Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липидный бислой и небислойные структуры в организации и функционировании биологических мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Липидный бислой и небислойные структуры в организации и функционировании биологических мембран"

На правах рукописи

ТАРАХОВСКИЙ Юрий Семенович

ЛИПИДНЫИ ВИСЛОЙ И НЕБИСЛОИНЫЕ СТРУКТУРЫ В ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино 2003

Работа выполнена:

в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, проф. Л.С. Ягужинский Доктор физико-математических наук Д.П. Харакоз Доктор физико-математических наук Ю.А. Ермаков Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится « 2003 г. в /54==

на заседании Диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Автореферат разослан » (£¿17. 2003г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Ланина Н.Ф.

йооз-А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Природные липиды способны образовывать разнообразные структур^ в зависимости от рН, ионной силы, температуры и других факторов. При этом липидный бислой, наиболее хорошо изученная составляющая биологических мембран, является лишь одной из известных фаз - а именно, ламеллярной фазой, наиболее полно отражающей наши представления о барьерных свойствах мембран. Однако все разнообразие функций биологических мембран связано с процессами временного и локального разрушения-восстановления бислоя в таких явлениях, как: трансмембранный перенос метаболитов, секреция белков, обмен генетической информацией между клетками, внутриклеточная доставка различных компонентов, эндоцитоз и экзоцитоз, клеточное деление, слияние клеток, бактериальная инвазия, вирусная инфекция и многие другие. Все эти процессы сопровождаются разнообразными видами межмембранного взаимодействия и слияния мембран при которых происходят изменения фазового состояния липидов. Такие кооперативные структурные перестройки в мембранах называются фазовыми переходами.

Два обширных и сильно отличающихся по физической природе типа фазовых переходов липидов привлекают особое внимание исследователей. Во-первых, это процессы плавления липидов, способные вызывать разделение твёрдых и жидких фаз, приводящее к латеральной сегрегации компонентов в плоскости мембраны. Во-вторых, это полиморфные фазовые переходы липидов, в результате которых могут образовываться такие небислойные структуры, как кубические или гексагональные фазы.

Биологическое значение обоих явлений чрезвычайно велико. В живых клетках гомеостатически поддерживается такой состав липидов, при котором, в интервале температур, характерных для жизнедеятельности данного организма, липиды находятся в расплавленном состоянии, при этом существует возможность возникновения полиморфных фазовых переходов

Принятые сокращения:

Природные липиды и их синтетические аналоги DGDG - дигалактозилдиглицерин MGDG - моногалактозилдиглицерин PG - фосфатидилглицерин DOPE - диолеилфосфатидилэтаноламин DOPC - диолеилфосфатидилхолин DMPC - димиристоилфосфатидилхолин DPPC - дипальмитоилфосфатидилхолин

Синтетические катионные липиды E-DOPC - этил-диолеоилфосфатидилхолин DOT АР - диолеилтриметиламмоний пропан ТТМА - татрадецилтриметиламмоний бромид DC-Choi - диметиламиноэтанкарбамоил-холестерин

Методы исследования ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия КД - круговой дихроизм

ЯМР - ядерный магнитный резонанс _________

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ] БИБЛИОТЕКА j С.Петербу^г ,/. J 1 ОЭ мЫ^\

В последние годы интерес к исследованию свойств липидов особенно возрос в связи с широким использованием липосомальных препаратов в медицине и, прежде всего, в генной терапии. Возникла практическая необходимость создания липосом, содержащих генетический материал или лекарственные вещества и способных активно и избирательно взаимодействовать с поверхностью определённых клеток-мишеней, проникать в цитоплазму и там освобождать биологически активный агент. Создание молекулярных машин, способных выполнять столь сложные и многостадийные операции, моделирующие явления живой природы, невозможно без глубокого и всестороннего изучения всего разнообразия физико-химических свойств липидов, которые, наряду с белками, полинуклеотидами и полисахаридами являются венцом биологической эволюции молекул.

Цели и задачи исследования. Целью представленной работы было изучение структурной организации различных фаз липидов, как в модельных системах, так и в живой клетке. Мы ставили следующие задачи исследования фазового поведения модельных систем:

■ Роль электростатических взаимодействий в регуляции полиморфного поведения липидов.

■ Влияние больших амфипатических молекул, например молекулы хлорофилла, на полиморфное поведение различных липидов.

■ Роль процессов перекисного окисления липидов в регуляции фазового поведения мембран. Структурные изменения в комплексах цитохром с - кардиолипин.

■ Физико-химические свойства комплексов белков или ДНК с различными липидами.

Закономерности, обнаруженные в модельных системах, были рассмотрены также на примере клеточных мембран. При этом ставились задачи исследовать:

■ Структуру и динамику изменений межмембранных контактов в зонах адгезии внешней и внутренней мембран грамотрицательных бактерий.

■ Влияние двухвалентных катионов на полиморфизм мембран грамотрицательных бактерий и проникновение ДНК в цитоплазму.

■ Роль мембранных процессов в инфецировании клеток Escherichia coli фагом Т4.

■ Изменения структурной организации клеточных мембран при взаимодействии с катионными липосомами.

Научная новизна.

■ Впервые обнаружена возможность контроля полиморфного поведения липидов, основанная на регуляции электростатических взаимодействий между противоположно заряженными полярными головами молекул. Было показано, что, изменяя соотношение зарядов липида, мы можем получать определённые полиморфные кубические или гексагональные фазы.

• Впервые показано, что амфипатические молекулы, имеющие большой объем в полярной области, например молекулы хлорофилла, способны инициировать полиморфные переходы липидов благодаря изменению соотношения размеров полярной и гидрофобной поверхностей мембраны.

■ Проведен анализ влияния перекисного окисления липидов tfa фазовое состояние и структурную организацию мембран, образованных кардиолипином и цитохромом с. Показано, что наблюдаемые структурные изменения мембран связаны с образованием олигомеров белка и продуктов перекисного окисления липидов.

■ Впервые обнаружено стабилизирующее воздействие катионных липидов, используемых в генной терапии, на молекулу ДНК. Благодаря формированию специфической мультиламеллярной фазы ДНК-липидного комплекса, в которой молекула ДНК оказывается «зажатой» между мембранами, температура плавления ДНК повышается до 105-115°С.

■ Проведен детальный анализ структурных изменений мембран в условиях трансформации клеток грамотрицательных бактерий экзогенной ДНК. Показано сходство механизмов полиморфных изменений мембран бактерий, ответственных за трансмембранный перенос ДНК, и полиморфизма липидов, наблюдаемого в модельных системах.

■ Исследованы структурные изменения мембран Escherichia coli при инфицировании бактериофагом Т4. Впервые показана роль межмембранных взаимодействий и процессов слияния мембран в инфицировании бактериальных клеток. Обнаружена специфическая структура, названная «тоннелем», ответственная за перенос молекулы ДНК через мембраны бактериальной клетки.

Практическая ценность работы. 1.Обнаружены и проанализированы условия, при которых образуются кристаллические и паракристаллические структуры на основе смесей анионных и катионных липидов, ДНК-липидных и белок-липидных комплексов. Такие структуры могут использоваться в качестве матрицы при создании электронных устройств и микрочипов для потребностей нанотехнологий. 2. Исследованы процессы взаимодействия с клеткой липосом и бактериофагов, что может найти применение в генной терапии и других областях медицины при создании средств доставки лекарственных препаратов в цитоплазму.

Основные положения, выносимые на защиту. Природные липиды, благодаря способности к сложному фазовому поведению, способны выполнять функцию активной матрицы, на которой происходят разнообразные процессы жизнедеятельности. Исследования фазового поведения липидов имеет большое практическое значение и потенциально может использоваться в медицине и технике.

Апробация работы. Работа пошла апробацию на Съездах биофизического общества в Канзасе (1998г.), в Новом Орлеане (2000г.), в Бостоне (2001г.), в Сан Франциско (2002г.). На Кейстонской конференции по невирусным средствам доставки генов, Кейстон, Колорадо, 1998г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 статьи в центральных отечественных и международных журналах.

Структура и объем работы. Работа изложена на 260 страницах машинописного текста. Она состоит разделов: Обзор литературы, Материалы и методы, Экспериментальная часть, Заключение и Выводы. Имеется также Список цитируемой литературы, содержащий более 500 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В работе использовались липиды, полученные от компаний Avanti Polar Lipids или Sigma. В некоторых случаях липиды выделяли из соответствующих природных источников. Их чистота определялась с использованием тонкослойной хроматографии. Синтез и анализ тион-дипальмитоил-фосфатидилхолина проводился в лаборатории И.А. Василенко (Институт Тонкой Химической Технологии, Москва). Синтез этил-фосфатидилхолинов проводился в Northwestern University, USA. Экстракцию липидов из пурпурных мембран проводили в лаборатории Л.И. Баксукова (Институт Биоорганической Химии, Москва).

Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия. Измерения теплопоглощения проводились на приборе a VP-DSC Micro Calorimeter (MicroCal Inc, США) или ДАСМ-4 (Биоприбор, Россия).

31Р-ЯМР спектроскопия. Анализ препаратов проводился в лаборатории И.А.Василенко и использованием спектрометра Bruker WM-250 (Германия). Рабочая частота 101,4 мГц.

Электронная микроскопия.

Метод замораживания-скалывания. Суспензии замораживали в жидком пропане и скалывали на модифицированной нами вакуумной установке JEE-4B фирмы JEOL (Япония) при вакууме 10'7 Topp и температуре -150'С.

Метод ультратонких срезов. Препараты фиксировали 12ч 1% раствором четырехокиси осмия, затем 1% растворе таннина и после стандартной процедуры обезвоживания, заливали в эпоксидные смолы. Срезы окрашивали-по стандартной методике уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на микроскопе JEM-100В.

Другие методы кратко описаны в подписях к рисункам и в основном тексте ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ

Изменения фазового состояния липидов живых клеток обычно протекают локально в специфических участках поверхности мембран и часто бывают весьма кратковременны. Это в значительной мере затрудняет их исследование in vivo. Существенный прогресс в этой области был достигнут, прежде всего, благодаря уникальной способности липидов спонтанно образовывать разнообразные структуры in vitro, что открывает широкие возможности для моделирования биологических процессов.

Электростатические силы в регуляции полиморфного поведения липидов.

Мы предположили, что в липосомах, образованных смесью положительно заряженных (катионных) и отрицательно заряженных (анионных) липидов, электростатические взаимодействия между полярными головами молекул могут зависеть от соотношения зарядов, определяемого липидным составом. Например, если количество отрицательных и положительных зарядов одинаково, доминируют силы электростатического притяжения между полярными головами и средняя площадь полярной области будет меньше, чем в случае, когда имеется избыток анионного или катионного липида, и присутствуют силы электростатического отталкивания между одноименными зарядами. Эти пороцессы могут влиять на фазовые переходы липидов.

Для проверки данной концепции мы использовали смесь катионного аналога фосфатидилхолина (E-DOPC), несущего один положительный заряд, и анионного фосфолипида кардиолипина, с двумя отрицательными зарядами на молекулу.

Рис. 1. Реплики с поверхности сколов липосом, полученных при смешивании синтетического катионнога липида E-DOPC и анионного липида кардиолипина из сердца быка. (А) - мембранные везикулы, образованные E-DOPC; (В) - трубочки гексагональной Ни фазы в смеси E-DOPC и кардиолипина, соотношение зарядов (+/-) = 1/1; (С) - кристаллы кубической фазы (те же липиды, но соотношение зарядов (+/-) = 2/1). В углу представлен Фурье-анализ изображения, обнаруживающий тетрагональную решетку.

Электронная микроскопия показала (Рис.1), что каждый липид в отдельности образует ламеллярную фазу, т.е. бислойные мембранные структуры, представленные большими везикулами. Однако при смешивании липидов, образуются иные фазы в следующем порядке: везикулы (чистый кардиолипин) губчатая фаза (+/-)=1/4 «> кубическая фаза (+/-)=1/2 о гексагональная Нп фаза (+/-)=1/1 <=> кубическая фаза (+/-)=2/1 <=> губчатая фаза (+/-)=4/1 <=> везикулы (чистый E-DOPC).

Гексагональная Нц фаза, структура с максимальной отрицательной кривизной монослоя, образуется в такой смеси липидов, в которой нейтрализация зарядов максимальна (+/-)= 1/1. Отклонение от этого соотношения в сторону преобладания положительного или отрицательного зарядов одинаковым образом приводит к появлению структур с последовательно уменьшающейся внутренней кривизной, поскольку известно, что соотношение площади, занимаемой жирными хвостами молекул к площади полярных голов изменяется в ряду фаз: ламеллярная >кубическая > гексагональная. Наличие такой закономерности подтверждается также данными малоуглового рентгеновского рассеяния (Рис.2). Анализ рефлексов обнаруживает присутствие гексагональной Нп фазы в нейтральной смеси липидов (+/-)=1/1. Более того, смеси (+/-)=2/1 и (+/-)=1/2 дают идентичные рефлексы, соответствующих известной кубической фазе Q224 с пространственной группой РпЗт. Сходство кубических фаз обращает особое внимание, поскольку представленные липосомы имеют противоположные по знаку, но одинаковые по абсолютному значению заряды, и существенно отличаются по химическому составу. Полученные нами результаты свидетельствуют о доминирующей роли абсолютной величины сил межзарядовых взаимодействий в определении структуры образующихся фаз.

Обнаруженное нами явление может найти непосредственное применение в биотехнологии поскольку катионные липиды, в том числе E-DOPC, являются перспективными агентами трансфекции и применяются в генной терапии.

\

---'- gUi—-----,- DI£-----

0 1 2 0123450 1 2

Reciprocal Spacing x 130 (1/A) Redprocal Spacing x 100 (1/a! Reciprocal Spaensx 100 (1/A)

Рис. 2. Графическое представление результатов малоуглового рентгеновского рассеяния липосом E-DOPC и кардиолипина. По горизонтали отложены величины обратного расстояния до рефлексов, а по вертикали -индексы Миллера (h,k,l) Наклон кривых даёт величину d - главный шаг решётки. (А) - кубическая фаза смеси (+/-)= 1/2, d = 12,4 нм; (В) - гексагональная Ни фаза смеси (+/-)= 1/1, d= 5,82 нм; (С) - кубическая фаза, (V-) = 2/1, d = 12,6 нм. Точки аппроксимированы прямыми по методу наименьших квадратов, при этом R2>0,999 для всех случаев. Данные получены совместно с T.J. Mcintosh.

Полиморфизм галактолипидов, инициируемый хлорофиллом.

Известно, что основная масса хлорофилла в мембранах тилакоидов входит в состав хлорофилл-белкового комплекса и лишь небольшая его часть ассоциирована с липидами. Влияние этой части хлорофилла на структурную организацию мембран изучено мало. По имеющимся представлениям, хлорофилл способен внедряться в липидный бислой, при этом порфириновое кольцо находится в области полярных групп липидов, в то время как гидрофобная боковая цепь, представленная остатком фитола, погружается вглубь гидрофобной области бислоя.

Липидная часть тилакоидной мембраны содержит 50% моногалактозиддиглицсрина (МОБО), 25-30% дигалактозилдиглицерина (БОВО), 9% фосфатидилглицерина (Рв) и небольшое количество сульфолипидов и фосфатидилхолина. Фазовое поведение галактолипидов хорошо изучено, построены фазовые диаграммы, в соответствие с которыми, в условиях дегидратации и при определённых соотношениях МвОв и 0000 могут формироваться различные кубические и гексагональная Ни фазы. При полной гидратации суспензия природного МООО образует гексагональную Нп фазу в широком диапазоне температур, тогда как аналог МООО с насыщенными алкильными цепочками полярных хвостов, а так же природный ООБО образуют стабильный бислой .

В настоящее время полиморфные фазовые переходы липидов хлоропластов привлекают большое внимание, поскольку они играют существенную роль в жизнедеятельности растений и, в частности, в адаптации к экстремальным условиям. Представленная часть работы посвящена изучению влияния хлорофилла на полиморфизм липидов хлоропластов, что особенно актуально в свете этих исследований.

В соответствии с данными 31Р-ЯМР хлорофилл, добавленный к различным смесям липидов хлоропластов, неизменно разрушал бислой и инициировал появление изотропных и трубчатых фаз. Так, смесь МООО/РО (2/1) образовывала бислойную структуру даже при повышенных температурах (50'С), в то время, как в присутствии хлорофилла бислой был стабилен только при 5'С, а при более высоких температурах появлялся и рос изотропный сигнал. При 50"С значительный вклад давала также

гексагональная Нп фаза . При большем содержании МООв прослеживалась такая же последовательность событий, но с еще более выраженной тенденцией к образованию гексагональной Нп фазы. Аналогичная картина наблюдалась и в более сложных, тройных смесях липидов (Рис.3). Тенденция была ещё более выражена в суммарной фракции липидов тилакойдов.

Рис. 3. Спектр 3,Р-ЯМР (А) - водной суспензии MGDG/DGDG/PG (3:2:1) при 50'С (а); те же липиды + хлорофилл (липидЛспорофилл 5:1) при ЗО'С (Ь). (В) - водной суспензии суммарной фракции липидов хлоропластов при ЗО'С (а); те же липиды + хлорофилл (пипид/хлорофилл 5:1) при ЗО'С (Ь). Галактолипиды, а также хлорофиллы формы "а" и "б" были экстрагированы из коммерческих препаратов шпината. Все смеси готовились в хлороформе, затем хлороформ удалялся высушиванием в потоке аргона и хранением под вакуумом. Суспензии готовились встряхиванием плёнки липидов в ОгО. Эти и последующие +20ррп Данные з'Р-ЯМР получены совместно с И.А. Василенко.

Нами также было проведено исследование изменения ультраструктурной организации всех перечисленных выше смесей липидов. Было обнаружено, что процесс нарушения бислойной структуры начинается с формирования многочисленных контактов между мембранами. При исследовании методом замораживания-скалывания эти контакты выглядят как специфические структуры, известные под названием «липидные частицы». Их присутствие в препарате коррелирует с появлением изотропного сигнала ЯМР. Данные ЯМР о появлении гексагональной Нп-фазы были также подтверждены электронной микроскопией. Полиморфные превращения в мембранах представляют типичные примеры многостадийного процесса слияния мембран (Рис.4), и широко распространены в различных биологических процессах, связанных как непосредственно функционированием хлоропластов, так и с многообразными иными процессами структурных преобразований в мембранах различных клеток.

Рис.4 Схематическое

представление последовательных стадий полиморфных превращений липидов хлоропластов в присутствии хлорофилла, суммирующее наши электронно-микроскопические исследования. Представлены

ламеллярная (L), губчатая (Sponge), кубическая (Cubic), и гексагональная (Hexagonal Ни) фазы. Показано, что процесс фазовых превращений является результатом образования различных типов межмембранных контактов.

Взаимодействие липидов с белками и структурные переходы в мембранах при перекисном окислении.

Взаимодействие мембранных белков с липидным бислоем является предметом многочисленных исследований. Одним из наиболее интересных примеров, демонстрирующих возможность существования многообразных форм белок-липидных взаимодействий, может быть продемонстрирован на примере цитохрома с. Будучи водорастворимым белком, цитохром с может проявлять также свойства типичного гидрофобного белка и инициировать структурные преобразования фосфолипидного бислоя. Взаимодействие цитохрома с с бислоем определяется конформационными изменениями белковой молекулы, сопровождающими процесс присоединения гемовой группы, или цикл окисления-восстановления гемового железа.

Необычное поведение цитохрома с, обнаруженное в исследованиях модельных систем, породило ряд спорных гипотез о возможном биологическом значении полиморфных фазовых переходов, инициируемых этим белком в мембранах митохондрий. Известно, что цитохром с присутствует внутри крист, на внутренней поверхности внутренний мембраны митохондрий, но, как некоторые другие митохондриальные белки, синтезируется в цитоплазме, и в дальнейшем, должен преодолеть барьеры обеих мембран для того, чтобы попасть во внутрикристное пространство, к месту своего функционирования. Существует предположение о том, что данный белок, в результате специфического взаимодействия с митохондриальным липидом кардиолипином, способен индуцировать появление инвертированных мицелл в участках полу слияния между внешней и внутренней мембранами митохондрий, в так называемых зонах адгезии, благодаря чему и осуществляется транспорт цитохрома с во внутрикристное пространство.

В представленной работе мы задались целью проверить, во-первых, способен ли цитохром с специфически взаимодействовать с кардиолипином, и во-вторых, способен ли цитохром с индуцировать возникновение инвертированных мицелл. Нами было показано, что цитохром с не вызывает фазовых переходов в бислое, но в процессе окисления кардиолипина, возникают мицеллярные олигомеры белка и продуктов окисления липида, что существенно меняет морфологию мембран.

В целях проверки предположения о возможности избирательного взаимодействия цитохрома с с кардиолипином, мы исследовали протеолипосомы, содержащие смесь кардиолипина с аналогом фосфатидилхолина: дипальмитоил-тион-фосфатидилхолином (тион-ОРРС).

Эта смесь использовалась потому, что химический сдвиг в 31Р-ЯМР спектре тион-ОРРС находится на 56 ррт влево от сигнала 85% НЗР04, что позволяет независимо регистрировать спектры двух липидов, как это показано на Рис.5. Представленный спектр свидетельствует о том, что исходная смесь кардиолипина и тион-ОРРС образует бислойную структуру, причем спектры обоих липидов весьма схожи. Однако, как и предполагалось, в присутствии цитохрома с только кардиолипин претерпевает структурные

ТЫоп-РС

-75 -50 -25

О 25 Н —

Рис. 5. Спектр 3,Р-ЯМР при 24,3 МГц полученный при 40'С на водной суспензии смеси кардиолипина сердца быка и тион-ОРРС (молярное соотношение липидов 1:4). Спектр получен при 40'С потому, что ниже этой температуры тион-ОРРС находится в состоянии геля. (А) -суспензия фосфолипида в отсутствии цитохрома с и (В) - суспензия фосфолипида в присутствии ферроцитохрома с (восстановленное гемовое железо) после ЗОмин инкубации. Восстановленная форма цитохрома с - ферроцитохром с был получен обработкой феррицитохрома с дитионатом натрия, с последующим удалением солей на сефадексе 6-25.

изменения, сопровождающиеся увеличением изотропного сигнала. Спектр тион-ОРРС остается неизменным и соответствует форме спектра фосфолипидного бислоя (Рис.5). Появление изотропного сигнала кардиолипина свидетельствует о появлении мицеллярных форм, в которых вращение фосфата а, значит, и всей молекулы кардиолипина не ограничено. Наложение «изотропного» и «бислойного» сигналов свидетельствует о том, что, в условиях нашего эксперимента, лишь часть кардиолипина претерпела структурный переход из бислоя в мицеллы.

Рис. 6. 31Р-ЯМР спектр (24,3 МГц) полученный на водной суспензии кардиолипина сердца быка в присутствии цитохрома с при 20"С; молярное соотношение фосфолипид/белок 44:1. (А) -суспензия чистого кардиолипина; (В) - суспензия кардиолипин - цитохром с, 1час инкубации, индекс окисления кардиолипина 0,6; (С) - то же, что и (В), но после б часов инкубации; (Э) - после 24 часов инкубации. Степень окисленности липидов определялась по соотношению максимумов поглощения при 215/233 нм.

Избирательное взаимодействие цитохрома с и кардиолипина обусловлено наличием негативного заряда на кардиолипине и позитивного заряда на цитохроме с. Однако дальнейшие исследования показали, что, хотя заряды необходимы для осуществления взаимодействия между белком и липидом, появление мицелл обусловлено другими факторами. Было обнаружено, что величина изотропного .сигнала кардиолипина может существенно возрастать при увеличении времени и повышении температуры инкубации протеолипидного комплекса (Рис.6). Напротив, изотропный сигнал не появлялся в случае, если использовался кардиолипин, двойные связи которого были гидрогенизированы, что предотвращало возможность окисления (не показано).

Электронная микроскопия (Рис.7) обнаруживает в суспензии липосом из кардиолипина и тион-ОРРС, а также комплексов цитохрома с и липида присутствие типичных мембранных везикул с гладкой поверхностью скола. Инкубация протеолипидных комплексов при повышенной температуре приводила сначала к появлению внутримембранных частиц, а затем к разрушению бислойной организации и возникновению мицелл. В присутствии антиоксиданта а-токоферола этот процесс был менее выражен при кратковременной инкубации (не показано), однако, через несколько часов морфология поверхностей скола мембран сильно изменялась. Гидрогенизация двойных связей кардиолипина предотвращала возможность

окисления липида и изменения морфологии мембран не наблюдалось, что свидетельствует о существенной роли окисления в этих процессах.

Рис. 7. Реплики с поверхности скопов липосом из кардиолипина и тион-ЭРРС в присутствии цитохрома с. А - инкубация 30 "* мин, при 20"С индекс окиспенности 0,6. Поверхности скола липосом гладкие; В -инкубация 2 часа, при 20'С, индекс окисленности 1,0. Видны внутримембранные частицы (показано стрелками); С -инкубация 120 мин при 60'С. Мембранные структуры

полностью разрушены,

присутствуют мицеллы; О -инкубация при 60'С, 2 часа в присутствии антиоксиданта а-токоферола. Видно

существенное нарушение морфологии поверхности скола мембран; Гидрогенизация кардиолипина проводилась на катализаторе Ддамса в метаноле. Отсутствие двойных связей контролировалось ЯМР. Масштаб: 200нм.

Электрофорез белок-липидных комплексов в полиакриламидном геле (Рис.8) свидетельствует о том, что при увеличении времени инкубации препаратов полоса, соответствующая мономерной форме цитохрома с, постепенно исчезает, но взамен появляется и растет полоса высокомолекулярных комплексов в области старта. Олигомеризация белка может быть обусловлена появлением оснований Шиффа в результате сшивок между белком и продуктом окисления кардиолипина - малоновым диальдегидом. Присутствие Шиффовых оснований можно наблюдать по их спектральным характеристикам (Рис.9). Представленные данные свидетельствуют о росте содержания Шиффовых оснований в условиях, благоприятствующих окислению липидов.

Известно, что цитохром с катализирует перекисное окисление кардиолипина, в результате чего появляются диальдегиды, способные сшивать белки и образовывать белок-липидные олигомеры, которые сначала образуют мицеллярные структуры в гидрофобной области мембран и выглядят, как внутримембранные частицы на поверхности скола, а при большей степени окисления и разрушении бислоя образуют суспензию мицелл (Рис.10)

V

> Sem 0 S cm О В cm

Рис. 8. Электрофорез в 15% полиакриламидном геле (фосфатный буфер + SDS). А -цитохром с, В -суспензия кардиолипина и цитохрома с, инкубированная 24 часа при 20'С; С - инкубация 3 часа при 37'С; D -то же что и «С» но после 24 часов инкубации; Е - суспензия гидрогенизированного кардиолипина и цитохрома с, инкубация 24 часа при 60'С. Старт находится в области Осм. Полоса 1 соответствует мономерной форме цитохрома с, а полосы 2-4 соответствуют олигомерным формам этого белка. Данные получены в сотрудничестве с лабораторией ИАВасиленко.

1.0

ж с Э

|0,б 4)

£ТС.

400 450 5Ö0 nm

Рис.9.

Спектр препаратов из А - чистого кардиолипина; В - протеолипосом кардиолипин-цитохром с (44:1), инкубация при 20'С в течение 24 часов; С - то же, что и «В», но нагрев до 37'С в течение 60 мин. Данные получены в сотрудничестве с лабораторией И.А. Василенко

Рис.10. Схематическое представление процесса образования олигомеров цитохрома с и кардиолипина в результате сшивок продуктами перекисного окисления. 1- вначале белок адсорбируется на поверхности бислоя благодаря электростатическим взаимодействиям; 2 - 3 - по мере увеличения степени перекисного окисления происходит процесс олигомерицации, что приводит к появлению внутримембранных частиц на поверхности скола; 4 -дальнейшее окисление приводит к росту олигомеров, при этом мембраны разрушаются и препарат содержит суспензию мицелл.

Роль латеральной сегрегации белка в мембране при формировании различных типов двумерных кристаллов бактериородопсина.

Встраивание белковых молекул в липидные мембраны представляет интерес не только в фундаментальных исследованиях, но также предполагается их использование в технике при создании биосенсоров и в медицине при создании средств доставки лекарственных веществ. Одним из наиболее интересных и активно

11

исследуемых объектов в этой области является бактериородопсин из пурпурных мембран НаЬЬааегшт каЬЫит. Особенностью этих мембран является наличие гексагональной двумерной кристаллической решетки, образованной бактериородопсином. В представленной работе мы обнаружили важную роль процессов латеральной сегрегации белка при формировании различных типов 2-х мерных кристаллов.

Спектры КД реконструированных мембран (Рис.11) характеризуются наличием положительного пика при 530 нм и отрицательного пика при 600 нм. Характерно, что по мере уменьшения содержания липидов в реконструированной мембране спектры КД все более приближаются к спектру нативной пурпурной мембраны. Так, при реконструкции бактериородопсина в липиды из пурпурных мембран наблюдается почти полное восстановление исходных параметров КД при соотношении липид/белок 0,33:1(Рис.11А). При реконструкции в фосфатидилхолин соотношение липид/белок 0,33:1 также дает лучшие результаты, хотя спектры сильно отличаются от нативных (РисЛ1 В). В присутствии 3,6М №С1 спектральные характеристики реконструированных мембран еще ближе к нативным (Рис.11С).

Анализ процессов плавления реконструированного бактериородопсина, проведенный с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (Рис.12), также свидетельствует о том, что №С1 влияет на термостабильность белка. Так, в присутствии 3,6М №С1 плавление реконструированных мембран наблюдается при более высокой температуре, приближающейся к таковой нативной мембраны, что свидетельствует о более полном восстановлении исходных параметров белковой молекулы при реконструкции.

500 600 пт $00 600 пгп 500 600 пт

Рис.11. Спектры КД бактериородопсина реконструированного в мембраны с различным составом липидов. А - комплекс бактериородопсина с липидами пурпурных мембран; В - с яичным фосфатидилхолином. Соотношение липид/белок: 1/1 (1); 0,6/1 (2); 0,33/1 (3); нативные пурпурные мембраны (4); С - в присутствии 3,6М №С1 комплекс с фосфатидилхолином 0,33/1 (5); комплекс с липидами пурпурных мембран 0,33/1 (6); нативные пурпурные мембраны (7). Данные получены в сотрудничестве с лабораториями И.А. Василенко и Л.И. Барсукова. - -

Рис.12. Кривые ДСК плавления бактериородопсина в комплексе с различными липидами: А- нативные пурпурные мембраны; В -ПЛ/БР (0,33/1) в буфере, содержащем 0,15 М ЫаС1; С- то же самое, но 3,6 М №С1; 0 - БР/ФХ (0,33/1) в буфере содержащем 0,15 М №С!; Е - то же самое, но 3,6 М №С1. Данные получены в сотрудничестве с лабораториями И.А. Василенко и Л.И. Барсукова.

Обозначения:

ФХ - яичный фосфатидилхолин ПЛ - липиды пурпурных мембран БР - бактериородопсин ПМ-пурпурные мембраны -

100вС

По данным электронной микроскопии (Рис.13) гексагональная кристаллическая упаковка белковых молекул, характерная для нативных мембран, наблюдается при реконструкции бактериородопсина в липиды из пурпурных мембран с соотношением липид/белок 0,33/1. При более высоком содержании липидов на поверхности сколов присутствуют хаотически расположенные внутримембранные частицы, типичные для большинства мембранных белков. Как показано на Рис.1 ЗА, реконструированные мембраны имеют островки шероховатых и гладких поверхностей скола. Оба типа поверхностей характеризуются присутствием гексагональной решетки и морфологически аналогичны цитоплазматической и экстраклеточной поверхностям скола пурпурных мембран. Напротив, при реконструкции в мембраны из яичного фосфатидилхолина (Рис. 13 В,С) можно наблюдать возникновение совершенно иной ортогональной кристаллической решетки. Эта решетка образуется в присутствии 3,4М ЫаС1 и при соотношении липид/белок 0,33/1. При снижении содержания соли кристаллическая структура разрушается.

пмпиити»! щщ»11М>1»И1

ИНН..........

............

1С >#»»м»1»пм1

Рис.13. Электронные микрофотографии реплик с поверхности сколов реконструированных мембран (А) -содержащих бактериородопсин и липиды пурпурных мембран, комплекс с соотношением белок/липид 0,33/1. Представлены отдельные фрагменты с гладкой (слева) и шероховатой (справа) поверхностями скопа, а так же данные 20-Фурье анализа, показывающие наличие гексагональной кристаллической решетки на обеих поверхностях. (В) - поверхности сколов мембран, образованных бактериородопсином и яичным фосфатидилхолином. Комплекс с соотношением липид/белок 0,33/1 в присутствии 3,6М №С1 и 20-Фурье анализ поверхности. Рефлексы, свидетельствующие о наличии орторомбической решетки, выделены кружками. (С) - обратное Фурье преобразование поверхности (В). Видна орторомбическая упаковка молекул бактериородопсина. Масштабная черта: ЮОнм. Фурье анализ изображений выполнен ААДеевым.

Таким образом, на основании проведенного исследования можно представить, что по мере удаления детергента из липвдно-белкового солюбилизата образуются мембранные структуры в которых мономерный белок ассоциирует в олигомеры. Структура олигомеров определяется природой используемых липидов. При этом олигомеры не находятся в состоянии максимально плотной упаковки, и их распределение и взаимная ориентация в плоскости мембраны являются хаотическими, что проявляется в неупорядоченной упаковке внутримембранных частиц. Лишь в случае использования для реконструкции липидов пурпурных мембран, при нативном соотношении липид/белок 0,33/1, по-видимому, создаются благоприятные условия для формирования регулярной гексагональной решетки. В случае использования фосфатидилхолина требуется внешний фактор для перехода мембраны из «аморфного» в кристаллическое состояние. Роль такого фактора играет ЫаС1.

Отличительной особенностью нативных клеточных мембран является наличие определенной ориентации белковых молекул поперек бислоя, благодаря чему,

например, бактериородопсин и другие транспортные белки способны создавать трансмембранный электрохимический потенциал. При реконструкции пурпурных мембран молекулы белка ориентированы поперек плоскости мембраны в двух противоположных направлениях. Поэтому, при формировании кристаллической решетки, присущей нативным пурпурным мембранам, должно происходить разделение молекул с различной ориентацией (Рис.14). Образование двух типов кристаллической решетки связано с различиями процессов сегрегации белковых молекул в плоскости мембраны. При использовании липидов пурпурных мембран (Рис. 14В,С) сегрегация приводит к восстановлению нативной гексагональной решетки. При реконструкции в фосфатидилхолин (Рис. 14В',С') происходит формирование ортогональной решетки в которой наблюдается чередование молекул с противоположной ориентацией. Преобладание того или иного процесса сегрегации белков зависит от липидного состава, температуры, концентрации солей и других факторов.

Рис.14. Схематическое представление процессов латеральной сегрегации бактериородопсина при формировании гексагональной и ортогональной кристаллических решеток. А - реконструированные липид-белковые комплексы представляют собой мембранные везикулы, в которых молекулы белка расположены случайным образом и выглядят на поверхности скола в виде внутримембранных частиц сферической формы. В отличие от нативных клеточных мембран, ориентация молекул поперек биспоя также случайна и на представленной схеме молекулы, ориентированные в противоположных направлениях, обозначены белым и черным цветами. В - в условиях, способствующих формированию кристаллической решетки, зародыши гексагональных кристаллов сегрегируют, в зависимости от ориентации белка, и образуют отдельные островки с гексагональной решеткой. С - далее, в результате фрагментации, участки мембран с различной ориентацией белков разделяются. В' и С' - возможен также иной способ латеральной сегрегации, при котором противоположно ориентированные молекулы образуют чередующиеся ряды. В этом случае также образуется гексагональная решетка, которая представляет собой наложение двух ортогональных решеток с противоположной ориентацией молекул белка.

Полиморфные фазовые переходы в ДНК-липидных

Взаимодействия ДНК с липидом привлекают большое внимание в связи. с возможностью использования липосом в качестве переносчиков генетического материала в генетике, молекулярной биологии и медицине. Многие природные фосфолипиды не могут непосредственно взаимодействовать с ДНК в связи с наличием сил отталкивания, присутствующими между отрицательно заряженными фосфатами молекул ДНК и фосфолипидов. Однако такое взаимодействие может быть опосредовано двухвалентными катионами некоторых металлов. В настоящей работе представлены исследования фазового поведения комплексов ДНК с фосфатидилхолинами в присутствии катионов кальция.

комплексах,

Комплекс flHK-Ca2+-DPPC

Процесс комплексообразования DPPC и ДНК можно проследить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). DPPC имеет узкий максимум плавления при 41,6'С, как это видно на термограмме (Рис.15). В присутствии ДНК и Са2+ термограмма DPPC обнаруживает появление нового максимума при 43,3'С.

Рис.15. ДСК термограммы комплексов ДНК-Са2* -DPPC. Указаны молярные пропорции ДНК/липид (п). ДНК тимуса теленка (Sigma) дополнительно очищалась фенолом и хлороформом (отношение поглощения при А260/А280> 1,9) и обрабатывалась ультразвуком до фрагментов 300-500 bp. Фрагменты ДНК смешивались с малыми липосомами, полученными ультразвуковой обработкой везикул яичного PC, или DPPC (Avanti) в 0,5 мМ растворе HEPES (рН 7,4). Далее ЮОмМ раствор СаСЬ медленно добавлялся к суспензии при постоянном перемешивании, комплекс лиофилизировапи и обрабатывали хлороформом для разрушения мембранных структур и для инициации формирования инвертированной фазы в органическом растворителе. После удаления хлороформа вакуумированием препарат регидратировапи. Скорость нагрева 0,25 К/мин Сканы получены в совместной работе с Т.И. Николаевой на калориметре ДАСМ-4.

Рис.16. Структурная организация гидрофобной поверхности скола мембран йРРС, фиксированных от различных температур. (А - С) - контрольный препарат липосом из БРРС; (О-Э) - комплексы ДНК-Са2+ -йРРС, молярное соотношение ДНК/липид 1:5. (А) - При температуре 17°С (ниже предперехода ) и (В) -47°С (выше главного фазового перехода) в поверхности скола мембран липосом выглядят гладкими; (С) -при температуре 38,8°С, между предпереходом (35°С) и главным фазовым переходом (41,6°С) липида, на поверхности скола наблюдается «риппл» фаза, период 15нм. ДНК-Са2+-ОРРС комплексы (0) - при 6'С образуют розетковидные структуры; (Е, Р)- при 17 и 39 'С образуются волны «риппл» фазы с периодом 25 нм; (в) - при 45'С образуются червеобразные складки. Масштаб: 200нм.

Наличие корреляции между площадью нового максимума и молярной пропорцией ДНК в образце свидетельствует о формировании комплекса ДНК- Са2+-ОРРС. Суммарная энтальпия обоих максимумов на представленных сканах была 7,0±0,6 ккал/моль. При этом, в условиях нашего эксперимента, значительная часть липида вовлекается в формирование комплекса с ДНК.

Электронно-микроскопический анализ реплик с поверхности сколов БРРС показывает (Рис.16), что при криофиксации от температуры, находящейся в интервале между предпереходом (35'С) и главным фазовым переходом липидов (41,6'С), образуется типичная структура, называемая «риппл» фазой с периодом 15 нм (Рис.16С). При более высоких и при более низких температурах мембраны выглядят гладкими (Рис.16А,В). При образовании комплекса ДНК-Са2+ -БРРС диапазон температур, при которых можно наблюдать «риппл» фазу, существенно расширяется. Так, при 6'С наблюдаются по меньшей мере две фазы: «риппл» фаза с периодом 25нм и розетковидные складки (Рис.16В,Е). При температурах, близких к главному фазовому переходу формируются два типа «риппл» фазы: с периодом 15нм, характерным для исходного БРРС, и с периодом 25 нм (Рис.16Р), который наблюдается для комплекса ДНК-Са2+-БРРС и при более низких температурах.

При температуре выше фазового перехода мембраны также не выглядят гладкими, как это характерно для исходного липида. На поверхности скола наблюдаются многочисленные извилистые червеобразные складки (Рис. 160). Анализ длины этих складок свидетельствует о корреляции их длины с длиной используемых в эксперименте фрагментов ДНК (не показано).

Итак, данные дифференциальной сканирующей калориметрии и электронной микроскопии свидетельствуют о том, что образование комплекса ДНК-Са2+-ОРРС приводит к существенному изменению фазового поведения липидов. В препарате сосуществуют две фазы, одна из которых по своим свойствам близка к исходному липиду, а свойства другой сильно изменены. Часть липида образует «риппл» фазу в характерном для исходного липида температурном диапазоне. Наблюдаемый период волн также характерен для исходного липида (15 нм). Другая фаза существенно отличается от исходного липида не только периодом волн 25 нм, но также и тем, что периодические структуры сохраняются во всем диапазоне исследуемых температур.

При этом молекулы ДНК могут ориентироваться вдоль гребней мембраны и образовывать на поверхности мембраны каркас, который может служить фактором стабилизации «риппл» структуры, что позволяет объяснить ее существование в широком диапазоне температур.

Комплекс ДНК- Са2+-лецитин

Способность ДНК инициировать полиморфные фазовые переходы мембран и, в частности, способствовать образованию инвертированных трубчатых структур была показана на синтетических катионных липидах. Предполагаемая нами возможность влияния ДНК на полиморфизм природных фосфолипидов может иметь большое значение для понимания процессов жизнедеятельности. В данной работе мы использовали катионы Са2+ для инициации взаимодействия между молекулами тимусной ДНК и липосомами из яичного лецитина. При этом образуется комплекс ДНК-Са2+-лецитин, в котором двухвалентный катион Са2+ играет роль мостика между фосфатами ДНК и лецитина.

Электронная микроскопия замораживания-скалывания выявляет изменения структурной организации природного яичного лецитина, инициируемые взаимодействием с ДНК- Са2+. Так, в отличии от суспензии лецитина, представленной мультиламеллярными липосомами, комплекс ДНК- Са2+-лецитин обнаруживал появление новых структур двух типов: (1) - палочковидные или нитевидные образования на гидрофобной поверхности скола некоторых липосом; (2) - пучки фибрилл, не связанных с мембранами (Рис.17).

Рис. 17. Микрофотографии замораживания-скалывания (А-В) и негативного контрастирования (С) комплекса ДНК- Са2*- лецитин. (А) палочковидные и нитевидные структуры на поверхности скола мембранных везикул; (В) - пучки фибрилл, не связанные с мембранами; (С) -пучки фибрилл, аналогичные представленным на «В» выявляются также негативным контрастированием в уранилацетате (ограничено стрелками). Хорошо видна периодическая организация. Масштаб: 100нм.

Палочковидные и нитевидные структуры схожи с описанными ранее, так называемыми, структурами «спагетти», найденными в комплексах ДНК с синтетическим катионным холестерином. Предполагается, что эти структуры представляют собой трубочки липида, покрывающие нити ДНК. Пучки фибрилл не связанные с мембранами представляют иной тип ДНК-липидных комплексов. Эти образования можно наблюдать как методом замораживания-скалывания, так и контрастированием с помощью уранилацетата. Структуры, окрашенные уранил ацетатйм имеют электронноплотные (темные) полосы, разделенные неокрашенными белыми полосами липида. Наличие темных полос может объясняться способностью уранилацетата окрашивать ДНК.

Мы предполагаем, что пучки фибрилл представляют собой гексагонально упорядоченные трубочки липида, заполненные ДНК (Рис.18) Величина периода I близкая к 60А довольно типична для трубочек гексагональной Нп фазы

фосфолипидов. Следует отметить, что длина фрагментов ДНК. используемых в нашем эксперименте была около 500 пар оснований, что соответствует около 150 нм. Однако, длина трубочек была намного больше, что свидетельствует о том, что внутри липидных трубочек молекулы ДНК могут располагаться последовательно друг за другом.

Известно, что лецитин обычно образует стабильный бислой и не проявляет выраженной склонности к полиморфному поведению за исключением немногих случаев действия биологически-активных модуляторов среди которых могут быть липиды, полипептиды и белки. Молекулы ДНК в комплексе с некоторыми поливалентными катионами могут служить в качестве таких биологически-активных модуляторов полиморфного поведения. Возможно, что способность липидов продуцировать упорядоченные структуры с ДНК может быть использована клетками для упаковки хромосом в ядре, или в процессах транслокации ДНК через мембраны при трансфекции, в процессах вирусной инфекции или в различных формах обмена генетического материала между клетками.

Рис.18. Гипотетическая модель структурной организации фибриллярных комплексов ДМК-лецитин. Модель основана на анализе изображений замораживания-скалывания (А) и контрастирования уранилацетатом (В). Профили электронной плотности этих изображений «а» и «Ь» обнаруживают периодичность около 60А. Предполагается, что светлые полосы окрашенных уранилацетатом фибрилл соответствуют гидрофобным областям трубочек липидного бислоя, а темные полосы - окрашенным молекулам ДНК, заключенным внутри трубочек.

В данной работе представлено исследование влияние мембранных катионных липидов на плавление ДНК, которое, как было обнаружено нами, существенно отличаются по своему действию на плавление ДНК от водорастворимых катионных агентов, таких как катионы двухвалентных металлов. Посредством спектрофотометрии в области 260 нм нами был проведен анализ присутствия нативной ДНК после нагрева ДНК-липидных комплексов до 100'С и последующего охлаждения препарата до комнатной температуры (Рис.19). Было обнаружено протектирующее влияние катионных липидов на молекулу ДНК. Максимальная протекция ДНК наблюдалась при соотношении зарядов 1,5-2,0.

0.0 0 5 1.0 1.5 2 0 R<«->

Необходимо отметить, что протектирующая способность липидов не коррелировала с их известной активностью в трансфекции. Высокая протектирующая способность была обнаружена как у очень активных транспортеров ДНК, таких как Е-DOPC, DOTAP, DC-Choi + DOPE, так и у липидов с низкой активностью в трансфекции, как например: DC-Chol+DOPC, TTMA+DOPE, или TTMA+DOPC. Возможно, что способность образовывать бислойные мембранные структуры являлась важным фактором, определяющим протектирующие свойства липидов,

Высокотемпературная стабилизация ДНК в комплексах с катионными липидами.

100

Рис. 19. Процент нативной ДНК после 10 мин кипячения ДНК-липидных комплексов с различными значениями Rm-Данные спектрофотометрии при 260 нм после охлаждения препарата до 25'С и обработки в 25мМ SDS. Даны средние значения 3-5 измерений. Использовали ультразвуковые фрагменты тимусной ДНК телёнка длиной около 8000 bp. Препараты в 5мМ какодилатном буфере, pH 7.0. E-DOPC (■), DOTAP{.), DC-Chol + DOPC (1:1) (»), DC-Chol + DOPE (1:1) (»), TT MA (♦), TTMA + DOPE (1:1) (+), TTMA+DOPC (1:1) (X), DOPC (*).

поскольку мицелообразующий катионный детергент ТТМА оказывал существенно меньшее протектирующее действие

Рис. 20. ДСК сканы комплекса Е-ООРС с плазмидой р-гал ДНК (7853Ьр) на стандартном фосфатном буфере Дулбекко. (А) -контроль р-гал ДНК; (В) - комплекс, полученный добавлением больших липосом Е-ООРС к р-гал ДНА, Я(./)= 1; (С) - комплекс, полученный добавлением малых (обработанных ультразвуком) липосом Е-ООРС к р-гал ДНК, (*(*.)= 1. Скорость сканирования 10 град/час. Калориметр \ZP-DSC (МюгоСа!, США)

> 70 80 90 100 110 120

Анализ профиля плавления ДНК-липидных комплексов показал наличие двух областей плавления ДНК (Рис.20). Одна область совпадала с кривой плавления v свободной ДНК в соответствующем буфере. Эту часть ДНК мы назвали

термолабильной. Другая область теплопоглощения располагалась в температурном диапазоне Ю5-115'С, независимо от используемого буфера. Эту ДНК мы назвали термостабильной. Температура плавления термостабильной ДНК мало зависела от концентрации катионного липида или от параметра R(+/_). Напротив, количество термостабильной ДНК было чувствительно не только к параметру R(+/.), но и к условиям приготовления комплекса. Например, оно зависело от размера используемых липосом. Большие липосомы были неизменно менее эффективны в формировании термостабильной ДНК, чем малые липосомы (Рис.20).

В процессе взаимодействия ДНК с катионными липидами формировались большие хлопья препарата, которые можно было легко отделить центрифугированием. Было обнаружено, что седимент содержал практически все количество термостабильной ДНК, тогда как прозрачный супернатант содержал термолабильную ДНК (Рис.21). При этом около 95% липида содержалось в седименте, тогда как супернатант содержал в основном свободную от липида ДНК (Рис.22). Анализ трансфекции свидетельствовал о том, что вся активность препарата принадлежала седименту, т.е. термостабильной фракции ДНК, тогда как ь термолабильная фракция была практически неактивна в трансфекции.

По данным электронной микроскопии, в препаратах, содержащих термостабильную ДНК, доминирующей структурой были мультиламеллярные ( комплексы с периодичностью около 6,0-6,5 нм (Рис.23А), что характерно для

i подобных комплексов, образованных различными катионными липидами. Было

обнаружено, что периодическая мультиламеллярная структура очень стабильна и сохраняется даже после нагрева препарата до 130'С (Рис.23В). При этом, периодичность структур существенно не изменялась. Высокая температурная стабильность мультиламеллярных комплексов, по всей зидимости, может служить структурной основой для возникновения термостабильной ДНК.

Лк.

Л/к,

— а / 1/1 Рис. 21. Сканы ДСК термостабильной и термолабильной

3¡ i фракций ДНК разделенных центрифугированием (15 ОООд, 30

J I мин). (А) - препарат перед центрифугированием; (В) -

1? в —А-_ супернатант препарата «А»; (С) - седимент препарата «А».

3' Комплекс получен добавлением больших липосом E-DOPC к р-

§ с___У\К - гал ЯНА' Rki= 1'

70 во so ióo lia 120

Supernatant Sediment

Рис. 22. Состав и активность в.трансфекции супернатанта и седимента комплекса, полученного как указано ранее (Рис.21). Трансфекция оценивалась на культуральных клетках ВНК в буфере Дулбекко, в отсутствии серы и антибиотиков. Экспрессия р-гапактозидазы оценивалась по флуоресценции субстрата. Количество ДНК оценивалось по поглощению при 260 нм. Для оценки содержания липида к липосомам был добавлен 1% фосфатидилэтаноламин, меченный родомином ((УьООРЕ), с максимумом поглощения при 560нм

Рис.23. Ультратонкие срезы ДНК-пипидного комплекса, полученного добавкой обработанных ультразвуком липосом ЕТЧЮРС к тимусной ДНК телёнка в присутствии 5 мМ какодилата, I1,7. Образцы фиксировались в 1% ОэО« при комнатной температуре (А); или при 130'С (В). Фурье анализ областей, выделенных звёздочками, представлен в верхних углах рисунков. В обоих препаратах величина периодов близка к 6.0-6.5 нм.

Температурная стабилизация ДНК в комплексах с катионными липвдами существенно отличается от известной из литературы стабилизации ДНК в присутствии катионов металлов. В соответствии с теорией диссоциации электролитов, взаимодействие катионов металлов с фосфатами ДНК возрастает с увеличением их концентрации, что, в конечном счете, определяет рост температуры плавления ДНК от концентрации катионов.

В случае мембранообразующих катионных липидов, температура плавления ДНК является величиной постоянной и не зависит от концентрации катионных липидов, или, вернее, от соотношения зарядов. При этом, параметр влияет лишь на количественное соотношение между энтальпиями термостабильной и термолабильной фракций. Т.е. в результате взаимодействия с катионными липидами, часть ДНК резко изменяет свойства, как бы «переключается» в новое термостабильное состояние, тогда как свойства оставшейся части ДНК не изменяются. Мы полагаем, что такое поведение связано с тем, что образующийся

ДНК-липидный комплекс имеет строго определенную стехиометрию зарядов !*<+/.)= 1,5-2,0 , определённую структуру и, следовательно, фиксированные физические свойства. В случае, если мы используем соотношения ДНК и липида, отличающиеся от стехиометрических, фаза комплекса отделяется от компонента, добавленного в избытке. Последний не принимает участия в образовании комплекса и присутствует в свободном виде (Рис.24).

Небольшой избыток Большой избыток

Избыток ДНК липида липида

Рис.24. Схема, показывающая структуру ДНК-липидного комплекса в котором мембраны катионного липида разделены слоями ориентированных нитей ДНК. Как известно из литературных данных, расстояние между молекулами ДНК является фиксированной величиной, зависящей от липидного состава и условий среды. По нашим данным, ^¡труктуры, в которых стехиометрия липид/ДНК близка к R^f 1,5-2,0, присутствуют в препарате неэависимЬ'от foro в какой пропорции были смешаны компоненты, т.е. в избытке ДНК (А), или в избытке липида (В,С). Мы полагаем, что именно эта многослойная структура с фиксированной стехиометрией содержит термостабильную ДНК, температура плавления которой также не изменяется в различных смесях ДНК и катионного липида.

ПОЛИМОРФИЗМ ЛИПИДОВ В КЛЕТКЕ

Фазовые переходы в мембранах грамотрицательных бактерий в процессах транспорта высокомолекулярных веществ.

Гипотеза об участии мембранных контактов в транспорте высокомолекулярных веществ впервые была высказана Байером, изучавшим структуру мембран оболочки грамотрицательных бактерий. Такие контакты, названные автором зонами адгезии, были обнаружены только в плазмолизованных клетках, помещенных в гипертонические среды. В дальнейшем, зоны адгезии были обнаружены также в митохондриях и хлоропластах. Несмотря на всесторонние исследования, мы мало знаем о тонкой структуре и механизмах функционирования зон адгезии. Различные авторы по-разному представляют характер взаимодействия мембран в этих участках. Так, в соответствии с гипотезой Байера, в зонах адгезии внешняя и внутренняя мембраны бактериальной клетки вступают в непосредственный контакт, благодаря чему высокомолекулярные вещества, в процессе транспорта, последовательно пересекают гидрофобную область обеих мембран, не попадая в периплазматическое пространство. Такие представления согласуются с гипотезой о возможном участии в транспортных процессах инвертированных мицеллярных структур, возникающих в местах контакта двух мембран. Предполагается, что возникновение таких структур связано с полиморфным фазовым переходом липидов типа бислой-гексагональная Нп фаза. При этом остается неясным, каким образом поддерживается целостность гидрофобного барьера плазматической мембраны. Раше работа направлена на исследование структуры зон адгнезии и характера взаимодействия мембран в этих участках.

г

Динамика структурных преобразований мембран Escherichia coli в средах с высоким осмотическим

давлением.

Бактериальные клетки способны приспосабливаться к существенным изменениям осмотического давления окружающих растворов благодаря наличию сложных и пока еще мало изученных механизмов адаптации. Настоящая работа посвящена изучению динамики морфологических изменений клеток Escherichia coli в условиях плазмолиза, вызванного действием концентрированных растворов сахарозы.

Рис. 25. Структурные изменения в организации мембран Escherichia coli в первые секунды плазмолиза. (А)

- клетка до плазмолиза, ультратонкий срез, мембраны располагаются параллельно; (В)- 3 сек плазмолиза, ультратонкий срез, появляются складки, внешняя мембрана продуцирует пузырьки; (С) - 3 сек плазмолиза, замораживание-травление поверхности скола, показана складчатая поверхность клетки с пузырьками, аналогичными тем, которые видны на "В"; (D и Е) - поверхность скопа и ультратонкий срез клеток через 1,5

- 2,5 мин плазмолиза. Видны инвагинации плазматической мембраны и образование везикул в периплазматическом пространстве; (F и G) - поверхность скола и ультратонкий срез клеток через 10 - 20 мин плазмолиза. Показан процесс фрагментации плазматической мембраны и появление везикул с компонентами цитоплазмы в порпплазматическопл пространстве. Масштаб; 200 нм.

Наблюдения структурных изменений оболочки клеток Е. coli в широком временном интервале от 3 сек до 30 мин после добавления 20%-ного раствора сахарозы показали, что плазмолиз является сложным и многостадийным процессом, в течение которого происходят существенные изменения организации клеточных мембран (Рис.25). При этом выживаемость клеток после 30 мин плазмолиза была близка к 100%.

В течение первых 3 сек наиболее существенные изменения наблюдаются на наружной мембране, в то время как внутренняя мембрана и объём периплазматического пространства изменяются незначительно. В интервале времени от 20 сек до 10-20 мин происходит сжатие цитоплазмы и увеличение периплазматического пространства. В этот момент сахароза уже находится в периплазматическом пространстве, и осмотические силы приложены к внутренней мембране. Цитоплазма равномерно уменьшилась в объеме в результате выхода воды, и, при этом, внутренняя мембрана сохраняла связь с не сжимающейся наружной мембраной лишь в некоторых точечных участках (зонах адгезии). Поэтому

внутренняя мембрана образовывала куполообразные впячивания. Через 10 мин плазмолиза начинается процесс фрагментации внутренней мембраны в области зон адгезии. Наличие длинных тяжей периплазматического материала, соединяющих обе мембраны, позволяет предположить, что этот процесс обусловлен ростом сил натяжения в зонах адгезии вследствие уменьшения объема цитоплазмы.

Рис. 26. Плазмолиз 30 мин. «Экзоцитоз» цитоплазматических везикул в периплазматическое пространство. В периплазматичесхом пространстве появляются везикулы с гладкой поверхностью скола(А). На ультратонких срезах видно, что везикулы образованы двумя мембранами (В и В'). Масштаб: 200 нм.

Через 20—30 мин после начала плазмолиза (Рис.26) наблюдается процесс, который можно охарактеризовать как экзоцитоз или секрецию цитоплазматических везикул в периплазматическое пространство. По некоторым морфологическим признакам у этого процесса имеется некоторое сходство с экзоцитозом в эукариотических клетках, однако у бактерий мы не наблюдаем окончательного слияния везикулярной и плазматической мембраны. Везикула «одевается» в оболочку из плазматической мембраны и оказывается в периплазматическом пространстве. Схематическое изображение динамики плазмолиза представлены на Рис.37.

Поскольку, как это отмечалось выше, в наших экспериментах практически 100% клеток выживает после 30 мин плазмолиза, можно предполагать, что наблюдаемые процессы являются нормальным физиологическим ответом клеток на воздействие гипертонических сред.

О Зс 20с 4mm 10min 30min

Рис.27. Динамика плазмолиза клеток Escherichia coli в 20% сахарозе. ОМ -наружная мембрана, PG -пептидогликановый слой, IM - внутренняя мембрана, 1 - пузырьки на поверхности клетки, 2 - инвагинации внутренней мембраны, 3 - образование везикул в цитоплазме, 4 - тяжи периплазматического материала, 5 - фрагментация плазмомембраны и образование везикул в периплазме, 6 - экзоцитоз цитоплазматических везикул в периплазматическое пространство.

Полиморфное поведение мембран грамотрицательных бактерий в присутствии двухвалентных катионов.

Известно, что в присутствии двухвалентных катионов клетки некоторых грамотрицательных бактерий приобретают способность генетически трансформироваться в результате захвата экзогенной ДНК. Процедура трансфекции сводится к инкубации клеток при О'С и в присутствии ЮОмМ двухвалентных катионов (Са2+ или Ва2+) в течение нескольких часов. При этом, в среде находится также плазмидная ДНК. В дальнейшем клетки подвергают кратковременному тепловому шоку при 42'С. Электронная микроскопия замораживания-скалывания *

показывает (Рис.28), что инкубация Escherichia coli или Pseudomonas putida при О'С с двухвалентными катионами Са2+ и Ва2+ вызывает появление гладких, лишенных внутримембранных частиц участков (Рис.28А), что свидетельствует о процессах латерального фазового разделения белковых и липидных компонентов мембран. »

Рис.28. Электронная микроскопия замораживания-скапывания (А,В) и ультратонких срезов (C,D), показывающая возникновение полиморфных фазовых переходов с мембранах Escherichia coli в условиях, *

способствующих проникновению экзогенной ДНК в цитоплазму. А - клетки при О'С в присутствии 100мМ Са3*; B-D - препарат «А» после теплового шока 15 мин при 42'С. Стрелками показана трубчатые структуры гексагональной Ни фазы липидов. Как показано на рисунке, трубочки часто образуются в местах контактов между клетками. i

Последующий тепловой шок (3-15 мин при 42-44'С) способствует появлению на поверхности клеток трубчатых структур гексагональной Нц фазы (Phc.28B-D). Появляются многочисленные мембранные мостики между клетками, что может способствовать слиянию мембран и даже объединению цитоплазматического содержимого соседних клеток.

Спектры 31Р-ЯМР клеток при тепловом шоке обнаруживают появление нового максимума при 20 ррт в сторону низкого поля от сигнала раствора Н3Р04 (Рис.29). Известно, что подобный сдвиг в спектре фосфолипидов соответствует появлению гексагональной Нп фазы и хорошо коррелирует с данными электронной микроскопии.

Рис.29. Спектр "Р-ЯМР клеток Escherichia сoff (а) - при 42"С. Клетки были предварительно инкубированы при О'С в присутствии 150мМ Са2\ (А) -время накопления сигнала 2 часа; (В) • представлен дифференциальный спектр, полученный вычитанием из спектра «А» спектра, записанного с насыщением сигнала (импульсная последовательность DANTE, несущая частота отмечена стрелкой). Спектры получены в лаборатории И А.Василенко

-40 О 40

Более того, эксперимент с переносом насыщения ЯМР сигнала (Рис.29В) свидетельствует о наличии быстрого обмена молекул между новым максимумом (вновь сформированными структурами) и сигналом от бислоя, а также между сигналом от бислоя и изотропным сигналом (везикулярные и мицеллярные структуры). Последнее свидетельствует о наличии физического контакта и обмена материалом между этими структурами, что, в совокупности с электронно-микроскопическими данными, позволяет рассматривать все наблюдаемые структурные изменения результатом трансформации липидов бактериальных мембран. Как видно из Рис.30, тепловой шок приводит к существенному снижению выживаемости, однако количество выживших клеток достаточно для успешной трансформации.

Результаты данного исследования свидетельствуют об участии полиморфных превращений липидов в присутствии двухвалентных катионов Са2+ или Ва2+ в захвате клеткой экзогенной ДНК (Рис.31). Подобные изменения структурной организации мембран, индуцируемые не только двухвалентными катионами металлов, но и другими субстанциями, присутствующими в клетке, как например, специфическими катионными белками или полиаминами, могут иметь место в течение клеточного цикла, и способствовать таким процессам, как обмен генетической информации между клетками, захвату или секреции различных экзогенных субстанций.

Рис.30. Влияние продолжительности теплового шока при 42'С на выживаемость клеток - (о). Количество трансформированных клеток - (•). Эффективность захвата ДНК (—). По вертикали отложено относительное количество выживших клеток в начальный момент времени и количество трансформантов (100 соответствует ^клеток/мл). Данные получены совместно с А.Г.Сабельниковым.

о

О Ю 20ш1п ЗО

А

Рис. 31. Схематическое изображение полиморфных фазовых переходов в мембранах клеток грамотрицательных бактерий, индуцируемых катионами Са2* или Ва2- при тепловом шоке. А -изображены две бактериальные клетки, на поверхности и в местах контактирования которых формируются полиморфные фазы липидов; В - процесс начинается с того, что при О'С происходит освобождение участков бислоя фосфолипидов в результате латеральной сегрегации белков. В присутствии катионов Садили Ва2*эти участки становятся местом адсорбции ДНК, добавленной в среду. Последующее повышение температуры индуцирует полиморфные фазовые переходы липида, слияние соседних мембран и образование пор, через которые может проникать ДНК.

Транспорт ДНК через мембраны при инфицировании клеток Escherichia coli фагом Т4

Инфицирование клеток E.coli фагом Т4 является наиболее хорошо изученным примером транслокации ДНК через мембраны оболочки грамотрицательных бактерий. Было показано, что фаг Т4 инфицирует клетки в зонах адгезии. При этом вопрос о том, использует ли фаг уже существующие в клетке зоны адгезии или индуцирует появление новых, оставался открытым. В соответствии со «шприцевой моделью», стержень фага, выдвигающийся при сокращении фаговой частицы, прокалывает сначала внешнюю, а затем внутреннюю мембраны бактериальной клетки. После этого в цитоплазму впрыскивается ДНК. При этом, предполагается «

пассивное участие мембран в процессе инфицирования.

Наши исследования позволяют предложить иную модель инфицирования клеток, в соответствии с которой предполагается более сложный процесс взаимодействия фага с мембранами бактериальной клетки. Электронная микроскопия ^

ультратонких срезов и реплик с поверхности сколов клеток Escherichia coli, фиксированных через 5 мин после начала инфицирования при комнатной температуре, выявляет разнообразные изменения в организации мембран. Прежде всего, обращает на себя внимание появление инвагинаций внешней мембраны. В результате инвагинации под действием фага, внешняя мембрана бактериальной клетки прогибается и вступает в непосредственный контакт с внутренней мембраной. Ультратонкие срезы позволяют обнаружить также появление межмембранных мостиков, индуцированных фагами (Рис.32А). Измерения показывают (Рис.32В), что внутренний диаметр мостиков, равный 50Ä, значительно меньше диаметра стрежня фага, который, как известно, равен 90Ä. Внешний диаметр мостика при этом составляет приблизительно 120-125Ä. Как видно на представленных микрофотографиях, электронно-прозрачные линии, ограничивающие мостик по своей

ширине и плотности, не отличаются от клеточных мембран и, по всей видимости, представляют собой срез наиболее гидрофобной части мембраны толщиной 30-35 А.

Ww в—Ьп . кЯк* С

Рис. 32. Межмембранные мостики в клетках Eco//, продуцируемые фагом Т4. (а) - мостики между внешней и внутренней мембранами бактериальной клетки на ультратонких срезах; (б) - распределение плотности в направлении, перпендикулярном мостику (представлено негативное изображение межмембранного мостика, взятого из рисунка а, и наложенная на это изображение денситограмма). (в) - гипотетическая схема межмембранного «тоннеля», предполагающая проникновение белков стержня фага внутрь гидрофобной области мембраны, основанная на проведенных измерениях.

Temperoture °С 40 30 20 10

;10

10 20 30 АО Temperature °С

В

3J9 3129 139 149 159 -r'io"3K

Рис. 33. (А) -Температурная зависимость величины лаг-периода выхода калия из цитоплазмы Escherichia coli при инфицировании фагом Т4. Лаг-период определялся как время, протекающее от момента добавки фагов к клеточной суспензии до начала выхода ионов калия из цитоплазмы. (В) -Температурная зависимость начальной скорости выхода капия из цитоплазмы клеток E.coli, инфицированных фагам Т4, выраженная в координатах Аррениуса. Клетки инфицированы в стандартной питательной среце М9 в присутствии (о) и в отсутствии (•) глюкозы в среде. Перед проведением измерений клетки дважды промывали при 4°С в среде, содержащей 5 мМ натриевую соль MOPS и 0,1 М NaCI (pH 7,0). Активность ионов калия регистрировали калий-селективным электродом ЕМ-К01, Тотальное содержание цитоллазматического калия оценивалось путем добавки полимиксина В (320 единиц на 1 мл) при 37°С. Данные получены совместно с А.А.Хусаиновым, Р. Даугелавичусом и Э Бакене

В соответствии с представленными измерениями белки стержня фага должны глубоко проникать в гидрофобную область окружающей его мембраны (Рис.32С). Данная структура была нами названа «тоннелем». Гидрофобное взаимодействие белков стержня фага с мембранным бислоем может предотвращать утечки ионов, что позволяет поддерживать мембранный потенциал, необходимый для жизнедеятельности клетки и продуцирования новых частиц фага.

Известно, что пониженная температура может существенно замедлять процесс инфицирования. Наши наблюдения показывают (Рис.33), что при понижении температуры происходит увеличение лаг-периода выхода калия (Рис.ЗЗА) и резкое увеличение начальной скорости выхода калия (Рис.ЗЗВ).

Рис.34. Изменения структурной организации мембран клеток Escherichia coli, индуцируемые фагом Т4 при различных температурах. Метод ультратонких срезов. Внизу представлены схематические изображения наблюдаемых межмембранных мостиков.

Совокупность полученных данных позволяет разделить процесс инфицирования натри независимые стадии:

1). При температуре 0-6°С мы наблюдали прогиб внешней мембраны и образование непосредственного контакта между внешней и внутренней мембранами бактериальной клетки (Рис.34А).

2). При температуре выше 6-7°С начиналось слияние мембран и образование широких межмембранных мостиков. Этот процесс коррелирует с началом выхода ионов калия из цитоплазмы (Рис.34В). При этом, начинается инфицирование.

3). При температуре выше 20°С диаметр межмембранных мостиков существенно уменьшался (Рис.34С). При этом наблюдается излом начальной скорости утечек ионов калия от температуры на графике Аррениуса (Рис.3 ЗВ), что также свидетельствует о существовании структурной перестройки в мембранах при 20'С.

1 Г ==о

Рис. 35. Схема, объясняющая наши представления о последовательных стадиях процесса инфицирования клеток Eco// фагом Т4. (1) - инфицирование нативных клеток. Фаг адсорбируется на поверхность клетки (1А), сокращается и прогибает стержнем внешнюю мембрану (1В). Вступающие во взаимодействие мембраны претерпевают процесс слияния (1C;1D) в результате чего образуется структура поры и ДНК фага инецируется в цитоплазму (1Е). При этом через пору может происходить утечка ионов. Далее мембрана специфически взаимодействует со стержнем, образуя структуру тоннеля (1F). Этот момент соответствует закрытию отверстия и прекращению утечки. (2А') - у клеток, деэнергизованных цианидом или мертиолятом, расстояние между мембранами увеличено. При этом контакт между мембранами не осуществляется (2В1), и следовательно, слияния мембран не происходит. В результате, ДНК абортивно впрыскивается в периплазматичекое пространство (2С). Обозначения: ОМ - внешняя мембрана; IM -внутренняя, плазматическая мембрана. '

Межмембранные мостики никогда не удавалось наблюдать на клетках, обработанных такими метаболическими ядами, как СССР, цианид или арсенат; что находится в хорошем соответствии с представлениями о необходимости мембранного потенциала для инфицирования. Отличительной чертой деэнергизованных' клеток

было значительное увеличение периплазматического пространства и, следовательно, межмембранного расстояния. Такие изменения, возможно, являются следствием осмотического сжатия цитоплазмы после исчерпания клеточной энергии и потери цитоплазматического калия. Это указывает на важную роль расстояния между мембранами при инфицировании, как показано на схеме (Рис.35)

Известно, что бактериофаг Т4 способен лизировать клетки Escherichia coli . Нами было обнаружено, что при температуре ниже 14'С лизис практически не наблюдался. При более высоких температурах его скорость возрастала, достигая максимума при 45-50'С. Кроме того, наблюдалась задержка от момента добавки фагов до начала лизиса. Величина задержки также завесила от температуры.

Проведенные структурные исследования показали, что лизис начинается с выпячивания мембран бактериальной клетки и отшнуровывания везикулярных структур (Рис.3 б). Вследствие этого, как показывают наблюдения, в месте разрыва внешняя и внутренняя мембраны бактериальной клетки могут сливаться, в результате чего образуется стабильная структура в виде поры диаметром около 100 - 500 нм (Рис.ЗбВ).

Мы полагаем, что наблюдаемые выпячивания мембран могут возникать вследствие нарушения целостности пептидогликанового слоя в некоторых локальных участках. Нами было показано, что на ранних стадиях инфицирования бактериальных клеток наиболее явные структурные изменения происходят в периплазматическом пространстве. Эти изменения связаны с инвагинацией внешней мембраны и образованием кармана. Как указывалось выше, такие структуры индуцируются лишь немногими фагами (около 1 - 5% частиц фага).

Рис. 36..Ультратонкие срезы клеток Escherichia coli, инфицированных фагом Т4. Представлены структурные изменения в мембранах, сопровождающие процесс лизиса извне. Масштаб 0.1 мкм.

В соответствии с нашей гипотезой (Рис.44), в месте формирования инвагинаций происходит нарушение целостности пептидогликанового слоя, поскольку инвагинация занимает значительный объем периплазматического пространства и, вероятно, вытесняет пептидогликан в данном участке. Мы не исключаем возможности того, что процесс вытеснения может осуществляться с участием периплазматических ферментов. Именно эти участки могут быть «слабым местом» в оболочке бактериальной клетки и впоследствии выпячиваться наружу под действием осмотических сил.

Слияние мембран при лизисе клеток Escherichia coli, индуцированном фагом Т4

! i

инициированных фагом Т4. (А)- нарушение целостности лептидогликанового слоя в месте инвагинации наружной мембраны (НМ) и ее контактирование с внутренней мембраной (ВМ); (В) - выпячивание наружу обеих мембран, (С) - отшнуровывание везикул в окружающую среду; (0) — смыкание гидрофобных краев мембран; (Е) - образование канала. Стрелки - действие осмотических сил на внутреннюю мембрану и потоки цитоплазмы из клетки.

Взаимодействие катионных липосом с плазматической мембраной эритроцитов

В ранних работах предполагалось, что катионные липосомы просто сливаются с плазматической мембраной клетки в результате чего их содержимое попадает в цитоплазму. В дальнейшем многие исследователи пришли к заключению, что наиболее вероятным путем проникновения различных катионных агентов в цитоплазму является эндоцитоз.

В данном исследовании проводится анализ морфологических характеристик взаимодействия катионных липосом с плазматической мембраной эритроцитов человека. Ее исследование особенно актуально в силу того, что в медицинской практике часто используется инъекция катионных липидов в русло крови где часть липосом может взаимодействовать с мембраной эритроцитов наряду с мембранами других клеточных компонентов крови.

Нами было обнаружено, что при взаимодействии с катионными липосомами на РР-поверхности скола мембран эритроцитов наблюдалось резкое снижение количества'внутримемебранных частиц (ВМЧ) и формирование гладких участков. ,

При этом, на ультратонких срезах можно было наблюдать адсорбцию липосом на поверхности клеток. Некоторые липосомы сливались с плазмамсмбраной. Анализ показывает, что гладкие участки на поверхности сколов плазмамембраны соответствовали местам адсорбции липосом. I

Через несколько минут после добавления липосом морфология эритроцитов существенно изменялась. Особенно драматическими были изменения эритроцитов, обработанных смесью лецитина и октадецилямина. Происходило существенное набухание клеток и трансформация в сфероциты (не показано). При этом в первые 10 мин наблюдался процесс инвагинации внешней мембраны и образование эндосом (Рис.28А). Процесс обособления эндосом морфологически соответствовал процессу эндоцитоза.

■мЯННИЯНШНННН^^^^^^^^Н^^Н Ж-гЯШь^ЩГ Ц< 11 |—И МП IИ .........'Г""** .

Рис.28. А - ультратонкий срез эритроцита человека, обработанного липосомами из ОС-холестерина и йОРС. Фиксация осмием через 10 мин после добавления липосом. Наблюдается процесс эндоцитоза и образования эндосом в цитоплазме. В - реплики с поверхности сколов тех же эритроцитов, криофиксированных через 30 мин после добавления липосом. Наблюдается экзоцитоз эндосом.

В более поздний период времени, приблизительно через 30 мин и позже начинался новый процесс. Мембраны эндосом контактировали с плазматической мембраной со стороны цитоплазмы и отделялись в окружающую среду. При этом, в области контактирования плазматической мембраны с эндосомой, поверхность скола освобождалась от внутримембранных частиц и выглядела гладкой, что свидетельствует о формировании специфического взаимодействия между мембранами (Рис.28В). Наблюдаемые изменения суммированы на схеме (Рис.38).

Рис.Зв.Схематическое изображение процессов взаимодействия катионных липосом с мембраной эритроцита. Показано, что при адсорбции на поверхность клетки липосомы плотно контактируют с мембраной эритроцита(1). В месте адсорбции липосом образуется специфическая зона контакта (2). Предполагается, что именно в этих участках наблюдаются гладкие, лишенные внутримембранных частиц • поверхности сколов, что может предшествовать слиянию мембран (3). Исходно, мембрана эритроцита

близка по своим свойствам к плоскому бислою (А), образованному цилиндрическими молекулами липида (для простоты участие белков не рассматривается). В результате адсорбции катионных липосом на поверхности мембраны (В - полярные головы катионного липида закрашены черным) отрицательный I заряд липидов внешнего монослоя плазматической мембраны нейтрализуется, что создает условия для

более компактной упаковки молекул липида и сокращения площади внешнего монослоя. В результате происходит прогиб мембраны (4) и формирование эндосом. Дальнейшее слияние мембран приводит к накоплению положительного заряда в эндосоме, в результате чего она взаимодействует с внутренним монослоем плазматической мембраны (5), что напоминает процесс экзоцитоза.

Липосомы с низкой эффективностью в трансфекции (смесь DC-холестерина и DOPC) оказывали также меньший эффект на структуру плазматической мембраны, хотя они эффективно адсорбировались на поверхности клеток. Напротив, существенные структурные изменения производили липидные смеси, содержащие DC-холестерин и DOPE, а также лецитин и октадециламин. Известно, что смесь DC-холестерини и DOPE очень активна в трансфекции, тогда как смесь лецитина и октадециламина обладает цитотоксическим действием. В последнем случае действие катионных липосом на плазматическую мембрану было наиболее выраженным, и вероятно, разрушительным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе приводятся экспериментальные данные, свидетельствующие о единстве механизмов и сходстве структурных проявлений фазовых переходов липидов в искусственных системах и в живой клетке. Можно предположить, что в процессе эволюции способы использования клеткой способности липидов к сложным и разнообразным структурным перестройкам совершенствовались, что позволяло обеспечивать ее разнообразные физиологические отправления. Различные фазы липидов, такие как бислой, кубические и, возможно, гексагональные фазы стали неотъемлемыми элементами конструкции клеток. При этом каждой из • фаз, образуемых липидами, отводится определенная роль в процессах жизнедеятельности.

Плоский или незначительно искривленный бислой выполняет функции барьера, •

отделяющего клетку от окружающей среды, а у эукариотических клеток, разграничивающий также различные компартменты цитоплазмы. Однако все разнообразие транспортных функций, необходимое для обмена внутриклеточного содержимого с окружающей средой, осуществляется благодаря возникновению специфических и весьма избирательных дефектов этого барьера, которые обычно называются каналами, переносчиками, порами и туннелями. К числу указанных явлений, связанных с нарушениями барьерных свойств мембран и транспортом веществ, можно отнести также слияние мембран, происходящее при экзо- и эндоцитозе, делении клеток, секреции и многих других процессах, которые, в соответствии с представлениями большинства исследователей, существуют исключительно благодаря функционированию белков.

Приведенные в данном исследовании факты свидетельствуют о возможности и необходимости участия липидов в структурных перестройках мембраны. Липиды можно рассматривать не только как активную среду, обеспечивающую необходимые условия для функционирования белков, но и как непосредственного участника разнообразных процессов, направляемых белками и модулируемых другими мембранно-активными молекулярными компонентами клетки. Эти процессы, наблюдаемые в искусственных системах как фазовые переходы, могут развиваться в клетке в весьма ограниченных локальных участках, что существенно затрудняет их исследование. Поэтому для нас особый интерес представляет отыскание пока что немногочисленных примеров вовлечения фазовых переходов липидов в процессы «

жизнедеятельности. Наши исследования показывают, что, как в искусственных мембранах, так и в живой клетке преобразования структуры бислоя осуществляются благодаря коллективному поведению компонентов бислоя. В эти процессы могут вовлекаться также соседние мембраны благодаря формированию контактов между ^

ними и слиянию. Исследование этих процессов имеет большое практическое значение и находит все большее применение при создании липосомальных препаратов в медицине, или при создании биосенсоров, мембранных фильтров, сорбентов и микрочипов в технике.

выводы

1. На модельных мембранных системах и мембранах живых клеток исследованы различные проявления и биологическое значение фазовых переходов и полиморфизма липидов. Показана высокая степень сходства структурных изменений, наблюдаемых как в моделях, так и в клетках. Это свидетельствует о единстве физико-химических процессов, лежащих в основе этих явлений.

2. Закономерное чередование полиморфных фаз в зависимости от соотношения зарядов мембраны обнаружено в смеси анионного фосфолипида кардиолипина и катионного фосфолипида этилфосфатидилхолина. Раздельно эти липиды образуют только ламеллярную фазу, тогда как смесь липидов образует различные полиморфные структуры: губчатую, кубитческую и гексагональную фазы. Предполагается, что взаимодействие зарядов определяет степень упаковки полярных головок липидов и влияет на их полиморфное поведение.

3. Обнаружено, что хлорофилл способен индуцировать полиморфные фазовые переходы липидов хлоропластов. Показано, что в комплексе с липидами хлоропластов хлорофилл способствует появлению межмембранных контактов, слиянию мембран и образованию кубической и гексагональной Нп фаз. Наблюдаемые структурные изменения, по-видимому, связаны с тем, что объемное парфириновое кольцо хлорофилла, находящееся в периферических областях бислоя, нарушает упаковку полярных головок липидов.

4. Перекисное окисление липидов способно существенно влиять на структурную организацию мембран. Нами было показано, что в протеолипосомах из смеси кардиолипина, лецитина, и цитохрома с при повышенной температуре образуются высокомолекулярные комплексы олигомеров белка и продуктов перекисного окисления липидов. Такие комплексы способны образовывать мицеллы внутри бислоя. При дальнейшем увеличении степени окисления мембраны разрушаются и мицеллярные структуры появляются в растворе.

5. Установлено, что при взаимодействии делипидизированного бактериородопсина с липидами, выделенными из пурпурных мембран (соотношении липвд/белок 0,33/1), образуются гексагональная решетка, аналогичная нативным пурпурным мембранам, тогда как при реконструкции этого' белка с фосфатидилхолином и при наличии высокой концентрации №С1, образуется орторомбическая решетка. Предложенная нами гипотеза дает объяснение данного явления на основе процессов фазового разделения белков в мембране.

6. Обнаружено, что молекула ДНК в присутствии катионов кальция способна взаимодействовать с природными и синтетическими фосфатидилхолинами, существенно влияя на их фазовое поведение. Возрастает температура плавления синтетического фосфолипида БРРС, исчезает предпереход, существенно расширяются температурные пределы существования «риппл» фазы. В сходных условиях природный фосфатидилхолин приобретает способность к формированию трубчатых структур гексагональной фазы, внутри которых может быть заключена молекула ДНК.

7. Показано, что в комплексах с катионными липидами образуется термостабильная форма ДНК, денатурирующая при температурах в интервале 105-115'С. На основе литературных и собственных данных предполагается, что обнаруженное нами явление связано с формированием специфической фазы, в которой многочисленные бислойные структуры липида чередуются со слоями ориентированных нитей ДНК. • -'•■-•*.:. I

„ | Библиотека ' /

| С.Петербург { 1____ 09 300 акт /

8. Показано, что двухвалентные катионы Са2+ и Ва2+ способны индуцировать формирование в мембранах грамотрицательных бактерий Escherichia coli и Pseudomonas pulida полиморфные фазовые переходы в условиях, обычно используемых для трансфекции этих клеток. Предполагается наличие непосредственной связи между наблюдаемыми нами нарушениями целостности мембран, связанных с полиморфизмом липидов и возможностью переноса экзогенной ДНК в цитоплазму.

9. Обнаружено, что фаг Т4 вызывает слияние внешней и внутренней мембран клеток Escherichia coli, в результате чего образуется специфическая структура «тоннеля», через который ДНК может попадать в цитоплазму. Процессы слияния мембран сопровождают также лизис клеток, индуцируемый фагом Т4. Наблюдаемые , нами структурные изменения мембран бактериальной клетки свидетельствуют о наличии нескольких стадий взаимодействия и слияния мембран, типичных для полиморфных фазовых переходов.

10. Сходные изменения структуры клеточных мембран, обусловленные ^ единством механизмов фазовых переходов бислоя, наблюдаются в таких различных процессах, как действие двухвалентных катионов металлов или повышенного осмотического давления на мембрану бактериальной клетки, или инфицирование бактериальных клеток фагами, или адсорбция катионных липосом на поверхность эритроцита. Во всех перечисленных случаях происходит изменение кривизны бислоя, образование межмембранных' контактов, сегрегация компонентов в плоскости мембраны и, наконец, слияние мембран.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шныров B.JI., Тараховский Ю.С.. Боровягин В.Л. (1981) Изучение структурных изменений в пурпурных мембранах из Halobacterium halobium при температурной и щелочной денатурации. Биоорг. Химия. 4, 1054-1059.

2. Тараховский Ю.С., Образцов В.В. (1982) Ультраструктурный и биохимический анализ фрагментированных мембран микросом. Биохимия. 47, 842-849.

3. Мальковская Г.М., Викторов A.B., Василенко И.А., Миронов А.Ф., Швец В.И., Евстигнеева Р.П., Образцов В.В.. Тараховский Ю.С.. Боровягин В.Л. (1982) ( Влияние цитохрома с на движение и проницаемость модельных фосфолипидных мембран. Изучение методом ЯМР. Биоорг. Химия. 8, 1563-1568.

4. Василенко И.А., Викторов A.B., Евстигнеева Р.П., Тараховский Ю.С., Образцов

В.В., Боровягин В.Л. (1982) Влияние перекисного окисления фосфолипидов на I

морфологию модельных фосфолипидных мембран. Боорг. Химия. 8, 1281-1284.

5. Borovyagin V.L., Muronov A.F., Rumyantseva V.D., Tarahovskv Y.S.. Vasilenko I.A. (1984) Model membrane morphology and crosslinking of oxidized lipids with proteins.

' J. Ultrastr. Res. 89, 261-273.

6. Боровягин В.Л., Василенко И.А., Миронов А.Ф., Румянцева В.Д., Тараховский Ю.С. (1984) Влияние олигомеризации белков при окислении фосфолипидов на морфологию модельных и биологических мембран. Биол. Мебраны. 1,926-936.

7. Сорокоумова Г.М., Василенко И.А., Тараховский Ю.С., Боровягин В.Л., Швец В.И. (1985) Сравнительная оценка методами 31Р-ЯМР и электронной микроскопии роли моноглюкозилдиглицерида и фосфатидилэтаноламина в полиморфном поведении модельных мембран. Биол. Мебраны. 2, 649-656.

8. Боровягин В.Л., Василенко И.А., Сорокоумова Г.М.. Тараховский Ю.С. (1986) Влияние хлорофилла на структурную организацию модельных мембран, состоящих

из галактолипидов и фосфатидилглицерина. Изучение методом электронной микроскопии замороженных сколов. Биол. Мембраны. 3,592-600.

9. Тараховский Ю.С.. Сабельников И.А., Ильяшенко Б.Н., Боровягин В.Л. (1986) Слияние клеток грамотрицательных бактерий при действии двухвалентных катионов. ДЛЯ СССР, 287,1474-1477.

10. Borovyagin V.L., Sabelnikov I.A., Tarahovsky Y.S., Vasilenko I.A. (1987) Polymorphic behavior of gram-negative bacteria membranes. J. Membrane Biol. 100, 229-242.

11. Боровягин В.Л., Василенко И.А., Сабельников А.Г., Тараховский Ю.С. (1987) Полиморфные превращения в клеточных мембранах грамотрицательных бактерий. Биол. Мембраны. 4, 624-638.

12. Боровягин В.Л., Василенко И.А., Сабельников А.Г., Тараховский Ю.С. Полиморфные превращения в клеточных мембранах грамотрицательных бактерий (1987) Биол. Мембраны. 4,624-638.

13. Borovyagin V.L., Tarahovsky Y.S., Vasilenko I.A. (1988) Polymorphism in galactolipid/phosphatidylglycerol model membranes initiated by chlorophylls: 31P-NMR and electron microscopy studies. Biochim. Biophys. Acta. 939,111-123.

14. Тараховский Ю.С., Манувахова M.III., Гонгадзе Г.М. (1989) Динамика изменений мембран оболочки Escherichia coli в условиях плазмолиза Биол. Мембраны. 6, 530540.

15. Чернышов В.И., Смехова Т.Р., Тараховский Ю.С.. Боровягин В.Л. (1989) Структурные изменения мембран эритроцитов человека при взаимодействии с положительно заряженными липосомами. Биол. Мембраны. 6, 516-529.

16. Borovyagin V.L., Chemishov V., Tarahovsky Y.S., Smekhova N. (1989/90) Dynamics of interaction of phosphatidylcholine/octadecyalmine liposomes with human erythrocytes: electron microscopy study. J. Liposome Res. 1,269-286.

17. Тараховский Ю.С.. Хусаинов A.A. (1990) Изменения структурной организации мембран Escherichia coli при инфицированиии бактериофагом Т4. Биол. Мембраны. 7, 1311-1317.

18. Tarahovsky Y.S.. Khusainov А.А., Deev А.А., Kim Y.V. (1991) Membrane fusion during infection of Escherichia coli cells by phage T4. FEBS Lett. 289,18-22.

19. Боровягин В.Л., Барсуков Л.И., Василенко И.А., Деев А.А., Единцов И.М., Половникова О.Ю., Симонова Т.Н., Тараховский Ю.С. (1994) Формирование кристаллической упаковки при реконструкции бактериородопсина в липосомы из яичного лецитина. Доклады РАН. 338. 113-115.

20. Тараховский Ю.С., Хусаинов А.А., Иваницкий Г.Р. (1994) Индуцированный бактериофагом Т4 лизис клеток Escherichia coli. Доклады РАН. 335,519-521.

21. Тараховский Ю.С.. Хусаинов А.А.., Иваницкий Г.Р. (1994) Температурные условия образования , межмембранных контактов в клеточном окружении Escherichia coli в результате инфекции бактериофогом Т4 .Доклады РАН. 335, 103105.

22. Тараховский Ю.С., Хусаинов А.А., Даугелавичус Р.Ю., Бакене Э.В. (1994) Новые представления о механизмах транспорта фаговой ДНК при инфицировании грамотрицательных бактерий. Биол. Мембраны. 11,12-25.

23. Tarahovsky Y.S.. Ivanitsky G.R., Khusainov А.А.. (1994) Lysis of Escherichia coli cells induced by bacteriophege T4. FEMS Microbiol. Letters. 122,195-200.

24. Половникова О.Ю., Суханов C.B., Тараховский Ю.С., Симонова Т.Н., Василенко И.А., Барсуков Л.Н.(1995) Влияние бактериородопсина на термотропное поведение 1,2-дипальмитоил-5п-глицеро-3-фосфатидилхолина в реконструированных пурпурных мембранах. Биол. Мембраны. 12,409-420.

25. Половникова О.Ю., Симонова Т.Н., Тараховский Ю.С., Никонова Т.Н., Суханов С.В., Василенко И.А., Барсуков Л.И. (1995) Реконструкция пурпурных мембран из делипидизированного бактериородопсина с использованием эндогенных и экзогенных липидов. Влияние структурных и внешних факторов. Биол. Мембраны. 12,260-275.

26. Tarahovsky Y.S., Khusainov А.А., Daugelavichus R., Bakene E. (1995) Structural changes in Escherichia coli membranes induced by bacteriophage T4 at different temperatures. Biophys.J. 68,157-163.

27. Tarahovsky Y.S., Khusainova R.S., Gorelov A.V., Nicolaeva T.I., Deev A.A., Dawson A.K., Ivanitsky G.R. (1996) DNA initiates polymorphic structural transitions in lecithin.

FEBS Lett. 390,133-136. „

28. Тараховский Ю.С., Хусаинова P.C., Горелов A.B., Давсон К.А., Иваницкий Г.Р. (1996) Влияние ДНК на ультраструктурную организацию лйпосом из лецитина в присутствии катионов кальция. Доклады РАН. 350,411-413. '

29. Тараховский Ю.С. (1996) Взаимодействие лйпосом, содержащих ДК-холестерин j с эритроцитами человека. Электронно-микроскопическое исследование. Бюл. Эксп.

Биол. Мед. 122, 83-86.

30. Тараховский Ю.С., Иваницкий Г.Р. (1998) Липосомы в генной терапии. Структурный полиморфизм липидов и эффективность доставки генетической информации. Биохимия. 63,5-18.

31. Тараховский Ю.С.. Деев А.А., Масулис И.С., Иваницкий Г.Р. (1998) Структурная организация и фазовое поведение комплекса ДНК-кальций-дипальмитоилфосфатидилхолин. Биохимия. 63,1325-1331. 1

32. MacDonald R.C., Rozenzweig H.S., Rakhmanova V.A., Choi K.L., Tarahovsky Y.S., Kennedy M.T., Macintosh T.J. (1998) Physical and biophysical properties of cationic phospholipids. Biophys.J., 74, A310. Annual meeting of the Biophysical Society, Kansas City.

33. MacDonald R.C., Ashley G.W. Shida M.M., Rakhmanova V.A., Tarahovsky Y.S.. Pantazatos D.P., Kennedy M.T., Pozharsky E.V., Baker K.A., Jones R.D., Rosenzweig H.S., Choi K.L., Qiu R., Mcintosh T.J. (1999) Physical and biophysical properties of cationic triesters of phosphatidylcholine. Biophys. J., 77,2612-2629.

34. Tarahovsky Y.S.. Arsenault A.L., Mcintosh T.J., Epand R.M., MacDonald R.C. (2000) , Electrostatic control of phospholipid polymorphism. Biophys. J. 79,3193-3200.

35. Tarahovsky Y.S., Rakhmanova V.A., Epand R.M., MacDonald R.C. (2001) Thermal stabilization of DNA by cationic lipids. BiophysJ.S0, 2153. Annual meeting of the Biophysical Society, Boston. ^

36. Tarahovsky Y.S.. Pozharski E.V. Mcintosh T.J., MacDonald R.C.(2002) Influence of anionic substances on the phase transition and structure of bilayers prepared from cationic triesters of phosphatidylcholine. Biophys. J., 82, 159a. Annual meeting of the Biophysical Society, San Francisco.

37. Koynova R.. Tarahovsky Y.. MacDonald R.C. (2002) On the phase behavior of hydrated cationic triesters of phosphatidylcholine: low-temperature polymorphism liquid crystalline-to-gel transition aspects. Biophys.J. 82, 158a. Annual meeting of the Biophysical Society, San Francisco.

38. Tarahovsky Y.S., Rakhmanova V.A., Epand R.M., MacDonald R.C. (2002) High temperature stabilization of DNA in complexes with cationic lipids.Biophys.J.,82,264-273.

39. Tarahovsky Y.S.. Koynova R., MacDonald R. (2003) Lost in labirinths of cubic phase. Restrictions on DNA release from lipoplexex. Biophys.J., 84, 508a. Annual meeting of the Biophysical Society, San Antonio.

»

и

к

г

Подписано в печать 18.09.2003 г. Формат 60 х 84'/|(..

Объем 2,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 2811.

ГУП МО «Серпуховская типография» Министерство по делам печати и информации Московской области

2оо2-А

]

M

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тараховский, Юрий Семенович

Актуальность проблемы;

Цели и задачи исследования

Научная новизна

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

1. Многообразие структурных форм, образуемых липидами

1.1; Фазовые переходы бислойных структур

1.2. Полиморфные фазовые переходы: бислой - небислойные структуры

1.3. Свойства липидов, определяющие формирование бислойных или небислойных структур

1.4. Механизм трансформации бислоя в небислойные структуры

2. Влияние различных веществ на полиморфизм липидов

2.1. Биоактивные липиды

2.2. Модуляция полиморфизма липидов полипептидами и белками

2.2.1. Взаимодействие полипептидов с бислоем

2.2.2. Полиморфные фазовые переходы липидов в присутствии полипептидов и белков

3. Полиморфизм липидов /л vivo

3.1. Небислойные структуры липидов в цитоплазме

3.2. Участие липидов в транслокации молекул через мембраны

3.3. Роль полиморфизма липидов в процессах слияния мембран

3.3.1. Интермедиаты слияния;

3.3.2. Участие небислойных структур в процессах слияния мембран

4. Полиморфизм липидов в генной терапии

4.1. Задачи и методы генной терапии

4.2. Методы доставки генетического материала

4.3.1. Вирусы в качестве средств доставки генетического материала

4.5.2. Искусственные транспортные средства;

4.6.3. Катионные липиды

4.7. Структура ДНК-липидных комплексов

4.8. Механизмы липофекции

4.8.1. Доставка ДНК-липидного комплекса к поверхности клеток.

4.8.2. Взаимодействие комплекса с клеточной поверхностью и проникновение в эндосомы.

4.8.3. Освобождение ДНК в цитоплазму

4.8.4. Транспорт ДНК в ядро

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

Методы исследования.

1. Приготовление липосом

2. Протеолипидные комплексы

3. Приготовление препаратов ДНК

4. ДНК-липидные комплексы

5. Определение трансфекционной активности ДНК-липидных комплексов

6. Бактерии

7. Инфицирование клеток бактериофагами■

8. Определение выхода калия из цитоплазмы клеток Escherichia со//

9. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия

10. Р-ЯМР спектроскопия

11. Рентгеновская дифракция

12. Электронная микроскопия а. Метод замораживания-скалывания б. Метод ультратонких срезов в. Метод негативного окрашивания

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Исследование модельных систем

1.1. Электростатические силы в регуляции полиморфного поведения липидов

1.1.1. Формирование инвертированной гексагональной Нп фазы в эквимолярных смесях катионных и анионных липидов

1.1.2. Кубические фазы образуются в образцах, содержащих двойной избыток анионного или катионного липидов

1.1.3. Большой дисбаланс зарядов приводит к исчезновению кубической фазы и появлению губчатой структуры

1.1.4. Чистые катионные и анионные липиды образуют ламеллярную фазу

1.1.5. Общие закономерности в поведении смесей анионных и катионных липидов

1.2. Полиморфизм галакголипидов, инициируемый хлорофиллом

1.3. Фазовые переходы в белок-липидных комплексах

1.3.1. Роль перекисного окисления в белок-липидных взаимодействиях

1.3.2. Латеральная сегрегация белка в мембране при формировании двумерных кристаллов

1.4. Фазовые переходы в ДНК-липидных комплексах

1.4.1. Комплекс ДНК-Са2+-ОРРС

1.4.2. Комплекс ДНК- Са2+-лецитин

1.5. Стабилизация ДНК в комплексах с катионными липидами

1.5.1. Ультрафиолетовая спектроскопия ДНК-липидных комплексов после теплового воздействия

1.5.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия ДНК-липидных комплексов после тепловой обработки

1.5.3. Анализ нативных ДНК-липидных комплексов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии

1.5.4. Разделение и анализ термостабильного и термолабильного комплексов

1.5.5. Структурные основы термостабильности ДНК

2. Полиморфизм липидов в клетке

2.1. Фазовые переходы в мембранах грамотрицательных бактерий

2.1.1. Динамика структурных преобразований мембран Escherichia coli в средах с высоким осмотическим давлением

2.1.1. Полиморфное поведение мембран грамотрицательных бактерий в присутствии двухвалентных катионов

2.2. Транслокация ДНК через мембраны при инфицировании клеток Escherichia coli фагом Т

2.2.1. Электронно-микроскопический анализ взаимодействия фага с клеткой|

2.2.2. Температурная зависимость процессов инфицирования

2.2.3. Инфицирование деэнергизованных клеток

2.2.4. Последовательные стадии структурных изменений в системе бактериофаг-бактериальная клетка в процессе инфицирования

2.2.5. Слияние мембран при лизисе клеток Escherichia coli, индуцированном фагом Т

2.3. Взаимодействие катионных липосом с мембраной эритроцитов

2.3.1. Способность липосом к полиморфным превращениям

2.3.2. Адсорбция липосом на поверхности эритроцитов

2.3.3. Процессы эндоцитоза и экзоциттоза липосом

2.3.4. Возможное значение и механизмы наблюдаемых структурных изменений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Липидный бислой и небислойные структуры в организации и функционировании биологических мембран"

Актуальность проблемы

Природные липиды способны образовывать разнообразные структуры в зависимости от pH, ионной силы, температуры и других факторов (Gruner S.M. и др., 1985) (Tilcock С.Р., 1986;Gruner S.M., 1985;Hyde S.T. и др., 1997;Lewis R.N.A. и др., 1997;Luzzati V. и др., 1993;Luzzati V., 1997;Luzzati V., 1997;Cribier S. и др., 1993). При этом липидный бислой, наиболее хорошо изученная составляющая биологических мембран, является лишь одной из известных фаз - а именно, ламеллярной фазой, наиболее полно отражающей наши представления о барьерных свойствах мембран. Однако все разнообразие функций биологических мембран связано с процессами временного и локального разрушения-восстановления бислоя в таких явлениях, как: трансмембранный перенос метаболитов, секреция белков, обмен генетической информацией между клетками, внутриклеточная доставка различных компонентов, эндоцитоз и экзоцитоз, клеточное деление, слияние клеток, бактериальная инвазия, вирусная инфекция и многие другие. Все эти процессы сопровождаются разнообразными видами межмембранного взаимодействия и слияния мембран при которых происходят изменения фазового состояния липидов. Такие кооперативные структурные перестройки в мембранах называются фазовыми переходами (Ивков В.Г., Берестовский Г.Н., 1982).

Два обширных и сильно отличающихся по физической природе типа фазовых переходов липидов привлекают особое внимание исследователей. Во-первых, это процессы плавления липидов, способные вызывать разделение твёрдых и жидких фаз, приводящее к латеральной сегрегации компонентов в плоскости мембраны. Во-вторых, это полиморфные фазовые переходы липидов, в результате которых могут образовываться такие небислойные структуры, как кубические или гексагональные фазы. Биологическое значение обоих явлений чрезвычайно велико. В живых клетках гомеостатически поддерживается такой состав липидов, при котором, в интервале температур, характерных для жизнедеятельности данного организма, липиды находятся в расплавленном состоянии, при этом существует возможность возникновения полиморфных фазовых переходов (Albers S.V. и др., 2000;Epand R.M., 1990;Epand R.M., 1998;Cullis P.R. и др., 1986;De Kruijff В и др., 1985;de Kruijff, 1997;Raetz C.R., 1978).

В последние годы интерес к исследованию свойств липидов особенно возрос в связи с широким использованием липосомальных препаратов в медицине и, прежде всего, в генной терапии (Гинтер Е.К., 2000;Горбунова В.Н., Баранов B.C., 1997;Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986;Hug P., Sleight R.G., 1991;Lasic D.D., Templeton N.S., 1996;Fe!gner P.L. и др., 1987;Lasic D.D., 1997;Engstrom и др., 1999;Lasic D.D., 1997;Hairison G.S. и др., 1995). Возникла практическая необходимость создания липосом, содержащих генетический материал или лекарственные вещества и способных активно и избирательно взаимодействовать с поверхностью определённых клеток-мишеней, проникать в цитоплазму и там освобождать биологически активный агент. Создание молекулярных машин, способных выполнять столь сложные и многостадийные операции, моделирующие явления живой природы, невозможно без глубокого и всестороннего изучения всего разнообразия физико-химических свойств липидов, которые, наряду с белками, полинуклеотидами и полисахаридами являются венцом биологической эволюции молекул.

Цели и задачи исследования

Целью представленной работы было изучение структурной организации различных фаз липидов, как в модельных системах, так и в живой клетке. Мы ставили следующие задачи исследования фазового поведения модельных систем:

Роль электростатических взаимодействий в регуляции полиморфного поведения липидов.

• Влияние больших амфипатических молекул, например молекулы хлорофилла, на полиморфное поведение различных липидов.

Роль процессов перекисного окисления липидов в регуляции фазового поведения мембран. Структурные изменения в комплексах цитохром с - кардиолипин.

• Физико-химические свойства комплексов белков или ДНК с различными липидами.

Закономерности, обнаруженные в модельных системах, были рассмотрены также на примере клеточных мембран. При этом ставились задачи исследовать:

Структуру и динамику изменений межмембранных контактов в зонах адгезии внешней и внутренней мембран грамотрицательных бактерий.

Влияние двухвалентных катионов на полиморфизм мембран грамотрицательных бактерий и проникновение ДНК в цитоплазму.

Роль мембранных процессов в инфекции клеток Escherichia coli фагом Т4.

Научная новизна

Впервые обнаружена возможность контроля полиморфного поведения липидов основанная на регуляции электростатических взаимодействий между противоположно заряженными полярными головами молекул. Было показано, что, изменяя соотношение зарядов липида, мы можем получать определённые полиморфные кубические или гексагональные фазы.

Впервые показано, что амфипатические молекулы, имеющие большой объем в полярной области, например молекулы хлорофилла, способны инициировать полиморфные переходы липидов благодаря изменению соотношения размеров полярной и гидрофобной поверхностей мембраны.

Проведен анализ влияния перекисного окисления липидов на фазовое состояние и структурную организацию мембран, образованных кардиолипином и цитохромом с. Показано, что наблюдаемые структурные изменения мембран связаны с образованием олигомеров белка и продуктов перекисного окисления липидов.

Впервые обнаружено стабилизирующее воздействие катионных липидов, используемых в генной терапии, на молекулу ДНК. Благодаря формированию специфической мультиламеллярной фазы ДНК-липидного комплекса, в которой молекула ДНК оказывается «зажатой» между мембранами, температура плавления ДНК повышается до 105-115*С.

Проведен детальный анализ структурных изменений мембран в условиях трансформации клеток грамотрицательных бактерий экзогенной ДНК. Показано сходство механизмов полиморфных изменений мембран бактерий, ответственных за трансмембранный перенос ДНК, и полиморфизма липидов, наблюдаемого в модельных системах.

Исследованы структурные изменения мембран Escherichia coli при инфицировании бактериофагом Т4. Впервые показана роль межмембранных взаимодействий и процессов слияния мембран в инфицировании бактериальных клеток. Обнаружена специфическая структура, названная «тоннелем», ответственная за перенос молекулы ДНК через мембраны бактериальной клетки.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Первые живые клетки появились, вероятно, с того момента, когда некий прототип биологической мембраны отделил сгусток живой материи - прототип цитоплазмы - от окружающей среды. Очевидно, что полное отделение, неминуемо, привело бы к гибели проорганизма, поскольку обмен веществом и энергией с окружающей средой является одним из важнейших атрибутов живого. Поэтому важнейшим атрибутом клеточной мембраны является способность к избирательному переносу веществ через барьер, который мембрана воздвигает между цитоплазмой и окружающей средой.

Мембраны современных организмов образованы липидами, способными спонтанно образовывать бислой - основной структурный компонент мембран. Открытие этой способности дало толчок для исследований искусственных мембран и липосом (Bangham A.D., 1995). Было обнаружено, что некоторые из наиболее фундаментальных свойств мембраны, необходимые для ее функционирования в живой клетке, присущи самим липидам, тогда как участие мембранных белков, по всей видимости, относится к регулированию этих процессов, приданию им избирательности и необратимости, что требует использования энергии. Кроме того, липосомы, образуемые мембранными липидами, привлекают все больший интерес в различных областях медицины и техники. Большое разнообразие липидов и сложность их поведения делают липосомы чрезвычайно ценным материалом для использования в практических целях.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тараховский, Юрий Семенович

выводы

1. На модельных мембранных системах и мембранах живых клеток исследованы различные проявления и биологическое значение фазовых переходов и полиморфизма липидов. Показана высокая степень сходства структурных изменений, наблюдаемых как в моделях, так и в клетках. Это свидетельствует о единстве физико-химических процессов, лежащих в основе этих явлений.

2. Закономерное чередование полиморфных фаз в зависимости от соотношения зарядов мембраны обнаружено в смеси анионного фосфолипида кардиолипина и катионного фосфолипида этилфосфатидилхолина. Раздельно эти липиды образуют только ламеллярную фазу, тогда как смесь липидов образует различные полиморфные структуры: губчатую, кубическую и гексагональную фазы. Предполагается, что взаимодействие зарядов определяет степень упаковки полярных головок липидов и влияет на их полиморфное поведение.

3. Обнаружено, что хлорофилл способен индуцировать полиморфные фазовые переходы липидов хлоропластов. Показано, что в комплексе с липидами хлоропластов хлорофилл способствует появлению межмембранных контактов, слиянию мембран и образованию кубической и гексагональной Ни фаз. Наблюдаемые структурные изменения, по-видимому, связаны с тем, что объемное порфириновое кольцо хлорофилла, находящееся в периферических областях бислоя, нарушает упаковку полярных головок липидов.

4. Перекисное окисление липидов способно существенно влиять на структурную организацию мембран. Нами было показано, что в протеолипосомах из смеси кардиолипина, лецитина, и цитохрома с при повышенной температуре образуются высокомолекулярные комплексы олигомеров белка и продуктов перекисного окисления липидов. Такие комплексы способны образовывать мицеллы внутри бислоя. При дальнейшем увеличении степени окисления мембраны разрушаются и мицеллярные структуры появляются в растворе.

5. Установлено, что при взаимодействии делипидизированного бактериородопсина с липидами, выделенными из пурпурных мембран (соотношении липид/белок 0,33/1), образуются гексагональная решетка, аналогичная нативным пурпурным мембранам, тогда как при реконструкции этого белка с фосфатидилхолином и при наличии высокой концентрации NaCI, образуется орторомбическая решетка. Предложенная нами гипотеза дает объяснение данного явления на основе процессов фазового разделения белков в мембране.

6. Обнаружено, что молекула ДНК в присутствии катионов кальция способна взаимодействовать с природными и синтетическими фосфатидилхолинами, существенно влияя на их фазовое поведение. Возрастает температура плавления синтетического фосфолипида DPPC, исчезает предпереход, существенно расширяются температурные пределы существования «риппл» фазы. В сходных условиях природный фосфатидилхолин приобретает способность к формированию трубчатых структур гексагональной фазы, внутри которых может быть заключена молекула ДНК.

7. Показано, что в комплексах с катионными липидами образуется термостабильная форма ДНК, денатурирующая гтри температурах в интервале 105-115°С. На основе литературных и собственных данных предполагается, что обнаруженное нами явление связано с формированием специфической фазы, в которой многочисленные бислойные структуры липида чередуются со слоями ориентированных нитей ДНК.

8. Показано, что двухвалентные катионы Са2+ и Ва2+ способны индуцировать формирование в мембранах грамотрицательных бактерий Escherichia coli и Pseudomonas putida полиморфные фазовые переходы в условиях, обычно используемых для трансфекции этих клеток. Предполагается наличие непосредственной связи между наблюдаемыми нами нарушениями целостности мембран, связанными с полиморфизмом липидов и возможностью переноса экзогенной ДНК в цитоплазму.

9. Обнаружено, что фаг Т4 вызывает слияние внешней и внутренней мембран клеток Escherichia coli, в результате чего образуется специфическая структура «тоннеля», через который ДНК может попадать в цитоплазму. Процессы слияния мембран сопровождают также лизис клеток, индуцируемый фагом Т4. Наблюдаемые нами структурные изменения мембран бактериальной клетки свидетельствуют о наличии нескольких стадий взаимодействия и слияния мембран, типичных для полиморфных фазовых переходов.

10. Сходные изменения структуры клеточных мембран, обусловленные единством механизмов фазовых переходов бислоя, наблюдаются в таких различных процессах, как действие двухвалентных катионов металлов или повышенного осмотического давления на мембрану бактериальной клетки, или инфицирование бактериальных клеток фагами, или адсорбция катионных липосом на поверхность эритроцита. Во всех перечисленных случаях происходит изменение кривизны бислоя, образование межмембранных контактов, сегрегация компонентов в плоскости мембраны и, наконец, слияние мембран.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе приводятся экспериментальные данные, свидетельствующие о единстве механизмов и сходстве структурных проявлений фазовых переходов липидов в искусственных мембранах и живой клетке. Можно предположить, что в процессе эволюции способы использования клеткой сложных и разнообразных структурных перестроек липидов совершенствовались, что позволяло обеспечивать ее физиологические отправления. Различные фазы липидов, такие как бислой, кубические и, возможно, гексагональные фазы стали неотъемлемыми элементами конструкции клеток.

Каждой из перечисленных выше фаз отводится определенная роль в процессах жизнедеятельности. Плоский или незначительно искривленный бислой выполняет функции барьера, отделяющего клетку от окружающей среды, а у эукариотических клеток разграничивающий также различные компартменты цитоплазмы. Однако все разнообразие транспортных функций, необходимое для обмена внутриклеточного содержимого с окружающей средой, осуществляется благодаря возникновению специфических и весьма избирательных дефектов этого барьера, которые обычно называются каналами, переносчиками, порами и туннелями. К числу указанных явлений, связанных с нарушениями барьерных свойств мембран и транспортом веществ, можно отнести также слияние мембран, происходящее при экзо- и эндоцитозе, делении клеток, секреции и многих других процессах, которые, в соответствии с представлениями большинства исследователей, существуют исключительно благодаря функционированию белков. Приведенные в данном исследовании факты свидетельствуют о возможности и необходимости участия липидов в структурных перестройках мембраны. Липиды можно рассматривать не только как активную среду, обеспечивающую необходимые условия для функционирования белков, но и как непосредственного участника разнообразных процессов, направляемых белками и модулируемых другими мембранно-активными молекулярными компонентами клетки. Эти процессы, наблюдаемые в искусственных системах как фазовые переходы, могут развиваться в клетке в весьма ограниченных, локальных участках, что существенно затрудняет их исследование. Поэтому для нас особый интерес представляет отыскание пока что немногочисленных примеров специфических структур, образованных липидами в процессах жизнедеятельности. Наши исследования показывают, что, как в искусственных мембранах, так и в живой клетке преобразования структуры бислоя осуществляются благодаря коллективному поведению липидных, белковых и других компонентов бислоя, в которое могут вовлекаться также соседние мембраны благодаря формированию контактов между ними и слиянию. Исследование этих процессов имеет большое практическое значение и находит все большее применение при создании липосомальных препаратов в медицине, или при создании биосенсоров, мембранных фильтров, сорбентов и микрочипов в технике.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тараховский, Юрий Семенович, Пущино

1. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.П. 1992. Липидные мембраны при фазовых превращениях. Наука, Москва.

2. Баранов B.C., Баранов А.Н., Зеленин A.B. 2001. Современное состояние и перспективы генной терапии миодистрофии Дюшена в мире и в России. Генетика 37:1046-1054.

3. Богданенко Е.В., Свиридов Ю.В., Московцев A.A., Жданов Р.И. 2000. Невирусный пареное генов in vivo в генной терапии. Вопросы Мед. Химии 46:226-245.

4. Гинтер Е.К. 2000. Генотерапия наследственных болезней. Вопросы Мед. Химии 46:264-278.

5. Головастое В.В., Золов С.Н., Несмеянова М.А. 2002. Изучение взаимодействия экспорт-индуцирующего домена зрелой щелочной фосфатазы Escherichia coli с фосфолипидами мембран в процессе секреции. Биохимия 67:1182-1190.

6. Горбунова В.Н., Баранов B.C. 1997. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург.

7. Гринюс JI.JI. 1986. Транспорт макромолекул у бактерий. Наука, Москва.

8. Громов Б.В. 1985. Строение бактерий. Ленинградский Университет, Ленинград.

9. Жданов Р.И., Семенова Н.В., Арчаков А.И. 2000. Реальности и надежды генной терапии. Вопросы Мед. Химии 46:197-206.

10. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. 1982. Липидный бислой биологических мембран. Наука, Москва.

11. Кантор Ч., Шиммел П. 1985. Биофизическая химия. Мир, Москва.

12. Кривцов Г.Г., Парфенова Е.В. 2000. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углевод-содержащих векторов. Вопросы Мед. Химии 46:246-255.

13. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. 1986. Липосомы и их взаимодействие с клетками. Наука, Москва.

14. Несмеянова М.А. 1982. О возможном участии кислых фосфолипидов в транслокации белков чераз цитоплазматическую мембрану. Молек. Виол. 16:821-828.

15. Парфенова Е.В., Ткачук В.А. 2000. Перспективы генной терапии сердечнососудистых заболеваний. Вопросы Мед. Химии 46:293-310.

16. Слинкин М.А., Шевелев А.Я. 2001. Тройные интерполиэлектролитные комплексы ДНК-поликатион-полианион: новый подход к оптимизации смесей для трансфекции эукариотических клеток. Биоорг. Химия 27:291-299.

17. Стручков В.А., Стражевская Н.Б. 1990. ДНК-связанные липиды клеток эукариот (сперма вьюна, эритроциты голубя) и прокариот (E.coliB, фагТ2). Биохимия 55:1266-1275

18. Угрюмов М.В., Ермаков А.С., Попов А.П., Жданов Р.И. 2000. Генная и генно-клеточная терапия и нейродегенеративные заболевания. Вопросы Мед. Химии 46:311-323.

19. Харакоз Д.П. 2001.0 возможной физиологической роли фазового перехода "жидкое-твердое" в биологических мембранах . Успехи Биол. Наук 41:333-264.

20. Agarraberes F.A., Dice J.F. 2001. Protein translocation across membranes. Biochim. Biophys. Acta 1513:1-24.

21. Akao Т., Nakayama Т., Takeshia K., Ito A. 1994. Design of a new cationic amphiphile with efficient DNA-transfection ability. Biochem. Mol. Biol. Int. 34:915-920.

22. Albers S.V., van De, Driessen A. J., Konings W.N. 2000. Adaptations of the archaeal cell membrane to heat stress. Front Biosci. 5:D813-D820.

23. Amos H. 1961. Protamine enhancement of RNA uptake by cultured chick cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 5:1-4.

24. Anderson R.G., Jacobson K. 2002. A role for lipid shells in targeting proteins to caveolae, rafts, and other lipid domains. Science 296:1821-1825.

25. Anderson W.F. 1992. Human gene therapy. Science 225:808-813.

26. Andersson B., Sundby C., Albertsson P. A. 1980. A mechanism for the formation of inside-out membrane vesicles. Preparation of inside-out vesicles from membrane-paired randomized chloroplast lamellae. Biochim. Biophys. Acta 599:391-402.

27. Andrushchenko V.V., Kornilova S.V., Kapinos L.E., Hackl E.V., Galkin V.L., Grigoriev D.N., Y.P.Blagoi. 1997. IR-spectroscopic studies of divalent metal ion effects on DNA hydration. Journal of Molecular Structure 408:225-228.

28. Anzai E., Masumi M., Kawasaki K., Kirino Y. 1993. Frequent fusion of liposomes to a positively charged planar bilayer without calcium ions. J. Biochem. 114:487-491.

29. Aota-Nakano U., Li S.J., Yamazaki M. 1999. Effect of electrostatic interaction on the phase stability and structures of cubic phases of monoolein/oleic acid mixture membranes. Biochim. Biohys. Acta 1461:96-102.

30. Audouy S., Molema G., de Leij L., Hoekstra D. 2000. Serum as a modulator of lipoplex-mediated gene transfection:dependence of amphiphile, cell type and complex stability. J. Gene Med. 2:465-476.

31. Bailey A.L., Cullis P.R. 1997a. Liposome fusion. In Lipid polymorphism and membrane properties. Epand R.M., editor. Academic Press, San Diego. 359-401.

32. Bailey A.L., Cullis P.R. 1997b. Membrane fusion with cationic liposomes: effects of target membrane lipid composition. Biochemistry 36:1628-1634.

33. Bally M.B., Harvie P., Wong F.M., Kong S., Wasan E.K., Reimer D.L. 1999. Biological barriers to cellular delivery of lipid-based DNA carriers. Adv. DrugDeliv. Rev. 38:291-315.

34. Baneijee R., Mahidhar Y.V., Chaudhuri A., Gopal V., Rao N.M. 2001. Design, synthesis, and transfection biology of novel cationic glycolipids for use in liposomal gene delivery. J. Med. Chem. 44:4176-4185.

35. Bangham A.D. 1995. Surrogate cells or Trojan horces. The discovery of liposomes. Bioassays 17:1081-1088.

36. Battersby B.J., Grimm R., Huebner S., Cevc G. 1998. Evidence for the three-dimensional interlayer correlations in cationic lipid-DNA complexes as observed by cryo-electron microscopy. Biochim. Biohys. Acta 1372:379-383.

37. Baumruker T., Prieschl E.E. 2002. Sphingolipids and the regulation of the immune response. Semin. Immunol. 14:57-63.

38. Bayer M.E. 1968b. Adsorption of bacteriophages to adhesions between wall and membrane of Escherichia coli. J. Virol. 2:346-356.

39. Bayer M.E. 1968a. Areas of adhesion between wall and membrane of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 53:395-404.

40. Bayer M.E. 1976. Role of adhesion zones in bacterial cell surface function and biogenesis. In Membrane biogenesis: mitochondria, chloroplasts, and bacteria. TzagolofF A., editor. Plenum Press, New York. 393-427.

41. Bayer M.E. 1991. Zones of membrane adhesion in cryofixed envelope of Escherichia coli. J. Stuct. Biol. 107:268-280.

42. Bayer M.E., Bayer M.H., C.A.Lunn, Pigiet V. 1987. Association of thioredoxin with the inner membrane and adhesion sites in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169:2659-2666.

43. Bayer M.F.J., Bayer M.H. 1981. Fast responses of bacterial membranes to virus adsorption: a fluorescence study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5618-5622.

44. Bayer M.H., Keck W., Bayer M.E. 1990. Localization of penicillin-binding protein lb in Escherichia coli: immunoelectron microscopy and immunotransfer studies. J. Bacteriol. 172:125-135.

45. Bearer E.L., Duzgunes N., Friend D.S., Papahadjopoulos D. 1982. Fusion of phospholipid vesicles arrested by quick-freezing. The question of lipidic particles as intermediates in membrane fusion. Biochim. Biohys. Acta 693:93-98.

46. Behr J.P., Demeneix B., Loeffler J.P., Perez-Mutul J. 1989. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86:6982-6986.

47. Bennet C.F., Chiang M.Y., Chan H., Shoemaker J.E., Mirabelly C.K. 1992. Cationic lipids enhance cellular uptake and activity of phosphorothiolate antisense oligonucleotides. Mol. Pharmacol. 41:1023-1033.

48. Bennet V. 1984. The human erythrocyte as a model system for understanding membrane cytoskeleton interactions. In Cell membranes: methods and reviews. Elson E.et al., editor. Plenum Press, New York. 149-95.53,54.57.58,59,60.