Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие липосом различного липидного состава с альвеолярными макрофагами и моноцитами крови человека

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие липосом различного липидного состава с альвеолярными макрофагами и моноцитами крови человека"

'д

На крапах рукописи

лтруз омл!» мухоммед

в:1,\имоде11стиие липосом различною липид! юго.сосгава с альвеолярными макрофагами и моноцитами кропи чклоиека

(И.00.23. г.иотхиологня (>3.<Ш)4. ЬИО'ХИМИЯ

AHToi'i;'i>i:i>Ar

Дисссрсиши на соисклшю ученой cicm:iin ка>|;1)1л:ия химических паук

МОС КВА IVy5 i

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии нм.М.В. Ломоносова

Научные руководители: Д.Х.Н., профессор К.Б.Н., Ст.Н.С.

Селшцева А.Л.

Василенко И.А.

Официальные онпоиенгы:

Д.Х.Н., профессор

Серебренникова Г.А.

Д.Б.Н., профессор

Асгашкни Е.А.

Ведущая организация: Институт биоорганичсской химии им. М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН.

на заседании Диссертационного Совета Д 063.41.01 в Московской Государственной Академии Топкой Химической Технологии ни. М. В. Ломоносова по адресу: г.Москва, 117571. пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова ( 119831, Москва, ул. М. Пироговская, 1) Автореферат разослан-*-"*^-4'-- 1995 г.

Ученый секретар специализированото совета,

Защита состоится-

5" и^нА

—в

I 5

часов

К.Х.Н., Ст. Н. С.

А. И. Лютик

Актуальность проблемы :

Шаимодействие лнлосом с клетками является ключевым процессом, определяющим эффективность действия лнпосом как лекарственных препаратов. В результате такого взаимодействия лроисходятструкгуриые перестройки в клеточной мембране и траисмсмбраиныГшеренос сигнала вовнутрь клетки, что вызывает активацию метаболических процессов клетки в целом. В случае клеток системы моноиуклеарнмх фагоцитов (моноцитов, макрофагов и т.д.) наблюдается резкое увеличение расхода глюкозы, возрастает потребление кислороден образуются такие продукты реакции, как супсроксидный анион-радикал, перекись водорода, гндроксил-радикал, скиглетаый кислород.Сочетание выше перечисленных процессов, происходящих при активации клетки, называют кислородным или респираторным взрывом.

Другой процесс происходящий при взаимодействия липосом с клетками -включение части фосфолнпидов в клеточную мембрану, результатом которого является изменение ее лнпнлного состава и какслсдствис активация биохимпческах процессов внутри клетки.

. Анализ литературных данных показал, что подробно изучены адсорбция и проникновение липосом различного состава в макрофаги животных или культуральпыя линий, и значительно меиьше сведений о влиянии липосом иа процесс кислородного взрыва. Практически отсутствуют такого рода данные для клеток человека. В соответствии с этик одной из задач настоящей работы явилось ичученне влияния лнпосом различного липкдного состава на кислородный взрыв АМ и моноцитов крови человека. В состав липосом вводились такие соединения как 1,2-лиацилглнцсрнк и арахилоиовая кислота, а также смесь эфиров жирных кислот и гашлиочиды. Эти соединения, с одной стороны, обеспечивают большую

Сокращения:. АК-арахидоноиая кислота; АМ-альвеолярный макрофаг; ПАЛЖ-бропхолльвсоляриая жидкость; ГАН-ганглиозиды;ДАГ-1,2-диацилглицер!ш ; ДГГ-дигалактоэшииглицнркды; МГГ-моногалактозилдиглицяриды; НСТ-нитроенний тстразолий; РЭС-ретикулоэндотелиальиая система; СМ-сфингомиелин; ХЛ-хсмилюминисцендня; ФГ-фосфатидилглиЦерин; ФМА-форбол-12- мирисгат-13-ацшат; ФХ-1[юсфаг11Д1(лх<>лин; ФЭ-<|>ос<|>агш1нлзта1Юлам1Ш;ЭЖК- эфиры жирных

К1К.101. .'..'••'•',

зффектинносгь межмембралных а заимодейстнин и результате с]рук 1урных перестроек и, с другой стропы, участвуют » биохимических процессах клеточной регуляции. Эффективность в:инмодсКствия липосом с клетками определяется не только составом ликосом, но и лшшдиым составом клеточных мембран, коюрый можо1 измениться при развитии различных заболевании.

В силу тою, что взаимодействие лицосом изучалось с АМ главным образом больных люден, представлялось необходимым определить их линндиын состав и соносташпь эти данные с результатами исследований но лннцдкому составу АМ здоровых людей. Впоследствии полученные результаты могут быть использованы при разрабо!ке лекарственных препаратов повышенной зффсктивлости на основе ликосом для ингаляции легких. Подводя итог, можно закдючшь, что изучение взаимодействия линосом с альвеолярными макрокодами н моноцитами человека, а также исследование лишшюго состава згих клсток в норме н при патологии надставляет актуальную задачу биохимии и Оно технологии.

Настоящая работа ¡шляется частью плановых исследовании, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В.Ломоносова,но разработке л внедрению новых лекарственных препаратов на основе липосом.

Цель работы. Изучение взаимодействия липосом различного липидного состава с альвеолярными макрофагами и моноцшамн крова человека.

В соответствии с.этим решались следующие задачи;

- определение лишщиого состава АМ человека, а также БАЛЖ в норме н патологии.

- изучение влияния липосом различного липидного состава на разшпие кислородного взрыва в АМ человека;

- сопоставление действия липосом различного липидного состава на индукцию сунероксндного радикала в альвеолярных макрофагах здоровых людей и больных с различными заболеваниями органов дыхания;

- изучение влияния лииосом различного липидного состава на индукцию супероксидного радикала в моноцитах кровн человека.

Научная новизна..При анализе липидного состава АМ человека в суммарном экстракте наряду с фосфолшщдами впервые выявлено наличие еще и гликолииндов. Идентификация одного из них методами ТСХ, масс-слектромстрии и ЯМР позволила приписать ему строение моногликозилдиглицерида. Его

з

содержание существенно снижайся при развитии различных заболеваний органон дыхания но сравнению с нормой.

При исследовании действия лнносом, содержащих 1,2-ДАГ, АК, ЭЖК, ГЛН использовали AM и моноциш крови человека.

Анализ концентрационной зависимости покатая, что ЛК и ДАГ оказывают активирующий эффект в микромолярных концентрациях, что сиидс[ельстиует в пользу механизма их действия в качестве вторичных мессенджероп.

Практическая ценность работы. Полученные в ходе работы результаты могут являться основой при разработке лекарственных препаратов, которые могут применяться как средство для ингаляции при заболевании органов дыхания.

Изучение взаимодействие лнносом различного дииидного состава с AM н моноцитами крови человека необходимо для понимания механизма действия лнносом в органично человека при использовании их как лекарст наших препаратов.

Определен лшшднын состав AM человека в норме и при патологии, чю может бмп, использовано при диагностике различных заболеваний легких.

На защиту вынесены следующие положения диссертации :

-Результат анализа лштдною состава AM человека п норме и при наюлогии.

-Изучение эффекта взаимодействия лнносом различною линидного состава с моноцитами крови и AM человека.

Апробация: Результаты исследования были доложены на VI симпозиуме но биохимии лииидов (Саикт-ГкчербурКоктябрь,1994). The 3cd liposome research days conference (Canadajune, 1994), Пятом национальном конгрессе болезнен органон дыхании ( Москва, март, 1995).

Публикация: По материалам диссертации опубликовано 1 статья , 5 тезисов докладов па конференциях.

Обьеи и структура работы:.. Диссертация состоит из следующих раздело»: введение, лнкрл lypiii.iii о6>ор, жеиериментальнаи Часть, результаты и их обсуждение, выводы, список ли icpa туры.

Работа щдожена на —.......-.......включая -- таблиц,— рисунков. Список

ли 1<.р;1 туры состоит III —■-— -ссылок. ...

. Материалы и методы.

Для выделения ДМ использовали КАЛЖ 5 здоровых людей н 25 больных

различными леч очными заболеваниями. АМ выделяли из БАЛЖ путем

последовательною четырехкратного центрифугирования: сначала в среде

Хепкса,потом в растворе фикола плотностью ],077 г/мл, далее в градиенте

иеркола(1,13;1,077 ;1,043 г/мл) и вновь в растворе Хснкса. Полученный таким

образом препарат клеток содержал 95% АМ.

Моноциты крови человека выделяли путем центрифугирования

лейкоцитарной массы в растворе фикола плотностью 1,077 г/мл. Из центрифужной

пробирки отбирали фра к кию,со держащую В-.Т-лнмфоциты и моноциты,»

разливали в чашки Петри.Клетки инкубировали в среде RPM1 1640 в

инкубаторе в течение 16 часов. Моноциты смывались со дна чашек Петри, к

полученная фракция имела чистоту 95% .

Определение образования сунероксидного анион-радикала в процессе

кислородного взрыва в моноцитах проводили с помощью красителя НСТ. Метод

основан па том,что краситель проникает в клетки н восстанавдЛнается до

(¡юрмазана сунероксщшым радикалом, который образуется при актнвации-

моноцитов. Сравнивали восстановление НСТ в присутствии и отсутсвпе ряда

i-i

активаторов: а)ФМА ; б) ионофора Са А23187 ; в) ФМА и ионофора

одновременно^) лнносом различного лннидного состава.

Для получения липосом водные дисперсии ФХ íuiu смеси ФХ с другими

компонентами в концентрации 7,5 мг/мл, обрабатывали на ультразвуковом

дезинтеграторе (УЗДН-2Т).

Помимо ФХ в сост ав липосом входили : А. ДА Г (2% по весу); Б. препарат,

содержащий 40 % ГАН спинного мозга ; D. смесь эфиров жирных кислот

растительного происхождении (2% но весу),Д. АК (2% но весу).

Взаимодействие липосом с АМ регистрировали методом люмннол-

заиисимой хсмшшмннисдешшн. Эксперименты проводили на хемнлюмннометре,

подключенном к монитору, при длине возбуждения 350 им и испускания 450 им.

В инкубационную ячейку, содержащую 1 мл раствора Хенкса, вносили

сначала 1 миллион АМ,инкубировали их в течение 3 мин при 37 С, затем 5 мкл

люмииола (конечная концентрация 5.10 М).Определяли базовый уровень

-п

люминисценции, затем вносили различные активаторы: ФМА (10 М),ионофор Са А

-ь

23187 (10),нли липосомы различного липадного состава .

Лмлилм in ЛМ экстрагировались но методу Фолча. Анализ липндншо состава проводили метолом ТСХ на пластинках с чакре »лепным слоем cu.i к ка t c;i я (Merk,Германия) в следующих системах растворителей: А) хлороформ - метанол-пода 65.25:4 ; К) хлороформ- метанол -8 % СаС1г60:35:8 ; В) хлоро<|юрм - ацетон -метанол 8:1:1.

Для определения класса,к которому относятся вещества,входящие в состав фракции полярных липидмп из ЛМ,пластики после окончания хромато|рафировання высушивались и окрашивались различными специфичными реагентами: молибденовым сипим (реактив на фосфоросодержащие соедш1сш1*);1Ш11П1лрин (на аминогруппы); раствор резорцина (на соединения,содержащие углеводы).

Количественную оценку содержания лииилов в ixcipaKie из AM получали методом лснснтомстрни на фо годенснгомстре CaMag TLC scanner М (Швеция).

Для анализа содержания 1|*>сфора в некоторых соединениях,входящих » состав .полярной фракции лннидои АМ.иснользопали метод Наськоиского.

Для идешифиглиии строения соедииеннн.ммоироплнш.и с хрома-юграфнческих цластпцок растиором длороформ-ксчанола.испо.тмоналн - меюды ^¡-ЯМГ-спеюромефйи OlMI'-tncKipoMcip Briikcr MS1.-200 (Германия)) и илачменно-дсСорбцнотгои масс-снек ipoMcipiiii па ядрах калис|к)р|тя-252 (НПО " Ьиолар")(Укранна)!

С'|атнс|нческая обраГмнка резулыа юл проводилась с помощью ларамстрическою t-кршсрмя СЧмодеЩа. Ja доо оперные нршшмались различия па чроине У5% (р<().(>5). Рассчн/ылалмсь средние арифметические значения (М) п зна.чення ctaiuapimuí ошибки (мМюдучспмс п 3-4-х различных зкенернменгак.

Соеднпення ucuoм'¿^„t*Д*».J^yt;' РУЦП*»?»'."".'!!

-lIpenapai.i'o/wpvKa'mHH 40% ГЛ1! и <">()'/» <1>Х, выделенный ич сшитого мо и ».выпускаемый Харьковским заводом "Пио.чек",Украина).

-ДАГ, полученный iiyicM порлПотки яичного <1>Х (]юс<)юл1И1лзой С из ИасеИцчсекчи (11С. 1.1.4.3) .(95% чист.им).

-Смеет, лиловых и|трон жирных кисло! (нрснпр>п"1>ш>Г10лисн"Мш(сК010 i.iHo.j,i,i;c.iop\cuin).Смесь YjiiiptiH содержи!: I I.57Í» 'и|шром плльмпiипонои кислот ы, ?)"'. (фирои олсинппон кис.кчьг п 2JÁ apaxiiTommoii mc.'iuiu.

'I>X про»•и'.о.кчиа Харьковскою шюда "(>ноле1",Украина.(К5% чпетош).

-АК ( Sii;ma) ('<№'•'. 'iiícioiuJ

Основные результаты работы и их обсуждение.

П рамках настоящей работы изучалось взаимодействие лнносом различного лнпидного состава с клетками человека. I! состав линосом нз ФХ вводили вюричиые мсссенжеры; 1,2- ДЛГ и арахидоновую кислоту, способные активировать биохимические процессы в клетке, а также галглноэнды, которые благодаря отрицательному заряду облегчают взаимодействие линосом с клетками. Для оценки э<1>фсктипности действия лниосомалышх препаратов в качестве теста использовали их влияние на индукцию сунероксидиого радикалов в процессе развития кислородного взрыва в двух типах клеток легочной ткани : в альвеолярных макрофагах и моноцитах человека. Эксперименты проводились на клетках, выделенных из крови и бронхоальвеолярной жидкости здоровых и больных различными эоболсваинямн органов дыхания, в связи с этим параллельно изучали линидиын состав АМ больных и здоровых людей.

Предполагается, что в ходе проведенных исследований будут выявлены наиболее эффективные линидные составы, которые впоследствии могут- стать основой для разработки лекарственного ингаляционного препарата на основе лнносом.

1. Анализ состава хлороформого экстракта,полученого из БАЛЖ и альвеолярных макрофагов здоровых и больных людей.

Из литературных данных хорошо известен фосфолипидный состав смыва легких человека физиологическим раствором так называемой бронхеальвеолярнон жидкости, который содержит 75 % ФХ. При развитии многих заболеваний органов дыхания фосфолипидный состав БАЛЖ существенно меняетсяходержание ФХ падает, а сфингомиелина возрастает. Аналогичных данных о фосфолшшдном составе отдельных клеточных элементов легких человека крайне мало.Поэтому задачей первого этапа работы явился анализ лицндного состава экстракта из АМ в норме и при патологии.

Результаты анализа липидов, выделенных из АМ и БАЛЖ здоровых и больных людей, суммированы в табл.1, из которой следует, что содержание фосфолипндов в макрофагах сильно отличается от такового в БАЛЖ. ■ Следует отметить; что результаты но БАЛЖ хорошо совпадают с литературными данными. Содержание фосфолипндов в АМ практически такое же,как в других клеточных и субклеточных фракциях, в которых количество ФХ достигает 40-45 % и СМ-' 5-7 %.

Анализ хроматографическнх данных по составу липидов АМ показал,что наряду с выше перечисленными фосфолипидами, холестерином и жирными кислотами в экстракте присутствуют еще два вещества, обозначенных в табл.! как

X и У. Ош1,во-первих,ис окрашиваются молибденовым снннм,и,во-вторых,в системе Л имеют хроматографическую подвижность.близкую к моногалактозилдилппщериду (МГГ) и днгалактозилдиглниервду

(ДГГ),выделе1ШЫИ из пшеничной мукн.Одной нз задач данной работы явилась идентификация вещества У.

ТЛБ.(1).Липндный состав альвеолярных макрофагов и БАЛЖ больных и здоровых людей. ___

1 Макрофаги ВАЯК

|Липиды!Здоров Бронх. Астма Пневм. Здоров¡Бронх. ¡Астма Пневм.

|ФХ 38+40 34+1.0 37+1.5 32+3.0 76 153+5.0 ¡40+6.0 |57+5.2

¡ФГ }10±1.7 7.0*1.3 6.0+1.0 8.0+1.5!11 ¡5.0+2.3|4.6^1.1(4.112.0

;ФИ 17.5*2.0 ¡8.0*1.0 9.0+1.1 7.0*1.3 2.6 ¡13+2.0 !16*2. 2 ¡4.6±1.8

|ФЭ ¡17.3t3.Oi 13*1.0 16+1.3 13И.5 ¡3.2 ¡13^7.0 ¡22*3.0 9.0г2.5

¡см ¡ю±г.о 8.011.0 7.Ой 1.1 8. 0г1 Л) 2.2 \7.0ta.0\6.0t2.5\4.0iZ.b

|Л-ФХ (4.311.0 10*2.0 11;1.б ¡ЮН.8 ¡0.7 ¡4.012.7¡4+0*2.4! 1.3+2.2

6.342.0 ¡10*0.6 9.5+1.0(9. 5±1.1 1 — ¡6.0;1.5|6.0М.7(11±2.1

6.411.0 ¡3.4+1.1(3.4+1.б|2.2*1.51 — ¡l-4i2.0j2.4tl Л ¡3.8+1.5

Р<0.С£,п 4-12 ,* литературные дзннне.

В первую очередь был проведен анализ иа наличие в молекуле данного соединения атомов фосфора по методу Банковского,который дал отрицательный результат. В сочетании с отсутствием сшгсго окрашивания данного вещества на хроматографической пластинке при обработке молибденовым синим этот результат позволяет сделать однозначный вывод о том,что соединение У не относится к классу фосфолипндов.

Для идентификации структуры вещества У использовались : 1 .\{-ЯМР-спекгроскопия; 2. Плазмеино-десорбциоииая масс-спектрометрм на ядрах калифорния-252; 3. Специфичный окрашивающий реагент па углеводный компонент-раствор резорцина.

Для У(-ЯМР спектроскопии использовался раствор вещества У в хлороформе, полученный при . эл к) про нации с хроматографической пластинки экстракта нз АМ на уровне свтсдетсля - МГГ. На рнс.1 представлен весь Н-ЯМРспектр синтетического моногалактозиддиглнцерина (А) и его часть при большем увеличении в области 6-3 м.д. ( Б), а также весь Ь-ЯМР-спектр вещества У (В) и сю часть в области 6-3 м.д.(Д).Ясно видно хорошее совпадение формы спектров в области 1-2 м.д.,где легко идентифицируются сигналы протонов- СН2и-СН, групп, что позволяет отнести исследуемое соединение к классу липндов, а также п области 5-4 м.д., где наблюдаются сигналы ог протонов при аномерном центре .в .МГГ.Одйако ыЬжюЬеп.,• иитсрирст» дли спектра в данной области

Рис.1

СРЖГРЫ -ЯМР -8-

ГГ р

4

(ррт)

в

I ч ' |-Г 'Г

в

"1-1-1-1-1-1-1—г-

5

4

(ррт)

-1—|—1—г-3

Ь

Ад.

-г-г-г-т

4

(ррт)

ЧдЦ/

-1-1-1-1-1—"I ■ I—р-

4

(ррт)

I—I—I

3

A. 1,2-дистеароил (6,6,7,7,8,8- Н^)-3-0_С В -^-галактопиранозил)-Гаь-глииерип Б. спектр А в области 3-6 м.д.

B. вещество У

П опвпксп У г>пру"тчп п п^лягти 3-6 м.п

заключается в то и, что здесь имеются также сигналы от протонов глицеринового скелета, которые есть и в фосфолипидах и в гликолннндах. Поэтому представлялось необходимым нспользовап. дополнительные методы идентификации.

В качестве одного из них был выбран метод масс-спектрометрнн на ядрах калифорння-252,лля которого также использовали хлороформный раствор вещества У, полученный смывом с пластиики.На рис. 2 приведены спектры свидетеля -сншегического МГГ (Л) и вещества У (В).Последний ник относится к массовому иону, химическая формула и молекулярная масса которого приведена в табл.2. Сопоставление данных таб.2 но синтетическому МГГ и веществу У убедительно свидетельствуют об одинаковом характере фрагментации молекул МГГ и вещество У.

И наконец,хлороформный раствор вещества У был исследован методом ТСХ в системе Л и В. В качестве свидетелей использовали сиитстический MIT и природный МГГ, выделенный из- пшеничной муки. После хроматографирования пластинка была обработана раствором резорцина, при этом пятна, соответствующие веществу У к гликолинидам-свидстелям, окрасились в розово-коричневый цвет.

Совокупность полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что в хлороформном экстракте из АМ наряду с фосфолинндами присутствует ранее невыделенный класс лниидов, одним из представ» гелей которого является моноглнкозилдигллцерид (вещество У).

Сопоставление лшшдного состава АМ здоровых и больных люден проведено на основании результатов, представленных в табл.1. Согласно данным эюй таблицы,качественный состав лилидов в норме и при патологии одинаков, но наблюдаемся некоторые отличия в количественном соотношении линидон. Так, например, при патологии значительно (в два раза), возрастает число лизо<1юсфолигшлов по сравнению с кормой, при этом несколько снижается содержание ФХ и ФГ. Существенные изменения отмечены для мопоглккозилдигликерида и нсидеитифнчированного соединения X. При развитии натоломщ количество первою уменьшается, а количество второго- увеличивается.

Наблюдаемые, изменения лшшшого состава АМ демонстрируют консервативность состава. Анализ литературных данных позволяет сделать вывод о юм, 410 подобные мембраны обладают также консервативностью структуы. Все изменения :_/обеспечивающие лшглучпше результаты и. эффективность .взаимодействуй с ji.iiiiocoMaMii[ Должны 'нроволигься'п лийосомах. С нате» точки

МАСС-СПЕКТР

1,2-Дм- (6, б,7,7,в.в-гёсадейтеросхеароил-з-о- (ß-D-галаютопиравоэия) - гас-глицерина лилия N

tu -

400 ■

300 ■

ZOO ■

lOO ■

ш

W-

лнл

. F*.

tu.

**

2Й • TO - «О S» W M 80« »fl 1« M/i

ВЕЩЕСТВА У, аэделегшого из альвеолярных макрофагов .человека

lanta

200 ■

ISO

100

липмд

г •

ш

УЛА

М

.

эт. ?

^ . Г

-г—-. ,

МП

i

I ■ l i1 г ■ | ' I 1 '

: 1КЮ

г/АСС-СГЕКТР

| Фрагмент МЗССЗ I!~НЯ

[ ЕещестЕа У расчетная по спектр.

(М) &,,н„ою 758 ----

1_ М + Na* 791 781.4

I с«н<,0. 565 559. г

267 267.0

С<Н„0 265 260.8

с*н,,о 287 281.2

С,.Н..Д. Ns* 3S2 333.3

Слктет. !\СТ расчетная по спектр.

(М> CWH^O*, 799

l'M\ J-Mn* v.w 921 821.0

919 " 519.0

273 273.7

Сг, H«r В/ 0» 253 347.4

CH^OH

L_a o-cHi

itfe* I ' ш

HCOCOß, 1 ' , нрсод,

зрения наилучшие результаты должны дать добавкки веществ -вторичных мессенжеров: ДА Г, полиеновых кислот, а также галглиозидов.

Поэтому следующий этаном работы явилось изучение взаимодействия линосом различного лишшюго состава с АМ и моноцитами крови человека.

2. Влияние лилосом различного лииндного состава на образование супероксвдного радикала в альвеолярных макрофагах человека.

I? качестве тест-системы для определения эффективности действия липосом на клетки и ткань легких было выбрано взаимодействие А.М легких с липосо^ами различного линндпого состава. При инкубации липосом с АМ происходила активация кислородного взрыва, в ходе развития которого образуются первичные метаболиты активированного кислорода различной природы. Для их регистрации исспользовался метод люминол-зависнмон хемилюминисценции.

На рнс.З представлена интенсивность хемилюминисценции (ХЛ) люмшгола

при инкубации с АМ человека (контроль) и при добавлении к ним различных

»•г

активаторов, таких как: ФМА; иопофор Са А23187; липосомы различного липидого состава. В контроле, т.е. в отсутствие активаторов, сами по себе АМ вызывают слабую хемилюминисцеицию люмшюла,равную 300* 20 щВ, Она возрастает при добавлении различных активаторов (рис.3). Эффект липосом зависит от концентрации: сначала при увеличении концентрации липосом величина хемилюминисценции возрастает , но при достижении значения ФХ 500-600 мкМ -надает (см.рис.4).

Аналогичным действием обладают липосомы, в состав которых помимо ФХ вводили 2 % смеси эфиров жирных кислот, содержащей арахндоновую кислоту. В настоящее время арахидоновая кислота рассматривается как вторичный мессенджер, добавление которого должно активировать процессы метаболизма. Однако из-за ее способности быстро окисляться сначала попробовали использовать арахидоновую кислоту в виде сложного эфира. Прн этом предполагалось, что под действием имеющихся в клетке гидролаз образуется свободная арахидоновая кислота. В случае АМ это предположение не оправдалось, т.к. липосомы, содержащие эфиры жирных кислот, оказывали на АМ эффект, близкий по величине липосомам из ФХ во всем исследуемом диапазоне концентраций (см. рис.4).

Напротив, введение арахидоновой кислоты в липосомы в концентрации 2 % от веса ФХ, в два раза увеличивало образование первичных метаболитов нктшшронанного кислорода во всем диапазоне исследуемою интервала

Интенсивность ХЛ. мВ

1. Контроль; 2. ФМА; 3. Ионофор Са2* А23187; 4. Липосомы (ФХ); 5. Липосомы (ФХ +' ЭЖК); 6. Липосомы (ФХ + ДАГ); 7. Липосомы (ФХ + АК); 8 Липосомы (ФХ + ГАН).

Рис. 3 Интенсивность ХП люминола при инкубации с альвеолярными макрофагами человека а отсутствие (контроль) и в присутствии различных активаторов. Р<0.05; п. 4-10.

Интенсивность ХП, мВ

Рис. 4 Интенсивность ХЛ люминола при инкубации с

альвеолярными макрофагами человека при добавлении различных концентраций липосом следующего состава: © - Липосомы из ФХ; □ - Липосомы из ФХ и ЭЖК; С, - Липосомы, содержащие ФХ и ДАГ; X - Липосомы, содержащие ФХ и ГАН; С) -Липосомы, содержащие ФХ и АК

концентрации. Следует отмстить, что сам характер концентрационной зависимости не менялся; при больших копнен грациях лшюсом, содержащих арахидоновую кислоту, также как и в случае ФХ, наблюдалось уменьшение эффекта.

Лналогичнос действие окатывало введение в состав лшюсом еще одного гидрофобного вторичного мсссенджера -1,2-ДЛГ. Содержание его и лшгосомах нт ФХ составило щкже 2 %. Как следует из рнс.(З), введение 1,2-ДЛГ оказывало активирующий эффект, но величине близкий арахидоновон кислоте; такой же •)(|м|юкт оказывали и ГАН.

Изучение влияние янносом различного лшпишош состава па образование первичных метаболитов активированного кислорода проводили па ЛМ, выделенных из БАЛЖ 25 больных с хроническими обструктивнымц заболеваниями органов дыхания.

Результаты, полученные па АМ больных с различными хроническими обструктввиыми заболеваниями легких, представлены на рис.5. Из пего следует, что линосомы увеличивают величину хемплюмшшецешши люмннола на 20-50 % но всех подгруппах больных вне зависимости от нша заболевания и в котролмюн группе. 'Згот результат был получен в 80 % исследований.

Наряду с линосомами в данной работе исследовали действие ФМА на

образование первичных продуктов метаболизма кислорода в АМ. Сопоставление

4 - Ч

действии различных коштешрацин ФМА от 10 до 10 М позволило выявить э<|к|!скгинную концентрацию ФМА, равную 1(Г М. Полученные результаты представлены на рис.5, coi ласно которому воздействие ФМА на АМ отмечалось только в группе больных с хроническим обструктивным бронхитом. В других группах больных и в контрольной группе ФМА не оказывал какого-либо эффекта.

Для объяснения этого явления следует сказать,что хотя ФМА и линосомы в принципе действуют на один участок метаболических процессов клетки, а именно на протснкиназу С, пути их действия различны. Для липосом это сложный многостадийный путь через активацию цикла фосфзтидшпшозитов н образование 1,2-диацшшшцерина,который в свою очередь активирует протенпкиназу С. Для ФМА этот путь сокращается до одной стадии - непосредственной активации протеинкнназы С.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что липосомы различного липндного состава активируют образование первичных метаболитов кислородного взрыва в АМ людей. Изменение функционального состояния АМ под влиянием липосом может быть одной из причин фармакологического эффекта лшюсом, о котром упоминалось ранее.

ш s

Д

t> о г a £

0 X

e

1 s

III

IV

- Ф M A; (==j - ЛнпосомыФХ; WZ,I - ЛипосомаФХ и ЭЖК;

- ЛипосомаФХ и ДАГ; - Л и п о с о мы Ф X и АК.

Рис.5 Влияние различных активаторов на интенсивность ХЛ люминопа при инкубации с макрофагами человека б норме и при различных паталогиях. I. Норма; К. Астма; III. Пневмония; IV. Хронический бронхит.

3. Взанмодейстне лшюсом различного лннидного состава с моноцитами крови

человека.

Моноциты кровн являются предшественниками ЛМ, в связи с чем представлялось интересным сопоставить эффективность действия липосом различного лннидного состава на активацию кислородного взрыва в этих клетках.

Результаты исследований взаимодействия моноцитов с лнпосомами представлены на рис.6, из которого следует, что в отсутствие различных активаторов уровень образования супероксндного радикала мал, и не наблюдается образования формазаиа, Добавление ФМЛ и ионофора сопровождалось существенным увеличением образования формазаиа, причем эффект иоиофора не превышает воздействие ФМЛ для данного типа клеток,а их совместное действие ие носит аддитивного характера.

При инкубации - липосом из ФХ с моноцитами наблюдается усиление образования сунерокеидного ' радикала. Действие липосом зависит от концентрации : при увеличении концентрации ФХ от 90 до 300 мкМ эффект действия увеличивается, достигает максимума и при дальнейшем росте концентрации (свыше 600 мкМ) уменьшается (см.рис.7).

При введении 1,2-ДАГ (2 %) в лнпосомы из ФХ характер концентрационной зависимости не меняется, но значительно возрастает величина эффекта. Сопоставление эффекта действия активаторов и лшюсом различного лннидного состава «оказало, что в области максимума 1,2-ДАГ усиливает образование сунероксидного радикала в большей степени, чем при совместном воздействии ФМА и нонофора.

Добавление в лииосомы из ФХ малых концентраций ганглиозидов (4 %) практически не сказывается на характере и эффекте воздействия, который был идентичен воздействию липосом из ФХ (данные не * приводятся). Однако при увеличении концентраций ганглиозидов до 8% появляется активирующий эффект, аналогичный тому, который оказывает 1,2-ДАГ (рис.7).

При введении в липосомы рмеси эфиров жирных кислот наблюдали активирующий эффект, по величине равный липосомам нэ ФХ.

Итак, при сопоставлении действия липосом различного липидного состава на образование супероксидного радикала в моноцитах человека изученные вещества располагаются по эффективности в следующей последовательности : ФХ = (ФХ + ЭЖК) < (ФХ+ ганглиозиды) < (ФХ + 1,2-ДАГ)

1 з » 4 « • I I активатор

Рис.6 Оптическая плотность раствора НСТ, инкубированного с моноцитами крови человека ( 3 миллиона клеток) в контроле(1) и в присутствии следующих активаторов: 2 - ФМА; 3 - ионофора А23187; 4 - сочетания ФМА и ионофора; 5 - липосомы из ФХ; 6 - липосомь» из ФХ, содержащих ЭЖК; 7 - ДАГ- содержащих липосомы; 8 - липосомы из ФХ, содержащих ГАН. Р<0.05; п. 4-10.

Рис. Т Оптическая плотность раствора НСТ, инкубированного с моноцитами крови человека при добавлении различных концентраций липосом следующего состава: « - Липосомы из ФХ; в - Липосомы из смеси ФХ и ЭЖК;Х - Липосомы, содержащие ФХ и ДАГ, 4 - Липосомы, содержащие ФХ и ГАН.

Несколько неожиданный эффект бьм получен при изучении совместного действия ФМА и липосом различного лкпидного состава, который представлен на

а «о это е» соо "tW ...

Рис. 8 Оптическая плотность раствора HCT, инкубированного с моноцитами крови человека в присутствии ФМА при добавлении различных концентраций липосом следующего состава: ♦ - Липосомы из ФХ; а. -Липосомы, содержащие ФХ и ДАГ; я - Липосомы. содержащие ФХ и ГАН. человека в присутствии липосом пз ФХ наблюдается очень незначительная активация образования супероксидного радикала при добавления лишь больших концентраций липосом. Для липосом, содержащих ганглиозвды и 1,2-ДАГ, эффект совместного действия с ФМА был значительным, ио наблюдался он в области больших концентрации липосом (600-900 мкМ).

Согласно литературным данным, липосомы го ФХ сами по себе оказывают фармакологический эффект и могут быть использованы как ранозаживяяющее средство при пулевых ранениях и операционных ранах легких. В последнем случае установлено, что введение ДАГ в состав липосом значительно повышает эффективность действия препарата.

Относительно механизма действия липосом как лекарственных препаратов высказано несколько гипотез. Согласно одной из них при введении липосом из фосфолипидов в ткань или орган происходит понижение уровня перекисного окисления лнпидов, которое активируется при развитии многих типов патологий. Согласно другой гипотезе, введение липосом в больной орган или ткань сопровождается восстановлением уровня липвдов до иативного, т.к. при развитии патологии содержание липпдов в ттаии , как правило, уменьшается. Результаты, приведешше в данной работе, указывают на иной механизм фармакологического действие липосом-через активацию клеток при ига взаимодействии с дипосомами.

Введение в состав липосом вторичного мессенджера 1,2-ДАГ значительно усиливает процесс образования супероксидного радикала, что может быть обусловлено действием 1,2-ДАГ на различных этапах процесса взаимодействия

"клетка-липосома". На первом этапе на стадии адсорбции 1,2-ДЛГ способе» облепить этот процесс за счет того, что он является эффективным модификатором мембран и сильным сливающим агентом. На следующем этапе, когда липосома либо попала в клетку,либо частично встроилась в ее мембрану, 1,2-ДАГ может активировать процессы метаболизма клетки на молекулярном уровне через активацию цротеинкинаэы С.

Результаты взаимодействия липосом, содержащих ганглнозиды, с моноцитами крови человека, согласуются с литературными данными, поскольку отрицателыюзаряженные линосомы как правило легче взаиодейсгвуют с макрофагами различных типов. Можно предположить,что наличие в молекуле ганглиозидов остатков сиаловых кислот облегчает первую стадию взаимодействия "клегка-липосома".

Виводи

1. Показано,что в АМ человека наряду с известными фосфолиши^ами присутсвуют гликолипиды, один из которых является моиогликозилдш лннеридом. Обнаружено, что при развитии легочной патологии содержание глнколинидов изменяется в зависимости от состояния организма.

2. Установлено, что линосомы различного лшшлного состава активируют образование первичных метаболитов кислородною взрыва в АМ и моношпах человека, причем наиболее эффективно действуют линосомы, содержащие 1,2-ДАГ" иАК.

3. Показано, что зависимость образования первичных метаболшов активированного кислорода от концентрации линосом различною лниидною состава, имеет нелиценний характер для обоих типов клеток.

4. Активация кислородного взрыва в АМ и моношпах под влиянием липосом может бып> одной из причин их фармаколотческого дейсшля.

Список работ, опубликованных но кме диссертации:

1. Атруз . О.М.Сорокоумопа Г.М.Се.тшиева Л.Л.Василенко И.А.Взаимодсйствнс моноцитов крови человека с лшюсочямн из фосфатидилхоиина,содержащими п своем сосите друше пшм липидовЛ V! Симпозиум по биохимии лииидов. Санкт-Пс1србур|«. ?-(> окшбря, №4.

2. Сорокоумона Г.М, Агру» О.М, Селшцева А.А, Василенко И.А. Изучение лннилного состава альвеолярных макрофагов человека в корме и при патологии.// VI Спмшущум но биохимии лнпидов. Санкт-Пе тербурте, 3-6 октября, 1994.

.4. A.A. Selishcheva , O.M.Atrouse, G.M.Sorokoumova, l.A.Vasilenko. The interaction of human blood inonocyles with 1,2-diacylgIyceroI-containing pliosphaliclylelioline liposomes.// The 3ed liposome research days conference. Vancouver,British Collumbia,Canada,June, 1994.

4. О.М.Атруч, A.A.Селшцева, Г.М.Сорокоумова, И.А.Василенко, С.Р.Орлов. Индукция кислородного взрыва в моноцитах крови человека липосомами различною нтшдного состава.// Биохимия, 59, 1995.

5. O.M.Aipyj, Г.М.Сорокоумопа, А.А.Селшцева, И.А.Василенко. Особенности лннилного сосгава альвеолярных макрофагов здоровых и больных людей.// Пятый национальный конгресс болезней органов дыхании. Москва, март, 1995.

6. О.М.Лтруз, Г.М.Сорокоумова, А.А.Селишева, И.А.Василенко. Взаимодействие альвеолярных макрофагов человека с липосомами при различной наюлогии легких человека.// Пятый национальный конгресс болезней органов дыхания. Москва, март, 1995.