Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2В интерферона человека: получение и свойства

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Липосомальный противовирусный препарат рекомбинантного альфа-2В интерферона человека: получение и свойства"

Золин Владимир Викторович

ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА -2В ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

- з ИЮН 2010

Кольцове-2010

004604651

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор медицинских наук Ставский Евгений Александрович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич доктор медицинских наук, профессор Трунов Александр Николаевич

Ведшая организация

НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск.

диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 630559; тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан _ _2010 г.

Защита состоится

часов на заседании

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Карпенко Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Отечественный рекомбинантный альфа-2Ь (далее альфа-2) интерферон человека (Реаферон) обладает антивирусной, антипролиферативной, иммуномодулирующей активностью [Рафальский В. В., 1997; Ершов Ф. И., 2005]. Являясь белком, Реаферон разрушается в желудочно-кишечном тракте, поэтому основным способом его использования в клинической практике являются инъекции, а также местное или ректальное применение [Ершов Ф. И., 2006; Малиновская В. В., 2006]. Рекомбинантный альфа - 2 интерферон (ИНФ) в виде раствора для инъекций широко применяется в комплексной терапии вирусных и онкологических заболеваний человека, а именно - при острых и хронических вирусных гепатитах В, С, D, гриппе и других ОРВИ (адено-, рино-, корона- и др), вирусных конъюнктивитах, раке почки, волосато-клеточном лейкозе, лимфомах кожи, плоскоклеточном раке кожи, рассеянном склерозе, СПИДе, цитомегаловирусных инфекциях и многих других болезнях [Smith G. L. et al., 1998; Sen G. С., 2001; Samuel С. E., 2001; Lenschow D. J. et al., 2007; Ершов Ф. И. и др. 2007]. Однако клиническое использование рекомбинантного интерферона создаёт и некоторые проблемы. Так, для достижения терапевтического эффекта при лечении большинства патологий, при которых показано применение препаратов интерферона (ИНФ), рекомендовано применять мегадозы препарата до 6 млн ME в сутки и выше [Маркарян А. С. и др., 1998]. Например, наиболее оптимальной дозой альфа-2 интерферона при лечении хронического вирусного гепатита В, считается 3,0 -5,0 млн ME внутримышечно три раза в неделю («золотой стандарт») в течение шести месяцев. При этом некоторые авторы рекомендуют более высокие дозы ИФН - до 10 млн ME в сутки ежедневно или через день в течение 4-6 месяцев, а при суперинфекции гепатита D до 12 месяцев [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И., 2006]. Использование таких дозировок помимо краткосрочных пирогенных реакций, таких как озноб, повышение температуры, преходящих утомляемости, кожных высыпаний, зуда, лейко- и тромбоцитопении, способствует проявлению более серьёзных побочных эффектов, таких как появление нервно-психических расстройств (возбуждение, нарушения сна, раздражительность, или, наоборот, вялость, апатия, депрессия), временное выпадение волос [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И. и др., 2005]. При обкалывании очага поражения возможно развитие местной воспалительной реакции [Ершов Ф.И., 2006]. Необходимость внутримышечного инъецирования делает проблематичным применение препарата у детей младшего возраста, а в некоторых случаях его применить невозможно, например, у пациентов с сахарным диабетом из-за большого числа осложнений. Кроме того, при проведении инъекций возможно инфицирование пациента (ВИЧ, гепатиты), наличие в составе препарата донорского альбумина потенциально увеличивает этот риск [Чуйкова В. И. и др., 2008].Несмотря на очевидные недостатки, свойственные инъекционной лекарственной форме, альтернативы рекомбинантному альфа-

2 интерферону при лечении ряда вирусных заболеваний в настоящее время не существует (хронические вирусные гепатиты [Блохина Н. П., 1998; Змызгова А. В.,1999], острые респираторные заболевания, вирусные заболевания респираторного тракта [Лобзин Ю.В. и др., 2004]). Однако применение Реаферона в терапии вирусных заболеваний респираторного тракта, особенно с профилактической целью, помимо побочного действия, сопутствующего парентеральному пути введения препарата, объективно сдерживается необходимостью проведения многократных внутримышечных инъекций [Маркарян А. С. и др., 1998; Лобзин Ю.В. и др., 2004].

В ряде случаев, например при лечении вирусных и онкологических заболеваний кожи и слизистых оболочек человека, целесообразно местное (наружное) применение интерферона [Клявина Е. А., 1991; Майданюк С.А. и др., 2000; Попов В. Ф„ 2002; Ершов Ф. И., 2006].

Также известны композиции для ректального введения препаратов интерферона, в частности, рекомбинанггный альфа-2 интерферон в свечах (виферон) [Чистова Л. В. и др., 1993; В. В. Малиновская, 2003]. Однако при ректальном введении интерферона трудно обеспечить точное дозирование препарата ввиду частичных пЬтерь либо жидкости, либо свечной массы, остающейся на руках или приспособлениях для введения.

В связи с вышеизложенными фактами, становится очевидной необходимость разработки новых современных лекарственных форм, которые не имели бы указанных выше недостатков, а также позволили бы их применять для ещё не используемых способов введения интерферона в организм, например перорального.

Одним из перспективных направлений снижения системной токсичности, повышения биодоступности и, как следствие, увеличения терапевтической эффективности лекарств, в современной

нанобиотехиологии является создание их липосомальных форм [Швец В. И., 2008]. Липосомы при этом используются как биосовместимые и биодеградируемые наносистемы доставки, оптимизирующие действие лекарств. Размеры липосом, обычно используемых в качестве переносчиков лекарств, составляют от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров, то есть находятся в нанодиапазоне, что наряду с их биологическимим свойствами обеспечивает их эффективность как систем доставки [Каплун А. П., 2007]. Липосомы изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их терапевтическую эффективность р^оп'асКБ е1 а1, 1983; Марголис Л. Б„ Бергельсон Л. Д., 1986].

На сегодняшний день именно липосомы из всех наночастиц наиболее широко применяются в качестве средств доставки лекарств в клинической практике, ряд; липосомальных препаратов лицензирован и производится в промышленных масштабах [Ооуа1 Р. е1 а1, 2005; ТогсЬШп V. Р., 2005]. Наиболее значимое применение липосомальные препараты получили в химиотерапии! опухолевых заболеваний, лечении глубоких микозов, вакцинологии,; офтальмологии, пульмонологии и при лечении некоторых других патологических состояний [Ооуа1 Р. й а], 2005; Швец В. И., 2008].

Таким образом, потребность практического здравоохранения в инновационных лекарственных' формах ИНФ, лишённых недостатков, свойственных традиционным лекарственным формам препарата, очевидна. Учитывая уникальные свойства липосом как носителей лекарств, одним из перспективных подходов к решению этой проблемы является создание липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона (ЛФИ), нацеленной на проведение интерферонотерапии без инъекций и сопутствующих им нежелательных побочных эффектов. Бесспорная важность этой задачи для отечественной клинической практики явилась актуальным основанием для проведения данной исследовательской работы.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы является разработка технологии производства, методов контроля качества и экспериментальное изучение in vitro и in vivo свойств новой липосомальной лекарственной формы человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона. В связи с этим задачами исследования являлись:

1. Разработка и экспериментальное обоснование основных стадий технологии получения липосомального ИНФ.

- оценка эффективности включения интерферона в липосомы, полученные различными способами;

определение биологической активности образцов липосомального интерферона, полученных разными методами;

- выбор на основе экспериментальных данных способа получения липосомального интерферона и оптимального состава липосомального препарата рекомбинантного альфа - 2 интерферона человека;

2. Оценка физико - химических свойств и стабильности образцов липосомального ИНФ в процессе хранения.

3. Разработка физико - химических и биологических методов контроля качества препарата.

4. Оценка противовирусных свойств липосомального интерферона in vitro и in vivo.

5. Разработка необходимого комплекта нормативно - технической документации (ФСП, РП, инструкция по применению) на готовый лекарственный препарат и его Государственная регистрация в Российской Федерации.

Научная новизна работы.

1. Впервые разработана технология промышленного производства новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека для перорального и наружного применения:

- впервые проведена сравнительная экспериментальная оценка влияния условий получения липосомального ИНФ различными методами на его биологическую (противовирусную) активность.

- исследована эффективность включения рекомбинантного альфа-2Ь интерферона в липосомы, полученные различными методами.

- теоретически и экспериментально обоснован выбор способа получения и оптимальный состав липосомального препарата ИНФ человека

i 1

для применения в медицинской практике.

2. Разработаны физико-химические и биологические методы контроля качества липосомального препарата ИНФ.

3. Изучена in vitro стабильность образцов липосомального ИНФ в процессе получения и хранения препарата.

4. Впервые показана безвредность липосомалыюй формы ИНФ при наружном и пероральном применении препарата in vivo.

5. Продемонстрирована эффективность липосомалыюй формы ИНФ при наружном применении препарата для лечения генитального герпеса экспериментальных животных.

6. Впервые показано, что интерферон, иммобилизованный в липосомы, сохраняет биологическую (противовирусную) активность в условиях, моделирующих физиологическое окружение ЖКТ человека.

7. Впервые подтверждено, что липосомальный ИНФ при наружном и пероральном применении способен преодолевать соответственно кожный и гастроинтестинальный барьеры организма и проникать в кровеносное русло экспериментальных животных, проявляя свойственную ему биологическую активность, а затем полностью элеминироваться из организма экспериментальных животных с помощью естественных ферментативных систем.

Практическая ценность работы. Результатом диссертационной работы является разработанная промышленная технология получения новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, проявляющей терапевтическую эффективность при пероральном и наружном применении, отвечающей всем требованиям Государственной Фармакопеи РФ. Разработан необходимый комплект НТД на препарат (ФСП, РП, инструкция по применению), проведены доклинические и клинические испытания липосомального интерферона.

Результаты работы защищены Патентом РФ № 2123328 «Противовирусное лекарственное средство для перорального применения».

На предприятии ЗАО «Вектор-Медика» наукограда Кольцово, при методическом руководстве автора налажен серийный промышленный выпуск нового лекарственного препарата - липосомального рекомбинантного интерферона альфа-2Ь - первого в отечественной клинической практике препарата интерферона для перорального применения. Впервые препарат был зарегистрирован в Российской Федерации под торговым названием «Липинт» 28.03.2001 года, регистрационное удостоверение Р № 000344/012001, затем переригистрирован как «Реаферон - ЕС - Липинт», регистрационное удостоверение Р № 000821/01 - 2001 от 16.11.2001. В настоящее время в медицинской практике препарат применяется в комплексной терапии больных острым и хроническим гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, а также хроническим гепатитом В, осложненным гломерулонефритом, в лечении больных атонической бронхиальной астмой, для проведения специфической иммунотерапии при аллергическом риноконъюнктивите, при профилактике

и лечении гриппа и ОРЗ у взрослых и детей, в комплексной терапии урогенитальной хламидийной инфекции у взрослых. Спектр терапевтического применения препарата «Реаферон-ЕС - Липинт» постоянно расширяется, продолжающиеся клинические испытания выявляют все новые нозологические формы заболеваний, в лечении и профилактике которых он эффективен.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новая липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека, производимая по разработанной технологии, лишена побочных эффектов, свойственных инъекционной лекарственной форме и обладает широким спектром терапевтического применения в качестве противовирусного препарата.

2. Липосомальная лекарственная форма ИНФ позволила доставлять интерферон в макроорганизм пероральным способом с сохранением его специфической активности.

3. Липосомы, содержащие иммобилизованный в их внутреннюю полость ИНФ, предохраняют белок от деградации в желудочно-кишечном тракте макроорганизма, способствуют попаданию цитокина в кровоток и пролонгируют его терапевтическое действие, по сравнению с лекарственной формой интерферона, предназначенной для парентерального введения.

4. Система контроля физико-химических и биологических свойств липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, применяющаяся на технологических стадиях её производства, позволяет выпускать лекарственный препарат в полном соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи Российской Федерации.

Апробация материалов диссертации. Материалы основных разделов диссертации были представлены на отечественных и зарубежных конференциях: I съезд иммунологов России 23.06 - 25.06 1992 г., Новосибирск, Россия; V конференция РФ «Новые направления биотехнологии» 18.05 - 22.05 1992 г., Пущино, Россия; Н-я научно -практическая конференция по генно - инженерным цитокинам 10.12 -11.12 1992 г., Оболенск, Россия; Научная конференция для врачей практиков «Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2» 25.01 - 29.01 1993 г., Кольцово, Россия; VII International symposium on viral hepatitis 25.01 -27.01 1996 г., Madrid, Spain; I конгресс педиатров - нефрологов России 17.09 -19.09 1996 г., С. Петербург, Россия; VIII конференция «Новые направления биотехнологии» 27.04 - 29.04 1998 г., Москва, Россия; Научная конференция для врачей практиков «Хорошая клиническая практика - опыт 15-летней работы службы профилактики СПИД в Хабаровском крае» 9.08 -10.08 2004 г., Хабаровск, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи из них 3 - в журнале Вестник РАМН (1993; 1999; 2001) и 1 - в журнале Российский вестник перинатолопш и педиатрии (1998). По результатам работы получен патент РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах, содержит 27 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает в себя 300 источников, из них 175 иностранных.

Вклад автора в диссертационную работу. Вклад автора в представленный материал диссертации заключается в личном участии во всех экспериментальных и теоретических исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. Основные экспериментальные результаты получены в соавторстве с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» В. В. Бирюковой, О. А. Агафоновой, А. А. Колокольцовым,

A. Е. Нестеровым, Е. Д. Даниленко, Е. И. Рябчиковой, В. И. Масычевой, Н. А. Антоновым в рамках научных тем, выполнявшихся в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», ряд научных исследований выполнен в соавторстве с сотрудниками Кардиологического научного центра РАМН

B. П. Торчилиным, А. Н. Лукьяновым, Ю. Н. Барановым, постановка препарата на серийное производство в ЗАО «Вектор - Медика» осуществлена в сотрудничестве с Н. Б. Бажутиным, А. В. Войтенко. Анализ материалов и оформление работы произведены под руководством Е. А. Ставского. Всем коллегам, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность.

I МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

i Материалы

Культуры клеток. Определение противовирусной активности ЛФИ биологическим методом (по цитопатическому действию вируса - ЦПД), а также содержание ИНФ и мышиного интерферона в сыворотках крови и органах экспериментальных животных, проводили с использованием в качестве чувствительных культур клеток диплоидной линии клеток (фибробластов) легкого эмбриона человека Л-68 и диплоидной линии клеток (фибробластов) легкого эмбриона мыши L-929 из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Культуральные среды, реактивы, используемые при этом соответствовали таковым, указанным в литературе [Сгавский Е. и др., 2007].

Вирусы', Для титрования интерферона в культуре клеток использовали в качестве тест - микроорганизма (индикаторного вируса) - вирусы энцефаломиокардита мышей (ЕМС) или везикулярного стоматита по ОСО 42 - 28 -, 158 - 88, полученные из ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Для определения противогерпетической активности ЛФИ in vivo был использован вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS), полученный из Государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ¡РАМН. Перед использованием в эксперименте штамм прошел два последовательных пассажа на культуре клеток Vero Е6, инфекционный титр вируса составил 106 ЦПД.

Животйые. Исследование биологических свойств ЛФИ проводили на конвенциональных самцах белых мышей ICR, крыс линии Wistar, морских

свинок, полученных из питомника ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Все манипуляции с животными проводили в соответствии с действующими «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755).

Интерферон. Липосомальный ИНФ получали с использованием субстанции человеческого рекомбинантного альфа-2Ь интерферона, полученной на основе штамма - продуцента E.coli SG 20050 pIF 16 производства ЗАО «Вектор-Медика», с концентрацией белка 0,12 мг/мл и противовирусной активностью 4,0 • 107 МЕ/мл.

Методы

Липосомы с ИНФ готовили из смеси ФХ и Хол (7:3, по молям) методами механического встряхивания (МЛ), «обращения фаз» (БОЛ), ультразвукового диспергирования (МОЛ), замораживания — оттаивания (МОЛ), дегидратации — регидратации (МЛ) в сочетании с экструзией липосом через поликарбонатные мембраны [Szoka F., 1980].

Для изучения степени захвата ИНФ липосомами, полученными разными способами, использовали интерферон, меченный с помощью «йодогена» [125I] [Markwell M. А. К., Fox С. F., 1978], добавляя его к основному объёму белка в соотношении 10 : 1 (v/v). Для флуоресцентного мечения липосом использовали флуоресцентный липидный зонд Rig («Molecular probes», США). Для определения потерь липида при проведении процедуры экструзии липосом через поликарбонатные мембраны использовали введение в липидную фазу холестерина меченого 14С из расчёта 106 распадов (1цКюри) на каждую исследуемую пробу. Для отделения ИНФ, невключенного в липосомы, использовали методы колоночной гель-фильтрации на сефарозе CL-6B [Huang С. Н., 1969], ультрацентрифугирования [Waits A., et al., 1978; Кузякова Л. М. и др., 2000] и метод флотации в градиенте плотности фиколла [Heath T. D., 1981]. Степень включения ИНФ в липосомы определяли методом флотации липосом с использованием ступенчатого градиента плотности фиколла. Процент включения ИНФ в липосомы рассчитывали по соотношению активностей липосомальной фракции и исходного препарата [ФСП 42 - 0140 -0371 -00, ЗАО «Вектор-Медика», 2001].

Время растворения липосомального препарата определяли визуально, рН определяли в суспензии потенциометрически (ГФ XI, вып. I, с.113). Потерю в массе при высушивании определяли согласно ГФ XI, вып. I, с. 176. Условия анализа по МУК 4.1/4.2.588-96, п.43, с. 116. Определение точности розлива в лиофилизированном препарате проводили весовым методом по МУК 4.1/4.2.588-96, п.44.1, с.117. Среднюю массу и отклонение от средней массы определяли согласно ГФ XI, вып. 2, с. 142.

Количество ФХ, содержащегося в образце, определяли по входящему в состав лецитина фосфору. Определение фосфора проводили по МУК 4.1/4.2.588 - 96, п. 21, с. 77. Количество Хол, содержащегося в образце, определяли по методу Златкис - Зака [Zlatkis A., et al., 1953]. Определение

продуктов перекисного окисления липидов проводили двумя методами: по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Yagi К., 1984] и используя спектрофотометрический метод определения индекса окисленности липидов (ИОЛ) [Кейтс М., 1975].

Стерилизацию липосом проводили в асептических условиях в специально оборудованном помещении с помощью фильтрации через ядерные мембраны на основе полиэтилентерефталатной плёнки с диаметром пор 0,1 мкм. Предварительно проводили «пузырьковую» пробу, заключающуюся в проверке целостности мембран, при помощи сжатого инертного газа (аргон высокой чистоты по ГОСТ 10157 -79, давление 1,0 атм). Стерильность препаратов липосомального ИНФ определяли в соответствии с ГФ XI, вып. 2, с. 187 методом прямого посева на тиогликолевую среду по ТУ 42.14.161-79 и жидкую среду Сабуро. Микробиологическую чистоту ЛФИ определяли в соответствии с ГФ XI, вып. 2, с. 196 -200 и Изменением №1,1996г.

Лиофилизацию препарата осуществляли в соответствии с разработанным Регламентом производства № 1194 -02 [архив ЗАО «Вектор - Медика», 2001]. Далее флаконы с препаратом укупоривали на закаточном автомате. Герметичность упаковки флаконов контролировали методом погружения в ёмкость с интенсивно окрашенным раствором метиленового синего при избыточном давлении над ним (80 - 120 кПа), в течение 10 - 15 минут.

Специфическую (противовирусную) активность липосомального интерферона определяли в соответствии с разработанной нами ФСП 42 -0140 - 0371 - 00 [архив ЗАО «Вектор - Медика», 2001].

Стабильность липосомального интерферона в условиях, моделирующих воздействие физиологических факторов желудочно -кишечного тракта человека (ЖКТ) изучали либо раздельно, либо последовательно инкубируя ЛФИ разные промежутки времени с растворами натурального желудочного сока, содержащим все ферменты с конечным разведением в 1000, 100, 10 раз и неразведённым препаратом (рН 0,8 - 1,2), трипсина (рН 7,0) (соотношение трипсин : ИНФ в липосомах составляло 1:10; 1:1; 15:l!(v/v), желчи медицинской с конечным разведением в 1000,100, 10 раз. Для разделения интерферона, заключенного в липосомы, и белка, освобождающегося из липосом в результате их разрушения, использовали ультрацентрифугирование (50000 g; 1час; 4 °С). О разрушении липосом судили по разнице в исходной радиоактивности липосомального ИНФ в начале опыта и п'осле разделения липосом и свободного интерферона, освободившегося в результате разрушения липосом под воздействием факторов ЖКТ, и выражали в процентах. Для нейтрализации трипсина применяли его ингибитор, полученный из соевых бобов.

Специфическую (лротивогерпетическую) активность препарата in vivo оценивали на модели генитальной герпетической инфекции. [Маренникова' С.С. и др., 1986]. Оценку безвредности препарата для лабораторных животных в остром и хроническом эксперименте

(токсичность, переносимость, кожно - резорбтивное действие, кожно -сенсибилизирующие свойства, конъюнктивальная проба, изменение массы и температуры тела, частота сердечных сокращений, исследовательское поведение в тесте "открытое поле", биохимический и гематологический анализ крови, гистологическое исследование образцов тканей, патоморфологическое исследование внутренних органов) проводили стандартными методами, одобренными для доклинических испытаний медицинских иммунобиологических препаратов [Фисенко В. П. и др., 2000]. В образцах крови определяли уровень гемоглобина, содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, рассчитывали лейкограмму. Биохимические исследования включали оценку показателей интенсивности основных видов обмена, а также активности ферментов - маркеров функционального состояния печени, почек, сердца [Меньшиков В.В., 1987].

Изучение острой токсичности и переносимости ЛФИ различными видами лабораторных животных проводили при однократном пероральном и внутрибрюшинном способах введения мышам ICR и крысам Wistar. Изучение токсичности ЛФИ в условиях хронического эксперимента проводили на крысах линии Wistar при пероральном введении препарата в течение двух недель. Животные были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой: 1 группа - контроль (физраствор), 2 группа - контроль (пустые липосомы), 3 группа - липосомальный ИНФ.

Изучение фармакокинетики рекомбинантного интерферона при наружном и пероральном применении липосомального препарата проводили на самцах беспородных мышей ICR с массой тела 20,0 ± 2,0 г. При наружном применении в дозе 6,25-103 ME на животное, при пероральном 20,0 103000 ME на животное. В качестве препарата сравнения использовали Реаферон, который вводили внутримышечно в одинаковой дозе. Контрольные животные получали инъекцию физиологического раствора. В разные сроки после введения препаратов мышей подвергали эвтаназии мгновенной дислокацией шейных позвонков и забирали кровь для определения ИНФ. На каждую временную точку брали от пяти до десяти животных. Уровень ИНФ в сыворотке крови мышей при наружном применении определяли иммуноферментным методом с помощью иммуноферментного набора "Procon IF2 plus" фирмы "Протеиновый контур" (г. С-Петербург). Чувствительность метода определения составляла 5,0 пкг/мл. Уровень ИНФ в сыворотках и печёночном гомогенате мышей при пероральном введении препарата определяли по цитопатическому действию вируса (ЦПД). Дополнительно исследовали содержание мышиного интерферона в сыворотке крови экспериментальных животных. Результаты определения концентрации ИНФ биологическим методом выражали в ME (международных единицах), мышиных интерферонов в ТЕ (титрационных единицах) [Forti R.L. et al., 1986].

Статистическая обработка результатов исследовании проводилась общепринятыми методами [Малета Ю.С. и др., 1981; Гланц С., 1999].

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка технологии получения липосомального препарата ИНФ человека для клинического применения

На первом этапе работы была проведена экспериментальная оценка методов иммобилизации ИНФ в липосомы, отобранные по результатам анализа литературы и патентной документации, с целью выбора наиболее оптимального и перспективного метода. Было установлено, что наиболее перспективными для дальнейшей работы по созданию ЛФИ оказались методы мягкого механического встряхивания и дегидратации — регидратации. Суммарная концентрация липидной композиции 100 мг/мл оказалась оптимальной для получения липосомального ИНФ, независимо от метода получения, так как позволила наиболее эффективно использовать и ИНФ, и липид. Затем поочерёдно была оценена возможность оптимизации технологических параметров выбранных методов с целью достижения максимально возможной иммобилизации ИНФ в липосомы без потери белком специфической (противовирусной) активности. При получении липосомального ИНФ методом мягкого механического встряхивания при комнатной температуре в течение 20 часов в липосомы было иммобилизовано около 30 % исходного количества ИНФ. При этом было отмечено двукратное снижение уровня исходной биологической активности белка. Таким образом, результаты проведенной работы свидетельствовали о том, что этот метод получения липосомального ИНФ, несмотря на проведенную нами модификацию условий получения, не подходит для создания ЛФИ ввиду недостаточного включения ИНФ в липосомы. Оптимизация параметров метода дегидратации - регидратации (длительность высушивания липидов, температура проведения процесса, способ регидратации липосом) позволила нам добиться высокого процента включения ИНФ в липосомы без потери его биологической активности. Для устранения гетерогенности липосомальной суспензии, полученной на стадии гидратации липида, в разрабатываемую технологию ввели стадию экструзии препарата под давлением инертного газа высокой степени очистки [Olson F.,1979]. Оптимизировав параметры процесса экструзии липосомального ИНФ (размеры пор поликарбонатных мембран, температура проведения процесса, количество циклов экструзии) добились необходимой гомогенности! липосомальной суспензии (более 90% везикул были стандартизованы по размерам) без значительных потерь липидов на мембранах и без деградации ИНФ (табл. 1).

Анализ 'полученных данных показал, что оптимальным для создания липосомального ИНФ в исследованных условиях является пятикратное экструдировайие опытных образцов препарата через мембраны с последовательно уменьшающимся диаметром пор (диапазон 1,0-0,1 мкм).

Таблица 1. Зависимость активности ИНФ от

среднего размера липосом и противовируснои количества циклов экструзии ЛФИ через

Количество Средний Концентрация Противовирусная

циклов диаметр липидов в активность

экструзии везикул, им фильтрованном ИНФ**, МЕ/мл,

препарата препарате, % in vitro

2 140 ±55 100,0 ± 1,0 1,0 • 106

5 125 ± 32 97,5 ±2,5 1,0 • 106

10 110 ±20 90,0 ± 5,0* 0, 75 • 10s

20 100 ± 10 86,2 ±6,3* 0,5 • 106

Примечание: *- достоверное отличие от нефильтрованного препарата, (п = 25 -30; р<0,05); ** - исходная активность образца составляла 1,0 • 106 ME/мл, приведены средние значения из числа исследованных образцов (п = 30).

Важнейшим параметром фармацевтического препарата является его стерильность или микробиологическая чистота в зависимости от планируемого способа применения препарата. В связи с этим была изучена возможность стерилизации ЛФИ методом ультрафильтрации с помощью стерильной ультрафильтрационной ячейки «Амикон» через ядерные мембраны на основе полиэтилентерефталатной плёнки с диаметром пор 0,1 -0,2 мкм. Возможность получения стерильных липосом продавливанием через поликарбонатные мембраны с таким диаметром пор ранее была показана рядом авторов [Freise J., 1984; Bommel E.M.G., 1984]. Как показал анализ результатов прямых посевов образцов препарата, подвергнутых ультрафильтрации, на тиогликолевую среду и жидкую среду Сабуро, нам удалось добиться стерилизации таким способом опытных партий готового препарата любого объёма. После их приготовления задача получения стерильного препарата ЛФИ сводилась к розливу во флаконы и лиофильному высушиванию в стерильных условиях, что не представляло технологической сложности. Поскольку в дальнейшем основным способом применения липосомального интерферона был выбран пероральный путь введения в организм, требования к препарату в соответствии с ГФ были смягчены до микробиологической чистоты, но стадия стерилизующей ультрафильтрации через мембраны с диаметром пор 0,1 - 0,22 мкм была оставлена в технологии получения препарата для гарантированного выполнения требований ГФ.

На следующем этапе настоящей работы необходимо было выбрать окончательный состав будущего лекарственного препарата с учётом всех требований ГФ. Очевидно, что липосомальный препарат, предназначенный для клинического применения, должен содержать только фармацевтически приемлемые компоненты. В связи с этим, в качестве основного липосомобразующего фосфолипида при получении липосомального интерферона использовали высокоочшценный фосфатидилхолин (ФХ) животного или растительного происхождения. Терапевтическая эффективность, присущая ФХ, обеспечила дополнительное положительное

терапевтическое воздействие липосом препарата на клетки - мишени. Известно, что для повышения стабильности липосом in vivo необходимо присутствие в липидной фазе липосом холестерина [Дранов Ф. А., 1996]. В клеточных мембранах гепатоцитов молярное соотношение ФХ : Хол составляет примерно 7:3, поэтому за основу в настоящей работе было взято именно это соотношение [Gregoriadis G., 1980]. Выбранный состав липидной фазы липосом, биодеградация которого будет осуществляться с помощью естественных ферментативных систем организма, прежде всего печени, позволил сделать предположение о полной биосовместимости липосомального ИНФ. Кроме того, при получении ЛФИ в состав липидной фазы липосом был дополнительно введён DL-á-токоферол (ТФ) в качестве природного антиоксиданта, защищающего ФХ от перекисного окисления и повреждения ; свободными радикалами и дополнительного стабилизатора мембран липосом [Плетнёва О. П., 1990]. Дополнительным эффектом введения ТФ в липосомы стала стабилизация антивирусной активности ИНФ [Малиновская В. В., 1994]. Для дополнительной стабилизации активности ИНФ на стадиях технологического процесса получения ЛФИ в состав препарата ввели аскорбиновую кислоту [Алексеев К. В. и др., 1990]. Проведенные' исследования показали, что для предотвращения перекисного окисления лйпида препарата и сохранения биологической активности интерферона в процессе получения и хранения ЛФИ, содержание ТФ в липидной «^азе липосом должно составлять 10 - 15 моль %, а содержание аскорбиновой кислоты 0,89 - 1,0 % от массы композиции. С целью обеспечения стабилизации белка, необходимой рН внутри липосом, осмотического давления и буферной ёмкости для изготовления липосомального интерферона использовали фосфатно-солевой буферный раствор (ФБР) [Фендлер Д. X., 1983; Алексеев К. В. и др.,1990]. Для уточнения влияния соотношения основных и вспомогательных компонентов препарата, вошедших в состав ЛФИ на сохранность противовирусной активности и степень иммобилизации белка в липосомы, размеры образующихся липосом, способность препарата к регидратации после лиофилизации, были изучены опытные образцы ЛФИ (табл.2).

Было установлено, что повышенное содержание Хол в липидной фазе липосом до 4(| моль % приводило к заметному увеличению среднего размера частиц по сравнению с липосомами, "бедными" Хол и достоверному снижению эффективности иммобилизации ИНФ в липосомы. Дополнительно к этому нужно отметить, что для полноценной гидратации липидной плёнки, содержащей повышенное количество холестерина, требовалось больше времени, липосомы "богатые" Хол, труднее поддавались экструзии, требовали более высокого давления аргона при продавливании через мембраны, что осложняло проведение технологического процесса. С учетом результатов исследований для получения липосомального ИНФ было выбрано молярное соотношение лецитина и холестерина в липидной фазе липосом 99,5 мМ ФХ : 25,8 мМ Хол как оптимальное для заданных условий и близкое к относительному содержанию этих липидов в

клеточных мембранах ( массовое соотношение между липидами и ТФ составило примерно 8:1:1).

Таблица 2. Некоторые физико-химические свойства липосом, полученных методом дегидратации - регидратации с последующей экструзией через поликарбонатные мембраны, (М ± т)___

Липидная композиция (молярное соотношение, мМ) Число серий препарата Степень включения интерферона, % Средний диаметр частиц, нм

83,3 ФХ : 66,7 Хол : 16,6 ТФ 6 52,7 ± 3,7 182 ±56

99,5 ФХ: 25,8 Хол : 23,2 ТФ 9 65,6 ± 4,5* 122 ±37

Примечание: Липосомальную суспензию, полученную методом дегидратации -регидратации подвергали многократной (10 - 20 циклов) последовательной экструзии через мембраны с начальным диаметром пор 1,0 мкм, конечным 0,1 мкм, затем лиофильно высушивали и регидратировали перед исследованием, (п = 5 в каждой серии); * - достоверное различие по сравнению с липосомами, содержащими повышенное количество Хол (р<0, 05)

На следующей стадии настоящей работы решали вопрос о необходимости включения, в состав разрабатываемой ЛФИ, стабилизатора конформации белка для сохранения биологической активности ИНФ при проведении лиофилизации препарата. Была изучена возможность применения человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), в качестве стабилизатора при лиофилизации ЛФИ, однако в результате экспериментов было установлено, что добавление альбумина в значительной степени ингибирует захват ИНФ липосомами (процент включения ИНФ падал с 65,0 ± 6,1 до 18, 3 ± 1,7). Поэтому ЧСА не использовали. Анализ лиофильно высушенных образцов ЛФИ, не содержащих ЧСА, показал, что величина противовирусной активности ИНФ при проведении лиофилизации препарата снижается в два — три раза, что было близко к величине снижения титра ИНФ при стерилизации и лиофилизации субстанции ИНФ, содержащей альбумин в качестве стабилизатора. С учётом полученных данных дополнительный стабилизатор структуры интерферона в состав ЛФИ решили не вводить, но при изготовлении препарата повысить в три раза концентрацию ИНФ в гидратирующем растворе для того, чтобы в лиофильно высушенном готовом препарате биологическая активность ИНФ соответствовала требованиям НТД на препарат. Кроме того, в состав ЛФИ в качестве криопротектора ввели дисахарид (сахароза, лактоза) для сохранения целостности липосомальной мембраны при лиофилизации в соотношении 0,6 мг/мг липида. Для лиофилизации липосомального ИНФ модифицировали режим лиофильной сушки, примененяемый для получения Реаферона. Суть отработанного режима лиофилизации ЛФИ заключалась в следующем. Предварительное замораживание препарата во флаконах проводили в морозильных прилавках при температуре минус 45,0 ± 5,0 °С в течение 18 -20 часов в асептических условиях. По окончании заморозки кассеты

переносили на полки с температурой минус 45,0 ± 5,0 °С предварительно подготовленной сублимационной камеры лиофильной сушилки, не допуская разморозки препарата. Процесс собственно сушки продолжался шесть -восемь часов, досушка при температуре 22,0 ± 2,0 °С длилась около суток, общая продолжительность процесса составляла 36 - 48 часов [РП № 1194 -02, 2001]. После регидратации сухой ЛФИ препарат восстанавливал липосомальную структуру (рис.1).

Рисунок 1. Липосомы с ИНФ под сканирующим электронным

микроскопом (увеличение 40000). Продемонстрирована восстановленная после регидратации липосомальная структура препарата, полученного но разработанной технологии.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана технология получения стерильной, лиофильно высушенной ЛФИ, пригодная для масштабного производства лекарственного препарата. В состав ЛФИ вошли только фармацевтически приемлемые компоненты (табл. 3). По разработанной технологии были получены экспериментальные серии препарата. Образцы были заложены на хранение при разных температурах с целью определения сроков годности и условий хранения препарата, а также использовались при проведении его доклинического (лабораторно -экспериментального) изучения.

Таблица 3.Оригинальная рецептура сухого липосомального препарата рекомбинантного альфа-2 интерферона человека (на 1,0 мл )_

Компонент препарата Количество

ИНФ (ФС 42-3279-96) 2,5-105 - 1,0Т06 МЕ

Лецитин-стандарт (ФС 42-150ВС-88) от 72,5 до 80,36 мг

Холестерин (ТУ 6-09-10-1780-86) от 9,85 до 10,(2 мг

Витамин Е (ВФС 42-2442-94) от 9,85 до 10,12 мг

Аскорбиновая кислота (ФС 42-2668 - 89) от 1,35 до 1,57 мг

Сахароза (ГОСТ 5833-75) от 60,37 до 62,03 мг

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (ГОСТ 4172-76) от 3,77 до 6,76 мг

Натрий фосфорнокислый однозамещенный (ГОСТ 245-76) от 0,54 до 0,75 мг

Натрия хлорид (ФС 42-2572-95) от 8,01 до 9,48 мг

Полученные на данном этапе работы результаты позволили разработать технологическую схему производства ЛФИ (рис.2).

Рисунок 2. Основные стадии процесса производства липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека.

На следующем этапе настоящей работы для контроля физико — химических и биологических свойств ЛФИ были разработаны новые, либо адаптированы существующие для обычных лекарственных форм методы анализа, отвечающие требованиям ГФ. Особое внимание было уделено стандартизации противовирусной активности готового препарата. Была изучена возможность использования метода анализа противовирусной активности свободного ИНФ титрованием в культуре клеток. В результате экспериментов было установлено, что для титрования ЛФИ в культуре клеток Л-68 необходимо разрушение липосом неионным детергентом Тритоном Х-100 (1,5 % - 2,0 % (v/v)). Метод титрования свободного ИНФ, изложенный в литературе [Pestka S., 1981; Pestka S., 1986], с введением дополнительной стадии разрушения липосом Тритоном Х-100 вошёл в фармакологическую статью на препарат [ФСП 42 - 0140 - 0371 - 00, 2000]. Таким образом, была предложена простая модификация стандартного метода контроля биологической активности интерферона, позволившая

использовать существующую на производстве интерфероновых препаратов материально - техническую базу.

Для количественного определения содержания ИНФ в липосомах на следующем этапе работы изучили возможность использования метода флотации в ступенчатом градиенте плотности фиколла [Heath Т. D., 1981]. Подбором условий нам удалось добиться 99% флотации липосом, в то время как белок практически полностью оставался в наиболее плотной части градиента. Достоверность полученных результатов была подтверждена наличием корреляции между методами флотации и использованием меченого [12SI] ИНФ (табл. 4).

Таблица 4. Степень включения ИНФ в липосомы, приготовленные по

разработанной технологии,* (М ± т)

Метод анализа Степень включения ИНФ, %

Радиоизотопный 65,0 ± 6,0

Флотация в градиенте плотности фиколла 55,0 ±5,0

Примечание: * - средние значения по результатам анализа 30 проб.

Для контроля стабильности липидов была изучена возможность использования метода, основанного на измерении концентрации продуктов перекисного |окисления липидов по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Yagi К., 1984]. Применив в качестве стандарта малоновый альдегид bis - диметилацеталя, показали, что исследуемые свежеприготовленные липосомальные препараты ИНФ содержали в среднем 1 моль ТБК -чувствительных продуктов на 240 молей липосомального лецитина. Другие методы анализа, использованные для оценки физико - химических и биологических свойств ЛФИ, были описаны ранее и соответствовали требованиям ГФ. Окончательная спецификация показателей качества ЛФИ, согласованная с комитетом МИБП и ГИСКом им. Л. А. Тарасевича, приведена в табл. 5.

2. Лабораторно - экспериментальное изучение липосомального ИНФ Для определения сроков годности и условий хранения ЛФИ изучили стабильность лиофильно высушенного препарата ЛФИ в процессе длительного ^хранения. Была осуществлена закладка 5 опытных серий лиофильно высушенной микробиологически чистой ЛФИ (п = 150, в каждой серии) на хранение при температуре (4,0 ± 1,0) °С сроком на 15 месяцев, с ежеквартальным анализом по полному комплексу физико - химических и биологических показателей. Воздействие света на препараты исключалось. Особое внимание, прежде всего, обращали на сохранность биологической (противовирусной) активности препарата и степени иммобилизации ИНФ в липосомы, а также на окисленность липвда. Полученные данные оказались практически идентичными для всех серий ЛФИ, заложенных на хранение, в качестве иллюстрации приведены данные для одной серии (табл. 6).

1S

Таблица 5. Спецификация некоторых показателей качества сухого липосомального препарата рекомбинантного альфа-2 интерферона человека

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Время растворения Визуальный Образование при встряхивании с 1 мл воды гомогенной суспензии белого цвета в течение 5 мин

рН Потенциометр ический, ГФ XI, вып.1, с. 113 От 6,5 до 7,5

Потери в массе при высушивании ГФ XI, вып. 1,с. 176; МУК 4. 1/4.2-558-96, п.43, с. 116 Не более 4%

Вакуум, защитный газ, герметизация Визуальный МУК 4.1/4.2558-96, п. 12, с.63 Соответствует требованиям герметизации

Специфическая активность Биологический. На культуре клеток легкого эмбриона человека Л-68, инфицированной вирусом везикулярного стоматита по ОСО 42-28-158-88 Противовирусная активность не менее 250 ООО МЕ/мл

Однородность дозирования Весовой МУК 4. 1/4.2-58896, п.44. 1,с. 1 17 Коэффициент вариации не более 7,5%

Средняя масса и отклонение от средней массы Весовой, ГФ XI, вып.2, с. 142 173,7мг; от 166,2мг до 181,2мг Допустимое отклонение средней массы: ±7.5%

Микробиологическая чистота ГФ XI, вып.2, с. 196-200 и Изменение №1,1996г. Соответствует требованиям, категория 2

Степень включения ИНФ в липосомы Биологический. В соответствии с показателем «Специфическая активность» Не менее 50% специфической активности

Липиды Колориметрический. По фосфору, согласно МУК 4.1/4.2-558-96, п.21, с.77 Не более 100 мг/л

Анализ представленных данных (табл. 6) показал стабильность сухой ЛФИ в процессе хранения при соблюдении температурного режима. Основные показатели качества, характеризующие препарат, такие как специфическая активность, степень иммобилизации ИНФ в липосомы, отсутствие накопления значительного числа продуктов перекисного окисления липидов, оставались стабильными на протяжении всего срока хранения (один год).

Таблица 6. Экспериментальные данные по стабильности образцов ЛФИ в процессе хранения опытных серий__

№ п/п Срок хранения препарата Специфическая активность, ME/мл, in vitro Степень захвата ИНФ, % Продукты перекисного окисления липидов, нмоль МДА/мг

1 1 день 1,0- 10" 53,5 0,236 ± 0,022

3 мес. 1,0 • 106 54,2 0,240 ± 0,020

6 мес. 1,0 - 106 53,0 0,264 ±0,021

9 мес. 0,75 • IО6 52,7 0,272 ± 0,022

12 мес. 1,0 • 106 53,3 0,283 ±0,025

15 мес. 1,0 ■ 106 54,0 0,317 ±0,024*

Примечание: *- достоверное различие между свежеприготовленной ЛФИ и хранящимся 15 месяцев препаратом (р<0,05); п = 10 для всех сроков хранения.

На следующем этапе работы щучили стабильность создаваемой ЛФИ в условиях, моделирующих воздействие физиологических факторов желудочно - кишечного тракта человека (ЖКТ), таких как натуральный желудочный сок, трипсин, желчь на препарат по мере его продвижения по пищеварительному тракту до места всасывания в тонком кишечнике. Концентрации физиологических факторов, воздействующих на ЛФИ, выбирали с учётом их реальных уровней в ЖКТ человека [Файтельберг Р. О., 1967; Гальперин С. И., 1977]. Для проведения исследования изготовили экспериментальную серию ЛФИ, степень включения ИНФ в липосомы (по ИНФ - [12S I]) составила 66,0 ± 3,3 %. Опытные образцы подвергали воздействию указанных выше веществ, временные интервалы воздействия составляли от пяти минут до одного часа, при 37 °С. Затем липосомы разделяли ультрацентрифугированием со свободным ИНФ, высвободившимся из них после разрушения, фракции исследовали на радиоактивность, по полученным результатам рассчитывали количество белка, оставшегося связанным с липосомами (табл.7).

Полученные данные свидетельствовали о том, что наиболее критичным для липосомальной структуры препарата оказалось воздействие желчи. Уже после 30 минутной инкубации образцов с раствором желчи в разведении 1:10 25% интерферона, иммобилизованного в липосомы, освобождалось в результате разрушения везикул. Вместе с тем необходимо отметить, что через час более 50% исходного количества ИНФ всё ещё оставалось внутри липосом, а это значит, что конформация белка внутри них не была нарушена. Инкубация с отдельно взятым желудочным соком, содержащим пепсин, и трипсином не приводила к значительному высвобождению ИНФ из липосом. Далее, изучили сочетанное последовательное воздействие факторов ЖКТ на ЛФИ с использованием положительного контроля - Реаферона. С учётом результатов предыдущих экспериментов, для исследования были выбраны максимальные концентрации физиологических факторов ЖКТ (желудочный сок натуральный в соотношении к препарату 1:1 (v/v), желчь медицинская

консервированная в разведении 1:10, трипсин - 0,015мг/мл или соотношение трипсин : интерферон 15:1). Опытные образцы подвергали последовательному воздействию каждого из указанных компонентов в течение 1 часа при 37 °С, затем наносили на монослой клеток Л-68 и исследовали на противовирусную активность (табл.8).

Таблица 7.Степень иммобилизации ИНФ в липосомы после воздействия факторов физиологического окружения ЖКТ человека (% от исходного количества ИНФ, иммобилизованного в липосомы перед началом

Фактор воздействия на препарат Концентрация воздействующего начала' Время инкубации, мин

5 15 30 60

Желудочный сок 1:1000 1 : 100 1 :10 1:1 100 ±0,9 100 ± 1,2 100 ± 2,3 98,1 ±2,6 100 ± 2,0 100 ±2,4 99.1 ±3,5 96.2 ± 3,8 100 ±3,0 100 ±2,9 95,2 ± 4,0 93,4 ± 5,6 100,0 ±4,6 99,7 ±5,1 93,3 ± 4,8 90,5 ± 6,3

Трипсин 1 :10 1: 1 15:1 100 ± 2,2 99.1 ±2,6 97.2 ±3,4 100 ±3,3 97,2 ± 3,8 94,0 ± 4,8 99,7 ± 4,2 95,0 ± 4,7 92,2 ± 5,3 95,2 ± 5,6 92,5 ± 5,8 87,7 ±6,3

Желчь 1 :1000 1 :100 1 :10 100 ±2,1 100 ±2,3 95,0 ± 3,2 100 ±3,6 99.3 ± 3,9 86.4 ± 5,2* 97.2 ± 5,1 95.3 ± 4,9 75,2 ± 4,6* 94,8 ±5,7 90,3 ± 5,2 55,7 ±6,4*

Контроль (липосомы с ФБР, рН 7,0) 1 : 1 100 ±2,2 100 ±3,3 99,7 ± 4,2 97,3 ± 5,9

для трипсина соотношение фермент : интерферон; * - разница между образцами, подвергнувшимися воздействию данных физиологических факторов ЖКТ и контролем достоверна (р < 0,05).

Таблица 8. Противовирусная активность ЛФИ (in vitro) после последовательного воздействия факторов физиологического окружения

Препарат Исходная Желудочный Трипсин Желчь

активность сок (1:1) (0,15 мг/мл) (1:10)

Реаферон 106 6,25 104 0 - ■

ЛФИ 106 0,85 • 106 0,75 • 106 0,5 ■ 106

Примечание: * - среднее значение из (п = 10) для каждого фактора ЖКТ

Результаты, представленные в табл. 8 подтверждают защитные свойства липосом как переносчиков лекарств, при пероральном применении препарата, только в случае включения их внутрь водной полости липосом. Действительно, липосомальный ИНФ суммарно после воздействия

желудочного сока и трипсина потерял в среднем 25% активности, вероятно, это явилось следствием деградации белка, адсорбированного на внешней стороне липосошльной мембраны, под влиянием трипсина. Наиболее значительная потеря биологической активности ЛФИ, как и в первой серии экспериментов, произошла под воздействием желчи вызвавшей частичную солюбилизацию липосом, высвобождение ИНФ из разрушенных везикул и последующую деградацию ИНФ. Общая потеря активности ЛФИ после сочетанного последовательного трёхчасового воздействия желудочного сока, трипсина и желчи в исследованных концентрациях составила в среднем 50 %.

Таким образом, экспериментально была подтверждена способность ЛФИ предохранять ИНФ, иммобилизованный во внутреннюю полость липосом, от разрушения физиологическими факторами ЖКТ при пероральном применении.

На следующем этапе работы изучили распределение рекомбинантного интерферона альфа-2 по органам и тканям экспериментальных животных и токсические свойства препарата при пероральном и наружном применении ЛФИ, а также противовирусную активность ЛФИ ¡n vivo.

Динамика изменения содержания интерферона в сыворотке крови мышей после его перорального применения в сравнении с инъекционным применением ИНФ в одинаковой дозе представлена на рис. 3.

Рисунок 3. Динамика содержания альфа-2интерферона в сыворотке крови мышей в разнйе сроки после воздействия препаратами интерферона (доза 20 000 МЕ на животное); по оси абсцисс — время после воздействия, ч; по оси ординат — концентрация альфа - 2 интерферона, МЕ/мл. 1 — интерферон (в/м инъекция); 2 — липосомальный интерферон (перорально); 3 — инъекционный интерферон, применённый перорально (контроль).

Полученные данные свидетельствовали о том, что через час после перорального применения ЛФИ в крови мышей регистрировали максимальные концентрации ИНФ* также как и в случае внутримышечного введения свободного ИНФ в одинаковой дозе, при этом достоверного различия между уровнями ИНФ в крови экспериментальных животных не наблюдали. Через три часа после внутримышечной инъекции свободного

ИНФ обнаруживали более чем 70% падение его уровня в кровотоке, при этом введённая перорально ЛФИ к этому времени показала лишь 40% падение концентрации ИНФ в крови от максимальных значений. Разница между показателями была достоверной (р<0,01). Как свидетельствует кривая 3, (рис.3), в крови животных контрольной группы значимого уровня ИНФ не обнаружили. Через 6 часов после внутримышечной инъекции ИНФ в крови животных не удалось обнаружить даже следовых количеств ИНФ, что свидетельствовало о его полной деградации и выведении из организма. Напротив, через 6 часов после перорального введения ЛФИ в крови животных регистрировали примерно 30% белка от его максимального уровня. Указанное различие в данных, вероятно, можно объяснить защитным действием липосом, предохраняющим ИНФ от воздействия протеаз крови [Маркарян А. С., 1998]. В диапазоне 6-12 часов в крови мышей, которым перорально вводили ЛФИ, стабильно обнаруживались концентрации ИНФ, достоверно не различающиеся с показателями, полученными для шести часов. Нами было сделано предположение о том, что в этот период времени циркулирующие в кровотоке животных макрофаги были насыщены липосомами и временно были не способны к захвату липосом с ИНФ и доставке их в печень, что позволило оставшимся неразрушенным везикулам, содержащим белок, постепенно высвобождать его в кровеносное русло, поддерживая концентрацию. Через 12 часов после применения ЛФИ установили достоверное (р<0,05) увеличение концентрации ИНФ в крови экспериментальных животных, титр сывороток к 15 часам наблюдения в среднем вырос с 200 - 250 МЕ/мл до 400 - 410 МЕ/мл или в 1,6-2 раза. Вероятнее всего это свидетельствовало о том, что к этому времени липосомы, ранее сохранявшие целостность в кровотоке, начали активно деградировать под воздействием физиологических факторов крови (липопротеины), высвобождая ИНФ. С 15 часа началось плавное падение уровня ИНФ в кровотоке, к 18 часам уровень ИНФ не превышал 100 МЕ/мл, с 18 до 24 часов титрование сывороток животных выявляло только следовые количества белка на уровне 10-20 МЕ/мл, то есть практически на пределе погрешности определения данным методом. Было сделано предположение о том, что падение титров ИНФ в сыворотках крови мышей с 15 по 18 час после введения, вызвано двумя причинами: во - первых к этому времени печёночные депо полностью освободились от ранее захваченных липосом, утилизировав их компоненты и готовы к катаболизму новой партии липосом и их содержимого, доставляемых циркулирующими макрофагами, во - вторых, освободившийся в кровоток из липосом, разрушившихся под воздействием компонентов крови ИНФ, подвергался интенсивной биодеградации под воздействием протеаз крови.

Изучение биораспределения свободного и липосомированного препарата в печени животных показало, что свободный интерферон максимально накапливался в печени к шести часам после внутримышечной инъекции и через девять часов после введения в печёночном гомогенате уже не определялся. Липосомальный интерферон медленнее выводясь из

кровотока, максимально накапливался в печени к девяти часам, повышенный уровень белка определялся до 15 часов после перорорального введения препарата, постепенно уменьшаясь до фоновых значений после этого срока. При этом снижение содержания интерферона в печени после воздействия ЛФИ к 15 часам, сопровождалось второй волной подъёма концентрации ИНФ в крови, вызванное, вероятно, помимо вышеназванных предположений ещё и метаболизмом липосомального интерферона в печени и поступлением ИНФ в кровоток (рис. 4).

Таким образом, липосомирование позволило сохранить биологическую активность ИНФ в физиологических условиях ЖКТ мышей, помогло его проникновению через гастроинтестинальный барьер и доставке в кровоток и печень. При этом наиболее высокий уровень накопления ИНФ в сыворотке крови мышей регистрировался через один час после введения, то есть, в те же сроки, что и после внутримышечного применения, причём величины максимальных концентраций, создаваемых одинаковыми дозами препаратов в кровотоке, достоверно не различались, что свидетельствовало о практически равной биодоступности инъекционной и липосомальной лекарственных форм ИНФ к исследованному моменту времени.

Рисунок 4. Динамика содержания альфа-2интерферона в печени мышей в разные сроки после воздействия препаратами интерферона в одинаковой дозе 20 ООО МЕ на животное. По оси абсцисс — время после воздействия, ч; по оси ординат — концентрация ИНФ, МЕ/мл. 1 — интерферон (в/м инъекция); 2 — липосомалыгый интерферон (перорально); * - достоверное различие, между свободным ИНФ и ЛФИ.

В следующей серии экспериментов изучили динамику изменения содержания ИНФ в сыворотке крови мышей после нанесения ЛФИ на скарифицированную кожу в сравнении с внутримышечным введением одинаковой дозы свободного ИНФ. Анализ полученных данных показал, что накожная аппликация ЛФИ приводила к увеличению содержания ИНФ в сыворотке крови. При этом максимальный уровень показателя в этой группе

животных был отмечен через час после нанесения на кожу, то есть, в те же сроки, что и в случае внутримышечной инъекции, составив 53% от уровня, зарегистрированного в группе, получившей ИНФ инъекционно. Липосомальный ИНФ отличался более длительным периодом циркуляции в крови экспериментальных животных, вероятно, за счет медленного высвобождения белка из липосом. Полученные данные свидетельствовали о том, что свободный ИНФ полностью элиминировался из кровеносного русла мышей в течение трёх часов после введения, а липосомальный к концу шестого часа наблюдения.

Таким образом, экспериментально было продемонстрировано, что липосомальный ИНФ, при его накожном применении, проникал в кровеносное русло животных, менее интенсивно накапливался в крови по сравнению с инъекционным, введённым в одинаковой дозе, но отличался более длительным периодом выведения. Полученные данные о восстановлении фонового уровня ИНФ через шесть часов после накожной аппликации его липосомальной формы и через 18 часов после перорального введения подтвердили, что создаваемая ЛФИ способна к биодеградации с помощью естественных ферментативных систем печени. Существование в организме ферментативных систем, обеспечивающих биодеградацию препарата, позволило нам предположить, что накожное или пероральное применение липосомальной формы интерферона не будет вызывать метаболических нарушений и токсических изменений структуры и функций основных систем организма.

Для проверки этого предположения изучили безвредность ЛФИ для экспериментальных животных при пероральном и наружном применении препарата.

Результаты исследования острой токсичности и переносимости ЛФИ свидетельствовали о том, что однократное пероральное введение препарата мышам и крысам в диапазоне испытанных доз 3 • 105 - 3 • 106- 3 • 107 МЕ/кг и 3 • 105 - 3 • 106 - 1,5 • 107 соответственно и внутрибрюшинное введение мышам, в диапазоне доз 3 • 105-3 • 1.06-3 • 107 МЕ/кг, крысам - 3 • 1053 • 106 - 1,5 • 107 МЕ/кг, не вызывало у подопытных животных каких - либо признаков интоксикации. При этом на протяжении всего периода наблюдения не было зарегистрировано гибели животных. Следует также отметить, что высшие из испытанных доз ЛФИ - 1,5 • 107 МЕ/кг для крыс и 3,0 • 107 МЕ/кг для мышей соответственно в 500 - 1000 раз превышали дозу, рекомендованную для человека (3,0 • 104 МЕ/кг). Такие дозы ЛФИ были обусловлены максимально возможными объёмами препарата, которые могли быть введены экспериментальным животным без ущерба для их организма. В связи с этим, не удалось установить показателей среднесмертельных доз - ЛД50 для ЛФИ.

При изучении токсичности ЛФИ в условиях хронического эксперимента установили, что двухнедельное пероральное введение препарата животным в исследуемой дозе 7,5 • 106 МЕ/кг (250-кратная терапевтическая доза), так же, как и десятикратное нанесение

липосомального интерферона на поверхность кожи крыс в суммарной дозе 5,0 - 104 на животное, не оказывало существенного влияния на уровень физиологических показателей. Внешний вид, поведение, потребление воды и корма животных опытной группы не отличались от контрольных показателей. Масса тела подопытных крыс закономерно нарастала, в среднем, на 3,0 - 3,5% в неделю, что достоверно не отличалось от привеса контрольных животных. Значения температуры тела, частоты сердечных сокращений и параметры исследовательского поведения не выходили за границы диапазона нормальных значений для этого вида животных. Макроскопическое исследование внутренних органов крыс, получавших препарат перорально, не выявило каких - либо отличий от показателей животных контрольной группы.

Липосомальная форма интерферона не оказывала существенного влияния на показатели красной крови, общее число лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови. Значения общего белка, мочевины, креатинина, холестерина, глюкозы крови животных опытной группы на протяжении всего эксперимента не отличались от контрольного уровня. Уровень триглицеридов в сыворотке крыс, получавших липосомальный интерферон наружно или перорально, соответствовал значениям показателей в группах животных, которым апплицировали на кожу либо вводили перорально физиологический раствор или "пустые" липосомы (1,0 ± 0,12; 0,97 ± 0,20 и 1,03 ± 0,11 мМ/мл, соответственно). Следовательно, многократные аппликации или пероральное введение липосомального интерферона не изменяли белкового, углеводного и липидного обмена. Активность сывороточных ферментов (аланин- и аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы) опытных крыс не выходила за границы диапазона нормальных значений, что свидетельствовало об отсутствии нарушения структуры и функции сердца, почек, печени и желчевыводящих путей животных, которым апплицировали на кожу либо перорально вводили ЛФИ. Аналогичные выводы были сделаны нами в результате патоморфологического исследования, в ходе которого не обнаружено отклонений в весовых индексах и патоморфологической картине внутренних органов.

Таким образом, ЛФИ при наружном и пероральном применении не оказывала токсического влияния на сердечную деятельность, функцию системы терморегуляции, поведенческие и ориентировочно-исследовательские реакции, не вызывала значимых изменений в морфологическом составе периферической крови, интенсивности обменных процессов и состоянии внутренних органов.

При оценке возможного местно - раздражающего и сенсибилизирующего действия ЛФИ установили, что двадцатикратное нанесение препарата на кожу животных не вызывало визуальных признаков эритемы, инфильтрации или отека. Во всех исследованных образцах кожи (как опытных, так и контрольных животных) эпителиальный покров был полностью сохранен, базальный слой прослеживался на всем протяжении.

Регионарные лимфоузлы при макроскопическом исследовании были обычного размера, цвета и консистенции. Проведенное исследование не выявило выраженных различий в гистологическом строении кожи и лимфоузлов у опытных и контрольных животных. Не обнаружено признаков воспалительной реакции и изменений митотической активности в коже и лимфоузлах.

Патоморфологический анализ кожи в месте аппликации ЛФИ и регионарных лимфоузлов показал, что липосомальная форма альфа-2 интерферона не обладала местно-раздражающим действием, не оказывала другого негативного влияния на нормальную кожу и не вызывала изменений в регионарных лимфатических узлах экспериментальных животных.

Конъюнктивальная проба была отрицательной, не было выявлено признаков сенсибилизации гиперемического или отечного характера. Эти данные позволили заключить, что липосомальная форма альфа-2 интерферона не обладала кожно-сенсибилизирующими свойствами.

Анализ полученных результатов показал, что ЛФИ не оказывала токсического, кожно - раздражающего и аллергизирующего действия на организм лабораторных животных, то есть являлась безвредной.

Оценка противовирусного действия ЛФИ in vivo. Результаты изучения накожного применения ЛФИ, свидетельствующие о накоплении ИНФ в кровотоке животных, послужили основанием для изучения противогерпетической активности препарата на модели генитальной герпетической инфекции у морских свинок. G этой целью самцов морских свинок заражали вирусом герпеса в дозе 100 БОЕ по известной методике [Маренникова С.С. и др.,1986]. Животным первой экспериментальной группы (шесть голов) апплицировали липосомальный интерферон по 400 МЕ на penis через 1, 24 и 48 ч после инфицирования, животные второй группы (шесть) служили положительным контролем и лечения не получали, животные третьей группы (отрицательный контроль) не были заражены и являлись группой, по отношению к которой сравнивалась интенсивность герпетических изменений на penis. За развитием заболевания следили по появлению характерных клинических признаков герпетической инфекции: гиперемии, отёку, кожным высыпаниям (везикулы) с последующим образованием эрозий. Для количественной характеристики использовали условную систему баллов (от 0 до 4), выражавшую суммарно интенсивность патологических признаков экспериментального герпеса [Маренникова С.С. и др.,1986]. Лечебный эффект оценивали по разности сумм баллов в контрольной и опытной группе в период максимального проявления симптомов заболевания (третий - четвёртый день после инфицирования).

В результате исследования специфической (противогерпетической) активности липосомального интерферона было установлено, что аппликации препарата существенно не изменяли динамику экспериментальной герпетической инфекции, но заметно уменьшали выраженность клинических признаков заболевания. В группе морских свинок, инфицированных вирусом и не получавших лечения, наблюдалась характерная картина генитального

герпеса. В течение первых двух суток на месте заражения появлялись гиперемия, отечность и отдельные элементы в виде везикул или пустул. К 72 - 96 часам поражения достигали максимально го развития: пустулезные элементы сливались между собой, появлялись кровоточащие изъязвления, превращающиеся в обширные эрозии. Через 96 ч после заражения из пустулезных элементов был выделен вирус герпеса 2 типа в титре 102 ЦПД. Через 120 часов начиналось обратное развитие клинических проявлений инфекционного процесса. У животных опытной группы, которым апплицировали липосомальный интерферон по 400 ME на penis, через 1, 24 и 48 часов после инфицирования клинические симптомы ограничивались небольшой отечностью и гиперемией в первые двое суток после заражения, а также отдельными пустулезными элементами на третьи сутки, выраженность которых уменьшалась к пятым суткам. Вирус герпеса из пустулезных элементов не выделялся. Лечебный эффект липосомального интерферона при использованной схеме нанесения препарата был оценен в 35 баллов. Вероятно, при увеличении кратности нанесения препарата до норм, соответствующих традиционной методике (два раза в сутки в течение четырёх дней) [Маренникова С. С. и др., 1986] или иммобилизации липосомального ИНФ в гелеобразующую структуру, для лучшей фиксации на penis животных, можно было ожидать более выраженного клинического эффекта.

Таким образом, липосомальный ИНФ при наружном применении способствовал купированию клинических признаков экспериментальной герпетической инфекции и сокращению продолжительности заболевания, что свидетельствовало о лечебном действии ЛФИ в отношении генитального герпеса морских свинок.

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствовали о наличии противовирусной активности у ЛФИ, проявляемой препаратом как in vitro, так и in vivo. Это послужило экспериментальным обоснованием возможности проведения испытаний ЛФИ в качестве противовирусного препарата для неинъекционного применения на добровольцах совместно с ЦНИИЭ МЗ РФ на базе 2-й клинической инфекционной больницы г. Москвы и в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

Лечение острого вирусного гепатита В. В клинических испытаниях ЛФИ у больных острым вирусным гепатитом В (ОВГВ) средней степени тяжести в клинике ЦНИИ МЗ РФ было установлено, что препарат в дозе 1 млн ME за 30 мин до еды два раза в день в течение 10 дней хорошо переносился больными и в отличие от Реаферона, вводившегося внутримышечно в той же дозе два раза в день, не вызывал каких-либо токсических или аллергических реакций. В ходе апробации осуществлялся ежедневный общеврачебный осмотр. Клинические и биохимические исследования проводились до начала лечения, после 10 дней терапии и при выписке. Кровь на маркеры вируса гепатита В (исследование методом иммуноферментного анализа) для верификации диагноза ОВГВ бралась до лечения и на HBsAg повторно перед выпиской.

Содержание а- и у-ИНФ в сыворотке крови больных показало, что оба препарата ИНФ являются его индукторами. При этом индуцирующий эффект ЛФИ оказался выше, чем у Реаферона. Так, в группе больных, получавших ЛФИ, содержание а-ИНФ повысилось через 10 дней лечения в 4 раза, а при в/м введении - в 2,5 раза по сравнению с исходным уровнем. Индуцирующий эффект, но менее выраженный, оказывали оба препарата и на у-ИНФ. Следует отметить, что длительность желтушного периода в группе больных, получавших ЛФИ, была короче на 7 дней, чем у принимавших Реаферон.

Оба препарата оказывали положительное влияние на элиминацию HBsAg из крови. При приеме ИНФ как перорально, так и внутримышечно HBsAg не определялся более чем у половины больных к моменту выписки из стационара, в то время как в контрольной группе, получавших традиционное лечение, лишь у одной трети больных.

Таким образом, при ОВГВ терапевтическая эффективность ЛФИ, применяемой перорально, не уступала Реаферону, вводимому парентерально, а по ИНФ-индуцирующему действию даже превосходила его [Змызгова А. В. и др., 1999]. ;

Лечение хронического гепатита В. Проведенные в Московском НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ клинические испытания ЛФИ показали, что липосомальная форма ИНФ при пероральном применении в дозе 500 тыс. МЕ детям до 7 лет и 1 млн МЕ школьникам два раза в день в течение 10 дней и затем в течение 1 мес через день один раз в сутки на ночь эффективна в комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, ассоциированным с гломерулонефритом, и по эффективности не уступает инъекционному Реаферону в тех же дозах. Побочных эффектов ЛФИ не было отмечено, препарат хорошо переносился больными. При использовании ЛФИ у некоторых больных отмечалось улучшение со стороны клинико-лабораторных проявлений как гепатита, так и гломерулонефрита. Пероральное применение препарата было значительно удобнее и избавляло детей от нежелательных стрессовых нагрузок, исключало риск передачи инфекций через шприц (парентеральные вирусные гепатиты, ВИЧ) [Маркарян A.C. и др., 1998].

Впоследствии, терапевтическая эффективность ЛФИ при лечении как острого, так и хронического гепатита В подтверждалась и в других исследованиях, выполненных в Кубанской государственной медицинской академии, Новосибирской государственной медицинской академии, показана эффективность ЛФИ, применяемой перорально в отношении гриппа, ОРЗ, клещевого энцефалита, в комплексной терапии генитального герпеса, хламидиоза, уреаплазмоза. Во всех исследованиях отмечалась хорошая переносимость препарата и взрослыми, и детьми [Колокольцов А. А. и др., 2007]. Клиническое применение ЛФИ в практике здравоохранения выявляет всё новые нозологические формы заболеваний, в лечении и профилактике которых эффективен липосомальный ИНФ, тем самым расширяя спектр терапевтического применения npenapaTa[http://lipint.ru],

выводы

1. Разработана новая лнпосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона (Реаферон - ЕС - Липинт) для перорального применения, а также технология её получения в промышленном масштабе. Экспериментально обоснован состав и соотношение основных компонентов и вспомогательных веществ липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа -2Ь интерферона человека, способ и технологические условия её получения, лиофильная форма выпуска препарата, условия хранения готовой лекарственной формы и способ применения лекарственного средства.

2. Разработана система оценки соответствия качества готовой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека требованиям Государственной Фармакопеи Российской Федерации, а также контроля качества препарата в процессе его получения на основных технологических стадиях.

3. Показана стабильность противовирусной активности лиофильно высушенного липосомального рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при сроках хранения не менее одного года.

4. Экспериментально установлено, что введённый перорально или нанесённый накожно липосомальный рекомбинантный альфа-2 интерферон преодолевает соответственно гастроинтесгинальный или кожный барьеры, сохраняя при этом свою биологическую активность, попадает в кровоток макроорганизма и обладает пролонгированным действием (18 и 6 часов, соответственно) по сравнению с интерфероном, введённым внутримышечно (3 часа).

5. Показано в экспериментах in vivo, что липосомальная форма рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при наружном и пероральном применении не обладает токсичностью, кожно - раздражающим и аллергизирующим действием и является безвредным препаратом для организма экспериментальных животных.

6. Показана in vitro стабильность липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека в условиях, моделирующих воздействие физиологических факторов желудочно - кишечного тракта человека. При этом препарат сохраняет более 50 % своей противовирусной активности в течение одного часа сочетанного воздействия факторами ЖКТ. Продемонстрировано, что свободный интерферон в аналогичных условиях подвергается практически моментальной деградации.

7. Продемонстрирована in vivo противогерпетическая активность липосомального ИНФ при наружном применении на модели генитального герпеса морских свинок.

8. Показана противовирусная эффективность липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при пероральном применении в комплексной терапии при клинических испытаниях у больных хроническим вирусным гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, осложнённых гломерулонефритом, перспективность

препарата для профилактики гриппа, других ОРЗ вирусного, бактериального и смешанного типов.

9. Разработан и утвержден необходимый комплект нормативно-технической документации (ФСП, РП, инструкция по применению), проведена Государственная регистрация препарата в Российской Федерации под торговым названием «Реаферон-ЕС-Липинт», организовано серийное производство первого липосомального лекарственного препарата, разрешённого для медицинского применения и промышленного выпуска в Российской Федерации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Золин В. В., Колокольцов А. А., Лукьянов А. Н. Методические подходы к созданию липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2. Тезисы I съезда иммунологов России 23-25 июня 1992; Новосибирск, Россия.

2. Золин В. В., Колокольцов А. А., Лукьянов А. Н. Изучение возможности создания липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2. Тезисы V конференции РФ «Новые направления биотехнологии» 18-22 мая 1992; Пущино, Россия.

3. Золин В. В., Колокольцов А. А., Бирюкова В. В. Липосомальный человеческий рекомбинантный интерферон альфа-2. Перспективы и применение. Тезисы II научно — практической конференции по генно-инженерным цитокинам 10-11 декабря 1992; Оболенск, Россия.

4. Золин В. В., Лукьянов А. Н., Нестеров А. Е., Колокольцов А. А. Торчилин В. П., Попов В. Ф., Варданян Н. В., Антонов Н. А. Методические подходы к созданию липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2. Вестник РАМН 1993; 2: 29-31.

5. Маркарян А. С., Длин В. В., Золин В. В., Колокольцов A. A. "The efficacy of administration of the liposomal form of recombinant alfa-2 interferon in children with glomerulone phritis (GN) associated with HB-virus infection (HBVI). VII International symposium on viral hepatitis 25-27 января 1996; Madrid, Spain.

6. Маркарян А. С., Длин В. В., Золин В. В., Колокольцов А. А. «Пероральная липосомальная форма рекомбинантного альфа-2 интерферона (ЛРИ) в терапии больных гломерулонефритом (ГН), ассоциированным с НВ-вирусной инфекцией (НВИ). Тезисы I конгресса педиатров - нефрологов России 17-19 сентября 1996; С. Петербург, Россия.

7. Золин В. В., Агафонова О. А., Колокольцов А. А. Создание липосомальной формы человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 и перспективы её применения. VIII конференция «Новые направления биотехнологии» 27-29 апреля 1998; Москва, Россия.

8. Маркарян А. С., Длин В. В., Колокольцов А. А., Золин В. В. Новая пероральная липосомальная форма рекомбинантного альфа-2 интерферона в комплексной терапии больных гломерулонефритом,

ассоциированным с HB - вирусной инфекцией. Российский вестник перинатологии и педиатрии 1998; 3: 25 - 27.

9. Золин В. В., Колокольцов А. А., Агафонова О. А., Бочкова Т. Г. Создание липосомапьного препарата, содержащего человеческий рекомбинантный альфа-2 интерферон. Вестник РАМН 1999; 12:18 - 22.

Ю.Золин В. В., Агафонова О. А., Колокольцов А. А., Даниленко Е. Д., Федосова JI. К., Гамалей С. Г., Омигов В. В., Фадина В. А., Масычева В. И. Изучение противовирусной активности, фармакокинетики и токсических свойств липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека при наружном применении. Вестник РАМН 2001; 5:27-31.

П.Бажутин Н. Б., Золин В. В, Колокольцов А. А., Таргонский С. Н. Перспективы применения липосомальных препаратов в медицинской практике. Terra Medica nova 2003; 3: 17 - 20.

12.Бажутин Н. Б., Золин В. В., Колокольцов А. А., Таргонский С. Н. «Терапевтическая эффективность Реаферона - ЕС - Липинта -отечественного липосомированного препарата рекомбинантного альфа - 2 интерферона при профилактике и лечении вирусных инфекций». «Хорошая клиническая практика - опыт 15-летней работы службы профилактики СПИД в Хабаровском крае». 9-10 августа, 2004; Хабаровск, Россия.

П.Бажутин Н. Б., Золин В. В, Колокольцов А. А., Таргонский С. Н. Перспективы применения липосомальных препаратов в медицинской практике. Здоровье Украины 2007; 3: С.71.

H.Колокольцов А. А., Золин В. В, Таргонский С. Н., Бажутин Н. Б. Терапевтическая эффективность Липоферона липосомального в профилактике и лечении вирусных инфекций. Здоровье Украины 2007; 7: 74-75.

Патент на изобретение:

I. Золин В. В., Колокольцов А. А., Баранов Ю. Н., Длин В. В., Маркарян А. С. Липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения. Патент РФ № 2123328, приоритет от 19.04.96 , опубликован 20.12.1998.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - аскорбиновая кислота;

БОЕ - бляшкообразующая единица;

БОЛ - большие одноламеллярные липосомы;

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека;

ГФ - Государственная Фармакопея РФ;

ЕМС - вирус энцефаломиокардита мышей;

ЖКТ - желудочно - кишечный тракт;

ИНФ — рекомбинантный альфа-2Ь интерферона человека;

ИФА — иммуноферментный анализ;

ЛП - липосомальный препарат;

ЛФИ - липосомальная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека;

ME - международные единицы активности интерферона;

НТД - нормативно - техническая документация;

ОСО - отраслевой стандартный образец;

ЦПД - цитопатогенное действие вируса;

МИБГТ - медицинский иммунобиологический препарат;

МЛ - мультиламеллярные липосомы;

МОЛ - малые одноламеллярные липосомы;

МУК — методические указания;

ОВГВ - острый вирусный гепатит В;

ОЛЛ - олиголамеллярные липосомы;

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция;

ОРЗ - острое респираторное заболевание;

РП - регламент производства;

РЭС - ретикуло - эндотелиальная система;

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита;

ТЕ -титрационные единицы активности интерферона;

ТФ - DL-альфа-токоферол;

ФС - фармакопейная статья;

ФСП - фармакопейная статья предприятия;

ФХ - фосфатидилхолин (лецитин);

Хол - холестерин.

Золин Владимир Викторович

ЛШГОСОМАЛЬНЫЙ ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА -2В ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА

Автореф. ;дисс. на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Подписановпечать21.03.2010. Заказ№/$"Формат60x84/16.Усл. дач. п. 1. Тираж 100экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН ; 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5