антибактериальной активностью часто оказывают иммунодепрессивное действие на организм [Никитин А.В. с соавт., 2002]. Поэтому значительный интерес представляет оценка влияния полученных липосомальных антибиотиков на факторы неспецифической резистентности макроорганизма.

Срок хранения липосомальных препаратов в жидком виде ограничен, так как липосомальные формы БАВ в процессе их приготовления и длительного хранения подвергаются воздействию целого ряда физических и химических факторов, способствующих деградации бислойных фосфолипидных мембран и вытеканию инкапсулированного материала. Следовательно, разработка технологий стабилизации липосом с целью сохранения биологических свойств материала и увеличения срока годности приобретает особое значение.

Вступая в различные взаимодействия с клетками макроорганизма, компоненты бислойной мембраны липосом активно включаются в метаболические процессы, вызывая определенные изменения функционального состояния отдельных органов и систем организма [Крейнес В.М. с соавт., 1990; Ефременко В.И., 1999]. Однако в доступной - литературе прак-

ганизме при поступлении липосом и липосомальных антибиотиков. Таким образом, значительный интерес представляет оценка возможных повреждений макроорганизма в ответ на введение сконструированных ли-посом и липосомальных форм антибиотиков.

Актуальной остается проблема получения иммунных чумных сывороток как сырья для производства медицинских иммунобиологических препаратов [Киреев М.Н. с соавт., 2001]. В литературе представлены лишь единичные работы, где для получения иммунных сывороток предприняты попытки использования липосом в качестве адъювантов и контейнеров для антигенов [Ефременко В.И., 1988; Тюменцева И.С., 1996].

Липосомальные вакцины, содержащие различные антигены, активно влияют на клеточные и гуморальные факторы иммунитета [Пиша Н. й а1., 1995; Мигунов А.И. с соавт., 2001]. Создание новых типов иммуно-профилактических препаратов на основе включенных в липосомы видос-пецифических и протективных антигенов чумного микроба представляет одно из перспективных направлений в области разработки способов эффективной защиты от чумной инфекции [Закревский В.И., Плеханова Н.Г., 1990; Гусева Н.П. с соавт., 1993; Киреев М.Н. с соавт., 1995; Тара-ненко Т.М. с соавт., 1997]. Поэтому разработка биотехнологии получения липосомальных композиций антигенов чумного микроба, эффективных в специфической профилактике чумной инфекции, представляется необходимой и своевременной.

Цель исследования: разработать биотехнологию получения и стабилизации липосомальных форм антигенов чумного микроба, пригодных в качестве сырья для производства МИБП, и антибиотиков, эффективных в лечении экспериментальных особо опасных инфекций.

Основные задачи исследования:

1. Разработать биотехнологическую схему выделения и очистки фосфолипидов из животного сырья для приготовления липосомальных препаратов

2.Разработать биотехнологию приготовления липосом с эффективным включением антигенов чумного микроба во внутренний объем и на наружную поверхность мембраны

3.Разработать биотехнологию включения в липосомы антибиотиков, отличающихся по структурным, химическим особенностям и свойствам. Оценить влияние полученных липосомальных антибиотиков на неспецифическую резистентность макроорганизма в эксперименте

4.Разработать биотехнологические приемы стабилизации липосо-мальных композиций и оценить безвредность полученных липосомаль-ных форм БАВ для лабораторных животных

5.Оценить биологическую эффективность полученных липосомаль-ных форм антибиотиков при лечении особо опасных зоонозных инфекций в эксперименте и разработать схемы адекватной терапии.

6.Отработать с использованием липосомальной формы фракции 1 чумного микроба биотехнологию получения гипериммунных сывороток, оценить протективную и гуморальную активность полученных липосо-мальных антигенных композиций в эксперименте

Научная новизна работы. Разработаны новые способы получения комплекса фосфолипидов и ганглиозидов из головного мозга крупного рогатого скота и методы их очистки, подтверженные патентами РФ № 2000109191/14 и №2000109192/14.

Впервые изучено влияние липосомальных форм антибиотиков на показатели неспецифической резистентности макроорганизма, определены механизмы иммуностимулирующего действия липосом с антибиотиками на уровне интралейкоцитарных микробицидных и энергетических систем полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) крови. Разработана биотехнология стабилизации липосомальных форм антибиотиков, сохраняющих специфическую активность инкапсулированных антибиотиков в течение 2 лет хранения, включающая использование антиоксиданта и лиофильного высушивания, позволяющая уменьшить экономические и временные затраты. Впервые по патоморфологическим критериям доказана относительная безвредность длительного введения липосомальных антибиотиков для экспериментальных животных.

Результаты проведенных исследований являются научно-экспериментальным обоснованием усовершенствования существующих в практическом здравоохранении средств антибактериальной терапии чумы, туляремии, сибирской язвы и бруцеллеза. Приоритетность подтверждена положительным решением о выдаче патентов РФ по заявкам №2002133738/14 от 19.03.04 «Способ лечения бруцеллеза» и №2002133737/14 от 21.05.04 «Способ лечения бруцеллеза».

При использовании фракции 1 чумного микроба, инкапсулированной в липосомы из димиристоилфосфатидилэтаноламина и стеариламина, разработана биотехнология получения гипериммунных сывороток, соответствующих требованиям экспериментально-производственного регламента [1987], предъявляемым к оценке сырья для производства медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП). Результаты иммунопрофилактики экспериментальной чумы сконструированными липосомаль-ными формами антигенов чумного микроба являются научно-экспериментальным обоснованием для создания липосомальных химических вакцин для парентерального и перорального использования.

Практическая и теоретическая значимость работы. Результаты исследования имеют как теоретическое, так и практическое значение, поскольку впервые в рамках одной работы представлены новые аспекты биотехнологии получения, оценки эффективности и использования липо-сомальных форм БАВ. Разработана технологическая схема экстракции фосфолипидов из головного мозга крупного рогатого скота, позволяющая исключить из технологического процесса токсичные вещества, повысить выход продукта и обеспечивающая достижение сбалансированного экви-молярного соотношения фосфолипидов с липидами мембран клеток макроорганизма. По предложенной биотехнологии экстракции липидов составлены Технические условия ТУ- 9154-001-01897080 - 2004 «Фосфо-липиды для получения липосом», утвержденные заместителем главного государственного санитарного врача РФ Беляевым Е.Н. (письмо № 12 ФЦ/2514 А от 19 августа 2004 г.). На разработанную биотехнологию получения липосомальных форм антибиотиков и антигенов чумного микроба составлен регламент производства «Липосомальная основа для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов», утвержденный директором института проф. Ефременко В.И. (протокол Ученого совета № 4 от 20 апреля 2004 г.).

Теоретические положения и практически значимые результаты диссертационной работы включены в цикл лекций по лечению, профилактике, диагностике особо опасных инфекций на курсах подготовки специалистов: «Курсы усовершенствования биологов службы ГСЭН по особо опасным и природноочаговым зоонозам»; «Курсы первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям»; «Подготовка личного состава учреждений сети наблюдения и лабораторного контроля по противоэпидемическому обеспечению населения в условиях возникновения чрезвычайных ситуаций».

Результаты выполненных исследований легли в основу 10 методических рекомендаций, 2 из которых утверждены Первым заместителем министра здравоохранения РФ, главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Замена метанола на этанол для экстракции фосфолипидов с последующим их осаждением охлажденным ацетоном позволяет получать липидный комплекс, пригодный для приготовления липосом различными методами

2. Методы «обращения фаз» и «замораживания-оттаивания» в использованной модификации позволяют получать липосомы с максимальным включением фракции 1 чумного микроба и обеспечивают адсорбцию значительного количества антигена на наружной поверхности мембран.

3. Включение антибиотиков методом «замораживания-оттаивания» без ультразвуковой обработки в «пустые» липосомы, полученные методом «обращения фаз», обеспечивает высокий процент иммобилизации антибиотиков с сохранением их биологической активности.

4. Разработанная .биотехнология лиофилизации с использованием а-токоферола ацетата в концентрации 0,5 мг на 1 г липидов и защитной сахарозо-желатиновой среды позволяет получить липосомальные формы антибиотиков, сохраняющие специфическую активность в течение 2 лет.

5. Разработанные схемы этиотропного лечения экспериментальной сибирской язвы, туляремии, чумы, бруцеллеза липосомальными антибиотиками для парентерального и перорального путей введения, позволяют уменьшить кратность лечения, снизить курсовые дозы препаратов и повысить эффективность терапии по сравнению с использованием их свободных форм.

6. Разработанная биотехнология получения гипериммунных сывороток к фракции 1 чумного микроба, инкапсулированной в липосомы из димиристоилфосфатидилэтаноламина и стеариламина, обеспечивает получение антифракционных кроличьих сывороток, удовлетворяющих требованиям оценки сырья, предъявляемым экспериментально-производственным регламентом [1987].

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговых научных конференциях Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (г. Ставрополь, 1996, 1997, 1998, 1999, 2000,2001 гг.), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания» (г. Ставрополь, 1997), на научной конференции Ставропольской государственной медицинской академии (г. Ставрополь, 1997 г.), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998), на научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (г. Киров, 2001г.), на научно-практической конференции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (г. Астрахань, 2001 г.), на научно-практической конференции «Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане» (г. Алма-Ата, 2001 г.), на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней» (г. Омск, 2001 г.), на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002 г.), на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института

(г. Ставрополь, 15-16 октября 2002 г.), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологической безопасности Российской Федерации», посвященной 75-летию образования НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 10 НИР, отражено в 45 опубликованных научных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей, депонированных - 9 статей, в иностранных журналах - 5 публикаций). Получено 2 патента на изобретения и 2 положительных решения о выдаче патента на изобретение.

Объем и структура работы. Работа изложена на 212 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 22 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 216 отечественных и 125 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. В работе использовано 3000 нелинейных белых мышей (б.м.)массой 18-20 г обоего пола, 40 морских свинок (м.св.) массой 300-400 г обоего пола и 12 кроликов-самцов породы "шиншилла" массой 3-3,5 кг. Штаммы микроорганизмов: Yersinia pestis EVлинии НИИЭГ, Yersinia pestis 461, Bacillus anthracis 81/1, Fransisella tularensis 144/713, Brucella melitensis565(биовар 2).

Для приготовления липосом использовали фосфатидилхолин (L-a-phosphatidylcholine, p-diarachidoyl, молекулярная масса 846,3; "Sigma", США); фосфатидилглицерин (L-a-phosphatidyl-a-glycerol, dipalmitoyl, молекулярная масса 740,0; "Sigma", США), сфингомиелин ("Sigma", США); димиристоилфосфатидилэтаноламин (L-a-phosphatidylethanolamine,

dimyristoyl, молекулярная масса 635,9; "Sigma", США); дицетилфосфат (dicetylphosphate, молекулярная масса 546,9; "Sigma", США); стеариламин (stearylamine, молекулярная масса 269,5; "Sigma", США), холестерин (5-Cholesten-3-p-ol; 3-p-Hydroxy-5-cholestene, молекулярная масса 386,7; "Sigma", США). Для включения в липосомальные везикулы использовали антибиотики: тетрациклин, стрептомицин (ОАО «Биосинтез», г. Пенза, Россия), сизомицин, ампициллин (Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез», г. Курган, Россия), кефзол (цефазолин - ELILILLY S.pA-Sesto Fiorentinq [Florence], Italy), максаквин (ломефлоксацин - «Searle», Франция).

Капсульный антиген фракцию 1 (Ф1) чумного микроба получали по методу Baker E.F. et. al. [1952]. Липополисахарид (ЛПС) чумного микроба получали по методу Бахрах Е.Э. с соавт. [1962]. Тонкослойную хромато-

графию липидов осуществляли по методу Кейтса М. [1975]. Для получения липосом использовали метод этанольной инжекции [Kremer J.M.H. et al., 1977], метод ручного встряхивания [Me Cown J.T. et al., 1981], метод «озвучивания мультиламеллярных везикул» [Hauser H.O., Barrat M.D., 1973], метод "выпаривания в обращенной фазе" [Szoka F., 1978; Cafiso D.S., Petty H.R., 1981] и метод "замораживания-оттаивания" [Pica U, 1981]. Контроль образования, размеров и структуры липосом осуществляли на электронном микроскопе JEM - 100SX «JEOL» (Tokyo, Japan) при исследовании нативных препаратов и их ультратонких срезов [За-кревский В.И. с соавт., 1982].

Бруцеллезную инфекцию моделировали у белых мышей путем подкожного введения по 0,5-105 микробных клеток (м.к.) вирулентного штамма В. melitensis 565. Туляремийную инфекцию моделировали путем внутрибрюшинного введения белым мышам вирулентного штамма возбудителя туляремии F. tularensis 144/713 в дозе 100 м.к. Сибиреязвенную инфекцию моделировали с помощью типичного высоковирулентного тест-заражающего штамма В. anthracis 81/1, вводимого подкожно во внутреннюю поверхность бедра в дозе 10 LD 50 (I LD50=10 спор). Чумную инфекцию моделировали путем подкожного или внутрибрюшинного введения белым мышам различных доз вирулентного штамма Y. pestis 461. Методы и схемы иммунизации животных представлены в соответствующих разделах работы.

Миелопероксидазу определяли по методу Лилли Р. [1927]. Катион-ные белки выявляли по методу Пигаревского В.Е. [1978] в модификации Сафроновой В.М. с соавт. [1994]. Гликоген обнаруживали по методу Мак-Мануса Дж. [1946] и Хочкисса Р. [1948] в модификации Сафроновой В.М. с соавторами [1994]. Оценку ферментативной активности миелоперокси-дазы и катионных белков в нейтрофилах крови проводили полуколичественным методом по Kaplow L. [1955] в модификации Astaldi G., Verga L. [1957].

Для статистической обработки материала использовали методы Ашмарина Г.П. и Воробьева А.А. [1962] и Ойвина И.А. [1960]. Результаты исследования обрабатывались на IBM PC 550 с использованием пакета прикладных программ EXCEL.

Результаты исследований

Исследованиями Калюжина О.В. [1998] установлено, что наиболее богатый спектр фосфолипидов в эквимолярном соотношении имеется в головном мозге крупного рогатого скота. Техническим результатом разработанной нами схемы экстракции фосфолипидов из головного мозга крупного рогатого скота (рис. 1) явился высокий выход целевого продукта (1,4 % от массы исходного сырья) и достижение сбалансированного

эквимолярного соотношения фосфолипидов, обладающих сродством к мембранам клеток макроорганизма.

Рисунок 1. Технологическая схема выделения фосфолипидов из головного мозга крупного рогатого скота (КРС)

Учитывая выраженную токсичность метанола, была произведена замена традиционного метилового спирта на этанол в фармакопейной концентрации 95%. Схема экстракции включала гомогенизацию, обезвоживание и экстракцию исходного сырья ацетоном, экстракцию осадка смесью хлороформа с этанолом, отделение липидной фазы и выделение из нее фосфолипидов добавлением ацетона в соотношении с экстрактом 1,5 - 2,0:1. Разработанная схема упрощает процесс отделения липидной фазы и позволяет получить комплекс липидов: цереброзиды - 16,6 %; фосфатидилэтаноламин - 16,6 %; фосфатидилхолин - 8,3 %; сфингомие-лин - 8,3 %; фосфатидилсерин - 6,25 %; фосфатидилинозит - 6,25 %; холестерин- 16,6%.

Конструирование липосом определялось природой включаемого вещества и его расположением в бислойных везикулах (во внутреннем объеме или в бислойной мембране) при стремлении включения максимального количества нативного материала. Сравнительная оценка методов приготовления липосом показала, что наибольший внутренний объем имели липидные везикулы, полученные методом «выпаривания в обра-

щенной фазе» и «замораживания-оттаивания» (9 и 10 л на моль липида соответственно).

При разработке биотехнологии получения липосом с антигенами чумного микроба проведена оценка методов «замораживания-оттаивания» и «выпаривания в обращенной фазе» для эффективного включения Ф1 чумного микроба с сохранением биологических свойств и максимального количества антигена, связанного с наружной поверхностью мембран. Для исключения негативного влияния на включаемый материал ультразвука при осуществлении метода «обращения фаз» перемешивание растворенных в хлороформе липидов (30 мг/мл) с водной фазой осуществляли при помощи скоростной мешалки до образования эмульсии типа «вода в масле» (около 10-12 минут). В результате получены липосо-мы с уровнем включения капсульного антигена чумного микроба 85 %, а содержание Ф1 в липосомах составило 50 г на 10 моль липидов. На наружной поверхности липидных мембран иммобилизовано 18,75 г Ф1 наЮ моль липидов или 37,5 % от общего включения антигена.

При исключении этапа ультразвуковой обработки в методе «замораживания-оттаивания» включение Ф1 чумного микроба достигло 90%, а содержание капсульного антигена в липосомах составило 56,7 г на 10 моль липидов. Иммобилизация антигена на наружной поверхности липидных мембран составила 28,35 г/10 моль липидов или 50 % от общего включения Ф1. Последняя характеристика представляется нам особенно важной, поскольку известно, что наличие антигенных детерминант на наружной поверхности мембран является важным условием формирования выраженного иммунного ответа [Закревский В.И. с соавт., 1983].

Для сохранения биологической активности антибиотиков при разработке биотехнологии получения липосомальных форм антибиотиков была использована щадящая двухэтапная методика включения химиопре-паратов в липидные везикулы. На первом этапе осуществлялось приготовление «пустых» липосом из полученных фосфолипидов методом «выпаривания в обращенной фазе», на втором - включение в них антибиотиков методом «замораживания-оттаивания». Использование этой методики исключает контакт антибиотиков с органическими растворителями, а также негативное действие ультразвука на препараты. Из данных табл. 1 видно, что, используя указанные методические приемы, в липосомы удается инкапсулировать 64 - 88 % включаемых антибиотиков.

Таблица 1. Уровень включения антибиотиков в «пустые» липосомы методом «замораживания-оттаивания»

Антибиотик п Уровень включения антибиотиков, М±т %

Стрептомицин 6 79,0 ±2.1

Гентамицин 4 78,0 ±1.3

Ампициллин 4 64,0 ±1.6

Кефзол 4 83,0 ± 3.3

Тетрациклин 4 84,0 ±2.5

Сизомицин 4 87,0 ±2.2

Ломефлоксацин 5 88,0 ±1.6

Повышение эффективности химиотерапии бактериальных инфекций с помощью липосомальных форм антибиотиков тесно связано с анализом действия модифицированных препаратов на факторы неспецифической резистентности макроорганизма. Известно, что многие высокоактивные антибиотики обладают иммунодепрессивным действием, приводят к нарушению фагоцитарной функции [Нагоев Б.С., 1986]. Оценка влияния сконструированных липосомальных антибиотиков на микроби-цидные и энергетические системы ПМЯЛ крови является весьма важной для их характеристики, адекватного выбора и рационализации клинического применения. Впервые проведено сравнительное изучение основных цитоэнзимохимических показателей ПМЯЛ крови экспериментальных животных при парентеральном и пероральном поступлении интактных и липосомальных антибиотиков.

Введение белым мышам ампициллина, кефзола, стрептомицина, ломефлоксацина и тетрациклина в свободной форме на 3-14 сутки исследования вызывало понижение уровня катионных белков и гликогена, а также активности миелопероксидазы в ПМЯЛ крови в 2-3 раза по сравнению с фоновыми значениями. К концу эксперимента значения большинства показателей оставались ниже контрольных, что свидетельствует об угнетении важнейших энергетических и микробицидных систем ПМЯЛ крови белых мышей в период введения интактных антибиотиков, а также в течение последующих 13 сут (срок наблюдения) после отмены химиоп-репаратов. Введение экспериментальным животным интактных липосом и липосомальных антибиотиков обусловливало менее выраженное, по сравнению с интактными химиопрепаратами, угнетение энергетических (гликоген) и биоцидных (катионные белки, миелопероксидаза) систем ПМЯЛ, которые в 1-е - 12-е сут после отмены препаратов во всех случаях возвращались к норме или даже превышали фоновые значения. Иными

словами, введение липосом обеспечивало усиление реактивности грану-лоцитов, в результате чего после отмены липосомальных форм БАВ ферментные системы нейтрофилов оставались в активизированном состоянии. Эти результаты подтверждают наличие неспецифического иммуно-модулирующего действия липосом на макроорганизм, а также снижение иммунодепрессивного действия антибиотиков при включении их в липосомы.

При хранении липосомальных препаратов в жидком виде происходит постепенное вытекание включенного материала [Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д, 1986]. Для сохранения биологических свойств и увеличения срока годности препаратов широкое применение в биотехнологии нашел метод лиофильного высушивания [Осадчая А.И. с соавт., 2002]. Учитывая вышесказанное, разработана биотехнология стабилизации, обеспечивающая получение лиофилизированных высокоактивных антибактериальных липосомальных форм, стабильных при длительном хранении. Разработка биотехнологии режима сублимиции проводилась на модели липосомальной формы стрептомицина. В качестве среды высушивания выбрана сахарозо-желатиновая среда, содержащая 40% сахарозы и 10% желатина, которую вносили в образцы в различных концентрациях.

Лиофилизацию осуществляли на установке LZ-9c в умеренном 26-часовом режиме (длительность удаления свободной воды 14-15 ч; связанной влаги - 10-11 ч; конечная температура подогрева - 25 °С; общая длительность процесса сушки - 25±1 ч). Сахарозо-желатиновая среда в концентрации 30 % оказывает выраженное защитное действие, обеспечивая формирование хорошо структурированной сухой массы в ампулах в виде однородной плотной непористой таблетки и максимальную стабильность липосомальных везикул в процессе лиофилизации (табл. 2).

Таблица 2. Влияние концентрации защитной среды на некоторые показатели липосомальной формы стрептомицина при 26-часовом режиме лиофильного высушивания

Концентрация защитной среды, % Количество инкапсулированного стрептомицина Остаточная влажность, % Образование плотной оформленной структуры

до лиофили-зации после лио-филизации

10 100 75 12,8 -

20 100 85 9,8 ±

30 100 93 6,5 +

40 100 82 9,6 ±

50 100 80 11,5 -

60 100 75 14,8 -

При этом обращает на себя внимание содержание сухих веществ в материале. При получении хорошо структурированной сухой массы в ампулах, остаточная влажность соответствовала 6,5 %, что принято считать оптимальным для готовых препаратов [Осадчая А.И. с соавт., 2002].

Поскольку биотехнология производства должна отражать тенденции настоящего времени и позволять получать препарат при эффективном и экономном использовании материальных, энергетических и временных ресурсов, на следующем этапе исследования был испытан ускоренный 14-часовой режим сублимационного высушивания (рис. 2).

Рисунок 2. Ускоренный режим лиофильного высушивания липосомального стрептомицина

Длительность периода сублимации и десорбции при данном режиме предусмотрены в течение 14±1 ч при повышении температуры плиты до 45°С. Замораживание материала проводили при минус 40°С, то есть достаточно низкой, чтобы избежать оттаивания, но и достаточно высокой, чтобы не удлинять процесс высушивания. Сокращено время удаления не только свободной, но и связанной воды за счет интенсивного плавного подвода тепла до 45 °С и низкой температуры десублиматора - минус 70 °С. Тем самым исключено оттаивание и вспенивание материала. Определение количества инкапсулированного антибиотика, стабилизированного

с применением ускоренного режима лиофильного высушивания, показало, что использование «жестких» параметров сушки не отразилось на биологических свойствах и внешнем виде липосомального стрептомицина. Для практических целей может быть использован любой из изученных режимов лиофильного высушивания. Наиболее оптимальным и реально применимым на практике является 14-часовой режим высушивания, позволяющий экономить материальные, временные и энергетические ресурсы без снижения качества готового продукта.

В липосомологии важное значение имеет проблема перекисного окисления липидов [Мельянцева Л.П. с соавт., 1995]. Изучено защитное действие а-токоферола ацетата из расчета 0,5 мг на 1 г липидов на различных стадиях приготовления и хранения фосфолипидов и липосом. Полученные результаты позволили сделать вывод о необходимости присутствия антиоксиданта уже на этапе экстрагирования фосфолипидов. Результаты изучения защитного действия а-токоферола ацетата на модели лиофилизированных липосом со стрептомицином представлены на рис. 3.

Рисунок 3. Уровень стрептомицина в составе липосом в процессе хранения после лиофилизации

Из данных рис. 3 видно, что в процессе лиофилизации липосом без антиоксиданта количество иммобилизованного антибиотика уменьшалось на 20 % по сравнению с исходным содержанием (до лиофилизации). При сублимации липосом с антиоксидантом потери включенного вещества

составили всего 5 % от исходного уровня. Через 2 года (срок наблюдения) в липосомах без антиоксиданта в составе везикул оставалась приблизительно половина от включенного до лиофилизации стрептомицина, в то время как в липосомах, стабилизированных а-токоферола ацетатом уровень связанного стрептомицина уменьшался всего на 20 %. Таким образом, добавление а-токоферола ацетата при получении везикул и разработанный режим лиофилизации позволили получить липосомальный стрептомицин, стабильный в течение двух лет.

Оценку степени возможного повреждающего действия полученных липосом и липосомальных антибиотиков (стрептомицина и ломефлокса-цина) на макроорганизм мы провели при определении патоморфологиче-ских изменений в тканях и органах. Наиболее распространенными способами введения антибиотиков в клинической практике являются внутримышечный и пероральный, поэтому в экспериментах использовались эти пути поступления липосомальных препаратов. Гистологические исследования показали, что изменения во внутренних органах при внутримышечном введении пустых липосом на 5-11 сутки характеризуются: в печени -гиперплазией купферовских клеток, дискомплексацией балочного строения и явлениями пылевидной и мелкокапельной жировой дистрофии (рис.4); в селезенке - умеренной гиперплазией лимфоидных фолликулов; в почках - отеком клубочков, жировой дистрофией клеток эпителия извитых канальцев. Вместе с тем, указанные нарушения носят преходящий характер и не влекут за собой глубоких деструктивных изменений в макроорганизме (рис. 5). Пероральный путь введения липидных везикул характеризовался незначительными изменениями со стороны тканей и органов белых мышей.

Важно отметить, что независимо от способа введения интактных липосомальных везикул и липосомального ломефлоксацина, на 11-14 сут в селезенке всех исследуемых животных имела место умеренная гиперплазия лимфоидной ткани, и выявлялось большое количество гигантских многоядерных клеток типа мегакариоцитов (рис. 6). Появление в строме селезенки мезенгиальных клеток - производных костного мозга - служит одним из критериев усиления неспецифического иммунного ответа [Струков А.И., Серов В.В.,1993], что, в свою очередь, является подтверждением наличия у липосом иммуностимулирующих свойств.

Рисунок 4. Печень белой мыши на 11 сутки внутримышечного введения пустых липосом. Окраска Суданом III. Увеличение х 400

Рисунок 5. Печень белой мыши после отмены препарата. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение х 160.

Рисунок 6. Селезенка белой мыши на 14 сутки внутримышечного введения пустых липосом. Окраска гематоксилин-эозином.

Увеличение х 160.

Внутримышечное введение терапевтической дозы свободного стрептомицина сопровождалось выраженным расстройством кровообращения и альтеративными воспалительными процессами, наблюдавшимися с 1 сут после введения препарата. В то же время введение липосомаль-ной формы стрептомицина характеризовалось малосущественными изменениями во все сроки наблюдения. Наблюдаемые при парентеральном введении свободного стрептомицина нарушения кровообращения (гемолиз), возможно, объясняются тем, что до 50 % введенного антибиотика связываются с белками крови [Справочник по клинической фармакологии и фармакопеи, М, 1987], а образовавшиеся комплексы вызывают указанные нарушения. Стрептомицин в липосомальной форме экранирован ли-пидной мембраной от взаимодействия с белками в кровяном русле, он доставляется непосредственно в клетки, предотвращая образование комплексов и, соответственно, не вызывает выраженных гистологических изменений. При внутримышечном и пероральном поступлении свободного и липосомального ломефлоксацина изменения в организме биологических моделей определялись в виде слабо выраженных дистрофических и пролиферативных процессов, которые быстро восстанавливались до нормы после отмены препарата.

Таким образом, в результате гистологического исследования доказана относительная безвредность для организма белых мышей длительного введения фосфатидилхолинхолестериновых липосом, сконструированных липосомальных форм стрептомицина и ломефлоксацина по сравнению с использованием их в свободной форме при различных способах поступления, а также косвенно подтверждено наличие у липидных везикул неспецифического иммуномодулирующего действия.

Основным показателем эффективности лекарственных препаратов является их биологическая активность. Эффективность сконструированных липосомальных форм антибиотиков в сравнении с их свободными формами оценивали на модели экспериментальных особо опасных инфекций: сибирской язвы, туляремии, чумы и бруцеллеза белых мышей. Полученные данные позволили разработать оптимальные схемы лечения указанных инфекций липосомальными формами антибиотиков. Для лечении экспериментальной сибирской язвы использовали липосомальные формы кефзола и ампициллина, интактные формы которых применяются в настоящее время для лечения сибирской язвы в клинической практике. Оба антибиотика в липосомальной форме проявили выраженное протек-тивное действие при лечении экспериментальной сибиреязвенной инфекции. Оптимальные результаты получены при дозе кефзола, составляющей 200 мкг. В этом случае выживаемость составила 80 %, процент защиты -60 %, а средняя продолжительность жизни увеличилась на 1,3 ± 0,3 сут.

Выживаемость животных, получавших трехкратно липосомальный ампициллин в дозе 1000 мкг/мышь однократно в сутки, достигла 100 %, показатель защиты составил 30 %. Значительный терапевтический эффект липосомальной формы ампициллина выявлен и при более низкой дозе, равной 100 мкг. При этом количество защищенных животных составило 60 %, средняя продолжительность жизни мышей увеличилась на 6,5 ± 0,9 сут по сравнению со свободной формой препарата. Преимущество липосомальной формы ампициллина над его свободной формой было подтверждено и при двукратном курсе антибиотикотерапии: протективный эффект липосомальной формы ампициллина получен как по показателю выживаемости, так и по средней продолжительности жизни инфицированных животных.

На модели туляремийной инфекции белых мышей изучено лечебное действие липосомальных форм стрептомицина и гентамицина. Результаты лечения прямо или косвенно свидетельствовали о преимуществе липо-сомальных форм стрептомицина и гентамицина по сравнению с их ин-тактными формами. Оптимальной схемой явилось внутримышечное введение липосомального стрептомицина в дозе 1,5 мг/мышь пятикратно с интервалом в 24 ч с началом лечения через 1 сутки после заражения, позволяющее повысить эффективность этиотропного лечения экспериментальной туляремии на 25-70 % по сравнению с применением свободного антибиотика Данная схема обеспечила выживаемость 95% взятых в опыт животных.

Оценка биологической эффективности сконструированной липосо-мальной формы стрептомицина дополнительно проверена на модели экспериментальной чумной инфекции при заражении белых мышей вирулентным штаммом Y. pestis 461. Наиболее успешным оказалось пятикратное лечение экспериментальной чумы белых мышей липосомальным стрептомицином в дозе 1,5 мг/мышь с интервалом 24 ч и началом лечения через 24 ч после заражения. Указанная схема обеспечила выживание 97,5 % зараженных животных, процент защиты составил 72,5, что подтвердило высокую эффективность полученного липосомального стрептомицина.

Бруцеллезная инфекция характеризуется развитием выраженной иммунодепрессии, которая, несмотря на лечение антибиотиками, сопровождается сохранением в фагосомах бруцелл, способных к размножению. На фоне подавленной иммунореактивности снижается клинический эффект применения антимикробных средств [Лусс Л.В. с соавт., 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Петров Р.В. с соавт., 2000]. Требуются новые подходы к лечению данного заболевания и, прежде всего, необходима разработка лекарственных препаратов, обеспечивающих воздействие на внутриклеточно расположенных бруцелл [Тихонов Н.Г., 2000; Малецкая

ОБ., 2002].

Учитывая возможность липосом доставлять лекарства внутрь клеток, а также оказывать иммуностимулирующее действие, мы использовали традиционно применяемые для лечения бруцеллеза тетрациклин и си-зомицин в липосомальной форме. Препарат группы фторхинолонов - ло-мефлоксацин, который проникает в ткани и клетки макроорганизма, обусловливает особую актуальность его применения для терапии инфекций с внутриклеточной локализацией возбудителя [Самоходкина Э.Д. с соавт., 2002; Никитин А.В., Литовченко К.В., 2002; Яковлев В.П., Полушкина Н.Р., 2002]. Лечение белых мышей, начиная с 21 сут после инфицирования В. melitensis 565, проводили 2 циклами с интервалом 10 сут. Свободный и липосомальный ломефлоксацин вводили перорально в разовых дозах 1 и 2 мг/мышь, сизомицин - внутримышечно и перорально в разовых дозах 2 мг/мышь, тетрациклин - внутримышечно в дозах 1 и 2 мг/мышь. Свободные антибиотики вводили с интервалом 24 ч, липосомальные - 48 ч. Об эффективности препаратов судили по результатам бактериологического исследования.

Пероральное лечение свободным сизомицином, как и следовало ожидать, оказалось неэффективным, так как сизомицин не всасывается из желудка. При оральном введении липосомального сизомицина в половинной курсовой дозе (10 мг/мышь) индексы высеваемости и обсеменен-ности были достоверно (р<0,01) ниже таковых при использовании свободного антибиотика, а после завершения лечения свободными от бру-целл оказались 10,0 % животных, что доказывает принципиальную возможность орального использования липосомальных форм препаратов, которые в свободной форме не всасываются в желудочно-кишечном тракте. Количество освободившихся от бруцелл мышей., получавших липосо-мальный сизомицин внутримышечно, превышало этот показатель в группе животных, леченных удвоенной курсовой дозой интактного антибиотика (р<0,01), и составляло 76,5 ± 0,5 % и 28,9 ± 0,4 % соответственно.

При использовании тетрациклина наиболее эффективным оказалось лечение липосомальным антибиотиком при курсовой дозе 10 мг. Количество свободных от инфекции животных в этой группе составило 80,8 ± 0,2 % и превысило (р<0,01) данный показатель на 70,0 ±0,1 % по сравнению с лечением свободным тетрациклином в той же дозе.

При лечении свободным ломефлоксацином (табл. 3) в курсовых дозах 10 и 20 мг/мышь после проведения I курса антибиотикотерапии все животные были инфицированы, что свидетельствует об активизации бруцеллезной инфекции после недостаточно эффективной терапии. Через 14 сут после окончания II курса свободными от инфекции были 49,4±0,5 и 64,1 ±0,3 % белых мышей соответственно указанным дозам. Добавление

интактных липосом в схему лечения животных с экспериментальной бруцеллезной инфекцией значительно повышало эффективность специфической терапии.

Таблица 3. Динамика бактериологических показателей при лечении экспериментального бруцеллеза свободным и липосомальным ломефлоксацином

Через 14 дней после

Кур- I курса лечения II курса лечения

Форма ломефлоксацина совая доза (мг) ИВ ИО % свободных от инфекции животных ив ИО % свободных от инфекции животных

свободная 10 0,56 0,33 0 0,35 0,17 49,4±0,5

20 0,36 0,27 0 0,21 0,12 64,1±0,3

5 0,48 0,29 0 0,28 0,13 62,2+0,2

липосомальная

10 0,21 0,14 46,5±0,1 0,12 0,07 89,7±0,3

свободная + пустые липосомы 10 0,41 0,30 0 0,29 0,18 58,8±0,4

пустые липосомы - 0,80 0,71 0 0,65 0,47 0

контроль заражения - 0,91 0,76 0 0,89 0,61 0

Примечание: ИВ — индекс высеваемости; ИО - индекс обсеменен-ности.

Наиболее обнадеживающие результаты получены при лечении липосомальным ломефлоксацином в курсовой дозе 10 мг/мышь. Освобождение организма биологических моделей от бруцелл в этом случае составило 89,7 % ± 0,3 % при двуцикловом курсе терапии в течение 10 сут. Индексы высеваемости и обсемененности в этой группе также были минимальными. Итак, при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции впервые показана высокая эффективность липосомальной формы нового препарата IV поколения фторхинолонового ряда - ломефлокса-цина, разработана рациональная схема лечения данным препаратом, по-

зволяющая снизить курсовую дозу антибиотика, предотвратить рецидивы инфекции и хронизацию процесса в пределах сроков данного исследования.

Классическая серологическая диагностика чумы основана преимущественно на выявлении капсульного антигена Ф1 чумного микроба или антител к нему [Самойлова Л.В. с соавт., 1998]. Будучи видоспецифиче-ским антигеном и основным иммуногенным компонентом возбудителя чумы, Ф1 чумного микроба является важнейшей составной частью большинства современных чумных диагностических и вакцинных препаратов. В настоящее время рассматривается возможность использования липосом в качестве адъювантов для получения поли- и моновалентных гипериммунных сывороток в качестве сырья для производства МИБП [Тюменцева И.С., 1996]. Нами разработана биотехнология получения гипериммунных чумных сывороток при введении животным-продуцентам липосомальной формы антигена Ф1 чумного микроба, пригодных для использования в производстве МИБП.

Липосомы готовили из фосфатидилхолина (ФХ), холестерина (X) и дицетилфосфата (ДЦФ), а также из синтетического фосфолипида димири-стоилфосфатидилэтаноламина (ДМФЭ) и положительно заряженного стеариламина (СА). Вышеупомянутый липидный состав везикул был определен нами по следующим соображениям. Во-первых, ДМФЭ - цвитте-рионный липид с температурой фазового перехода + 48 °С. Высокая температура плавления обеспечивает "жесткость" бислоя в условиях пребывания в организме теплокровного животного [Марголис Л.Б., Нейфах А.А., 1982]. Во-вторых, в бислоях фосфатидилэтаноламина (ФЭ) в отличие от ФХ происходит образование межмолекулярных водородных связей. Вследствие этого полярные головки молекул ФЭ образуют более компактную "сшитую" поверхностную структуру. Из-за более прочного межмолекулярного связывания поверхностная вязкость ФЭ и его температура фазового перехода выше, чем у ФХ [Hayashi M. et al., 1975; Jacobson К., Papahadjopoulos D., 1975]. В-третьих, СА придает липосомам дополнительный положительный заряд, а его раздражающее действие на ткани в месте введения усиливает адъювантные свойства липосом [За-кревский В.И., Плеханова Н.Г., 1990]. Иммуногены вводили кроликам шестикратно внутрикожно по разработанной одноцикловой комбинированной схеме внутрикожной шестикратной иммунизации кроликов. Лучшими антигенными свойствами среди испытанных препаратов обладали липосомы из ДМФЭ и СА с Ф1 чумного микроба (табл. 4).

Таблица 4. Сравнительный анализ специфической активности

сывороток крови кроликов после 6-кратной внутрикожной иммунизации различными препаратами Ф1 чумного микроба

1 ........ I Иммуноген п Средне-геометрический титр антител

И<3 OA HP] ИФ РИД

t* mt** t m, t m,

I Липосомы из ФХ, X 1 и ДЦФ с Ф1 9 5149 +7,2 -6,7 455 • +7,2 -6,7 12 +7,9 -7,3

I Эмульсия из Ф1, ФХ, X и ДЦФ 9 597 +7,2 -6,7 128 +14,9 -13,0 4 -

Липосомы из ДМФЭ, СА с Ф1 9 6472 +16,5 -14,2 796 +7,2 -6,7 12,8 +7,9 -7,3

Эмульсия из Ф1, ДМФЭ и СА 9 1193 +7,9 -7,3 381 +26,6 -21,1 6,36 +16,5 -14,2

Интактная Ф1 9 322 +7,9 -7,3 43 +7,2 -6,7 2 -

Требования регламента [1987] - - - 384 - 12 -

* t - средний геометрический титр антител

** га,- ошибка в определении среднего геометрического титра антител

При этом средние геометрические титры специфических антител в сыворотках крови в НРИФ и РИД достоверно (р<0,01) превышали соответствующие показатели, приведенные в экспериментально-производственном регламенте [1987]. Положительно заряженные липо-сомы с "жесткой" мембраной из ДМФЭ и С А, по-видимому, обеспечивали длительное пребывание антигена в организме, постепенное его высвобождение и взаимодействие с клетками ретикулоэндотелиальной системы. При использовании липосом из ФХ, X и ДЦФ, средние геометрические титры антифракционных антител были достоверно ниже (р<0,01), чем в предыдущей группе, но при этом их значения также удовлетворяли требованиям, предъявляемым к сырью для производства МИБП.

ментально обоснованного подбора состава липосомальных носителей антигена и усовершенствования схем иммунизации.

Способность антигенсодержащих липосомальных везикул влиять на клеточные и гуморальные факторы иммунитета предопределяет интерес исследователей к разработке липосомальных вакцинных препаратов. Эти вакцины, по мнению ряда авторов, являются весьма перспективными для профилактики различных инфекций [Gregoriadis G., 1997; Барсуков Л.И., 1998; Бурханов С.А. с соавт., 1998; Ефременко В.И., 1999; Gluck R., 1999; Мигунов А.И. с соавт., 2001]. На модели экспериментальной чумной инфекции проведена оценка протективной активности инкапсулированных в липосомы антигенов чумного микроба (Ф1 и ЛПС). Изучена зависимость между методом введения (пероральным, внутримышечным, подкожным), липидным составом везикул (синтетические и натуральные) и протективной активностью липосомальной формы Ф1 чумного микроба в дозе 50 мкг/мышь. При подкожном введении выявлено значительное увеличение протективного эффекта в случае иммунизации белых мышей антигеном в липосомальной форме. Величина LD50 для этого препарата составила 3420 ±310 м.к., средняя продолжительность жизни павших - 7,0 ± 0,9 сут, что достоверно отличается от аналогичных показателей при подкожном введении свободного капсульного антигена чумного микроба (р<0,01).

При внутримышечной иммунизации животных протективное действие как свободного, так и липосомального антигена значительно менее выражено по сравнению с подкожным введением препаратов. Это выражается в уменьшении значений LD50 и средней продолжительности жизни павших приблизительно в 2 раза, однако тенденция зависимости степени защитного действия от формы используемого антигенного препарата полностью сохранилась. Самые высокие показатели LD50 заражающего штамма и средней продолжительности жизни мышей, павших от чумы, по-прежнему отмечены в случае использования Ф1, инкапсулированной в липосомальные везикулы

При получении липосом, предназначенных для перорального введения, в фосфатный буфер дополнительно был добавлен додецилсульфат натрия в количестве 0,1 % от общей массы липидов. Кроме этого, в состав бислойных везикул наряду с ФХ введен фосфатидилглицерин (ФГ). Эти компоненты обеспечивают устойчивость липосомального носителя в желудочно-кишечном тракте [Иванова Н.Н. с соавт., 1984; Иванов А.С. с соавт., 1986; Клибанов А.Л. с соавт., 1990]. Пероральная иммунизация белых мышей свободной Ф1 чумного микроба оказалась неэффективной. При поступлении антигена в липосомальной форме значение LD50 Y. pestis 461 на порядок превышало данный показатель контроля и введе-

ния свободной формы Ф1 (112 ±40; 150 ± 46 и 11 ± 4 м.к. соответственно).

Поскольку Ф1 чумного микроба неиммуногенна для морских свинок, мы использовали Ф1 в сочетании с ЛПС чумного микроба в интакт-ной и липосомальной форме по 50 мкг/м.св. подкожно и перорально. Критериями протективного эффекта являлись увеличение средней продолжительности жизни животных и процент защиты. В результате было установлено, что максимальная выживаемость (83,3 %) и средняя продолжительность жизни (10 сут) имели место в группе морских свинок, иммунизированных подкожно липосомальным препаратом Ф1 и ЛПС чумного микроба в одной везикуле. Показатель защиты при этом составил 33,3 %.

В случае пероральной иммунизации Ф1 и ЛПС чумного микроба морские свинки приобретают иммунитет против чумы только после прививки липосомальными антигенами (33,3 %) и не иммунизируются теми же дозами антигенов в свободной форме, которые разрушаются в желудочно-кишечном тракте, теряя свою иммуногенность. Выявленную в экспериментах эффективность липосомальных форм антигенов чумного микроба при пероральном введении белым мышам и морским свинкам можно объяснить воздействием электростатических сил за счет введения в состав липосом отрицательно заряженных ДЦФ и ФГ. Это, вероятно, обусловило повышение прочности липосомальных мембран и, соответственно, возможность доставки антигенов в неизмененной форме в имму-нокомпетентные клетки макроорганизма. Кроме того, известно, что ФГ характеризуется способностью к образованию межмолекулярных водородных связей в отличие от ФХ [Клибанов А.Л. с соавт., 1990], а включение в состав липосом додецилсульфата натрия дополнительно обеспечивает устойчивость везикулярных мембран к действию ферментов желудочно-кишечного тракта [Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Клибанов А.Л. с соавт., 1990].

Активность антигенных препаратов определяется по способности формировать клеточный и гуморальный иммунитет. Определение титров антифракционных антител имеет определенное диагностическое значение и используется в комплексе с другими методами изучения иммунитета при чуме [Руководство по профилактике чумы, 1972]. Поэтому для характеристики сконструированных липосомальных форм антигенов чумного микроба представляла интерес оценка уровня гуморального иммунитета, вырабатываемого в ответ на их введение различными способами в сравнении с иммунизацией животных свободными формами указанных антигенов.

Установлено, что путь введения и форма антигенного раздражителя оказывают существенное влияние на формирование гуморального имму-

нитета. Максимальные среднегеометрические титры антител в РПГА и ИФА имели место при подкожной иммунизации белых мышей липосо-мальной формой Ф1 чумного микроба в дозе 50 мкг/мышь и составили 446 (+30,1; - 23,1) и 2521 (+7,2; -6,7) соответственно. При пероральном введении нативного антигена титры антител в РПГА и в ИФА отсутствовали. В случае пероральной иммунизации белых мышей липосомальной Ф1 средние геометрические титры антител в РПГА и в ИФА достигли 84,5 (+14,1; -12,3) и 274 (+7,2; -6,7) соответственно. Эти показатели статистически достоверно отличались от контроля (р<0,01). Таким образом, полученная липосомальная Ф1 чумного микроба при однократном подкожном или пероральном введении белым мышам обеспечивает гуморальный ответ более высокого уровня по сравнению с использованием аналогичной дозы свободного капсульного антигена.

Морских свинок иммунизировали подкожно и перорально интакт-ными и липосомальными антигенами чумного микроба (Ф1 и Ф1+ЛПС). Наиболее высокий уровень гуморального ответа имел место при подкожном введении морским свинкам липосомальной Ф1 в сочетании с ЛПС чумного микроба. При этом средние геометрические титры в РПГА достигли 1218 (+39,5; -28,1). Этот показатель достоверно (р<0,01) отличался от результатов подкожного введения морским свинкам Ф1 и ЛПС в ин-тактной форме, при котором средние геометрические титры в РПГА составили 420 (+26,6; -21,1). По-видимому, включение в везикулы, наряду с капсульным антигеном, иммуностимулятора ЛПС чумного микроба обеспечивает их взаимодействие с иммунокомпетентными клетками, что в сочетании с адъювантным действием липосом приводит к усилению выработки антифракционных антител, и, соответственно, к повышению уровня гуморального ответа организма морских свинок на антигенный раздражитель.

Подводя итоги экспериментов по иммунизации животных интакт-ными и липосомальными антигенами чумного микроба, можно с уверенностью говорить о преимуществе полученных липосомальных форм антигенов чумного микроба, формирующих более напряженный гуморальный и клеточный иммунитет. Полученные результаты подтверждают данные других исследователей [Закревский В.И, Плеханова Н.Г., 1990; Клибанов А.Л. с соавт., 1990; Тараненко Т.М. с соавт., 1997] о существенной роли липосомального носителя в реализации иммунного ответа организма на введение антигенов чумного микроба.

зволил снизить токсичность технологического процесса, обеспечил достижение сбалансированного эквимолярного соотношения фосфолипидов с липидами мембран клеток макроорганизма. Разработана биотехнология конструирования липосомальных форм антигенов чумного микроба, обеспечивающая сохранение биологической активности антигенов, позволяющая получать липосомы с максимальным включением материала (85 — 90 %), а также наличием значительного количества Ф1 на наружной поверхности мембраны (37,5 - 50 %). Разработана биотехнология приготовления липосомальных форм антибиотиков, отличающихся по структурным, химическим особенностям и свойствам, пригодных для различных путей введения в организм. Впервые проведено сравнительное изучение основных цитоэнзимохимических показателей ПМЯЛ крови экспериментальных животных при введении им липосомальных антибиотиков парентерально и перорально. Доказано снижение иммунодепрессивного действия антибиотиков при включении их в липидные везикулы.

Предложенные биотехнологические приемы стабилизации ли-посомальных композиций включают использование антиоксиданта и лиофильное высушивание липосом. На основании результатов, полученных при разработке биотехнологии ускоренного 14-часового режима лиофильного высушивания жидкого препарата с целью стабилизации его свойств и увеличения срока годности, нами была выбрана эта технология, как более экономичная, позволяющая сократить материальные, энергетические и временные затраты без снижения качества готового продукта. Доказана относительная безвредность полученных липосом и липо-сомальных форм антибиотиков при парентеральном и пероральном введении белым мышам. Установлено, что патоморфологические изменения, происходящие в ответ на введение липосомальных антибиотиков, носят обратимый характер - показатели гомеостаза организма восстанавливаются к исходному уровню после прекращения их введения.

ляемым к сырью, предназначенному для производства МИБП. Экспериментально доказана высокая биологическая эффективность полученных липосомальных форм антигенов чумного микроба, способствующих формированию клеточного и гуморального иммунитета у экспериментальных животных. Проведенные исследования позволяют прогнозировать перспективность использованных нами подходов для конструирования вакцин нового поколения.

В целом, полученные результаты открывают широкие возможности для дальнейшего теоретического и экспериментального изучения липосомальных форм биологически активных веществ в плане усовершенствования биотехнологий их получения и использования в лечении и специфической профилактике особо опасных инфекций, а также при получении сырья для диагностических препаратов.

ВЫВОДЫ

1.Разработана биотехнология получения комплекса фосфолипи-дов из головного мозга млекопитающих, включающая гомогенизацию, обезвоживание и экстракцию исходного сырья ацетоном, экстракцию осадка смесью хлороформа с этанолом, отделение липидной фазы и выделение из нее фосфолипидов добавлением ацетона в соотношении с экстрактом 1,5 - 2,0:1, обеспечивающая уменьшение токсичности технологического процесса и получение сбалансированного эквимо-лярного состава комплекса липидов.

2.При получении липосомальных препаратов капсульного антигена чумного микроба (фракция 1) методом «выпаривания в обращенной фазе» и методом «замораживания-оттаивания» исключен этап ультразвуковой обработки материала, что обеспечивает получение липосом с высоким уровнем включения фракции 1 (до 85-90 %) и адсорбцией значительного количества активного антигена (до 37,5-50 %) на наружной поверхности мембраны липидных везикул.

3.Двухэтапное включение ампициллина, кефзола, стрептомицина, гентамицина, сизомицина, тетрациклина, ломефлоксацина методом «замораживания-оттаивания» в пустые липосомы, приготовленные методом «выпаривания в обращенной фазе», исключающее контакт химиопрепаратов с органическими растворителями, позволяет получать липосомальные формы антибиотиков с сохранением специфической активности, высоким уровнем инкапсулирования (73 - 87 %), более низким уровнем иммунодепрессивного и повреждающего действия на макроорганизм по сравнению со свободными антибиотиками.

4.Использование в качестве среды высушивания сахарозо-желатиновой среды (40 % сахарозы и 10 % желатина) в концентрации 30 % оказывает выраженное защитное действие при сублимации липосомальной формы стрептомицина в ускоренном 14-часовом режиме, обеспечивая формирование хорошо структурированной сухой массы в ампулах в виде однородной плотной непористой таблетки и максимальную стабильность липосомальных везикул в процессе лиофилизации и последующего хранения.

5.Подтверждена высокая биологическая эффективность полученных липосомальных форм антибиотиков в лечении сибирской язвы, туляремии, чумы и разработаны оптимальные схемы лечения данных инфекций в эксперименте. Оптимальными схемами лечения экспериментальной сибирской язвы липосомальными формами ампициллина и кефзола является внутримышечное двукратное введение ампициллина в суточной дозе 100 мкг на мышь (показатель защиты 80 %), трехкратное введение кефзола в суточной дозе 200 мкг на мышь (показатель защиты 60 %) при начале лечения через 24 ч после заражения. Эффективной схемой лечения экспериментальной туляремии липосо-мальной формой стрептомицина является внутримышечное пятикратное введение по 1,5 мг на мышь в сутки (показатель защиты 70 %) при начале лечения через 24 ч после заражения. Оптимальной схемой лечения экспериментальной чумы липосомальной формой стрептомицина является внутримышечное пятикратное введение в суточной дозе 1,5 мг на мышь (показатель защиты 72,5 %) при начале лечения через-24 ч после заражения.

6.Впервые показана высокая терапевтическая эффективность липосомальной формы ломефлоксацина при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции белых мышей. При пероральном десятидневном двуцикловом лечении в курсовой дозе 10 мг на мышь количество животных, свободных от инфекции, увеличивается на 40,3 %. Эффективными являются аналогичные схемы лечения липосомальны-ми сизомицином и тетрациклином. Количество животных, свободных от инфекции, увеличивается соответственно на 47,6 % и на 70,6 % по сравнению с лечением свободными антибиотиками.

7.Разработана биотехнологическая схема иммунизации кроликов Ф1 чумного микроба в липосомах из димиристоилфофатидилэтанола-мина и стеариламина в молярных соотношениях 7:2 или из фосфати-дилхолина, холестерина и дицетилфосфата в молярных соотношениях 7:2:1, обеспечивающая получение гипериммунных антифракционных

сывороток, удовлетворяющих требованиям экспериментально-производственного регламента.

8.Доказана высокая биологическая эффективность сконструированных липосомальных форм фракции 1 и липополисахарида чумного микроба в специфической профилактике чумы в сравнении с их ин-тактными формами. Однократное введение липосомальной формы фракции 1 чумного микроба в дозе 50 мкг на мышь, независимо от способа иммунизации и природы фосфолипидов (животного или синтетического происхождения), индуцирует протективное действие более высокого уровня (в 5,5 - 8,3 раз) по сравнению со свободной формой антигена. Иммунизация морских свинок липосомальными формами фракции 1 (50 мкг) и липополисахарида (50 мкг) чумного микроба повышает показатель защиты животных на 33,3%.

9. Иммобилизация фракции 1 и липополисахарида чумного микроба в липосомы, состоящие из фосфатидилглицерина, дицетилфосфа-та и додецилсульфата натрия защищает данный иммуногенный комплекс от разрушения в желудке, позволяя использовать пероральный метод вакцинации, и потенцирует активизацию неспецифической резистентности у экспериментальных животных. По косвенным показателям противочумного иммунитета (иммуноглобулиногенез) в опытах на белых мышах и морских свинках выявлена большая эффективность сконструированных липосомальных форм чумных антигенов по сравнению с антигенами в свободной форме.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1.Ефременко В.И., Гринько Р.А., Таран Т.В., Б.Ариунсанаа. Изучение стабильности лиофилизированных липосомальных препаратов стрептомицина в процессе длительного хранения //Матер, научно-практич. конф. (16-18 сент. 1997), Саратов, 1997.-Т. 1.- С. 54.

2.Гринько Р.А., Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н., Таран Т.В. Влияние ультразвуковой обработки и ультрафиолетового облучения на уровень деградации фосфолипидов на различных стадиях приготовления липосом //Материал.конф. "Эпидемиол. и клинико-иммунол. аспекты профилактики важнейших инфекционных заболе-ваний".-Астрахань, 1996.-С.110.

3.Гринько Р.А., Таран Т.В., Афанасьев Е.Н. Опыт стабилизации липосомальных препаратов методом сублимации //Матер..конф. "Эпидемиол. и клинико-иммунол. аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний".- Астрахань, 1996.-С.78-79.

4.Гринько Р.А., Ефременко В.И., Таран Т.В., Бямбаагийн А. Лиофилизация липосомальных препаратов стрептомицина и контроль их стабильности на различных этапах исследования //Матер, научно-практ. конф., посвящ. 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания».- Ставрополь, 1997. - С. 249-251.

5.Ефременко В,И., Бямбаа А., Таран Т.В., Таран В.И., Оверченко В.В. Изучение протективных свойств антигенсодержащих липосом при чуме //Материалы научн. конф. «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний», 30 ноября-1 декабря 1998 г., г. Киров, 1998.-С. 26-27.

6.Ефременко В.И., Кузякова Л.М., Таран Т.В., Курилова А.А. Строение, функции, свойства биомолекул, способных формировать бислойную мембрану липосом // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. -Ставрополь, 1998. - 74 с. - Деп. в ВИНИТИ 05.02.99, № 383-В99.

7.Ефременко В.И., Кузякова Л.М., Таран Т.В., Андреева И.Н. Физико-химические и биологические свойства липосом // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. - Ставрополь, 1998. - 82 с. - Деп. в ВИНИТИ 05.02.99, №384-В99.

8.Ефременко В.И., Кузякова Л.М., Таран Т.В. Липосомы -переносчики генетического материала // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. - Ставрополь, 1998. - 76 с. - Деп. в ВИНИТИ 16.12.98, № 3720-В98. 9.Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Малецкая О.В., Таран В.И. Направленный транспорт лекарств с помощью липосом //Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. - Ставрополь, 1998. — 80 с. - Деп. в ВИНИТИ 11.12.98. № 3637-В98.

10. Ефременко В.И., Таран Т.В., Бямбаагийн А., Таран В.И. Пе-роральная иммунизация животных антигенами чумного микроба, иммобилизованными в липосомы //Матер, юбилейной науч. конф. «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний.» (30 ноября - 1 декабря 1998 г.)- Киров, 1998. - С. 410-412.

11. Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Б. Ариунсанаа, Савельева И.В. Методы приготовления липосом. Иммобилизация в липосомы различных веществ, стерилизация и лиофилизация липосом // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. - Ставрополь, 1998. - 92 с. - Деп. в ВИНИТИ 11.12.98, №3636-В98.

12. Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Таран В.И., Савельева И.В. Липосомы в диагностических системах // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. - Ставрополь, 1998. - 88 с. - Деп. в ВИНИТИ 16.12.98г,№3721-В98.

13. Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л^., Maлецкaя О.В., Aриyнсaнaa Б., Курилова A.A., Оверченко В.В. Липосомы в иммунологических исследованиях // Ставроп. н.-и. противочумн. ин-т. -Ставрополь, 1998.-92 с.-Деп. в ВИНИТИ 16.12.98. №3719-В98.

14. Бямбаа A., Ефременко В.И., Таран Т.В., Волохова ИА. Сравнительное изучение протективной активности антигенов чумного микроба в свободной и липосомальной формах в зависимости от способа введения //Деп.в ВИНИТИ 28.01.00., № 174-ВОО.

15. Брюханов A.Ф., Тихенко Н.И., Таран Т.В., Цыганкова P.E. О влиянии липосомальных препаратов на изоферментный спектр лак-татдегидрогеназы //Эрдэм шинжилгээний бутээл.- Улаанбаатар, 1999.-№7.-С. 232-233.

16. Ефременко В.И., Бямбаа A., Таран Т.В. Специфическая профилактика чумы липосомальными формами антигенов чумного микроба // Научный журнал «Эрдэм шинжилгээний бутээл» (Mонголия), 1999, № 7, С. 233-234.

17. Efremenko V.I., Ariunsanaa В., Taran T.V. Peroral immunization of animal antigens of plague microbe which is immobilized in liposome //Scientific journal centre for control and research of natural infectious diseases (Ulanbator), 2000, № 8, P. 33-35.

18. Maлецкaя О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Лямкин Г.И., M^ci^a Е.Н., Оверченко В.В., Ляпустина Л.В., Соколова ИА Использование липосомальных форм антибактериальных и иммуномо-дулирующих препаратов в лечении инфекционных заболеваний — Ставропол.н-и противочум.и-нт. - Ставрополь, 2000. - 19 с. - Библи-огр. 73 назв. - Рус. - Деп. в ВИНИТИ 28.12.00, № 3307-ВСЮ.

19. Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л^., Maлецкaя О.В., Mисетовa Е.Н., Оверченко В.В., Савельева И.В. Биотехнология выделения из растительного и животного сырья фосфолипидов, используемых для получения липосом // Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы: Сб. матер, науч.-практич. конф. - Киров, 2001. -С. 121-122.

20. Оверченко В.В., Ефременко В.И., Коготкова О.И., Зайцев A.A., Еременко Е.И., Maлецкaя О.В., Бондаренко АИ., Таран Т.В. Эффективность липосомальных форм антибиотиков при сибирской язве //Aктyaльные аспекты природноочаговых болезней /Maтериaлы межрегиональной науч.-практич. конф. 16-17 окт. 2001 г - Омск, 2001.-С.215-216.

21. Таран Т.В., Ефременко В.И., Maлецкaя О.В., Mисетовa Е.Н.

Изучение активности липосомальных антибиотиков in vitro в отношении различных штаммов бруцелл //Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. /Материалы междунар. науч.-практич. конф. «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы». - Алматы, 2001. - Вып.З.- С. 248-251.

22. Ефременко В.И., Таран Т.В., Бондаренко А.И., Малецкая О.В., Мисетова Е.Н., Зайцев А.А. Структура и размеры фос-фолипидных везикул, полученных разными методами // Материалы междунар. науч.-практич. конф. «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы - Алматы, 2001.- Вып.З.- С. 303-

23. Таран Т.В., Ефременко В.И., Малецкая О.В., Кузякова Л.М., Мисетова Е.Н. Уровень включения антибиотиков в зависимости от способа получения липосом //Материалы междунар. науч.-практич. конф. «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы» - Алматы, 2001.- Вып. 4.- С. 273-276.

24. Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Малецкая О.В., Мисетова Е.Н., Оверченко В.В., Савельева И.В. Использование липосомальных антигенов для получения гипериммунных сывороток //Сб. матер, науч.-практ. конф. «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы», Киров, 22-23 мая 2001г. С 24-25.

25. Taran T.V., Efremenco V.I., Ariunsanaa В. Use of the liposomal form of Yersinia pestis fraction 1 for the production of hyperimmune sera //Байгалийм голомтот халдварт эвгим (Эрдем шиажил гээний бага хурлым илтгэлийн хураанчуй) 2001оны 12-р сарын 6 Natural infections disease Abstract of scientific conference 6 December 2001.- Ulaanbaatar. -P. 64-66.

26. Малецкая О.В. , Таран Т.В., Ефременко В.И., Лямкин Г.И., Умнов А.В., Логвиненко О.В., Ляпустина Л.В., Мисетова Е.Н., Бондаренко А.И. Эффективность липосомального меропенема при экспериментальной бруцеллезной инфекции //Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: Сб. матер, науч.-практич. конф. - Астрахань, 2001. - С.

27. Малецкая О.В. Лямкин Г.И. , Логвиненко О.В., Ляпустина Л.В., Таран Т.В., Соколова И.А., Дальвадянц В.Г. Течение инфекционного процесса при лечении экспериментального бруцеллеза в зависимости от времени и кратности введения ликопида //Природно-оча-говые особо опасные инфекции на Юге Росс ' и

304.

207-208.

лабораторная диагностика: Сб. матер, науч.-практич. конф. - Астрахань, 2001.- С.204-206.

28. Мисетова Е.Н., Ефременко В.И., Таран Т.В., Логвиненко О.В., Малецкая О.В. Борздова И.Ю. Влияние липосом на функциональную активность полиморфноядерных лейкоцитов //Материалы УШ Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (26-28 марта 2002 г., Москва), Москва, РОСИНЭКС, 2002.- Т. 2.-С. 205-206.

29. Таран Т.В., Малецкая О.В.,Мисетова Е.Н., Ефременко В.И., Логвиненко О.В., Борздова И.Ю. Изучение эффективности липосомальной формы азитромицина при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции //Материалы УШ Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (26-28 марта 2002 г., Москва), Москва, РОСИНЭКС, 2002.- Т.4.-С. 119-120.

30. Taran T.V., Efremenco V.I., Ariunsanaa В. Use ofthe liposomal form of Yersinia pestis fraction 1 for the production of hyperimmune sera //«Natural infectious disease» Scientilic conference.- Ulaanbatar, 2002.- P. 101-102.

31. Таран Т.В. Протективные свойства фракции 1 чумного микроба, иммобилизованной в липосомы, при подкожном и пероральном введении в эксперименте //Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. тр. -Саратов.-2002.-Вып. 1 [83].-С. 129-134.

32. Таран Т.В., Ефременко В.И., Малецкая О.В., Коготкова О.И., Тихенко Н.И., Мисетова Е.Н. Разработка схем лечения экспериментальных инфекций (бруцеллез, туляремия, сибирская язва) липосо-мальными антибиотиками //Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. тр. -Саратов.-2002.-Вып. 1 [83].-С. 134-141.

33. Коготкова О.И., Оверченко В.В., Ефременко В.И., Таран Т.В. Повышение эффективности антибиотикотерапии сибирской язвы в эксперименте //Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - Т. 47. - № 12. -С.27-30.

34. Таран Т.В. Лечение экспериментального бруцеллеза свободным и липосомальным ломефлоксацином //Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Сб. науч. тр. - Алматы. - 2003. - Вып.6. — С.14-16.

35. Таран Т.В. Липосомальная форма сизомицина в лечении экспериментального бруцеллеза //Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Сб. науч. тр. - Алматы. - 2003. - Вып.7. - С.21-26.

36. Таран Т.В. Использование липосомальной формы тетрацик-

лина в лечении экспериментального бруцеллеза белых мышей //Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Сб. науч. тр. -Алматы. - 2003. - Вып.7. - С.26-29.

37. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Лямкин Г.И., Ляпустина Л.В., Соколова И.А. Влияние липосомальных форм докси-циклина и гентамицина на эффективность лечения экспериментального хронического бруцеллеза // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: Сб. науч. тр. - Алматы. - 2003. - Вып.4. - С.233-236.

38. Таран Т.В. Лечение экспериментального бруцеллеза липосо-мальным ломефлоксацином и тетрациклином //Проблемы ООИ. -Саратов, 2003.-Вып. 85.-С.101-145.

39. Таран Т.В. Конструирование и характеристика липосом с капсульным антигеном чумного микроба, приготовленных различными методами //Проблемы ООИ. - Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 151157.

40. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Лямкин Г.И., Мисетова Е.Н., Умнов А.В., Бондаренко А.И., Ляпустина Л.В., Соколова И.А. Новые подходы к лечению бруцеллеза //Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2003. - № 6. - С. 34-36.

41. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Логвиненко О.В., Лямкин Г.И., Руднев СМ., Ляпустина Л.В., Пашнева Е.И.Влияние липосом на состояние интралейкоцитарных бактерицидных систем клеток крови при бруцеллезе //Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров. -2003.-С. 93-95.

42. Таран Т.В. Влияние интактных и липосомальных антибиотиков на неспецифические показатели иммунитета экспериментальных животных //Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров. - 2003. - С. 115-116.

43. Малецкая О.В., Таран Т.В., Ефременко В.И., Логвиненко О.В., Лямкин Г.И., Руднев СМ., Ляпустина Л.В., Пашнева Е.И. Влияние липосом на состояние интралейкоцитарных бактерицидных систем клеток крови при бруцеллезе //Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров. - 2003. - С. 93-95.

44. Таран Т.В. Изучение иммуномодулирующего и повреждающего действия фосфатидилхолестериновых липосом при длительном введении экспериментальным животным //Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров. -

2003.-С. 117-118.

45. Таран Т.В., Малецкая О.В., Ефременко В.И., Логвиненко О.В., Борздова И.Ю., Пашнева Е.И. Изучение иммуномодулирующего действия липосом на уровне маркерных показателей ПМЯЛ крови белых мышей //Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров. - 2003. - С. 118-119.

ТАРАН Татьяна Викторовна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ЛР № 020326 от 20 января 1997 г.

Сдано в набор 28.10.04. Подписано в печать 28.10.04. Формат 60x84 'Дв Бумага типогр. № 2. Печать офсетная. Гарнитура офсетная. Усл. печ. 2,3. Уч.-изд. л. 2,5. Заказ 1688. Тираж 100 экз.

Ставропольская государственная медицинская академия, 355024, г. Ставрополь, ул. Мира, 310.

»21560

РНБ Русский фонд

2005-4 19154

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Таран, Татьяна Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТРЫ.

1.1 Принципы включения в липосомы веществ различной химической природы и стабилизации липосом. Влияние ли-пидных везикул на гомеостаз макрооргаиизма.

1.2 Использование липосом для конструирования вакцин и лечения особо опасных инфекций.

1.2.1 Липосомы в иммунологических исследованиях.

1.2.2 Лечение особо опасных зоопозных инфекций липо-сомальными формами антибиотиков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы исследования.

2.2 Методы исследования.

3 ВЫДЕЛЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЛИПОСОМ.

3.1 Разработка биотехнологии экстракции и очистки фосфоли-пидов из головного мозга крупного рогатого скота.

3.2 Основные физические параметры липосом, полученных различными методами.

4 БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИБИОТИКОВ И АНТИГЕНОВ, ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА.

4.1 Разработка биотехнологии получения липосом с антигенами чумного микроба.

4.1.1 Включение в липосомы Ф1 чумного микроба.

4.1.2 Включение в липосомы ЛПС чумного микроба.

4.2 Оптимизация включения антибиотиков в липосомы.

4.2.1 Оценка влияния полученных липосом и липосомальных форм антибиотиков на факторы неспецифической резистентности макроорганизма в эксперименте.

5 СТАБИЛИЗАЦИЯ ЛИПОСОМ С ВКЛЮЧЕННЫМИ АНТИБИОТИКАМИ И ОЦЕНКА ИХ БЕЗВРЕДНОСТИ ДЛЯ МАКРООРГАНИЗМА.

5.1 Стабилизация липосомальных форм антибиотиков методом лиофильного высушивания.

5.2 Изучение защитного действия а-токоферола ацетата от пе-рекисного окисления свободных и липосомальных липидов на разных стадиях их приготовления и хранения.

5.3 Оценка безвредности полученных липосом и липосомальных антибиотиков для макроорганизма в эксперименте.

6 ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СКОНСТРУИРОВАННЫХ ЛИПОСОМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АНТИБИОТИКАМИ, РАЗРАБОТКА СХЕМ ЛЕЧЕНИЯ.

6.1 Лечение экспериментальной сибиреязвенной инфекции ли-посомальными антибиотиками.

6.2 Лечение экспериментальной туляремийной инфекции ли-посомальными антибиотиками.

6.3 Лечение экспериментальной чумы липосомальным и свободным стрептомицином.

6.4 Лечение экспериментального бруцеллеза липосомальными антибиотиками.

7 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИПОСОМ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АНТИГЕНАМИ ЧУМНОГО МИКРОБА В РАЗРАБОТКЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК И ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЧУМЫ

7.1 Биотехнология получения гипериммунных кроличьих ан<тифракционных сывороток.

7.2 Применение сконструированных липосомальных форм антигенов чумного микроба в специфической профилактике экспериментальной чумы.

7.2.1 Оценка протективного действия липосомальной фракции 1 чумного микроба в эксперименте

7.2.2 Оценка гуморального ответа при иммунизации липосомальными формами антигенов чумного микроба в эксперименте

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнология получения лекарственных и иммуногенных липосомальных композиций, используемых в лечении экспериментальных особо опасных инфекций и получении сырья для производства медицинских иммунобиол"

Актуальность проблемы

Возрастающий интерес к разработке биотехнологий получения различных липосомальных форм БАВ обусловлен значительным расширением использования липосом во многих областях медицинской науки и практики. Существуют методы изготовления липосом, позволяющие получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема. Тем не менее, в зависимости от цели конструирования липосомальных форм биологически активных веществ необходима разработка технологий включения в липосомы конкретных препаратов. Важную роль также играет разработка биотехнологии получения и очистки сырья для производства липосом - фосфолипидов.

В специальной литературе достаточно широко представлены результаты лечения особо опасных зоонозных инфекций липосомальными антибиотиками [43, 66, 98, 99, 129, 141, 153, 156, 160, 192, 193, 294]. Однако не удалось найти сведений о разработке унифицированной биотехнологии включения различных антибиотиков в липидные везикулы с проведением оценки включения материала, сохранения специфической активности и эффективности in vivo на модели экспериментальных инфекций. Кроме того, известно, что антибиотики с высокой антибактериальной активностью часто оказывают иммунодепрессивное действие на организм [138]. Поэтому значительный интерес представляет оценка влияния полученных липосомальных антибиотиков на факторы неспецифической резистентности макроорганизма.

Вступая в различные взаимодействия с клетками макроорганизма, компоненты бислойной мембраны липосом активно включаются в метаболические процессы, вызывая определенные изменения функционального состояния отдельных органов и систем организма [56, 94]. Однако в доступной литературе практически отсутствуют данные о морфологических изменениях в макроорганизме при поступлении липосом и липосо-мальных антибиотиков. Таким образом, значительный интерес представляет оценка возможных повреждений макроорганизма в ответ на введение сконструированных липосом и липосомальных форм антибиотиков.

Актуальной остается проблема получения иммунных чумных сывороток как сырья для производства МИБП [89]. В литературе представлены лишь единичные работы, где для получения иммунных сывороток предприняты попытки использования липосом в качестве адъювантов и контейнеров для антигенов [55, 196, 197].

Липосомальные вакцины, содержащие различные антигены, активно влияют на клеточные и гуморальные факторы иммунитета [93, 124, 269]. Создание новых типов иммунопрофилактических препаратов на основе включенных в липосомы видоспецифических и протективных антигенов чумного микроба представляет одно из перспективных направлений в области разработки способов эффективной защиты от чумной инфекции [49, 71, 188]. Поэтому разработка биотехнологии получения липосомальных композиций антигенов чумного микроба, эффективных в специфической профилактике чумной инфекции, представляется необходимой и своевременной.

Основные задачи исследования:

2. Разработать биотехнологию приготовления липосом с эффективным включением антигенов чумного микроба во внутренний объем и на наружную поверхность мембраны

3. Разработать биотехнологию включения в липосомы антибиотиков, отличающихся по структурным, химическим особенностям и свойствам. Оценить влияние полученных липосомальных антибиотиков на неспецифическую резистентность макроорганизма в эксперименте

4. Разработать биотехнологические приемы стабилизации липосомальных композиций и оценить безвредность полученных липосомальных форм БАВ для лабораторных животных

5. Оценить биологическую эффективность полученных липосомальных форм антибиотиков при лечении особо опасных зоонозных инфекций в эксперименте и разработать схемы адекватной терапии.

6. Отработать с использованием липосомальной формы фракции 1 чумного микроба биотехнологию получения гипериммунных сывороток, оценить протективную и гуморальную активность полученных липосомальных антигенных композиций в эксперименте

Впервые изучено влияние липосомальных форм антибиотиков на показатели неспецифической резистентности макроорганизма, определены механизмы иммуностимулирующего действия липосом с антибиотиками на уровне интралейкоцитарных микробицидных и энергетических систем ПМЯЛ крови. Разработана биотехнология стабилизации липосомальных форм антибиотиков, сохраняющих специфическую активность инкапсулированных антибиотиков в течение 2 лет хранения, включающая использование антиоксиданта и лиофильного высушивания, позволяющая уменьшить экономические и временные затраты. Впервые по патоморфо-логическим критериям доказана относительная безвредность длительного введения липосомальных антибиотиков для экспериментальных животных.

При использовании Ф1 чумного микроба, инкапсулированной в ли-посомы из ДМФЭ и СА, разработана биотехнология получения гипериммунных сывороток, соответствующих требованиям экспериментально-производственного регламента [1987], предъявляемым к оценке сырья для производства МИБП. Результаты иммунопрофилактики экспериментальной чумы сконструированными липосомальными формами антигенов чумного микроба являются научно-экспериментальным обоснованием для создания липосомальных химических вакцин для парентерального и перо-рального использования.

Практическая и теоретическая значимость работы. Результаты исследования имеют как теоретическое, так и практическое значение, поскольку впервые в рамках одной работы представлены новые аспекты биотехнологии получения, оценки эффективности и использования липосомальных форм БАВ. Разработана технологическая схема экстракции фос-фолипидов из головного мозга крупного рогатого скота, позволяющая исключить из технологического процесса токсичные вещества, повысить выход продукта и обеспечивающая достижение сбалансированного экви-молярного соотношения фосфолипидов с липидами мембран клеток макроорганизма. По предложенной биотехнологии экстракции липидов составлены Технические условия ТУ- 9154-001-01897080 - 2004 «Фосфо-липиды для получения липосом», утвержденные заместителем главного государственного санитарного врача РФ Беляевым Е.Н. (письмо № 12 ФЦ/2514 А от 19 августа 2004 г.). На разработанную биотехнологию получения липосомальных форм антибиотиков и антигенов чумного микроба составлен регламент производства «Липосомальная основа для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов», утвержденный директором института проф. Ефременко В.И. (протокол Ученого совета № 4 от 20 апреля 2004 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

2. Методы «обращения фаз» и «замораживания-оттаивания» в использованной модификации позволяют получать липосомы с максимальным включением Ф1 чумного микроба и обеспечивают адсорбцию значительного количества антигена на наружной поверхности мембран.

4. Разработанная биотехнология лиофилизации с использованием а-токоферола ацетата в концентрации 0,5 мг на 1 г липидов и защитной сахарозо-желатиновой среды позволяет получить липосомальные формы антибиотиков, сохраняющие специфическую активность в течение 2 лет.

5. Разработанные схемы этиотроппого лечения экспериментальной сибирской язвы, туляремии, чумы, бруцеллеза липосомальными антибиотиками для парентерального и перорального путей введения, позволяют уменьшить кратность лечения, снизить курсовые дозы препаратов и повысить эффективность терапии по сравнению с использованием их свободных форм.

6. Разработанная биотехнология получения гипериммунных сывороток к Ф1 чумного микроба, инкапсулированной в липосомы из ДМФЭ и СА, обеспечивает получение антифракционных кроличьих сывороток, удовлетворяющих требованиям оценки сырья, предъявляемым экспериментально-производственным регламентом [1987].

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на итоговых научных конференциях Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (г. Ставрополь, 1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001 гг.), на научпо-практической конференции, посвященной 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания» (г. Ставрополь, 1997), на научной конференции Ставропольской государственной медицинской академии (г. Ставрополь, 1997 г.), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 1998), на научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (г. Киров, 2001г.), на научно-практической конференции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (г. Астрахань, 2001 г.), на научно-практической конференции «Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане» (г. Алма-Ата, 2001 г.), на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Омского НИИПИ «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней» (г. Омск, 2001 г.), на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002 г.), на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (г. Ставрополь, 15-16 октября 2002 г.), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологической безопасности Российской Федерации», посвященной 75-летию образования НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 10 НИР, отражено в 45 опубликованных научных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей, депонированных — 9 статей, в иностранных журналах — 5 публикаций). Получено 2 патента на изобретения и 2 положительных решения о выдаче патента на изобретение.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Таран, Татьяна Викторовна

выводы

1. Разработана биотехнология получения комплекса фосфолипидов из головного мозга млекопитающих, включающая гомогенизацию, обезвоживание и экстракцию исходного сырья ацетоном, экстракцию осадка смесью хлороформа с этанолом, отделение липидной фазы и выделение из нее фосфолипидов добавлением ацетона в соотношении с экстрактом 1,5 — 2,0:1, обеспечивающая уменьшение токсичности технологического процесса и получение сбалансированного эквимолярного состава комплекса липидов.

2. При получении липосомальных препаратов капсульного антигена чумного микроба (фракция 1) методом «выпаривания в обращенной фазе» и методом «замораживания-оттаивания» исключен этап ультразвуковой обработки материала, что обеспечивает получение липосом с высоким уровнем включения фракции 1 (до 85-90 %) и адсорбцией значительного количества активного антигена (до 37,5-50 %) на наружной поверхности мембраны липидных везикул.

3. Двухэтапное включение ампициллина, кефзола, стрептомицина, гентамицина, сизомицина, тетрациклина, ломефлоксацина методом «замораживания-оттаивания» в пустые липосомы, приготовленные методом «выпаривания в обращенной фазе», исключающее контакт химиопрепаратов с органическими растворителями, позволяет получать липосомальные формы антибиотиков с сохранением специфической активности, высоким уровнем инкапсулирования (73 - 87 %), более низким уровнем иммунодепрессивного и повреждающего действия на макроорганизм по сравнению со свободными антибиотиками.

4. Использование в качестве среды высушивания сахарозо-желатиновой среды (40 % сахарозы и 10 % желатина) в концентрации 30 % оказывает выраженное защитное действие при сублимации липосомальной формы стрептомицина в ускоренном 14-часовом режиме, обеспечивая формирование хорошо структурированной сухой массы в ампулах в виде однородной плотной непористой таблетки и максимальную стабильность липосомальных везикул в процессе лиофилизации и последующего хранения.

5. Подтверждена высокая биологическая эффективность полученных липосомальных форм антибиотиков в лечении сибирской язвы, туляремии, чумы и разработаны оптимальные схемы лечения данных инфекций в эксперименте. Оптимальными схемами лечения экспериментальной сибирской язвы липосомальными формами ампициллина и кефзола является внутримышечное двукратное введение ампициллина в суточной дозе 100 мкг на мышь (показатель защиты 80 %), трехкратное введение кефзола в суточной дозе 200 мкг на мышь (показатель защиты 60 %) при начале лечения через 24 ч после заражения. Эффективной схемой лечения экспериментальной туляремии липосомальной формой стрептомицина является внутримышечное пятикратное введение по 1,5 мг на мышь в сутки (показатель защиты 70 %) при начале лечения через 24 ч после заражения. Оптимальной схемой лечения экспериментальной чумы липосомальной формой стрептомицина является внутримышечное пятикратное введение в суточной дозе 1,5 мг на мышь (показатель защиты 72,5 %) при начале лечения через 24 ч после заражения.

6. Впервые показана высокая терапевтическая эффективность липосомальной формы ломефлоксацина при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции белых мышей. При пероральном десятидневном двуцикловом лечении в курсовой дозе 10 мг на мышь количество животных, свободных от инфекции, увеличивается на 40,3 %. Эффективными являются аналогичные схемы лечения липосомаль-ными сизомицином и тетрациклином. Количество животных, свободных от инфекции, увеличивается соответственно на 47,6 % и на 70,6 % по сравнению с лечением свободными антибиотиками.

7. Разработана биотехнологическая схема иммунизации кроликов Ф1 чумного микроба в липосомах из димиристоилфофатидилэтанола-мина и стеариламина в молярных соотношениях 7:2 или из фосфати-дилхолина, холестерина и дицетилфосфата в молярных соотношениях 7:2:1, обеспечивающая получение гипериммунных антифракционных сывороток, удовлетворяющих требованиям экспериментально-производственного регламента.

8. Доказана высокая биологическая эффективность сконструированных липосомальных форм фракции 1 и липополисахарида чумного микроба в специфической профилактике чумы в сравнении с их ин-тактными формами. Однократное введение липосомальной формы фракции 1 чумного микроба в дозе 50 мкг на мышь, независимо от способа иммунизации и природы фосфолипидов (животного или синтетического происхождения), индуцирует протективное действие более высокого уровня (в 5,5 - 8,3 раз) по сравнению со свободной формой антигена. Иммунизация морских свинок липосомальными формами фракции 1 (50 мкг) и липополисахарида (50 мкг) чумного микроба повышает показатель защиты животных на 33,3%.

9. Иммобилизация фракции 1 и липополисахарида чумного микроба в липосомы, состоящие из фосфатидилглицерина, дицетилфос-фата и додецилсульфата натрия защищает данный иммуногенный комплекс от разрушения в желудке, позволяя использовать перораль-ный метод вакцинации, и потенцирует активизацию неспецифической резистентности у экспериментальных животных. По косвенным показателям противочумного иммунитета (иммуноглобулиногенез) в опытах на белых мышах и морских свинках выявлена большая эффективность сконструированных липосомальных форм чумных антигенов по сравнению с антигенами в свободной форме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возрастающий интерес к разработке биотехнологий получения различных липосомальных форм БАВ обусловлен значительным расширением использования липосом во многих областях науки и практики. Предложены сотни разнообразных методов приготовления липосом, позволяющих получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема, а также способы иммобилизации в них веществ различной химической природы. Однако для серийного производства липосомальных препаратов необходима разработка биотехнологий получения конкретных липосомальных форм БАВ с заданными физико-химическими и биологическими свойствами.

Липосомальные формы антибиотиков и антигенов в настоящее время широко используются для разработки лечения [43, 66, 97, 99, 129, 141, 153, 156, 166, 192, 294] и иммунопрофилактики экспериментальных особо опасных инфекционных заболеваний [48, 71, 188]. Поэтому представляется актуальной разработка биотехнологий получения липосомальных форм антибиотиков и антигенов чумного микроба с высоким уровнем включения и сохранением биологической активности инкапсулируемых препаратов, безвредных при введении в организм, стабильных при длительном хранении и обладающих более высокой биологической эффективностью в сравнении с интактными формами.

Бислойная мембрана липидных везикул состоит из фосфолипидов, обладающих амфипатическими свойствами, и по структуре сходна с мембранами эукариотических клеток. Расширение и уточнение знаний о липидах приводит к новому пониманию функций этих соединений, к восприятию их как биологически активных веществ (209). Одним из условий эффективности липосомальных препаратов является сродство состава их мембран к клеточной структуре различных тканей макроорганизма, что обеспечивается сбалансированным эквимолярным соотношением фосфолипидов [56]. Поэтому в липосо-мологии большое значение имеет разработка эффективных биотехнологий экстракции фосфолипидов из различного сырья. Исследованиями Калюжина О.В. [85] установлено, что наиболее богатый спектр фосфолипидов в эквимолярном соотношении имеется в головном мозге крупного рогатого скота.

Для получения ФЛ животного происхождения традиционно используется азеотропная хлороформно-метанольная смесь с последующей фильтрацией, выпариванием органического растворителя на роторном испарителе и растворением липидной пленки в хлороформе [154]. Известны также способы получения ФЛ, включающие экстракцию этиловым спиртом, перераспределение липидов в диэтиловом эфире и осаждение ацетоном (169, 332). Недостатком вышеперечисленных способов является наличие в препаратах примесей ганглиози-дов и других липидов, экстрагируемых данной смесью и трудоемкость процесса, связанная с необходимостью использования роторного испарителя. Учитывая эти недостатки, а также выраженную токсичность метанола мы произвели замену метилового спирта на этанол, взятый в фармакопейной концентрации 95%. Эта более безопасная и экологически совершенная технология обеспечивала идентичность результатов.

Разработанная биотехнология экстракции липидов из головного мозга крупного рогатого скота (серого и белого вещества) заключается в использовании хлороформно-этанольной смеси для экстракции липидов с последующим их осаждением путем добавления к пробе ацетона. Экстракция осадка смесью хлороформа с этанолом обеспечила полное выделение липидов и повышение выхода целевого продукта, упростила процесс отделения липидной фазы и позволила исключить из технологического процесса токсичные вещества при достижении сбалансированного эквимолярного соотношения ФЛ с липи-дами мембран клеток макроорганизма. Схема позволяет получить комплекс липидов (цереброзиды - 16,6 %; фосфатидилэтаноламин — 16,6 %; фосфатидилхолин - 8,3 %; сфингомиелин - 8,3 %; фосфати-дилсерин - 6,25 %; фосфатидилинозит - 6,25 %; холестерин - 16,6 %) с выходом целевого продукта 1,4 % от массы исходного сырья, пригодный для приготовления липосом различными методами, и может быть использована в технологии получения исходного материала для липосомальных форм лекарственных препаратов.

Выбор метода конструирования липосом определяется целью работы, природой включаемого вещества и его расположением в бис-лойных везикулах (во внутреннем объеме или в бислойной мембране), причем практически во всех случаях желательно включение максимального количества нативного материала (100). Целью следующего раздела работы явилась оценка пригодности различных способов для конструирования липосом с максимальным внутренним объемом. Наиболее крупные липосомы были получены при "ручном встряхивании (200-1900 нм) и "замораживании-оттаивании" (150-1500 нм), величина удельного внутреннего объема липосом при этом составила 5 и 10 л/моль липида соответственно. Везикулы, приготовленные "эта-нольной инжекцией" и "выпариванием в обращенной фазе" имели размеры 100-850 нм и внутренний объем 1,7 и 9 л/моль липида соответственно. Обработанные ультразвуком липосомы были более однородными по размерам и очень мелкими: средний диаметр около 12 нм, удельный внутренний объем составил 1 л/моль липидов. Таким образом, липосомы с максимальным внутренним объемом получены методами «замораживания-оттаивания» и «выпаривания в обращенной фазе».

При разработке биотехнологии получения липосомальных форм антигенов чумного микроба использованы методы «замораживания-оттаивания» и «выпаривания и обращения фаз», проведена их оценка в плане эффективного включения Ф1 чумного микроба с сохранением биологических свойств и количества антигена, связанного с наружной поверхностью мембран. При осуществлении метода «обращения фаз» для исключения прооксидантного влияния на антигены ультразвука липиды перемешивали с водной фазой при помощи скоростного миксера, В результате получены липосомы с уровнем включения капсульного антигена чумного микроба 85 %, а содержание Ф1 в липосомах составило 50 г на 10 моль липидов. При этом на наружной поверхности липидных мембран было иммобилизовано 18,75 г/10 моль липидов или 37,5 % от общего включения антигена.

При включении Ф1 чумного микроба в липосомы методом «замораживания-оттаивания» использовали модификацию, предложенную Клибановым A.JI. с соавт. [92] для инкапсулирования в липосомы веществ, чувствительных к воздействию ультразвука. Включение материала в результате достигло 90 %, а содержание капсульного антигена в липосомах составило 56,7 г на 10 моль липидов. Иммобилизация антигена на наружной поверхности липидных мембран составила 28,35 г/10 моль липидов или 50 % от общего включения фракции 1. Последняя характеристика представляется нам особенно важной, поскольку известно, что наличие антигенных детерминант на наружной поверхности мембран является важным условием формирования выраженного иммунного ответа [70]. Известно, что в состав капсульного антигена входят три фракции липидов, идентифицированные как ФЭ, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты [32]. Наличие липидов, по-видимому, обусловливает способность Ф1 в значительных количествах адсорбироваться на поверхности липосом путем встраивания липидных участков антигена в бислойную фосфолипидную мембрану везикул без использования каких-либо специальных приемов.

В целях сохранения биологической активности материала приготовление липосомальных форм антибиотиков проводили в два этапа — получение «пустых» липосом из ФЛ методом «выпаривания в обращенной фазе» и последующее включение в них антибиотиков методом «замораживания-оттаивания» для исключения контакта препаратов с органическими растворителями. В результате формировались бислойные везикулы с иммобилизованными антибиотиками: стрептомицином, гентамицином, сизомицином, тетрациклином, кефзолом, ампициллином, ломефлоксацином. Процент иммобилизации составил 64±1,6 — 88,Oil,6 % в зависимости от конкретного антибиотика.

Известно, что многие высокоактивные антибиотики обладают иммунодепрессивным действием, приводят к нарушению фагоцитарной функции преходящего характера [135]. Как высокочувствительный индикатор фагоциты являются информативным показателем нарушения иммунного гомеостаза при ряде заболеваний [94, 185, 195, 212]. Следовательно, весьма важной является оценка возможного им-мунодепрессивного действия полученных липосом и липосомальных форм антибиотиков. Анализируя количественные результаты цитохимического исследования активности кислородзависимой (МПО) и кислороднезависимой (КБ) биоцидных систем, а также уровня содержания гликогена ПМЯЛ крови при длительном введении интактных липосом различными способами, необходимо отметить, что на 24 сут исследования значения большинства ЦХП оставались выше уровня фоновых величин. Иными словами, введение пустых липосом обеспечивало усиление реактивности гранулоцитов, в результате чего после отмены липосомальных препаратов ферментные системы нейтрофи-лов оставались в активизированном состоянии. Таким образом, результаты цитоэнзимохимического исследования косвенно подтверждают наличие у липосом иммуностимулирующих свойств и позволяют объяснить механизм иммуномодулирующего действия фосфо-липидных везикул на уровне полиморфноядерных лейкоцитов крови.

Введение белым мышам ампициллина, кефзола, стрептомицина, ломефлоксацина и тетрациклина в свободной форме на 3-14 сут исследования вызывало понижение содержания КБ и гликогена, а также активности МПО в ПМЯЛ крови в 2-3 раза по сравнению с фоновыми значениями. К концу эксперимента значения большинства показателей оставались ниже контрольных, что свидетельствует об угнетении важнейших энергетических и микробицидных систем ПМЯЛ крови белых мышей в период введения интактных антибиотиков, а также в течение последующих 13 сут (срок наблюдения) после отмены химиопрепаратов. Парентеральное или пероральное введение липосомальных антибиотиков белым мышам обусловливало менее выраженное, по сравнению с интактными химиопрепаратами, угнетение энергетических и микробицидных систем ПМЯЛ, которые в 1-е — 12-е сут после отмены препаратов во всех случаях возвращались к норме или даже превышали фоновые значения. Таким образом, доказано снижение иммунодепрессивного действия антибиотиков при включении их в липосомы.

При хранении липосомальных препаратов в жидком виде происходит постепенное вытекание включенного материала [111]. Для сохранения биологических свойств и увеличения срока годности препаратов широкое применение в биотехнологии нашел метод лиофиль-ного высушивания [144]. Учитывая вышесказанное, следующий раздел работы посвящен разработке биотехнологии стабилизации, обеспечивающей получение лиофилизированных высокоактивных антибактериальных липосомальных форм, стабильных при длительном хранении. Разработка биотехнологии режима сублимиции (подбор концентрации криозащитной среды и режима высушивания) проводилась на модели липосомальной формы стрептомицина

В качестве среды высушивания была выбрана сахарозо-желатиновая среда, содержащая 40 % сахарозы и 10 % желатина, которую вносили в образцы в различных концентрациях. Лиофилизацию осуществляли на установке LZ-9c в умеренном 26-часовом режиме или в ускоренном 14-часовом режиме. В обоих случаях выявлено преимущество использования исходной защитной среды в концентрации 30 %. Сахарозо-желатиновая среда в данной концентрации оказывала выраженное защитное действие и обеспечивала максимальную стабильность липосомальных везикул в процессе лиофилизации. Определение количества инкапсулированного антибиотика, стабилизированного с применением ускоренного режима лиофильного высушивания, показало, что использование «жестких» параметров сушки не отразилось на биологических свойствах и внешнем виде липосомального стрептомицина. На основании результатов, полученных при разработке биотехнологии ускоренного 14-часового режима лиофильного высушивания жидкого препарата с целью стабилизации его свойств и увеличения срока годности, нами была выбрана эта технология, как более экономичная, позволяющая сократить материальные, энергетические и временные затраты без снижения качества готового продукта.

Липосомы подвергаются воздействию целого ряда физических и химических факторов, способствующих деградации бислойных фосфолипидных мембран. Одним из важнейших негативных факторов является ПОЛ, вызывающее появление свободных радикалов в системе, приводящих к нарушению проницаемости и лизису мембранных структур [15, 28, 96, 201]. Поэтому не вызывает сомнений важность подбора средств, предотвращающих перекисное окисление на разных этапах изготовления и хранения липосом. Изучено защитное действие а-токоферола ацетата на различных стадиях приготовления и хранения ФЛ и липосом. При экстракции ФЛ с добавлением АО в концентрации 0,5 мг на 1 г липидов уровень МДА был ниже на 4,2 мкМ/г липидов, чем при экстракции без АО (р<0,01). В липосомах, приготовленных без АО, концентрация МДА составила 33,42±1,4 мкМ/г липидов, а в случае использования при получении липосом а-токоферола ацетата этот показатель уменьшился до 24,38±1,6 мкМ/г липидов (р<0,01). Полученные результаты позволили сделать вывод о необходимости присутствия АО уже на этапе экстрагирования ФЛ, а также при получении липосом для предотвращения инициации ПОЛ.

Доказано также преимущество присутствия АО в составе ФЛ при длительном (2 года) хранении последних: в ФЛ без АО концентрация МДА возросла более чем в два раза, а с АО - в 1,47 раза по сравнению с фоновым значением показателя и составила соответственно 53,21 ±1,6 и 31,02±1,8 мкМ/г липидов. При хранении липосом выявлена та же зависимость, однако результаты несколько отличались от предыдущих. Оказалось, что в липосомальных ФЛ даже без АО перекисное окисление развивалось менее интенсивно, чем в свободных ФЛ при одинаковых условиях хранения. По-видимому, ФЛ, входящие в состав внутреннего слоя бислойных липосомальных мембран, менее подвержены ПОЛ, чем ФЛ в свободной форме. В пересчете на 1 г липосомальных липидов через 24 месяца хранения концентрация МДА в липосомах с АО и без АО составила 28,02±1,1 и 50,13±0,9 мкМ соответственно. Защитное действие а-токоферола ацетата также экспериментально подтверждено при длительном хранении лиофилизиро-ванного липосомального стрептомицина. Через 2 года (срок наблюдения) в липосомальных препаратах без АО в составе везикул остается приблизительно половина от включенного до лиофилизации стрептомицина, в то время как в препаратах, стабилизированных а-токоферола ацетатом уровень связанного стрептомицина уменьшается всего на 20 %.

Таким образом, отработаны оптимальные условия лиофильного высушивания липосом со стрептомицином. Добавление о:-токоферола ацетата из расчета 0,5 мг на 1 г липидов при получении везикул и разработанный 14-часовой режим лиофилизации с использованием в качестве криопротектора сахарозо-желатиновой среды в концентрации 30 % позволили получить липосомальный препарат стрептомицина, стабильный в течение двух лет (срок наблюдения). При этом сохраняется нативная структура липосом и биологическая активность иммобилизованного антибиотика.

Основным показателем безвредности лекарственных препаратов является отсутствие патоморфологических изменений в органах и тканях. Вопрос взаимодействия липосом с различными структурами в организме имеет большое значение для решения проблемы безвредности липосом при различных путях их введения. В специальной литературе практически отсутствуют данные об изучении влияния липосом на гомеостаз макроорганизма. Проведена оценка степени возможного повреждающего действия сконструированных липосомальных антибиотиков и интактных липосом при длительном введении на органы и ткани экспериментальных животных. Для изучения использовании внутримышечный и пероральный пути поступления липосомальных композиций, поскольку именно эти способы введения являются наиболее распространенными при использовании антибиотиков.

При внутримышечном и оральном введении интактных липосомальных везикул существенных патоморфологических изменений не выявлено. Важно отметить, что независимо от способа введения интактных липосомальных везикул и липосомального ломефлоксацина, на 11-14 сут в селезенке всех исследуемых животных имела место умеренная гиперплазия лимфоидной ткани, и выявлялось большое количество гигантских многоядерных клеток типа мегакариоцитов. Появление в строме селезенки мезенгиальных клеток - производных костного мозга - служит одним из критериев усиления неспецифического иммунного ответа [183], что, в свою очередь, является подтверждением наличия у липосом иммуностимулирующих свойств.

Внутримышечное введение терапевтической дозы свободного стрептомицина белым мышам сопровождалось выраженным расстройством кровообращения и альтеративными воспалительными процессами, наблюдавшимися с 1 сут после введения препарата. В то же время введение липосомальной формы стрептомицина характеризовалось малосущественными изменениями. Наблюдаемые при парентеральном введении свободного стрептомицина нарушения кровообращения (гемолиз), патологические изменения в печени (фокальный некроз, кариопикноз, кариорексис и кариолизис в гепатоцитах), почках (образование спаек), возможно, объясняются тем, что до 50 % введенного антибиотика связывается с белками крови [181], а образовавшиеся комплексы вызывают указанные нарушения. Стрептомицин в липосомальной форме экранирован липидной мембраной от взаимодействия с белками в кровяном русле, он доставляется непосредственно в клетки, предотвращая образование комплексов и, соответственно, не вызывает выраженных гистоморфологических нарушений.

При внутримышечном и пероральном поступлении липосомального ломефлоксацина выявлены минимальные изменения в организме белых мышей во все сроки исследования. На 7-9 сут эксперимента в регионарных лимфатических узлах отмечалась умеренная гиперплазия фолликулов. В печени выявлялась пылевидная жировая дистрофия, у отдельных животных обнаруживалась незначительная дискомплексация балочного строения. В селезенке всех исследуемых животных отмечалась умеренная гиперплазия лимфоидной ткани, выявлялось большое количество гигантских многоядерных клеток типа мегакариоцитов, умеренно выраженное полнокровие сосудов. В почках - умеренный отек клубочков в виде серозного пропитывания петель, отмечалась гиперплазия со стороны мезенгиальных клеток клубочков, гидропическая дистрофия клеток эпителия извитых канальцев, полнокровие сосудов стромы. После отмены препаратов быстро восстанавливалась структура исследуемых органов. На 17 сут эксперимента изменения характеризовались незначительной гиперплазией фолликулов селезенки и слабой реакцией со стороны купфе-ровских клеток печени. В отдаленные сроки наблюдения (21 сут) отмечалось восстановление нарушенной структуры тканей и органов. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что изменения в тканях и органах мышей, вызванные внутримышечным и пероральным введением липосомальных антибиотиков, вполне сопоставимы с таковыми при поступлении интактных везикул. Другими словами, влияние липосомального ломефлоксацина и стрептомицина на структуру тканей и органов животных настолько минимально, что маскируется действием самих фосфолипидных везикул, входящих в состав липосомальных антибиотиков. Таким образом, результаты патоморфологи-ческого исследования показали относительную безвредность длительного введения фосфатидилхолинхолестериновых липосом и сконструированных липосомальных форм стрептомицина и ломефлоксацина для организма белых мышей при различных способах поступления.

Косвенно подтверждено наличие у липидных везикул иммуно-модулирующих свойств, а также показано преимущество введения липосомальных антибиотиков по сравнению с использованием их в свободной форме.

Для характеристики полученных препаратов большое значение имеет оценка их биологической эффективности. Эффективность инкапсулированных в липосомы антибиотиков оценена в сравнении с действием их свободных форм на модели экспериментальных инфекций: сибирской язвы, туляремии, чумы и бруцеллеза. В процессе изучения разработаны схемы оптимального лечения указанных инфекций липосомальными формами антибиотиков.

Для лечении экспериментальной сибирской язвы мы использовали полученные липосомальные формы ампициллина и кефзола, ин-тактные формы которых применяются в настоящее время для лечения сибирской язвы в клинической практике. Оба антибиотика в липосомальной форме проявили выраженное протективное действие при лечении экспериментальной сибиреязвенной инфекции. Трехкратное лечение липосомальной формой кефзола при дозе, равной 2000 мкг, способствовало повышению количества защищенных животных на 20 % и увеличению средней продолжительности жизни павших мышей на 1,0 ± 0,2 сут по сравнению со свободной формой антибиотика. При более низкой дозе препарата, составляющей 200 мкг, данные показатели достигли соответственно 60 % и 1,3 ± 0,3 сут.

Выживаемость животных, получавших трехкратно липосомальный ампициллин в дозе 1000 мкг/мышь однократно в сут, достигла 100 %, процент защиты составил 30. Значительный терапевтический эффект липосомальной формы ампициллина выявлен и при более низкой дозе, равной 100 мкг. При этом количество защищенных животных возросло на 60 %, средняя продолжительность жизни мышей — на 6,5 ± 0,9 сут по сравнению со свободной формой препарата. Преимущество липосомальной формы ампициллина над его свободной формой было подтверждено и при двукратном курсе антибиотикоте-рапии: протективный эффект липосомальной формы ампициллина получен как по показателю выживаемости, так и по средней продолжительности жизни инфицированных животных. Введение липосомального ампициллина по 1000 мкг обеспечило возрастание количества защищенных животных на 20 % и увеличение среднего срока жизни белых мышей на 7,2 ± 1,1 сут по сравнению с использованием аналогичной дозы свободного антибиотика. При дозе липосомального препарата, равной 100 мкг, рассматриваемые показатели составили соответственно 80 % и 14,0 ±1,8 сут.

На модели туляремийной инфекции изучалось лечебное действие липосомальных форм стрептомицина и гентамицина в сравнении с их интактными формами, которые in vitro проявили высокую активность в отношении штамма F. tularensis 144/713. Результаты лечения экспериментальной туляремийной инфекции прямо или косвенно свидетельствуют о преимуществе сконструированных липосомальных форм стрептомицина и гентамицина по сравнению с их интактными формами. Использование липосомальной формы стрептомицина позволило повысить эффективность этиотропного лечения экспериментальной туляремии на 25-70 % по сравнению с применением свободного антибиотика, а оптимальной схемой явилось внутримышечное введение липосомального стрептомицина в дозе 1,5 мг/мышь пятикратно с интервалом в 24 ч с началом лечения через сут после заражения. Данная схема обеспечила выживаемость 95% взятых в опыт животных. Пятикратное введение зараженным туляремией белым мышам пустых липосом позволило выжить 10 % животных, в то время как в контрольной группе все мыши пали от инфекции, и увеличило

СПЖ павших белых мышей на 1,6±0,3 сут, что свидетельствует о неспецифической активизации иммунных сил макроорганизма фосфо-липидными везикулами.

Оценка биологической эффективности сконструированной липосомальной формы стрептомицина дополнительно проведена на модели экспериментальной чумной инфекции при заражении белых мышей вирулентным штаммом Y. pestis 461. Наиболее успешным оказалось пятикратное лечение экспериментальной чумы белых мышей липосомальным стрептомицином в дозе 1,5 мг/мышь с интервалом 24 ч. Указанная схема обеспечила выживание 97,5 % зараженных животных, процент защиты составил 72,5, что подтвердило высокую эффективность полученного липосомального стрептомицина.

Бруцеллезная инфекция сопровождается развитием выраженной иммунодепрессии, которая, несмотря на лечение антибиотиками, обеспечивает сохранение в фагосомах бруцелл, способных к размножению. На фоне подавленной иммунореактивности снижается клинический эффект применения антимикробных средств [109, 204 147]. Необходимость длительных и повторных курсов лечения часто приводит к развитию побочных реакций. Требуются новые подходы к лечению данного заболевания и, прежде всего, необходима разработка лекарственных препаратов, обеспечивающих воздействие на внутри-клеточно расположенных бруцелл [110, 193 С целью совершенствования существующих схем лечения особо опасных заболеваний вполне естественны поиски новых форм лекарственных препаратов и их комбинаций, которые обеспечивали бы проникновение лекарств в клетки и позволили снизить терапевтические дозы токсичных антибиотиков. Достижение этих целей во многих случаях оказывается более эффективным при использовании липосомальных форм антибиотиков [3, 145, 177, 205,246].

Учитывая возможность липосом доставлять лекарства внутрь клеток, а также оказывать иммуномодулирующее действие, мы использовали традиционно использующиеся для лечения бруцеллеза тетрациклин и сизомицин и липосомальной форме. Препараты группы фторхинолонов хорошо проникают в ткани и клетки макроорганизма, что обусловливает особую актуальность их применения для терапии инфекций с внутриклеточной локализацией возбудителя [138, 175, 215, 216]. Кроме того, известно, что ломефлоксацин в терапевтических дозах повышает адгезию лейкоцитов, избирательно повышает уровень Ig М- антител, что свидетельствует о его иммуностимулирующем эффекте [78]. Поэтому, наряду с традиционными антибиотиками, мы использовали ломефлоксацин в свободной и липосомальной форме для лечения экспериментальной бруцеллезной инфекции. Все изученные антибиотики проявили высокую активность в отношении бруцелл in vitro.

Пероральное лечение мышей свободным сизомицином оказалось неэффективным, так как сизомицин не всасывается из желудка. При оральном введении липосомального сизомицина в половинной курсовой дозе (10 мг/мышь) свободными от бруцелл оказались 10,0 % белых мышей (р>0,05), а ИВ и ИО были достоверно (р<0,01) ниже таковых при использовании свободного антибиотика, что доказывает возможность орального использования липосомальных форм препаратов, которые в свободной форме не всасываются в желудочно-кишечном тракте.

Количество освободившихся от бруцелл белых мышей, получавших липосомальный сизомицин внутримышечно, статистически достоверно (р<0,01) превысило этот показатель в группе мышей, леченных удвоенной курсовой дозой интактного антибиотика, и составило 76,5 ± 0,5 % и 28,9 ± 0,4 % соответственно. При внутримышечном введении интактных липосом во все сроки эксперимента не было свободных от инфекции животных, однако ИВ и ИО были достоверно ниже (р<0,01) аналогичных показателей в контрольной группе.

Лечение животных тетрациклином в свободной форме в курсовой дозе 10 мг/мышь оказалось неэффективным. Количество свободных от инфекции животных через 14 сут после проведения полного курса антибиотикотерапии составило лишь 10,8±0,1 %. Достаточно высокими были ИВ и ИО (0,42 и 0,34 соответственно). При курсовой дозе тетрациклина 20 мг/мышь показатель освобожденности от инфекции увеличился до 59 ± 0,3 %, а ИВ и ИО составили 0,31 и 0,19 соответственно через 14 дней после последнего введения препарата. Практически аналогичные результаты были при лечении животных свободным тетрациклином в курсовой дозе 10 мг и введении параллельно с антибиотиком пустых липосом, вероятно, благодаря имму-номодулирующему действию последних.

Через 14 сут после окончания лечения 36,4 ± 0,7 % животных освободились от инфекции при использовании липосомального тетрациклина в курсовой дозе 5 мг/мышь. Этот результат был значительно выше аналогичного показателя при введении интактного антибиотика в курсовой дозе 10 мг/мышь. Наиболее эффективным оказалось лечение бруцеллеза белых мышей липосомальпым тетрациклином при курсовой дозе 10 мг. Количество свободных от инфекции животных в этой группе статистически достоверно превысило этот показатель во все сроки исследования при лечении свободным тетрациклином в курсовых дозах 10-20 мг, липосомальным тетрациклином в дозе 5 мг на курс и составило 80,8 ± 0,2 % на 14-е сут после второго курса антибиотикотерапии. ИВ и ИО также были минимальными.

При лечении экспериментальных животных свободным ломеф-локсацином в курсовых дозах 10 и 20 мг/мышь через 14 сут после окончания II курса свободными от инфекции были 49,4+0,5 и 64,1+0,3 % животных соответственно. Добавление интактных липосом в схему лечения животных с экспериментальной бруцеллезной инфекцией значительно повышало эффективность специфической терапии.

Максимальное увеличение интенсивности элиминации возбудителя из организма обеспечивало использование липосомального ломефлоксацина Лечение ломефлоксацином, иммобилизованным в липосомальные везикулы, в дозе 5,0 мг/мышь на курс позволило достичь результатов, сопоставимых с результатами лечения интактным ломефлоксацином в дозе 20 мг/мышь на курс. При этом количество свободных от инфекции животных после проведения II курса терапии составило 62,2+0,2 %. Наиболее обнадеживающие результаты обеспечило лечение бруцеллеза белых мышей липосомальным ломефлоксацином при курсовой дозе 10 мг/мышь. Освобождение организма от бру-целл в этом случае составило 89,7 % + 0,3 % при десятидневном дву-цикловом курсе терапии в течение 10 сут. ИВ и ИО в этой группе животных составили 0,12 и 0,07 соответственно. При этом даже удвоенная курсовая доза свободного антибиотика не обеспечивала аналогичных результатов лечения.

Обобщая результаты лечения сибирской язвы, туляремии, чумы и бруцеллеза, необходимо отметить, что сконструированные липосомальные формы антибиотиков показали более высокую эффективность в этиотропном лечении экспериментальных инфекций по сравнению с использованием интактных препаратов. Выявлено статистически достоверное повышение терапевтического эффекта при добавлении в схемы лечения инфекций свободными формами антибиотиков интактных липосом. По-видимому, это связано с тем, что интактные липосомальные везикулы действуют как неспецифические иммуномодуляторы в макроорганизме. На примере сизомицина показана принципиальная возможность перорального использования липосомальных антибиотиков, которые в интактной форме не всасываются из желудочно-кишечного тракта. В результате исследований разработаны рациональные схемы этиотропного лечения экспериментальных сибирской язвы, туляремии, чумы, бруцеллеза липосомальными антибиотиками для парентерального и перорального путей введения, позволяющие уменьшить кратность лечения, в 2 - 4 раза снизить курсовые дозы препаратов и повысить эффективность терапии. Таким образом, в эксперименте подтверждена высокая эффективность полученных липосомальных форм антибиотиков при лечении особо опасных зоонозных инфекций. Активизация неспецифической резистентности макроорганизма к возбудителям сибирской язвы, туляремии, чумы, бруцеллеза под действием липосом, повышение эффективности анти-биотиекотерапии путем иммобилиации антибиотиков в липосомы иллюстрируют реальные пути усовершенствования существующих средств и схем лечения данных заболеваний с целью их последующего внедрения в практическое здравоохранение.

Классическая серологическая диагностика чумы основана преимущественно на выявлении капсульного антигена Ф1 чумного микроба или антител к нему [89, 136]. Будучи видоспецифическим антигеном и основным иммуногенным компонентом возбудителя чумы, Ф1 является важнейшей составной частью большинства современных чумных диагностических и вакцинных препаратов. При производстве чумных МИБП иммунные сыворотки оцениваются, в первую очередь, по величине титров антифракционных антител.

Большое значение для развития эффективного иммунного ответа имеет дополнительное введение вместе со специфической иммунизирующей субстанцией того или иного адъюванта. В настоящее время рассматривается возможность использования липосом в качестве адъювантов для получения поли- и моновалентных гипериммунных производственных сывороток [56, 196] при создании диагностических препаратов.

Липосомы как иммуноадъюванты и иммуностимуляторы для получения иммунных сывороток лишены многих побочных действий, сопровождающих введение нерастворимых природных адъювантов -образование фиброзных капсул и гранулем в месте инъекции, полиартритов, аллергических, аутоиммунных реакций [56, 196, 197]. Исходя из вышеизложенного, нами разработана биотехнология получения гипериммунных чумных сывороток при введении животным-продуцентам липосомальной формы антигена Ф1 чумного микроба, пригодных для использования в производстве МИБП.

Липосомы готовили из ФХ, X и ДЦФ, а также из синтетического ФЛ ДМФЭ и положительно заряженного СА. Вышеупомянутый ли-пидный состав везикул был определен нами по следующим соображениям. Во-первых, ДМФЭ - цвиттерионный липид с температурой фазового перехода + 48 °С. Высокая температура плавления обеспечивает "жесткость" бислоя в условиях пребывания в организме теплокровного животного [112]. Во-вторых, в бислоях ФЭ в отличие от ФХ происходит образование межмолекулярных водородных связей. Вследствие этого полярные головки молекул ФЭ образуют более компактную "сшитую" поверхностную структуру. Эти межмолекулярные сшивки не зависят от степени гидратации и температуры. Из-за более прочного межмолекулярного связывания поверхностная вязкость ФЭ и его температура фазового перехода выше, чем у ФХ [264, 270]. В-третьих, СА придает липосомам дополнительный положительный заряд, а его раздражающее действие на ткани в месте введения усиливает адъювантные свойства липосом [71]. Липосомы готовили без X, так как известно, что его введение вызывает разрушение водородных связей между молекулами ФЭ и резко снижает температуру фазового перехода последнего [334].

Лучшими антигенными свойствами среди испытанных препаратов обладали липосомы из ДМФЭ и С А с Ф1. При этом средние геометрические титры специфических антител в сыворотках крови достигли 6472 (+16,5; -14,2), 796 (+7,2; -6,7), 12,8 (+7,9; -7,3) в ИФА, НРИФ и РИД соответственно, что достоверно (р<0,01) выше соответствующих показателей, приведенных в экспериментально-производственном регламенте [213]. Положительно заряженные липосомы с "жесткой" мембраной из ДМФЭ и СА, по-видимому, обеспечивали длительное пребывание антигена в организме, постепенное его высвобождение и взаимодействие с клетками РЭС.

При использовании для иммунизации кроликов липосом, полученных из ФХ, X и ДЦФ и содержащих Ф1 чумного микроба, средние геометрические титры антифракционных антител в ИФА составили 5149 (+7,2; -6,7), в НРИФ - 455 (+7,2; -6,7), в РИД - 12 (+7,9; -7,3). Таким образом, в данной группе кроликов титры сывороточных антител были ниже, чем в предыдущей (р<0,01), но при этом их значения удовлетворяют требованиям, предъявляемым к сырью для производства МИБП.

Таким образом, в результате сравнительного изучения антигенных свойств липосомальных препаратов капсульного антигена Ф1 чумного микроба, различающихся по химическому составу и электрическому заряду везикул, разработана биотехнология получения антифракционных гипериммунных сывороток. Из двух испытанных препаратов липосомальной Ф1, содержащих в составе липидных мембран ФХ, X, ДЦФ или ДМФЭ и СА, последний обладал наилучшими антигенными свойствами. Для получения гипериммунной сыворотки к Ф1 с производственными титрами антител предложена комбинированная схема иммунизации кроликов при шестикратном одноцикловом введении липосомального антигена. Результаты исследования открывают широкие перспективы для дальнейших разработок в плане теоретически и экспериментально обоснованного подбора состава липосомальных носителей антигена и усовершенствования схем иммунизации.

На модели экспериментальной чумной инфекции мы оценили протективную и гуморальную активность инкапсулированных в липосомы антигенов чумного микроба. Изучена зависимость между методом введения (пероральным, внутримышечным, подкожным), липид-ным составом везикул (синтетические и натуральные) и протективной активностью липосомальной формы Ф1 чумного микроба в дозе 50 мкг/мышь. При подкожном введении выявлено значительное увеличение протективного эффекта в случае иммунизации белых мышей антигеном в липосомальной форме. Величина LD50 для этого препарата составила 3420±310 м.к., средняя продолжительность жизни павших - 7,0±0,9 сут, что достоверно отличается от аналогичных показателей при подкожном введении свободного капсульного антигена чумного микроба (р<0,01).

При получении липосом, предназначенных для перорального введения, в фосфатный буфер дополнительно был добавлен додецил-сульфат натрия в количестве 0,1 % от общего веса липидов. Кроме этого, в состав бислойных везикул наряду с ФХ введен ФГ. Эти компоненты обеспечивают устойчивость липосомального носителя в желудочно-кишечном тракте [75, 76, 92, 206]. Пероральная иммунизация белых мышей свободной Ф1 чумного микроба оказалась неэффективной. При поступлении антигена в липосомальной форме значение LD50 Y. pestis 461 на порядок превышало данный показатель контроля и введения свободной формы Ф1 (112 ± 40; 150 ± 46 и 11 ±4 м.к. соответственно).

Поскольку Ф1 чумного микроба неиммуногенна для морских свинок, мы использовали Ф1 в сочетании с ЛПС чумного микроба в интактной и липосомальной форме по 50 мкг на морскую свинку подкожно и перорально. Критериями протективного эффекта являлись увеличение СПЖ животных и процент защиты. В результате было установлено, что максимальная выживаемость (83,3 %) и средняя продолжительность жизни (10 сут) имели место в группе морских свинок, иммунизированных подкожно липосомальным препаратом Ф1 и ЛПС чумного микроба. Процент защиты при этом составил 33,3.

В случае пероральной иммунизации Ф1 и ЛПС чумного микроба морские свинки приобретают иммунитет против чумы только после прививки липосомальными антигенами (33,3 %) и не иммунизируются теми же дозами антигенов в свободной форме, которые разрушаются в желудочно-кишечном тракте, теряя свою иммуногенность. Выявленную в экспериментах эффективность липосомальных форм антигенов чумного микроба при пероральном введении белым мышам и морским свинкам можно объяснить воздействием электростатических сил за счет введения в состав липосом отрицательно заряженных ДЦФ и ФГ. Это, вероятно, обусловило повышение прочности липосомальных мембран и, соответственно, возможность доставки антигенов в неизмененной форме в иммунокомпетентные клетки макроорганизма. Кроме того, известно, что ФГ и СМ характеризуются способностью к образованию межмолекулярных водородных связей в отличие от ФХ [92], а включение в состав липосом додецилсульфата натрия дополнительно обеспечивает устойчивость везикулярных мембран к действию ферментов желудочно-кишечного тракта [92, 111].

Активность антигенных препаратов определяется по способности формировать клеточный и гуморальный иммунитет. Определение титров антифракционных антител имеет определенное диагностическое значение и используется в комплексе с другими методами изучения иммунитета при чуме [167]. Поэтому для характеристики сконструированных липосомальных форм антигенов чумного микроба представляла интерес оценка уровня гуморального иммунитета, вырабатываемого в ответ на их введение различными способами в сравнении с иммунизацией животных свободными формами указанных антигенов.

Установлено, что путь введения и форма антигенного раздражителя оказывают существенное влияние на формирование гуморального иммунитета. Максимальные среднегеометрические титры антифракционных антител в РПГА и ИФА имели место при подкожной иммунизации белых мышей липосомальной формой Ф1 чумного микроба в дозе 50 мкг/мышь и составили 446 (+30,1; - 23,1) и 2521 (+7,2; -6,7) соответственно. При пероральном введении нативпого антигена титры антител в РПГА и в ИФА отсутствовали. В случае однократной пероральной иммунизации белых мышей липосомальной Ф1 средние геометрические титры антител в РПГА и в ИФА достигли 84,5 (+14,1; -12,3) и 274 (+7,2; -6,7) соответственно. Эти показатели статистически достоверно отличались от контроля (р<0,01). Таким образом, полученная липосомальная Ф1 чумного микроба при однократном подкожном или пероральном введении белым мышам обеспечивает гуморальный ответ более высокого уровня по сравнению с использованием аналогичной дозы свободного капсульного антигена.

Морских свинок иммунизировали подкожно и перорально ин-тактными и липосомальпыми антигенами чумного микроба (Ф1 и Ф1+ЛПС). Наиболее высокий уровень гуморального ответа имел место при однократном подкожном введении морским свинкам липосомальной Ф1 в сочетании с ЛПС чумного микроба. При этом средние геометрические титры в РПГА достигли 1218 (+39,5; -28,1). Этот показатель достоверно (р<0,01) отличался от результатов однократного подкожного введения морским свинкам капсульного антигена и ЛПС в интактной форме, при котором средние геометрические титры в РПГА составили 420 (+26,6; -21,1). По-видимому, включение в везикулы, наряду с капсульным антигеном, иммуностимулятора ЛПС обеспечивает их взаимодействие с иммунокомпетентными клетками, что в сочетании с адъювантным действием липосом приводит к усилению выработки антифракционных антител, и, соответственно, к повышению уровня гуморального ответа организма морских свинок на антигенный раздражитель.

Подводя итоги экспериментов по однократной иммунизации белых мышей и морских свинок интактными и липосомальными антигенами чумного микроба, можно с уверенностью говорить о преимуществе полученных липосомальных форм антигенов чумного микроба, формирующих более напряженный гуморальный и клеточный иммунитет. Полученные результаты подтверждают данные других исследователей [71, 92, 188] о существенной роли липосомального носителя в реализации иммунного ответа организма на введение антигенов чумного микроба. Результаты экспериментов являются основанием к дальнейшему изучению и совершенствованию биотехнологии получения липосомальных форм антигенов для получения гипериммунных сывороток и разработки высокоиммуногенных химических вакцин.

Резюмируя вышеизложенное, следует отметить основные положения, представляющие теоретические и практические результаты наших исследований. Разработана биотехнология нового способа экстракции фосфолипидов из головного мозга крупного рогатого скота, который позволил снизить токсичность технологического процесса, обеспечил достижение сбалансированного эквимолярного соотношения фосфолипидов с липидами мембран клеток макроорганизма. Разработана биотехнология конструирования липосомальных форм антигенов чумного микроба, обеспечивающая сохранение биологической активности антигенов, позволяющая получать липосомы с максимальным включением материала (85 - 90 %), а также наличием значительного количества Ф1 на наружной поверхности мембраны (37,5 — 50 %). Разработана биотехнология приготовления липосомальных форм антибиотиков, отличающихся по структурным, химическим особенностям и свойствам, пригодных для различных путей введения в организм. Впервые проведено сравнительное изучение основных цитоэнзимохимических показателей ПМЯЛ крови экспериментальных животных при введении им липосомальных антибиотиков парентерально и перорально. Доказано снижение иммуно-депрессивного действия антибиотиков при включении их в ли-пидные везикулы.

Предложенные биотехнологические приемы стабилизации липосомальных композиций включают использование антиокси-данта и лиофильное высушивание липосом. На основании результатов, полученных при разработке биотехнологии ускоренного 14-часового режима лиофильного высушивания жидкого препарата с целью стабилизации его свойств и увеличения срока годности, нами была выбрана эта технология, как более экономичная, позволяющая сократить материальные, энергетические и временные затраты без снижения качества готового продукта. Доказана относительная безвредность полученных липосом и липосомальных форм антибиотиков при парентеральном и пероральном введении белым мышам. Установлено, что патоморфологические изменения, происходящие в ответ на введение липосомальных антибиотиков, носят обратимый характер - показатели гомеостаза организма восстанавливаются к исходному уровню после прекращения их введения.

Подтверждена высокая биологическая эффективность сконструированных липосомальных антибиотиков, выявлены преимущества последних перед свободными антибиотиками. Разработаны рациональные схемы этиотропиого лечения липосомальными антибиотиками экспериментальной сибирской язвы, туляремии, чумы и бруцеллеза, позволяющие уменьшить кратность лечения, снизить курсовые дозы антибиотиков и повысить эффективность терапии. С использованием липосомальной формы Ф1 чумного микроба разработана биотехнология получения гипериммунных чумных антифракционных кроличьих сывороток, соответствующих требованиям экспериментально-производственного регламента [1987], предъявляемым к сырью, предназначенному для производства МИБП. Экспериментально доказана высокая биологическая эффективность полученных липосомальных форм антигенов чумного микроба, способствующих формированию клеточного и гуморального иммунитета у экспериментальных животных. Проведенные исследования позволяют прогнозировать перспективность использованных нами подходов для конструирования вакцин нового поколения.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Таран, Татьяна Викторовна, Ставрополь

1. Абдулаева Б.И. Изучение некоторых показателей обменных процессов под действием лекарственных растений на фоне гипергликемии. Автореф. дис. . канд.мед.наук.- Ставрополь, 1997.- 20 с.

2. Абдулаева Б.И., Ефременко В.И., Смирнова А.С. Влияние липосомальных фитопрепаратов на состояние обменных процессов на фоне гипергликемии в эксперименте // Деп. в ВИНИТИ 4.08.97. N 2602-В97.

3. Абрамов К.С., Скидан И.Н., Гуляев А.Е., Северин С. Е., Гель-перина С.Э. Некоторые аспекты направленного транспорта лекарств в организме с помощью полимерных наночастиц // Клинич. исслед. лекар. средств в России. 2001. - № 2. - С. 18-21.

4. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокисли-тельные вещества. Л., 1985. - 230 с.

5. Авилов В.М., Селиверстов В.В., Пылинин В.Ф., Шумилов К.В., Калмаков В.В. Бруцеллез животных и его специфическая профилактика // Ветеринария.- 1997.- № 7.- С.3-13.

6. Адаменко Г.П. Методы оценки взаимодействия нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов крови в смешанной культуре клеток // Клинич. лаб. диагностика. 1993. - № 4. - С. 53-56.

7. Аляутдин Р.Н., Филиппов В.И., Немировский А.Ю. Свойства магнитоуправляемых липосом, содержащих курареподобные препараты //Фармация. 1989. - Т.38, N 3. - С.20-23.

8. Антоненко А.Д. Научное обоснование системы мер профилактики особо опасных зоонозных бактериальных инфекционных заболеваний в Ставропольском крае в современных условиях: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 2000. - 26 с.

9. Антоненко А.Д. Проблемы инфекционных заболеваний в Ставропольском крае и пути их решения //Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности. Ставрополь. — 2002. - С. 18-19.

10. Антоненко А.Д. Эпидемиологические особенности современного бруцеллеза // Здоровье и болезнь как состояния человека.- Ставрополь,2000.- С.704-708.

11. Антонов В.Ф., Князев Ю.А., Мошковский Ю.Ш. Использование в клинической практике липосомальных форм лекарственных препаратов //Советская медицина. 1983. - N 5. - С.54-63.

12. Антонов В.Ф., Князев Ю.А., Мошковскнй Ю.Ш. Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями //М.: Наука, 1981. С.3-9

13. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях.-Л.: Медгиз, 1962.- 180с.

14. Банкова В.В. Роль малонового диальдегида в регуляции пере-кисного окисления липидов в норме и при патологии: Автореф. дис. . д-ра. биол. наук. М., 1990. - 42 с.

15. Барсуков А.А., Бердичевский В.Р., Земсков В.М. Эндоцитоз липосом макрофагами in vitro // Успехи совр. биол. 1980. - Т. 90, № 3. - С. 394-404.

16. Барсуков Л.И. Липосомы // Соросовский образоват. журн. -1998.-№ 10.-С. 2-9.

17. Бахрах Е.Э., Егорова В.Д., Павлова Л.П. К характеристике по-лисахаридсодержащей фракции чумного микроба // ЖМЭИ.- 1962.- №6.-С.126-130.

18. Бекренева В.Ю., Жуйнов А.Г., Шаладтаян А.А. Взаимодействие аутолипосом с опухолевыми клетками //Биол. мембраны. 1990. - Т.7, N 3. - С.289-296.

19. Бектимиров Т.А. Тактика использования разных вакцин против гриппа //Биопрепараты (научно-практический журнал). 2002. - № 3 (7). -С.10.

20. Белицер Н.В., Анищук М.Г., Богданов А.А., Торчилин В.П. Взаимодействие плазматической мембраны эритроцитов с "твердыми" ли-посомами //Биол. мембраны. 1989. - Т.6, N 9. - С.955-964.

21. Березовская Л.Н., Грязнова Н.С., Баирамашвили Д.И., Яроцкий С.В. Проблемы создания липосомальных лекарственных форм антибиотиков //Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т.35, N10. - С.31-35.

22. Богданов А.А. Модификация поверхности липосом с целью регуляции их взаимодействия с клетками: Автореф. дис. . канд. биол.наук. -М., 1988.-25 с.

23. Болдырев А.А., Курелла Е.Г., Павлова Т.Н. Биологические мембраны. -М., 1992.- 124 с.

24. Брискин Б.С., Савченко З.И., Хачатрян A.M. Иммунологические аспекты прогнозирования эффективности антибиотикотерапии у больных перитонитом //Антибиотики и химиотерапия. 2000. - № 2. - С. 15-21.

25. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М.: Медицина, 1984. 208 с.

26. Бурлакова Е.Б., Губарева А.В., Архипова Г.В., Рогинский В.А. Модуляция перекисного окисления липидов биогенными аминами в модельных системах //Вопр. мед.химии. 1992. - Т.38, N 2. - С.17-20.

27. Бурханов С.А., Саатов Т.С. Липосомы как эффективные имму-ноадъюванты III Всесоюз. иммунол. съезд (Сочи, 15-17 нояб., 1989); Тез. секц. и стенд. сообщ.Т.1. М.,1989. - С.23.

28. Бямбаагийн А. Использование липосом с иммобилизованными антигенами возбудителя чумы для оценки их протективного действия и при получении гипериммунных сывороток: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 1999. - 25 с.

29. Варпаховская И. Липосомальные формы лекарственных средств // Ремедиум.- 1999. №5. с.68-70.

30. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах,- М.: Наука, 1972.- 252с.

31. Владимирский М.А., Ладыгина Г.А., Тенцова А.И. Получение липосомальных препаратов стрептомицина и дигидрострептомицина //Антибиотики. 1984. -N3. - С. 163-166.

32. Владимирский М.А., Ладыгина Г.А., Тенцова А.И. Эффективность стрептомицина, включенного в липосомы, при экспериментальном туберкулезе у мышей //Антибиотики. 1983. - N 1. - С.23-26.

33. Власов Г.С., Салов В.Ф., Торчилин В.П., Бердичевский В.Р. Липосомы и перспективы их использования в прикладной иммунологии // ЖМЭИ. 1982. - N 8. - С.12-19.

34. Воробьев М.С., Гуринович Н.А., Кисилев П.А. Способ встраивания инсулина в липосомы: А.с. N1345398, СССР, 1985

35. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажур J1.H. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой //Вопр. мед. химии.- 1987.- Т. 33, №1.-С.118-122.

36. Голубинский Е.П., Коновалова Ж.А., Дубровина В.И. Современные аспекты фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis //Журн. инфекционной патологии. Иркутск. -2001. - Т. 8. - № 2-3. - С. 102-107.

37. Голубчикова Н.А., Сидоров В.Н., Крейнес В.М., Шраер Т.И. Взаимодействие липосом различного состава с компонентами сыворотки крови //Вестн. акад.мед.наук СССР,- 1990.- N 6.- С. 36-38.

38. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Ставропольском крае в 2002 г.», Ставрополь. 2003. — С. 103105.

39. Грибанов Г.А. Особенности структуры и биологическая роль лизофосфолипидов // Вопр. мед. химии.- 1991.- Т.37, №4.- С. 2-10.

40. Грибенча С.В., Кобринский Г.Д., Сафаров С.А. Изучение имму-ногенных свойств липосомальной формы антирабической вакцины //Вопр. вирусол. 1988. - Т. 33, N 4. - С.431-433.

41. Гринько Р.А. Стабилизация бислойных фосфолипидных везикул (липосом), содержащих антибиотик //Матер, научно-практ. конф., посвящ. 75-летию санэпидслужбы России "Здоровье населения и среда обитания". -Ставрополь, 1997. С.251-252.

42. Гуревич Г.Л., Залуцкая О.М., Суркова Л.К. Оценка микобакте-рицидной активности липосомального рифампицина в эксперименте //Человек и лекарство: Тез. докл. VI Российского национального конгресса.- 19-23 апреля 1999. М., 1999. - С. 24.

43. Гусева Н.П. Липосомальные формы иммуногенов чумного микроба: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1995. -20 с.

44. Гусева Н.П., Брандзишевский Ю.В., Тараненко Т.М. Протек-тивная активность модифицированных липосомами антигенов чумного микроба //Матер. Российской научн. конф. "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций". Саратов,1993. - С.144.

45. Даценко З.М., Кокунин В.А., Зилберс Ю.А., Гозимс И.К., Семенов Б.Н., Малей С.М., Тимченко А.П., Морозов С.Ю., Осис Г.Е. Способ получения комплексов фосфолипидов. А.с. СССР № 1175486, А61К 37/22, оп. 30.08.85, Бюл. №32

46. Даценко З.М., Косунин В.А., Семенов Б.Н., Савкина Н.И., Морозов С.Ю. Способ получения комплексов фосфолипидов. А.с. СССР № 1080825, А61К 37/22, оп. 23.03.84, Бюл. №11

47. Дикий И.Л., Стрельников Л.С., Чуешов В.И. Эктерицид как дисперсионная среда для получения клинически перспективных липосомальных лекарственных форм // Вестн. акад.мед.наук СССР. 1990. - N6. -С.41-44.

48. Домашенко О.Н., Бондарев Л.С. Исследование катионных белков лейкоцитов у больных острым и хроническим гепатитом // Лаб. дело.- 1998.-№ 9.-С. 25-27.

49. Ермакова Г.В., Гусева Н.П., Кравцов А.Л., Наумов А.В. Нейтрализация токсического действия липополисахарида Yersinia pestis, модифицированного липосомой //Деп. в ВИНИТИ, 11.02.93, N332, В-93.- 8 с.

50. Ефременко В.И. Новые методы исследования холерного вибриона //Тезисы Всесоюзн. научн. конф. "Актуальные вопросы микробиологии, лабораторной диагностики и профилактики холеры" Ростов-на-Дону, 1988. - С.145-151.

51. Ефременко В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине). Ставрополь, 1999. - 236 с.

52. Ефременко В.И. Молекулярная организация и функции белковых токсинов возбудителей холеры и чумы //ЖМЭИ. 1983. - N 11. - С.7-13.

53. Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н., Самарина И.В. К проблеме повышения эффективности этиотропной и патогенетической терапии бруцеллеза //Тес. докл. II Российского национ. конгресса "Человек и лекарство" (10-15 апреля 1995). М.1995. - С.252.

54. Ефременко В.И., Дятлов А.И., Таран И.Ф. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. 50 лет. Ставрополь. -2002.-336 с.

55. Ефременко В.И., Столбин С.В., Греков Л.И. Биосенсоры и аспекты их использования //Прикладная биохимия и микробиология. -1990. -Т.26, в.1. С.11-18.

56. Ефременко В.И., Тихенко Н.И., Цыганкова Р.Е., Афанасьев Е.Н.

57. Изучение лечебных свойств липосомальных форм антибиотиков при туляремии. // Тес. докл. II Российского национ. конгресса "Человек и лекарство" (10-15 апреля 1995). М.1995. - С.252-253.

58. Закиров М.М., Петров А.Ю., Бурханов С.А. Иммунологическая активность липополисахарида Neisseria meningitidis, включенного в липосомы //ЖМЭИ. 1995. - N 1. - С.49-53.

59. Закревский В.И. Некоторые аспекты применения липосом в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний //Молек. генетика, микробиол. и вирусол.- 1985. -N1. С.3-8.

60. Закревский В.И., Ефременко В.И., Мельников В.А., Курилов В.Я., Ротов К.А., Денисов ИИ, Плеханова Н.Г. Приготовление липосом, содержащих биологически активные вещества: Методические рекомендации,- Волгоград, 1982.-23с.

61. Закревский В.И., Курилов В.Я., Мельников В.А., Ефременко В.И. Включение в липосомы капсульного антигена чумного микроба //Молекул, генет. микробиол.и вирусол. 1983. - N 9. - С.33-36.

62. Закревский В.И., Плеханова Н.Г. Изучение протективных свойств антигенсодержащих липосом различного липидного состава при чуме //Вестн. акад. мед.наук СССР. 1990. - N 8. - С.41-44.

63. Здродовский П.Ф., Гурвич Г.А., Кабанова Е.А. О природе явлений угнетения иммуногенеза // Вест. АМН СССР.- 1964.- № 10.- С.З.

64. Зилберс Ю.А., Томсон А.А., Гозите И.К. Способ извлечения лецитина из растительного сырья: А.с. N 833977, СССР, 1981.

65. Золин В.В., Лукьянов А.Е., Нестеров А.Е. Методические подходы к созданию липосомальной формы человеческого рекомбинантного 7 1 42 интерферона//Вест. Рос. АМН. 1993. - N 2. - С.29-31.

66. Иванов А.С., Захарова Т.С. Халилов Э.М., Торховская Т.И., Бачманова Г.И., Маркин С.С., Лопухин Ю.М., Арчаков А.И. Способ получения фосфолипидного носителя холестерина: А.с. 1690769 Al, СССР.-1986.

67. Иванова Н.Н., Каплун А.П., Петров В.И., Сенноков Г.И., Швец В.И. Способ получения препарата фосфатидилэтаноламина: А.с. 1267655А.- 1984.

68. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам.-М, 1990.- 36 с.

69. Йорданова А.И. Иммунофармакологическая активность фтор-хинолонов. Критерии оценки и характеристика препаратов. Атореф. дис. . канд. биол. наук. -М. 1997. -21 с.

70. Каган В.Е., Скрыпин В.И., Сербинова Е.А. Локализация а -токоферола в гидрофобной зоне липидного бислоя //Докл. Академии наук СССР. 1986. - Т.288, N 5. - С.1242-1245.

71. Кадочкина О.А. Гистологические критерии эффективности использования препаратов корня солодки при лечении аллергического дерматита //XII итоговая (межвузовская) научная конференция молодых ученых и студентов. Ставрополь. - 2004. - С. 370-371.

72. Каледин В.И., Курунов Ю.Н. Противоопухолевая активность заключенного в липосомы кортифена , введенного мышам с солидными опухолями //Эксперим. онкология. 1990. - Т. 13, N2. - С.65-67.

73. Каледин В.И., Курунов Ю.Н., Чельцов П.А. Эффективность воздействия на метастазы опухоли ГА-1 в печени у мышей циклоплатама в липосомах после лиофильного высушивания и хранения //Деп. в ВИНИТИ 31.10.90, N5599-B90.

74. Каледин В.И., Николин В.П., Попова Н.А. Подавление опухолевого роста в печени цисдиаминодихлорплатином в составе больших оли-голамеллярных липосом, приготовленных методом замораживания и оттаивания //Вопросы онкологии. 1989. - Т.35, N5. - С.599-602.

75. Каледин В.И., Попова Н.А., Стеценко А.И., Яковлев К.И. Противоопухолевая эффективность свободного и заключенного в липосомы плаксанта у мышей линии А/Не с метастазами опухоли ГА-1 в печени //Эксперим. онкология. 1993. - Т. 15, N5. - С.75-77.

76. Калюжин О.В. Производные мурамилпептида в эксперименте и клинике//Журн. микробиол.- 1998.-№1.- С. 104-108.

77. Карсонова М.И., Андронова Т.М., Пинегин Б.В., Хаитов P.M. Иммуностимулирующая активность мурамилдипептида и его производных // Ж. микробиол.-1999.- № 3.- С. 104-110.

78. Кашкин К.П., Дмитриева Л.Н., Медведкин В.Н. с соавт. Имму-номодулирующая активность хемотоксического пептида, конъюгированно-го с липосомальным антигеном //Иммунология. 1987. - N 6. - С.37-40.

79. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. - С. 258-286.

80. Киреев М.Н., Тараненко Т.М., Веренков М.С., Гусева Н.П., Полунина Т.А. Опыт получения гипериммунной сыворотки к капсульномуантигену Ф1 чумного микроба //Проблемы особо опасных инфекций. Саратов. - 2001. - С. 119-125.

81. Кириленко В.Н., Стефанов А.В., Скорик Л.В., Мельничук Д.А. Получение липосом из фосфолипидов пахты //Тез. докл. 5 Всесоюзн. конф. "Методы получ. и анал. биохим. препаратов". (Юрмала, 26-28 oict. 1987). -Рига, 1987. -С.186.

82. Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., Бенов Л.Ц., Рибаров С.Р. Инициирование перекисного окисления липидов мембран липосом активированными полиморфноядерными лейкоцитами крови //Бюл. эксперим. биол. и мед. 1988. - Т. 105, N 6. - С.674-677.

83. Кобринский Г.Д. Липосомы транспортеры лекарств.- М.: Знание, 1989.-49 с.

84. Крейнес В.М., Мельникова В.М., Марголин Я.М. Противовоспалительные эффекты липосом //Вестн. Акад. мед. наук СССР. -1990. -N 6. С.44-47.

85. Криобиология и биотехнология /Под ред. А.А.Цуцаевой. Киев: Наукова думка, 1987. - 216 с.

86. Кружалкин М.А. Применение антиоксидантов в комплексной терапии экспериментального сальмонеллеза. Автореф. дис. . канд. фарм. наук. - Пятигорск, 2001. - 23 с.

87. Кузнецов О. К., Киселев О.И., Автушенко С.С. Экспериментальное изучение сухой липосомальной инактивированной гриппозной вакцины (ЛИГВ) для перорального введения //Современная вакцинология — Пермь, 1998 —С 107-108.

88. Кузякова JI.M. Методологические подходы и разработка технологии липосомальных лекарственных и лечебно-профилактических препаратов: Дис. . .д-ра фарм. наук. Пятигорск, 2000. - 326 с.

89. Кузякова Л.М., Ефременко В.И. Медикаментозное преодоление анатомических и клеточных барьеров с помощью липосом. Ставрополь, 2000.- 169 с.

90. Куликов В.И., Кашкин К.П., Драновская Е.А. Включение про-тективного антигена Brucella abortus в липосомы и иммуногенные свойства антигенсодержащих липосом //ЖМЭИ. 1985. - N 12. - С.69-72.

91. Курунов Ю.Н., Николин В.П., Каледин В.И. Изучение эффективности антибактериальных препаратов, заключенных в липосомы, при лечении экспериментального туберкулеза //Проблемы туберкулеза. 1982. - N 10. - С.54-58.

92. Кучма И.Ю., Волянский А.Ю., Москаленко В.Ф. Применение фенилимидацисаконитовой кислоты в липосомальной форме для терапии герпеса //Журн. микробиол. 2000. - № 5. - С. 58-61.

93. Ладыгина Г.А. Экспериментальное изучение липосомальной формы стерптомицина и дигидростерптомицина на модели туберкулеза -Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 1985. - 19 с.

94. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. -М.Медицина, 1985.-255 с.

95. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Гордеева Н.Т. Липоксигеназы животных: активация липоксигеназы ретикулоцитов при взаимодействии с природными и искусственными мембранами //Биохимия. 1983. - Т.48, N 12. -С.2009-2015.

96. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., 1969. - 645 с.

97. Липосомы в биологических системах /Под ред. Г.Грегориадиса, А.Аллисона, М., 1983.-384 с.

98. Лусс Л.В., Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Бхардварж А, Бхар-дварж Л.А. Роль иммуномодулирующей терапии в общеклинической практике // Иммунология.- 2000,- №5,- С.34- 38.

99. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками //М.: Наука, 1986. 240 с.

100. Марголис Л.Б., Нейфах А.А. Взаимодействие липосом с клетками. Липосомы с жидко-кристаллической мембраной //Успехи совр.биолог.- 1982. Т.93, N 2. - С. 214-229.

101. Мартынова О.М., Тюрина О.П., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М., Швец В.И., Ларионова Н.И. Взаимодействие трипсина с мультила-меллярными везикулами из липидов сои // Биохимия. 2000. - Т.65, № 9. -С. 1240-1246.

102. Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей,- Т.2. М.: «Новая волна», 2000.- 608 с.

103. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза.- Казань: Магариф, 1993.- 192 с.

104. Медуницын Н.В. Антиинфекционный иммунитет, вакцинация и антигены гистосовместимости // ЖМЭИ.- 1990.- №8.- С. 107.

105. Медуницын Н.В. Вакцинология. М., 1999.

106. Медуницын Н.В. Лечебные вакцины и иммунотерапия инфекционных болезней //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - № 4.-С. 52-56.

107. Мельников В.Р., Кобринский Г.Д., Львов Н.Д. Лечение липосо-мальным интерфероном экспериментального генитального герпеса //Вестн. акад. мед.наук СССР. 1990. - N8. - С.35-37.

108. Мельянцева Л.П., Крейнес В.М., Булгаков В.Г. Влияние уровня перекисного окисления липидов и величины рН липосомальной суспензии на ее антибактериальную активность //ЖМЭИ. 1995. - N 1. - С. 6-10.

109. Мельянцева Л.П., Крейнес В.М., Шраер Т.И., Лагунова Н.Г., Ульянцева И.М. Влияние продуктов перекисного окисления липосомальных липидов на антибактериальную активность липосом // Антибиотики и химиотерапия.- 1992.-Т.37,№11.- С.8-10.

110. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Учеб. пособие /Под ред. проф. М.И.Прохоровой. JT: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. - 272 с.

111. Мигунов А.И., Кузнецов O.K., Киселев О.И. Использование липосом для конструирования вакцин // Вопросы вирусологии. 2001. - № 2. - С.4-7.

112. Минухин В.В. Иммуногенные свойства липосомальной формы анатоксина синегнойной палочки при экспериментальном термическом ожоге у мышей //Деп в УкрНИИНТИ 24.09.90, N 1623 Ук 90.- 9 с.

113. Минухин В.В., Бродииова Н.С., Цыганенко А.Я. Иммуногенные свойства липосомальной формы анатоксина синегнойной палочки //Вестн. акад. мед.наук СССР. 1990. - N 8. - С.44-47.

114. Минухин В.В., Халанский А.А. Содержание лейкотриена С 44 в плазме крови мышей, иммунозированных липосомальной формой анатоксина синегнойной палочки //Деп в УкрНИИНТИ 24.01.91, N 159 Ук 91. -5 с.

115. Мисетова Е.Н. Влияние липосом на показатели гомеостаза макроорганизма // Студенческая наука экономике России: Сб. матер. III межрегион. науч. конф. - Ставрополь, 2002. - Т.1. - С. 129-130.

116. Мисетова Е.Н. Метаболические изменения в крови при различных способах введения липосом: Дис. . канд. мед. наук, Ставрополь, 2003.- 167 с.

117. Митрофанова Т.К., Евстигнеева Р.П. Способ получения фосфа-тидилхолинов. А.с. СССР № 957908, А61К 35/50, оп. 15.09.82, Бюл. №34

118. Молочная С.В., Прищепа И.В. Влияние липосомальных препаратов на гормональный и иммунный статус у больных бронхиальной астмой // Тез.докл. II Российск. национ. конгресса "Человек и лекарство" (1015 апреля 1995). М., 1995.-С. 113.

119. Музя Г.И., Лыкова Е.О., Шестаков К.А. Способ получения липосом, содержащих водорасторимые низкомолекулярные соединения: Пат. РФ N2014071, 1994.

120. Навашин С.М. Макро- и микроорганизм взаимодействие в инфекционном процессе при антибактериальной терапии //Антибиотики и химиотерапия.- 1998. - № 11. - С. 3-5.

121. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотера-пия. М., "Медицина", 1982.- 495 с.

122. Нагоев Б.С. Очерки о нейтрофильном гранулоците. Нальчик,1986.-144 с.

123. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. -Саратов, 1992.- 172 с.

124. Никитин А.В., Литовченко К.В. Побочное действие фторхино-лонов, Безопасность и переносимость левофлоксацина при клиническом применении //Ант. и химиотерапия.- 2002. Т. 47. - №. 4. - С. 20-22.

125. Никонов Г.И. Дестабилазный комплекс природная липосома, синтезируемая медицинской пиявкой //Тез.докл. II Российск. национ. конгресса "Человек и лекарство" (10-15 апреля 1995). - М., 1995. - С.214.

126. Нэромэ Куниаки. Модифицированные вакцины липосомы -вакцины //Кобунси, High Polym Jap. - 1986. - Т.35, N 6. - С.563.

127. Оверченко В.В. Лечение сибирской язвы у экспериментальных животных свободными и липосомальными формами антибиотиков и им-муномодуляторов Автореф. дис. . канд. мед. наук. — Ростов-на-Дону, 2002. 22 с.

128. Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований // Пат. физиология. 1960. - № 4. - С. 76-85.

129. Онищенко Г.Г., Монисов А.А., Гульченко Л.П., Федоров Ю.М. Заболеваемость зооантропонозными и природноочаговыми инфекциями и меры по их профилактике // ЖМЭИ.-1999.-№4.-С.14-17.

130. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Влияние некоторых факторов на криорезистентность и сохранение жизнеспособности при лиофилизации культур Bacillus subtilis //Биотехнология. 2002. - № 3. -С. 45-54

131. Остро М.Д. Липосомы //В мире науки. 1987. - N3. - С.71-79. Отрощенко В.А., Деборин Г.А., Янопольская Н.Д. с соавт. Исследование включения нуклеотидов в липосомы //Изд. АН СССР. Сер. биол. - 1988. -N5. - С.772-776.

132. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Фторхинолоны. М., 1995.- 208 с.

133. Пигаревский В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства. — М.,1978

134. Пирс Э. Гистохимия: Пер. со 2-го англ. издания. М., «Изд-во Иностранной литературы». -1962.- С.752.

135. Плетнева О.П., Оксинойд О.Э., Афонин Н.И. Некоторые аспекты создания лекарственной формы липосомального препарата цитабарина //Вестн. акад. мед.наук. СССР. 1990. - N 8. - С.33-34.

136. Покровский В.И., Пак С.Г., Брико Н.И., Данилкин Б.К. Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник. М.: «Гэотар Медицина», 2000.-384 с.

137. Постановление восьмой (LXXI) сессии общего собрания Российской академии медицинских наук «Новые технологии в медицине XXI века» //Вестник РАМН. 1999. - № 10. - С. 32-34.

138. Препаративная биохимия липидов. Москва. Наука. - 1981.-е.10.15.

139. Ротов К.А., Васильев В.П., Антонов Ю.В. Получение и характеристика липосом, содержащих антибиотики //Микробиол. журн. 1989. -Т.51, N 6.- С.79-83.

140. Ротов К.А., Перепелкин А.И., Тихонов Н.Г. Эффективность стрептомицина, включенного в липосомы, при лечении туляремии животных //Человек и лекарство: Тез. докл. VII Российского национального конгресса. 10-14 апреля 2000. - М., 2000. - С. 540.

141. Ротов К.А., Тихонов Н.Г., Климова И.М. Использование липосомальной формы сульфазина для лечения экспериментального мелиоидоза //Тез.докл. II Российск. национ. конгресса "Человек и лекарство" (10-15 апреля 1995). М., 1995. - С.214.

142. Ротов К.А., Тихонов Н.Г., Климова И.М. Разработка схем лечения экспериментального мелиоидоза липосомальной формой тетрациклина //Тез.докл. II Российск. национ. конгресса "Человек и лекарство" (10-15 апреля 1995). М., 1995.- С.225.

143. Ротов К.А., Тихонов Н.Г., Петров В.И. Эффективность лечения острого мелиоидоза липосомальным цефазолином //Человек и лекарство: Тез. докл. VII Российского национального конгресса. 10-14 апреля 2000. -М., 2000.-С. 540.

144. Руководство по профилактике чумы /под ред. Н.И.Николаева. -Саратов. 1972.-200 с.

145. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. Аутологичные липосомы //Вестн. акад. мед.наук СССР. 1990. - N 8. - С.47-50.

146. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. с соавт. Способ получения Липосом: А.с. СССР N 1022357, 1983.

147. Савельева И.В. Эффективность наружного применения новой магнитоуправляемой липосомальной лекарственной формы преднизолона // XII итоговая (межвузовская) научная конференция молодых ученых и студентов. Ставрополь. - 2004. - С. 370-371.

148. Саипов Т.Д., Исаев Э.И., Исмаилов С.И., Садыков С. Изменение содержания фосфолипидов при узловом зобе и коррекция нарушений обмена липосомными препаратами //5 Конф. биохимиков респ. Сред.Азии и Казахстана. Ташкент, 1991. - С.322.

149. Самарина И.В., Таран И.Ф. Преимущество липосомальной формы рифампицина при экспериментальном бруцеллезе //Тез. докл. научн. конф. "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций". Ставрополь, 1991. - С.53-55.

150. Самойлова Л.В.Динамика развития иммунитета к чуме после прививки живой вакциной и особенности иммуногенеза при этой вакцинации Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов. - 1963. - 16 с.

151. Сафронова В.М., Локтев Н.А., Руднев С.М. Практическое пособие по цитоэнзимохимическим методам исследования. Ставрополь, 1994. -11с.- Рус. - Деп. в ВИНИТИ № 1424 - В.94.

152. Севастьянов В.И. Биосовместимость. -М., 1999. — 368 с.

153. Смирнов А.А. Получение липосом методом с обращением фаз и замораживанием оттаиванием //Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1984. - Т.97, N8. - С.249-252.

154. Солодовников Б.В. Совершенствование биотехнологии производства сибиреязвенного диагностического бактериофага. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ставрополь. — 2002. — 20 с.

155. Справочник по клинической фармакологии и фармакопии /Под ред. И.С.Чекман, А.П.Белещук, О.А.Пятак //Киев, «Здоров'е», 1987. С. 653.

156. Стефанов А.В., Пожаров В.П., Миняйленко Т.Д. Биологический эффект липосом при гипоксических состояниях различной этиологии //Вестн. Акад.мед.наук СССР. 1990. -N 6. - С.47-51.

157. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина.- 1993.-628 с.

158. Сухинин В.П., Зарубаев В. В., Платонов В Г. Влияние липосо-мального бета-каротина на экспериментальную летальную гриппозную инфекцию// Вопр вирусол. — 1999. —N. 4.- С 163-167.

159. Сулейманов А.К., Ющук Н.Д., Никулин В.Н., Кузнецов В.Ф., Желудков М.М. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови у больных хроническим бруцеллезом // ЖМЭИ. 1993. - № 4. -С. 99-103.

160. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.Н. Методы статистической обработки результатов серологических исследований //ЖМЭИ. 1969. - № 10. - С. 26-31.

161. Таран И.Ф., Лямкин Г.И., Антоненко А.Д., Сысолятина Г.В.,

162. Шпилевая Э.Г., Панченко В.П., Дальвадянц В.Г., Ляпустина Л.В., Малец-кая О.В., Соколова И.А. Проблемы борьбы с бруцеллезом в Ставропольском крае Ставрополь, 1999.-17 е.- Деп в ВИНИТИ 15.11.99. №3360-В99.

163. Таранеико Т.М., Гусева Н.П., Киреев М.Н. Липосомальная модификация антигенов чумного микроба //Тез. стенд, сообщений второго съезда биохим. общества Российской академии наук. Пущино, 1997. -4.II. -С.310-311.

164. Тихонов Н.Г., Ротов К.А., Перепелкин А.И. Липосомальные антибиотики и их использование при лечении особо опасных инфекционных заболеваний //Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. науч. тр. Волгоград, 2000. -С. 291-301.

165. Тихонов Н.Г., Ротов К.А., Перепелкин А.И. Липосомальный гентамицин в лечении экспериментального бруцеллеза //Проблемы биологической и экологической безопасности: Сб. материалов междунар. науч. конф. 22-25 мая.-Оболенск, 2000.-С.95.

166. Тихонова С.Н., Комисаренко С.В., Волощенко Ю.В., Богуславский В.А., Мирошниченко И.Ю., Гавриш И.Н. Способ получения комплекса липидов «Фосфотим» из животного сырья. Пат. РФ № 1836092, А61К 31/685, оп.23.08.93, Бюл.№31

167. Ткаченко Л.И. Функционально-метаболическая активность нейтрофильных гранулоцитов у больных с различными клиническими формами бруцеллеза в процессе комплексного лечения. Автореф. дис. канд.мед. наук. — Ставрополь, 1995. 23 с.

168. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций: Автореф. дис. . д-ра мед. наук.- Саратов, 1996. 57с.

169. Тюрина О.П., Шарф Т.В., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М., Швец В.И., Ларионова Н.И. Комплексообразование основного панкреатического ингибитора протеиназ с мультиламеллярными везикулами фосфолипидов из сои // Биохимия. 2001. - Т.66, № 3. - С. 419-424.

170. Тюрин-Кузьмин А.Ю. Метод приготовления липосом с большим внутренним объемом //Тез. докл. II Российского национального конгресса "Человек и лекарство" (10-15 апреля 1995). М., 1995. - С.20-21.

171. Устьянцева И.М. Исследование механизма токсичности липосом: Автореф. дис. . канд. биол. наук. 1991. -22 с.

172. Ушкалова В.И., Иоанидис Н.В., Кадочникова Г.Н., Деева З.М. Контроль перекисного окисления липидов. Новосибирск. - 1993. — 181 с.

173. Федосеева В.Н., Авдеева Т.А., Шустова В.И. Гипосен-сибилизирующие свойства липосомальных аллергенов //Тез. докл. II российск. национ. когресса "Человек и лекарство" (10-15 апреля 1995). М., 1995. -С.146.

174. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса // Иммунология. 1995. - № 4. - С. 3-8.

175. Хаитов P.M., Пинегин Б.П. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения // Иммунология,- 2000.- №5.- С.4-7.

176. Хворостов И.Н. Экспериментальное фармакологическое и токсикологическое изучение липосомальных форм антибиотиков группы ами-ногликозидов. Автореф. дис. . канд. мед. наук. - Волгоград, 2001. - 18 с.

177. Ховака В.В., Стефанов А.В., Шевченко А.В. Способ стабилизации липосом: А.С. 1214101 А, СССР.-1984.

178. Цыганенко А.Я., Степаненко С.И., Иванова Н.Н. Эффективность интактных липосом при экспериментальном эшерихиозном перитонине у мышей //Микробиол., эпидемиол и клиника инфекц. болезней. Харьковский мед. ин-т. - Харьков, 1991. - С.46-48.

179. Черепахина И.Я., Козловский В.Н., Ефанова Е.А. Динамика образования антител к вакцинному штамму Fracisella tularensis при различных схемах иммунизации //Микробиол. журн. 1990 - Т. 52.- №2. - С. 8993.

180. Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Липиды в лекарственных препаратах //Вестн. Акад. мед.наук СССР. 1990. - N 6. - С. 19-28.

181. Шнейдер М. Способ получения липосом: Пат. N 1158031, СССР, 1985.

182. Шопен И.В. Цитоэнзимохимическая активность нейтрофилов периферической крови при хронических заболеваниях печени. Автореф. дис. . канд. мед. наук. - Ставрополь, 1999. - 20 с.

183. Экспериментально-производственный регламент «Иммуноглобулины диагностические чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые) полигрупповые люминес-цирующие. Ставрополь. - 1987.- 351 с.

184. Экстренная профилактика и лечение опасных инфекционных заболеваний //Методические указания. МЗ России. Москва, 2000. — 43 с.

185. Яковлев В.П. Сравнительная фармакокинетика ломефлоксацина и других фторхинолонов // Антибиотики и химиотерапия.- 1998.-Т.43,№10.- С.46-52.

186. Яковлев В.П., Полушкина Н.Р. Моксифлоксацин: антимикробная активность и фармакокинетические свойства //Антибиотики и химиотерапия. 2002. - Т. 47. - № 5. - С. 19-29.

187. A new vaccine in the bag //New Sci, 1981. V.90. - P.558 Abra R.M., Hunt C.A., Lau D.T. Liposome disposition in vivo YI: Delivery to the lung //J. pharm.Sci. - 1984. - V.73, N 2. - P.203-206.

188. Allen T.M., Murray L., MacKeigan S., Shah M. Chronic liposome administration in mice: effects on reticuloendothelial function and tissue distribution //J. Pharmacol, and Exp. Ther. 1984.- V.229, N 1. - P.267-275.

189. Allen T.M., Smuckler E.A. Liver pathology accompanying chronic liposome administration in mouse // Res.Commun. Chem. Pathol, and Pharmacol. 1985. - V.50, N 2. - P.281-290.

190. Alving C.R. Liposomes as carriers of antigens and adjuvants // J.Immunol. Meth. 1991. - V. 140, N 1. - C. 1-13.

191. Alving C.R., Urban K.A., Richards R.L. Influence of temperature of complement-dependent immune damage to liposomes //Bioc- him. et biophys. acta. 1980. - V.600, N 1. - P.l 17-125.

192. Ambrosch F., Wiedermann G., Jonas S. Immunogenicity and protec-tivity of a new liposomal hepatitis A vaccine // Vaccine. 1997. — Vol. 15 - P. 1209-1213.

193. Araujo R., Lobenberg J., Kreuter J. Influence of the surfactand concentration of the body distribution on the body distribution of nanoparticles. — J. Drug Targeting, 1999. № 5. - P. 373-385.

194. Astaldi G., Verga Z. The glicogen content of the cells of lymphatic leucemia // Acta Haemat. 1957. - V. 17, № 3. p. 129-136.

195. Bachhawat B.K. Biresh Chandra Guha Memorial Lecture 1984. Liposome technology //Proc. Indian Nat. Sci. Acad. - 1985. - V.51, N 4. - P.639-648.

196. Bachhawat B.K. Liposome technology in medicine //Ann.Nat. Acad. Med. Sci (India). 1986. - V.22, N 2. - P. 71-77.

197. Baker E.E., Sommer H., Foster E.E., Meyer E., Meyer K.F. Studies on immunization against plague. 1. The isolation and characterization of the soluble antigen of Pasteurella pestis // J. Immunol.- 1952.- V.68.- P. 131-145.

198. Bakouche О., Lachman L.B. Synthetic macrophages: Liposomes bearing antigen, class II MHC and membrane-IL-1 //Lymphokine Res.- 1990. -V.9, N 3. P.259-281.

199. Barsukov L.I., Hauser II., Hasselbach H.J., Semenza G. Phosphatidylcholine exchange between brush border membrane vesicles and sonicated liposomes //FEBS Lett. 1980. - V.l 15, N 2. - P. 189-192.

200. Betager G.V., Black C.D., Szebeni J. Fc-receptor-mediated targeting of antibody-bearing liposomes contaning dideoxycytidine triphosphate to human monocyte (Macrophages) //J.Pharm. and Pharmacol. 1993. - V.45, N 1. - P.48-53.

201. Boudad H., Ponchel G., Legrand P., Duchene D. Poly (isobutylc-tanacrylate) cyclodextrin combined nanoparticles for oral administration of saquinavir. Proc. 3 rd World Meeting APV / APGI, Berlin, 3/6 April, 2000, P. 24.

202. Cafiso D.S., Petty H.R., McConnell H. Preparation of unilamellar lipid vesicles at 37 5°C by vaporization method //Biochim. et biophys. acta. -1981. V.649. - P. 129-131.

203. Choquet C.G., Patel G.B.,Beveridge T.J., Sprott G.D. Formation of unilamellar liposomes from total polar lipid extracts of methanogens //Appl. and Environ. Microbiol.- 1992. V. 58, N 9.- P.2894-2900.

204. Couvreur P., Fattal E., Andermont A. Liposomes and nanoparticles in the treatment of intracellular bacterial infections // Pharm. res. 1991. - V.8. -P. 1079-1086.

205. Cryz S.J., Que J.U., Gluck R. Virosome vaccine antigen delivery system does not stimulate an antiphospholipid antibody response in humans //Vaccine.- 1996.-Vol. 14, —P. 1381-1383.

206. Curti P.C. The role of surfactant in the alveolar defence from inhaled particles//Lung and Respir. 1988. - V.5, N 1. -P.8-10.

207. Davis D., Davies A., Gregoriadis G. Liposomes as immunological adjuvants in vaccines: studies with entrapped and surfacelinked antigen //Biochem.Soc.Trans. 1986.-V.14, N 6. - P.1036-1037.

208. Davis D., Gregoriadis G. Primary immune response to liposomal tetanus toxoid in mice: the effect of mediators //Immunology.- 1989. V.68, N 2. - P.272-282.

209. De Rycke J. Effect of rifampicine and tetracycline alone and in combination against Brucella suis // Ann. Microbiol.- 1980.- V.131, №3.- P.277-287.

210. Dees C., Fountain M.W., Schultz R.D. Liposome antibiotis activated phagocytes enhanced intraphagocytic killing of Brucella abortus by liposomes, containing gentamycin //Fed. Proc. 1982.- V.41, N 3. - P.4361-4369.

211. Dees C., Fountain M.W., Taylor J.R., Schultz R.D. Enhancedin-traphagocytic killing of Brucella abortus in bovine mononuclear cells by lipo-somes-containing gentamicin //Vet. Immunol, and Immunopathol. 1985. - V.8, N 1-2. - P. 171-182.

212. Dees C., Schultz R.D. The mechanism of enhanced intraphagocytic Killing of bacteria by liposomes containin antibotics //Vet. Immunol, and Immunopathol. 1990. - V.24, N 2. - P.135-146.

213. Dijkstra J., Mellors J.W., Ryan J.L. Altered in vivo activity of lipo-some-incorporated lipopolysaccharide and lipid A. //Infect, and Immun. 1998. - V.57.,N 11.-P.3357-3363.

214. Dijkstra J., Ryan J.L., Szoka F.C. //A procedure for the efficient incorporation of wild-type lipopolysaccharide into liposomes for use in immunological studies //J.Immunol. Meth. 1988.- V.l 14, N 1-2. - P.197-205.

215. Egbaria K.,Ramachandran C.,Kittayanond D., Weiner N Topical delivery of liposomally encapsulated interferon evaluated by in vitro diffusion studies //Antimicrob. Agents and Chemother. -1990. V.34, N 1. - P. 107-110.

216. Fendler J.H. Membrane mimetic systems that contain catalysts, semiconductros and magnets //Chemtech. 1985. - V.l5, N11. - 686-691.

217. Fiani M.L., Grimaldi P., Sargiacomo M. Development for liposomal carrier specific for mucosal immunity //Ann. Scla- vo. 1986 (1987). - N 1-2. -P.123-124.

218. Francis J.W., Stoehz S.J., Margolis D.I. Glyceraldehyde-3-phosphat dehydrogenase promote Ca 52+-dependent fusion of liposomes and secretion sinpermeabilyzed neutrophils //J.Cell.Biol. 1990. - V.l 11, N 5. - P.77.

219. Frisch В., Muller S., Hriand J.P. Parameters affecting the immuno-genecity of a liposome-associated synthetic hexapeptide antigen //Eur.J.Immunol. 1991. - V.21, N 1. - P.185-193.

220. Furukawa M., Ohtsubo Y., Sugimoto N. Induction of tumoricidal activated macrophages by a liposome-encapsulated glycolipid, trehalose 2,3'6-trymicolate from Gordona aurantiaca //FEMS Microbiol. Immunol. 1990. -V.64, N 2. - P.83-88.

221. Garcon N., Gregoriadis G., Taylor M., Summerfield J. Mannose-mediated targeted immunoadjuvant action of liposomes //Immuno- logy. 1988.- V.64, N4. -P.743-745.

222. Gerlier D., Bakouche O., Dore J.F. Liposomes as a tool to study the role of membrane presentation in the immunogenicity of a MuLV-related tumor antigen//J. Immunol. 1983. - V.l31, N 1.- P.485-490.

223. Gluck R. Immunopotentiating reconstituted influenza virosomes (1RIV) as universal vaccine carriers // Options for the Control of Influenza III / Eds. L E Brown et al. — Berne, 1996. — P. 668-676.

224. Gluck R., Mischler R., Finkel B. Immunogenicity of new virosome influenza vaccine in elderly people // Lancet. — 1994. — Vol. 344. P. 160— 163.

225. Gluck U. Gebbers J. O., Gluck R. Phase I evaluation of intranasal vi-rosomal influenza vaccine with and without Escherichia coli heat-labile toxin in adult voluntteers // J. Virol. — 1999. — Vol. 73. P. 7780-7786.

226. Gregoriadis G. The tmmunological adjuvant and vaccine carrier properties of liposomes //J. Drug. Targeting. — 1994. —Vol. 2. P 351-356.

227. Harding C.V., Collins D.S., Slot J.W. Liposome-encapsulated antigens are processed in lysosomes, recycled and presented to T cells //Cell. 1991.- V.64, N2. -P.393-401.

228. Harokopakis E. Childers N.K., Michalek S.M. Conjugation of cholera toxin or its В subunit to liposomes for targeted delivery of antigens //J.Immunol.Meth. 1995. - V.185, N 1. -P.31-42.

229. Hauser H.O., Barrat M.D. Effect of chain lenght on the stability of lecitnin bilayres // Biochem. and Biophys. Res. Commun.- 1973,- V.53.- P.399-405.

230. Hayashi M., Muramatsu Т., Нага I., Seimya T. Phase transition of phospholipids monolayers and surface viscosity // Chem. and Phys. Lipids.1975.-V.15.-P. 209-215.

231. Holzer B.R., Hats C., Schmidi-Sissolak D. Immunogenicity and adverse effects of inactivated virosome versus alum-adsorbed hepatitis A vaccine: a randomized controlled trial //Vaccine. 1996. - Vol. 14. - P. 982-986.

232. Huang J.T. Accumulation of aminoacids, metenkephalinamide and morphine in choroid plexus: effect of pretreatment with phosphatidylcholine vesicles //Res. Commun. Chem. Pathol, and Pharmacol. 1980. - V.28, N 3. -P.567-570.

233. Huang K.J., Luk K.S., Beaumier P.L. Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomielin cholesterol liposomes: A Kinetic study //Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1980. - V.77. - P.4030-4034.

234. Hub H.H., Zimmermann U., Ringstorf H. Preparation of large unilamellar vesicles //FEBS Lett. 1982. - V.140. - P.254-256.

235. Iinuma H., Nerome K., Yoshioka Y. Characteristics of cytotoxic T lymphocytes directed to influenza virus haemagglutinin elicited by immunization with muramyldipeptide-innuenza liposome vaccine //Scand. J. Immunol. — 1995.—Vol. 41.—P. 1-10.

236. Jacobson K., Papahadjopoulos D. Phase transitions and phase separations in phospholipid membranes induced by changes in temperature, pH and bivalent cations//Biochemistry.- 1975,- V. 14.-P. 152-161.

237. Jizomoto H., Kanaoka E., Hirano K. Encapsulation of drugs by ly-iphilized, empty dipalmitoylphosphatidylcholine liposomes //Chem. and Pharm. Bull. 1989. - V.37, N 7. - P.1895-1898

238. Johnston D.S., Sanghera S., Pons M., Chapman D. Phospholipid polymers synthesis and spectral characteristics //Biochim. et biophys. acta. -1980.-V. 602. - P.57-69.

239. Kanaseki Т., Kawasaki K., Murata M. Structural features of membrane fusion between influenza virus fnd liposome as revealed by quick-freezing electron microscopy // J. Cell Biol. 1997. - V.137. - P. 1041-1056.

240. Kaplow L.S. The relastionship of mieloperoxdaze activity to neutrophil maturity indicators of infection // Blood Cells. 1986. - V.12, № 1. - P. 153-165.

241. Kaplow L.S. A histochemical procedure for localising and evaluating leukocyte alkaline phosphates activity in smears of blood and marrow // Blood the J. of Haematology.- 1955.- № 10.- P. 1023-1029.

242. Kato E., Akiyoshi K., Furuno T. Interaction between gangliosidecontaining liposome and rat T-lymphocyte: Confocal fluorescence microscopic study //Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1994. - V.203, N 3. - P. 17501755.

243. Kitano H. Polymerized liposomes //Сэйбуцу буцури, Biophysics. -1987. V.27, N 5. - P.229-232.

244. Koehler T.M., Collier R.J. Anthrax toxin protective antigen: low-pH-induced hydrophobicity and channel fornation in liposomes //Mol. Microbiol. 1991. - V.5, N 6. - P.1501-1506.

245. Kremer J.M.H., Esker M.W.J., Pathmamanoharan C., Wiersema P.H. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method //Biochemistry.- 1977.- V.16.- P. 3933-3935.

246. Latif N., Bachhawat B.K. Liposomes in immunology //J.Biosci. -1984. V.6, N 4. - P.491-502.

247. Latif N., Bachhawat B.K. The effect of surface sugars on liposomes in immunopotentiation //Immunol. Lett.- 1984. V.8, N 2. - P. 75-78.

248. Lichtenberg D., Markello T. Structural characteristics of phospholipid multilamellar liposomes //J. Pharm. Sci. 1984. - V.73, N 1. - P. 122-125.

249. Liu D., Wada A., Huang L. Potentiation of the humoral response of intravenous antigen by splenotropic liposomes //Immunol. Lett. 1992. - V.31, N2. -P.177-182.

250. Lochman L. В., Ozpolat В., Rao X.M. Cytokine containing liposomes as vaccine adjuvants //Eur. Cytokine Netw. — 1996. Vol. 7. - P. 693698.

251. Loughrey H.C., Choi L.S., Cullis P.R., Bally M.B. Optimized procedures for the coupling of proteins to lipisomes //J.Immunol. Meth. 1990. - V. 132, N 1. - P.25-35.

252. Loutan L, Bovier P., Althaus B. Inactivated virosome hepatite A vaccine //Lancet. -1994. -Vol. 343. -P. 322-324.

253. Love W.G., Amos N., Williams B.D., Rellaway I.W. High performance liquid chromatographic analysis of liposome stability //J. Microencapsul. -1990. V.7,N 1. -P.105-112.

254. Manosroi A., Bauer K.H. The entrapment of a human insulin-DEAEdextran complex in different compound liposomes // Drug Dev. and Ind. Pharm.- 1989. V.15, N 14-16. - P.2531-2546.

255. Marie-Line Joffret., Sylvie Morgeaux., Claude Leclerc et al. Enhancement of interleukin-2 activity by liposomes //Vaccine. 1990. - V.8, N 4. -P.385-389.

256. Maitinon F., Krishnan S., Lenzen G. Induction of virus-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo by liposome-entrapped mRNA //Eur. J. Immunol.- 1993.-Vol. 23.-P. 1719-1722.

257. Matei L., Trif M., Motas C. Lipozomes as immunological adjuvants for lysozame, intragastrically administered into rabbits, serum immunity potentiating //Rev.roum. biochim. 1986. - V.23, N 3. - P.203-209.

258. Mc Cown J.T., Evans E., Diehl S., Wiles H.C. Degree of hydration and lateral diffusion in phospholipid multibilayers // Biochemistry.- 1981.- V. 20.-P. 3134-3138.

259. Medda S. Das N., Mahato S.B. et al. Glycoside-bearing liposomal delivery systems againts macrophage-associated disorders involving Mycobacterium leprae and Mycobacterium tuberculosis //Indian J. Biochem. and Biophys.- 1995. V.32, N 3. - P.147-151.

260. Mengiardi В., Berger R., Jast M. Virosomes as carriers for combined vaccines//Vaccine.- 1995.-Vol. 13.-P. 1306-1315.

261. Mincheva R., Boyanov A., Tenchov B. Interaction of "solid" and liquid crystalline multilamellar liposomes with alveolar macrophages //Докл. Болг. АН 1990. - T.43, N 12. - P. 132-138.

262. Mufson D. Liposomes: a novel delivery system for peptides and other drugs //World Biotech. Rept, 1986; Proc. Conf., San Francisco. Nov, 1986.- V.2. Pt 6. New York, London, 1986. P.29-34.

263. Munn M.W., Parce J.W. Antibody-dependent phagocytosis of hapte-nated liposome by human neutrophils is dependent on the physical state of the liposomal membrane //Biochim. et biophys. acta. 1982. - V.692, N 1. - P. 101108.

264. Nayar R., Fidler I.J. The systemic activation of macrophages by liposomes containing immunomodulators //Springer-Semin. Immu- nopathol.1985. V.8, N 4. - Р.413-428.

265. Nerome К., Yoshioka Y., lshida M. . Development of a new type of influenza subunit vaccine made by muramyldipeptide-liposome enhancement of humoral and cellular immune responses //Vaccine. 1990. -Vol. 8. - P. 503509.

266. Neveu P.J. Immunogenicity of hapten-carrier conjugates associated with liposomes //Int. Arch. Allergy and Appl. Immunol. 1987. - V.84, N 3. -P.306-310.

267. Nussbaum O., Lapidot M., Loyter A. Reconstitution of functional influenza virus envelopes and fusion with membranes and liposomes lacking virus receptors//J.Virol. — 1987. —Vol. 61.-P. 2245-2252.

268. Oliver J., Fenart L., Chauvet R., Pariat C., Cecchelli R., Couet W. Evidence that drug brain targeting using polysorbate 80-coated polybutyl-cyanoacrylate nanoparticles is related to toxicity // Pharm. Res. 1999. - V.16, № 12. - P. 1863-1842.

269. Oxford J. S., Hockley D.J., Heath T.D. The interaction of influenza virus haemagglutinin with phospholipid vesicles — morphological and immunological studies //J. Gen. Virol. — 1981. Vol. 52. - P. 329-343.

270. Parant M., Chedid L. Macrophage activation by muramylpeptides //Biol.Prop. Peptidoglycan Proc. 2 Int.Workshop. Munich, May 20-21. 1985. -Berlin; New York, 1986. P.353-370.

271. Phillips N.C., Major P.P, Sikorska H. Tumor-associated antigens as immunotherapy targets //Cancer Detect, and Prev. 1988. V.12, N 1-6. - P.451-459.

272. Pick U. Liposomes with a large trapping capability prepared by freezing //Arch. Biochem. and Biophys. 1981. - V.212. - P. 186-194.

273. Pimm M.V., Baldwin R.W. Liposomal encapsulation augments delayed hypersensitivity reactions to tuberculin proteins //J.Med. Microbiol. -1984. V.18, N 3. - P.429-432.

274. Plant A.L., Brizgys M.V., Locasio-Brown L., Durst R.A. Generic liposome reagent for immunoassays //Anal.Biochem. 1989. - V.176, N 2. -P.420-426.

275. Pnisieux F., Beau D. Procede de preparation de liposomer et liposomes ainsi obtenus: Заявка N 2561101, Франция; Заявл. 13.03.84, N 84-0342; 0публ.20.09.85.

276. Poltl-Frank F., Zurbriggen R., Helg A. et al. Use of reconstituted influenza virus virosomes as an immunopotentiatmg delivery system for a peptide-based vaccine //Clin. Exp. Immunol. — 1999. -Vol. 117. P. 496-503.

277. Polymerized liposomes //Bioprocess. Technol.- 1989.- V. 11, N 10.1. P.13.

278. Powers J.D., Kilpatrick P.K., Carbonell R.G. Tripsin purification by affinity binding to small unilamellar liposomes // Biotechnol. and Bioeng. -1990. V.36, N 5. - P.506-519.

279. Rabinovici R., Rudolph A.S., Feuerstein G. Improved biological properties of synthetic distearoylphosphatidylcholine-based liposome in the conscious rat //Circ. Shock. 1990. - V.30, N 3. - C.207-219.

280. Raphael L., Tom B.H. Liposome facilitated xenogeneic approach for studying human colon cancer immunity carrier and adjuvant effect of liposomes //Clin, and Exp. Immunol. 1984. - V.55, N 1. - P.l-13.

281. Roerdink F.H., Daemen Т., Regts D. Delivery of macrophage activating factors by means of liposomes //Delivery Syst. Peptide Drugs. Proc. NATO Adv. Res. Workshop, Copenhagen, May 28- June 1, 1986. New York, London, 1986.-P.285-294.

282. Rudolph A.S., Cliff R.O. Dry storage of liposome-encapsulated hemoglobin: a blood substitute //Cryobiology. 1990. - V.27, N 6. - P. 585-590.

283. Samuel D., Patt R., Taylor A.G. Removal of liposomes with incompletely encapsulated enzyme using a monoclonal anti-alkaline phosphatase immunosorbent//J.Immunol. Meth.- 1990. V.l31, N 1.-P. 153-154.

284. Sarkar D.P., Das M.K. Immunogenicity of galactosylated liposomes //Immunol. Commun. 1984. - V.l3, N 1. -P.5-13.

285. Shahum E., Therien H.M. Immunopotentiation of the humoral response by liposomes: encapsulation versus covalent linkage //Immunology. -1988. V.65, N 2. - P.315-317.

286. Shek P.N. Applications of liposomes in immunopotentiation //Immunotoxicol. Curr. Perspect. Princ. and Pract. Proc. NATO Adv. Study Inst., WolfVille, 14-23 July, 1982. Berlin e.a., 1982. - P.103-125.

287. Shek P.N. Dry storage of liposome-encapsulated hemoglobin1.munotoxicol. Curr. Perspect. Princ. and Pract. Proc. NATO Adv. Study Inst., Wolfville, 14-23 July, 1982. Berlin e.a., 1984. - P.107-129.

288. Stozek T. Proby otrzymania liposomow z chlorowodorkiem pro-kainy //Farm, pol.- 1985.-V.41,N 10. P.587-591.

289. Stozek Т., Krowczynski L. Badanie wplywu zamkniecia triamci-nolonu w liposomach na resorpcie przez skore //Farm. pol. 1983. - V.39, N 11. - P.651-656.

290. Szoka F., Jacobson K., Derzko Z., Papahadjopoulos D. Fluorescence studies on the mechanism of liposome-cell interactions in vitro //Biochim. et biophys. acta. 1980. - V.600. - P. 1-18.

291. Szoka F., Papahadjopoulos D. Procedures for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - V.75, N 9. - P.4194-4198.

292. Tan L., Weissig V., Georgiadis G. Comparison of the immune response against polio peptides covalently-surfacelinked to and internally-entrapped in liposomes //Asian Pacific J. allergy immunol. — 1991. Vol. 9. -N. l.-P. 25-30. .

293. Taylor R.L., Williams D.M., Craben P.C. Liposomes as a proposed vehicle for the persorption of bovine xanthine oxidase //Amer. Rev. resp. Dis. -1982. -V. 125.-P.610-611.

294. Tomlinson S., Taylor P.W., Luzio J.P. Transfer of phospholipid and protein into the envelope of gramnegative bacteria by liposome fusion //Biochemistry. 1989. - V.28, N 21. - P.8303-8311.

295. Torchilin V.P., Berdichevsky V.R., Barsukov A.A., Smirnov V.N. Coating liposomes with protein decreases their capture by macrophages //FEBS Lett. 1980. -V.111,N 1. - P.184-188.

296. Van Dijk P.W.M., de Kruiff В., Verkleij A.J. Comparative studies of the effects of pH and Ca 5++ on bilayers of various negatively charged phospholipids and their mixtures with phosphatidylcholine //Biochim. et biophys. acta. 1978. - V.512. - P.84-96.

297. Velinova V., Read N., Kirby C. Morphological observations on the fate of liposomes in the regional limph nodes after footpad injection into rats //

298. Acta biochem. et biophys. 1996. - V.1299, № 2. - P. 207-215.

299. Wachsmann D., Klein J.P., Scholler M. Serum and salivary antibody responses in rats orally immunized with Streptococcus mutans carbohydrate protein conjugate associated with liposomes //Infect, and Immun. 1986. - V.52, N 2. - P.408-413.

300. Wachsmann D., Klein J.P., Scholler M., Frank R.M. Local and systemic immune response to orally administered liposome-associated soluble S.mutans cell wall antigens //Immunology. 1985. - V.54, N 1. - P.189-193.

301. Walden P. Antigen presentation by liposomes as model system for T-B cell interaction//Eur. J.Immunol. 1988. - V.l 8, N 11. - P. 1851-1854.

302. Wassef N.M., Swartz G.M., Alving C.R., Kates M. Antibodies to liposomal phosphatidylcholine and phosphatidylsulfocholine //Biochem. and Cell Biol. 1990. - V.68, N 1. - P.54-58.

303. West G., Martin F.J. High-concentration liposome processing method: Pat. N 4781871, USA, 1986

Информация о работе

Таран, Татьяна Викторовна
доктора медицинских наук
Ставрополь, 2004
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнология получения лекарственных и иммуногенных липосомальных композиций, используемых в лечении экспериментальных особо опасных инфекций и получении сырья для производства медицинских иммунобиол - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы