Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2b интерферона человека: получение и свойства
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2b интерферона человека: получение и свойства"
003489103
Золин Владимир Викторович
ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-2Ь ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА
03.00.06 - вирусология, 03.00.23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук
1 7 ЛЕК 2009
Кольцово-2009
003489103
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.
Научный руководитель
доктор медицинских наук Ставский Евгений Александрович
Официальные оппоненты
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
Евстропов Александр Николаевич Трунов Александр Николаевич
Ведущая организация
НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск
Защита состоится «29» декабря 2009 года в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН «Государственный научный Центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 6330559, тел. (383) 336 - 74 - 28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.
Автореферат разослан « 2-Х ноября 2009 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
Карпенко Л. И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Отечественный рекомбинантный альфа-2Ь (далее альфа-2) интерферон человека (Реаферон) обладает антивирусной, антипролиферативной, иммуномодулирующей активностью [Рафальский В. В., 1997; Ершов Ф. И., 2005]. Являясь белком, Реаферон разрушается в желудочно-кишечном тракте, поэтому основным способом его использования в клинической практике являются инъекции, а также местное или ректальное применение [Ершов Ф. И., 2006; Малиновская В. В., 2006]. Рекомбинантный альфа - 2 интерферон (ИНФ) в виде раствора для инъекций широко применяется в комплексной терапии вирусных и онкологических заболеваний человека, а именно - при острых и хронических вирусных гепатитах В, С, D, гриппе и других ОРВИ (адено-, рино-, корона- и др), вирусных конъюнктивитах, раке почки, волосато-клеточном лейкозе, лимфомах кожи, плоскоклеточном раке кожи, рассеянном склерозе, СПИДе, цитомегаловирусных инфекциях и многих других болезнях [Smith G. L. et al., 1998; Sen G. С., 2001; Samuel С. E., 2001; Lenschow D. J. et al., 2007; Ершов Ф. И. и др. 2007]. Однако клиническое использование рекомбинантного интерферона создаёт и некоторые проблемы. Так, для достижения терапевтического эффекта при лечении большинства патологий, при которых показано применение препаратов интерферона (ИНФ), рекомендовано применять мегадозы препарата до 6 млн ME в сутки и выШе [Маркарян А. С. и др., 1998]. Например, наиболее оптимальной дозой альфа-2 интерферона при лечении хронического вирусного гепатита В, считается 3,0 -5,0 млн ME внутримышечно три раза в неделю («золотой стандарт») в течение шести месяцев. При этом некоторые авторы рекомендуют более высокие дозы ИФН - до 10 млн ME в сутки ежедневно или через день в течение 4-6 месяцев, а при суперинфекции гепатита D до 12 месяцев [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И., 2006]. Использование таких дозировок помимо краткосрочных пирогенных реакций, таких как озноб, повышение температуры, преходящих утомляемости, кожных высыпаний, зуда, лейко- и тромбоцитопении, способствует проявлению более серьёзных побочных эффектов, таких как появление нервно-психических расстройств (возбуждение, нарушения сна, раздражительность, или, наоборот, вялость, апатия, депрессия), временное выпадение волос [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И. и др., 2005]. При обкалывании очага поражения возможно развитие местной воспалительной реакции [Ершов Ф.И., 2006]. Необходимость внутримышечного инъецирования делает проблематичным применение препарата у детей младшего возраста, а в некоторых случаях его применить невозможно, например, у пациентов с сахарным диабетом из-за большого числа осложнений. Кроме того, при проведении инъекций возможно инфицирование пациента (ВИЧ, гепатиты), наличие в составе препарата донорского альбумина потенциально увеличивает этот риск [Чуйкова В. И. и др., 2008].Несмотря на очевидные недостатки, свойственные инъекционной лекарственной форме, альтернативы рекомбинантному альфа-2 интерферону при лечении ряда вирусных заболеваний в настоящее время
не существует (хронические вирусные гепатиты [Блохина Н. П., 1998; Змызгова А. В.,1999], острые респираторные заболевания, вирусные заболевания респираторного тракта [Лобзин Ю.В. и др., 2004]). Однако применение Реаферона в терапии вирусных заболеваний респираторного тракта, особенно с профилактической целью, помимо побочного действия, сопутствующего парентеральному пути введения препарата, объективно сдерживается необходимостью проведения многократных внутримышечных инъекций [Маркарян А. С. и др., 1998; Лобзин Ю.В. и др., 2004].
В ряде случаев, например при лечении вирусных и онкологических заболеваний кожи и слизистых оболочек человека, целесообразно местное (наружное) применение интерферона [Клявина Е. А., 1991; Майданюк, С.А. и др., 2000; Попов В. Ф„ 2002; Ершов Ф. И., 2006].
Также известны композиции для ректального введения препаратов интерферона, в частности, рекомбинантный альфа-2-интерферон в свечах (виферон) [Чистова Л. В. и др., 1993; В. В. Малиновская, 2003]. Однако при ректальном введении интерферона трудно обеспечить точное дозирование препарата ввиду частичных потерь либо жидкости, либо свечной массы, остающейся на руках или приспособлениях для введения.
В связи с вышеизложенными фактами, становится очевидной необходимость разработки новых современных лекарственных форм, которые не имели бы указанных выше недостатков, а также позволили бы их применять для ещё не используемых способов введения интерферона в организм, например перорального.
Одним из перспективных направлений снижения системной токсичности, повышения биодоступности и, как следствие, увеличения терапевтической эффективности лекарств, в современной
нанобиотехнологии является создание их липосомальных форм [Швец В. И., 2008]. Липосомы при этом используются как биосовместимые и биодеградируемые наносистемы доставки, оптимизирующие действие лекарств. Размеры липосом, обычно используемых в качестве переносчиков лекарств, составляют от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров, то есть находятся в нанодиапазоне, что наряду с их биологическимим свойствами обеспечивает их эффективность как систем доставки [Каплун А. П., 2007]. Липосомы изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их терапевтическую эффективность [СгеяопасИз й., й а1,1983; Марголис Л. Б., Бергельсон Л. Д., 1986].
На сегодняшний день именно липосомы из всех наночастиц наиболее широко применяются в качестве средств доставки лекарств в клинической практике, ряд липосомальных препаратов лицензирован и производится в промышленных масштабах [Ооуа1 Р. е! а1, 2005; ТогсЫНп V. Р., 2005]. Наиболее значимое применение липосомальные препараты получили в химиотерапии опухолевых заболеваний, лечении глубоких микозов, вакцинологии, офтальмологии, пульмонологии и при лечении некоторых других патологических состояний [Ооуа1 Р. е1 а1,2005; Швец В. И., 2008].
Таким образом, потребность практического здравоохранения в инновационных лекарственных формах ИНФ, лишённых недостатков, свойственных традиционным лекарственным формам препарата, очевидна. Учитывая уникальные свойства липосом как носителей лекарств, одним из перспективных подходов к решению этой проблемы является создание липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона (ЛФИ), нацеленной на проведение интерферонотералии без инъекций и сопутствующих им нежелательных побочных эффектов. Бесспорная важность этой задачи для отечественной клинической практики явилась актуальным основанием для проведения данной исследовательской работы.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы является разработка технологии производства, методов контроля качества и экспериментальное изучение in vitro и in vivo свойств новой липосомальной лекарственной формы человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона. В связи с этим задачами исследования являлись:
1. Разработка и экспериментальное обоснование основных стадий технологии получения липосомального ИНФ.
- оценка эффективности включения интерферона в липосомы, полученные различными способами;
определение биологической активности образцов липосомального интерферона, полученных разными методами;
- выбор на основе экспериментальных данных способа получения липосомального интерферона и оптимального состава липосомального препарата рекомбинантного альфа - 2 интерферона человека;
2. Оценка физико - химических свойств и стабильности образцов липосомального ИНФ в процессе хранения.
3. Разработка физико - химических и биологических методов контроля качества препарата.
4. Оценка противовирусных свойств липосомального интерферона in vitro и in vivo.
5. Разработка необходимого комплекта нормативно - технической документации (ФСП, РП, инструкция по применению) на готовый лекарственный препарат и его Государственная регистрация в Российской Федерации.
Научная новизна работы.
1. Впервые разработана технология промышленного производства новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека для перорального и наружного применения:
- впервые проведена сравнительная экспериментальная оценка влияния условий получения липосомального ИНФ различными методами на его биологическую (противовирусную) активность.
- исследована эффективность включения рекомбинантного альфа-2Ь интерферона в липосомы, полученные различными методами.
- теоретически и экспериментально обоснован выбор способа получения и оптимальный состав липосомального препарата ИНФ человека
для применения в медицинской практике.
2. Разработаны физико-химические и биологические методы контроля качества липосомального препарата ИНФ.
3. Изучена in vitro стабильность образцов липосомального ИНФ в процессе получения и хранения препарата.
4. Впервые показана безвредность липосомальной формы ИНФ при наружном и пероральном применении препарата in vivo.
5. Продемонстрирована эффективность липосомальной формы ИНФ при наружном применении препарата для лечения генитального герпеса экспериментальных животных.
6. Впервые показано, что. интерферон, иммобилизованный в липосомы, сохраняет биологическую (противовирусную) активность в условиях, моделирующих физиологическое окружение ЖКТ человека.
7. Впервые подтверждено, что липосомальный ИНФ при наружном и пероральном применении способен преодолевать соответственно кожный и гастроинтестинальный барьеры организма и проникать в кровеносное русло экспериментальных животных, проявляя свойственную ему биологическую активность, а затем полностью элеминироваться из организма экспериментальных животных с помощью естественных ферментативных систем.
Практическая ценность работы. Результатом диссертационной работы является разработанная промышленная технология получения новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, проявляющей терапевтическую. эффективность при пероральном и наружном применении, отвечающей всем требованиям Государственной Фармакопеи РФ. Разработан необходимый комплект НТД на препарат (ФСП, РП, инструкция по применению), проведены доклинические и клинические испытания липосомального интерферона.
Результаты работы защищены Патентом РФ № 2123328 «Противовирусное лекарственное средство для перорального применения».
На предприятии ЗАО «Вектор-Медика» наукограда Кольцово, при методическом руководстве автора налажен серийный промышленный выпуск нового лекарственного препарата - липосомального рекомбинантного интерферона альфа-2Ь - первого в отечественной клинической практике препарата интерферона для перорального применения. Впервые препарат был зарегистрирован в Российской Федерации под торговым названием «Липинт» 28.03.2001 года, регистрационное удостоверение Р № 000344/012001, затем переригистрирован как «Реаферон - ЕС - Липинт», регистрационное удостоверение Р № 000821/01 - 2001 от 16.11.2001. В настоящее время в медицинской практике препарат применяется в комплексной терапии больных острым и хроническим гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, а также хроническим гепатитом В, осложненным гломерулонефритом, в лечении больных атопической бронхиальной астмой, для проведения специфической иммунотерапии при аллергическом риноконъюнктивите, при профилактике
б
и лечении гриппа и ОРЗ у взрослых и детей, в комплексной терапии урогенитальной хламидийной инфекции у взрослых. Спектр терапевтического применения препарата «Реаферон-ЕС - Липинт» постоянно расширяется, продолжающиеся клинические испытания выявляют все новые нозологические формы заболеваний, в лечении и профилактике которых он эффективен.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Новая липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека, производимая по разработанной технологии, лишена побочных эффектов, свойственных инъекционной лекарственной форме и обладает широким спектром терапевтического применения в качестве противовирусного препарата.
2. Липосомальная лекарственная форма ИНФ позволила доставлять интерферон в макроорганизм пероральным способом с сохранением его специфической активности.
3. Липосомы, содержащие иммобилизованный в их внутреннюю полость ИНФ, предохраняют белок от деградации в желудочно-кишечном тракте макроорганизма, способствуют попаданию цитокина в кровоток и пролонгируют его терапевтическое действие, по сравнению с лекарственной формой интерферона, предназначенной для парентерального введения.
4. Система контроля физико-химических и биологических свойств липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, применяющаяся на технологических стадиях её производства, позволяете выпускать лекарственный препарат в полном соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи Российской Федерации.
Апробация материалов диссертации. Материалы основных разделов диссертации были представлены на отечественных и зарубежных конференциях: I съезд иммунологов России 23.06 - 25.06 1992 г., Новосибирск, Россия; V конференция РФ «Новые направления биотехнологии» 18.05 - 22.05 1992 г., Пущино, Россия; П-я научно -практическая конференция по генно - инженерным цитокинам 10.12 -11.12 1992 г., Оболенск, Россия; Научная конференция для врачей практиков «Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2» 25.01 - 29.01 1993 г., Кольцово, Россия; VII International symposium on viral hepatitis 25.01 -27.01 1996 г., Madrid, Spain; I конгресс педиатров - нефрологов России 17.09 -19.09 1996 г., С. Петербург, Россия; VIII конференция «Новые направления биотехнологии» 27.04 - 29.04 1998 г., Москва, Россия; Научная конференция для врачей практиков «Хорошая клиническая практика - опыт 15-летней работы службы профилактики СПИД в Хабаровском крае» 9.08 -10.08 2004 г., Хабаровск, Россия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи из них 3 - в журнале Вестник РАМН (1993; 1999; 2001) и 1 - в журнале Российский вестник перинатологии и педиатрии (1998). По результатам работы получен патент РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах, содержит 27 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает в себя 300 источников, из них 175 иностранных.
Вклад автора в диссертационную работу. Вклад автора в представленный материал диссертации заключается в личном участии во всех экспериментальных и теоретических исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. Основные экспериментальные результаты получены в соавторстве с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» В. В. Бирюковой, О. А. Агафоновой, А. А. Колокольцовым, А. Е. Нестеровым, Е. Д. Даниленко, Е. И. Рябчиковой, В. И. Масычевой, Н.
A. Антоновым в рамках научных тем, выполнявшихся в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», ряд научных исследований выполнен в соавторстве с сотрудниками Кардиологического научного центра РАМН
B. П. Торчилиным, А. Н. Лукьяновым, Ю. Н. Барановым, постановка препарата на серийное производство в ЗАО «Вектор - Медика» осуществлена в сотрудничестве с Н. Б. Бажутиным, А. В. Войтенко. Анализ материалов и оформление работы произведены под руководством Е. А. Ставского. Всем коллегам, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы
Культуры клеток. Определение противовирусной активности ЛФИ биологическим методом (по цитопатическому действию вируса - ЦПД), а также содержание ИНФ и мышиного интерферона в сыворотках крови и органах экспериментальных животных, проводили с использованием в качестве чувствительных культур клеток диплоидной линии клеток (фибробластов) легкого эмбриона человека Л-68 и диплоидной линии клеток (фибробластов) легкого эмбриона мыши L-929 из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Культуральные среды, реактивы, используемые при этом соответствовали таковым, указанным в литературе [Ставский Е. А. и др., 2007].
Вирусы. Для титрования интерферона в культуре клеток использовали в качестве тест - микроорганизма (индикаторного вируса) - вирусы энцефаломиокардита мышей (ЕМС) или везикулярного стоматита по ОСО 42 - 28 - 158 - 88, полученные из ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Для определения противогерпетической активности ЛФИ in vivo был использован вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS), полученный из Государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Перед использованием в эксперименте штамм прошел два последовательных пассажа на культуре клеток Vero Еб, инфекционный титр вируса составил 106 ЦПД.
Животные. Исследование биологических свойств ЛФИ проводили на конвенциональных самцах белых мышей ICR, крыс линии Wistar, морских
свинок, полученных из питомника ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Все манипуляции с животными проводили в соответствии с действующими «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Интерферон. Липосомальный ИНФ получали с использованием субстанции человеческого рекомбинантного альфа-2Ь интерферона, полученной на основе штамма - продуцента E.coli SG 20050 pIF 16 производства ЗАО «Вектор-Медика», с концентрацией белка 0,12 мг/мл и противовирусной активностью 4,0 • 107 МЕ/мл.
Методы
Липосомы с ИНФ готовили из смеси ФХ и Хал (7:3, по молям) методами механического встряхивания (МЛ), «обращения фаз» (БОЛ), ультразвукового диспергирования (МОЛ), замораживания - опаивания (МОЛ), дегидратации -регидратации (МЛ) в сочетании с экструзией липосом через поликарбонатные мембраны [Szoka F., 1980].
Для изучения степени захвата ИНФ липосомами, полученными разными способами, использовали интерферон, меченный с помощью «йодогена» [125I] [Markwell M. А. К., Fox С. F., 1978], добавляя его к основному объёму белка в соотношении 10 : 1 (v/v). Для флуоресцентного мечения липосом использовали флуоресцентный липидный зонд R]8 («Molecular probes», США). Для определения потерь липида при проведении процедуры экструзии липосом через поликарбонатные мембраны использовали введение в липидную фазу холестерина меченого 14С из расчёта 106 распадов (1цКюри) на каждую исследуемую пробу. Для отделения ИНФ, невключенного в липосомы, использовали методы колоночной гель-фильтрации на сефарозе CL-6B [Huang С. Н., 1969], ультрацентрифугирования [Waits A., et al., 1978; Кузякова Л. М. и др., 2000] и метод флотации в градиенте плотности фиколла [Heath T. D., 1981]. Степень включения ИНФ в липосомы определяли методом флотации липосом с использованием ступенчатого градиента плотности фиколла. Процент включения ИНФ в липосомы рассчитывали по соотношению активностей липосомальной фракции и исходного препарата [ФСП 42 - 0140 - 0371-00, ЗАО «Вектор-Медика», 2001].
Время растворения липосомального препарата определяли визуально, pH определяли в суспензии потенциометрически (ГФ XI, вып. I, с. 113). Потерю в массе при высушивании определяли согласно ГФ XI, вып. I, с. 176. Условия анализа по МУК 4.1/4.2.588-96, п.43, с. 116. Определение точности розлива в лиофилизированном препарате проводили весовым методом по МУК 4.1/4.2.588-96, п.44.1, с.117. Среднюю массу и отклонение от средней массы определяли согласно ГФ XI, вып. 2, с, 142.
Количество ФХ, содержащегося в образце, определяли по входящему в состав лецитина фосфору. Определение фосфора проводили по МУК 4.1/4.2.588 - 96, п. 21, с. 77. Количество Хол, содержащегося в образце, определяли по методу Златкис - Зака [Zlatkis A., et al., 1953]. Определение
продуктов перекисного окисления липидов проводили двумя методами: по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Yagi К., 1984] и используя спектрофотометрический метод определения индекса окисленности липидов (ИОЛ) [КейтсМ., 1975].
Стерилизацию липосом проводили в асептических условиях в специально оборудованном помещении с помощью фильтрации через ядерные мембраны на основе полиэтилентерефталатной плёнки с диаметром пор ОД мкм. Предварительно проводили «пузырьковую» пробу, заключающуюся в проверке целостности мембран, при помощи сжатого инертного газа (аргон высокой чистоты по ГОСТ 10157 -79, давление 1,0 атм). Стерильность препаратов липосомального ИНФ определяли в соответствии с ГФ XI, вып. 2, с. 187 методом прямого посева на тиогликолевук} среду по ТУ 42.14.161-79 и жидкую среду Сабуро. Микробиологическую чистоту ЛФИ определяли в соответствии с ГФ XI, вып. 2, с. 196 - 200 и Изменением №1, 1996г.
Лиофилизацию препарата осуществляли в соответствии с разработанным Регламентом производствах» 1194-02 [архив ЗАО «Вектор - Медика», 2001]. Далее флаконы с препаратом укупоривали на закаточном автомате. Герметичность упаковки флаконов контролировали методом погружения в ёмкость с интенсивно окрашенным раствором метиленового синего при избыточном давлении над ним (80 - 120 кПа), в течение 10-15 минут.
Специфическую (противовирусную) активность липосомального интерферона определяли в соответствии с разработанной нами ФСП 42 -0140-0371-00 [архив ЗАО «Вектор-Медика», 2001].
Стабильность липосомального интерферона в условиях физиологического окружения ЖКТ изучали либо раздельно, либо последовательно инкубируя ЛФИ разные промежутки времени с растворами натурального желудочного сока, содержащим все ферменты с конечным разведением в 1000, 100, 10 раз и неразведённым препаратом (рН 0,8 - 1,2), трипсина (рН 7,0) (соотношение трипсин : ИНФ в липосомах составляло 1:10; 1:1; 15:1 (v/v), желчи медицинской с конечным разведением в 1000,100, 10 раз. Для разделения интерферона, заключенного в липосомы, и белка, освобождающегося из липосом в результате их разрушения, использовали ультрацентрифугирование (50000 g; 1час; 4 °С). О разрушении липосом судили по разнице в исходной радиоактивности липосомального ИНФ в начале опыта и после разделения липосом и свободного интерферона, освободившегося в результате разрушения липосом под воздействием факторов ЖКТ, и выражали в процентах. Для нейтрализации трипсина применяли его ингибитор, полученный из соевых бобов.
Специфическую (противогерпетическую) активность препарата in vivo оценивали на модели генитальной герпетической инфекции. [Маренникова С.С. и др.,1986]. Оценку безвредности препарата для лабораторных животных в остром и хроническом эксперименте (токсичность, переносимость, кожно - резорбтивное действие, кожно -
сенсибилизирующие свойства, конъюнктивальная проба, изменение массы и температуры тела, частота сердечных сокращений, исследовательское поведение в тесте "открытое поле", биохимический и гематологический анализ крови, гистологическое исследование образцов тканей, патоморфологическое исследование внутренних органов) проводили стандартными методами, одобренными для доклинических испытаний медицинских иммунобиологических препаратов [Фисенко В. П. и др., 2000]. В образцах крови определяли уровень гемоглобина, содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, рассчитывали лейкограмму. Биохимические исследования включали оценку показателей интенсивности основных видов обмена, а также активности ферментов - маркеров функционального состояния печени, почек, сердца [Меньшиков В.В., 1987].
Изучение острой токсичности и переносимости ЛФИ различными видами лабораторных животных при пероральном введении проводили при однократном внутрибрюшинном и пероральном способах введения мышам ICR и крысам Wistar. Изучение токсичности ЛФИ в условиях хронического эксперимента на крысах проводили на крысах линии Wistar при пероральном введении препарата в течение двух недель. Животные были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой: 1 группа-контроль (физраствор), 2 группа -контроль (пустые липосомы), 3 группа - липосомальный ИНФ.
Изучение фармакокинетики рекомбинантного интерферона при наружном и пероральном применении липосомального препарата проводили на самцах беспородных мышей ICR с массой тела 20,0 ± 2,0 г. При наружном применении в дозе 6,25-103 ME на животное, при пероральном 20 000 ME на животное. В качестве препарата сравнения использовали Реаферон, который вводили внутримышечно в одинаковой дозе. Контрольные животные получали инъекцию физиологического раствора. В разные сроки после введения препаратов мышей подвергали эвтаназии мгновенной дислокацией шейных позвонков и забирали кровь для определения ИНФ. На каждую временную точку брали от пяти до десяти животных. Уровень ИНФ в сыворотке крови мышей при наружном применении определяли иммуноферментным методом с помощью иммуноферментного набора "Procon IF2 plus" фирмы "Протеиновый контур" (г. С-Петербург). Чувствительность метода определения составляла 5,0 пкг/мл. Уровень ИНФ в сыворотках и печёночном гомогенате мышей при 1 пероральном введении препарата определяли по цитопатическому действию вируса (ЦПД). Дополнительно исследовали содержание мышиного интерферона в сыворотке крови экспериментальных животных. Результаты определения концентрации ИНФ биологическим методом выражали в ME (международных единицах), мышиных интерферонов в ТЕ (титрационных единицах) [Forti R.L. et al., 1986].
Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами [Малета Ю.С. и др., 1981; Гланц С., 1999].
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка технологии получения липосомального препарата ИНФ человека для клинического применения
На первом этапе работы была проведена экспериментальная оценка методов иммобилизации ИНФ в липосомы, отобранные по результатам анализа литературы и патентной документации, с целью выбора наиболее оптимального и перспективного метода. Было установлено, что наиболее перспективными для дальнейшей работы по созданию ЛФИ оказались методы мягкого механического встряхивания и дегидратации -регидратации. Суммарная концентрация липидной композиции 100 мг/мл оказалась оптимальной для получения липосомального ИНФ, независимо от метода получения, так как позволила наиболее эффективно использовать и ИНФ, и липид. Затем поочерёдно была оценена возможность оптимизации технологических параметров выбранных методов с целью достижения максимально возможной иммобилизации ИНФ в липосомы без потери белком специфической (противовирусной) активности. При получении липосомального ИНФ методом мягкого механического встряхивания при комнатной температуре в течение 20 часов в липосомы было иммобилизовано около 30 % исходного количества ИНФ. При этом было отмечено двукратное снижение уровня исходной биологической активности белка. Таким образом, результаты проведенной работы свидетельствовали о том, что этот метод получения липосомального ИНФ, несмотря на проведенную нами модификацию условий получения, не подходит для создания ЛФИ ввиду недостаточного включения ИНФ в липосомы. Оптимизация параметров метода дегидратации - регидратации (длительность высушивания липидов, температура проведения процесса, способ регидратации липосом) позволила нам добиться высокого процента включения ИНФ в липосомы без потери его биологической активности. Для устранения гетерогенности липосомальной суспензии, полученной на стадии гидратации липида, в разрабатываемую технологию ввели стадию экструзии препарата под давлением инертного газа высокой степени очистки [Olson F.,1979]. Оптимизировав параметры процесса экструзии липосомального ИНФ (размеры пор поликарбонатных мембран, температура проведения процесса, количество циклов экструзии) добились необходимой гомогенности липосомальной суспензии (более 90% везикул были стандартизованы по размерам) без значительных потерь липидов на мембранах и без деградации ИНФ (табл. 1).
Анализ полученных данных показал, что оптимальным для создания липосомального ИНФ в исследованных условиях является пятикратное экструдирование опытных образцов препарата через мембраны с последовательно уменьшающимся диаметром пор (диапазон 1,0-0,1 мкм).
Таблица 1. Зависимость среднего размера липосом и противовирусной активности ИНФ от количества циклов экструзии ЛФИ через
Количество Средний Концентрация Противовирусная
циклов диаметр липидов в активность
экструзии везикул, нм фильтрованном ИНФ**, МЕ/мл,
препарата препарате, % in vitro
2 140 ±55 100,0 ± 1,0 1,0 «106
5 125 ±32 97,5 ± 2,5 1,0 • 106
10 110 ±20 90,0 ± 5, 0* 0, 75 • 106
20 100 ± 10 86,2 ± 6,3* 0,5 • 106
Примечание: *- достоверное отличие от нефильтрованного препарата, (п = 25 -30; р<0,05); ** - исходная активность образца составляла 1,0- 106 МЕ/мл, приведены средние значения из числа исследованных образцов (п = 30).
Важнейшим параметром фармацевтического препарата является его стерильность или микробиологическая чистота в зависимости от планируемого способа применения препарата. В связи с этим была изучена возможность стерилизации ЛФИ методом ультрафильтрации с помощью стерильной ультрафильтрационной ячейки «Амикон» через ядерные мембраны на основе полиэтилентерефталатной плёнки с диаметром пор 0,1 -0,2 мкм. Возможность получения стерильных липосом продавливанием через поликарбонатные мембраны с таким диаметром пор ранее была показана рядом авторов [Freise J., 1984; Bommel E.M.G., 1984]. Как показал анализ результатов прямых посевов образцов препарата, подвергнутых ультрафильтрации, на тиогликолевую среду и жидкую среду Сабуро, нам удалось добиться стерилизации таким способом опытных партий готового препарата любого объёма. После их приготовления задача получения стерильного препарата ЛФИ сводилась к розливу во флаконы и лиофильному высушиванию в стерильных условиях, что не представляло технологической сложности. Поскольку в дальнейшем основным способом применения липосомального интерферона был выбран пероральный путь введения в организм, требования к препарату в соответствии с ГФ были смягчены до микробиологической чистоты, но стадия стерилизующей ультрафильтрации через мембраны с диаметром пор 0,1 - 0,22 мкм была оставлена в технологии получения препарата для гарантированного выполнения требований ГФ.
На следующем этапе настоящей работы необходимо было выбрать окончательный состав будущего лекарственного препарата с учётом всех требований ГФ. Очевидно, что липосомальный препарат, предназначенный для клинического применения, должен содержать только фармацевтически приемлемые компоненты. В связи с этим, в качестве основного липосомобразующего фосфолипида при получении липосомального интерферона использовали высокоочищенный фосфатидилхолин (ФХ) животного или растительного происхождения. Терапевтическая эффективность, присущая ФХ, обеспечила дополнительное положительное
терапевтическое воздействие липосом препарата на клетки - мишени. Известно, что для повышения стабильности липосом in vivo необходимо присутствие в липидной фазе липосом холестерина [Дранов Ф. А., 1996]. В клеточных мембранах гепатоцитов молярное соотношение ФХ : Хол составляет примерно 7:3, поэтому за основу в настоящей работе было взято именно это соотношение [Gregoriadis G., 1980]. Выбранный состав липидной фазы липосом, биодеградация которого будет осуществляться с помощью естественных ферментативных систем организма, прежде всего печени, позволил сделать предположение о полной биосовместимости липосомального ИНФ. Кроме того, при получении ЛФИ в состав липидной фазы липосом был дополнительно введён DL-á-токоферол (ТФ) в качестве природного антиоксиданта, защищающего ФХ от перекисного окисления и повреждения свободными радикалами и дополнительного стабилизатора мембран липосом [Плетнёва О. П., 1990]. Дополнительным эффектом введения ТФ в липосомы стала стабилизация антивирусной активности ИНФ [Малиновская В. В., 1994]. Для дополнительной стабилизации активности ИНФ на стадиях технологического процесса получения ЛФИ в состав препарата ввели аскорбиновую кислоту [Алексеев К. В. и др., 1990]. Проведенные исследования показали, что для предотвращения перекисного окисления липида препарата и сохранения биологической активности интерферона в процессе получения и хранения ЛФИ, содержание ТФ в липидной фазе липосом должно составлять 10-15 моль %, а содержание аскорбиновой кислоты 0,89 - 1,0 % от массы композиции. С целью обеспечения стабилизации белка, необходимой рН внутри липосом, осмотического давления и буферной ёмкости для изготовления липосомального интерферона использовали фосфатно-солевой буферный раствор [Фендлер Д. X., 1983; Алексеев К. В. и др.,1990]. Для уточнения влияния соотношения основных и вспомогательных компонентов в составе препарата, вошедших в состав ЛФИ на сохранность противовирусной активности и степень иммобилизации белка в липосомы, размеры образующихся липосом, способность препарата к регидратации после лиофилизации, были изучены опытные образцы ЛФИ (табл.2).
Было установлено, что повышенное содержание Хол в липидной фазе липосом до 40 моль % приводило к заметному увеличению среднего размера частиц по сравнению с липосомами, "бедными" Хол и достоверному снижению эффективности иммобилизации ИНФ в липосомы. Дополнительно к этому нужно отметить, что для полноценной гидратации липидной плёнки, содержащей повышенное количество холестерина, требовалось больше времени, липосомы "богатые" Хол, труднее поддавались экструзии, требовали более высокого давления аргона при продавливании через мембраны, что осложняло проведение технологического процесса. С учетом результатов исследований для ' получения липосомального ИНФ было выбрано молярное соотношение лецитина и холестерина в липидной фазе липосом 99,5 мМ ФХ : 25,8 мМ Ход как оптимальное для заданных условий и близкое к относительному содержанию этих липидов в
клеточных мембранах ( массовое соотношение между липидами и ТФ составило примерно 8:1:1).
Таблица 2. Некоторые физико-химические свойства липосом, полученных методом дегидратации — регидратации с последующей экструзией через поликарбонатные мембраны, (М ± ш)__ '_
Липидная композиция (молярное соотношение, мМ) Число серий препарата Степень включения интерферона, % Средний диаметр частиц, нм
83,3 ФХ : 66,7 Хол : 16,6 ТФ 6 52,7 ±3,7 182 ±56
99,5 ФХ : 25,8 Хол : 23,2 ТФ 9 65,6 ±4,5* 122 ±37
Примечание: Липосомальную суспензию, полученную методом дегидратации -регидратации подвергали многократной (10 - 20 циклов) последовательной экструзии через мембраны с начальным диаметром пор 1,0 мкм, конечным 0,1 мкм, затем лиофильно высушивали и регйдратировали перед исследованием, (п = 5 в каждой серии); * - достоверное различие по сравнению с липосомами, содержащими повышенное количество Хол (р<0, 05)
На следующей стадии настоящей работы решали вопрос о необходимости введения в состав разрабатываемой Л ФИ стабилизатора конформации белка на стадии лиофилизации препарата, а также для сохранения биологической активности ИНФ при хранении лиофильно высушенного продукта. Была изучена возможность применения человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), в качестве стабилизатора при лиофилизации ЛФИ, однако в результате экспериментов было установлено, что добавление альбумина в значительной степени ингибирует захват ИНФ липосомами (процент включения ИНФ падал с 65,0 ± 6,1 до 18, 3 ± 1,7). Поэтому ЧСА не использовали. Анализ лиофильно высушенных образцов ЛФИ, не содержащих ЧСА, показал, что величина противовирусной активности ИНФ при проведении лиофилизации препарата снижается в два - три раза, что было близко к величине снижения титра ИНФ при стерилизации и лиофилизации субстанции ИНФ, содержащей альбумин в качестве стабилизатора. С учётом полученных данных дополнительный стабилизатор структуры интерферона в состав ЛФИ решили не вводить, но при изготовлении препарата повысить в три раза концентрацию ИНФ в гидратирующем растворе для того, чтобы в лиофильно высушенном готовом препарате биологическая активность ИНФ соответствовала требованиям НТД на препарат. Кроме того, в состав ЛФИ в качестве криопротектора ввели дисахарид (сахароза, лактоза) для сохранения целостности липосомальной мембраны при лиофилизации в соотношении 0,6 мг/мг липида. Для лиофилизации липосомального ИНФ модифицировали режим лиофильной сушки, примененяемый для получения Реаферона. Суть отработанного режима лиофилизации ЛФИ заключалась в следующем. Предварительное замораживание препарата во флаконах проводили в морозильных прилавках при температуре минус 45,0 ± 5,0 °С в течение 18 -
20 часов в асептических условиях. По окончании заморозки кассеты переносили на полки с температурой минус 45,0 ± 5,0 °С предварительно подготовленной сублимационной камеры лиофильной сушилки, не допуская разморозки препарата. Процесс собственно сушки продолжался шесть -восемь часов, досушка при температуре 22,0 ± 2,0 °С длилась около суток, общая продолжительность процесса составляла 36 - 48 часов [РП № 1194 -02, 2001]. После регидратации сухой ЛФИ препарат восстанавливал липосомальную структуру (рис.1).
Рисунок 1. Липосомы с ИНФ под сканирующим электронным
микроскопом (увеличение 40000). Продемонстрирована восстановленная после регидратации липосомальная структура препарата, полученного по разработанной технологии.
Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана технология получения стерильной, лиофильно высушенной ЛФИ, пригодная для масштабного производства лекарственного препарата. В состав ЛФИ вошли только фармацевтически приемлемые компоненты (табл. 3). По разработанной технологии были получены экспериментальные серии препарата. Образцы были заложены на хранение при разных температурах с целью определения сроков годности и условий хранения препарата, а также использовались при проведении его доклинического (лабораторно -экспериментального) изучения.
Таблица 3.Оригинальная рецептура сухого липосомального препарата рекомбинантного альфа-2 интерферона человека (на 1,0 мл )_
Компонент препарата Количество
ИНФ (ФС 42-3279-96) 2,5-Ю5 - 1,0Т0б МЕ
Лецитин-стандарт (ФС 42-150ВС-88) от 72,5 до 80,36 мг
Холестерин (ТУ 6-09-10-1780-86) от 9,85 до 10,12 мг
Витамин Е (ВФС 42-2442-94) от 9,85 до 10,12мг
Аскорбиновая кислота (ФС 42-2668 - 89) от 1,35 до 1,57 мг
Сахароза (ГОСТ 5833-75) от 60,37 до 62,03 мг
Натрий фосфорнокислый двузамещенный (ГОСТ 4172-76) от 3,77 до 6,76 мг
Натрий фосфорнокислый однозамещенный (ГОСТ 245-76) от 0,54 до 0,75 мг
Натрия хлорид (ФС 42-2572-95) от 8,01 до 9,48 мг
Полученные на данном этапе работы результаты позволили разработать технологическую схему производства ЛФИ (рис.2).
I
Розлив во флаконы
Рисунок 2. Основные стадии процесса производства липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека.
На следующем этапе настоящей работы для контроля физико -химических и биологических свойств ЛФИ были разработаны новые, либо адаптированы существующие для обычных лекарственных форм методы анализа, отвечающие требованиям ГФ. Особое внимание было уделено стандартизации противовирусной активности готового препарата. Была изучена возможность использования метода анализа противовирусной активности свободного ИНФ титрованием в культуре клеток. В результате экспериментов было установлено, что для титрования ЛФИ в культуре клеток Л-68 необходимо разрушение липосом неионным детергентом Тритоном Х-100 (1,5 % - 2,0 % (v/v)). Метод титрования свободного ИНФ, изложенный в литературе [Pestka S., 1981; Pestka S., 1986], с введением дополнительной стадии разрушения липосом Тритоном Х-100 вошёл в фармакологическую статью на препарат [ФСП 42 - 0140 - 0371 - 00, 2000]. Таким образом, была предложена простая модификация стандартного метода контроля биологической активности интерферона, позволившая
использовать существующую на производстве интерфероновых препаратов материально - техническую базу.
Для количественного определения содержания ИНФ в липосомах на следующем этапе работы изучили возможность использования метода флотации в ступенчатом градиенте плотности фиколла [Heath Т. D., 1981]. Подбором условий нам удалось добиться 99% флотации липосом, в то время как белок практически полностью оставался в наиболее плотной части градиента. Достоверность полученных результатов была подтверждена . наличием корреляции между методами флотации и использованием меченого [|251] ИНФ (табл. 4).
Таблица 4. Степень включения ИНФ в липосомы, приготовленные по
разработанной технологии,* (М ± т)
Метод анализа Степень включения ИНФ, %
Р адиоизотопный 65,0 ± 6,0
Флотация в градиенте плотности фиколла 55,0 ±5,0
Примечание: * - средние значения по результатам анализа 30 проб.
Для контроля стабильности липидов была изучена возможность использования метода, основанного на измерении концентрации продуктов перекисного окисления липидов по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Yagi К., 1984]. Используя в качестве стандарта малоновый альдегид bis — диметилацеталя, было показано, что исследуемые свежеприготовленные липосомальные препараты ИНФ содержали в среднем 1 моль ТБК -чувствительных продуктов на 240 молей липосомального лецитина. Другие методы анализа, применяемые для оценки физико - химических и биологических свойств ЛФИ, описаны ранее и соответствуют требованиям ГФ. Окончательная спецификация показателей качества ЛФИ, согласованная с комитетом МИБП и ГИСКом им. Л. А. Тарасевича, приведена в табл. 5.
2. Лабораторно - экспериментальное изучение липосомального ИНФ
Для определения сроков годности и условий хранения ЛФИ изучили стабильность лиофильно высушенного препарата ЛФИ в процессе длительного хранения. Была осуществлена закладка 5 опытных серий лиофильно высушенной микробиологически чистой ЛФИ (п = 150, в каждой серии) на хранение при температуре (4,0 ± 1,0) °С сроком на 15 месяцев, с ежеквартальным анализом по полному комплексу физико - химических и биологических показателей. Воздействие света на препараты исключалось. Особое внимание, прежде всего, обращали на сохранность биологической (противовирусной) активности препарата и степени иммобилизации ИНФ в липосомы и окисленность липида. Полученные данные оказались практически идентичными для всех серий ЛФИ, заложенных на хранение, в качестве иллюстрации приведены данные для одной серии (табл. 6).
Таблица 5. Спецификация некоторых показателей качества сухого липосомального препарата рекомбинантного альфа-2 интерферона человека
ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ
Время растворения Визуальный Образование при встряхивании с 1 мл воды гомогенной суспензии белого цвета в течение 5 мин
рн Потенциометрический, ГФ XI, вып. 1, с. 113 От 6,5 до 7,5
Потери в массе при высушивании ГФ XI, вып.1,с.176; МУК 4. 1/4.2-558-96, п.43, с. 116 Не более 4%
Вакуум, защитный газ, герметизация Визуальный МУК 4.1/4.2558-96, п. 12, с.63 Соответствует требованиям герметизации
Специфическая активность Биологический. На культуре клеток легкого эмбриона человека Л-68, инфицированной вирусом везикулярного стоматита по ОСО 42-28-158-88 Противовирусная активность не менее 250 ООО МЕ/мл
Однородность дозирования Весовой МУК 4. 1/4.2-588-96,п.44. 1,с. 1 17 Коэффициент вариации не более 7,5%
Средняя масса и отклонение от средней массы Весовой, ГФ XI, вып.2, с. 142 173,7мг; от 166,2мг до 181,2мг Допустимое отклонение средней массы: ±7.5%
Микробиологическая чистота ГФ XI, вып.2, с. 196-200 и Изменение №1,1996г. Соответствует требованиям, категория 2
Степень включения ИНФ в липосомы Биологический. В соответствии с показателем «Специфическая активность» Не менее 50% специфической активности
Липиды Колориметрический. По фосфору, согласно МУК 4.1/4.2-558-96, п.21,с.77 Не более 100 мг/л
Анализ представленных данных (табл. 6) показал стабильность сухой ЛФИ в процессе хранения при соблюдении температурного режима. Основные показатели качества, характеризующие препарат, такие как специфическая активность, степень иммобилизации ИНФ в липосомы, отсутствие накопления значительного числа продуктов ПОЛ, оставались стабильными на протяжении всего срока хранения (один год).
Таблица 6. Экспериментальные данные по стабильности образцов ЛФИ в
процессе хранения опытных серий
№ п/п Срок хранения препарата Специфическая активность, ME/мл, in vitro Степень захвата ИНФ, % Продукты перекисного окисления липидов, нмоль МДА/мг
1 1 день 1,0 • 106 53,5 0,236 ± 0,022
3 мес. 1,0 • 106 54,2 0,240 ± 0,020
6 мес. 1,0- 106 53,0 0,264 ±0,021
9 мес. 0,75 • 106 52,7 0,272 ± 0,022
12 мес. 1,0 - 106 53,3 0,283 ±0,025
15 мес. 1,0 • 106 54,0 0,317 ±0,024*
Примечание: *- достоверное различие между свежеприготовленной ЛФИ и хранящимся 15 месяцев препаратом (р<0,05); п = 10 для всех сроков хранения.
На следующем этапе работы изучили стабильность создаваемой ЛФИ в условиях, моделирующих воздействие физиологических факторов желудочно — кишечного тракта человека (ЖКТ), таких как натуральный желудочный сок, трипсин, желчь на препарат по мере его продвижения по пищеварительному тракту до места всасывания в тонком кишечнике. Концентрации физиологических факторов, воздействующих на ЛФИ, выбирали с учётом их реальных уровней в ЖКТ человека [Файтельберг Р. О., 1967; Гальперин С. И., 1977]. Для проведения исследования изготовили экспериментальную серия ЛФИ, степень включения ИНФ в липосомы (по ИНФ - [ш I]) составила 66,0 ± 3,3 %. Опытные образцы подвергали воздействию указанных выше веществ, временные интервалы воздействия составляли от пяти минут до одного часа, при 37 °С. Затем липосомы разделяли ультрацентрифугированием со свободным ИНФ, высвободившимся из них после разрушения, фракции исследовали на радиоактивность, по полученным результатам рассчитывали количество белка, оставшегося связанным с липосомами (табл.7).
Полученные данные свидетельствовали о том, что наиболее критичным для липосомальной структуры препарата оказалось воздействие желчи. Уже после 30 минутной инкубации образцов с раствором желчи в разведении 1 : 10 25% интерферона, иммобилизованного в липосомы, освобождалось в результате разрушения везикул. Вместе с тем необходимо отметить, что через час более 50% исходного количества ИНФ всё ещё оставалось внутри липосом, а это значит, что конформация белка внутри них не была нарушена. Инкубация с отдельно взятым желудочным соком, содержащим пепсин, и трипсином не приводила к значительному высвобождению ИНФ из липосом. Далее, изучили сочетанное последовательное воздействие факторов ЖКТ на ЛФИ с использованием положительного контроля - Реаферона. С учётом результатов предыдущих экспериментов, для исследования были выбраны максимальные концентрации физиологических факторов ЖКТ (желудочный сок натуральный в соотношении к препарату 1:1 (v/v), желчь медицинская
консервированная в разведении 1:10, трипсин - 0,015мг/мл или соотношение трипсин : интерферон 15:1). Опытные образцы подвергали последовательному воздействию каждого из указанных компонентов в течение 1 часа при 37 °С, затем наносили на монослой клеток Л-68 и исследовали на противовирусную активность (табл.8).
Таблица 7.Степень иммобилизации ИНФ в липосомы после воздействия факторов физиологического окружения ЖКТ человека (% от исходного количества ИНФ, иммобилизованного в липосомы перед началом
Фактор воздействия на препарат Концентрация воздействующего начала1 Время инкубации, мин
5 15 30 60
Желудочный сок 1: 1000 1 :100 1 : 10 1: 1 100 ±0,9 100 ± 1,2 100 ±2,3 98,1 ±2,6 100 ±2,0 100 ±2,4 99.1 ±3,5 96.2 ± 3,8 100 ±3,0 100 ±2,9 95,2 ±4,0 93,4 ± 5,6 100,0 ±4,6 99,7 ±5,1 93,3 ±4,8 90,5 ± 6,3
Трипсин 1 : 10 1 : 1 15 : 1 100 ±2,2 99.1 ±2,6 97.2 ± 3,4 100 ±3,3 97,2 ±3,8 94,0 ± 4,8 99,7 ± 4,2 95,0 ±4,7 92,2 ± 5,3 95,2 ±5,6 92,5 ± 5,8 87,7 ±6,3
Желчь 1 :1000 1 : 100 1 : 10 100 ±2,1 100 ±2,3 95,0 ±3,2 100 ±3,6 99.3 ±3,9 86.4 ± 5,2* 97.2 ±5,1 95.3 ± 4,9 75,2 ± 4,6* 94,8 ± 5,7 90,3 ± 5,2 55,7 ±6,4*
Контроль (липосомы с ФБР, рН 7,0) 1 :1 100 ± 2,2 100 ±3,3 99,7 ± 4,2 97,3 ± 5,9
для трипсина соотношение фермент : интерферон; * - разница между образцами, подвергнувшимися воздействию данных физиологических факторов ЖКТ и контролем достоверна (р < 0,05).
Таблица 8. Противовирусная активность ЛФИ (in vitro) после последовательного воздействия факторов физиологического окружения
Препарат Исходная Желудочный Трипсин Желчь
активность сок (1:1) (0,15 мг/мл) (1: 10)
Реаферон 106 6,25 10" 0 -
ЛФИ 106 0,85 • 106 0,75 • 106 0,5 • 106
Примечание: * - среднее значение из (п = 10) для каждого фактора ЖКТ
Результаты, представленные в табл. 8 подтверждают защитные свойства липосом как переносчиков лекарств, при пероральном применении препарата, только в случае включения их внутрь водной полости липосом. Действительно, липосомальный ИНФ суммарно после воздействия
желудочного сока и трипсина потерял в среднем 25% активности, вероятно это явилось следствием деградации белка, адсорбированного на внешней стороне липосомальной мембраны, под влиянием трипсина. Наиболее значительная потеря биологической активности ЛФИ, как и в первой серии экспериментов, произошла под воздействием желчи вызвавшей частичную солюбилизацию липосом, высвобождение ИНФ из разрушенных везикул и последующую деградацию ИНФ. Общая потеря активности ЛФИ после сочетанного трёхчасового воздействия желудочного сока, трипсина и желчи в исследованных концентрациях составила в среднем 50 %.
Таким образом, экспериментально была подтверждена способность ЛФИ предохранять ИНФ, иммобилизованный во внутреннюю полость липосом, от разрушения физиологическими факторами ЖКТ при пероральном применении.
На следующем этапе работы изучили распределение рекомбинантного интерферона альфа-2 по органам и тканям экспериментальных животных и токсические свойства препарата при пероральном и наружном применении ЛФИ, а также противовирусную активность ЛФИ in vivo.
Динамика изменения содержания интерферона в сыворотке крови мышей после его перорального применения в сравнении с инъекционным применением ИНФ в эквивалентной дозе представлена на рис. 3.
Рисунок 3. Динамика содержания альфа-2интерферона в сыворотке крови мышей в разные сроки после воздействия препаратами интерферона (доза 20 ООО МЕ на животное); по оси абсцисс — время после воздействия, ч; по оси ординат — концентрация альфа - 2 интерферона, МЕ/мл. 1 —интерферон (в/м инъекция); 2 — липосомальный интерферон (перорально); 3 — инъекционный интерферон, применённый перорально (контроль).
Полученные данные свидетельствовали о том, что через час после перорального применения ЛФИ в крови мышей регистрировали максимальные концентрации ИНФ, также как и в случае внутримышечного введения свободного ИНФ в одинаковой дозе, при этом достоверного различия между уровнями ИНФ в крови экспериментальных животных не наблюдали. Через три часа после внутримышечной инъекции свободного
ИНФ обнаруживали более чем 70% падение его уровня в кровотоке, при этом перорально введённая ЛФИ к этому времени показала лишь 40% падение концентрации ИНФ в крови от максимальных значений. Разница между показателями была достоверной (р<0,01). Как свидетельствует кривая 3, (рис.3), в крови животных контрольной группы значимого уровня ИНФ не обнаружили. Через 6 часов после внутримышечной инъекции ИНФ в крови животных не удалось обнаружить даже следовых количеств ИНФ, что свидетельствовало о его полной деградации и выведении из организма. Напротив, через 6 часов после перорального введения ЛФИ в крови животных регистрировали примерно 30% белка от его максимального уровня. Указанное различие в данных, вероятно, можно объяснить защитным действием липосом, предохраняющим ИНФ от воздействия протеаз крови [Маркарян А. С., 1998]. В диапазоне 6-12 часов в крови мышей, которым перорально вводили ЛФИ, стабильно обнаруживались концентрации ИНФ, достоверно не различающиеся с показателями, полученными для шести часов. Нами было сделано предположение о том, что в этот период времени циркулирующие в кровотоке животных макрофаги были насыщены липосомами и временно были не способны к захвату липосом с ИНФ и доставке их в печень, что позволило оставшимся неразрушенным везикулам, содержащим белок, постепенно высвобождать его в кровеносное русло, поддерживая концентрацию. Через 12 часов после применения ЛФИ установили достоверное (р<0,05) увеличение концентрации ИНФ в крови экспериментальных животных, титр сывороток к 15 часам наблюдения в среднем вырос с 200 - 250 МЕ/мл до 400 — 410 МЕ/мл или в 1,6-2 раза. Вероятнее всего это свидетельствовало о том, что к этому времени липосомы, ранее сохранявшие целостность в кровотоке, начали активно деградировать под воздействием физиологических факторов крови (липопротеины), высвобождая ИНФ. С 15 часа началось плавное падение уровня ИНФ в кровотоке, к 18 часам уровень ИНФ не превышал 100 МЕ/мл, с 18 до 24 часов титрование сывороток животных выявляло только следовые количества белка на уровне 10 - 20 МЕ/мл, то есть практически на пределе погрешности определения данным методом. Было сделано предположение о том, что падение титров ИНФ в сыворотках крови мышей с 15 по 18 час после введения, вызвано двумя причинами: во - первых к этому времени печёночные депо полностью освободились от ранее захваченных липосом, утилизировав их компоненты и готовы к катаболизму новой партии липосом и их содержимого, доставляемых циркулирующими макрофагами, во - вторых, освободившийся в кровоток из липосом, разрушившихся под воздействием компонентов крови ИНФ, подвергался интенсивной биодеградации под воздействием протеаз крови.
Изучение биораспределения свободного и липосомированного препарата в печени животных показало, что свободный интерферон максимально накапливался в печени к шести часам после внутримышечной инъекции и через девять часов после введения в печёночном гомогенате уже не определялся. Липосомальный интерферон медленнее выводясь из
кровотока, максимально накапливался в печени к девяти часам, повышенный уровень белка определялся до 15 часов после перорорального введения препарата, постепенно уменьшаясь до фоновых значений после этого срока. При этом снижение содержания интерферона в печени после воздействия ЛФИ к 15 часам, сопровождалось второй волной подъёма концентрации ИНФ в крови, вызванное, вероятно, помимо вышеназванных предположений ещё и метаболизмом липосомального интерферона в печени и поступлением ИНФ в кровоток (рис. 4).
Таким образом, липосомирование позволило сохранить биологическую активность ИНФ в физиологическом окружении ЖКТ мышей, помогло его проникновению через гастроинтестинальный барьер и доставке в кровоток и печень. При этом наиболее высокий уровень накопления ИНФ в сыворотке крови мышей регистрировался через один час после введения, то есть, в те же сроки, что и после внутримышечного применения, причём величины максимальных концентраций, создаваемых одинаковыми дозами препаратов в кровотоке, достоверно не различались, что свидетельствовало о практически равной биодоступности инъекционной и липосомальной лекарственных форм ИНФ к исследованному моменту времени.
400 350 300 250 200 150 100 50
375
1
12 15
Рисунок 4. Динамика содержания альфа-2интерферона в печени мышей в разные сроки после воздействия препаратами интерферона в одинаковой дозе 20 000 МЕ на животное. По оси абсцисс — время после воздействия, ч; по оси ординат — концентрация ИНФ, МЕ/мл. 1 — интерферон (в/м инъекция); 2 — липосомальный интерферон (пероралыю); * - достоверное различие, между свободным ИНФ и ЛФИ.
В следующей серии экспериментов изучили динамику изменения содержания ИНФ в сыворотке крови мышей после нанесения ЛФИ на скарифицированную кожу в сравнении с внутримышечным введением одинаковой дозы свободного ИНФ. Анализ полученных данных показал, что накожная аппликация ЛФИ приводила к увеличению содержания ИНФ в сыворотке крови. При этом максимальный уровень показателя в этой группе
животных был отмечен через час после нанесения на кожу, то есть, в те же сроки, что и в случае внутримышечной инъекции, составив 53% от уровня, зарегистрированного в группе, получившей ИНФ инъекционно. Липосомальный ИНФ отличался более длительным периодом циркуляции в крови экспериментальных животных, вероятно, за счет его медленного высвобождения из липосом. Полученные данные свидетельствовали о том, что свободный ИНФ полностью элиминировался из кровеносного русла мышей в течение трёх часов после введения, а липосомальный к концу шестого часа наблюдения.
Таким образом, экспериментально было продемонстрировано, что липосомальный ИНФ, при его накожном применении, проникал в кровеносное русло животных, менее интенсивно накапливался в крови по сравнению с инъекционным, применённым в одинаковой дозе, но отличался более длительным периодом выведения. Полученные данные о восстановлении фонового уровня ИНФ через шесть часов после накожной аппликации его липосомальной формы и через 18 часов после перорального введения подтвердили, что создаваемая ЛФИ способна к биодеградации с помощью естественных ферментативных систем печени. Существование в организме ферментативных систем, обеспечивающих биодеградацию препарата, позволило нам предположить, что накожное или пероральное применение липосомальной формы интерферона не будет вызывать метаболических нарушений и токсических изменений структуры и функций основных систем организма.
Для проверки этого предположения изучили безвредность ЛФИ для экспериментальных животных при пероральном и наружном применении препарата.
Результаты исследования острой токсичности и переносимости препарата при пероральном применении свидетельствовали о том, что однократное введение ЛФИ мышам и крысам в диапазоне испытанных доз 3 • Ю5 - 3 • Ю6 - 3 • 107 МЕ/кг и 3 • 105 - 3 • 106- 1,5 • Ю7 соответственно и внутрибрюшинное введение мышам ЛФИ, в диапазоне доз 3 • 105 - 3 • 10б -3 • 107 МЕ/кг, крысам - 3 • 105 - 3 • 106 - 1,5 • 107 МЕ/кг, не вызывало у подопытных животных каких - либо признаков интоксикации. При этом на" протяжении всего периода наблюдения не было зарегистрировано гибели животных. Следует также отметить, что высшие из испытанных доз ЛФИ- 1,5-107 МЕ/кг для крыс и 3,0 • 107 МЕ/кг для мышеи соответственно в 500 - 1000 раз превышали дозу, рекомендованную для человека (3,0 • 104 МЕ/кг). Такие дозы ЛФИ были обусловлены максимально возможными объёмами препарата, которые могли быть введены перорально без ущерба для организма экспериментальных животных. .В связи с этим не удалось установить показателей среднесмертельных доз - ЛД50 для ЛФИ.
При изучении токсичности ЛФИ в условиях хронического эксперимента установили, что двухнедельное пероральное введение препарата животным в исследуемой дозе 7,5 • 106 МЕ/кг (250-кратная терапевтическая доза), так же, как и десятикратное нанесение
линосомалыюго интерферона на поверхность кожи крыс в суммарной дозе 5,0 • 104 на животное, не оказывало существенного влияния на уровень физиологических показателей. Внешний вид, поведение, потребление воды и корма животных опытной группы не отличались от контрольных показателей. Масса тела подопытных крыс закономерно нарастала, в среднем, на 3,0 - 3,5% в неделю, что достоверно не отличалось от привеса контрольных животных. Значения температуры тела, частоты сердечных сокращений и параметры исследовательского поведения не выходили за границы диапазона нормальных значений для этого вида животных. Макроскопическое исследование внутренних органов крыс, получавших препарат перорально, не вьивило каких - либо отличий от показателей животных контрольной группы.
Липосомальная форма интерферона не оказывала существенного влияния на показатели красной крови, общее число лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови. Значения общего белка, мочевины, креатинина, холестерина, глюкозы крови животных опытной группы на протяжении всего эксперимента не отличались от контрольного уровня . Уровень триглицеридов в сыворотке крыс, получавших липосомальный интерферон наружно или перорально, соответствовал значениям показателей в группах животных, которым апплицировали на кожу либо вводили перорально физиологический раствор или "пустые" липосомы (1,0 ± 0,12; 0,97 ± 0,20 и 1,03 ± 0,11 мМ/мл, соответственно). Следовательно, многократные аппликации или пероральное введение липосомального интерферона не изменяли белкового, углеводного и липидного обмена. Активность сывороточных ферментов (аланин- и аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы) опытных крыс не выходила за границы диапазона нормальных значений, что свидетельствовало об отсутствии нарушения структуры и функции сердца, почек, печени и желчевыводящих путей животных, которым апплицировали на кожу либо перорально вводили ЛФИ. Аналогичные выводы были сделаны нами в результате патоморфологического исследования, в ходе которого не обнаружено отклонений в весовых индексах и патоморфологической картине внутренних органов.
Таким образом, ЛФИ при наружном и пероральном применении не оказывала токсического влияния на сердечную деятельность, функцию системы терморегуляции, поведенческие и ориентировочно-исследовательские реакции, не вызывала значимых изменений в морфологическом составе периферической крови, интенсивности обменных процессов и состоянии внутренних органов.
При оценке возможного местно - раздражающего и сенсибилизирующего действия ЛФИ установили, что двадцатикратное нанесение препарата на кожу животных не вызывало визуальных признаков эритемы, инфильтрации или отека. Во всех исследованных образцах кожи (как опытных, так и контрольных животных) эпителиальный покров был полностью сохранен, базальный слой прослеживался на всем протяжении.
Регионарные лимфоузлы при макроскопическом исследовании были обычного размера, цвета и консистенции. Проведенное исследование не выявило выраженных различий в гистологическом строении кожи и лимфоузлов у опытных и контрольных животных. Не обнаружено признаков воспалительной реакции и изменений митотической активности в коже и лимфоузлах.
Патоморфологический анализ' кожи в месте аппликации ЛФИ и регионарных лимфоузлов показал, что липосомальная форма альфа-2 интерферона не обладала местно-раздражающим действием, не оказывала , другого негативного влияния на нормальную кожу и не вызывала изменений в регионарных лимфатических узлах экспериментальных животных.
Конъюнктивальная проба была отрицательной, не было выявлено признаков сенсибилизации гиперемического или отечного характера. Эти данные позволили заключить, что липосомальная форма альфа-2 интерферона не обладала кожно-сенсибилизирующими свойствами.
Анализ полученных результатов показал, что ЛФИ не оказывала токсического, кожно - раздражающего и аллергизирующего действия на организм лабораторных животных, то есть являлась безвредной.
Оценка противовирусного действия ЛФИ in vivo. Результаты изучения накожного применения ЛФИ, свидетельствующие о накоплении ИНФ в кровотоке животных, послужили основанием для изучения противогерпетической активности препарата на модели генитальной герпетической инфекции у морских свинок. С этой целью самцов морских свинок заражали вирусом герпеса в дозе 100 БОЕ по методике [Маренникова С.С. и др.,1986]. В первой экспериментальной группе (шесть животных) апплицировали липосомальный интерферон по 400 МЕ на животное через 1, 24 и 48 ч после инфицирования, животные второй группы (шесть) служили положительным контролем и лечения не получали, в третьей группе (отрицательный контроль) животные не были заражены и являлись группой, по отношению к которой сравнивалась интенсивность герпетических изменений на penis. За развитием заболевания следили по появлению характерных клинических признаков герпетической инфекции: гиперемии, отёку, кожным высыпаниям (везикулы) с последующим образованием эрозий. Для количественной характеристики использовали условную систему баллов (от 0 до 4), выражавшую суммарно интенсивность патологических признаков экспериментального герпеса [Маренникова С.С. и др.,1986]. Лечебный эффект оценивали по разности сумм баллов в контрольной и опытной группе в период максимального проявления симптомов заболевания (третий - четвёртый день после инфицирования).
В результате исследования специфической (противогерпетической) активности липосомального интерферона было установлено, что аппликации препарата существенно не изменяли динамику экспериментальной герпетической инфекции, но заметно уменьшали выраженность клинических признаков заболевания. В группе морских свинок, инфицированных вирусом и не получавших лечения, наблюдалась характерная картина генитального
герпеса. В течение первых двух суток на месте заражения появлялись гиперемия, отечность и отдельные элементы в виде везикул или пустул. К 72 - 96 часам поражения достигали максимального развития: пустулезные элементы сливались между собой, появлялись кровоточащие изъязвления, превращающиеся в обширные эрозии. Через 96 ч после заражения из " пустулезных элементов был выделен вирус герпеса 2 типа в титре 102 ЦПД. Через 120 часов начиналось обратное развитие клинических проявлений инфекционного процесса. У животных опытной группы, которым апплицировали липосомальный интерферон по 400 ME на животное, через 1, 24 и 48 часов после инфицирования клинические симптомы ограничивались небольшой отечностью и гиперемией в первые двое суток после заражения, а также отдельными пустулезными элементами на третьи сутки, выраженность которых уменьшалась к пятым суткам. Вирус герпеса из пустулезных элементов 'не выделялся. Лечебный эффект липосомального интерферона при использованной схеме нанесения препарата был оценен в 35 баллов. Вероятно, при увеличении кратности нанесения препарата до норм, соответствующих традиционной методике (два раза в сутки в течение четырёх дней) [Маренникова С. С. и др., 1986] или иммобилизации липосомального ИНФ в гелеобразующую структуру, для лучшей фиксации на penis животных, можно было ожидать более выраженного клинического эффекта.
Таким образом, липосомальный ИНФ при наружном применении способствовал купированию клинических признаков экспериментальной герпетической инфекции и сокращению продолжительности заболевания, что свидетельствовало о лечебном действии ЛФИ в отношении генитального герпеса морских свинок.
Полученные нами экспериментальные данные свидетельствовали о наличии противовирусной активности у ЛФИ, проявляемой препаратом как in vitro, так и in vivo. Это послужило экспериментальным обоснованием возможности проведения испытаний ЛФИ в качестве противовирусного препарата для неинъекционного применения на добровольцах совместно с ЦНИИЭ МЗ РФ на базе 2 - й клинической инфекционной больницы г. Москвы и в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.
Лечение острого вирусного гепатита В .•В клинических испытаниях ЛФИ у больных острым вирусным гепатитом В (ОВГВ) средней степени тяжести в клинике ЦНИИ МЗ РФ было установлено, что препарат в дозе 1 млн ME за 30 мин до еды два раза в день в течение 10 дней хорошо переносился больными и в отличие от Реаферона, вводившегося внутримышечно в той же дозе два раза в день, не вызывал каких-либо токсических или аллергических реакций. В ходе апробации осуществлялся ежедневный общеврачебный осмотр. Клинические и биохимические исследования проводились до начала лечения, после 10 дней терапии и при выписке. Кровь на маркеры вируса гепатита В (исследование методом иммуноферментного анализа) для верификации диагноза ОВГВ бралась до лечения и на HBsAg повторно перед выпиской.
Содержание а- и у-ИФН в сыворотке крови больных показало, что оба препарата ИФН являются его индукторами. При этом индуцирующий эффект ЛФИ оказался выше, чем у Реаферона. Так, в группе больных, получавших ЛФИ, содержание а-ИФН повысилось через 10 дней лечения в 4 раза, а при в/м введении - в 2,5 раза по сравнению с исходным уровнем. Индуцирующий эффект, но менее выраженный, оказывали оба препарата и на у-ИФН. Следует отметить, что длительность желтушного периода в группе больных, получавших ЛФИ, была короче на 7 дней, чем у принимавших Реаферон.
Оба препарата оказывали положительное влияние на элиминацию HBsAg из крови. При приеме ИФН как перорально, так и внутримышечно HBsAg не определялся более чем у половины больных к моменту выписки из стационара, в то время как в контрольной группе, получавших традиционное лечение, лишь у одной трети больных.
Таким образом, при ОВГВ терапевтическая эффективность ЛФИ, применяемой перорально, не уступала Реаферону, вводимому парентерально, а по ИФН-индуцирующему действию даже превосходила его [Змызгова А. В. и др., 1999].
Лечение хронического гепатита В
Проведенные в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ клинические испытания ЛФИ показали, что липосомальная форма ИФН при пероральном применении в дозе 500 тыс. МЕ детям до 7 лет и 1 млн МЕ школьникам два раза в день в течение 10 дней и затем в течение 1 мес через день один раз в сутки на ночь эффективна в комплексной терапии больных хронической ВГВ-инфекцией в активной и неактивной репликативных формах, ассоциированной с гломерулонефритом, и по эффективности не уступает инъекционному Реаферону в тех же дозах. Побочных эффектов ЛФИ не было отмечено, препарат хорошо переносился больными. При использовании ЛФИ у некоторых больных отмечалось улучшение со стороны клинико-лабораторных проявлений как гепатита, так и гломерулонефрита. Пероральное применение препарата было значительно удобнее и избавляло детей от нежелательных стрессовых нагрузок, исключало риск передачи инфекций через шприц (ВГВ, ВГС, ВИЧ) [ Маркарян A.C. и др., 1998].
Впоследствии, терапевтическая эффективность ЛФИ при лечении как острого, так и хронического гепатита В подтверждалась и в других исследованиях, выполненных в Кубанской государственной медицинской академии, Новосибирской государственной медицинской академии, показана эффективность ЛФИ, применяемой перорально в отношении гриппа, ОРЗ, клещевого энцефалита, в комплексной терапии генитального герпеса, хламидиоза, уреаплазмоза. Во всех исследованиях отмечалась хорошая переносимость препарата и взрослыми, и детьми [Колокольцов А. А. и др., 2007]. Клиническое применение ЛФИ в практике здравоохранения выявляет всё новые нозологические формы заболеваний, в лечении и профилактике которых эффективен липосомальный ИНФ, тем самым расширяя спектр терапевтического применения npenapaTa[http://lipint.ru].
выводы
1. Разработана новая липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона (Реаферон - ЕС - Липинт) для иерорального применения, а также технология её получения в промышленном масштабе. Экспериментально обоснован состав и соотношение основных компонентов и вспомогательных веществ липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа -2Ь интерферона человека, способ и технологические условия её получения, лиофильная форма выпуска препарата, условия хранения готовой лекарственной формы и способ применения лекарственного средства.
2. Разработана система оценки соответствия качества готовой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека требованиям Государственной Фармакопеи Российской Федерации, а также контроля качества препарата в процессе его получения на основных технологических стадиях.
3. Показана стабильность противовирусной активности лиофильно высушенного липосомального рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при сроках хранения не менее одного года.
4. Экспериментально установлено, что введённый перорально или нанесённый накожно липосомапьный рекомбинантный альфа-2 интерферон преодолевает соответственно гастроинтестинальный или кожный барьеры, сохраняя при этом свою биологическую активность, попадает в кровоток макроорганизма и обладает пролонгированным действием (18 и б часов, соответственно) по сравнению с интерфероном, введённым внутримышечно (3 часа).
5. Показано в экспериментах in vivo, что липосомальная форма рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при наружном и пероральном применении не обладает токсичностью, кожно - раздражающим и аллергизирующим действием и является безвредным препаратом для организма экспериментальных животных.
6. Показана in vitro стабильность липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека в условиях, моделирующих физиологическое окружение желудочно - кишечного тракта человека. При этом препарат сохраняет более 50 % своей противовирусной активности в течение одного часа сочетанного воздействия факторами ЖКТ. Продемонстрировано, что свободный интерферон в аналогичных условиях подвергается практически моментальной деградации.
7. Продемонстрирована in vivo противогерпетическая активность липосомального ИНФ при наружном применении на модели генитального герпеса морских свинок.
8. Показана противовирусная эффективность липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при пероральном применении в комплексной терапии при клинических испытаниях у больных хроническим ВГВ (вирусным гепатитом В) в активной и неактивной репликативных формах, осложнённых гломерулонефритом,
перспективность препарата для профилактики гриппа, других ОРЗ вирусного, бактериального и смешанного типов, а также его эффективность при проведении аллерген - специфической иммунотерапи.
9. Разработан и утвержден необходимый комплект нормативно-технической документации (ФСП, РП, инструкция по применению), проведена Государственная регистрация препарата в Российской Федерации под торговым названием «Реаферон-ЕС-Липинт», организовано серийное производство первого липосомального лекарственного препарата, разрешённого для медицинского применения и промышленного выпуска в Российской Федерации.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Золин В. В., Колокольцов А. А., Лукьянов А. Н. Методические подходы к созданию липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2. Тезисы I съезда иммунологов России 23-25 июня 1992; Новосибирск, Россия.
2. Золин В. В., Колокольцов А. А., Лукьянов А. Н. Изучение возможности создания липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2. Тезисы V конференции РФ «Новые направления биотехнологии» 18-22 мая 1992; Пущино, Россия.
3. Золин В. В., Колокольцов А. А., Бирюкова В. В. Липосомальный человеческий рекомбинантный интерферон альфа-2. Перспективы и применение. Тезисы II научно - практической конференции по генно-инженерным цитокинам 10-11 декабря 1992; Оболенск, Россия.
4. Золин В. В., Лукьянов А. Н., Нестеров А. Е., Колокольцов А. А. Торчилин В. П., Попов В. Ф., Варданян Н. В., Антонов Н. А. Методические подходы к созданию липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2. Вестник РАМН 1993; 2: 29-31.
5. Маркарян А. С., Длин В, В., Золин В. В., Колокольцов A. A. "The efficacy of administration of the liposomal form of recombinant alfa-2 interferon in children with glomerulone phritis (GN) associated with HB-virus infection (HB VI). VII International symposium on viral hepatitis 25-27 января 1996; Madrid, Spain.
6. Маркарян А. С., Длин В, В., Золин В. В., Колокольцов А. А. «Пероральная липосомальная форма рекомбинантного альфа-2 интерферона (ЛРИ) в терапии больных гломерулонефритом (ГН), ассоциированным с НВ-вирусной инфекцией (НВИ). Тезисы I конгресса педиатров - нефрологов России 17-19 сентября 1996; С. Петербург, Россия.
7. Золин В. В., Агафонова О. А., Колокольцов А. А. Создание липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 и перспективы её применения. VIII конференция «Новые направления биотехнологии» 27-29 апреля 1998; Москва, Россия.
8. Маркарян А. С., Длин В. В., Колокольцов А. А., Золин В. В. Новая пероральная липосомальная форма рекомбинантного альфа-2
интерферона в комплексной терапии больных гломерулонефритом, ассоциированным с НВ-вирусной инфекцией. Российский вестник перинатологии и педиатрии 1998; 3: 25 - 27.
9.3олин В. В., Колокольцов А. А., Агафонова О. А., Бочкова Т. Г. Создание липосомального препарата, содержащего человеческий рекомбинантный альфа-2 интерферон. Вестник РАМН 1999; 12: 18 - 22.
Ю.Золин В.В., Агафонова O.A., Колокольцов A.A., Даниленко Е.Д., Федосова, JI. К., Гамалей С. Г., Омигов В. В., Фадина В. А., Масычева В. И. Изучение противовирусной активности, фармакокинетики и токсических свойств липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при наружном применении. Вестник РАМН 2001; 5: 27-31.
П.Бажутин Н. Б., Золин В. В, Колокольцов А. А., Таргонский С. Н. Перспективы применения липосомальных препаратов в медицинской практике. Terra Medica nova 2003; 3: 17-20.
12.Бажутин Н. Б., Золин В. В., Колокольцов А. А., Таргонский С. Н. «Терапевтическая эффективность Реаферона - ЕС - Липинта -отечественного липосомированного препарата рекомбинантного альфа - 2 интерферона при профилактикё и лечении вирусных инфекций». «Хорошая клиническая практика - опыт 15-летней работы службы профилактики СПИД в Хабаровском крае». 9-10 августа, 2004; Хабаровск, Россия.
13.Бажутин Н. Б., Золин В. В, Колокольцов А. А., Таргонский С. Н. Перспективы применения липосомальных препаратов в медицинской практике. Здоровье Украины 2007; 3: С.71.
14.Колокольцов А. А., Золин В. В, Таргонский С. Н., Бажутин Н. Б. Терапевтическая эффективность Липоферона липосомального в профилактике и лечении вирусных инфекций. Здоровье Украины 2007; 7: 74 - 75.
Патент на изобретение:
1. Золин В. В., Колокольцов А. А., Баранов Ю. Н., Длин В. В., Маркарян А. С. Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения. Патент РФ № 2123328, приоритет от 19.04.96 , опубликован 20.12.1998.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АК- аскорбиновая кислота;
БОЕ - бляшкообразующая единица;
БОЛ - большие одноламеллярные липосомы;
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека;
ГФ - Государственная Фармакопея РФ;
ЖКТ - желудочно - кишечный тракт;
ИНФ - рекомбинантный альфа-2Ь интерферона человека;
ИФА - иммуноферментный анализ;
ЛП - липосомальный препарат;
ЛФИ - липосомальная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека;
ME - международные единицы активности интерферона;
ТЕ -титрационные единицы активности интерферона;
ОСО - отраслевой стандартный образец;
ЦПД - цитопатогенное действие вируса;
ЕМС - вирус энцефаломиокардита мышей;
МИБП - медицинский иммунобиологический препарат;
МЛ - мультиламеллярные липосомы;
МОЛ - малые одноламеллярные липосомы;
МУК - методические указания;
НТД - нормативно - техническая документация;
ОВГВ - острый вирусный гепатит В;
ОЛЛ - олиголамеллярные липосомы;
ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция;
ОРЗ - острое респираторное заболевание;
РП - регламент производства;
РЭС - ретикуло - эндотелиальная система;
СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита;
ТФ - DL-альфа-токоферол;
ФС - фармакопейная статья;
ФСП - фармакопейная статья предприятия;
ФХ - фосфатидилхолин (лецитин);
ХВГ - хронические вирусные гепатиты;
Хол - холестерин;
Золин Владимир Викторович
ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-2Ь ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА
Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата медицинских наук. Подписано в печать 24.11.2009. Заказ № 120. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5
Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Золин, Владимир Викторович
Список принятых сокращений Введение
Глава 1. Перспективы применения липосомальных форм биологически активных веществ в медицинской практике (литературный обзор)
1.1. Липосомы - наноконтейнеры для доставки лекарств
1.2. Технологические аспекты получения липосомальных препаратов
1.2.1. Разработка рецептуры липосомального препарата
1.2.2. Методы получения липосомальных форм лекарственных 28 препаратов
1.2.3. Включение препаратов интерферона в липосомы
1.2.4. Проблемы получения фармакопейных липосомальных 46 препаратов для применения в клинической практике
1.3. Транспорт липосомированных лекарств, при различных путях их 48 введения в организм
1.4. Терапевтический потенциал лекарственных препаратов, 53 иммобилизованных в липосомы
Введение Диссертация по биологии, на тему "Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2b интерферона человека: получение и свойства"
Актуальность исследования. Отечественный рекомбинантный альфа-2Ь (далее альфа-2) интерферон человека (Реаферон) обладает антивирусной, антипролиферативной, иммуномодулирующей активностью [Рафальский В. В., 1997; Ершов Ф. И., 2005]. Являясь белком, Реаферон разрушается в желудочно-кишечном тракте, поэтому основным способом его использования в клинической практике являются инъекции, а также местное или ректальное применение [Ершов Ф. И., 2006; Малиновская В. В., 2006]. Рекомбинантный альфа — 2 интерферон (ИНФ) в виде раствора для инъекций широко применяется в комплексной терапии вирусных и онкологических заболеваний человека, а именно -при острых и хронических вирусных гепатитах В, С, D, гриппе и других ОРВИ (адено-, рино-, корона- и др.), вирусных конъюнктивитах, раке почки, волосато-клеточном лейкозе, лимфомах кожи, плоскоклеточном раке кожи, рассеянном склерозе, СПИДе, цитомегаловирусных инфекциях и многих других болезнях [Smith G. L. et al., 1998; Sen G. С., 2001; Samuel С. E., 2001; Lenschow D. J. et al., 2007; Ершов Ф. И. и др., 2007]. Однако клиническое использование рекомбинантного интерферона создаёт и некоторые проблемы. Так, для достижения терапевтического эффекта при лечении большинства патологий, при которых показано применение препаратов интерферона (ИНФ), рекомендовано применять мегадозы препарата до 6 млн ME в сутки и выше [Маркарян А. С. и др., 1998]. Например, наиболее оптимальной дозой альфа-2 интерферона при лечении хронического вирусного гепатита В считается 3,0 - 5,0 млн ME внутримышечно три раза в неделю («золотой стандарт») в течение шести месяцев. При этом некоторые авторы рекомендуют более высокие дозы ИФН - до 10 млн ME в сутки ежедневно или через день в течение 4-6 месяцев, а при суперинфекции гепатита D до 12 месяцев [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И., 2006]. Использование таких доз обусловливается быстрым разрушением интерферона протеазами крови. Интерферонотерапия с применением высоких доз помимо краткосрочных пирогенных реакций, таких как озноб, повышение температуры, преходящих утомляемости, кожных высыпаний, зуда, лейко- и тромбоцитопении, способствует проявлению более серьёзных побочных эффектов, таких как появление нервно-психических расстройств (возбуждение, нарушения сна, раздражительность, или, наоборот, вялость, апатия, депрессия), временное выпадение волос [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И. и др., 2005]. При обкалывании очага поражения возможно развитие местной воспалительной реакции [Ершов Ф.И., 2006]. Необходимость внутримышечного инъецирования делает проблематичным применение препарата у детей младшего возраста, а в некоторых случаях его применить невозможно, например, у пациентов с сахарным диабетом из-за большого числа осложнений. Кроме того, при проведении инъекций возможно инфицирование пациента (герпес, гепатит, СПИД), наличие в составе препарата донорского альбумина потенциально увеличивает этот риск [Чуйкова В. И. и др., 2008].
Несмотря на очевидные недостатки, свойственные инъекционной лекарственной форме, альтернативы рекомбинантному альфа-2 интерферону при лечении ряда вирусных заболеваний в настоящее время не существует. Так, например, сегодня общепризнано, что альфа - интерфероны наиболее эффективны при лечении хронических вирусных гепатитов (ХВГ), они являются , единственными противовирусными препаратами, которые снижают риск формирования цирроза печени и трансформацию его в гепатоцеллюлярную карциному [Блохина Н. П., 1998; Змызгова А. В.,1999]. Кроме этого, препараты рекомбинаитного альфа-2 интерферона востребованы при лечении больных гриппом и другими острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ). Широкий спектр возбудителей ОРЗ, уникальная изменчивость вирусов гриппа, а также иммуносупрессирующее действие самих респираторных вирусов обусловливают необходимость использования ИНФ в комплексной терапии вирусных заболеваний респираторного тракта [Лобзин Ю.В. и др., 2004]. Однако применение Реаферона в терапии вирусных заболеваний респираторного тракта, особенно с профилактической целью, помимо побочного действия, сопутствующего парентеральному пути введения препарата, объективно сдерживается необходимостью проведения многократных внутримышечных инъекций [Маркарян А. С. и др., 1998; Лобзин Ю.В. и др., 2004].
В ряде случаев, например при лечении вирусных и онкологических заболеваний кожи и слизистых оболочек человека (вирусные конъюнктивиты, кератоконъюнктивиты, герпес, злокачественные лимфомы кожи, грибовидный микоз, плоскоклеточный рак кожи), целесообразно местное (наружное) применение интерферона, позволяющее локально воздействовать на клинический процесс и избегать отрицательных последствий, наблюдающихся при системном введении высоких доз ИНФ [Клявина Е. А., 1991; Попов В. Ф., 2002]. Использование для местного применения инъекционной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона в виде раствора ограничивается, во-первых, низкой стабильностью ИНФ в водных растворах, во-вторых, невозможностью обеспечения длительного контакта действующего начала с обрабатываемой поверхностью. Традиционными лекарственными формами ИНФ для местного (наружного) применения являются мази, гели. Введение биологически активного вещества в мазевую (гелевую) основу позволяет создать высокие концентрации ИНФ в области поражения и повысить его стабильность при хранении. Однако сложный набор компонентов, в том числе консервантов, включаемых в составы для обеспечения стабильности противовирусных свойств мази (геля) и наличие других вспомогательных веществ может вызвать аллергические реакции у пациентов, это ограничивает терапевтические возможности мазевых (гелевых) лекарственных форм [Клявина Е. А., 1991; Майданюк С.А.и др., 2000; Ершов Ф. И., 2006].
Также известны композиции для ректального введения препаратов интерферона, в частности, рекомбинантный альфа-2 интерферон в свечах (виферон) [Чистова Л. В. и др., 1993; В. В. Малиновская, 2003]. Однако, ректальный путь введения интерферона в виде микроклизм или свечей не удобен, не гигиеничен и вызывает естественную неприязнь, особенно у детей. Кроме того, при ректальном введении интерферона трудно обеспечить точное дозирование препарата ввиду частичных потерь либо жидкости, либо свечной массы, остающейся на руках или приспособлениях для введения.
В связи с тем, что терапевтический потенциал рекомбинантного альфа-2 интерферона не полностью использован традиционными лекарственными формами, становится очевидной необходимость разработки новых современных лекарственных форм, которые не имели бы указанных выше недостатков, а также позволили бы их применять для ещё не используемых способов введения интерферона в организм, например перорального.
Одним из перспективных направлений снижения системной токсичности, повышения биодоступности и, как следствие, увеличения терапевтической эффективности лекарств в современной нанобиотехнологии является создание их липосомальных форм [Швец В. И., 2008]. Липосомы при этом используются как биосовместимые и биодеградируемые наносистемы доставки, оптимизирующие действие лекарств. Размеры липосом, обычно используемых в качестве переносчиков лекарств, составляют от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров, то есть находятся в нанодиапазоне, что наряду с их биологическими свойствами обеспечивает их эффективность как систем доставки [Каплун А. П., 2007]. Известно, что липосомальные препараты снижают токсичность лекарственных средств, защищают их от преждевременной деградации, тем самым пролонгируя время действия лекарства в организме. Модифицируя мембрану липосом векторными молекулами (то есть молекулами, обеспечивающими специфическое сродство к структурам в поражённом органе или ткани и взаимодействие по типу лиганд - рецептор), можно обеспечить адресную доставку лекарства к клеткам-мишеням. При необходимости транспорта лекарственного вещества к органам ретикуло - эндотелиальной системы использование липосом автоматически решает эту проблему в силу тропности носителя к органам РЭС. Кроме того, липосомы изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их терапевтическую эффективность [Марголис Л. Б.и др., 1986].
На сегодняшний день именно липосомы из всех наночастиц наиболее широко применяются в качестве средств доставки лекарств в клинической практике, ряд липосомальных препаратов лицензирован и производится в промышленных масштабах [воуа1 Р. е1 а1, 2005; ТогсЫНп V. Р., 2005]. Наиболее значимое применение липосомальные препараты получили в химиотерапии опухолевых заболеваний, лечении глубоких микозов, вакцинологии, офтальмологии, пульмонологии и при лечении некоторых других патологических состояний [воуа1 Р. еЬ а1, 2005; Швец В. И., 2008].
Таким образом, потребность практического здравоохранения в инновационных лекарственных формах рекомбинантного альфа-2 интерферона, лишённых недостатков, свойственных традиционным лекарственным формам препарата, очевидна. Учитывая уникальные свойства липосом как носителей лекарств, одним из перспективных подходов к решению этой проблемы является создание липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, нацеленной на проведение интерферонотерапии без инъекций и сопутствующих им нежелательных побочных эффектов. Бесспорная важность этой задачи для отечественной клинической практики явилась актуальным основанием для проведения данной исследовательской работы.
Цель и задачи диссертационной работы.
Целью настоящей работы является разработка технологии производства, методов контроля качества и экспериментальное изучение in vitro и in vivo свойств новой липосомальной лекарственной формы человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона. В связи с этим задачами исследования являлись:
1. Разработка и экспериментальное обоснование основных стадий технологии получения липосомалыюго ИНФ.
- оценка эффективности включения интерферона в липосомы, полученные различными способами;
- определение биологической активности образцов липосомального интерферона, полученных разными методами;
- выбор на основе экспериментальных данных способа получения липосомальной формы интерферона и оптимального состава липосомального препарата рекомбинантного альфа - 2 интерферона человека.
2. Оценка физико - химических свойств и стабильности образцов липосомального ИНФ в процессе хранения.
3. Разработка физико - химических и биологических методов контроля качества препарата.
4. Лабораторно - экспериментальное изучение липосомального ИНФ, включающее оценку противовирусных свойств липосомального интерферона in vitro и in vivo.
5. Разработка необходимого комплекта нормативно - технической документации (НТД) на готовый лекарственный препарат (фармакопейная статья предприятия (ФСП), регламент производства (РП), инструкция по применению) и его Государственная регистрация в Российской Федерации.
Научная новизна работы. Научная новизна данной работы заключается в следующем:
1. Впервые разработана технология промышленного производства новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека для перорального и наружного применения:
- впервые проведена сравнительная экспериментальная оценка влияния условий получения липосомального рекомбинантного альфа-2Ь интерферона различными методами на его биологическую (противовирусную) активность;
- исследована эффективность включения рекомбинантного альфа-2Ь интерферона в липосомы, полученные различными методами;
- теоретически и экспериментально обоснован выбор способа получения и оптимальный состав липосомального препарата рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека для применения в медицинской практике.
2. Разработаны физико-химические и биологические методы контроля качества липосомального препарата ИНФ.
3. Изучена in vitro стабильность образцов липосомального ИНФ в процессе получения и хранения препарата.
4. Впервые показана безвредность липосомальной формы ИНФ при наружном и пероральном применении препарата in vivo.
5. Продемонстрирована эффективность липосомальной формы ИНФ при наружном применении препарата для лечения генитального герпеса экспериментальных животных.
6. Впервые показано, что липосомальный ИНФ сохраняет биологическую (противовирусную) активность в условиях, моделирующих воздействие физиологических факторов желудочно - кишечного тракта человека.
7. Впервые подтверждено, что липосомальный ИНФ при наружном и пероральном применении способен преодолевать соответственно кожный и гастроинтестинальный барьеры организма и проникать в кровеносное русло экспериментальных животных, проявляя свойственную ему противовирусную активность, а затем полностью элиминироваться из организма экспериментальных животных с помощью естественных ферментативных систем.
Практическая ценность работы. Результатом диссертационной работы является разработанная промышленная технология получения новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, проявляющей терапевтическую эффективность при пероральном и наружном применении, отвечающей всем требованиям Государственной Фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ). Разработан необходимый комплект НТД на препарат (ФСП, РП, инструкция по применению), проведены доклинические и клинические испытания липосомального интерферона.
Результаты работы защищены Патентом РФ № 2123328 «Противовирусное лекарственное средство для перорального применения».
На предприятии ЗАО «Вектор-Медика» наукограда Кольцово под руководством автора налажен серийный промышленный выпуск нового противовирусного и иммуномодулирующего лекарственного препарата -липосомального рекомбинантного интерферона альфа-2Ь - первого в отечественной клинической практике препарата интерферона для перорального применения. Впервые препарат был зарегистрирован в Российской Федерации под торговым названием «Липинт» 28.03.2001 года, регистрационное удостоверение Р № 000344/01-2001, затем переригистрирован как «Реаферон - ЕС -Липинт», регистрационное удостоверение Р № 000821/01 -2001 от 16.11.2001. В настоящее время в медицинской практике препарат применяется в комплексной терапии больных острым гепатитом В, хроническим гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, а также хроническим гепатитом В, осложненным гломерулонефритом, в лечении больных атопической бронхиальной астмой, для проведения специфической иммунотерапии при аллергическом риноконъюнкти-вите, при профилактике и лечении гриппа и ОРЗ у взрослых и детей, в комплексной терапии урогенитальной хламидийной инфекции у взрослых. Спектр терапевтического применения препарата «Реаферон-ЕС - Липинт» постоянно расширяется, в связи с тем, что клинические испытания выявляют все новые нозологические формы заболеваний, в лечении и профилактике которых он эффективен.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Новая липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона человека, производимая по разработанной технологии, лишена побочных эффектов, свойственных инъекционной лекарственной форме ИНФ и обладает широким спектром терапевтического применения в качестве противовирусного препарата.
2. Липосомальная лекарственная форма ИНФ позволила доставлять интерферон в макроорганизм пероральным способом с сохранением его специфической (противовирусной) активности.
3. Липосомы, содержащие иммобилизованный в их внутреннюю полость ИНФ, предохраняют белок от деградации в желудочно-кишечном тракте макроорганизма, способствуют попаданию цитокина в кровоток и пролонгируют его терапевтическое действие, по сравнению с лекарственной формой интерферона, предназначенной для парентерального введения.
4. Система контроля физико - химических и биологических свойств липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, применяющаяся на технологических стадиях её производства, позволяет выпускать лекарственный препарат в полном соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи Российской Федерации.
Апробация материалов работы. Материалы диссертации представлены на следующих конференциях:
I съезд иммунологов России 23.06 - 25.06 1992 г., Новосибирск, Россия;
V конференция РФ «Новые направления биотехнологии» 18.05-22.05 1992 г., Пущино, Россия;
II научно - практическая конференция по генно - инженерным цитокинам 10.12 -11.12 1992 г., Оболенск, Россия;
Научная конференция для врачей практиков «Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2» 25.01 -29.01 1993 г., Кольцово, Россия;
VII International symposium on viral hepatitis 25.01 - 27.01 1996 г., Madrid, Spain;
I конгресс педиатров - нефрологов России 17.09 -19.09 1996 г., С. Петербург, Россия;
VIII конференция «Новые направления биотехнологии» 27.04 - 29.04. 1998 г., Москва, Россия;
Научная конференция для врачей практиков «Хорошая клиническая практика - опыт 15 - летней работы службы профилактики СПИД в Хабаровском крае» 9.08 - -10.08 2004 г., Хабаровск, Россия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи из них 3 - в журнале Вестник РАМН (1993; 1999; 2001) и 1 - в журнале Российский вестник перинатологии и педиатрии (1998), получен патент РФ.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах, содержит 27 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает в себя 300 источников, из них 175 иностранных.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Золин, Владимир Викторович
выводы
1. Разработана новая липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона (Реаферон - ЕС - Липинт) для перорального применения, а также технология её получения в промышленном масштабе. Экспериментально обоснован состав и соотношение основных компонентов и вспомогательных веществ липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона человека, способ и технологические условия её получения, лиофильная форма выпуска препарата, условия хранения готовой лекарственной формы и способ применения лекарственного средства.
2. Разработана система оценки соответствия качества готовой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека требованиям Государственной Фармакопеи Российской Федерации, а также контроля качества препарата в процессе его получения на основных технологических стадиях.
3. Показана стабильность противовирусной активности лиофильно высушенного липосомального рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при сроках хранения не менее одного года.
4. Экспериментально установлено, что введённый перорально или нанесённый накожно липосомальный рекомбинантный альфа-2 интерферон преодолевает соответственно гастроинтестинальный или кожный барьеры, сохраняя при этом свою биологическую активность, попадает в кровоток макроорганизма и обладает пролонгированным действием (18 и 6 часов, соответственно) по сравнению с интерфероном, введённым внутримышечно (3 часа).
5. Показано в экспериментах in vivo, что липосомальная форма рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при наружном и пероральном применении не обладает токсичностью, кожно - раздражающим и аллергизирующим действием и является безвредным препаратом для организма экспериментальных животных.
6. Показана in vitro стабильность липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека в условиях, моделирующих воздействие физиологических факторов желудочно - кишечного тракта человека. При этом препарат сохраняет более 50 % своей противовирусной активности в течение одного часа сочетанного воздействия факторами ЖКТ. Продемонстрировано, что свободный интерферон в аналогичных условиях подвергается практически моментальной деградации.
7. Продемонстрирована in vivo противогерпетическая активность липосомального ИНФ при наружном применении на модели генитального герпеса морских свинок.
8. Показана противовирусная эффективность липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при пероральном применении в комплексной терапии при клинических испытаниях у больных хроническим вирусным гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, осложнённых гломерулонефритом, перспективность препарата для профилактики гриппа, других ОРЗ вирусного, бактериального и смешанного типов.
9. Разработан и утвержден необходимый комплект нормативно-технической документации (ФСП, РП, инструкция по применению), проведена Государственная регистрация препарата в Российской Федерации под торговым названием «Реаферон-ЕС-Липинт», организовано серийное производство первого липосомального лекарственного препарата, разрешённого для медицинского применения и промышленного выпуска в Российской Федерации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как известно, интерфероны являются биологическими регуляторами широкого спектра действия. Системе интерферона принадлежит ведущая роль в контроле за генетическим постоянством организма. Многообразие биологических эффектов альфа - 2 интерферона, в частности, таких как противовирусный, антипролиферативный и иммуномодулирующий, позволяет применять его при самом широком спектре вирусных заболеваний. Применение различных лекарственных форм интерфероновых препаратов является одним из наиболее перспективных направлений в современном лечении как вирусных заболеваний, так и иммунодефицитных состояний организма.
Выбор противовирусных препаратов, активным действующим началом которых является интерферон, в частности для терапии хронических гепатитов или ОРВИ довольно ограничен. Препараты импортного производства имеют высокую стоимость, поэтому не находят широкого применения в практике отечественного здравоохранения.
Отечественный рекомбинантный альфа-2Ь интерферон человека (Реаферон) пользуется наибольшим спросом из - за его доступности и умеренной стоимости. Однако клиническое использование инъекционной лекарственной формы рекомбинантного интерферона ограничивается побочными эффектами, вызванными необходимостью применения мегадоз препарата, обусловленной быстрым разрушением интерферона протеазами крови и других биологических жидкостей организма. Кроме того, при проведении инъекций возможно инфицирование пациента (герпес, ВИЧ, гепатиты) и развитие аллергических реакций, поскольку Реаферон в качестве стабилизатора содержит донорский альбумин. Самый удобный и естественный путь введения лекарства в организм — пероральный для Реаферона недоступен, потому что, являясь белком, он разрушается в желудочно - кишечном тракте.
Разработанная в результате диссертационной работы промышленная технология позволила получить новую липосомальную лекарственную форму рекомбинантного альфа-2 интерферона, которая проявляет терапевтическую эффективность при ранее не использующемся пути введения ИНФ в организм -пероральном. ЛФИ отвечает всем требованиям Государственной Фармакопеи РФ, на препарат разработан необходимый комплект НТД (ФСП, РП, инструкция по применению), проведены доклинические и клинические испытания в качестве противовирусного средства, произведена регистрация в Российской Федерации, налажено масштабное промышленное производство. В состав липосомального ИНФ вошли только фармацевтически приемлемые компоненты.
Таким образом, на фармацевтическом рынке России появился инновационный отечественный противовирусный лекарственный препарат, созданный с применением нанотехнологий. Новая липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона человека, предназначенная для перорального применения, лишена побочных эффектов, свойственных Реаферону, не содержит в своём составе альбумин, обладает широким спектром терапевтического применения в качестве противовирусного лекарственного средства и невысокой ценой по сравнению с импортными лекарствами, активным действующим началом которых является рекомбинантный альфа-2 ИНФ.
Липосомальная лекарственная форма ИНФ явилась первым отечественным липосомальным лекарственным препаратом, разрешённым для промышленного производства. Несмотря на то, что в настоящее время разработка липосомальных форм лекарственных веществ является одним из приоритетов стремительно развивающейся в последние годы наномедицины, практически все липосомальные препараты, представленные на мировом и российском фармацевтических рынках, за исключением липосомального ИНФ, имеют зарубежное происхождение. Отставание отечественной фармацевтической промышленности особенно заметно в области создания инновационных препаратов нового поколения, в частности, новых лекарственных форм противовирусных, иммуномодулирующих, обладающих антиканцерогенными свойствами препаратов, что, в наше время хронических иммунодефицитных состояний населения России, особенно тревожно. Учитывая хорошо известные недостатки препаратов этого класса, такие как токсичность in vivo, недостаточная эффективность, побочные эффекты, актуальность создания отечественных липосомальных лекарственных форм таких препаратов для отечественной клинической практики не вызывает сомнений.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Золин, Владимир Викторович, Кольцово
1. Абдуллаева Б. И., Ефременко В. И., Смирнова A.C. Влияние липоеомальных фитопрепаратов на состояние обменных процессов на фоне гипергликемии в эксперименте. Депонировано в ВИНИТИ 1997; 2602-В 97:7.
2. Алексеев К. В., Шалдырван Е. А. Лекарственные формы интерферона. Антибиотики и химиотерапия 1990; 35 (9): 51-54.
3. Анджапаридзе О. Г., Торчилин В. П., МажульЛ. А., Бурханов С. А., Агеева О. Н. Защитное действие виросом, содержащих антигены вируса гриппа, при интраназальном способе введения. Вопросы вирусологии 1987; 1: 112.
4. Антонов В.Ф., Князев Ю.А., Мошковский Ю.Ш. и др. Использование в клинической практике липоеомальных форм лекарственных препаратов. Советская медицина 1983; 5: 54 63.
5. Бажутин Н. Б., Золин В. В, Колокольцов А. А., Таргонский С. Н. Перспективы применения липоеомальных препаратов в медицинской практике. Здоровье Украины 2007; 3: С.71.
6. Бергельсон Л. Д., Дятловицкая Э. В., Молотковский Ю. Г. и др. Препаративная биохимия липидов. М.: «Наука», 1981.
7. Бергельсон Л. Д. Мембраны, молекулы, клетки. М.: Наука, 1982.
8. Березов Т. Т., Коровкин В. Ф. Биохимия. М.: Медицина, 1998.
9. Благой Ю.П., Васильченко В. Н., Зимогляд Б.Н., Гусева И.С. Структурная и аггрегационная устойчивость лецитиновых липосом по данным светорассеяния. Биофизика 1980; 6(25): 1017 1022.
10. Богач П. Е., Курский М. Д., Кучеренко Н. Е, Рыбальченко В. К. Структура и функции биологических мембран. Киев: Вища школа, 1981.
11. Будкер В. Г., Вахрушева Т. Е., Киселёва Е. В., Христолюбова Н. Б. Получение липосом с лекарственными препаратами. Химико-фармацевтический журнал 1987; 2: 347 352.
12. Василенко И. А., Краснопольский Ю. М., Степанов А. Е., Швец В. И. Проблемы и перспективы производства фосфолипидов. Химико — фармацевтический журнал 1998; 32 (5): 9-15.
13. Варпаховская И. Липосомальные формы лекарственных средств. Ремедиум 1999; 5: 68 70.
14. Владимиров Ю. А., Арчахов А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: «Наука», 1972.
15. Владимирский М. А., Ладыгина Г. А., Тенцова А. И. Эффективность стрептомицина, включенного в липосомы, при экспериментальном туберкулезе у мышей. Антибиотики 1983;1: 23 26.
16. Владимирский М.А., Ладыгина Г. А., Тенцова А. И. и др. Получение липосомальных препаратов стрептомицина и дищдрострептомицина. Антибиотики 1984; 3: 163 166.
17. Галкина С. И. Влияние различных форм витамина А и его сочетания с витамином Е на перекисное окисление липидов. Вопросы мед. химии 1984; 4:91-94.
18. Гальперин С. И. Физиология человека и животных. М.: Высшая школа, 1977.
19. Гапонюк П. Я. И., Марков И. А., Маркова Е. А., Гапонкж П.П. Противовирусное средство в липосомальной форме: Патент РФ № 2176518, 2001.
20. Гланц С. Медико биологическая статистика. М.: Практика, 1999.
21. Грегориадис Г., Аллисон А. (редакторы). Липосомы в биологических системах. М.: Медицина, 1983.
22. Голубчикова Н. А., Сидоров В. Н., Крейнес В. М. и др. Взаимодействие липосом различного состава с компонентами сыворотки крови. Вестник АМН СССР 1990; 6: 36 38.
23. Гринько Р.А. Стабилизация бислойных фосфолипидных везикул (липосом), содержащих антибиотик. В кн.: Здоровье населения и среда обитания: Материалы научно практ. конф. Ставрополь; 1997. 251 -252.
24. Даниельс Р. Галенические формы современных средств по уходу за кожей. Сырье и упаковка 2003; 4: 21 22.
25. Дранов Ф. А., Дудниченко А. С., Лизин И. А. и др. Эффективность липосомных форм цитостатиков. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1996; 124 (1): 85 88.
26. Ершов Ф. И. Иммуномодуляторы новое поколение противовирусных средств. Экспериментальная и клиническая фармакология. 1995; 58 (2): 74 - 78.
27. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М.: Гэотар Медиа, 2005 г.
28. Ершов Ф.И. Цитокины новое поколение биотерапевтических препаратов. Вестник Российской АМН 2006; 9: 45 - 50.
29. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. М.: Гэотар Медиа, 2006.
30. Ершов Ф.И., Романцов М.Г. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях. Руководство для врачей. М.: Гэотар - Медиа, 2007 г.г
31. Ефременко В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине). Ставрополь: Б.и., 2001.
32. Ефременко В. И. Открытия ученых дорого стоят. Фармацевтический вестник 2003; 27: 22.
33. Закревский В. И., Ефременко В. И., Мельников В. А. Приготовление липосом, содержащих биологически активные вещества. Методические рекомендации, Волгоград, 1982.
34. Закревский В.И., Курилов В.Я., Мельников В.А., Ефременко В.И. Включение в липосомы капсульного антигена чумного микроба. Молекул, генет. микробиол и вирусол. 1983; 9: 33-36.
35. Закревский В.И. Некоторые аспекты применения липосом в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний. Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 1985; 1: 3-8.
36. Змызгова А. В. Интерферонотерапия вирусных гепатитов. М., 1999.
37. ИвковВ. Г., Берестовский Г. Н. Динамическая структура липидного бислоя. М.: Наука, 1981.
38. Ипатова О. М., Арчаков А. И., Иванов А. С. Фосфолипидная система доставки лекарственных веществ. В кн.: Человек и лекарство: Материалы VI Российского нац. конгресса. М.; 1999 г. 412.
39. Инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре. М.; 1983.
40. Каган В. Е., Скрыпин В. И., Сербинова Е. А. и др . Локализация а токоферола в гидрофобной зоне липидного бислоя. Докл. АН СССР 1986; 288 (5): 1242-1245.
41. Каледин В. И., Николин В. П., Попова Н. А. Подавление опухолевого роста в печени цисдиаминодихлорплатином в составе больших олиголамеллярных липосом, приготовленных методом замораживания и оттаивания. Вопросы онкологии 1989; 35 (5): 599 602.
42. Каледин В. И., Курунов Ю. Н. Противоопухолевая активность заключенного в липосомы кортифена, введенного мышам с солидными опухолями. Экспериментальная Онкология 1991; 13(2): 65 67.
43. Капании П.В., Соболева H.H., Трофимов В.И. О возможности криорадиоционной стрерилизации липосом. Химико фармацевтический журнал 1988; (22):479-482.
44. Каплун А. П., Шон Ле Банг, Краснопольский Ю.М. , Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Вопросы медицинской химии 1999; 45(1): 3 -12.
45. Каплун А. П. Нанолекарства, 2007. цитировано 22 июля 2009.; Доступно с сайта: http: //www.etero.ru/pages-99.html.
46. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975.
47. Кириленко В.Н., Стефанов A.B., Скорик Л.В., Мельничук Д.А. Получение липосом из фосфолипидов пахты. В кн.: Методы получения и анализа биохимических препаратов: Материалы конф. Юрмала; 1987. 186.
48. Клибанов А. Л., Бурханов С. А., Трубецкой В. С. Химическая модификиция липосом и создание новых форм физиологически активных препаратов. В сб.: Итоги науки и техники, серия Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1988; 8: 79 142.
49. Клявина Е. А. Технология и исследования лекарственных форм интерферона: Автореферат дис. канд. фарм. наук. М.; 1991.
50. Кобринский Г. Д. Липосомы транспортёры лекарств. М.: Знание, 1989.
51. Колокольцов А. А., Золин В. В., Таргонский С. Н., Бажутин Н. Б. Терапевтическая эффективность Липоферона липосомального в профилактике и лечении вирусных инфекций. Здоровье Украины 2007; 7: 74-75.
52. Комаров Ф. И., Коровкин Б. Ф., Меньшиков В. В. Биохимические исследования в клинике. Элиста: АПП Джангар, 1999.
53. Краснопольский Ю. М., Степанов А. Е., Швец В. И. Некоторые аспекты технологии получения липосомальных форм лекарственных препаратов. Химико-фармацевтический журнал 1999; 33 (10): 20-23.
54. Кузякова Л. М., Ефременко В. И., Степанова Э. Ф., Андреева И. Н. Поиск возможностей усиления фармакотерапевтической активности антибиотиков для лечения особо опасных инфекций. В кн.: Гомеостаз и инфекционный процесс: Материалы конф. Саратов; 1998. 40.
55. Кузякова JI. М., Ефременко В. И. Медикаментозное преодоление анатомических и клеточных барьеров с помощью липосом. Ставрополь, 2000.
56. Кулаков В. Н., Пименова Г.Н., Матвеев В.А. и др. Фармакокинетика рекомбинантного альфа-2 интерферона (Реаферона). Вопросы вирусологии 1989; 2: 183-186.
57. Курунов Ю. Н., Николин В. П., Каледин В.И. и др. Изучение эффективности антибактериальных препаратов, заключенных в липосомы, при лечении экспериментального туберкулеза. Проблемы туберкулеза 1982; 10: 54-58.
58. Ладыгина Г.А. Экспериментальное изучение липосомальной формы стрептомицина и дигидрострептомицина на модели туберкулеза: Автореферат дис. канд. биол. наук. Москва; 1985.
59. Лейтес С. М., Лаптева Н. Н. Очерки по патофизиологии обмена веществ и эндокринной системы. М.: Наука, 1967.
60. Левчук Ю. Н., Волокин З.Н. Спектроскопическое определение содержания липидов в суспензиях липосом. Украинский биохимический журнал 1982; 1 (54): 66 68.
61. Левчук Ю. Н., Волокин З.Н. Размеры лицитиновых липосом, образующихся при взаимодействии ульразвука. Биофизика 1983; 2(28): 266 -269.
62. Лобзин Ю.В., Львов Н.И., Колокольцов A.A. Реаферон-ЕС®-Липинт липосомальный в терапии больных гриппом и другими острыми респираторными заболеваниями. Цитокины и воспаление 2004; 3(1): 49 54.
63. Лукьянов А.Н. Направленное регулирование физико химических свойств липосом и взаимодействие липосом с клетками: Автореферат дис. канд. биол. М.; 1991.
64. Майданюк С.А., Гурьев В. П. Колокольцов А. А. и др. Противовирусное средство в мазевой форме на основе интерферона -альфа- 2: Патент РФ №2159609, 2000.
65. Мак-Дугалл И. Р. Липосомы как диагностические средства. В кн.: Липосомы в диагностических системах, под редакцией Грегориадиса Г. Г. и Аллисона А. А. М, 1983.
66. Малета Ю. С., Тарасов В. В. Математические методы статистического анализа в биологии и медицине. М.: МГУ, 1981.
67. Малиновская В. В. Ректальные свечи и устройство для введения ректальных свечей в полость организма: Патент РФ № 2024253, 1994.
68. Малиновская В. В. (ред.) Виферон. Комплексный противовирусный и иммуномодулирующий препарат для детей и взрослых. Руководство для врачей. М.: Медицина, 2006 г.
69. Маренникова С. С., Мацевич Г. Р., Чекунова Э. В. и др. Разработка и практическое использование новых экспериментальных моделей разных форм герпетической инфекции. Вопросы вирусологии 1986;1: 59 65.
70. Марголис Л. Б., Бергельсон Л. Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука, 1986.
71. Матвиенко П. В. Липосомы — «скафандры» для лекарств». Провизор 2004; 15. цитировано 25 августа 2009.; Доступно с сайта: http://www.provisor.com.ua/archive/2004; 15/аг125.htm.
72. Маякова С.А., Червонобаб Ю.В., Курмашов В.И. Применение противогрибкового липосомального препарата амбизом у больных гемобластозами (ГБ). В кн.: Человек и лекарство: Материалы VI Российского нац. конгр. Москва; 1999. 202.
73. Медуницын Н. В. Вакцинология. М.: Триада, 1999.
74. Мельников В. Р., Кобринский Г. Д., Львов Н. Д., Болотин И. М.,
75. Баринский И. Ф. Лечение липосомальным интерфероном экспериментального генитального герпеса. Вестник АМН СССР 1990; 8: 35- 37.
76. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987.
77. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания, МУК 4.1/4.2.588 96. М.: Информационно — издательский центр Минздрава России, 1998.
78. Музя Г.И., Лыкова Е.О., Шестаков К.А. с соавт. Способ получения липосом, содержащих водорастворимые низкомолекулярные соединения: Патент РФ № 2014071, 1994.
79. Несытова Н. Ю., Палева Н. С., Ильина Е. В. и др. Тенденции в развитии исследований в области липосом. Вестник АМН СССР 1990; 6: 8-19.
80. Никонов Г.И. Дестабилазный комплекс природная липосома, синтезируемая медицинской пиявкой. В кн.: Человек и лекарство: Материалы II Российского нац. конгр. М.; 1995. 214.
81. Одинец А. В., Ефременко В. И., Чеботарев В. В., Базиков И. А. Конструирование наноструктур (липосом), содержащих антибиотики и их использование для лечения экспериментального сифилиса. Медицинский вестник Северного Кавказа 2007; 4:41 44.
82. Оксинойд О. Э., Копыт С. Н., Маевский Е. И. Косметологические транспортные системы. Сырье и упаковка 2003; 4: 26—27.
83. Орехов Д. А. Иммунобиохимическая характеристика крови птицы при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза: Автореферат дис. канд. вет. наук. Санкт Петербург, 2008.
84. Остро М.Д. Липосомы. В мире науки.1987; 8: 71-79.
85. Пальцев М. А. Нанотехнологии в клинической медицине и фармации. Терапевт 2009; 4: 20-26.
86. Пальцев М. А. Нанотехнологии в медицине и фармации. Справочник врача общей практики: ежемесячный научно-практический журнал 2009; 7: 68-72.
87. Плетнёва О. П., Оксинойд О. Э., Афонин Н. И. Некоторые аспекты создания лекарственной формы липосомального препарата цитарабина. Вестник1. АМН СССР 1990; 8: 33 34.
88. Попов В. Ф., Попов О. В. Лекарственные формы интерферонов. Справочник врача. М.: Триада-X, 2002.
89. Пшеничнов В. А., Хамитов Р. А., Колосков А. В. Липосомы в экспериментальной вирусологии. Вопросы вирусологии 1990; 1: 4 — 8.
90. РафальскийВ.В. Клиническое применение препаратов интерферона. Смоленск: СГМА, Русич Принт, 1997.
91. Регламент производства № 1194 02. Реаферон — ЕС — Липинт липосомальный для перорального применения сухой. Архив ЗАО «Вектор — Медика», Кольцово, 2001.
92. Ротов К.А. , Васильев В.П., Антонов Ю.В. Получение и характеристика липосом, содержащих антибиотики. Микробиологичекий журнал 1989; 51 (6): 79-83.
93. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А.Аутологические липосомы. Вестник РАМН 1990;8:47-50.
94. Скатков С. А. Эссенциальные фосфолипиды: воспроизведение или некачественная имитация. Фапматека 2001; 7: 26 -30.
95. Скатков С. А. Фосфатидилхолин и интенсивные нагрузки. Теория и практика физической культуры 2003; 1: 27- 29.
96. Смирнова Е. Б., Ефременко В. И., Смирнова А. С. и др. К вопросу использования липосомальных препаратов солодки и цикория на фоне гипергликемии. В кн.: Здоровье и среда обитания: Материалы конф. Ставрополь; 1997. 258.
97. Сорокоумова Г.Н., Селицев A.A., Тюрина О.П. и др. Расчет размера липосом по оптической плотности. Биофизика 2002; 47 (2): 268-276.
98. Ставский Е. А., Леляк А.Е. , Нестеров А.Е. и др. Изучение динамики накопления интерферона -а2 человека in vivo , продуцируемого генетически модифицированным микроорганизмом Bacillus subtilis. Молекулярная медицина 2007; 2: 25-28.
99. Степанов А. Е. Краснопольский Ю. М., Швец В. И. Физиологически активные липиды. М.: Наука, 1991.
100. Стефанов А. В. Использование липосом в медицине. Молекул. Биология1980; 27: 32-44.
101. Стефанов A.B., Лишко В. К., Шевченко А. В., Ефимов А. С., Ховака В.В. Стабильность и всасывание липосом с включенным инсулином в тонком кишечнике. Украинский биохимический журнал 1986; 58 (2): 64 69.
102. Торчилин В. П., Смирнов В. Н., Чазов Е. И. Проблемы и перспективы использования липосом для направленного транспорта лекарств. Вопросы медицинской химии 1982; 1: 3 14.
103. Торчилин В. П., Смирнов В. Н. Направленный транспорт лекарств с помощью липосом. Украинский биохимический журнал 1984; 56 (3): 339 344.
104. Трофимов В.И., Нисневич М.М. Вопросы получения и контроля свойств стерильных липосом с лекарственными препаратами. Вестник РАМН 1990; 6: 28-32.
105. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1981.
106. Файтельберг Р. О. Всасывание углеводов, белков и жиров в кишечнике. Л.: Наука, 1967.
107. ФСП 42 0140 - 0371 - 00. «Липинт для перорального применения сухой». Архив ЗАО «Вектор - Медика», 2000.
108. Фендлер Д.Х. Оптимизация включения лекарственных препаратов в липосомы. В кн.: Липосомы в биологических системах под ред. Г. Грегориадиса, А. А. Аллисона М.: Медицина, 1983.
109. Фисенко В. П., Арзамасцев Е. В. , Бабаян Э. А., и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Ремедиум , 2000.
110. Холодова Е.А., Забаровская З.В., Данилова Л.И. Липосомы в диабетологии. Проблемы эндокринологии 1990; 6 (36): 80-83.
111. Чистова Л. В., Хусаинова Д.Г., Малиновская В.В. Применение виферона в комплексном лечении хронических вирусных гепатитов у детей. В кн.:
112. Методические основы применения Реаферона человеческого интерферона альфа- 2 b - белка. Кольцове; 1993. 51-54.
113. Чучалин А. Г. Всесоюзная программа «Липосомы и их применение в биологии и медицине. Вестник АМН СССР 1990; 6: 3 7.
114. Швец В. И., Краснопольский Ю.М. Липиды в лекарственных препаратах. Вестник АМН СССР 1990; 6: 19 28.
115. Швец В. И., Краснопольский Ю. М. Липосомы в фармации. Продукты нанобиотехнологии. Провизор 2008; 3. цитировано 20 сентября 2009.; Доступно с сайта: http://www.provisor.com.ua/archive/2008.
116. Шраер Т.И., Семченко С.Б. Направленный транспорт липосом в условиях ауто- и аллотрансплантации. В кн.: Человек и лекарство: Материалы II Российского нац. конгр. М.; 1995. 292.
117. Экспериментально производственный регламент № 530 - 95 «Реаферон для инъекций сухой». ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцово, 1995.
118. Эрнандес Е. И., Марголина А. А., Петрухина А. О. Липидный барьер кожи и косметические средства. М.: Клавель фирма ООО, 2005.
119. Эчкалов А. П. и др., Захарова Т. С., Халилов Э. М. и др. Способы получения липосомальных гелей, содержащих цитокины для топикального применения. В кн.: Человек и лекарство: Материалы V Российского нац. конгр. М.; 1998. 640.
120. Adler-Moore J. P., Chiang S. M., Satorius A., Guerra D. and McAndrews B. Treatment of murine candidosis and cryptococcosis with a unilamellar liposomal amphotericin В formulation (AmBisome). J. Antimicrob. Chemother 1991; 28: 63-71.
121. Adler-Moore J. and Proffitt R. T. AmBisome: liposomal formulation, structure, mechanism of action and preclinical experience. J. Antimicrob. Chemother 2002; 49:21-30.
122. Almeida J. D., Brand С. M., Edwards D. C. Formation of virosomes frominfluensa subunits and liposomes. The Lancet 1975; 306: 899-901.
123. Ames B. N. Assay of inorganic phosphate and phosphatases. Methods Enzymol 1966; 8: 115-118.
124. Bakker-Woudenberg I. A., Lokerse A. F., Roerdink F., Regts D.and Michel M. F. Free versus liposome-entrapped ampicillin in treatment of infection due to Listeria monocytogenes in normal and athymic nude mice. J. Infect. Dis. 1985; 55:917-924.
125. Backer J. M., Dowidowicz E. A. Transmembrane movement of cholesterol in small unilamellar vesicles detected by cholesterol oxidase. J. Biol. Chem. 1981; 256:586-588.
126. Bangham A. D., Home, R. W. Negative staining of phospholipids and their structural modification by surface active agents as observed in the electron microscope. J. Molec. Biol. 1964; 8 (5): 660 - 668.
127. Bangham A. D., Standish M.M., Watkins J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. J. Mol., Biol. 1965; 13: 238-252.
128. Bangham A.D., Hill M.W., Miller N.G.A. Preparation and use of liposomes as model of biological membranes. Methods Membr. Biol. 1974; 1: 1-78.
129. Barsoum I. S. and Reich M. The effect of liposome entrapped penicillin G on Staphylococcus aureus infection in mice. Pharmacology 1982; 10:358-363.
130. Blok M. C., van der Neut- Kok E. C. M., van Deenen L.L.M. , de Gier J. The effect of chain length and lipid phase transition on the selective permeability properties of liposome. Biochim.et biophis.acta.1975; 406: 187 196.
131. Blum G., Cevc G. Liposomes for the sustained drug release in vivo. Biochim. Biophys. Acta 1990; 1029 (2): 91 97.
132. Bommel E. M. G., Cromelin D. J. A. Stability of doxorubicine liposomeson storange: as an aqueous dispertion, frozen or freeze-dried. Int. J. Pharm. 1984; 22: 299-310.
133. Bonnardiere C. Association of mouse interferon with liposomes. FEBS Letters 1977; 77 (2): 191 -196.
134. Bonventre P. and Gregoriadis G. Killing of intraphagocytic Staphylococcus aureus by dihydro-streptomycin entrapped within liposomes. Antimicrob. Agents Chemother. 1978; 13: 1049-1051.
135. Brendzel A. M., Miller I. F. Effects of lipid soluble substance on the thermotropic properties of liposome filtration. Biochim. et biophys. Acta 1980; 601(2): 260-270.
136. Campbell P. J., Harding G. L., Ryman B. E., Tyrrell D. A. Redistribution and altered excretion of digoxin in rats receiving digoxin antibodies incorporated in liposomes. Eur. J. Biochem. 1980; 109 (1): 87 92.
137. Carlsson A., Sato T., Sunamoto J. Physicochemical stabilization of lipid microspheres by coating with polysaccharide derivatives. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1989; 62:791-796.
138. Chao T. C., Wang W. S., Yen C. C., Chiou T. J., Liu J. H., Chen P. M. A dose escalating pilot study of sterically stabilized, pegylated liposomal doxorubicin (Lipo-Dox) in patients with metastatic breast cancer. Cancer Invest. 2003; 21:' 837-847.
139. Chopra R., Blair S, Strang J., Cervi P., Patterson K. G., Goldstone A. H. Liposomal amphotericin B (AmBisome) in the treatment of fungal infections in neutropenic patients. J. Antimicrob.Chemother. l'99l; 28: 93 104.
140. Cohen B. M. Lecithin in Mania. A Preliminary Report. American Journal of Psychiatry. 1980; 137 (2): 242 243.
141. Crowe L.M., Crowe J. H., Rudolph A.S., Womersley C., Appel L. Preservation of freeze-dried liposomes by trehalose. Arch. Biochem. Biophys. 1985;242:240-247.
142. Crowe L.M., Womersley C., Crowe J.H., Reid D., Appel L., Rudolph A. Prevention of fusion and leakage in freeze-dried liposomes by carbohydrates. Biochim. Biophys. Acta 1986; 861: 131-140.
143. Crowe J.H., McKersie B. D., Crowe L.M. effects of free fatty acids and transition temperature on the stability of dry liposomes. Biochim. Biophys. Acta 1989; 979: 7-10.
144. Crystal R. G. Transfer of genes to humans: early lesions and obstacles to Success. Science 1995; 270: 404 410.
145. Cudd A., Nicolau C. Intracellular fate of liposome encapsulated DNA in mouse liver. Analysis using electron microscope autoradiography and subcellular fractionation. Biochim. Biophys. Acta. 1985; 845: 477 - 491.
146. Daniele B., DeVivo R., Perrone F., Lastoria S., Tambaro R., Izzo F., Fiore F., Vallone P. and Pignata S. Phase-I clinical trial of liposomal daunorubicin in hepatocellular carcinoma complicating liver cirrhosis. Anticancer Res. 2000; 20: 1249-1251.
147. Dapergolas G., Neerunjun E.D., Gregoriadis G.Penetration of target areas in the rat by liposome-associated bleomycin, glucose oxidase and insulin. FEBS Lett. 1976; 63:235-239.
148. Desiderio J. V. and Campbell S. G. Intraphagocytic killing of Salmonelle typhimurium by liposome encapsulated cephalothin . J. Infect. Dis.' 1983; 148: 563 570.
149. Dittmer J. C., Lester R. L. A simple, specific spray for the detection of phospholipids on thin layer chromatograms . J. Lipid Res. 1964; 5: 126 - 127.
150. Egbaria K., Ramachandran C, Kittayanond D., Weiner N. Topical delivery of liposomally encapsulated interferon evaluated by in vitro diffusion studies. Antimicrob. Agents and Chemother. 1990; 34(1): 107 110.
151. Eppstein D. A., Stewart W.E. Altered pharmacological properties of liposome -associated human interferon alpha. J. of Virology 1982; 41 (2): 575 - 582.
152. Eppstein D. A., Marsh J.Y. Partial dissociation of antiviral and antimitogenic activities of murine interferon after its incorporation into liposomes. J. of Interferon research 1983; 3: 161 168.
153. Eppstein D. A. Medical utility of interferons: approaches to increasing therapeutic efficacy. Pharm. Int. 1986; 7 (8): 195 199.
154. Eppstein D. A., Van der Pas M. A., Gloff C. A., Soike K. F. Liposomal interferon p: sustained release treatment of Simian varicella virus infection in monkeys. J. of infectios diseases 1989; 159 (4): 616 - 620.
155. Fielding R. M., Moon McDermott L., Lewis R. O. Bioavailability of a small unilamellar low - clearance liposomal amikacin formulation after extravascular administration. J. Drug Targ. 1999; 6: 415 -426.
156. Feigner P. L., Zangg R. H., Norman J. A. Synthetic recombinant DNA delivery for cancer therapeutics. Cancer Gene Ther. 1995;2:61-65.
157. Fildes F. J. T. In book: Knight C.G. (ed.). Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic applications. Elsevier: North Holland Biomedical Press. Inc., Amsterdam, 1981.
158. Forssen E. A. and Ross M. E. Daunoxome TM treatment of solid tumors: Preclinical and clinical investigations . J. Liposome Res. 1994; 4: 481 512.
159. Forti R.L. et al., Schuffinan S.S., Davies H. A. and Mitchell W. M. Objective antiviral assay of the interferons by computer assisted data collections and analysis. In book: Methods Enzymology (ed. by Pestka S.) 1986; 119: 533 540.
160. Fox J.M. Phosphatidylcholine. Springer: Berlin, 1976.
161. Freise J., Magerstedt P., Schmidt F. W. Die in vivo und in vitro Stabiiitat des Einschlusses von Methotrexat in negative geladenen Liposomen nach Sterilfiltration. Z. Naturforsch 1984; 34 : 114-117.
162. Gallien C.L., Levaillant C.Etude CYR MeV sur la utilisation des faisceaux electrons de hdate energie dans le traitment des caux et des bones. J. TC.770058 C GR MeV Ed. BVC., France, 1977.
163. Gesztes A., MezeiM. Liposomal drug delivery for local anaesthetics. Abstract of the Forty-seventh International Congress of Pharmaceutical Sciences of Federation Inter national Pharmaceutique. Amsterdam, 1987.
164. Glück R. Liposomal Hepatitis A Vaccine and Liposomal Multiantigen Combination Vaccines. Journal of Liposome Research 1995; 5.(3): 467 479.
165. Gómez-Gutiérrez. J., Rodriguez Crespo I., Peterson D. L., Gavilanes F. Antigenicity of hepatitis B surface antigen proteins reconstituted with phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta 1995; 1233 (2): 205 - 212.
166. Goyal P., Goyal K., Kumar S. G. V. et al. Liposomal drug delivery systems Clinical Applications. Acta Pharm. 2005; 55: 1 -25.
167. Gregoriadis G. Targeting of drugs. Nature 1977; 265: 407 -411.
168. Gregoriadis G. Liposomes in therapeutic and preventive medicine: The development of the drugcarrier concept. Ann N.Y, Acad. Sci. 1978; 308: 343-370.
169. Gregoriadis G., Allison C. A. (eds). Liposomes in biological systems. John Wiley and Sons Ltd, New Yore, 1980.
170. Gregoriadis G., Manesis E.K. Liposomes as immunological adjuvants for hepatitis B surface antigens. Liposomes and Immunobiol. Proc. Nat. Symp., Houston, Tex., March 14-15, 1980, New York.
171. Gregoriadis G. (ed.). Liposome Technology. CRC Press, Boca Raton, 1984.
172. Gregoriadis G. (ed.). Liposomes as drug carriers: recent trends and progress. John Wiley and Sons Ltd., New York, 1988.
173. Gregoriadis G. Immunological adjuvants: a role for liposomes. Immunology Today 1990; 11: 89-79.
174. Gregoriadis G. Overview of liposomes. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1991;28:39-48.
175. Gregoriadis G. and Florence A. T. Liposomes and cancer therapy. Journal Cancer Cells 1991; 4: 144 146.
176. Gregoriadis G. The Immunological Adjuvant and Vaccine Carrier Properties of Liposomes. Journal of Drug Targeting 1994; 2 (5): 351 356.
177. Gregoriadis G. Liposome Technology, Volume I: Liposome Preparation and Related Techniques. CRC Press, Boca Raton, 2006.
178. Gruner, S.M. R.P. Lenk, A.S, Janoff A. S. and Ostro M.J. Novel multilayered lipid vesicles: comparison of physical characteristics of multilamellar liposomes and stable plurilamellar vesicles. Biochemistry 1985; 24: 2833 2842.
179. Gurari Rotman D., Lekes P. J. Encapsulation of human fibroblast interferon activity in liposomes. Biochem. biophys. Res. Commun. 1982; 107 (1): 136- 143.
180. Hackett C. J., Taylor P. M., Asconas B. A. Stimulation of cytotoxic T cells by liposomes containing influenza virus or its components. Immunology 1983; 492.: 255-263.
181. Hanschmann H., Lober G. Einigs aspecte der anvendung von liposomen in therapie, immunologic, gentechnik und biotechnologie. Informationsbl. ges. phys. und math. biol. DDR 1989; 3-4: 136 -143.
182. Hauser H. O., Jrons L. The effect of ultrasonication on the chemical and physical properties of aqueous egg yolk lecithin dispersions . Hoppe — Seyler's Ztschr. physiol. Chem.1972; 353: 1579-1590.
183. Heath T. D., Macher B. A., Papahadjopoulos D. Covalent attachment of immunoglobulins to liposomes via glycosphirtgolipids. Biochim. Biophys. Acta 1981; 640: 66-81.
184. Herman E. H., Rahman A., Ferrans V. J., Visk J. A. and Schien P. S. Prevention of chronic doxorubicin cardiotoxicity in beagles by liposome encapsulation. Cancer Res. 1983; 43: 5427-5432.
185. Hernandez J., Estelrich J., Pouplana R. Determination of encapsulation efficiency in liposomes obtained by the «extruder method». J. Microincapsulation 1987; 4 (4): 315-320.
186. Hockertz S., Franke G., Kniep E., Lohmann Matthes M.L. Mouse interferon -gamma in liposomes: pharmacokinetics, organ - distribution and activation of spleen and liver macrophages in vivo. J. of Interferon research 1989; 9(5): 591 -602.
187. Hockertz S., Franke G., Paulini I., Lohmann Matthes M.L. Immunotherapy of murine recombinant interferon - gamma and MTP -PE encapsulated in liposomes. J. of Interferon research 1991; 11: 177- 185.
188. Huang. C. H. Studies on phosphatidylcholine vesicles: Formation and physical characteristics. Biochemistry 1969; 8: 344 352.
189. Ishida T., Kirchmeier M. J., Moase E. H., Zalipsky S. and Allen T. M. Targeted delivery and triggered release of liposomal doxorubicin enhances cytotoxicity against human B lymphoma cells. Biochim. Biophys. Acta 2001;1515: 144 158.
190. Ishiwata H., Suzuki N., Ando S., Kikuchi H. and Kitagawa T. Characteristics and biodistribution of cationic liposomes and their DNA complexes. J. Contr. Rel. 2000; 69: 139 148.
191. Jain M.K., Zakim D. The spontaneous incorporation of proteins into preformed bilayers. Biochim. Biophys. Acta 1987; 906(1): 33 68.
192. Jizomoto H., Kanaoka E Hirano K. Encapsulation of drugs in Iyophilized, empty dipalmitoylphosphatidylcholine liposomes. Chem. and Pharm. Bull. 1989; 37 (7): 1895 1898.
193. Juliano B.L., Stamp D. The effect of particle size and change on the clearance rates of liposomes and liposome encapsulated drugs . Biochem. Biophys. Res. Com.1975; 63: 651-658.
194. Kantor H. L. , Prestegard J. H. Fusion of phosphatidylcholine bilayer vesicles. Role of free fatty acids. Biochemistry 1978; 17: 3592-3597.
195. Kato K., Yoshida J., Kageyama N. et al. Liposome entrapped human interferon -J3. Inst, pharmacokinetics and antitumor activity against human Brain tumor cells. J.Clin. Biochem. and Nutr.1988; 4(2): 139-147.
196. Kidd PM. Phosphatidylcholine, a superior protectant against liver damage. Alternative Medicine Review 1996; 4: 258 274.
197. Kidd PM. Phosphatidylcholine: Monograph. Alternative Medicine Review 2002; 7(2): 150- 154.
198. Kim S., Martin G. Preparation of cell site unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochim. Biophys. Acta 1981; 646:1-9.
199. Kim S., Turker M. S., Chi E. Y., Sela S. and Mai G. M. Preparation of multivesicular liposome. Biochim. Biophys. Acta 1983; 728: 339 348.
200. Kim A., Lee E. H., Choi S. H. and Kim C. K. In vitro and in vivo transfection efficiency of a novel ultradeformable cationic liposome. Biomaterials 2004; 25:305.313.
201. Klibanov A. L., Maruyama K., Torchilin V.P., Huang L. Amphipathic polyethylene glycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 1990; 268: 235-237.
202. Knepp V. M., Szoka C. Z., Guy R. H. Controlled drug release from a novel liposomal delivery system. II. Transdermal delivery characteristics. J. of Controlled Release 1990; 12:25-30.
203. Knight C.G. (ed.). Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Applications. Elsevier: North Holland Biomedical Press. Inc., Amsterdam, 1981.
204. Komatsu H., Higaki K., Okamoto H. et al. Preservative activity and in vivo percutaneous penetration of butylparaben entrapped in liposomes. Chem. Pharm. Bull. 1986; 34(8): 3415-3422.
205. Kotwani R. N„ Bodhe P. V., Kirodian B. G., Mehta K. P., Ali U. S. and Kshirsagar N. A. Treatment of neonatal candidiasis with liposomal amphotericin B (L-AMP-LRC-1): phase II study. Indian Pediatr. 2003; 40: 545 550.
206. Koff W. C., Fidler I. J. The potential use of liposome mediated antiviral therapy. Antiviral Res. 1985; 5 (3): 179- 190.
207. Koff W. C., Fidler I. J., Showalter S. D., et al. Human monocytes activated by immunomodulators in liposomes lyse gerpes virus infected but not normal cells. Science 1985; 224: 1007- 1009.
208. Koff W. C., Fidler W. E., Gutterman J., Fidler I. J. Efficient activation of human blood monocytes to a tumoricidal state by liposomes containing human recombinant gamma interferon. Cancer Immunol. Immunother. 1985; 19: 85 - 89.
209. Kruijff B. D., Morris G. A. , Cullis P.R. Application of 3IP-NMR saturation transfer technigues to investigade phospholipids motion and organization in model and biological membranes . Biochim. et biophys. Acta. 1980; 1(598): 206-211.
210. Levaillant C., Gallien C.L. Sanitation methods using high energy electron beams.
211. Radiât. Phys. Chem. 1978; 14: 309 310.
212. MacDonald R.I. Action of detergents on membranes: differences between lipid exracted from red cell ghosts and from red cell lipid vesicles by Triton X-100.
213. Biochemistry 1980; 19 (9): 1916 -1922.
214. Madden T. D., Peel W. E., Quinn P. J., Chapman D. The modulation of membrane fluidity by hydrogénation processes. Biochem. and Biophys. Meth.1980; 2 (1-2): 19 27.
215. Madden. T. D., Bally M. B., Hope M. J. et al. Protection of large unilamellar vesicles by trehalose during dehydration: retention of vesicle contents. Biochim.et biophys. Acta 1985; 817: 67 74.
216. Madden. T. D., Harrigan, R., Tai, L. et al. The accumulation of drugs within largeunilamellar vesicles exhibiting a proton gradient: a survey. Chem. Phys. Lipids. 1990; 53:37-43.
217. Magin R. L., Morse P.D. Rapid measurement of drug release from temperature-sensitive liposomes by electron paramagnetic resonance and radioisotope techniques. Biochim. et biophys. Acta. 1983; 3(760): 357 362.
218. Manesis E. K., Cameron C. H., Gregoriadis G. Hepatitis B surface antigen-containing liposomes enhance humoral and cell mediated immunity to the antigen. FEBS Letters 1979; 102 (1): 107 - 111.
219. Mahato. R. I., Rolland A. and Tomlinson E. Cationic lipid based gene delivery systems: Pharmaceutical perspectives. Pharm. Res. 1997; 14: 853 - 859.
220. Manosroi A., Bauer K. H. The entrapment of a human insulin DEAE dextran complex in different compound liposomes. Drug Dev. and Ind. Pharm. 1989; 15(14-16): 2531-2546.
221. Markwell M. A. K., Fox C. F. Surfase specific iodination of membrane proteins of viruses and eucariotic cells using 1,3, 4, 6-3,6 - diphenylglycoluril.
222. Biochemistry 1978; 17: 4807 4817.
223. Maruyama K., Ishida O., Takizawa T., Moribe K. Possibility of active targeting to tumor tissues with liposomes. Adv. Drug Del. Rev. 1999; 40: 89-102.
224. Matei L., Trif M., Motas C. Lipozomes as immunological adjuvants for lysozame, intragastrically administered into rabbits, serum immunity potentiating. Rev. Roum. biochim.1986; 23(3): 203-209.
225. Mayer L.D., Hope M.J., Cullis P.R.,Janoff A.S. Solute distributions and trapping efficiencies observed in freeze-thawed multilamellar vesicles. Biochim. Biophys. Acta 1985; 817: 193-196.
226. Mayer L.D., Hope M.J., Cullis P.R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta 1986; 858: 161-168.
227. Mellors J. W., Debs R. J., Ryan J. L. Incorporation of recombinant gamma interferon into liposomes enhances its ability to induce peritoneal macrophage antitoxoplasma activity. Infec. and Immun. 1989; 57 (1): 132 137.
228. Meunier F., Prentice H. G. and Ringden O.Liposomal amphotericin B (AmBisome): safety data form and phase- II/III clinical trial. J. Antimicrob. Chemother. 1991; 28: 83-91.
229. Mezei M, Gulasekharam V. Liposomes: a selective drug delivery system for the topical route of administration — gel dosage form. J. Pharm. Pharmacol. 1982;34: 473-474.
230. Milsman M. H. W., Schwendener R. A., Weder H. G. The preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochim. Biophys. Acta 512: 147 -155.
231. Morrison W. R. A fast, simple, and reliable method for themicrodetermination of phosphorus in biological materials. Anal. Biochem. 1964; 7:218-224.
232. Muggia F. M., Hainsworth J. D., Jeffers S. et al. Phase II study of liposomal doxorubicin in refractory ovarian cancer: antitumor activity and toxicity modification by liposomal encapsulation. Journal of Clinical Oncology 1997; 15: 987-993.
233. Murphy T. J., Shamoo A.E. Reconstitution of Ca 2+ Mg2+- ATPase in giant vesicles. Biophys. J. 1978; 21: 27 - 30.
234. Newman G. C., Huang C. Structure studies of phosphatidylcholine cholesterol mixed vesicles. Biochemistry 1975; 14: 3363-3370.
235. Oku N., MacDonald R. C. Formation of giant liposomes from lipids in chaotropic ion solutions. Biochim. et biophys. Acta 1983; 734 (1): 51 -61.
236. Olson F., Hunt C. A., Szoka F. C. et al. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochim. et biophys. Acta 1979; 557(1): 9-23.
237. Olson. F., Mayhew E., Maslow D., Rustum Y. and Szoka F. Characterization, toxicity and therapeutic efficacy of adriamycin encapsulated in liposomes. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1982; 18: 167 176.
238. Ostro M. J. (ed.). Liposomes. Marcel Dekker, New York Basel, 1983.
239. Papahadjopoulos D., Miller N. D. Phospholipid Model Membranes. I. Structural Characteristics of Hydrated Liquid Crystals. Biochim. Biophys. Acta. 1967; 135: 624-638.
240. Papahadjopouluos D., Allen T. M., Gabizon A., et al. Sterically stabilized liposomes: improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88: 1460 1464.
241. Partearroyo M., Urbaneja M., Gony F. Effective detergentMipid ratios in the solubilization of phosphatidylcholine vesicles by Triton X -100. FEBS 1992; 302 (2): 138-140.
242. Patel N. M., Ryman B. E. Orally administrated liposomally entrapped insulin. Biochem. Soc. Trans. 1977; 5(6): 1739-1741.
243. Pea F., Russo D., Michieli M., Baraldo M., Ermacora A., Damiani D., Baccarani M. and Furlanut M. Liposomal daunorubicin plasmatic and renaldisposition in patients with acute leukemia. Cancer Chemother. Pharmacol. 2000; 46: 279-286.
244. Pecar S. Liposomi v elektronski paramagnetni spektroskopiji. Farm.vestn 1980; 3(31): 237 -239.
245. Pedroso de Lima M. C., Neves S., Filipe A., Duzgunes N. and Simoes S. Cationic liposomes for gene delivery: from biophysics to biological applications. Curr. Med. Chem. 2003; 10: 1221 1231.
246. Pestka S (ed.) Methods of Enzymology; 78: Pt. A. Academic Press, New York, USA, 1981.
247. Pestka S (ed.) Methods of Enzymology; 119: Pt.C. Academic Press, New York, USA, 1986.
248. Pick U. Liposomes with a large trapping capability prepared by freezing. Arch. Biochem. andBiophys. 1981; 212: 186 -194.
249. Ponpipom M. M., Bugianesi R. L. Isolation of 1,3 distearoyl - glycero -2-phosphocholine (P-lecithin) from commercial l,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Lipid Res. 1980; 21: 136-139.
250. Poste G., Kirsh R., Bugelshi P. Liposomes as a drug delivery system in cancer therapy. In book: Novel Approaches to cancer Chemotherapy. Sunkara P. (ed.). Academic Press, New York, 1984.
251. Powers J. D., Kilpatrick P. K., Carbonell R. G. Tripsin purification by affinity binding to small unilamellar liposomes. Biotechnol. and Bioeng. 1990; 36(5): 506-519.
252. Proffitt R. T., Satorius A., Chiang S. M., Sullivan L. and Adler Moore J. P. Pharmacology and toxicology of a liposomal formulation of amphotericin B (AmBisome) in rodents. J. Antimicrob. Chemother. 1991; 28: 49 - 61.
253. Qiu J., Wei X., Geng F., Liu R., Zhang J., Xu Y. Multivesicular liposome formulations for the sustained delivery of interferon aji&4>a-2b. Acta Pharmacologica Sinica 2005; 26: 1395-1401.
254. Ratz H., Fraise J., Magerstedt P. et al. Sterilization of contrast media containing liposomes by ethylene oxide.J. Microencapsul 1989; 4 (6): 485 492.
255. Ringden O. Ten years experience with liposomal amphotericin B in transplant recipients at Huddinge University Hospital. J. Antimicrob. Chemother. 2002;266.267.268.269.270,271,272273,27427527627727827949: 51-55.
256. Samuel C. E. Antiviral actions of interferons. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14 (4): 778 809.
257. Shaw N. The detection of lipids on thin layer chromatograms with the periodate- Schiff reagents. Biochim. Biophys. Acta 1968; 164(2): 435 436.
258. Shek P.N. Applications of liposomes in immunopotentiation.1.munotoxicology, NATO ASI Series 1984; G2: 103-125.
259. Shek P.N., Barber R. F. Liposomes are effective carriers for the ocular deliveryof prophylactics. Biochim. Biophys. Acta 1987; 902: 229-236.
260. Shew R. L., Deamer D. W. A novel method for encapsulation of macromoleculesin liposomes. Biochim. Biophys. Acta 1985; 816; 1-8.
261. Smith G. L., Symons A.J., Alcami A. Poxviruses: interfering with interferon. Semin. Virol. 1998; 8: 409-418.
262. Smith G., Olliff CJ. Differential thermal analysis as-a-means of investigating the interactions of ciyoprotectants with liposomes. J. Anal. Atom. Spectrom. 1989; 4 (8): 139 142.
263. Stewart J.C.M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrocyanate. Anal. Biochem. 1980; 104: 10-14.
264. Stozek T., Krowczynski L. Badanie wplywu zamkniecia triamcinolonu wliposomach na resorpcie przez skore. Farm. pol. 1983; 39(11): 651 656.
265. Szoka F., Papahadjopouios. D. Comparative properties and methods o^ preparation of lipid vesicles (liposomes). Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1980; -467 508.
266. Tang Hui-xian, Ala Shi-rong, Yen Chong sheng, Zhao Nan-ming. Liposom<^ mediated delivery of calcein into suspention protoplast. Acta boil. exp. sin. 198^. 3(21):285-293.
267. Torchilin V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carrierfg Nature Reviews Drug Discovery 2005; 4: 145 160.
268. Turner A., Kirby C., Senior J. et al. Fate of cholesterol rich liposomes subcutaneous injection into rats. Biochim. et biophys. Acta 1983; 760 (1): H 125.
269. Vaage J., Donovan D., Uster P. and Working P. Tumor uptake doxorubicin in polyethylene glycol coated liposomes and therapeutic ef^ect against a xenografted human pancreatic carcinoma. British Journal of Caxxcer 1997; 75:482-486.
270. Van Hoesel Q. G. C. M., Steerenberg P. A., Crommelin D. J. A. et al. Red-uced cardiotoxicity and nephrotoxicity with preservation of antitumor activity Qf doxorubicin entrapped in stable liposomes in the LOU/M Wsl rat. Cancer 1984; 44: 3698-3705.
271. Watts A., Marsh D., Knowles P. E. Characterization dymiristoylphosphatidylcholin vesicles and their dimensional changes through the phase transition: molecular control of membrane morphology. Biochemistry 1978; 17: 1792-1801.
272. Weiner N. N., Williams G., Birch C et al. Topical delivery of liposomally encapsulated interferon evaluated in a cutaneous herpes guinea pig model. Antimicrob. Agents Cemother. 1989; 33: 1217 1221.
273. Weinstein J. N., Leserman L. D. Liposomes as drug carriers in cancer chemotherapy.Pharmacol. Ther. 1984; 2(24): 207 233.
274. Wertz P., Abraham W., Landmann L., Downing D. Preparation of liposomes from stratum corneus lipids. J. Invest. Dermatol. 1986; 87: 582 584.
275. Wohlrab W., Lasch J. Penetration kinetics of liposomal hydrocortisone in human skin. Dermatologica 1987; 174: 18-22.
276. Wollina U., Hohaus K., Schonlebe J., Haroske E.and Kostler E. Liposomal daunorubicin in tumor stage cutaneous T cell lymphoma: report of three cases. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2003; 12: 65 - 69.
277. Worth H. G. J., Wright. D. Colorimetric determination of phospholipids by use of molybdophosphate and its application to amniotic fluid. J. Clin.Chem.1977; 23:1995 2000.
278. Yagi K. Lipid peroxidation. Assay for blood plasma and serum. Methods Enzymol. 1984; 105: 328 333.
279. Yanagihara K. Design of anti-bacterial drug and anti-mycobacterial drug for drug delivery system. Curr. Pharm. Des. 2002; 8: 475 482.
280. Zlatkis, A., Zak, B. and Boyle, A.J. A new method for the direct determination of serum cholesterol. J. Lab. Clin. Med. 1953; 41: 486 492.
281. Zou Y., Zong G., Ling Y. H. and Perez Soler R. Development of cationic liposome formulations for intratracheal gene therapy of early lung cancer. Cancer Gene Ther. 2000; 7: 683 - 696.
282. Zumbuhel O., Weder H.G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid / detergent mixed micelles. Biochim. Biophys. Acta 1981; 640: 252 262.
-
Золин, Владимир Викторович
-
кандидата медицинских наук
-
Кольцово, 2010
-
ВАК 03.02.02
- Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2В интерферона человека: получение и свойства
- Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2b интерферона человека: получение и свойства
- Гамма-интерферон человека: его получение, физико-химические и биологические характеристики
- Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a
- ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ БАЦИЛЛ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ НОВЫХ БИОПРЕПАРАТОВ
