Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аннексины кролика: идентификация, характеристика и оценка их взаимодействия с фосфолипидами ионами двухвалентных металлов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Аннексины кролика: идентификация, характеристика и оценка их взаимодействия с фосфолипидами ионами двухвалентных металлов"

т 1 "1 3

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ям. И.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧ ЕСКНЙ ФАКУЛЬТЕТ

II» нравах рукописи УДК .575.577

Набокина Светлана Михайловна

АННЕКСИНЫ КРОЛИКА; ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ОЦЕНКА ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ФОСФОЛИПИДАМИ И ИОНАМИ ДВУХВАЛЕНТНЫХ МЕТАЛЛОВ

03.00.03 - молекулярная биология

Аггореферат диссертации на соискание ученой степени кии плата биологических наук

Москва-1992

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета МГУ им. Ы.В. Ломоносова

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

вед. н. сотр. В. И. Ыельгунов

Официальные оппонент - доктор биологических наук

Ы.А. Белозерский

Ведущая организация - Институт акспэрименталъной кардиологии

Кардиологического научного иэнтра Российской АМН

Защита диссертации состоится 8 декабря 1992 г. в 10.00 часов на заседании Специализированного совета Д.053.05.70 при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: П98Э9 Москва, Ленинские горы, МРУ, Биологический факультет С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан ________________1992г.

доктор биологических наук, проф. Н.Б. Гусов

/

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

/

В. Н. Каграыанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеш. Сравнительно недавно в самых разных клетках и тканях были идентифицированы представители нового зшапса Са2+ связывающих' белков, впоследствии получивших' название "аннексиш". Отличительной чертой белков етого класса является их способность в присутствии микромолярных концентраций Са2+ связываться с фосфолипидными бисдояки, а при более высоких концентрациях иона индуцировать агрегацию природных и модельных мембран оаее. 1983; Мэльгунов, 1990).

Обычно концентрация ионов Са2+ в клетке находится на субмикромолярном или микромолярноа уровне. В то та время концентрация ионов других металлов в клетке монет намного превышать концентрацию ионов Са2+. В связи с этил .участки' связывания Са2+ должны соответствовать двум требованиям: они долгаш обеспечивать избирательность связывания иона-субстрата и одновременно исключать конкурирующие ионы, присутствующие в гораздо более высокой концентрации. Поэтому, исследования по возможности замены ионов Са2* на ионы других двухвалентных металлов представляются весьма актуальными при решении вопроса о необходимости именно конов Са24" для взаимодействия аннексинов с мембранами.

Ашекспны связываются исключительно с кислыми фосфолипидами, преимущественно находящимися во внутреннем монослое лшпшюго бйслоя. Такая ассиметрия в связывании аннексинов с биологическими 'мембранами мокет иметь принципиальное значение для выполнения этими белками физиологических функций. Выяснение закономерностей связывания белков о фосфолипидами представляется полезным для установления возможной физиологической роли аннексинов. Кроме того, определенный вклад в . решение указанной проблемы моявт внести: I) изучение распространения аннексинов в ранее не исследованных объектах, например, в различ -ных тканях кролика, и 2) установление корреляции мекду экспрессией индивидуальных аннексинов и их'функцией в той или иной ткани.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось:

1) изучение распространения аннексшюв в различных тканях кролика,

2) идентификация выявленных белков, 3) исследование их взаимодействия с фосфолипидами и ионами двухвалентных металлов. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) выделить вннексины из соответствующих органов и тканей кролика;

2) идентифицировать выделенные белки: выявить представителен семейства аннекшшов и установить их групповую принадлежность;

3) доследовать влияние состава липосом на способность аннексинов связываться с ними в присутствии ионов Са2+; 4) изучить влияние, ионов различных, двухвалентных металлов на связывание аннексинов с липосомами, приготовленными из азолектина и-Б сои, и на индуцируемую ашексинама агрегацию лгаюсом.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые проведено систематическое сравнительное изучение аннексинов, присутствующих в различных тканях кролика. Предложен метод, возводящий быстро идентифицировать аннэксины на двумерных электрофореграммах. Впервые исследовано взаимодействие с фосфолипидшшя везикулаш не индивидуальша аннекшшов, а суммарной фракции белков, выделяемой из печени кролика. Кроме того, изучено влияние на ето взаимодействие различных ионов двухвалентных металлов. При этом установлено, что аннексикы, относящиеся к разы™ грушам семейства, конкурируют друг с другом за участки связывания на тпосожлХ, в его, - в свою очередь, влияет на степень агрегации липосом.

Практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях, при изучении строения и • специфичности металл / фэсфолшид - связывающих центров аннексинов, а также в прикладных исследованиях, посвященных установлению роли аннексинов в явлениях свертывания крови, противовоспалительных процессах, передаче сигнала и т.п.

Апробация работа. Результаты работы были представлены на И-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991) и на 1-ом съезда физиологов Средней Азии и Казахстана (Душанбе, 1991). Работа прошла апробацию на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликована I статья и тезисы двух сообщений.

Структура в объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литература, включающего наименований. Работа

изложена на страницах машинописного текста, содержит 17 ри -

сунков и 7 таблиц.

материалы и методу исследования.

Объектами исследования слупили кролики и крысы линии Вистар. Политональные антитела против липокортинов I-III, у и VI были любезно предоставлены д-ром Б. Пепински (Биоген Инк., Кембридж), антисыворотки, узнающие аннексины человека I и III-VI, антитело анти-17-мэр., аннексины I и V человека - д-ром Д. Эрнстом (Калифорнийский' университет, Сан-ОСранциско), антисыворотки СР2 и СР4 - д-ром Ф. Гэрке (Институт Биофизической химии Макса Планка, Геттинген), 67-кДа кальцимедин из мускульного желудка утки - д-ром Н.Б.Гусевым (МГУ, кафедра биохимии). В работе использовали меченные пэроксидазой Ig о против Ig с кролика (Институт им. Н.Ф. Гамалеи), Ig а крысы (Агро-Био, Москва), Ig о мшга (Signa, США>.

Аннексины выделяли из бесклеточного гомогената и из мембран ПО комбинированному методу (Clenney et al., 19В7; Boustead et al., .1988). Поликлональные антитела против индивидуальных аннекспнов кролика получали из крысиной антисыворотки иммуноадсорбцией антител на индивидуальные аннексины ' по методу (Smith, Fischer, 1984). Липосомы готовили при помощи ультразвуковой обработки суспензии ' фосфолипида. Хромаффшрше.. гранулы получали по модифицированному методу (Terland, t Flatmark, 1980). Для оценки связывания ашексинов с липосомами различного состава в присутствии ионов Са2+ использовали метод (Boustead et al., 1989) с модиЯмкациями. Влияние ионов двухвалентных металлов на связывание вннексинов с липосомами и на агрегации липосом оценивали в соответствии с методом (Blackwood, Ernst, 1990). Одномерный и двумерный электрофорез выполняли, соответственно, по методам (Laemmli, 1970) и (o'parrel. • 1975) с модификациями. Иммуноблотипг проводили но методу' (Towbin at al., 1979) с модификациями. Гели окрашивали Кумасси R-250 и аммиачным серебром по методу (Игау et al., 1981). Титр антисавороток определяли фермент-зависимым иммуноадсорбционным методом- (ELISA). Концентрацию белка в пробе определяли по модифицированному методу (Bradford, 1976). Концентрацию ионов двухвалентных" металлов измеряли с помощью селективного электрода, чувствительного к ионам двухвалентных металлов ("Orion Eesearoh", США), а для определения

исходной концентрации свободных ионов двухвалентны! металлов ъ растворе использовали программу, написанную на MBASIC для компьютера Zema-Twin (Австрия), работающего в операционной системе! Apple II СР/Ы 56К, версия 2.20Ы, Программа рассчитывает концентрацию egoйодного иона и концентрацию лиганда в смесях, приготовлении из растворов с известной концентрацией иона металла и буферного лиганда. В основу программы полонен алгоритм, предложенный (Pabiato, íabiato, 1979-), учитывающий соответствующие абсолютные константы ассоциации для н+, Mg2"1', Sr2+ (Schwarzenbash et al., 1957). Сд2+ (Pabiato, Fabiato. 1979), l£n2+ (Bulos, Saolctor, 1979), Ba2+, Ni2+, Co2+ (Sillen, ' Uartell, 1964). Программа рассчитывает кажущиеся константы ассоциации в конкретном раствора с учетом влияния истинной величины рН, ионной силы и температуры раствора и - решает систему нелинейных уравнений с использованием итерационного процесса по модифицированному методу Ньютона (Дьяконов, 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение препаратов ашексинов. В основе примененного нами метода выделения левит экстракция, белков ЭДТА, осавденш Са2+, перерастворение- в ЭРТА и последуюцая Св21" - зависимая сорбция -десорбция их на фосфолштадные везикулы. Такая процедура выделения позволяет подучить высокоочщенную фракцию суммарных аннекешгсш (Qlenney et al-., 1987; Bouatead at al., 1988). Известно, что при электрофореза 'в денатурирующих условиях аннексины VI имеют Mj, порядка 67-73 кДа, аннексины VII-47-5I кДа, а все.остальные белки очень близки друг к другу и мигрируют в зоне 32-38 кДа. Как видно из рис. I, пооле электрофореза в денатурирующих условиях в бесклеточных гомогенатах' всех изученных нами органов кролика выявляются две главнее 'группы белков: одна с Щ. порядка 67-63 кДа и вторая - с Ыг 32-36 кДй. .Сходные наборы белков с ur, характерными для- аннексинов,' были - обнаружены и в мембранах соответствующих органов кролика.

. Таким образом, полученные нами белки по способу выделения и результатам одномерного электрофореза, по-видимому, являются аннексииами. Однако для более точного отнесения их к этому семейству белков, а также для установления групповой принадлекности того или иного индивидуального аннексина мы провели

■«Ж! 2 3 4 5 б kD.

..'l'-Л ■■ I__ __ _____ ftT

Рис. I. Аннексиям, при -сутствукщие в суммарных гомогенатах различных органов кролика. I-печень; 2 - сердце; 3 - головной мозг; 4-легкие; 5-почки; 6 - скелетные мышцы. Разделение белков по ме -ТОДУ ЛВММЛИ (ЬаеттИ,

30

1970) проводили в 12Ж-ном ПААГ. Окраска Нумасси ярко голубым R-250. Сбоку - Му белков-маркеров в

кДа..

идентификацию белков на основании данных: Г) по двумерному влект -рофорезу и 2) по взаимодействию их со специфическими антителами.

Идентификация опнексшгов на дауиершх электрофорограииах.

Известно, что величины М^ и pi для белков даже одной и той ке группы варьируют в достаточно широких пределах (Geisow, Walker, 1986; Мельгунов, 1990). fiu солировали данные по и pi для более, чем 70 различных аннексинов и разработали графический способ выражения представленных результатов, который позволяет нивелировать указанные выше вариации- Эмпирическим путем было установлено, что нагляднее всего такие данные выглядят, если по оси ординат отложить величину pi, деленную на величину ^ (выраженную 6 нДа), а по оси абсцисс - величину произведения pi х Hp. Преобразованные таким образом характеристики аннексинов, Мр которых находится в пределах 32-38 кДа, представлены на рис. 2, а данные для аннексинов с большей Мг - на рис. 3.

Предложенная система коор^шат позволяет достаточно хорошо вычленить границы отдельных груш аннексинов и использовать ее для быстрой предварительной идентификации белков, которые по способу выделения и ряду характеристик, скорее всего, являются аннексинами, но до сих пор не идентифицированы. Например, среди Са2+-связыва1щих белков, способных в присутствии Са2+ взаимодействовать с инвертированными везикулами плазматической мембраны эритроцитов (Kristermen, Kristensen, 1989), можно идентифицировать аннексии I (белок 78ab на рис. 2) и аннексии IV (79аЪ). Са -зависимые мембраносвязыващие белки, выделенные из коры головного мозга (Hhoads et al., 1985) и обозначенные на рис.

"А

(Ш|

ада

.»45

ГРф

,!„ I, I ■,.!„,

Рис. 2. Сводный график данных до двумерному электрофорезу еннексинов с ^ эг-эа кДа. Группы аннексинов обозначены римскими цифрами. Номера то -чек- на графике соответствуют белкам а) на основании раз -лачних методов идентификации, отнесенных ' к аннексинам I груши (1-6), Ц-(7-14), III-(15-18), ГМ19-29), V - (30-4-7) и VIII (65а - 65с); к производным аннексшюв (70, 71); к-новым аннексдаам (72, 73). 74-81 *■ неидантифициро -ванные белки, выделяемые ' ?еы же методом, что и.аншкгашы.

гр».,г- «я/■

т

2 как 7баь и 76аь, можно отнести к' группе аннексинов V, а хроыобиндин-2Д (белок 74 на рнс.З) из надпочечников (Сгеи^а вЬ а!., 1907? - к группа айщксивов VI,

Графики, представленные на рис. 2 и 3, демонстрируют гетерогенность ряда аннексинов,•в частности, групп ГУ, V и VI. Так, среди аннексинов V очень часто обнаруживаются суперкислые белки и отмечается наибольшая разница в значениях Ыг, а группа аннексинов 17, занимает, весьма широкий диапазон р1. Нагляднее всего гетерогенность аннексинов проявляется у аннексинов п. Как известно (СгошрЪоп et а1., 1988), в ряде случаев при одномерном электрофорезе удается выявить либо одну, либо две . близко расположенные белковые зоны в области 67 кДа. Скорее всего, в

U1

OJJ

п

вв.вГ.,68.»-'^

|I<M,

—1_' ' ' ■—1_I_1_l—L_í—I—I—I—I—|—I—1—¡—I—i—I—I_1—I—l—I_I—1—1—I—1_L—I—1—1_

553 ш ioS «il smI «oí «от не,

Рис. 3. Сводный график данных по двумерному электрофорезу аннексинов с Mr 47-85. Группы аннексинов обозначены римскими цифрами. 74, 77аъ, 81-неидентифицированные белки, выделяемые тем же методом, что и аннексины.

составе белков с Мр порядка 67 кДа выделяется несколько полипэптидов, что подтверждается различной реакцией с гомологичными и гетерологачными ангисыворотрами. Кроме того, имеются данные (Hayashi et al., 1989), что в составе аннексинов VI плаценты выявляется димер аннекснна I (белок 69 на рис. 3), имепций ковалэнтную сшивку в N-концевой области. Из рис.'З следует также, что и белок 67R (59)-' из легких свиньи, который был идентифицирован по реакции с антителом против аннексина IV как 67 кДа - кальэлектрин (Fauvel et al., 1987), скорее всего, можно рассматривать как димэр аннексина i.

Мы воспользовались графиками, изображенными на рис. 2 и 3, и в разных тканях кролика идентифицировали различные наборы аннексинов I-VI типов, -для которых величины pl и^ составили, соответственно, 6,8; 7,2; 6,0-6,2; 5,9; 4,6; 5,2-5,4 и 33; 33; 33,5; 33; 33; 67 кДа (рис. 4). Эти результаты получили дальнейшее подтверждение в экспериментах по иммунохшической идентификации индивидуальных аннексинов (см. нижа).

Кроме . того, в легких был обнаружен белок (отмечен вопросительным знаком на рис. 4), похожий на аннексии V, но с большей Мг (35; 4,6). Этот белок во многом напоминает белок САР-ГУ, обнаруженный в легких крупного рогатого скота (Khanna et

4А

sa

6.0.

_El

bPf,.!:

fef^fcV ' «i'

Щ

.1»,

/л-,?

кД> 67

3.

3ii

кДа

3jj 3"

Tl

S, у»*'»,. ;f r

tew

Г"""

ivi

s

4ß, t!A Fl

шшх- •. Л •■:■■■■" в.! 1

ЙЖ i'"-' . 1

I

Ife'-i'f,'"'

mrfc'.."-«fe-., v ■ i

---- г

» «В! i 1 1 (

31

32

IV «

4,S'

SA'

T

б/f ep

pi

Рис. 4. ''вумерный влектрофорез аннексинов, выделенных из гомоге-натов некоторых органов кролика: а-легкие; б-окелатныа мышцы; в-почки; г-дачень. Окраска кумасси R-250. . Римскими цифрами обозначены аннексины, идентифицированные по рис. 2 и 3.

»I., 1990). В легких, почках И печени был найден 67 кДа (на рис. 4 белок отмечен вопросительным знаком) о pi порядка 4,6-4,8, который, скорее всего, не является аннексином и похож на белок 67Е, Обнаруженный В легких свиньи (Fauvel et al., 1987; Vioendo et al., 1991).

йиыунохштеская идентификация аннексинов. Известно, что достаточно строгим критерием принадлежности того или иного белка к семейству аннексинов является его способность к взаимодействии о антиконсенсусными антителами, т.е. антителами, направленными против . высококонсервативных участков в молекулах различных аннексинов. (Qerka, 1989; . Ernst et al., 1989; Kaetzel, Dedman, 1989). Мы воспользовались антителом подобного типа анти-17-мер, полученным против синтетического 17-членного пептида, соответствувдего области наибольшей гомологии в последовательностях аннексинов 1-V1 груш (Emst et. al., 1989). Как видно из рис. б, анти-17-мер в печени кролика узнает 2 группы белков о молекулярными массами порядка 67-68 кДа и примерно 32-36

кДа, соответственно. Белки со сходными молекулярными массами выявляются также й. в. белковых препаратах, выделяемых из печени крысы. Поскольку.айнексини печени крысы достаточно хорошо изучены (Mathew et al., 198&), oira_ Шли взяты нами в качестве положительного контроля при-'Вестерн - Слоттинге. Взаимодействие антшсонсенсусной сыворотки анти-17-мер о полученными белковыми препаратами однозначно. .свидетельствует о том, что ' исследуемые белки относятся к семейству аннексшов.

Рис.-5. Взаимодействие аннексинов с антшсонсэнсусшм антителом'. вн-ти-17-ш'р. Разведемте антисыворотки -

- IíI'OO. I - аннексины печени- крысы (30 мкг); 2 -

- аннексия г человека' (I мкг); 3 -аннексины печени кролика-(36'мкг). .

При определении групповой принадлежности различных аннексинов печени кролика мы пршешли собственные антитела кролика, полученные против очищенных или рекомбинантннх аннексинов i-vi человека. Было абсолютно неясно,; будут Ли вообще указанные антитела реагировать с. аннексшами кролика, а, если будут, то с какой специфичностью..' . '.. '• •

При исследовании взаимодействия антисывороток с аннексинами 1сролика оказалось, что 'все' антисывороиш дают положительную

этом наблюдается различная степень

Рис. 6. Узнавание аннексинов печени кролика антителами кролика, полученными против аннексинов человека. 1-6 - сум -марше аннексины печени кролика. 1-6 мкг белка; 2-4 - 12 мкг; 5-36 мкг; в-2,4мкг. Разведения антисывороток против аннексина I - 1:3000; 11-у -1:1000; 71-1:2000.

Как видно«из рис. 6, антитела против аннексинов Ii, TV-VI человека довольно специфичны и лишь слабо взаимодействуют с другими белками. Антисыворотки против аннексинов I и III, однако, реагируют со многими аннексинами.

Наблюдаемая иммунореактивность предполагает, что существует

IZ 3

реакцию, однако, при специфичности.

1 2 3 4 ' б в

I •

Ai,

*v

•V! Üb

¿4

два типа антител: к одному типу относятся антитела против аннексинов и, IV-VI кролика, которые моноспецифичны и могут быть использованы для выявления аннексинов соответствующих групп в различных тканях кролика. Антитела второго типа, т.е. антитела против аннексинов I и III, реагируют со многими аннексинами и в этом отношении напоминают антитела против консенсусных пептидов.

Взаимодействие аннексинов о фосфолипвдаии и иопяш двухвалентных иеталлов. Для всех аннексинов характерно Са -зависимое связывание с кислыми фосфолипидами, находящимися во внутреннем монослое лшшдного бислоя, и отсутствие такового в случае липосом, приготовленных из одного лишь фосфатидилхолина. Мы исследовали способность белкового препарата аннексинов печени кролика свйзываться с липосомами, приготовленными из фосфатидилхолина (1СШ), смеси фосфатидилсэрина и фосфагидилхолина (1:1), фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина (1:1).

Оказалось, что большинство анализируемых белков связываются с двумя последними типами фосфолипидных везикул в присутствии ионов Са , и ни один из них не способен связываться при наличии в среде хелатора ионов Са2+ типа ЭГТА. Эти данные можно рассматривать как еще один довод в пользу того, что исследуемые белки относятся к семейству аннексинов.

Для эффективного взаимодействия аннексинов с мембранами

необходимы ионы Са2+. В то ке время есть данные о возможности.

24-

замепы ионов Са на ионы других двухвалентных металлов (Sohlaepfer, Haigler, 1937} Oenge et al., 1989). В связи с этим мы исследовали влияние ионов ы^2*", ва2+, Ып2+. Вг2+, ш2+ и Со2"1"' на способность аннексинов связываться с липосомами и индуцировать агрегацию липосом. В эксперименте использовали фракцию суммарных аннексинов, выделенных из печени кролика, и лшосомы, приготовленные из азолектина II S сои.

Зависимость степени агрегации липосом от концентрации свободных ионов представлены на -рис. 7а. Здесь же (рис. 76) отражено и суммарное связывание аннексинов с липосомами в тех же условиях. Как видно из рис. 7, ионы lig24, в отличие от ионов всех остальных исследованных металлов, практически не способствуют ни связыванию аннексинов с липосомами, ни агрегации липосом, что хорошо согласуется с данными, полученными другими авторами для

Рис, 7. Зависимость степени агрегации липосом (а) и общего связывания аннексинов с литосомами (0) от концентрации различных ионов двухвалентных металлов. I - Н12+; 2 - Нп2+; 3 - Со2+; 4 - Са2+; 5 - Ва2+; 6 - Эг24"; 7 - йё2*.

индивидуальных белков (Апагее а1., 1990). Причина этого,

по-видимому, заключается в совокупности физико-химических свойств,

присущих ионам %г+: высокая плотность заряда, склонность к

сольватации и образовании "ковалзнтшх" связей с лигандами,

постоянное координационное число, равное 6, правильная геометрия

внутренней сферы. Напротив, до1я,Са2+ характерна очень изменяющаяся

геомбгрия внутренней сферы, когда варьируют и координационное

число, и величина угла мевду связями, и сама длина таких связей.

По-видимому, параметры, характеризующие ион Са2+, имеют

принципиальное значение и для остальных ионов двухвалентных

металлов в том случае, если их связывание с нолегулой аннексина 2+

происходит по, Са -связывающим центрам. С другой стороны, на исключена возможность связывания' ионов по совершенно разным центрам, что, в частности, было продемонстрировано для ионов гп2+

(Апйгее еЪ а1., 1990).

Как видно из рис. 7, наблюдаются значительные вариации между

Рис. 8. Влияние иокое 0а2+ (в),

Г"Т

»«г

концентрации Ва2+ (б) и

Вг2+ (в) на связнваше аннек -синов с липосомами: 1-р68 белки; 11-р35 белки; Iix-p32 белки. 1-Б - аннексины I-VI; 1п, 2п - продукты протеолиза ан -нексинов I и IX; 6а, 66 - две фракции аннексина VI в порядке их миграции при электрофорезе; ? - неизвестные белки.

ионами по диапазонам концентра -ций, при которых они способствуют взаимодействии аннексинов с липосомами, и, кроме того, в присутствии этих ионов варьирует и форма кривых агрегации липосом и связывания аннексинов. Для объяснения полученных результатов мы оценили связывание индивидуальных аннекси -нов при различных концентрациях исследуемых ионов. Чтобы умень -шить число кривых на графиках, все аннексины были разделены на 3 группы: первую - р68-белки, где присутствуют аннексии VI (в виде двух близко мигрирующих при электрофорезе полос, обозначенных как Via и VI6) и еще какие-то р68-белки; вторуч - р35-белки, в составе которой выявляются аннексины I-III, и третью - р32-белки, где выявляются аннексины IV и V, продукты протеолиза аннексинов I и II в какие-то новые белки, возмож но сходные с 33 кДа - белком, описанным Эрнстом и др. (Emst et al.,1908). Эти данные представлены на рис. 8 и 9. Как видно из рис. 8 и.9, существует определенная конкуренция между белками за участки связывания на липосомах. Так, при добавлении суммарного препарата аннексинов по мере увеличения концентрации ионов Са2+ (рис. 8а) с липосомами связываются: неизвестный р68-белок, затем протеолизованный и нативный аннексии II , далее

в а

w

1 ■ 3

в

►с»

Рис. 9. Влияние концентрации ионов (а), Н12+ (б) и

Со2+ (в) на связывание вн -нексинов с липосомами. Все обозначения те re, что и на рис. 8.

протеолизованный и нативный вн -нексин Г, быстрее мигрирующий компонент аннексиив VI (VI6) и аннексии IV, затем вннексшш III и Via, аннексии V и неизвестный р35-бело1С. Такой порядок связывания практически не- меняется в присутствии ионов Ва2+ (рио. 8б). В присутствии ионов Вг (рис. 8в) порядок связывания заметно меняется: нативный аннексии II связывается одновременно с неиз -вестннм • р68-белком и продуктами лротеолиза аннексинов i и и, затем одновременно связываются аянексини vr а и I, за ними следует аннексии IV и завершают связывание.шшексшш VI0 и III. В исследованном диапазоне кон -центраций свободного иона аннек -син V не связывается с липосомами В отличие от' вариантов с ионами Са2+ или Ва2*, в присутствии sr2+ происходит изменение порядка связывания компонентов via и VI6, ко торце в данном случае как бы ме -няются местами-. Аналогичные изменения ъ связывании..via и VI6 наблюдаются и.в присутствии ионов Нп2+' и Ni2* (рис. 9а и 96). .Совершенно особым'образом проис -ходит связывание аннексинов в при сутствии ионов Со2+ (рис. 9в). В »том случае не наблюдается ника -кой специфичности и все аннексины начинают связываться практически одновременно. Все это позволяет прийти к выводу о том, что поря -

док связывания аниэксинов, по-видимому, меняется в зависимости от того, какой ион присутствует в среде, 8 это, в свою очередь, влияет на степень агрегации лнпосом. Гак, в присутствии Са2+ агрегации сопутствует (или предшествует) связывание аннексинов II и I, включая и продукты их протеолиза, но в связи с малым исходным содержанием этих белков степень агрегации невелика. Максимум агрегации совпадает со связыванием аннексина ГУ, который в печени встречается в значительном количестве. Судя по форме кривой, агрегация слегка снижается при связывании аннексинов III и via и снова возрастает при завероапцей процесс связывания сорбции аннексина V.

Связывание аннексинов в присутствии ионов Ва2+ сопутствует агрегации везикул, если сравнить кривые (Б) на рис. 7а и 76, однако вто не находит своего отражения в связывании индивидуальных белков (рис. 86), поскольку аннексины II, I и VI6 начинают связываться о липосомами только после заметной их агрегации. Поэтому не исключено, что начальные втвпы агрегации липосом обусловлены присутствием неизвестных белков, способных связывать Ва2+ (cLe laFuente et al., 1990). Агрегация в присутствии Sr2+ начинается сразу же после • связывания, аннексинов II и I (включая продукты протеолиза). Аннексины via слегка увеличивают, а аннексины rv. III и VI6 - слегка уменьшают агрегацию липосом. В случае Мп2+ агрегация начинается, когда связываются аннексины'II, IV и via, достигает максимума при сорбции анна..лша I и слегка снижается при связывании аннексинов VI6 и V, эффект которых минимален,.так как наблюдается на фоне продолжающегося связывания аннексина I. Агрегация в присутствии Ni2+ совпадает.с сорбцией основных компонентов Фракции аннексинов (Via, IV, V и VI6), а в случае Со2+ трудно сказать что либо определенное о связи агрегации липосом с порядком связывания аннексинов, т.к. практически все белки связываются одновременно.

Таким образом, совокупность данных по взаимодействию аннексинов с фосфолипидными везикулами свидетельствует о том, что, по-видимому, "центры связывания" у аннексинов не столь уж инвариантны, и в строгом смысле слова аннексины нельзя называть Са2+-связывающими белками. Вполне возможно, что эти белки составляют лишь один из компонентов системы, взаимодействующей с ионами различных двухвалентных металлов, когда белок определяет

лишь частичную координации каждого из ионов, а окончатольно связывающий центр формируется в результате взаимодействия с фосфолипидами мембраны. При этом фосфолипида либо непосредственно участвуют в формировании Ме2+-связывающих центров в тройном комплексе "фосфолипид - аннексии - Ме2+", либо они взаимодействуют с другим центром в молекуле белка и индуцируют конформационные изменения, приводящие к существенной модификации топологии Ме2+ -связывающих центров и к повышению их сродства к Са2+ и ионам других двухвалентных металлов.

.. ВЫВОДЫ.

1) При помощи одномерного и двумерного электрофореза в геле изучен состав аннексинов в бесклэточных гомогенатах и мембранах скелетных и сердечной мышц, печени, почэк, легких и головного мозга кролика. Определены р1 и мр индивидуальных белков. Систематизированы данные по двумерному электрофорезу у других животных. " Предложен графический способ, позволяющий быстро идентифицировать аннексины на двумерных электрофореграммах. Продемонстрированы возможности применения данного' приема для распознавания групповой принадлежности ранее неидентифицированных белков и для предсказания направления поисков новых представителей семейства аннексинов.

2) Исследованы иммунохнмические характеристики, индивидуальных аннексинов. Установлено, что аннексины кролика реагируют о антителами, полученными у кролика против аннексинов человека. Существует два типа антител: к первому типу относятся антитела против аннексинов II и IV-VI„ которые достаточно специфичны и практически нэ взаимодействуют с другими белками; ко второму типу относятся антитела против аннексинов I й III, которые реагируют со многими аннексинами и в этом отношешщ напоминают антитела против консенсусных пептидов.

3) Исследовано взаимодействие' естественной смеси аннексинов с фосфэлипидными везикулами. Установлено, что индивидуальные аннексины* конкурируют друг с другом за участки связывания на липосомах, а это, в свою, очередь; влияет на степень агрегации липосом. При этом последовательность связывания разных аннексинов определяется тем, какой двухвалентный ион присутствует в среде.

4) Аннексины составляют лишь один из компонентов сложной системы,

р.

взаимодействующей с ионами Се и других металлов. При этом белки обеспечивают лишь частичную координацию иона металла, а окончательно полноценный металл-связывавдий центр в такой системе формируется в результате взаимодействия с фэофолкпидаш мембраны.

список работ, штажовдшш по ms диссертации.

I) Акимова Е.И., Адаимолаэв Т.А., Набокэша С.Н., Мельгупов В.И. Экспрессия и состав вннекспнов в различных органах кролика. // Матер. I съезда физиологов Средней Двш и Казахстана. Душанбе: Дошли, 1991. Ч. I. С. 29.

?.) Аджимолаэв Т.А., Акимова Е.И., Кабогаша С.М., Ыельгунов В.И. Взаи.гадействио аннексинов кролика о дипосомаш: Со2+-зависикое свя зывание с фосфэлЕшядами, агрегация везикул, слияние мембран.// Тез. докл. Второго Всесовзн. Симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". Ы:, 1991. С. Б. 3) Мельгуков в.и., Нябокина C.U. Аннексины кролика: сравнение набора белков п бесклеточных гошгенатах и мембранах различных тканей и способ быстрой предварительной идентификации индивидуальных компонентов после двумерного электрофореза.// Биохимия, 1992. Т. 67. К II. С..1720-1732.