Термоиндуцированные фазовые переходы и полиморфизм липидов фосфатидилхолиновых липосом в присутствии ноотропных агентов нейропептида АКТГ и антиоксиданта фенозана

Погорецкая, Ирина Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Термоиндуцированные фазовые переходы и полиморфизм липидов фосфатидилхолиновых липосом в присутствии ноотропных агентов нейропептида АКТГ и антиоксиданта фенозана
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Термоиндуцированные фазовые переходы и полиморфизм липидов фосфатидилхолиновых липосом в присутствии ноотропных агентов нейропептида АКТГ и антиоксиданта фенозана"

На правах рукописи.

РГ5 ОД

ПОГОРЕЦКАЯ Ирина Львовна'

Термоиндуцированные фазовые переходы и полиморфизм

липидов фосфатидилхолиновых липосом в присутствии ноотропных агентов нейропептида АКТГ и антиоксиданта

фенозана.

03. 00. 02 - биофизика.

Автореферат

диссертации на соисканне ученой степени кандидата химических наук.

Москва. - 2000 г.

Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Бурлакова Е.Б. кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Архипова Г.В. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Коварский А.Л.

доктор биологических наук, профессор Рощупкин Д.И.

Ведущая организация:

НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ.

Защита состоится в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 200.53.01

в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

по адресу: Москва, ул. Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института химической физики им H.H. Семенова РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кадидат химических наук М.А. Смотряева

E994.SM, О

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. В связи с увеличением продолжительности жизни человека и общим постарением населения Земли, а также в связи с ухудшением её экологии и увеличением количества рождающихся умственно неполноценных детей, работы по изучению молекулярных механизмов памяти и механизмов действия нейробиологических веществ, способных улучшать мозговую деятельность, имеют особую актуальность. Особенно ценно, если на основании этих исследований можно предложить несложные тесты по отбору наиболее эффективных нейротропных препаратов для коррекции памяти, улучшения обучения и рассудочной деятельности.

Огромное количество исследований в области изучения молекулярных механизмов памяти, в основном, посвящено изучению роли ДНК и белков. Уже давно многими исследователями придавхтось большое значение биологическим мембранам как клеточным регуляторам, однако, только в последнее десятилетие была сформулирована гипотеза о важной роли липидов биологических мембран в процессах передачи и хранения информации. Была высказана следующая гипотеза: и кратковременная, и долговременная память связаны с переходом липидов в новое мезофазное состояние. Если время жизни этого состояния меньше, чем время, необходимое для синтеза новых интегральных белков, то система возвращается к исходному состоянию, иначе - если новые белки успевают синтезироваться и встроиться в новую мезофазу - то увеличивается и время жизни мезофазы, и возможность извлечения информации через длительное время. \Бурлакова Е.Б., 1990\

Поскольку биологическая мембрана представляет собой целостное структурное сложноорганизованное образование, состоящее из белков, липидов и воды, обладающее целым рядом собственных уникальных свойств, таких, например, как полиморфизм её фосфолипидов (рис. 1), то особенную актуальность имеют работы по изучению жидкокристаллических мезоморфных превращений мембранных фосфолипидов \Богуславский Л.И., 1979, Василенко И.А., 1988.. P.R. Cullis, M.I. Норе, В. De Kruijff, A.I. Verhleij and C.P.S. Tilcock, 1986, B. De Kruijff, 1987\. и выяснению их роли в нейробиологических процессах. Важность и перспективность такого рода исследований основывается на экспериментальных данных, которые свидетельствуют о том. что изменение

структуры и вязкостных свойств биологических мембран влечёт за собой функциональные изменения активности мембраносвязанных. липидзависимых ферментов и рецепторов центральной нервной системы (в частности аденилатциклазы, протеинкиназы С, ацетилхолинэстеразы) \Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., 1986, Молочкина Е.М., 1992\. К тому же недавние исследования показывают существование зависимости между составом фосфолипидов синаптических мембран и функциональной активностью ряда нейромедиаторных систем: холинэргической, серотонинергической \Бурлакова Е.Б. Губарева А.Е., Архипова Г.В., 1992, Бурлакова Е.Б., Архипова Г.В., Чернявская Л.И., 1987\.

Поэтому для выяснения механизмов памяти особенно перспективны те исследования, которые посвящены изучению молекулярного механизма действия ноотропных агентов: как уже известных, например, нейропептидов \Ашмарин И.П., 1987\, так и новых препаратов с ноотропным действием из класса антиоксидантов УАрхипова Г.В. и др., 1981, 1982, 1983\. В качестве таких агентов, улучшающих память и обучение у животных, мы выбрали два препарата различного химического строения, но близкой нейробиологической активности: нейропептид АКТГ и антиоксидант фенозан (2,4-дитретбутил-З-оксифенилпропионовая кислота) \Ашмарин И.П., 1987, Архипова Г.В. и др., 1981, 1982, 1983, 19904.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является комплексное изучение влияния ноотропных веществ на структурное жидкокристаллическое состояние модельных биологических мембран с применением различных физико-химических методов. В задачи работы входило:

1. Сравнительное изучение общих закономерностей структурно-фазовых превращений в водных дисперсиях природного и синтетического фосфатидилхолина под действием температуры, а также изучение этих термоиндуцированпых превращений при изменении состава мембранных фосфолипидов (добавлении в изучаемую систему различного количества ФЭА).

2. Комплексное исследование полиморфных превращений в мембранном бислое при действии на систему фосфолипид - вода веществ, улучшающих

память и обучение in vivo, с помощью различных физико-химических методов.

3. Анализ структурно-фазовых мезоморфных превращений липидов биологических мембран как важного условия молекулярного действия ноотропных агентов. Новизна и научно-практическая значимость работы. В процессе экспериментальной работы на уровне сложных молекул липидов природного происхождения, а именно, фосфатидилхолина из мозга быка, впервые были изучены полиморфные превращения липидов как при действии температуры и изменения фосфолипидного состава, так и при действии двух ноотропных препаратов различной химической природы: нейропептида АКТГ и антиоксиданта фенозана.

В работе впервые было показано, что при действии ноотропных веществ на уровне мембранного бислоя как синтетических, так и природных липидов, существуют общие закономерности в изменении полиморфного состояния системы, в частности, увеличение содержания небислойных мезофазных структур, увеличение толщины и разупорядоченности бислоя. Эти данные позволяют предположить, что появление новых мезоморфных структур фосфолипидов является важным условием действия ноотропных веществ, а также, возможно, что полиморфные превращения в липидном бислое участвуют в механизме записи и хранения информации на уровне синаптических мембран. Полученные экспериментальные и аналитические данные имеют как теоретическое значение для более полного понимания молекулярных механизмов памяти, так и практическую значимость при подборе наиболее эффективных ноотропных лекарственных препаратов.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на конкурсе молодых ученых ИБХФ РАН, на X Международной Конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии", Суздаль, 1998г., на Международной конференции "Биоантиоксидант", Москва, 1998г., на 1! съезде Биофизиков России, Москва, 1999г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения

результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, а также списка сокращений. Текст диссертации изложен на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирован 29 рисунками и 1 таблицей. Библиография включает 96 наименовании.

Положения, выносимые на защиту.

1 .Температуры фазовых переходов водных дисперсий природного и синтетического фосфатидилхолинов практически совпадают в интервале температур 28-45°С.

2.Кривые нагревания и охлаждения водных дисперсий природного и синтетического фосфатидилхолина образуют гистерезис в изучаемом интервате температур.

3.Показана универсальность изучаемых закономерностей поведения водных смесей природного и синтетического фосфатидилхолинов.

4.Добавление фосфатидилэтаноламина в систему природного ФХ-вода увеличивает содержание неламеллярной мезофазы и увеличивает время возвращения системы к исходному состоянию при нагревании и охлаждении. Система ФХ-вода в присутствии ФЭА возвращается к исходному состоянию при более низких температурах.

5.Ноотропные препараты различного химического строения (нейропептид АКТГ и синтетический антиоксидант фенозан) вызывают в водных дисперсиях как природных, так и синтетических фосфатидилхолинов однотипные изменения мезофазного состояния, а именно: увеличение содержания неламеллярных структур, разрыхление липидного бислоя, увеличение толщины мембраны.

6.Полученные данные подтверждают предположение о роли полиморфных превращений липидов в молекулярном механизме действия ноотропных веществ и записи информации на уровне биологических мембран. Содержание работы.

Материалы исследования.

В работе использованы: 1,2-дипальпальмитоил-5п-глицеро-3-фосфатидилхолин (ДПФХ) (№ 4295, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Mw 734,1); фосфатидилхолин (ФХ) и фосфатидилэтаноамин (ФЭА) из головного мозга

быка (производство ДВГУ, кафедра физико-химической биологии). Чистота дипальмитоилфосфатидилхолина, используемого в наших экспериментах, составляет 99,98 % и дальнейшая очистка не проводилась. Содержание фракций фосфолипидов в используемых препаратах фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина из мозга быка определяли методом ТСХ и количественной денситометрии ("Хромоскан", Англия). Препараты содержали 81,2 ±5,7 % ФХ и 80,5±5,6 % ФЭА. Жирнокислотнын состав фосфатидилхолина анализировался на газовом хроматографе ("Pay", Англия) путем получения метиловых эфиров с помощью щелочного деацилирования ^Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г., 198IV Был установлен следующий состав жирных кислот:

ФХ - С |4 о = 0,3%, С ,бо = 26,6%, С ,6, =2,1%, С 18 о =17,8%, С ,8, =46,7%, С ,82 = 1,0%, С и з = 1,2%, С 2о 4 = 2,7%.

ФЭА-С 16 о =6,8%, С |б-| = 1,0%,С 18о = 20%, С ш = 31,7%. С is г = 0,1%, С ,5з = 3,2%, С 204 = 4,3%,

Полученные нами данные по жирнокислотному составу фосфолипидов головного мозга быка хорошо согласуются с литературными данными \Крепс Е.М.,1981\.

В работе были использованы три парамагнитных зонда, расположенных на различном удалении от поверхности липидного бислоя: зонд 1) - 16-доксилстеариновая кислота, локализирующийся в мембране в области 16-го атома углерода жирнокислотного остатка фосфолипидной молекулы (№ D-5158, Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, MW= 384,6) \Адамчик А., Стругальский 3., 1979, Гриффит О., Джойст П., 1979\, зонд 2) - 3-доксил-17Р-гидрокси-5а-андростан (№ D-5158, Sigma Chemical Со, St.Louis, МО, MW= 376,6), вращательная подвижность которого выражает динамические свойства липидов в области их полярных групп \Гриффит О., Джойст П., 1979, Кольтовер В.К., 1979Y, и зонд 3) - 2, 2, 6, 6-тетраметил-4-каприлоил-пиперидин-1-оксил УГолощапов А.Н., Бурлакова Е.Б., 1986\, алифатическая часть молекулы которого встраивается в липидные области жирнокислотных остатков, а радикальный фрагмент локализован внутри поверхностного слоя мембраны в

гидрофобном окружении \Гольдфельд М.Г. 1970, Рууге Э.К., Субчински С.А., Тихонов H.A., 197А

Нами использовались следующие модифицирующие ноотропные агенты: 1) адренокортикотропный гормон (АКТГ) производства Института кровезаменителе» и гормональных препаратов, 2) фенозан в двух формах: 2,4-дитретбутил-3-оксифенилпропионовой кислоты и её калиевой соли, синтезированный в ИБХФ РАН.

Приготовление липосом: Липосомы готовились методом обращенных фаз \Василенко И.А., и др. 1987\ в водном трис-буфере для ЭПР и РСА -исследований и в DiO для 31Р-ЯМР и ПМР - исследований. Методы исследования. Для изучения полиморфного состояния систем природного и синтетического ФХ применялись несколько методов, как динамические, так и релаксационные:

1. Метод спиновых зондов. Спектры ЭПР зондов регистрировали на спектрометре '"Bruker", ФРГ. Образец водной дисперсии липидов помещали в резонатор спектрометра ЭПР в плоской кварцевой кювете для водных образцов. Исследование проводили в Х-диапазоне ЭПР-спектрометрии, в котором частота поглощаемого в резонаторе переменного магнитного поля лежит в области сверхвысоких частот (СВЧ) и составляет примерно 9*109 сек"', напряженность постоянного магнитного поля Н равна приблизительно 3300 Гс. Вращательную подвижность зонда характеризовали величиной времени вращательной корреляции Тс. Время вращательной корреляции рассчитывалось по формуле: \Кузнецов А.Н., 1976\:

Тс = 6.65 X ДН(1) X

хЮ

-10

сек

где I +. I. -интенсивности соответствующих компонент спектра, АН(|+) - ширина низкопольной компоненты спектра, область применимости соотношения -значения тс, лежащие в интервале 5x10 -"<тс < 10'9 п, что соответствует условию быстрого вращения радикала.

ЭПР спектры анализировались и по параметру упорядоченности Б \ МакКоннел, 1979\., который служит мерой ширины распределения ориентаций молекулярных осей спиновых зондов относительно оси предпочтительной ориентации, т.е. мерой относительной упорядоченности (анизотропии) липидного бислоя.

Выражение для вычисления Б , содержащее поправки на отличие полярности окружения нитроксильного радикала от его окружения в монокристалле, имеет следующий вид:

где Ап равно половине расстояния между внешними экстремумами (от первого максимума до последнего минимума) спектра. Ах равно половине расстояния от первого минимума до последнего максимума спектра.

Вероятность отклонения молекулярной оси зонда от нормали бислоя тем больше, чем выше подвижность липидных молекул, которая таким образом служит "динамической" причиной нарушения микроскопической упорядоченности липидного бислоя. (5=1 полностью упорядоченная система, 5=0 полностью разупорядоченная система).

2. Метод 3,Р-ЯМР - спектроскопии. Спектры 31Р-ЯМР регистрировали на импульсном Фурье спектрометре "Брукер" АМ-400 на частоте 161,98 МГц. Длительность импульса 15 мс, задержка между импульсами -1,5с, ширина спектрального диапазона -200 кГц, число сканирований -500. При обработке сигнала применяли экспоненциальный фильтр с показателем 100 Гц. Широкополосную развертку не применяли, т.к. ее применение не влияло на форму линии. Длительность каждого измерения составляла 30 мин. Образцы выдерживали при каждой температуре 30 мин.

3. Метод протонной магнитной релаксации. Измерение времени протонной релаксации Т2 проводили на приборе "Мтврес рс 120" фирмы "Брукер" на

С {Гс ) = 1,4 - 0 ,053 (Аи - А1 ),

рабочей частоте 20 МГц. В диапазоне температур 25-47°С с интервалом 0,5-1° С (± 0.1° С) для измерения времени спин-спиновой релаксации Т?, использовали метод Kappa - Переела в модификации Мейбума - Грилла \Фаррар Т, Беккер Э, 1973\ (импульсная последовательность 90о-Т-(180°-Т)„. п выбрали равным 100, с измерением сигнала эха после каждого второго 180° импульса. Для изучения системы в диапазоне температур 28-37°С с интервалом 0,5-1 °С (±0,1 °С), применили метод F.I.D. (Free Induction Decay - спад свободной индукции). На кривой спада снимали 20 точек с задержкой после 90° импульса от 20 до 200 мкеек с логарифмическим распределением их по шкале времени (т n+i/Tn = const).

Для улучшения отношения сигнал \ шум каждую точку на кривой изменения неравновесной намагниченности усредняли после 50-100 кратного повторения в случае спада свободной индукции и 2500 кратного повторения в случае последовательности Карра-Перселла. Каждая кривая температурной зависимости воспроизводилась 5-7раз с последующим усреднением и оценкой среднеквадратичного отклонения в каждой точке.

Разделение сложных кривых спада неравновесной намагниченности на экспоненты проводилось с помощью программы "Т2 В1ЕХР" (алгебраический метод решения линейных уравнений регуляционными методами) \Рубин А.Б., 1988\.

4. Метод рентгеноструктурного анализа. Рентгеновские измерения проводили на созданном в ИБХФ РАН малоугловом дифрактометре (модифицированный вариант дифрактометра "АМУР-K" \Могилевский Л.Ю., Дембо А.Т., 1984\) с линейным координатным детектором, разработанным и изготовленном в Объединенном институте ядерных исследований \Васильев С.Е., Донец Д.ЕЛ. Измерения проводили с трехщелевой коллимацией рентгеновского пучка и трубкой БСВ-29Си (30 кВ\ ЗОмА). Для монохроматизации пучка (линия СиКа, 54 нм) использовали Ni- фильтр и амплитудный дискриминатор в системе регистрирующей электроники детектора. Во время рентгеновских измерений дисперсии липидов находились в кварцевом капилляре диаметром 1 мм с толщиной стенки 0,01 мм ("Mark-

КогсЬеп", Германия) в термостатируемой ячейке при 19 ± 0,5°С. Измерения проводили начиная с угла рассеивания 0,1°С, с угловым шагом 0,133°. Продолжительность съемки одной дифрактограммы составляла 10-20 мин. Коллимационную поправку не вводили.

По дифрактограммам определяли период повторяемости мембран в мультислое = ЬА./25тЭ|, (9|, - брегговский угол для рефлекса с номером Ь) и проводили расчет центросимметричных профилей электронной плотности поперечного сечения мембран.

где каждый член стамы взят со знаком + или - в зависимости от фазы рефлекса, Ьтах - число рефлексов, и интенсивности рефлексов 1(Ь) нормированы

Ошибка эксперимента (95% -ый доверительный интервхт по ф-ле Стьюдента) составляет 5-7% \Бейли И., 1962\. Результаты н их обсуждение.

Мы предприняли свои исследования термоиндуцированных фазовых переходов в липидном бислое. впервые выбрав в качестве липида для получения модельных мембран фосфатидилхолин из головного мозга быка, поскольку известно, что этот класс липидов составляет около 50% всех фосфолипидов клеточных мембран у животных, в том числе и синаптических мембран головного мозга. Мы полагали, что выбранная модель в наибольшей степени отражает свойства липидов синаптических мембран по сравнению, например, с мембранами из хорошо изученного ДПФХ.

Начальным этапом нашей работы было сравнительное изучение структурного поведения двух водных систем фосфатидилхолинов в зависимости от температуры: 1)ДПФХ-вода и 2) ФХ из мозга - вода. На основании наших и литературных Ше КгшеГГ В., 1987, СиШэ Р.Я., Норе М.1., Ое КгшеГГ В., е1 а1.. 1986\ данных, мы установили, что и в первом и во втором случаях в изучаемом интервале температур (28° - 45°С) обе системы ФХ\вода испытывают

Бислойная (ламеллярная) фаза

Кубическая фаза

/ \

Гексагональная фаза

Рис.1. Полиморфные мезофазы водных дисперсий фосфолипидов.

идентичные структурные изменения (рис. 2), которые принято называть фазовыми переходами. На рис.2 видны два характерных изменения изучаемых параметров: наиболее ярко выраженные при температуре 410 С и менее резкие при температуре около 35° С, которые в литературе известны как фазовые переходы I и II рода.

Во время фазового перехода I рода при непрерывном изменении макропараметров (например, температуры, объёма или давления) скачкообразно меняются свойства, выражаемые первой производной от энергии Гиббса по температуре, или объему, или давлению. Температура фазового перехода I рода для дисперсии ФХ из мозга практически совпадает с температурой фазового перехода I рода для дисперсии ДПФХ и составляет 41°С, что хорошо согласуется с литературными данными \Сорокоумова Г.М., Василенко И.А., 1987, De Kruieff В., 1987\. Однако в случае природного ФХ этот переход менее ярко выражен и более размыт. Это связано с тем, что в состав природного ФХ входят более 40 молекулярных видов фосфагидилхолинов, имеющих различные углеводородные остатки жирных кислот в своём составе, поэтому каждый из молекулярных видов имеет индивидуальную температуру фазового перехода. Для фазового перехода II рода характерно изменение свойств, выражаемых второй производной от энергии Гиббса по температуре, давлению или объёму, также наблюдается резкое изменение теплоемкости системы . По мнению Л.Д. Ландау выше температуры фазового перехода II рода система обладает более высокой симметрией, поэтому точка фазового перехода II рода может трактоваться как точка изменения симметрии системы УЛандау Л.Д., Лившиц Е.МЛ.

По данным авторов, изучавших структурно-фазовые изменения в водных дисперсиях фосфолипидов \Василенко И.А., 1988, Slater J.L., Huang С., 1987, De Kruieff В, 1987\, методами сканирующей калориметрии и 31Р-ЯМР-спектроскопии было установлено, что в данном случае происходят изменения термодинамики системы (появление острого эндотермического пика при температуре фазового перехода I рода) и изменение симметрии системы (осуществляется переход из одной мезофазы в другую) при достижении температуры, которую авторы \Василенко И. А., 1988, De Kruieff В., 1987\ считают температурой фазового перехода II рода

Рис.2а. Зависимость быстрой компоненты времени спин-спиновой релаксации от температуры водной дисперсии ДПФХ.

0,12

1/тс*10"10,с'1

0.07 •

т,°с

23 25 27 29

33 35 37 39

Рис.2б. Зависимость обратного времени вращательной корреляции от температуры водной дисперсии природного ФХ.

При изучении термоиндуцированного поведения водной дисперсии ФХ из мозга нами было впервые обнаружено, что кривые нагревания и охлаждения образуют гистерезис в области мезофазного предперехода. Причем величина гистерезиса и в первом, и во втором случае составляет 2.5° (см. рис. 4,5,6). Все результаты хорошо воспроизводились методом спиновых зондов для водной дисперсии природного ФХ и синтетического ДПФХ и методами ПМР. ЯМР -спектроскопии для дисперсии ДПФХ. Ранее другими авторами методом 31Р-ЯМР спектроскопии на синтетических и природных липидах растительного происхождения также был обнаружен подобного рода гистерезис Шасиленко А.И. 1988, с1е КгшеГ!" В., 1987\. Полученное нами экспериментальное доказательство наличия гистерезиса в водной дисперсии природного ФХ в интервале 30° - 40° С особенно важно в связи с тем. что эти и другие авторы связывают наличие гистерезиса в температурной области предперехода именно с явлениями полиморфизма липпдов в мембранном бислое. В связи с изложенным, можно говорить о том, что в изучаемом интервале температур водные дисперсии ДПФХ и ФХ из мозга быка претерпевают одинаковые термоиндуцированные фазовые полиморфные превращения, имеют практически совпадающие температуры фазовых переходов. Таким образом, мы показали общность изучаемых характеристик как для дисперсии ДПФХ-вода. так и для водной дисперсии природного ФХ. Применение природного фосфолипида в наших исследованиях приближает нас в большей степени к процессам, происходящим в биологической мембране, по сравнению с синтетическими липидами.

При сравнении поведения двух систем : дисперсии ФХ- вода и смеси ФХ \ ФЭА-вода, изучаемых методом '''Р-ЯМР-спектроскопии при различных соотношениях [ФХ] : [ФЭА] мы показали, что в зависимости от количества ФЭА в системе меняется структурно-фазовое полиморфное состояние липидов. По данным 31 Р-ЯМР-спектроскопии водная дисперсия ФХ находится в ламеллярнои фазе, в то время как ФЭА не образует в воде ламеллярной фазы в данном интервале температур (рис. 3(1)).

При добавлении в систему ФХ-вода некоторого количества ФЭА в соотношении [ФХ]:[ФЭА] = 2:1 увеличивается интенсивность сигнала в области сильного поля, что по литературным данным свидетельствует о присутствии

Рис.3. Спектры Р-ЯМР водных дисперсий

1 -ФХ

2 - ФХ:ФЭА=2:1

3 - ФХ:ФЭА=1:1

гексагональной фазы \Василенко И.А.,1988\. При возрастании температуры вклад гексагональной фазы увеличивается, однако система возвращается в исходное состояние практически при исходной температуре. При добавлении ФЭА к ФХ в соотношении [ФХ]:[ФЭА] = 1:1 в водной дисперсии преобладает гексагональная фаза. В этих же экспериментах мы показали, что если при нагревании и последующем охлаждении для дисперсии ФХ в воде возвращение в состояние ламеллярной фазы происходит достаточно быстро (30-60 мин.) и гистерезис кривых нагревания и охлаждения составляет 2,5°, то для случая с добавлением в эту систему ФЭА в соотношении [ФХ]:[ФЭА] = 1:1, необходим значительно более длительный период времени (примерно 24 часа.) и более низкая температура для формирования неизотропной ламеллярной фазы. Таким образом мы установили, что даже при комнатной температуре добавление к системе ФХ - вода небислойобразующего липида ФЭА позволяет изменить полиморфное жидкокристаллическое состояние липосомальной мембраны (от ламеллярной фазы для "чистого" ФХ, через "смешанную" при соотношении [ФХ]:[ФЭА] = 2:1, до гексагональной, при соотношении [ФХ]:[ФЭА]= 1:1).

Полученные данные, по-видимому, свидетельствуют о том, что изменение in vivo состава липидов клеточных мембран на фоне изменения мезофазного состояния лнпидного бислоя, а именно, повышения концентрации ФЭА приводит к увеличению содержания гексагональной мезофазы по отношению к исходной ламеллярной. Важно отметить, что это новое мезофазное состояние возвращается к исходному состоянию при более низких температурах и за более длительное время.

Исходя из поставленной в работе задачи, для нас было важно изучить влияние не только температурного фактора и примесей других мембранных липидов на полиморфное поведение системы ФХ-вода, но и исследовать действие некоторых известных ноотропных агентов различного химического строения и близкого ноотропного действия \Ашмарин И.П. 1987, Архипова Г.В. и др. 1992\ на полиморфное состояние этой системы.

Изучая полиморфные превращения водных дисперсий ФХ, мы выяснили, что при добавлении в эту систему ноотропных агентов таких, как нейропептида АКТГ или антиоксиданта фенозана, однотипно изменяются основные

характеристики структурно-фазовых превращений и полиморфное состояние липидов модельных фосфатидилхолиновых мембран. Основные изменения происходят в области температур мезофазного предперехода, а именно, изменяется характер кривых нагревания и охлаждения, сдвигаются температуры фазовых переходов таким образом, что площадь гистерезиса становится наибольшей. Это свидетельствует об увеличении степени полиморфизма в изучаемой системе ФХ-вода.

Следует подчеркнуть, что в зависимости от условий проведения эксперимента (вначале охлаждение, затем нагревание или вначале нагревание, а затем охлаждение) несколько меняется и форма кривых, и температуры фазовых переходов так же, как размер площади гистерезиса. Нами было замечено, что изменение взаимного расположения кривых нагревания и охлаждения наблюдается в зависимости от того, находилась ли дисперсия, содержащая фенозан, при температуре выше температуры фазового перехода I рода или она не находилась выше этой температуры. В первом случае кривая нагревания располагается в среднем ниже кривой охлаждения, а во втором случае кривая нагревания лежит выше кривой охлаждения.

Следует отметить .что добавление к водной дисперсии ДПФХ нейропептида АКТГ в концентрации 1,5% от массы липида ( 0,001 М\ мл ) сдвигает температуру фазового перехода в сторону более низких значений на 1°С (фазовый переход I рода) и сдвигает температуру мезофазного предперехода на 3°С. Гистерезис кривых нагревания и охлаждения составляет 2,5°. (рис. 4, 5) Рассчитанная нами степень разупорядоченности липидов Б под влиянием АКТГ значительно увеличивается. Причем в отсутствие нейропептида подобных эффектов мы не наблюдали. В случае введения АКТГ в систему при температуре выше температуры фазового перехода I рода также было обнаружено изменение взаимного расположения кривых нагревания и охлаждения по сравнению с расположением кривых системы, не испытавшей действия температуры фазового перехода I рода. Если в первом случае кривая нагревания лежит выше кривой охлаждения, то во втором случае она расположена ниже этой кривой. Мы полагаем, что такого рода изменения взаимного расположения кривых для дисперсий с АКТГ и фенозаном связаны с

7у 10"

0.18

а)

0.16

0.14

7>10"4

0.18

0.16

0.14

б)

1'ис.4. Зависимость времени спин-спиновой релаксации от температуры (1 - охлаждение; 2 - нагревание) водных дисперсий

а) ДГ1ФХ

б) ДПФХ+ЛКТГ

Рис.5. Зависимость отрицательного логарифма времени вращательной корреляции от температуры (1 - охлаждение; 2 - нагревание) водных дисперсий

а) ДПФХ

б) ДПФХ+АКТГ

К) О

различными молекулярными механизмами взаимодействия ноотропных веществ с образующимися полиморфными лнпидными структурами в изучаемых мезофазах.

Для более полного изучения полиморфного состояния липидного бислоя важно было исследовать структурные характеристики липидов фосфатидилхолиновых мембран тремя спиновыми зондами, располагающимися (по данным Гольдфельда \Гольдфельд М.Г., 1970\) на различной глубине и на поверхности липидного бислоя.

При проведении измерений методом спиновых зондов с применением ЭПР-спектрометрии использовались три спиновых зонда различного химического строения. Экспериментально было установлено некоторое сходство в полученных с помощью этих зондов результатах, однако было замечено и различие в изменении формы кривых нагревания и охлаждения (рис. 4. 6). Эти различия скорее всего связаны с уровнем зондирования бислоя.. В итоге, сравнивая полученные данные по влиянию фенозана и АКТГ на полиморфное состояние и температуры фазовых переходов, можно сказать, что оба ноотропных агента вызывают одинаковые изменения температур фазовых переходов, размеров гистерезиса и форм кривых нагревания и охлаждения. Однако, наблюдаемые в присутствии того и другого агентов изменения во взаимном расположении кривых нагревания и охлаждения прямо противоположны: если для дисперсии в присутствии фенозана в случае прохождения системой фазового перехода I рода кривая нагревания лежит ниже кривой охлаждения, то для системы с АКТГ - эффект обратный, кривая нагревания лежит выше кривой охлаждения при одинаковых температурах. Однако, это различие .по-видимому, связано с разным механизмом взаимодействия этих веществ с липидны.м бислоем.

Для более детального изучения структурных характеристик фосфатидилхолиновых мембран нами был применён метод рентгеноструктурного анализа, являющийся наиболее информативным хтя этих исследований \Могилевский Л.Ю. и др. 1984\.

По данным рентгеноструктурного анализа, добавление фенозана при комнатной температуре (в форме жирорастворимой кислоты и в форме водорастворимой калиевой соли) в водную дисперсию ФХ из мозга в количестве 5% и 10% от

тс*1О10,с

40° - 32° ФХ-вода

I-охлаждение 32° - 40° 2-нагревание

8.5

тс*Ю10,с

♦ 32°-40° ФХ-вода

нагревание 40° - 32° 2- охлаждение

Тс*Ю10,С

♦40° - 32° • 32°-40°

ФХ-вода-фенозан I -охлаждение 2-нагревание

ФХ-вода-фенозан

1- нагревание

2-охлаждение

Рис.6.

Зависимость времени вращательной корреляции от температуры

массы липида увеличивает (а в случае добавления соли, значительно увеличивает) толщину липидного бислоя. Добавление фенозана в той и другой форме увеличивает период с1 и регулярность укладки мембран в мультислое. а также толщину липидного бислоя, сохраняя ламеллярное мезофазное состояние липидов мембраны (рис. 7, табл. 1).

Таблица 1.

Значения периода повторяемости мембран в мультислое Д. рассчитанные по положению первого рефлекса

Состав дисперсии а, нм

ФХ без антиоксидантов (контроль) 6,8

ФХ + 5% фенозан 1 7,4

ФХ - 10% фенозан 1 7,6

ФХ - 5% фенозан 2 7,5

ФХт 10% фенозан 2 8,0

Фенозан (в форме кислоты) добавленный в водную дисперсию природного ФХ в количестве 0,5% от массы липида (0,001 МУмл) при термоиндуцированных фазовых переходах, зафиксированных методом спинового зонда, сдвигает температуру фазового перехода I рода и температуру мезофазного предперехода на 1° н 2° соответственно. К тому же присутствие фенозана изменяет форму кривых нагревания и охлаждения, тем самым увеличивая гистерезис по температуре вплоть до 2.5°-3°.

Таким образом, мы установили, что и АКТГ. и фенозан влияют на полиморфное жидкокристаллическое состояние липидов модельных мембран. Поскольку введение этих веществ в систему происходило до температуры мезофазного предперехода и влияние их более всего проявилось в диапазоне температур, при которых и наблюдаются явления полиморфизма, то более чувствителен к действию агентов оказался именно мезофазный предпереход. Результатом действия и АКТГ, и фенозана, является увеличение содержания полиморфных неламеллярных структур, разрыхление липидного бислоя, увеличение разупорядоченности и толщины фосфолипидной мембраны.

Рис.7а. Дифрактограмма водной дисперсии ФХ из мозга быка. I, инп/с

Рис.7в. Дифрактограмма водной дисперсии ФХ+5% фенозана 2.

2в1 пв/Х, ни''

Рис.7б. Днфрактограмма водной дисперсии ФХ + 5% фенозан-1.

Рис. 7г. Профили электронной плотности фосфатиднлхолиновых мембран: 1 - С 5% содержанием фенозана 1; 2 - Без антиоксидантов.

Известно, что появление гексагональных структур связано с увеличением изотропии и уменьшением анизотропии системы \Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 198б\. Поэтому вещества, увеличивающие содержание полиморфных неламеллярных структур, увеличивают изотропию липидных молекул бислойных мембран.

Поскольку и фенозан, и АКТГ в опытах т \по положительно влияют на память и обучение, то, по-видимому, структурно-фазовые изменения липидов, разупорядоченность липидного бислоя, увеличение толщины биологических мембран и увеличение изотропии липидных молекул являются важным этапом механизма записи и сохранения информации на уровне синаптических мембран головного мозга. Вполне возможно, что усиление именно этих мембранных процессов с помощью нейротропных препаратов способствует улучшению памяти и обучаемости в экспериментах т упо. Выводы.

1. Методами ПМР, 3|Р - ЯМР - спектроскопии, а также методом спиновых зондов впервые изучено термоиндуцированное поведение водной дисперсии фосфатидилхолина из мозга быка в интервале температу р 23° - 45°С.

2. Показано, что добавление к системе ФХ-вода различного количества фосфатидилэтаноламина увеличивает содержание гексагональной фазы. При возвращении такой системы к исходному состоянию требуется более низкая температура и более длительное время по сравнению с первоначальной системой.

3. Установлено, что в интервале температур 23° - 45°С кривые нагревания и охлаждения системы природный фосфатидилхолин - вода имеют гистерезис по температуре = 2°С.

4. Доказано, что температуры фазовых переходов системы фосфатидилхолин из мозга быка - вода в интервале температур 23° - 45°С при нагревании и охлаждении идентичны температурам фазовых переходов системы дипальмитоилфосфатидилхолин - вода в аналогичных условиях.

гистерезиса, ограниченную кривыми нагревания и охлаждения (степень полиморфизма), увеличивает разупорядоченность системы, а также увеличивает толщину липидного бислоя. Причем, к действию ноотропных агентов более чувствителен мезофазный предпереход.

6. Методом рентгеноструктурного анализа впервые установлен факт изменения толщины липидных мембран, а также периода и регулярности их укладки в многослойных ФХ липосомах в присутствии антиоксиданта фенозана при сохранении ламеллярной мезофазы.

7. Полученные экспериментальные и расчётные данные позволяют предположить участие мезофазных структурных липидных превращений в механизме записи информации и действия ноотропных веществ на уровне липидного бислоя биологических мембран.

Перечень работ, в которых отражены основные научные результаты, представленные в диссертации.

1.Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б., Кривандин A.B., Погорецкая И.Л. Рентгеновский дифракционный анализ липосом из природных липидов при добавлении синтетических антиоксидантов \\ Нейрохимия, 1996, т.13, в.2, с. 128-133.

2.Архипова Г.В., Погорецкая И.Л.. Бурлакова Е.Б. Полиморфизм липидов в системе фосфагидилхолин-вода в присутствии ноотропных агентов \\ В тр. 12-й Международной конференции "Электромагнетизм в биологии и медицине", Вашингтон, США, май 1997, с. 30.

3.Архипова Г.В., Байдер Л.М., Бурлакова Е.Б., Кривандин A.B., Погорецкая И.Л. Влияние антиоксиданта фенозана и нейропептида АКТГ как ноотропных агентов на структурное жидкокристаллическое полиморфное состояние липидного бислоя и толщину фосфатидилхолиновых мембран \\ В тр. X -международной конференции "Магнитный резонанс в химии и биологии", Суздаль, Россия, июнь 1998, с. 96.

4.Архипова Г.В.. Байдер Л.М., Бурлакова Е.Б., Кривандин A.B., Погорецкая И.Л. Влияние антиоксиданта фенозана и нейропептида АКТГ как ноотропных агентов на структурное жидкокристаллическое полиморфное состояние липидного бислоя и толщину фосфатидилхолиновых мембран \\ В тр.

Международной конференции "Биоантиоксидант". Москва, Россия, ноябг» 1998, с. 108.

5.Архипова Г.В., Погорецкая И.Л., Бурлакова Е.Б. Полиморфизм липиднсмт бислоя и толщина фосфатидилхолиновых мембран под влиянием ноотропных веществ \\ В тр. 11-го съезда "Биофизиков России", Москва, 1999, т.2, с. 478.

6.Погорецкая И.Л., Архипова Г.В., Байдер Л.М., Бурлакова Е.Б. Влияние антиоксиданта фенозана и нейропептида АКТГ на структуртгс жидкокристаллическое состояние липидного бислоя и толщшг фосфатидилхолиновых мембран \\ Биофизика, 1999, т. 44, в. 5, с. 852-860. Список сокращений.

ДПФХ - дипальмигоилфосфатндилхолин.

ФХ - фосфатидилхолин.

ФЭА - фосфатидилэтаноламин.

АКТГ - адренокортикотропный гормон.

ПМР - протонная магнитная релаксация.

ЯМР - ядерный магнитный резонанс.

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс.

РСА - рентгеноструктурньш анализ.

ДВГУ - Дальневосточный Государственный Университет.

ИБХФ - Институт Биохимической Физики.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Погорецкая, Ирина Львовна

1. введение.

2. обзор литературы.

2.1. Строение и структурные свойства бислойных мембран.

2.2. Структурно-фазовые превращения и полиморфизм липидов в водных дисперсиях

2.3. Фазовые переходы и полиморфизм липидов в фосфатидилхолиновых модельных мембранах.

2.4. Свойства нейропептида АКТГ и антиоксиданта фенозана как ноотропных веществ.

3. материалы и методы.

3.1. Метод получения липосом. Определение состава мембранных липидов.

3.2. Метод спиновых зондов для изучения фазовых переходов липидов мембранных структур.

3.3. Метод 31Р-ЯМР спектроскопии для изучения полиморфизма мембранных липидов.

3.4. Метод протонной магнитной релаксации для изучения полиморфизма мембранных липидов.

3.5. Метод рентгеноструктурного анализа для изучения мембранных структур.

4. результаты.

4.1. Изучение поведения системы ФХ-Н20 при нагревании и охлаждении в интервале температур 32°-40°С. Данные ЭПР-спектрометрии и ПМР-спектроскопии.

4.2. Структурно-фазовые изменения в системе ДПФХ-Н20 при нагревании и охлаждении в интервале температур 25-45°С.

4.3. Полиморфные превращения липидов в системах ФХ-Н20 и ФХ\ФЭА-Н20 при нагревании и охлаждении. Результаты 3|Р-ЯМР спектроскопии.

4.4. Влияние АКТГ на полиморфизм липидов и упорядоченность липидного бислоя фосфатидилхолиновых мембран . Данные ЭПР-спектрометрии и ПМР-спектроскопии.

4.5. Влияние фенозана на полиморфизм липидов и толщину липидного бислоя фосфатидилхолиновых мембран. Данные ЭПР и РСА.

5. обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Термоиндуцированные фазовые переходы и полиморфизм липидов фосфатидилхолиновых липосом в присутствии ноотропных агентов нейропептида АКТГ и антиоксиданта фенозана"

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что помимо компартментальной функции биологические мембраны могут выполнять роль регуляторов клеточного метаболизма /Бурлакова Е.Б.1974, Минц Р.И.,1982, Браун Г., Уолкен Дж., 1982/. Многочисленными экспериментальными данными показано, что клеточные мембраны имеют большое значение как при нормальной жизнедеятельности клетки, так и при самых разнообразных патологиях /Бурлакова Е.Б. 1974, Дятловицкая Э.В.1976/. Современные исследования показали, что биологические мембраны представляют собой динамичное структурное образование, состоящее в основном из белков, фосфолипидов и воды \Бергельсон Л.Д.1981 и др. Причем, соотношение между этими компонентами и их состав в каждый момент времени под влиянием различных химических агентов и физических факторов может меняться \там же. Молекулы фосфолипидов из-за своей амфифильности (т.е. способности одновременно растворяться и в воде и в органическом растворителе) обладают уникальной способностью самосборки в различные полиморфные структуры. В зависимости от количества воды и температуры фосфолипиды могут иметь ламеллярную (бислойную) - анизотропную или гексагональную и кубическую -изотропные структуры (рис. 3) /Василенко И.А., 1988., P.R. Cullis, M.I. Норе, В. De Kruijff, A.I. Verhleij and C.P.S. Tilcock, 1986, B. De Kruijff, 1987/.

Благодаря своей анизотропии и изотропии эти структуры хорошо идентифицируются методами ЯМР, ПМР и ЭПР-спектрометрии, а также рентгеноструктурного анализа \Фаррар Т., Беккер Э., 1975, Lee A.S., Birdsall J.M., Levine Y.K., et al., 1972, Sunney I Chan, Seiter

С.Н.А., Feigenson W, 1972, Гриффит О., Джойст П., 1979, МакКоннел Г., 1979\.

Молекулы фосфолипидов в связи с этим разделяют на образующие бислой (фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит) и необразующие бислоя (фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин). Экспериментальные данные показывают, что состав фосфолипидов биологических мембран постоянно обновляется, причём, полярная часть молекулы значительно медленнее (3 - 8 суток), а жирнокислотная часть молекулы быстрее (5 -10 часов) \Бергельсон Л.Д.1981\.

Известно также, что каждая молекула бислойобразующих фосфолипидов (например, фосфатидилхолина) способна удерживать 22 молекулы воды, в то время как молекулы небислойобразующих фосфолипидов (например, фосфатидилэтаноламина) - только 12 молекул воды \Василенко А.И.,1988, Р.Я. СиШб, М.1. Норе, В. Эе Кш^ е1 а1., 1986\. Поэтому, замена одного фосфолипида на другой приводит к изменению соотношения липид\вода, а, следовательно, к полиморфным превращениям: ламеллярная структура превращается в гексагональную (рис 3) Поскольку углы наклона углеводородных цепей жирнокислотных остатков фосфолипидной молекулы к поверхности бислоя в случае полиморфных превращений изменяются УБогуславский Л.И.1979\, то, скорее всего, будут изменяться как степень упорядоченности липидных молекул, так и толщина самого липидного бислоя.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что состав липидов биологических мембран качественно и количественно меняется как в норме, так и в особенности при различных патологиях \Архипова Г.В. и др. 1971,1975,1983,

Дятловицкая Э.В.1976У Одними из агентов, обладающих способностью к нормализации состава липидов биологических мембран, являются природные и синтетические антиоксиданты \Бурлакова Е.Б. и др., 1975\. Являясь ингибиторами перекисного окисления липидов, они способны задерживать окисление и выход из мембран, прежде всего полярных, ненасыщенных фракций фосфолипидов (например, фосфатидилэтаноламинов), относительное количественное содержание которых при этом накапливается в составе липидов биологических мембран. В результате чего, как мы уже говорили, могут происходить структурные полиморфные превращения: замена ламеллярной структуры на гексагональную. При этом экспериментальные данные свидетельствуют об изменении текучести и степени упорядоченности бислойной мембраны, а также, в связи с этим, - изменении активности мембраносвязанных и липидзависимых ферментов /Бурлакова Е.Б. и др. 1982/. Это в свою очередь приводит к изменению функциональной активности биологических мембран и клеточного метаболизма \там же\. В Институте Биохимической Физики РАН было предложено использовать антиоксиданты для лечения таких заболеваний, которые сопровождаются повышением скорости перекисного окисления и изменением вследствие этого состава липидов биологических мембран: онкологические заболевания, лучевая болезнь, ожоговая болезнь и эпилепсия /Бурлакова Е.Б. и др., 1975, 1981 /.Экспериментально было показано, что антиоксиданты не только нормализуют состав липидов биологических мембран, но и повышают выживаемость организма при острых патологиях /Бурлакова Е.Б. и др., 1982, Архипова Г.В. и др., 1982, 1986/.

Однако антиоксиданты оказались эффективными не только при патологии, но и при нормальных поведенческих реакциях у животных. При исследовании влияния антиоксидантов на нормальное поведение животных, было обнаружено, что снижается количество ошибок и повышается эффективность решения животными задач, особенно при их первом предъявлении \Архипова Г.В. и др., 1989\. Скорость обучаемости возрастает, а память становится оптимальной /Архипова Г.В. и др., 1992/. При сравнении с уже известными ноотропными веществами такими как, например, нейропептид АКТГ \Ашмарин И.П. и др., 1978\, антиоксиданты по эффективности были аналогичны или превышали показатели этого нейропептида /Бурлакова Е.Б. и др., 1982, Архипова Г.В. и др., 1982,1986/. Учитывая схожесть результатов нейробиологического действия АКТГ и фенозана, можно было полагать, что, несмотря на различное химическое строение, оба эти препарата могут иметь некоторые общие этапы механизма их ноотропного действия на уровне синаптических мембран. Если оба эти ноотропных вещества, изменяя различными путями, соотношение липид\вода в липидном бислое, могут способствовать полиморфным превращениям в мембранных липидах и тем самым изменять степень упорядоченности и толщину синаптической мембраны, то ноотропное действие этих препаратов может быть связано с их мембранным действием. Повышенное содержание гексагональных структур, изменение в связи с этим степени упорядоченности и толщины липидного бислоя может способствовать ускорению нейротрансмиттерных процессов и увеличению скорости нейромедиаторной передачи за счёт изменения активности соответствующих ферментов. Получены данные, что активность таких важных для нейромедиаторной передачи ферментов, как протеинкиназа-С, аденилатциклаза, ацетилхолинэстераза, а также ряда рецепторов ЦНС, зависит от вязкости и структурного состояния липидов синаптической мембраны \Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., 1986, Молочкина Е.М.,1992, Хохлов А.П., 1984\.

В свою очередь, получены экспериментальные данные, что биологическая активность таких важных нейромедиаторов, как норадреналин, адреналин, серотонин и др. проявляется в зависимости от того, при какой температуре они находились в модельном эксперименте при инкубации с липидами, а также находились ли липиды в гомогенном виде или в виде структурно-упорядоченного липидного бислоя \Бурлакова Е.Б. и др., 1992\.

По всей видимости, изменение структурного состояния липидного бислоя в связи с полиморфизмом липидов на синаптическом уровне влечёт за собой целую цепь таких изменений в механизмах нейротрансмиссии, что приводит, в конечном счёте, на поведенческом уровне у животных к снижению количества ошибок при решении задач и улучшению памяти.

Литературные данные о влиянии на уровне мембран различных веществ на температуры фазовых переходов и показатели вязкости липидного бислоя в основном ограничиваются исследованием этих феноменов без учёта поведения всей системы липид\вода в целом. На наш взгляд изучение этих процессов необходимо проводить на уровне системного, кооперативного поведения липидных молекул, структурно встроенных вместе с молекулами воды в бислой, поскольку жидкокристаллические свойства бислойной системы липид-вода в той или иной полиморфной упаковке имеют собственные поведенческие различия. Эти свойства могут иметь особое значение для функциональной активности мембраносвязанных и липидзависимых белков и ферментов в процессах нейромедиаторной передачи и молекулярных механизмов действия ноотропных веществ.

Целью настоящего исследования является комплексное изучение влияния ноотропных веществ на структурное жидкокристаллическое состояние модельных липидных мембран с применением различных физико-химических методов.

Всё вышесказанное поставило перед нами следующие задачи:

1. Сравнительное изучение общих закономерностей структурно-фазовых превращений в водных дисперсиях природного и синтетического фосфатидилхолина (ФХ) под действием температуры, а также изучение этих термоиндуцированных превращений при изменении состава мембранных фосфолипидов (добавлении в изучаемую систему различного количества фосфатидилэтаноламина (ФЭА).

2. Исследование полиморфных превращений в мембранном бислое при действии на систему фосфолипид - вода веществ, улучшающих память и обучение in vivo (нейропептид АКТГ и антиоксидант фенозан).

3. Анализ структурно-фазовых мезоморфных превращений в липидах мембранного бислоя как важного условия молекулярного действия ноотропных агентов.

Полиморфизм липидов довольно широко изучен для небольших молекул липидов, однако для сложных молекул фосфолипидов природного происхождения работ по изучению полиморфизма очень мало \Василенко И.А. и др.1988\, а для фосфолипидов головного мозга мы их не обнаружили в литературе.

На наш взгляд системное жидкокристаллическое поведение липидных молекул и полиморфизм липидов в мембранном бислое может играть особую роль в процессах записи и хранения биологической информации, если ноотропные вещества, не зависимо от их химического строения, способны влиять на жидкокристаллическое поведение системы липид-вода и полиморфизм мембранных липидов, степень их упорядоченности и толщину липидного бислоя. Вещества, способные увеличивать степень полиморфных превращений в липидах биологических мембран, одновременно будут способствовать улучшению памяти и обучаемости.

Актуальность настоящей работы. В связи с увеличением продолжительности жизни человека и общим постарением населения Земли, а также в связи с ухудшением её экологии и увеличением количества рождающихся умственно неполноценных детей, работы по изучению молекулярных механизмов памяти и механизмов действия нейротропных веществ, способных улучшать мозговую деятельность, имеют особую актуальность. Особенно ценно, если на основании этих исследований можно предложить несложные тесты по отбору наиболее эффективных и недорогих нейротропных препаратов для коррекции памяти, улучшения обучаемости и рассудочной деятельности.

Огромное количество исследований в области изучения молекулярных механизмов памяти, в основном, посвящено изучению роли ДНК и белков. Придавая важное значение биологическим мембранам как клеточным регуляторам и метаболическим модификаторам \Бурлакова Е.Б.1974, Минц Р.И.,1982, Браун Г., Уолкен Дж., 1982\, исследования последнего времени показали важную роль липидов биологических мембран в процессах клеточного метаболизма в норме и патологии \Бурлакова Е.Б, 1974, Дятловицкая Э.В, 1976\, в том числе и патологий головного мозга. \Архипова Г.В. и др., 1971, 1975, 1981V

Поскольку биологическая мембрана представляет собой уникальное структурное образование из белков, липидов и воды и обладает целым рядом собственных структурных свойств, в том числе, полиморфизмом её фосфолипидов , то особенное значение имеют работы по изучению структурных полиморфных изменений мембранных липидов и выяснению их роли в нейробиологических процессах \Богуславский Л.И., 1979, Василенко И.А., 1988., P.R. Cullis, МЛ. Норе, В. De Kruijff, A.I. Verhleij and C.P.S. Tilcock, 1986, B. De Kruijff, 1987/.

Важность и перспективность такого рода исследований основывается на тех экспериментальных данных, которые свидетельствуют о том, что изменение структуры и вязкостных свойств липидов мембран влечёт за собой функциональные изменения активности мембраносвязанных и липидзависимых ферментов, в частности аденилатциклазы, протеинкиназы С, ацетилхолинэстеразы) \Пальмина Н.П., Мальцева E.JL, 1986, Молочкина Е.М., 1992\ и рецепторов центральной нервной системы \Бурлакова Е.Б., Хохлов А.П. 1984V К тому же недавние исследования показывают существование зависимости между составом фосфолипидов, структурным состоянием как модельных, так и синаптических мембран и функциональной активностью как отдельных нейромедиаторов таких, как норадреналин, серотонин, адреналин и др., так и в целом нейромедиаторных систем -холинэргической, серотонинэргической \Бурлакова Е.Б, Губарева

А.Е., Архипова Г.В., 1992, Бурлакова Е.Б., Архипова Г.В., Чернявская Л.И., 1987\.

Для выяснения механизмов памяти особенно перспективны те исследования, которые посвящены изучению молекулярного механизма действия ноотропных агентов, как уже известных, например, нейропептидов \Ашмарин И.П., 1987\, так и новых препаратов с ноотропным действием из класса антиоксидантов \Архипова Г.В. и др., 1981, 1982, 1983\.

В качестве таких агентов, улучшающих память и обучаемость у животных, мы выбрали два препарата различного химического строения: нейропептид АКТГ и антиоксид ант фенозан (2,4-дитретбутил-3-оксифенилпропионовая кислота) \Ашмарин И.П., 1987, Архипова Г.В. и др., 1981, 1982, 1983, 1990\. Оба препарата достаточно хорошо изучены как на физиологическом, так и на биохимическом уровне, однако, данных по их влиянию на полиморфизм липидного бислоя в литературе нами не обнаружено. Новизна и практическая значимость данного исследования. В процессе экспериментальной работы на уровне сложных молекул липидов природного происхождения, а именно, фосфатидилхолина из мозга быка, впервые были изучены полиморфные превращения липидов как при действии температуры и изменения фосфолипидного состава липосом, так и при действии двух ноотропных препаратов различной химической природы: нейропептид а АКТГ и антиоксиданта фенозана. Было установлено, что добавление небислойобразующего липида - фосфатидилэтаноламина в систему ФХ - вода, находящуюся в ламеллярной фазе, приводит к увеличению содержания небислойных мезоморфных липидных структур, увеличению времени релаксации и понижению температуры возвращения системы к исходному состоянию.

В работе впервые было показано, что при действии двух ноотропных веществ различного химического строения (нейропептида и антиоксиданта) на уровне мембранного бислоя как синтетических, так и природных липидов, существуют общие, характерные закономерности в изменении полиморфного состояния системы, в частности, увеличение содержания небислойных мезофазных структур, увеличение толщины и разупорядоченности бислоя. Эти данные позволяют предположить, что появление новых мезоморфных структур фосфолипидов в мембранном бислое является важным условием действия ноотропных веществ на уровне биологических мембран.

В работе впервые были исследованы термоиндуцированные фазовые переходы водных дисперсий фосфатидилхолина из мозга быка. Впервые различными методами экспериментальных исследований было показано существование гистерезиса кривых нагревания и охлаждения водных дисперсий фосфатидилхолина из мозга в том же интервале температур, что и для водных дисперсий ДПФХ. Впервые метод протонной магнитной релаксации был применён для изучения полиморфизма липидов мультислойных липосом. Для исследования полиморфизма фосфатидилхолина из головного мозга быка впервые был применён метод 31Р-ЯМР - спектроскопии. Для исследования полиморфизма фосфатидилхолина из головного мозга впервые был применён метод спиновых зондов. Для получения дифрактограмм и рентгенограмм мультислойных природных мозговых фосфатидилхолиновых везикул и определения толщины их липидного бислоя впервые был применён метод рентгеноструктурного анализа.

Впервые высказано предположение об участии мезоморфных жидкокристаллических липидных структур в молекулярном механизме действия ноотропных веществ на уровне биологических мембран. Анализ полученных результатов позволил впервые высказать гипотезу о возможном участии полиморфизма липидов в молекулярном механизме записи и хранения информации. Полученные экспериментальные данные имеют как теоретическое значение для более полного понимания молекулярных механизмов памяти, так и могут быть практически использованы при подборе наиболее эффективных ноотропных лекарственных препаратов. Положения, выносимые на защиту.

1.Температуры фазовых переходов водных дисперсий природного и синтетического фосфатидилхолинов практически совпадают в интервале температур 28-45°С.

2.Кривые нагревания и охлаждения водных дисперсий природного и синтетического фосфатидилхолина образуют гистерезис в изучаемом интервале температур.

3.Показана универсальность изучаемых закономерностей поведения водных дисперсий как природного, так и синтетического фосфатидилхолинов.

4.Добавление фосфатидилэтаноламина в систему природного ФХ-вода увеличивает содержание неламеллярной мезофазы, время релаксации системы и понижает температуру возвращения системы к исходному состоянию при нагревании и охлаждении. Система ФХ-вода в присутствии ФЭА возвращается к исходному состоянию при более низких температурах.

6.На основании полученные данные сделано предположение об участии полиморфных превращений липидов в молекулярном механизме действия ноотропных веществ и записи информации на уровне биологических мембран.

2. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Погорецкая, Ирина Львовна

7. Выводы.

1. Методами ПМР, Р- ЯМР - спектроскопии, а также методом спиновых зондов изучено термоиндуцированное поведение водной дисперсии фосфатидилхолина из мозга быка в интервале температур 23° - 45°С.

3. Установлено, что в интервале температур 23° - 45°С кривые нагревания и охлаждения системы природный фосфатидилхолин -вода имеют гистерезис по температуре = 2°С.

4. Доказано, что температуры фазовых переходов системы фосфатидилхолин из мозга быка - вода в интервале температур 23° - 45 °С при нагревании и охлаждении идентичны температурам фазовых переходов системы дипальмитоилфосфатидилхолин -вода в аналогичных условиях.

5. Показано, что влияние ноотропных агентов разного химического строения (нейропептид АКТГ, антиоксидант фенозан) сдвигает температуры фазовых переходов системы фосфатидилхолин - вода, увеличивает площадь гистерезиса, ограниченную кривыми нагревания и охлаждения (степень полиморфизма), увеличивает разупорядоченность системы, а также увеличивает толщину липидного бислоя. Причем, к действию ноотропных агентов более чувствителен мезофазный предпереход.

6. Методом рентгеноструктурного анализа установлен факт изменения толщины липидных мембран, а также периода и регулярности их укладки в многослойных ФХ липосомах в присутствии антиоксиданта фенозана при сохранении ламеллярной мезофазы.

7. Полученные экспериментальные и аналитические данные позволяют предположить участие мезоморфных липидных структур ( полиморфизма липидов ) в механизмах записи информации и действия ноотропных веществ на уровне биологических мембран.

6. Заключение.

Возможные молекулярные механизмы процессов записи и хранения информации на уровне биологических мембран. Участие полиморфизма липидов в этих процессах. Основной вопрос, стоящий перед исследователями, занимающимися проблемами молекулярных основ памяти, заключается в следующем: имеется ли вещество, "отвечающее" за память, а также существует ли вещество - "хранитель памяти"?

Поскольку известно, что в ДНК закодирована информация о наследственных признаках, которая реализуется посредством РНК и последующим синтезом белков, то, само собой разумеется, что основная роль носителей информации, прежде всего, отдавалась молекулам ДНК и РНК \Кометиани Г.А., Алексидзе Н.Г., Клейн Э.А., 1980, Hyden Н., 1959, 1962V

Ещё в 60-е годы Hyden выдвинул теорию о том, что индивидуальный опыт кодируется в молекулах РНК \Hyden Н, 1962V Согласно этим представлениям, совокупность нервных импульсов переводится на язык молекулярного кода РНК, служащей основой памяти, т.е. в процессе записи информации производится синтез новых РНК, на которых и может "записываться" информация \Hyden Н, 1978\. Было проведено много исследований, посвященных как влиянию ингибиторов синтеза РНК и ДНК на выработку и сохранение условных рефлексов, так и влияние выработки условных рефлексов на синтез РНК и ДНК.

Так, введение ингибитора синтеза белка - актиномицина - нарушало выработку новых условных рефлексов и их закрепление. \Agranoff B.W. et al., 1967\. После введения животным 8-азогуанина, вызывающего образование аномальных молекул рибонуклеиновых кислот, способность к плаванию у крыс в водном лабиринте сохранялась полностью, но тормозился процесс образования нового условного рефлекса YDinigman W., Sporn M.W., 1964V В присутствии рибонуклезы синтезированная рибонуклеиновая кислота разрушается. Разрушение рибонуклеиновых кислот также оказало влияние на поведение животных: выработанные двигательные условные рефлексы у байкальских планарий обратимо тормозились после инъекций рибонуклеазы УГушмалова H.A., 1967V С другой стороны, существует очень много данных, связанных с изменением количества и распределения РНК и ДНК при выработке условных рефлексов и обучении у животных. Hyden и Egyhazi опубликовали данные об изменении (увеличении) количества рибонуклеиновой кислоты в отдельных клетках в процессе обучения крыс \Hyden Н., Egyhazy Е., 1962V Изменялось (увеличивалось) соотношение аденин \ урацил как в ядерной, так и в цитоплазматической нуклеиновой кислоте (по сравнению с контрольной группой). Этот факт дал возможность авторам сделать вывод о том, что в процессе обучения происходит синтез нового типа информационной рибонуклеиновой кислоты.

Изменение соотношения нуклеотидов при различных условиях стимулирования показано и в экспериментах с планариями УГушмалова H.A., 1967, Черкашин А.Н., Шейман И.М., 1966\.У крыс при выработке условного рефлекса интенсифицируется синтез ДНК в неокортексе \Hyden Н., Egyhazy Е., 1965, Hyden Н., Lange P.W., 1965V В литературе также имеются данные о том, что факторы, положительно влияющие на обмен нуклеиновых кислот, улучшают работоспособность головного мозга УГимкин В.Н. с соавт., 1968, Shashua V.A., 1968V

Дальнейшие исследования в области записи и хранения информации привели к выводу о том, что стадия химических превращений в цепи событий, удерживающих приобретенную информацию, связана с вновь синтезируемыми белками. \Кометиани Г.А., Алексидзе Н.Г., Клейн Е.Э, 1980, Hyden Н., 1959, Hyden Н., Egyhazy Е., 1962V Этот вывод также основывался на том факте, что и РНК, как участник акта записи и хранения информации может действовать через белок. В связи с этим получило распространение представление о т.н. "пептидной" памяти Унгара (Ungar.G). В результате проведенных им экспериментов был выделен пептид, названный скотофобином, а несколько позже в той же лаборатории был выделен другой пептид -амелетин \Унгар Г., 1973Y Было определено, что концентрация скотофобина нарастает в мозге мышей в первые шесть дней обучения, после чего уменьшается вплоть до его исчезновения или по крайней мере снижается ниже пороговой чувствительности после 15 дней обучения. Введение этих пептидов животным улучшало их способность к обучению. Похожие данные получены и для амелетина \Ungar G, 1973, Ungar G., Desiderio R.M., 1972V Унгар с коллегами также выделили и определили первичные структуры еще нескольких пептидов, синтезируемых в процессе обучения или выработки условного рефлекса. \Унгар Г., 1973Y

На основании полученных данных Унгар сделал вывод о том, что имеется химический код памяти. Благодаря пластичности -способности формировать новые синаптические связи, возможно образование нейронами новых синаптических цепей, т.н. метацепей. По мнению исследователя, синтезируемый в процессе обучения пептид памяти внедряется в активированные синаптические мембраны, что и приводит к формированию метацепи, в которой и происходит запись информации. Каков бы ни оказался механизм кодирования, считает Унгар, имеющиеся данные свидетельствуют о пептидах, как о молекулах, в которых записана и хранится информация УУнгар Г., 1973V

Изучался также феномен синтеза de novo ряда нейроспецифических белков, который проявляется сразу после обучения и достигает максимума примерно через 3-6 часов после обучения \Ашмарин И.П., 1987, Hyden Н., 1978V Таковы, например, белок S-100, гликопротеин 11 В. Методами иммунохимии и системного анализа изучено распределение нейроспецифического белка S-100 в коре головного мозга, гиппокампе, мозжечке \Ашмарин И.П., 1987, Штарк М.Б., 1978Y В эксперименте по обучению крыс использовать непредпочитаемую лапу для добычи пищи синтез белка S-100 в процессе обучения явился ответной реакцией нервных клеток специфических структур мозга, участвующих в формировании памяти и новой поведенческой реакции.

Модель памяти Gold'a и McGaugh (1973) включает наряду со специфическими (нейронными) компонентами неспецифические, часть которых "работает" на периферии \Gold P.E., McGaugh J.L., 1973V Наблюдается изменение концентрации адреналина в крови за счет его выброса надпочечниками во время стресса, сопровождающего начальные этапы обучения, а также выброс в кровь АКТГ при обучении. Системное введение адреналина или АКТГ после сеанса обучения в оптимальных дозах улучшает закрепление и сохранение временных связей, и эффект убывает по мере того, как увеличивается интервал между завершением обучения и введением веществ. Причем введение АКТГ или его фрагментов (фрагмент 4-10) не вызывает увеличение содержания адреналина в плазме, что свидетельствует, что эффекты АКТГ не опосредуются через выброс адреналина надпочечниками \Ашмарин И.П., Кругликов Р.И., 1983, Ungar G., Desiderio Р.М., Parr W, 1972Y

Довольно хорошо известно влияние не только нейропептида АКТГ, но и вазопрессина, МСГ на процесс обучения как стимуляторов обучаемости. Их особенность заключается в том, что эти пептиды стимулируют запоминание при введении извне \Ашмарин И.П., Кругликов Р.И., 1983, HydenH., 1978V

Однако данные современных исследований молекулярных основ памяти свидетельствуют о том, что не существует веществ, являющихся непосредственными "носителями" памяти \Ашмарин И.П., 1987V Многими исследованиями доказано, что синтез РНК и биосинтез белка в нервных клетках сопровождает практически любой акт жизнедеятельности живых существ \Алексидзе Н.Г. и др., 1982, Ашмарин И.П., 1987 Бурлакова Е.Б., 1990Y Причем происходит это одинаково как при обучении, так и, по-видимому, во время иной активной деятельности животных \Ашмарин И.П., 1987V Например, синтез белка S-100 при обучении не имеет сигнального значения \Алексидзе Н.Г. и др., 1982\, поскольку S-100 участвует в регуляции неспецифического ответа, например на физическую нагрузку \там же\. В данном случае возникает вопрос еще и о переводе информации из нуклеотидных и полипептидных последовательностей в энграмму и обратно \Ашмарин И.П., 1987V

На уровне современных знаний гипотеза о веществах - молекулярных кодах памяти не имеет основательной опоры. Поэтому можно говорить о том, что информация в живом организме записывается и хранится не с помощью каких-либо молекул - "носителей" памяти. Скорее следует говорить не о "веществах памяти", а о свойствах определенных веществ, влияющих на сохранение информации. К таким свойствам, прежде всего, могут относиться физико-химические и структурные характеристики биомолекул.

В настоящее время существует достаточно много моделей памяти человека, как кратковременной, так и долговременной. Представляется необходимым остановиться на некоторых из них, вызывающих определенный интерес для нашего исследования. МоптсЛо и КоэЫапё \Morimoto-BH , КозЫапс1-ОЕ, 1991\ предполагают, что нейрональная клеточная линия НТ-4 служит моделью памяти, показывая коротко- и долгосрочное потенцирование нейротрансмиттерной секреции. Деполяризация мембраны вызывает секрецию и серотониновые и №метил-Б-аспартатовые рецепторы вовлекаются в потенцирование ответа. Адренергические и аденозиновые рецепторы, которые связаны с аденилатциклазой, также ускоряют потенцирование ответа . В добавление, основная оценка уровня ц-АМФ с помощью фореколина или при применении дибутил-цАМФ также потенцирует ответ. При этих различных типах стимулирования уровень ц-АМФ является общим фактором, на основании которого, независимо от типа, можно говорить об отсутствии или наличии потенцирования. Уровень ц-АМФ также можно определить как регулятор ответа при этом явлении. . Повторная стимуляция адренергического рецептора приводит к кратковременному потенцированию, тогда как повторная стимуляция аденозинового рецептора приводит к долгосрочному потенцированию. Это различие можно объяснить, учитывая, что некоторый предшественник, который определяет уровень ц-АМФ, превышает порог, продуцируя долговременное потенцирование. Этот порог превышается при стимуляции аденозинового рецептора, и не превышается при стимуляции -адренергического рецептора. \Morimoto-BH, КобЫшкШЕ, 1991\.

Монтегю \Montague РЯ, 1996\ предлагает гипотезу о роли внеклеточного пространства в коре головного мозга, в котором находятся атомы и молекулы, необходимые для функционирования синапсов, в процессе формирования памяти. Автор предполагает, что быстрый переход этих атомов и молекул из внеклеточного пространства во внутрисинаптическое пространство представляет собой потребление ограниченного ресурса, доступного для локального объема нейрональной ткани. Это приводит к состязанию между синапсами за данный ограниченный ресурс, необходимый для функционирования синапсов. Предложена теория, в которой данный процесс играет критическую роль в процессах локальных объемов нейрональной ткани. В краткосрочный период времени этот принцип позволяет выбрать синапсы, чья функция соответствует ситуации и помогает интегрировать многие нейрональные сигналы в объеме ткани в любой данный момент. В долгосрочном периоде этот принцип приводит к стабильному хранению воспроизведенной информации. \Montague Р11, 1996\.

На основании данных, полученных в результате исследований последнего времени , имеет смысл говорить о записи информации при изменении структурных и физико-химических свойств сложноорганизованных биологических систем, каковыми, в частности, являются биологические мембраны. Эти сложные структурные целостные образования, состоящие из липидов, белков и воды, в зависимости от их соотношения способны к мезофазным переходам и полиморфным превращениям. Липиды мембран в жидкокристаллическом состоянии, способны находится в нескольких мезофазных состояниях. Переходы между мезофазами могут стимулироваться различными факторами: и химическими агентами (например, ионами Са ++ или Mg ++), и физическими воздействиями (например, магнитными полями). Причем время релаксации составляет от нескольких часов до нескольких суток. Учитывая как литературные, так и собственные данные, была высказана следующая гипотеза: и кратковременная, и долговременная память связаны с переходом липидов в новое мезофазное состояние. Если время жизни этого состояния меньше, чем время, необходимое для синтеза новых интегральных белков, то система возвращается к исходному состоянию, иначе - если новые белки успевают синтезироваться и встроиться в новую мезофазу - то увеличивается и время жизни мезофазы, и возможность извлечения информации через длительное время \Бурлакова Е.Б., 1990\.

На основании этой гипотезы можно объяснить и факты участия РНК, белка и нейропептидов в процессе обучения. Ингибиторы синтеза РНК и белков не позволяют "закрепить" вновь образованную мезофазу и, соответственно, препятствуют переходу кратковременной памяти в долговременную \Ашмарин И.П., 1987, Бурлакова Е.Б., 1990\.

Если говорить о роли ноотропных агентов в связи с вышеизложенным, то возможен следующий механизм их действия: ноотропные агенты увеличивают время пребывания липидов мембран в новом мезофазном состоянии до стабилизации его белками. Данные наших экспериментов свидетельствуют о том, что и при добавлении синтетического антиоксиданта фенозана, и добавлении АКТГ при термоиндуцированных фазовых переходах происходит значительно более медленная, чем в контроле релаксация системы, увеличивается площадь гистерезиса кривых нагревания и охлаждения, т.е. увеличивается степень полиморфизма. Возможно, фенозан, также как и любой ноотропный агент, изменяет соотношение липид\вода (полярная "головка" липида становится менее гидратированной), к чему очень чувствительно фазовое состояние липидов в мембране. Вследствие этого и продлевается существование мембраны в новом мезофазном состоянии.

За счет продления времени релаксации системы пептиды и белки, синтезированные за это время, успевают более надежно встроиться в биологическую мембрану и "удерживать" это "новое" жидкокристаллическое состояние. Таким образом, на первом месте выступает не какое-то отдельное вещество памяти, а физико-химическое его свойство, а именно, полиморфное жидкокристаллическое состояние липидных структур, какими являются не отдельные молекулы, а в целом клеточные мембраны, состоящие из липидов, белков и воды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Погорецкая, Ирина Львовна, Москва

1. Адамчик А., Стругальский 3.- \\ Жидкие кристаллы (под. ред.

2. Чистякова И.Г.), М., "Советское радио", 1979.

3. Алексидзе Н.Г., Бережной Г.А., Кикурадзе В.О., Белик Я.В. "К вопросу о синергичности белка S-100 в процессах обучения и памяти." \\ Нейрохимия, 1982, т.1, №1, с.43-50.

4. Архипов В.И., Архипова Г.В., Федотова И.Б. "Влияние синтетического антиоксиданта фенозана на эффекты пенобарбитала при диссоциированном обучении." \\ Ж. ВНД, т. 40, № 6, 1990, с. 1140-1144.

5. Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б., Кондрашева Е.А., Мурза Л.И., Юшманов В.Е. "Роль липидов биологических мембран в процессах записи и хранения информации." \\ Биологические мембраны, 1994, т. 11, №4, с.456-460.

6. Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б., Кривандин A.B., Погорецкая И.Л. " \\ Нейрохимия, 1996, т. 13, №2, с. 128-133

7. Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б., Федотова И.Б. "Липиды нейрональных мембран в моделях памяти и обучения у крыс линии КМ сверхчувствительных к звуковому раздражению." \\ Сенсорные системы, т. 6, № 4, 1992, с. 66-68.

8. Ашмарин И.Г. "Механизмы памяти.", JI, 1987.

9. Ю.Ашмарин И.П., Еропкин М.Ю., Ковалева Т.А., Рожанец В.В. "Олигопептиды мозга анальгетики, стимуляторы памяти и сна." \\ Молекулярная биология., 1978, №12, т.5, с. 965.

10. Ашмарин И.П., Кругликов Р.И. "Пептиды, обучение, память." \\ Нейрохимия, 1983, т.2, №3, с. 327-333.

11. Барсуков Л.И. "Vesicular membrane structures: principles of self-organisation and mechanisms of self-assembly, potential technological applications." \\ в "Materials of future and non traditional chemical technologies", Pushchino, 1998, c.34.

12. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В, Молотковский Ю.Г., Батраков С.Г., Барсуков Л.И., Проказова Н.В. "Препаративная биохимия липидов". М., "Наука", 1981.

13. Бейли И. Статистические методы в биологии., М., 1962.

14. Богуславский Л.И. "Жидкокристаллические структуры в биологических системах." \\ В сб. "Жидкие кристаллы" (под ред. Жданова С.И.), М, 1979.

15. Бородкин Ю.С., Шабанов П.Д. "Нейрохимические механизмы извлечения следов памяти." (отв. ред. Бехтерева Н.П.), Л., "Наука", 1986, 150 с.

16. Браун Г., Уолкен Дж. "Жидкие кристаллы и биологические структуры." М., 1982.

17. Бурлакова Е.Б., Алесенко A.B., Молочкина Е.М., Пальмина Н.П., Храпова Н.Г. "Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте.", М., "Наука", 1975.

18. Бурлакова Е.Б., Архипова Г.В., Семиохина А.Ф., Федотова И.Б., Крушинский JI.B. "Влияние синтетических антиоксидантов на функциональное состояние головного мозга крыс после звукового раздражения." \\ ДАН, 1981, т. 256, №3, с.746-749.

19. Бурлакова Е.Б., Губарева А.Е., Архипова Г.В., Рогинский В.А. "Модуляция перекисного окисления липидов биогенными аминами в модельных системах." \\ Вопросы мед. Химии, 1992, №2, с. 17-20.

20. Бурлакова Е.Б. "Роль липидов биологических мембран в передаче и хранении информации." \\ в сб. "Исследование памяти" (под ред. Корж H.H.), М., Наука, 1990, с. 146-153.

21. Вайнштейн Б.К. "Дифракция рентгеновских лучей на цепных молекулах.", М.: Издательство АН СССР, 1963.

22. Василенко И.А. "Полиморфизм липидов и его роль в структурной организации модельных и биологических мембран." \\ Док. дисс., М, "Наука", 1988.

23. Васильев С.Е., Донец Д.Е., Заневский Ю.В., Иванов А.Б., Смыков Л.П., Черемухина Г.А., Черненко С.П. "Автоматизированный однокоординатный детектор рентгеновского излучения." \\ Приборы и техника эксперимента, 1995, №2., с. 172.

24. Гексагональная и другие типы небислойных липидных фаз. \\ РЖ, 1989, 12,53 (12 В609).

25. Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. \\ В сб. "Метод спиновых меток и зондов. Проблемы и перспективы.", М., "Наука", 1986., с. 165-170.

26. Гольдфельд М.Г. "Исследование биологических мембран и модельных микродетергентных систем с помощью иминоксильных стабильных свободных радикалов." \\ Канд. дисс., М., 1970.

27. Гриффит О., Джойст П. "Липидные спиновые метки в биологических мембранах." \\ В сб. "Спиновые метки. Теория и применение" (ред. Берлинер А.), М., 1979, с. 489-567.

28. Дятловицкая Э.Г. "Исследование состава липидов опухолей и гомологичных нормальных тканей." \\ Док. дисс., М., 1976.

29. ЗГИвков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран., М.,1982.

30. Кольтовер В.К. "Спиновые метки и зонды в исследованиях модельных и биологических мембран." \\ В сб. "Итоги науки и техники ВИНИТИ. Биофизика" (ред. Владимиров Ю. К.), 1979, т. 11, с. 11-100.

31. Кометиани П.А., Алексидзе Н.Г., Клейн Е.Э. "Специфические белки и пептиды мозга." \\ В сб.: Нейрохимические аспекты памяти, (ред. Кругликов Р.И.), 1980, Тбилиси., "Мецниереба", с. 137-176.

32. Конев C.B. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы, (ред. Разумович А.Н.), Минск, "Наука и техника", 1987, 240с.

33. Крепс Е.М.- В кн.: Липиды клеточных мембран., 1981, Л., "Наука", с. 188-193.

34. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда., М., "Наука", 1976, 196 с.

35. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Т.9, ч.2 Теория конденсированного состояния., М., 1978.

36. Мак Коннел Г. "Молекулярное движение в биологических мембранах." \\ В сб. "Спиновые метки. Теория и применение." (под ред. Берлинера Л), М., "Мир", 1979, с. 570-606.

37. Мальцева Е.Л., Бурлакова Е.Б. "Различие в ответе мембран клеток мозга и печени на действие in vitro антиоксиданта и жирной кислоты (по изменению активности циклаз и вязкости). \\ Биологические мембраны, 1986, т. 3, № 8, с. 773-779.

38. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. "Липосомы и их взаимодействие с клетками", (под. ред. Чайлахяна Л.М.), М., "Наука", 1986, 240 с.

39. Медведев В.И., Акимов Г.А., Бахарев В.Д. "Эффекты применения нейропептидов в уровнерефлекторных исследованиях на грызунах, у здоровых людей и больных с нарушениями памяти." \\ Физиология человека, 1981, т. 7, № 4, с. 593.

40. Медведев В.И., Бахарев В.Д., Гречко А.Г., Незовибатько В.Н. "Влияние на память человека вазопрессина и фрагмента адренокортикотропного гормона АКТГ4„7." \\ Физиология человека, 1980, т.6, №5, с. 771.

41. Минц Р.И., Кононенко Е.В. "Жидкие кристаллы в биологических системах." \\ В сб. Итоги науки и техники ВИНИТИ. Биофизика, (под. Ред. Веденова A.A.), 1982, М., т. 13, 150 с.

42. Могилевский Л.Ю., Дембо А.Т., Свергун Д.И., Фейгин Л.А. "Малоугловой рентгеновский дифрактометр с однокоординатным детектором." \\ Кристаллография, 1984, т. 29, с. 587-591.

43. Молочкина Е.М., Боровок Н.В., Каипова Т.Д., Бурлакова Е.Б. "Нейромодуляторная роль липидной компоненты нейрональных мембран in vivo." \\ В сб. "Клеточная сигнализация." (под. ред. Островского М.А. и Костюка П.Г.), М., Наука., !992, С. 103-115.

44. Пономарева-Степная С.А. "Синтез и исследование Фрагментов АКТГ и их аналогов стимуляторов памяти." \\ Химико-фармац. журнал, 1981, т. 16, №7, с. 463.

45. Рууге Э.К., Субчински С.А., Тихонов H.A. "Исследование структуры мембран хлоропластов высших растений при помощи парамагнитных зондов." \\ Молекулярная биология, 1977, т. 11, №3, с.646.

46. Скулачев B.C. Трансформация энергии в биомембранах., М., "Наука", 1972.

47. Сорокоумова Г.М., Василенко И.А., Якуб И.С., Швец В.И. "Динамика перехода бислой гексагональная фаза в водных дисперсиях липидов." \\ Биологические мембраны, 1987, т.4, №10, с. 1073-1083.

48. Спиновые метки. Теория и применение, (под ред. Берлинера Д.), М., 1979.

49. Тушмалова Н.А. "Условные рефлексы у байкальских планарий Poloplana olivacea К. После инъекции рибонуклеазы." \\ Журнал ВИД, 1967, т. 17, №1, с. 359-365.

50. Фаррар Т., Беккер Э. \\ Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР (ред. Федин Э.И.), М., "Мир", 1975, 164 с.

51. Федотова И.Б., Семиохина А.Ф., Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б. "Возможности коррекции некоторых сложных поведенческих реакций у крыс КМ с помощью антиоксиданта."\\ Ж.ВНД, т. 40, 1990, с. 318-325.

52. Хохлов А.П., Ярыгин К.И., Бурлакова Е.Б. "Синтетические фенольные антиоксиданты полифункциональные модуляторы биологических мембран." \\ Биологические мембраны, 1989, т.6, № 2, с. 133-142.

53. Черкашин А.Н., Шейман И.М. " О влиянии рибонуклеазы на нервную деятельность планарий." \\ Доклады АН СССР, 1966, т.171, №3, с. 996-998.

54. Sen A., Williams W.P., Quinn P.J. "A comparision of the in vitro binding of a-tocoferol to microsomes of lung, liver, heart and brain of the rat." \\ BBA, 1981, v.663, p. 380-389.

55. Agranoff B.W., Davis R.E., Casola L., Lim R. "Actinomicin D blocks formation of memory of shock-avoidance in goldfish." \\ Science, 1967, v 158, N 3808, p.1600-1603.

56. De Kruijff "Polimorphyc regulation of membrane lipid composition." \\ Nature, 1987, N 329, p. 587-588.

57. Cahpman D. "Phase transitions and fluidity characteristics of lipids and sell membranes." \\ B c6. "Quarterly reviews of biophysics", Cambridge university press, 1975, v. 8, N 2, p. 185-237.

58. De Wield D., Witter A., Greven H.M. "Behaviorally active ACTH analogues" \\ Biochem. Pharmacol., 1976, v.24, p. 1463.

59. Dingman W., Sporn M.B. " Molecular theory of memory." \\ Science, 1964, v.3614,p.29-31.

60. Garwish K. "Hydration of phospholipids and hydration forces between membrane surface." \\ B c6. "Electromagnetic fields and biomembranes", 1986, Pleven, p. 18-21.

61. Gold P.E., McGaugh J.L. "Short-term memory.", Acad. Press, N-Y, p.355-378.

62. Hawton M.N., Doane T.W. "Pretransitional phenomena in phospholipid \ water multilayers." \\ Biophys. J, 1987, v. 52 N 3, p. 401-404.

63. Hui S.W., Stewart T.P., Boni L.T. "The nature of lipidic particles and their roles in polymorphic transitions." \\ Chem. and Phys. Lipids., 1983, v. 333, p. 113-126.

64. Hyden H. \\ Macromolecules and Behavior, MacMillan, London, 1973, p.3.

65. Hyden H. Biochemistry of the Nervous System (4-th Internat. Congress Biochem), Pergamon Press, N-Y, 1959, p. 64.

66. Hyden H., Egyhazi E. "Nuclear RNA changes of nerve cells during a learning experiment in rats." \\ Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1962, v.48, p.1366.

67. Hyden H., Egyhazi E. " Changes in RNA content and base composition in cortical neurones of rates in a learning experiment involving transfer of handedness." \\ Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1964, v.52, p. 1030-1035.

68. Hyden H., Lange P.W. " A differentiation in RNA responce in neurones early and late during learningW Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1965, v.53, p. 946-952.

69. Ladbrooke B.O., Williams R.M., Chapman D. "Studies of lecithin -cholesterol water interactions by differential scanning calorimetry and X-ray diffraction." \\ BBA, 1968, v. 150, p. 333-340.

70. Mason-JT, Cunningham-RE, Oleary-TJ "Lamellar-Phase Polymorphism in Interdigitated Bilayer Assemblies." \\ BBA-Biomembranes, 1995, v. 1236, Iss l,p. 65-72.

71. Maurer N, Prenner E, Paltauf F, Glatter O " Phase-Behavior of the Antineoplastic Ether Lipid l-0-0ctadecyl-2-0-Methyl-Glycer0-3-Phosphocholine." \\ BBA Biomembranes, 1994, vol. 1192, Iss 2, p. 167-176.

72. Cullis, B. De Kruijff "Polymorphyc phase behaviour of lipid mixtures as detected by 31P-NMR." //BBA, 1978, v.507. p. 207-218.

73. Shashua V.A. "RNA changes in goldfish brain during learning." \\ Nature, 1968, v.217, p.238-242.

74. Slater J.L., Huang C. "Scanning calorimetry reveals a new phase transition in L-a-dipalmitoilphosphatidylcholine." \\ Biophys. J., 1987, 52 (4), p. 667-670.

75. Chin-An Chang and Sunney I Chan. "Nuclear magnetic resonance studies of interactions of sonicated lecithin bilayera with poly(L-glutamic asid)". \\ Biochemistry, 1974, v. 13, N 21, p. 4381 -4385.

76. Tenchov B.G., Leonard J. L., Peter J. Quinn. "Mechanism and kinetics of subtransition in hydrated L-dipalmitoilphoaphatidylcholine." \\ BBA, 1987, v. 897, N 1, p. 143-151.

77. Tristram-Nagle S., Wiener M.C., Yang C.P., Nagle J.F. "Kinetics of subtransition of dipalmitoilphosphatidylcholine." \\ Biochemistry, 1987, v. 26, N 14, p. 4288-4294.

78. Ungar G. "Molecular coding of memory" \\ Life Sci., 1974, N. 14, p.595-604.

79. Ungar G. "Role of proteins and peptides in memory and learning." \\ b c6. "Molecular mechanism of memory and learning.", N.Y.-London, 1970, p. 149-175.

80. Ungar G., Desiderio P.M., Parr W. "Isolation, identification and synthesis of a specific-behaviour-inducting brain peptide." \\ Nature, 1972,v.238, p. 198-202.

81. Wiegant V.M., Dunn A.J., Schotmann P., Gispen W.H. Brian Res. "ACTH-like neurotropic peptides. Possible regulators of rat brain with AMP." \\ 1979, v.168, p.565.

82. Wieslander A., Ulmius J., Lindblom G., Fontell K. "Water binding and phase structures for different Acholiplasma Laidianii membrane lipids studied by deuteron NMR and X-ray diffraction." \\ BBA, 1978, v. 512, p. 241-253.

83. Zwiers H., Townaer J., Wiegant V.M., Schotman P., Gispen W.H. J. "ACTH-sensitive proteinkinase from rat brain membranes." \\ Neurochemistry, 1979, v.33, p.247.

84. Zwiers H., Veldnius D., Schotmann P., Gispen W.H. "ACTG, cyclic nucleotides and brain protein phosphorilation in vitro" \\ Neurochem. Res., 1976, v.l, p.669.

85. Morimoto B.H., Koshland D.E. "Identification of Cyclic-AMP as the Response Regulator for Neurosecretory Potentiation A Memory Model System." \\ Proc. Nat. Acad. Sci., 1991, Vol. 88, Iss 23, pp 835-839.

86. Montague PR. "The resource consumption principle: attention and memory in volumes of neural tissue." \\ Brain Cogn ., 1996, Feb; 30(1), p. 127-152.

Информация о работе

Погорецкая, Ирина Львовна
кандидата химических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.02

Диссертация

Термоиндуцированные фазовые переходы и полиморфизм липидов фосфатидилхолиновых липосом в присутствии ноотропных агентов нейропептида АКТГ и антиоксиданта фенозана - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы