Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экзоцитоза в нейтрофилах человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Набокина, Светлана Михайловна, Москва

У * ъ ъ

f7■ Ж-З/АЫ-ж,

На правах рукописи УДК 576.382:612.112.91

НАБОКИНА Светлана Михайловна

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКЗОЦИТОЗА В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 03.0025 - клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

. ^гс^/ю степень

ДОКТОРА

, /5чо7С?.______наук |

5 ВАК России |

Москва - 1999

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

NSF - фактор,чувствительный к N-этилмалеимиду SNAP - белок цитозоля, связывающийся с NSF SNARE - рецептор для SNAP

SNAP-25 - белок с молекулярной массой 25 кДа, ассоциированный с синаптосомами

SNAP-23 - белок с молекулярной массой 23 кДа, ассоциированный с синаптосомами

VAMP - мембранный белок, ассоциированный с везикулами

FMLP - F-Met-Leu-Phe

PMA - 4Р-форбол 12-миристат 13-ацетат

ДМСО - диметилсульфоксид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

R - рецептор

TNF - фактор некроза опухолей

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

BoNT/A - ботулинический токсин серотипа А

GST - глутатион-Б-трансфераза

ЭГТА - этилен-гликоль-бис-(р-аминоэтиловый эфир)-МЬГ-тетрауксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ДТТ - дитиотреитол ДДС-Na - додецилсульфат натрия ПААГ - полиакриламидный гель ТЕМЕД - ^^№,№-тетраметилэтилендиамин БСА - бычий сывороточный альбумин

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр

Введение 6

I. Обзор литературы. 12

1. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека 12

1.1. Классификация и общая характеристика гранул 12

1.2. Мобилизация гранул. 16

2. Модель слипания/слияния мембран (SNARE гипотеза), 18

2.1. Характеристика основных белковых компонентов модели, 19

2.1.1. VAMP/синаптобревин 19

2.1.2. Синтаксин 22

2.1.3. SNAP-25 25

2.1.4. Синаптотагмин 2 8

2.1.5. NSF. 30

2.1.6. SNAP 30

2.2. Механизм слипания/слияния мембран 31

3. Особенности Са2+-триггерной стадии экзоцитоза. Воз -

можная роль аннексинов 40

II. Материалы и методы исследований. 47

1. Объекты исследования 47

2. Материалы, 47

3. Методы 49

3.1 Выделение нейтрофилов человека 49

3.2 Субклеточное фракционирование нейтрофилов человека 50

3.3 Культура клеток 51

3.4 Электрофорез белков 51

3.5 Иммуноблоттинг (Вестерн-блот анализ) 53 3.5.1 Перенос фракций из геля на фильтр 53

3.5.2 Иммунное выявление антигенов на фильтре 54

3.6 Протеолиз SNAP-25 ботулиническим токсином BoNT/A 55

3.7 Активация нейтрофилов 55

3.8 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 56

3.9 Иммуноэлектронная микроскопия 56

3.10 Экстракция РНК 57

3.11 Синтез к ДНК 58

3.12 Полимеразная цепная реакция 5 9

3.13 Гель-электрофорез ДНК 64

3.14 Клонирование ДНК 65

3.14.1 Лигирование 65

3.14.2 Трансформация бактерий 66

3.14.3 Анализ рекомбинантных клонов ДНК 67

3.14.3.1 Выделение плазмидной ДНК 67

3.14.3.2 Расщепление ДНК рестриктазами (рестрикция) 68

3.14.3.3 Определение нуклеотидной последовательности ДНК 68

3.15 Получение гибридных белков GST-SNAP-23А и GST-SNAP-23B 70

3.15.1 Конструирование вектора для экспрессии GST-SNAP-23А/В 70

3.15.2 Экспрессия и очистка GST-SNAP-23 А/В 71

3.16 Связывание белков in vitro 73

3.17 Получение антисыворотки 74

3.18 Изучение взаимодействия аннексина I с желатиназными гранулами нейтрофилов человека 74

III. Полученные результаты и их обсуждение 76

1. Белки семейства синтаксинов в нейтрофилах человека, 76

1.1. Экспрессия синтаксинов в нейтрофилах человека. 76

1.2. Определение первичной структуры синтаксинов 3, 4 и 6 из нейтрофилов человека. 81

1.3. Экспрессия синтаксинов в клетках линии HL-60, дифференцированных в

нейтрофилы 99

1.4. Внутриклеточная локализация синтаксина 6 в нейтрофилах человека 108 2. Белки семейства VAMP/синаптобревинов в нейтрофилах человека 119

2.1. УАМР-1 нейтрофилов человека: идентификация, первичная структура и внутриклеточная локализация 120

2.2. VAMP-2 нейтрофилов человека: идентификация и первичная структура 130 3. Белки семейства SNAP-25 в нейтрофилах человека 137

3.1. SNAP-25: идентификация и внутриклеточная локализация 138

3.2. Внутриклеточная локализация SNAP-23 в нейтрофилах человека 150

4. Взаимодействие синтаксина 6 и SNAP-23 164

5. Схема регуляции экзоцитоза с участием SNARE 169

6. Взаимодействие аннексина I с желатиназными гранулами нейтрофилов человека 175

Выводы 186

Заключение 190

Список литературы 191

ВВЕДЕНИЕ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Реализация защитных и воспалительных функций нейтрофилов человека (полиморфноядерных лейкоцитов) в значительной мере обусловлена мобилизацией внутриклеточных гранул. Экзоцитоз гранул необходим для адгезии, трансэндотелиальной миграции и выхода клеток из кровеносных сосудов в ткани, образования реактивных метаболитов кислорода, секреции литических ферментов. Нейтрофилы человека содержат четыре типа гранул, в различной степени способных претерпевать экзоцитоз в ответ на повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ (Borregaard N., Cowland J.B., 1997). Селективная дегрануляция коррелирует с очередностью участия компонентов определенных гранул в ходе миграции нейтрофила к очагу повреждения/воспаления и развитии последующих реакций и, следовательно, определяет функционирование нейтрофила.

Несмотря на очевидную важность процессов экзоцитоза в нейтрофилах человека, молекулярные механизмы взаимодействия мембраны секреторной гранулы с плазматической мембраной («состыковка», слипание и слияние) в этих клетках практически не исследованы. Молекулярные основы, определяющие селективный и независимый характер мобилизации отдельных популяций гранул нейтрофилов, также не выяснены. В частности, абсолютно не понятно, каким образом в нейтрофилах происходит узнавание друг другом строго определенных гетерологичных мембран и образование состыковочного центра между ними.

Напротив, механизмы экзоцитоза в некоторых других клеточных типах, в основном в нейрональных и дрожжевых клетках, изучены довольно детально, и накопленные экспериментальные данные обобщены в модели слипания/слияния мембран, SNARE гипотеза (Sollner T. et al., 1993; Rothman J.E., 1994; Calakos N., Scheller R.H., 1996; Martin T.F.J., 1997). Эта модель основана на взаимодействии белков мембраны секреторной везикулы и белков плазма-

тической мембраны с последующим связыванием цитозольных белков, приводящем к слиянию мембран. Основными белками являются: 1) белок секреторной везикулы, синаптобревин / VAMP (vesicle-associated membrane protein); 2) белки плазматической мембраны, синтаксин и SNAP-25 (synaptosome-associated protein of 25 kDa); 3) белки цитозоля, NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF attachment protein). Комплекс трех мембранных белков (SNARE комплекс), являющийся высокоаффинным рецептором для NSF и SNAP, играет ключевую роль в межмембранном взаимодействии, опосредуя состыковку контактирующих мембран. Модель, по-видимому, носит универсальный характер. Поэтому, весьма актуальными представляются исследования по поиску в нейтрофилах человека компонентов SNARE комплекса и их идентификации. Обнаружение всех основных типов SNARE белков позволило бы однозначно утверждать, что в нейтрофилах человека экзоцитоз осуществляется по механизму, постулированному SNARE гипотезой.

К моменту начала выполнения данного исследования в литературе имелось лишь одно сообщение относительно SNARE белков, присутствующих в нейтрофилах человека (Brumell J.H. et al., 1995). Авторы указанной работы, используя иммунохимический подход, обнаружили в нейтрофилах два SNARE - VAMP-2 и синтаксин 4 - и не смогли детектировать присутствие в этом типе клеток SNAP-25, третьего обязательного компонента SNARE комплекса.

SNARE гипотеза постулирует, что транспортная везикула узнает соответствующую акцепторную мембрану за счет строго специфического связывания мембранных белков везикулы (v-SNARE) с их белковыми партнерами, находящимися на акцепторной мембране (t-SNARE) (Sollner T. et al., 1993; Bock J.B., Scheller R.H., 1997). Специфичность взаимодействия различных внутриклеточных мембран, по-видимому, обеспечивается присутствием в клетке нескольких изоформ SNARE, функционирующих в составе разных SNARE комплексов и, следовательно^участвующих в разных секреторных событиях. В нейтрофилах человека, содержащих четыре типа секреторных гра-

нул, подверженных экзоцитозу в разной степени, изоформы SNARE могли бы принимать участие в экзоцитозе разных популяций гранул и, таким образом, являться факторами, обеспечивающими селективный характер дегрануляции. Поэтому, систематический поиск и идентификация всех изоформ SNARE, присутствующих в нейтрофилах человека, а также определение их субклеточной локализации и способности к взаимодействию с другими SNARE белками представляется крайне важным для понимания молекулярных основ селективности экзоцитоза в нейтрофилах.

Известно, что Са2+ является одним из основных индукторов экзоцитоза в нейтрофилах (Nuße О., Lindau M., 1988). Для индукции секреции отдельные

л I

популяции гранул требуют различных пороговых уровней цитозольного Ca (Borregaard N. et al., 1993). Роль Ca2+ в регуляции экзоцитоза, по-видимому, реализуется через взаимодействие с определенными Ca -связывающими белками. Все известные типы белок-белковых взаимодействий между VAMP, синтаксином и SNAP-25 не требуют присутствия ионов Ca (Martin T.F.J., 1997). Предполагается, что аннексины, Са2+-зависимые фосфолипид-связывающие белки, принимают участие в дегрануляции и,возможно, в какой-то мере регулируют его селективный характер (Borregaard N. et al., 1992; Meers P. et al., 1993; Sjolin С., Dahlgren С., 1996). Причем, аннексии I, основной аннексии цитозоля нейтрофилов, вероятно.,является компонентом муль-тибелковой системы, опосредующей межмембранные контакты при экзоцитозе специфических гранул (Meers P. et al., 1993). Роль этого белка в экзоцитозе желатиназных гранул, одной из наиболее легко мобилизуемых популяций гранул, не исследована.

Цель и задачи исследования

Основной целью данной работы явилось исследование молекулярных основ гетерологичных межмембранных взаимодействий в ходе экзоцитоза внутриклеточных гранул нейтрофилов человека и определение факторов, регулирующих селективный характер экзоцитоза.

Для достижения этой цели были определены следующие экспериментальные задачи:

- систематический поиск, идентификация и характеристика различных SNARE в нейтрофилах человека;

- установление внутриклеточной локализации выявленных SNARE;

- исследование способности к белок-белковым взаимодействиям между отдельными SNARE in vitro;

- изучение взаимодействия аннексина I с желатиназными гранулами нейтрофилов человека.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Нейтрофилы человека содержат все белковые компоненты, требуемые для формирования SNARE комплекса, что свидетельствует о реализации экзоцитоза внутриклеточных гранул через молекулярный механизм, постулированный SNARE гипотезой. Образование SNARE комплекса между гранульной мембраной и плазмалеммой определяет состыковку мембран и их слипание/слияние.

2. В нейтрофилах человека присутствуют множественные изоформы трех основных типов SNARE белков. Различные комбинации этих изоформ в составе SNARE комплекса вносят вклад в селективный характер экзоцитоза гранул.

3. Аннексии I является потенциальным белковым медиатором экзоцитоза желатиназных гранул нейтрофилов человека. Продукт ограниченного протеолиза аннексина I, вероятно, участвует в контроле селективного экзоцитоза, связываясь только с легко мобилизуемыми гранулами нейтрофилов.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые проведено систематическое изучение различных изоформ SNARE белков, экспрессируемых в нейтрофилах человека. Впервые продемонстрировано, что нейтрофилы человека содержат все бел-

ковые компоненты SNARE комплекса. При этом, идентифицирован ряд белков, которые ранее были описаны в литературе как отсутствующие в нейтро-филах человека, в частности, SNAP-25, синтаксин 1 и VAMP-1. Впервые установлена внутриклеточная локализация в нейтрофилах человека SNAP-25, SNAP-23A/B, VAMP-1 и синтаксина 6. Для синтаксина 6 и SNAP-25 определена внутриклеточная локализация и в клетках, подвергнутых стимуляции. Впервые исследован образец экспрессии индивидуальных синтаксинов в нейтрофилах человека и в клетках линии HL-60, дифференцированных в нейтро-филы. Идентифицирована новая нейтрофил-специфичная изоформа синтаксина 3 (синтаксин ЗВ), ранее не описанная в литературе. Впервые определены полные нуклеотидные последовательности, кодирующие синтаксин ЗА, синтаксин 4, синтаксин 6, VAMP-1 и VAMP-2 из нейтрофилов человека, на основе которых выведены первичные структуры этих белков. Причем, в случае синтаксина 6 впервые установлена первичная структура белка человеческого происхождения. Обнаружен новый тип взаимодействия между SNARE белками: синтаксин 6 связывается in vitro со SNAP-23A и SNAP-23B. Предложены модели объединения различных изоформ SNARE белков в нейтрофилах человека. Предложена схема, объясняющая возможный механизм контроля селективного экзоцитоза в нейтрофилах человека через образование SNARE комплексов. Впервые изучено взаимодействие аннексина I с желатиназными гранулами нейтрофилов.

Научно-практическая ценность работы

Результаты работы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях при изучении общих механизмов слипания/слияния мембран. В частности, они вносят вклад в решение вопроса о молекулярных основах межмембранного узнавания и расширяют представление о строении состыковочного центра взаимодействующих мембранных поверхностей. Результаты работы могут быть использованы при исследовании молекулярных механизмов селективного экзоцитоза в клетках, содержащих две и более популяции секреторных везикул.

Данные по нуклеотидным последовательностям SNARE, помещенные в EMBL/GenBank, применяются для изучения особенностей структуры SNARE.

Результаты работы могут быть использованы в прикладных исследованиях, посвященных установлению роли SNARE и аннексинов в индукции и развитии защитных и воспалительных функций нейтрофилов человека, в особенности на ранних стадиях развитии острого воспаления.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Ii-ом Всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991), на 1-ом съезде физиологов Средней Азии и Казахстана (Душанбе, 1991), на 3-ем и 4-ом Европейских симпозиумах «Calcium Binding Proteins in Normal and Transformed Cells» (Цюрих, Швейцария, 1994; Перуджа, Италия, 1996), на Международной конференции «Membrane Fusion» (Juan March Institute, Мадрид, Испания, 1997), на научных семинарах Института Молекулярной Генетики и Биологии (IBGM, Вальядолидский университет, Испания, 1996-1998), на П1-ей конференции молодых ученых Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева (Саранск, 1998), на Международной конференции "Neutrophil Development and Function" (Juan March Institute, Мадрид, Испания, 1999),. Работа прошла апробацию на объединенном семинаре кафедр биохимии, генетики и биотехнологии биологического факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 22 работы.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего3^источников. Работа изложена на225страницах машинописного текста, содержит ¿Орисунков и Z таблицы,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека 1.1. Классификация и общая характеристика гранул

Исходно внутриклеточные гранулы нейтрофилов человека подразделяли на два основных типа: пероксидаза-позитивные (азурофильные, первичные) гранулы и пероксидаза-негативные (специфические, вторичные) гранулы (Spicer S.S., Hardin J.H., 1969; Leffell M.S., Spitznagel J.K., 1972; Bretz U., Bag-giolini M., 1974; West B.C. et al., 1974; Baiton D.F., 1975). Классификация основывалась на сродстве гранул к основному красителю азуровому А, содержании в гранулах миелопероксидазы и очередности появления гранул в ходе миелопоеза. В последние 10-15 лет использование высокоразрешающих методов субклеточного фракционирования и иммуноэлектронной микроскопии привело к обнаружению значительной гетерогенности в популяции как пе-роксидаза-позитивных, так и пероксидаза-негативных гранул, а также к идентификации еще одного типа внутриклеточных секреторных органелл, названных секреторными везикулами (Borregaard N. et al., 1993; Borregaard N., Cowland J.B., 1997).

В настоящее время под термином пероксидаза-позитивные гранулы объединяют 2 набора гранул, отличающихся плотностью и содержанием в них особых антимикробных пептидов - дефензинов: 1) обогащенные дефензина-ми гранулы с высокой плотностью и 2) гранулы с низкой плотностью и низким содержанием дефензинов (Ganz Т. et al., 1985; Rice W.G. et al., 1987; Oren A., Taylor J.M.G., 1995). В популяции пероксидаза-негативных гранул выделяют 3 набора гранул различной плотности и с разным относительным содержанием в них лактоферрина и желатиназы (Kjeldsen L. et al., 1993). Так, в частности, 15 % всех пероксидаза-негативных гранул содержит лактоферрин и не содержит желатиназу, 60 % гранул содержит и лактоферрин и желатина-зу, и, наконец, 25 % гранул содержит желатиназу и не содержит лактоферрин (гранулы перечислены в порядке уменьшения плотности). В настоящее время первые два набора пероксидаза-негативных гранул обозначают как специфи-

ческие или вторичные гранулы, а третий набор относят к отдельн�