Свойства и топография внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании

Григорьев, Павел Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Свойства и топография внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Свойства и топография внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании"

На правах рукописи

Григорьев Павел Николаевич

СВОЙСТВА И ТОПОГРАФИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ КАЛЬЦИЙ-СВЯЗЫВАЮЩИХ САЙТОВ ЭКЗОЦИТОЗА И ЭНДОЦИТОЗА СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В ДВИГАТЕЛЬНОМ НЕРВНОМ ОКОНЧАНИИ

03.00.13-физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань-2008

003453236

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, Зефиров Андрей Львович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ и РТ, Ситдиков Фарит Габдулхакович; доктор медицинских наук, профессор Волков Евгений Михайлович

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В Ломоносова»

Защита состоится « 5 » 2008 года вна заседании

диссертационного совета Д 208.034.01 при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО Казанского государственного медицинского университета (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49, корпус Б).

Автореферат разослан « ^ » УМЗ^К)^-^ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор йЛЗ Л^/-- Залялютдинова Л.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Везикулярный цикл представляет собой уникальный механизм, благодаря которому происходит повторное использование синаптических везикул (СВ) в процессах секреции медиатора из нервных окончаний (НО) химического синапса. Основными этапами везикулярного цикла являются, экзоцитоз, сопровождающийся секрецией кванта медиатора в синаптическую щель и эндоцитоз, завершающийся образованием новой везикулы [Т.С. Sudhof, 2008; А.Л. Зефиров, 2007; ET. KavalaH, 2007]. Выделяют следующие механизмы экзоцитоза: полный экзоцитоз, для которого характерно слияние мембраны везикулы с пресинаптической мембраной, и частичный экзоцитоз, по типу kiss-and-run, при котором происходит образование временной поры между содержимым СВ и синаптической щелью [SO. Rizzoli and R. Jahn, 2007]. Процессы экзоцитоза и эндоцитоза являются тесно связанными, однако механизмы, обеспечивающие эту связь, не раскрыты. Среди факторов, способных нарушить соотношение процессов экзо- и эндоцитоза, можно отметить отсутствие во внеклеточном растворе двухвалентных катионов [A L. Zefirov et si., 2006]

Для изучения цикла СВ широко используются электрофизиологический и оптический подходы [М. Khvotchev and Е.Т. Kavalali, 2008]. Комбинация двух подходов в экспериментах по изучению эндоцитоза является необходимой, т.к. изменения эндоцитоза при каких-либо воздействиях могут быть связаны с их эффектами на экзоцитоз. Поэтому обычно предварительно используются электрофизиологические методы, которые позволяют количественно оценивать секрецию медиатора и судить об экзоцитозе СВ. Далее применяется флуоресцентный метод, например, с использованием красителя FM 1-43, который при эндоцитозе захватывается во вновь образующиеся везикулы и «загружается» в НО Использование этого метода при соблюдении условия одинаковой секреции медиатора позволяет судить об интенсивности процессов эндоцитоза, а также оценивать тип экзоцитоза - полный или kiss-and-run [М A. Cousin, 2008, S.O. Rizzoli at al„ 2003, А.Л. Зефиров, 2007]

В инициации процессов экзоцитоза решающую роль отводят внутриклеточным ионам Ca, которые поступают в НО через потенциал-зависимые Са-каналы пресинаптической мембраны и взаимодействуют со специфическими сайтами [E.R. Chapman, 2008; Т.С. Sudhof, 2004; G J. Augustine, 2001]. Многочисленные исследования показали, что в процессах слияния везикул и секреции медиатора задействованы разные Са-связывающие сайты экзоцитоза, отличающиеся по локализации, афинности к ионам Ca и катионам других щелочноземельных металлов (Sr, Ва). Активация этих сайтов лежит в основе различных видов секреции медиатора: 1) вызванной (фазной) - связанной с возникновением пресинаптического потенциала действия (ПД) и 2) спонтанной - возникающей в отсутствии

ПД [3. Del Castillo and В. Katz, 1954, W. Van Der Kloot and J. Molgo, ¡994; E. Neher and T. Sakaba, 2008]. Топографию и афинность Са-сайтов экзоцитоза удобно описывать двумя основными моделями Модель Са-микродомена предполагает расположение низкоаффинного сайта экзоцитоза в непосредственной близости от Са-канала (десятки нм), который активируется короткоживущим облаком повышенной (сотни мкМ) концентрации кальция при открытии канала. Модель макродомена предполагает наличие высокоаффинного сайта на

более удаленном расстоянии {сотни км) от Са-канала. В этом случае активация экзоцитоза---

происходит при концентрации Са менее 10 мкМ, и связана с открытием нескольких (множества) близкорасположенных каналов [O.J. Augustine et. al, 2003; Е. Neher, 1998; Е. Neher and Т. Sakaba, 2008] Определить, по какой из моделей осуществляется активация сайта - Са-микродоменом или Са- макродоменом, позволяет использование быстрого (ВАРТА-АМ) и медленного (EGTA-AM) внутриклеточных Са-хелаторов [Е. Neher, 1998].

Значение ионов С а в процессах эндоцитоза не столь очевидно, выявлена как их инициирующая, так и ингибирующая роль в процессах рециклирования везикул [А.Л. Зефиров, 2007, М.А. Cousin, 2000] Топография и свойства Са-связывающих сайтов эндоцитоза не определены

Ключевая роль процессов экзоцитоза и эндоцитоза в синаптнческих механизмах, недостаточность наших знаний о значении ионов Са в запуске, регуляции и поддержании соотношения процессов экзоцитоза и эндоцитоза, диктуют необходимость исследования расположения относительно Са-каналов пресинаптической мембраны и чувствительности к двухвалентным катионам Са-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза СВ.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования явилось изучение соотношения процессов экзо- и эндоцитоза СВ при различных способах стимуляции экзоцитоза, а также определение топографии и чувствительности Са-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза СВ к ионам Са, Sr, Ва и Mg в двигательном нервном окончании лягушки

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задаче.

1) Оценить экзоцитоз СВ при увеличении спонтанной и вызванной секреции медиатора различными способами (деполяризация пресинаптической мембраны гиперкалиевым раствором или постоянным током, экспозиция гиперосмотического раствора, воздействие кофеина, высокочастотное раздражение),

2) Оценить соотношение процессов эндоцитоза и экзоцитоза СВ при стимуляции спонтанной и вызванной секреции медиатора;

3) Исследовать влияние быстрого (ВАРТА-АМ) и медленного (EGTA-AM) внутриклеточных кальциевых хелаторов на спонтанную и вызванную секрецию медиатора;

4) Для оценки топографии Са-связывшощих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза исследовать влияние быстрого и медленного внутриклеточных кальциевых хелаторов на загрузку и выгрузку красителя FM 1 -43 при стимуляции спонтанной и вызванной секреции;

5) Оценить спонтанную и вызванную секрецию медиатора при замене внеклеточных ионов Са на ионы Sr, Ва, Mg.

6) Для оценки свойств Са-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул исследовать загрузку и выгрузку красителя FM 1-43 при замене внеклеточных ионов Са на ионы Sr, Ва, Mg.

Объект и методы исследования

Эксперименты проводились на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки Rana Ridibunda в летне-осенний период (август-ноябрь месяцы). Использовано 240 лягушек. Для получения результатов исследования были использованы два экспериментальных подхода. Электрофизиологический подход (внутри- и внеклеточное отведение постсинаптических токов, регистрация мембранного потенциала) позволил количественно оценить секрецию медиатора (зкзоцитоз), а оптический подход (конфокальная флуоресцентная микроскопия с использованием красителя FM 1-43) - судить об интенсивности процессов экзоцитоза и эндоцитоза СВ.

Достоверность полученных данных и их научная новизна

Достоверность полученных данных достигалась использованием достаточного и представительного объема экспериментальных исследований, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием математического анализа и статистического метода. Достоверность различий между популяциями оценивали по критерию Стьюдента.

Впервые показана активация Са-связывающего сайта спонтанной секреции не только ионами Са, Sr, Ва, но и ионами Mg. Впервые показано, что в двигательном нервном окончании лягушки экзоцитоз СВ может происходить по типу kiss-and-run. В работе получены данные, предполагающие наличие внутриклеточного Са-связывающего сайта эндоцитоза СВ в двигательном нервном окончании лягушки. Впервые установлено, что активация Са-связывающего сайта эндоцитоза при спонтанной и вызванной секреции медиатора осуществляется в области Са-микродомена, и данный сайт в нервном окончании обладает чувствительностью к ионам Ва и Sr. Са-связывающие сайты экзоцитоза и эндоцитоза СВ отличаются по топографии и свойствам.

Теоретическая значимость

осуществлении передачи информации между возбудимыми клетками. Более глубокое понимание механизмов, обеспечивающих процессы экзоцитоза и зндоцитоза, может быть использовано при объяснении процессов, происходящих в центральной нервной системе и лежащих в основе памяти, эмоций, поведения, научения и т.п; и позволят в дальнейшем влиять па скорость везикулярного цикла, изменения которого могут лежать в основе возникновения и развития некоторых неврологических и психиатрических заболеваний.

-------Учитывая тот факт, что механизмы зндоцитоза являются универсальными для всех видов

клеток, результаты работы могут помочь в выяснении механизмов и поиска новых фармакологических препаратов, регулирующих также процессы фагоцитоза и пиноцитоза. В целом, изложенные экспериментальные данные расширяют представления о механизмах передачи информации в химическом синапсе.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1) В двигательном нервном окончании лягушки существуют самостоятельные Са-связывающие сайты для экзоцитоза и зндоцитоза СВ, различные по своей природе. При раздельной их активации наблюдается разобщение процессов экзоцитоза и зндоцитоза.

2) Са-свиывающий сайт зндоцитоза СВ расположен в непосредственной близости (десятки нанометров) от потешшалзависимого Са-канала.

3) Са-связывающий сайт зндоцитоза и Са-связывающие сайты спонтанного и вызванного экзоцитоза СВ в двигательном нервном окончании характеризуются различной чувствительностью к ионам Са, Sr, Ва, Mg.

Сведения об апробации результатов диссертации

Основные результаты диссертационной работы доложены на конференциях и форумах: международном симпозиуме «Синаптогенез» (Вена, Австрия, 2003), 8-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), летней школе IBRO по сенсорным и интегративным нейронаукам (Москва, 2004), международной школе-конференции IBRO по клеточной физиологии "Транспортные механизмы через клеточные мембраны" (Санкт-Петербург, 2004), 9-м FEBS форуме молодых ученых (Визеград, Венгрия, 2005), 5-м Европейском форуме по нейронаукам (Вена, Австрия, 2006), XX Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова, (Москва, 2007), летней школе PENS-Blackwell с углубленным курсом по нейропластичности (Рим, Италия, 2007).

Сведения о публикациях по теме диссертации

Основные положения диссертации отражены в 19-ти научных работах, написанных автором, в том числе двух работ, опубликованных в ведущих зарубежных журналах, пяти работ, опубликованных в российских научных рецензируемых журналах, из них трех -согласно перечню изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для

опубликования основных результатов диссертаций. Общий объем публикаций - 4.4 условно печатных листа, в т.ч. авторский вклад —1.8 условно печатных листа.

Личный вклад соискателя

Внедрение результатов работы

Результаты проведенного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета, на кафедре физиологии человека и животных Казанского государственного университета и на кафедре анатомии и физиологии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 131 страница состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 243 названия, из них 9 на русском и 234 на английском языках. Диссертация содержит 25 рисунков.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования в растворы. Использовался стандартный раствор Рингера для холоднокровных (Са-раствор) следующего состава (в мМ): 117 ЫаС1, 2,5 КС1, 1,8 СаСЬ, 2,42,7 КаНСОз. Все эксперименты проведены при температуре 20° С, рН поддерживался на постоянном уровне 7.2-7.4. Наряду с Са-раствором использовались растворы, в которых ионы Са были заменены на ионы вг, Ва или в концентрациях 1,8 мМ (вг-, Ва-, растворы). Гиперкалиевые растворы содержали увеличенную концентрацию ионов К, а для сохранения осмотичности растворов уменьшалась концентрация ионов Иа. В гиперосмотические растворы добавляли сахарозу (25-100 мМ). Высокочастотное (20 имп/с) раздражение двигательного нерва проводилось прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0,1-0,2 мс сверхпорогововой силы. Для блокирования мышечных сокращений использовался тубокурарин (2 * 10"5М).

Для изучения аффинности и расположения сайтов экзо- и эндоцитоза относительно Са-каналов пресинаптической мембраны были использованы два мембранопроникающих

мобильных кальциевых буфера с различной кинетикой связывания ионов Ca: ВАРТА-АМ (1,2-bis(2-Aminophenoxy)ethane - N,N,N',N'-tetraacetic acid acetoxymethyl ester) - «быстрый» буфер, и ЕОТА-АМ (ethylene giyco!-bis(2-ammoethylcther) ethane - N,N,N',N'-tetraacetic acid acetoxymethyl ester) - «медленный» буфер. Нервно-мышечные препараты выдерживались в инкубационном растворе (концентрация буфера - 100 мкмоль/л, DMSO - 0.1 %, Pluronic -0.01%) в течение 1 часа, после чего в течение 30 минут отмывались в стандартном растворе.

--------- — Регистрация сиваптнческвх сигналов и мембранного потенциала. Использовались

два метода регистрации синаптических сигналов:

1) Внеклеточная регистрация. Осуществлялось отведение спонтанных, одноквантовых, миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП), возникающих при секреции медиатора из небольшого (около 8 мкм) участка нервной терминали [А.Л. Зефиров и др., 1990]. Для регистрации использовали стеклянные микроэлектроды, заполненные 2М раствором NaCl, с диаметром кончика около 1-2 мкм и сопротивлением 1-5 МОм. Для деполяризации НО использовался внеклеточный электрод, подведенный к проксимальному участку НО. В экспериментах с деполяризацией мембраны НО постоянным током использовали тетродотоксин в концентрации 1 мкМ. Частоту МТКП определяли по среднему интервалу времени между соседними МТКП (в с"!). В эксперименте микроэлектрод подводился к нескольким участкам различных НО, в каждом из которых регистрировалось 100-200 МТКП.

2) Внутриклеточная регистрация. Осуществлялась регистрация сигналов, связанных с секрецией медиатора во всем НО. Этот вид отведения использовался для анализа вызванных, многоквантовых потенциалов концевой пластинки (ПКП), Использовали стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 2-10 МОм, заполненные ЗМ раствором KCl. Введение микроэлектрода в мышечное волокно осуществляли в области НО под визуальным контролем. Для определения количества квантов медиатора, освобождаемых из НО в ответ на отдельное раздражение (квантовый состав), использовался анализ дисперсии амплитуды потенциалов концевой пластинки (ПКП) [D. Elmqvist and D.M. Quastel, 1965; J.I. Hubbard and D.F. Wilson, 1973; А.Л. Зефиров и др., 2008].

Флуоресцентная микроскопия.

Для изучения экзоцитоза и эндоцитоза использовался флуоресцентный краситель FM 143 (фирма Biotium, США) в концентрации 6 мкМ. При стимуляции секреции медиатора в присутствии красителя FM 1-43 во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся СВ («загружается» в НО). При стимуляции секреции медиатора в предварительно окрашенных НО в отсутствии красителя FM 1-43 благодаря процессам экзоцитоза покидает СВ («выгружается» из НО). В экспериментах с выгрузкой красителя предварительную загрузку FM 1-43 в НО осуществляли высокочастотным раздражением 20 имп/сек в

присутствии красителя. Флуоресценцию наблюдали с помощью универсального микроскопа OLYMPUS BX51W1 с конфокальной приставкой. В качестве осветителя использовалась ртутная лампа мощностью 100Вт. Оптика для анализа свечения FM 1-43 включала 480 нм возбуждающий фильтр и 515 нм фильтр эмиссии. Использовались водноиммерсионный объектив LUMPlanFI 60Х (0,9 NA) (фирма Olympus). Анализу подвергались только поверхностно расположенные НО. Регистрация изображений осуществлялась черно-белой CCD-камерой F-View И (фирма Olympus), совмещенной через специализированный софт CeUP с персональным компьютером. Интенсивность свечения нервных терминалей оценивали в относительных единицах, принимая максимальное свечение пикселя за 1. Значение фонового свечения определяли как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50x50 пикселей в участке изображения без НО и впоследствии вычитали из каждого пикселя полученного камерой изображения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Секреция медиатора и экзо-эндоцнтоз синаптическнх везикул при различных способах увеличения спонтанной н стимуляции вызванной секреций медиатора*

Было выбрано несколько способов увеличения спонтанной секреции медиатора. При калиевой деполяризации (уменьшении мембранного потенциала покоя вследствие увеличения внеклеточной концентрации ионов К) и токовой деполяризации (уменьшение мембранного потенциала, возникающее под отрицательным электродом) возникают открытие потенциалзависимых Са-каналов, вход внеклеточных ионов Ca и увеличение внутриклеточной концентрации ионов Ca [M.I. Glavinjvic, 1988, J.K. Angleson and W.J. Betz, 2001]. Кофеин приводит к освобождению ионов Ca из эндоплазматического ретикулума [О.П. Балезина, 2002; A. Martinez-Serrano and J. Satrustegui, 1989]. Гиперосмотический раствор сахарозы стимулирует спонтанную секрецию медиатора по Са-независимому пути [C.F. Stevens and J.H. Williams, 2000].

Оказалось, что при концентрации ионов Ca 1.8 мМ в окружающем растворе калиевая или токовая деполяризации, а также добавление кофеина или использование гиперосмотического раствора приводили к быстрому дозозависимому увеличению частоты МТКП (рис. 1 А-Г).

Для последующего изучения процессов эндоцитоза СВ посредством флуоресцентного метода с использованием FM 1-43 необходимо было использовать способы увеличения

* Часть электрофизиологических эксперименты данной части работы выполнены совместно с к.м.н. Абдрахмановым М.М.

Qj-я

20 В 20

10 / 10

ft т— 0

0 2 4 6

Г J

Концентрация ионоз К, мМ

Гиперкалиезый раствор (40 мМ)

Сила тока, мА

Воздействие тока (4мА)

Концентрация кофеина, мМ

Кофеин (5 мМ)

0 50 100

Концентрация сахарозы, мМ

Сахароза (30 мМ)

Рис. 1. Спонтанная секреция медиатора и зндоцитоз синалгических везикул при различных воздействиях

А-Г - частота МТКП, с'1, при различных способах стимуляции спонтанной секреции, внеклеточное отведение.

Д - картины флуоресценции участков НО после стимуляции секреции медиатора (5 мин).

секреции медиатора с примерно одинаковым уровнем экзоцитоза. Поэтому были выбраны такие воздействия, при которых частота МТКП составляет около 7 с"': гиперкалиевый раствор (К-40 мМ), воздействие постоянного тока силой 4мА, а также добавление кофеина (5 мМ) или сахарозы (ЗОмМ), продолжительность воздействий составляла 5 мин. При калиевой и ли токовой деполяризации мембраны, а также при экспозиции кофеина в присутствии FM 1-43 происходила загрузка красителя, и в НО можно было обнаружить пространственно-обособленные светящиеся пятна различной величины и интенсивности, являющиеся скоплением везикул, прошедших цикл экзо-эндоцитоза в области активных зон (W.J. Betz and G.S.Bewick, 1993). При использовании гиперосмотического раствора загрузка FM 1-43 не наблюдалась. В предварительно загруженных красителем НО светящиеся пятна сохранялась в течение длительного времени. Стимуляция экзоцитоза калиевой или токовой деполяризацией, или при воздействии кофеина приводила к выгрузке красителя, выражавшаяся в исчезновении флуоресцирующих пятен и уменьшении свечения терминалей. При действии гиперосмотического раствора выгрузка красителя отсутствовала.

При стимуляция вызванною экзоцитоза высокочастотным раздражением (20 с"') препарата в течение 5 мин в присутствии FM 1-43 наблюдалась загрузка красителя. Раздражение предварительно окрашенного препарата приводило к выгрузке FM 1-43.

Т.о., применение способов стимуляции секреции медиатора, при которых происходит увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са за счет их входа через Са-каналы

(гиперкалиевая или токовая деполяризация, ритмическое раздражение) или при освобождении ионов Са из внутриклеточных депо (кофсии) наблюдается сохранность соотношения процессов полного экзоцитоза и эндоцитоза СВ, о чем свидетельствует наличие успешной загрузки н выгрузки красителя. В гнперосмотическнх растворах выраженное увеличение секреции медиатора не сопровождается загрузкой и выгрузкой красителя, что позволяют делать вывод о секреции медиатора по механизму к155-ап(1-гип с образованием короткоживущей поры между СВ и синаптической щелью (1а85-апс1-гип механизм). При этом медиатор способен диффундировать через пору, а РМ 1-43 - нет.

Экзо-эндоцитоз синаптнчсскнх везикул при использоваввв быстрого в медленного внутриклеточного Са-хелаторов'

Помещение нервно-мышечного препарата в гиперкалиевый раствор (К-40 мМ) через 5 мин приводило к увеличению частоты МТКП с 0.23 ± 0.03 имп/с (п=28) до 7.25 ± 0.91 имп/с (11=23) имп/сек. В препаратах, НО которых предварительно были загружены Са-буферами, аппликация гиперкалиевого раствора также приводила к росту частоты МТКП, однако, менее выраженному (Рис. 2А). Можно отметить, что как быстрый буфер (ВАРТА-АМ), так и медленный (ЕОТА-АМ) оказывают примерно одинаковое действие (р > 0.05).

В препаратах, НО которых были предварительно загружены медленным Са-буфером, ЕОТА-АМ, пятиминутная аппликация гиперкалиевого раствора, содержащего РМ 1-43, вызывала появление в НО ярко светящихся пятен (Рис. 2Б-В). В этих условиях применение быстрого буфера (ВАРТА) не приводило к появлению светящихся пятен, что свидетельствует о нарушении процессов эндоцитоза СВ (Рис. 2Б-В).

В стандартном растворе квантовый состав первого ПКП в серии составлял 470+80 квантов (п=8). В процессе высокочастотного раздражения с частотой 20 имп/с наблюдалось постепенное снижение квантового состава ПКП, который через 3 мин раздражения составлял 8,2 ± 2,7 % (п = 8) от исходного уровня. В препаратах, НО которых предварительно были загружены ЕОТА-АМ или ВАРТА-АМ, исходный квантовый состав составлял 390±90 квантов (п=6) и 80 ± 20 квантов (п=6), соответственно, а снижение квантового состава ПКП через 3 мин раздражения происходило до 11.5 ± 3.8 % (п = 6) и 35.3 ± 10.2 % (п = 6) от исходного уровня, соответственно. Сравнение кумулятивных кривых количества освобожденных квантов медиатора при высокочастотном раздражении двигательного нерва показало, что

* Часть электрофизиологических экспериментов по высокочастотному раздражению в данной части работы выполнены совместно с ассистентом КГМУ, к.м.н., Мухамедьяровым М.А.

0.30.20.10.0 -

0.15. 0.10

0.00-

и «

60 120 180 240

Время, сек

Рис, 2. Секреция медиатора и загрузка красителя при использовании быстрого и медленного внутриклеточных кальциевых хелаторов.

1 - контрольные опыты, 2 - опыты с EGTA-AM, 3 - опыты с ВАРТА-АМ.

А - частота МТКП при действии гиперкалиевого раствора (К-40 мМ), внеклеточное отведение, Б - картины флуоресценции и В - средняя интенсивность свечения терминалей после 5-мин экспозиции гилеркалиевого раствора в присутствии FM-1-43 и последующей 30-мин отмывки, Г - кумулятивные кривые количества освобожденных квантов медиатора при высокочастотном раздражении. Пунктирная линия проведена через значение 180000 квантов. Д картины флуоресценции и Е - средняя интенсивность свечения терминалей после высокочастотного раздражения в присутствии FM-1-43 и последующей 30-мин отмывки. 1 ¡родолжительность раздражения подобран по линии, проведенной на рис. 2Г.

около 180000 квантов в контроле и при использовании ЕйТА-АМ освобождается примерно за одну минуту, а при использовании ВАРТА-АМ - за 3.5 мин стимуляции (рис. 2 Г).

Высокочастотное раздражение продолжительностью I мин в стандартном растворе в присутствии РМ 1-43 приводило к появлению флуоресцирующих пятен (Рис. 2 Д-Е). При использовании внутриклеточных Са-хелаторов флуоресцирующие пятна появлялись в случае применения ЕСТА-АМ (раздражение 1 мин), однако отсутствовали при использовании ВАРТА-АМ (раздражение 3.5 мин) (Рис. 2 Д-Е).

Как стимуляция спонтанной (гиперкалиевый раствор), так и вызванной (ритмическое раздражение) предварительно окрашенных терминален приводила к выгрузке красителя, что свидетельствует о сохранности процессов экзоцитоза СВ Влияние различных Са-буферов на секрецию медиатора и процессы экзо- и эндоцитоза позволяет сделать целый ряд заключений об аффинности и расположении Са-сенсоров, отвечающих за слияние и повторное образование СВ. Известно, что скорость связывания ионов Са у ВАРТА примерно в 150 раз выше, чем у EGTA, поэтому ВАРТА, как более быстрый буфер, сильнее ограничивает размеры «облака» ионов Са в области устья открытого Са-канала, чем EGTA [Е. Neher, 1998; Е Neher and Т. Sakaba, 2008]. В результате, применение ВАРТА-АМ должно приводить к более выраженному эффекту на интенсивность процессов, запускаемых увеличением внутриклеточной концентрации Са около одиночного Са-канала, т.е. Са-микродоменом Электрофизиологические данные демонстрируют, что запуск вызванной секреции осуществляется в области Са-микродомена, а спонтанной в гиперкалиевых растворах -определяется Са-макродоменом. Что касается эндоцитоза везикул, то тут ситуация иная. Оказалось, что, в случае стимуляции как спонтанной, так и вызванной секреции процесс эндоцитоза СВ определяется Са-микродоменом в районе одиночного Са-канала и, скорее всего, протекает в областях с низкой плотностью Са-каналов, т.е. вне активных зон. Отсюда можно считать, что эндоцитоз запускается высокопороговым Са-сенсором, для активации которого необходимы достаточно большие концентрации ионов Са.

Оценка чувствительности внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза я эндоцитоза сннаптических везикул к катионам Са, Sr, Ва и Mg.

В Са-, Sr-, Ва- или Mg- растворах при внеклеточном отведении частота МТКП составляла 0,24±0,06 (п=21), 0,28+0,1 (п=15), 1,4+0,5 (п=15), и 0,2+0,05 с' (п=17), соответственно (рис. ЗА). Для исследования способности различных двухвалентных катионов поддерживать спонтанную секрецию медиатора был использован гиперкалиевый раствор (К-40 мМ). Оказалось, что при наличии в перфузируемом растворе любого исследуемого катиона аппликация гиперкалиевого раствора приводила к резкому и примерно одинаковому увеличению частоты МТКП. Через 5 мин гиперкалиевой деполяризации в растворах с ионами Са, Sr, Ва, Mg частота МТКП возрастала до 7,25±0,9 (п=23), 8,1±0,8 (п=20), 9,0±1,0 (п=21) и 9,5±1,2 с"' (п=17), соответственно. Резкое увеличение частоты МТКП при гиперкалиевой деполяризации свидетельствует о том, что все исследованные катионы могут поступать в НО через Са каналы, а сайт спонтанного экзоцитоза способен примерно одинаково активироваться катионам щелочноземельных металлов. Примерно одинаковая частота МТКП

ю-

£ 5

ПП1 1П

д.

0.2 0.1 0.0

Са Эг Ва I

Контроль

Са Зг

Са вг Ва Мд

Гйперкалиевый раствор

0.2< 0.10.0-

0.2

0.1

Сз Зг Ва %

0.0" Са ЭТ

Рис. 3. Экзоцитоз и эндоцитоз синаптических везикул при использовании катионов различных щелочноземельных металлов.

А - частота МТКП в контроле (К-2.5 мМ) и в гияеркалиевом растворе (К-40 мМ) при использовании Са, 8г, Ва и Б - кумулятивные кривые количества освобожденных квантов медиатора при высокочастотном раздражении в растворах с ионами Са, $г и Ва. Пунктирные линии проведены через значения 180000 квантов (черные кружки), и 225000 квантов (белые кружки). Стрелками указаны временные интервалы раздражения, при которых освобождаегся одинаковое количество квантов медиатора в Са-, вг- и Ва- растворах. В - столбиковая диаграмма средней интенсивности свечения нервных терминалей, в отн.ед. в гиперкалиевом растворе (! мин), содержащем ионы Са, 5г, Ва или Г" - столбиковая диаграмма средней интенсивности свечения нервных терминалей, в отн.ед. при раздражении с частотой 20 имп/с в растворах, содержащих ионы Са, Бг, Ва или Продолжительность раздражения подобрана по линиям, проведенным через значение 180000 квантов на рис. ЗБ. Г - столбиковая диаграмма средней интенсивности свечения нервных терминалей, в отн.ед., при продолжительном ритмическом раздражении в растворах, содержащих ионы Са и вг. Продолжительность раздражения подобрана по линиям, проведенным через значение 225000 квантов на рис. 2Д.

в Са-, Б г-, Ва- и М§- растворах (р > 0.05) свидетельствует, что в единицу времени одинаковое количество везикул сливаются с пресинаптической мембраной (рис ЗА).

Экспозиция этих растворов в присутствии РМ 1-43 продемонстрировала различия а загрузке красителя. В Са- и Ва- растворах 1-мин экспозиция гиперкалиевого раствора с красителем приводила к появлению в НО ярко светящихся пятен, Эг- растворах интенсивность свечения была несколько ниже (р<0.05), а в растворах - пятна не появлялись (рис. 3 В) При внутриклеточном отведении раздражение двигательного нерва в Са- и Б г- растворах вызывало появление многоквантовых ПКП (синхронная секреция медиатора). В Бг- растворах квантовый состав ПКП был значительно ниже, чем в Са-растворах, и составлял 41,4±10 квантов (п= 6). В процессе высокочастотного раздражения наблюдалось первоначальное примерно двукратное увеличение квантового состава ПКП, а затем его медленное снижение. К 3 мин раздражения квантовый состав ПКП составлял 98,4 ± 0,2 % (п = 6) от исходного уровня. Сравнение кумулятивных кривых количества освобожденных квантов медиатора при ритмическом раздражении двигательного нерва показало, что за одну мин в Са- растворах освобождается около 180000 квантов, в то время как в 5г- растворах это количество квантов освобождается примерно за 3 мин. За 1,5 мин в Са- растворах освобождалось около 225000 квантов, а в Бг- растворах такое количество квантов освобождается примерно за 4 мин (Рис. ЗБ) В растворах в ответ на раздражение нерва синхронная секреция отсутствовала (ПКП не наблюдались).

В Ва- растворах раздражение двигательного нерва не вызывало синхронной секреции медиатора (многоквантовые ПКП отсутствовали). Длительное высокочастотное раздражение приводило к появление огромного количества асинхронно возникающих одноквантовых сигналов (резкому увеличению частоты МПКП), которые, суммируясь друг с другом, вызывали деполяризацию мышечных волокон. Определить частоту МПКП и, соответственно, количество освобожденных квантов медиатора при внутриклеточном отведении было невозможно. Поэтому для приблизительной оценки секреции медиатора при высокочастотном раздражении в Ва- растворах было применено 2 метода. Первый использованный метод основан на определении частоты асинхронно возникающих одноквантовых сигналов по значению производимой ими деполяризации постсинаптической мембраны с использованием формулы л= К(1-К/(Е-£))-1(а*г)-1 [Е.М ЗШпэку, 1978]

Где п - частота спонтанной секреции медиатора, с'1; а - средняя амплитуда МТКП; т -временная постоянная МТКП, мсек, К-деполяризация цитоплазматической мембраны, мВ; Е - мембранный потенциал покоя, мВ; е - равновесный потенциал ацетилхолина, =-15 мВ [Е.М. БШгаку, 1978].

После начала стимуляции быстро, в течение нескольких секунд, развивалась деполяризация мембраны с -45±2.6мВ (п=9) до -37±2.8мВ (п=9) сохранявшаяся все время 40-сек раздражения. Использованная формула позволяет считать, что данная деполяризация может наблюдаться при возникновении МТКП с частотой 6200 имп/сек ± 450 с"1 (п = 9).

Второй использованный метод - внеклеточное отведение, при котором регистрируются сигналы от небольшого участка НО. В этом случае через 10 с высокочастотного раздражения частота МТКП составила 145,3±10 с*1 (п = 8), которое сохранялось в течение всего раздражения. Опираясь на наши и литературные [Р.А. Рау«оп е! а1., 1998] данные, о том, что средняя протяженность двигательного НО кожно-грудинной мышцы лягушки (суммарная длина всех терминалей) составляет около 300 мкм, а внеклеточный электрод регистрирует постсинаптические сигналы от участка синапса длиной около 8 мкм [А.Л. Зефиров и др., 1990}, производился расчет частоты МТКП во всем синапсе, умножая внеклеточно регистрируемую частоту МТКП на 37,5. Расчеты показали, что частота МПКП в синапсе в Ва-растворах составляет 5450+380 с'1 (п = 8). Таким образом, определяемая частота МТКП при высокочастотном раздражении в Ва-растворах при использовании обоих методов подсчета не отличалась (р>0 05). При сравнении кумулятивных кривых освобожденных квантов медиатора видно, что одинаковое количество квантов (около 184000) освобождается из НО в Са-растворах в течение 1 мин, а в Ва-раегворах - примерно за 30 сек (Рис. ЗБ).

Для изучения процессов эндоцитоза использовались параметры стимуляции, при которых наблюдалось одинаковое количество освобожденных квантов. Так, светящиеся пятна наблюдались только в Са- (1мнн) и Ва- (30 сек) растворах (Рис. 3 Г). Отсутствие загрузки в Эг- растворах могло быть связано с полным отсутствием способности данных ионов поддерживать эндоцитоз. Поэтому была проведена дополнительная серия экспериментов с увеличенным временем раздражения, 1,5 мин в Са- растворах и 4 мин - в Бг- растворах, при которых количество освобожденных квантов было снова одинаково (около 225000). При этом светящиеся пятна появлялись и в Б г- растворах, но яркость свечения НО была значительно меньше, чем в Са- растворах (р < 0.05) (Рис. 4Д).

При воздействии гиперкалиевого раствора с ионами Са, Бг, Ва или Mg, а также при ритмическом раздражении в растворах с ионами Са, вг, Ва через 15 мин наблюдается полная выгрузка РМ 1-43 из предварительно окрашенных препаратов, что свидетельствует о сохранности процессов полного экзоцитоза СВ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование продемонстрировало, что в двигательном нервном окончании лягушки существуют отдельные Са-связывающие сайты для экзоцитоза и эндоцитоза СВ.

В механизмах спонтанного экзоцитоза принимает участие Са-связывающий сайт, активирующийся в области Са-макродомена, обнаруживающий сходную чувствительность к ионам Са, Sr, Ва, Mg и запускающий полный экзоцитоз СВ. Учитывая его работу при сравнительно низкой концентрацией ионов Са (<10 мкМ) [Е. Neher, 1998], сенсор должен быть низкопороговым. Полученные данные свидетельствуют о том, что этот сайт не обладает селективностью и способен активироваться практически всеми катионами щелочноземельных металлов (Са, Sr, Ва и Mg). Наиболее вероятным молекулярным кандидатом сайта служит белок мембраны СВ - синаптотагмин [E.R. Chapman, 2008, Т.С. Sudhof, 2008] Несмотря на обнаруженную различную аффинность Са-связывающего домена синаптотагмина к различным двухвалентным катионам [М. Fukuda, 1997], одинаковая частота МТКП в Са-, Sr-, Ва- и Mg- растворах при гиперкалиевой деполяризации может быть объяснена достижением достаточной для активации сайта спонтанного экзоцитоза концентрации этих катионов в макродомене. Наиболее вероятным кандидатом служит синаптотагмин III - высокоаффинная изоформа, для которой обнаружена способность связывать катионы Са, Sr, Ва и Mg [М. Fukuda, 1997, Т.С. Sudhof, 2004].

В механизмах вызванного, синхронного экзоцитоза, по всей видимости, происходит активация высокопорогового сайта, которая осуществляется кальциевым микродоменом в области открытого Са- канала, на что указывают данные о различном влиянии быстрого и медленного кальциевого хелатора. Сайт фазного экзоцитоза оказался чувствителен только к ионам Са и Sr, с меньшей аффиностью к катионам Sr, и не чувствителен к ионам Ва и Mg. Вероятно, данный сайт представлен низкоаффинной изоформой, синаптотагмином I, который обладает такими свойствами [Т.С. Sudhof, 2004].

Механизмы увеличения асинхронного экзоцитоза и спонтанной секреции медиатора при ритмическом раздражении в растворах с ионами Ва остаются неизвестными и требуют дальнейшего изучения. Можно высказать несколько предположений на этот счет. Возможно, существует отдельный сайт асинхронного освобождения медиатора, активируемый только ионами Ва. Не исключено, что вследствие резко замедленной способности нервной клетки выводить и утилизировать ионы Ва по сравнению с ионами Са и Sr [Е. Neves et al., 2001], внутриклеточная концентрация Ва при высокочастотной активности резко увеличивается, что может приводить к формированию Ва- макродомена и активации низкопорогового сайта асинхронного освобождения, либо «ломке» обычных механизмов экзоцитоза СВ с переводом сайта синхронного освобождения в асинхронный.

Оказалось, что независимо от способа экзоцитоза (спонтанною или вызванного) процесс эндоцитоза СВ запускается универсальным Са-зависимым механизмом, который активируется в области Са-микродомена и характеризуется чувствительностью к ионам Са, Sr и Ва, с наименьшей аффинностью к ионам Sr и не обладает чувствительностью к ионам Mg. Это отличает эндоцитоз от экзоцитоза, в осуществлении которого принимают участие несколько различных по своим свойствам Са- сенсоров. Са-зависимый сайт эндоцитоза, может быть представлен целой группой белков, участвующих в клатриновом эндоцитозе. Не исключено, что внутриклеточный кальций запускает процессы дефосфорилирования/фосфорилирования амфифизина, АР 180, динамина, Epsl5, эпсина, Р1Р5К, синаптоянина и др., которые осуществляются с участием Са-связывающих белков кальмодулина и кальциневрина [О. Shupliakov, 2008; MA. Cousin and P.J. Robinson, 2001; P. De Camilii, 2001].

Можно считать, что вход внеклеточных ионов Са с одной стороны, обеспечивает запуск спонтанного или вызванного экзоцитоза, а с другой - эндоцитоза СВ. Ионы Са могут служить необходимым фактором, поддерживающим сохранение соотношения процессов экзо- и эндоцитоза СВ.

ВЫВОДЫ:

1.) Гиперкалиевые растворы (0.25-40 мМ), кофеин (1-6 мМ), сахароза (30-100 мМ) вызывают дозозависимое увеличение частоты МТКП. Деполяризация мембраны постоянным током вызывает увеличение частота МТКП, определяемой значением силы тока. Частота МТКП примерно одинакова при действии ионов калия в концентрации 40 мМ или постоянного тока силой 4мА, а также при добавлении кофеина (5 мМ) или сахарозы (ЗОмМ).

2.) Выдерживание препарата в гиперкалиевом растворе (40 мМ), также как и в растворе с кофеином (5 мМ) или воздействие постоянного деполяризующего тока силой 4 мА в течение 5 мин в присутствии FM1-43 приводят к загрузке эндоцитозного красителя FM 1-43 в НО (появляются светящиеся пятна). Выдерживание предварительно окрашенного препарата в гииеркалиевом растворе (40 мМ), растворе с кофеином (5 мМ) или воздействие постоянного деполяризующего тока силой 4 мА в течение 15 мин приводят к выгрузке эндоцитозного красителя из НО (светящиеся пятна исчезают, интенсивность свечения падает).

3.) При использовании гиперосмотичного раствора сахарозы (30 мМ) наблюдается отсутствие как загрузки, так и выгрузки FM 1-43.

4.) В гиперкалиевом растворе (40 мМ) как быстрый (ВАРТА-АМ), так и медленный (ЕСТА-АМ) внутриклеточные Са-буферы приводят к одинаковому снижению частоты МТКП. Снижение квантового состава ПКП при высокочастотном раздражении отмечается при использовании обоих буферов, но эффект быстрого буфера более выражен.

5.) В гиперкалиевом растворе или при ритмическом раздражении загрузка РМ 1-43 при использовании ВАРТА-АМ не происходила, но имела место в случае ЕСТА-АМ. Выгрузка наблюдалась в опытах как с ВАРТА-АМ, так и с ЕвТА-АМ.

6.) Аппликация гиперкалиевого раствора, содержащего ионы Са, Б г, Ва или М§ приводила к примерно одинаковому увеличению спонтанной секреции (частоты МТКП). При высокочастотном раздражении примерно одинаковое количество квантов (180000) освобождалось за одну мин в Са- растворах, за 3 мин Эг- растворах и за 30 сск в Ва-растворах. Примерно 225000 квантов освобождалось за 1,5 мин в Са- растворах и 4 мин в Б г- растворах.

7.) Гиперкалиевый раствор (40 мМ), содержащий ионы Са, Эг, Ва или Mg, приводил к загрузке красителя только при использовании ионов Са, Бг или Ва. Выгрузка ИМ 1 -43 наблюдалась при использовании ионов Са, Бг, Ва или Мя.

8.) Высокочастотное раздражение в условиях одинакового экзоцитоза (около 180000 квантов) приводит к захвату красителя при использовании ионов Са или Ва. Загрузка в Бг-растворах возможна при увеличенном времени раздражения, но при этом остается более слабой, чем при использовании Са-растворов. Выгрузка красителя наблюдается при использовании как ионов Са, так и вг или Ва.

Сносок опубликованных работ по теме диссертации

1. Секреция медиатора в нервно-мышечном синапсе после длительного воздействия бескальциевых растворов / А.Л. Зефиров, Р.Д. Мухамедзянов, М.Г. Минлебаев и др. II Росс, физиол. журнал им. И.М. Сеченова. -2002. - Т. 88, №2. - С. 191-204.

2. Differences of spontaneous and evoked raonoquantal signals in the frog neuromuscular junction / L. Zefirov, A.I. Skorinkin, K.F.Hafizov, P.N. Grigoryev et al. II Neurophysiology. -2002. - V.34, №2/3. - P. 181-184.

3. Прижизненое флуоресцентное исследование двигательного нервного окончания лягушки с использованием эндоцитозного маркера FM 1-43 / А.Л. Зефиров, П.Н. Григорьев, A.M. Петров и др. // Цитология. - 2003. - Т.45, Х»12. - С. 34-40.

4. Григорьев П.Н. Неоднородность экзо-эндоцитозного цикла в нервно-мышечном синапсе лягушки / П.Н. Григорьев, М.М. Абдрахманов, М.А. Мухамедьяров // Материалы III конф. молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2004. - С. 384.

5. Зефиров, А.Л. «Kiss-and-run» механизм квантовой секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки / А. Л. Зефиров, М. М. Абдрахманов, П. Н. Григорьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2004. - Т. 137, N2. - С. 124-128.

6. Григорьев П.Н. Топография мест эндоцитоза синаптических везикул I П.Н. Григорьев, A.M. Петров, М.М. Абдрахманов И Вестник Российского государственного медицинского университета.. -2004. -Т.29, №34.-С. 177-178.

7. Grigoryev, Р. N. The calcium entry initiate the endocytosis processes at the frog neuromuscular junction / P. N. Grigoryev, M. M Abdrakhmanov // International workshop in cell physiology IBRO "Transport mechanisms across cell membranes: channel and pumps". - St.Petersburg, Russia, 2004. - P. 35.

8 Григорьев П.Н. Блок входа внеклеточного кальция прекращает эндоцитоз в нервно-мышечном синапсе лягушки. / П.Н. Григорьев, М.М. Абдрахманов / Материалы всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». Вестник молодых ученых, приложение к серии «Науки о жизни», Санкт-Петербург, 2005. - С. 29

9. Григорьев П Н. Роль внеклеточного кальция в процессах эндоцитоза. / П.Н. Григорьев, М М. Абдрахманов, А.Л. Зефиров / Тезисы докладов 9-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых - Пущине, 2005. - С. 111.

10. Grigoryev Р. N. The endocytosis processes at the frog neuromuscular junction are initiated by calcium ions / P. N. Grigoryev, M. M. Abdrakhmanov II The FEBS journal. -2005. -V. 272, Supplement I. - P. 236.

11. Зефиров, А. Л. Эффекты гиперкалиевых растворов и кофеина на процессы экзо-эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки. / А. Л. Зефиров, М. М. Абдрахманов, II. Н. Григорьев // Рос. Физиол. Журнал им. И.М. Сеченова -2005 - Т. 91, К» 7 - С. 821-831.

12. Внутриклеточный кальций и механизмы эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки. / А. Л. Зефиров, М. М. Абдрахманов, П. Н. Григорьев, А. М. Петров // Цитология. - 2006. - Т.48, №1 - С. 34-41.

13. P.N. Grigoryev Calcium influx is nesessary for retrieval of synaptic vesicles at neuromuscular junction of the frog. / P.N. Grigoryev, M.M Abdrakhmanov II Abstract book of 5th Forum of European Neuroscience, Vienna, Austria, 2006. - P. 468.

14. The role of extracellular calcium in exo- and endocytosis of synaptic vesicles at the frog motor nerve terminal / Zefirov AL, Abdrakhmanov MM, Mukhamedyarov MA, Grigoryev P.N. II Neuroscience - 2006.- V. 143, №4. - P. 905-910.

15. Григорьев П.Н. Внутриклеточный кальций-связывающий сайт эндоцитоза / П.Н. Григорьев, А.Л. Зефиров // Сборник тезизов XX Съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова, Москва, 2007. - С. 202.

16. Григорьев П.Н. Высокоафшпгый кальций-чувствительный сайт эндоцитоза. / П.Н. Григорьев, А.Л. Зефиров // Сборник тезисов международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". Пущино, 2007. - С. 119-121.

17. Григорьев П.Н. Нарушение соотношения процессов экзоцитоза и эндоцитоза при блокаде входа внеклеточных ионов кальция в двигательном нервном окончании лягушки //Неврологический вестник. -2007. - Т. 39, Jfel. - С. 96.

18. Grigoryev P.N. The role of calcium influx in retrieval of synaptic vesicles at the neuromuscular junction of the frog / P.N. Grigoryev, A.L. Zefirov II Abstract book of PENS-Blackwell Summer School 2007 "Advanced Course in Neuroplasticity" Rome, Italy. 2007. - P. 38.

19. Григорьев П.Н. Афинность внутриклеточного сайта эндоцитоза к двухвалентным катионам / Григорьев П.Н., Зефиров А.Л. // Сборник тезисов докладов VI Сибирского физиологического съезда. Барнаул, 2008. -Т.2. - С. 19-20.

Отпечатано в типографии "Первый печатный двор" Г. Казань, ул. Университетская 11, оф. 2 Подписано в печать 01.11.200S г. Заказ №0026. Тираж 100 экз. Форм. Еум. 60x80.1/8. Усл. пл. 1,0. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Григорьев, Павел Николаевич

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цель и задачи исследования.

Объект исследования.

Методы исследования.

Научная новизна полученных результатов.

Теоретическая значимость полученных результатов.

Положения, выносимые на защиту.

Личный вклад соискателя.

Внедрение результатов работы.

Сведения об апробации результатов диссертации.

Структура диссертации, ее объем.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура нервно-мышечного синапса.

1.1.1. Пресинаптическая область.

1.1.1.1. Активные зоны.

1.1.1.2. Синаптические везикулы.

1.1.2. Постсинаптическая область.

1.2. Механизм секреции нейромедиатора.

1.2.1. Квантово-везикулярная гипотеза секреции медиатора.

1.2.2. Работа активной зоны и везикулярные пулы.

1.2.2.1. Докирование везикул.

1.2.2.3. Механизмы секреции медиатора, значение 8КАЛЕ-комплекса25 1.2.2.4 Пресинаптические кальциевые сигналы. Гипотеза кальциевых микро- и макродоменов.

1.3. Механизмы эндоцитоза синаптических везикул.

1.3.1. Функционирование клатринового покрытия.

1.3.2 Молекулярная «машина» эндоцитоза.

1.3.2. Связывание клатрина с мембраной.

1.3.3. Отделение везикулы от пресинаптической мембраны.

1.3.4. Освобождение поверхности везикулы от клатринового покрытия.

1.3.5. Постэндоцитозный везикулярный транспорт.

1.3.6. Кинетика эндоцитоза.

1.3.7. Регуляция эндоцитоза.

1.3.8. Время везикулярного цикла.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования и растворы.

2.2. Электрофизиология.

2.2.1. Внутриклеточная регистрация, миниатюрных потенциалов концевой пластинки, токов концевой пластинки и мембранного потенциала.

2.2.2. Внеклеточная регистрация миниатюрных токов концевой пластинки и токов концевой пластинки.

2.2.3. Количественная оценка квантового состава при длительном высокочастотном раздражении в растворах с ионами Са и Бг, а также при использовании ВАРТА-АМ и ЕСТА-АМ.

2.2.4. Количественная оценка асинхронной квантовой секреции медиатора при высокочастотном раздражении в растворах с ионами Ва.

2.3. Оптический метод исследования экзо-эндоцитозного цикла с использованием маркера БМ 1-43.

2.4. Статистическая обработка экспериментальных данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Оценка значения ионов Са в обеспечении сохранения соотношения процессов экзо- и эндоцитоза при различных способах стимуляции секреции медиатора.

3.1.1. Влияние калиевой деполяризации на спонтанную секрецию медиатора

3.1.2. Влияние деполяризации мембраны постоянным током на спонтанную секрецию медиатора.

3.1.3. Спонтанная секреция медиатора при действии кофеина.

3.1.4. Спонтанная секреция медиатора при экспозиции гиперосмотических растворов.

3.1.5. Вызванная синхронная секреция медиатора в процессе высокочастотного раздражения.

3.1.6. Влияние калиевой деполяризации на процессы экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул.

3.1.7. Влияние деполяризации мембраны постоянным током на процессы экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул.

3.1.8. Экзо- и эндоцитоз синаптических везикул при действии кофеина

3.1.9. Эндоцитоз синаптических везикул при экспозиции гиперосмотических растворов.

3.1.10. Эндоцитоз и экзоцитоз синаптических везикул при высокочастотном раздражении.

3.1.11. Эндоцитоз и экзоцитоз синаптических везикул в условиях блокады потенциалзависимых кальциевых каналов ионами Cd. Вход ионов Са как фактор, обеспечивающий сохранение соотношения процессов экзо- и эндоцитоза.

3.2. Оценка топографии внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул.

3.2.1. Влияние внутриклеточных Са-буферов (EGTA-AM) и (ВАРТА-АМ) на спонтанную секрецию медиатора при действии гиперкалиевого раствора и фазную секрецию медиатора при высокочастотной ритмической активности

3.2.2. Внутриклеточные Са-буферы (EGTA-AM) и (ВАРТА-АМ) и процессы экзоцитоза синаптических везикул.

3.2.3. Внутриклеточные Са-буферы (ЕОТА-АМ) и (ВАРТА-АМ) и процессы эндоцитоза синаптических везикул. Топография кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул.

3.3. Оценка чувствительности внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул к катионам Са , Бг, ВаиМё.'.

3.3.1. Ионы Са , Бг, Ва и одинаково стимулируют асинхронную, спонтанную секрецию медиатора при действии гиперкалиевого раствора

3.3.2. Ионы Са и Бг, но не поддерживают синхронную секрецию медиатора при высокочастотной ритмической активности.

3.3.3. Ионы Ва не поддерживают синхронную, но стимулируют асинхронную секрецию медиатора при высокочастотном раздражении.

3.3.4. Ионы Са, Бг, Ва и стимулируют полный экзоцитоз синаптических везикул.

3.3.5. Ионы Са и Ва одинаково эффективны в стимуляции эндоцитоза синаптических везикул. Ионы Бг менее эффективны, а ионы не поддерживают эндоцитоз при стимуляции везикулярного цикла гиперкалиевым раствором.

3.3.6. Ионы Са и Ва одинаково эффективны в стимуляции эндоцитоза синаптических везикул. Ионы Эг менее эффективны, а ионы М^ не поддерживают эндоцитоз при стимуляции везикулярного цикла высокочастотным раздражением.

3.3.7. Экзоцитоз и эндоцитоз синаптических везикул в растворах с ионами щелочноземельных металлов. Возможные кандидаты на роль Са-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства и топография внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании"

Везикулярный цикл представляет собой уникальный механизм, благодаря которому происходит повторное использование синаптических везикул (СВ) в процессах секреции медиатора из нервных окончаний (НО) химического синапса. Основными этапами везикулярного цикла являются: экзоцитоз, сопровождающийся секрецией кванта медиатора в синаптическую щель и эндоцитоз, завершающийся образованием новой везикулы [202; 2; 114]. Выделяют следующие механизмы экзоцитоза: полный экзоцитоз, для которого характерно слияние мембраны везикулы с пресинаптической мембраной, и частичный экзоцитоз, по типу 1а88-апс1-гип, при котором происходит образование временной поры между содержимым СВ и синаптической щелью [166]. Процессы экзоцитоза и эндоцитоза оказываются тесно сцепленными, однако механизмы, обеспечивающие данное явление, не раскрыты. Среди факторов, способных нарушить соотношение процессов экзо- и эндоцитоз факторов, можно отметить отсутствие во внеклеточном растворе двухвалентных катионов [235].

Для изучения цикла СВ широко используются электрофизиологический и оптический подходы [116]. Комбинация двух подходов в экспериментах по изучению эндоцитоза является необходимой, т.к. изменения эндоцитоза при каких-либо воздействиях могут быть связаны с их эффектами на экзоцитоз. Поэтому обычно предварительно используются электрофизиологические методы, которые позволяют количественно оценивать секрецию медиатора и косвенно судить об экзоцитозе СВ. Далее применяется флуоресцентный метод, например, с использованием красителя БМ 1-43, который, при эндоцитозе захватывается во вновь образующиеся везикулы и «загружается» в НО. Использование этого метода при соблюдении условия одинаковой секреции медиатора позволяет судить об интенсивности процессов эндоцитоза, а также оценивать тип экзоцитоза -полный или 1а88-апс1-гип [53; 123].

В инициации процессов экзоцитоза решающую роль отводят внутриклеточным ионам Са, которые поступают в НО через потенциал-зависимые Са-каналы пресинаптической мембраны и взаимодействуют со специфическими сайтами [48; 203; 17]. Многочисленные исследования показали, что в процессах слияния везикул и секреции медиатора задействованы разные Са-связывающие сайты экзоцитоза, отличающиеся по локализации, афинности к ионам Са и другим катионам щелочноземельных металлов (Бг, Ва). Активация этих сайтов лежит в основе различных видов секреции медиатора: 1) вызванной (фазной) - связанной с возникновением пресинаптического потенциала действия (ПД) и 2) спонтанной -возникающей в отсутствии ПД [63; 214; 144]. Топографию и афинность сайтов экзоцитоза удобно описывать двумя основными моделями. Модель Са-микродомена предлагает расположение низкоаффинного сайта экзоцитоза в непосредственной близости от Са-канала (десятки нм), который активируется короткоживущим облаком повышенной (сотни мкМ) концентрации кальция при открытии канала. Модель макродомена предполагает наличие высокоаффинного сайта на более удаленном расстоянии (сотни нм) от Са-канала. В этом случае активация экзоцитоза происходит при концентрации Са менее 10 мкМ, и связана с открытием нескольких (множества) близкорасположенных каналов [19; 143; 144]. Определить, по какой из моделей осуществляется активация сайта - Са-микродоменом или Са- макродоменом, позволяет использование быстрых и медленных внутриклеточных Са-хелаторов [143].

Значение ионов Са в процессах эндоцитоза не столь очевидно, выявлена как их инициирующая, так и ингибирующая роль в процессах рециклирования везикул [2; 55], и в то же время оспаривается необходимость участия ионов Са в данных процессах [241]. Топография и свойства Са-связывающих сайтов эндоцитоза не определены.

Ключевая роль процессов экзоцитоза и эндоцитоза в синаптических механизмах, недостаточность наших знаний о значении ионов Са в запуске, регуляции и поддержании соотношения процессов экзоцитоза и эндоцитоза, диктуют необходимость исследования расположения относительно Са-каналов пресинаптической мембраны и чувствительности к двухвалентным катионам Са-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза СВ.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования явилось изучение соотношения процессов экзо- и эндоцитоза СВ при различных способах стимуляции экзоцитоза, а также определение топографии и чувствительности Са-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза СВ к ионам Са, 8г, Ва и в двигательном нервном окончании лягушки.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

3) Исследовать влияние быстрого (ВАРТА-АМ) и медленного (ЕвТА-АМ) внутриклеточных кальциевых хелаторов на спонтанную и вызванную секрецию медиатора;

4) Для оценки топографии Са-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза исследовать влияние быстрого и медленного внутриклеточных кальциевых хелаторов на загрузку и выгрузку красителя БМ 1-43 при стимуляции спонтанной и вызванной секреции;

5) Оценить спонтанную и вызванную секрецию медиатора при замене внеклеточных ионов Са на ионы Sr, Ва, Mg.

Объект исследования

Методы исследования

Для получения результатов исследования были использованы следующие подходы: электрофизиологический подход (внутри- и внеклеточное отведение постсинаптических токов, регистрация мембранного потенциала) и оптический подход (конфокальная флуоресцентная микроскопия с использованием красителя FM 1-43); для обработки полученных результатов использовались математический анализ и статистический метод.

Научная новизна полученных результатов

Впервые показана активация Са-связывающего сайта спонтанной секреции не только ионами Са, Sr, Ва, но и ионами Mg. Впервые показано, что в двигательном нервном окончании лягушки экзоцитоз СВ может происходить по типу kiss-and-run. В работе получены данные, предполагающие наличие внутриклеточного Са-связывающего сайта эндоцитоза СВ в двигательном нервном окончании лягушки. Впервые установлено, что активация Са-связывающего сайта эндоцитоза при спонтанной и вызванной секреции медиатора осуществляется в области Са-микродомена, и данный сайт в нервном окончании обладает чувствительностью к ионам Ва и Бг. Са-связывающие сайты экзоцитоза и эндоцитоза СВ отличаются по топографии и свойствам.

Теоретическая значимость полученных результатов

Проведенное исследование имеет важное теоретическое значение. Работа позволяет более детально определить функциональные возможности химического синапса. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о механизмах, участвующих в осуществлении передачи информации между возбудимыми клетками. Более глубокое понимание механизмов, обеспечивающих процессы экзоцитоза и эндоцитоза, может быть использовано при объяснении процессов, происходящих в центральной нервной системе и лежащих в основе памяти, эмоций, поведения, научения и т.п; и позволяют в дальнейшем влиять на скорость везикулярного цикла, изменения которого могут лежать в основе возникновения и развития некоторых неврологических и психиатрических заболеваний. Учитывая тот факт, что механизмы эндоцитоза являются универсальными для всех видов клеток, результаты работы могут помочь в выяснении механизмов и поиска новых фармакологических препаратов, регулирующих также процессы фагоцитоза и пиноцитоза. В целом, изложенные экспериментальные данные расширяют представления о механизмах передачи информации в химическом синапсе.

Положения, выносимые на защиту

1) В двигательном нервном окончании лягушки существуют самостоятельные Са-связывающие сайты для экзоцитоза и эндоцитоза СВ, различные по своей природе. При раздельной их активации наблюдается разобщение процессов экзоцитоза и эндоцитоза.

2) Са-связывающий сайт эндоцитоза СВ расположен в непосредственной близости (десятки нанометров) от потенциалзависимого Са-канала.

3) Са-связывающий сайт эндоцитоза и Са-связывающие сайты спонтанного и вызванного экзоцитоза СВ в двигательном нервном окончании характеризуются различной чувствительностью к ионам Са, Бг, Ва,

Личный вклад соискателя

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, постановку задач, выбор методов исследования, проведение экспериментов, обработку экспериментальных данных и оформление публикаций. При участии соискателя впервые в России освоен метод флуоресцентной микроскопии с использованием красителя эндоцитоза БМ 1-43. Основные положения диссертации отражены в 19-ти научных работах, написанных автором, в том числе двух работ, опубликованных в ведущих зарубежных журналах, пяти работ, опубликованных в российских научных рецензируемых журналах, из них трех - согласно перечню изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для опубликования основных результатов диссертаций. Общий объем публикаций - 4.4 условно печатных листа, в т.ч. авторский вклад —1.8 условно печатных листа.

Внедрение результатов работы

Результаты проведенного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета, на кафедре физиологии человека и животных Казанского государственного университета и на кафедре анатомии и I физиологии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.

Сведения об апробации результатов диссертации

Основные результаты диссертационной работы доложены на конференциях и форумах: международном симпозиуме «Синаптогенез» (Вена, Австрия, 2003), 8-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), летней школе ГОЯО по сенсорный и интегративным нейронаукам (Москва, 2004), международной школе-конференции 1В1Ю по клеточной физиологии "Транспортные механизмы через клеточные мембраны" (Санкт-Петербург, 2004), 9-м БЕББ форуме молодых ученых (Визеград, Венгрия, 2005), 5-м Европейском форуме по нейронаукам (Вена, Австрия, 2006), XX Съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова, (Москва, 2007), летней школе РЕМ8-В1аск\уе11 с углубленным курсом по нейропластичности (Рим, Италия, 2007).

Структура диссертации, ее объем

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Григорьев, Павел Николаевич

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ

Гиперкалиевые растворы (0.25-40 мМ), кофеин (1-6 мМ), сахароза (30100 мМ) вызывают дозозависимое увеличение частоты МТКП. Деполяризация мембраны постоянным током вызывает увеличение частоты МТКП, определяемой значением силы тока. Частота МТКП примерно одинакова при действии ионов калия в концентрации 40 мМ или постоянного тока силой 4мА, а также при добавлении кофеина (5 мМ) или сахарозы (ЗОмМ).

Выдерживание препарата в гиперкалиевом растворе (40 мМ), также как и в растворе с кофеином (5 мМ) или воздействие постоянного деполяризующего тока силой 4 мА в течение 5 мин в присутствии FM1-43 приводит к загрузке эндоцитозного красителя FM 1-43 в НО (появляются светящиеся пятна). Выдерживание предварительно окрашенного препарата в гиперкалиевом растворе (40 мМ), растворе с кофеином (5 мМ) или воздействие постоянного деполяризующего тока силой 4 мА в течение 15 мин приводит к выгрузке эндоцитозного красителя из НО (светящиеся пятна исчезают, интенсивность свечения падает).

При использовании гиперосмотичного раствора сахарозы (30 мМ) наблюдается отсутствие как загрузки, так и выгрузки FM 1 -43. В гиперкалиевом растворе (40 мМ) как быстрый (ВАРТА-АМ), так и медленный (EGTA-AM) внутриклеточные Са-буферы приводят к одинаковому снижению частоты МТКП. Снижение квантового состава ПКП при высокочастотном раздражении отмечается при использовании обоих буферов, но эффект более выражен у быстрого буфера. В гиперкалиевом растворе или при ритмическом раздражении загрузка FM 1-43 при использовании ВАРТА-АМ не происходила, но имела место в случае EGTA-AM. Выгрузка наблюдалась в опытах как с ВАРТА-АМ, так и с EGTA-AM.

6.) Аппликация гиперкалиевого раствора, содержащего ионы Са, 8г, Ва или приводила к примерно одинаковому увеличению спонтанной секреции (частоты МТКП). При высокочастотном раздражении примерно одинаковое количество квантов (180000) освобождалось за одну мин в Са- растворах, за 3 мин Бг- растворах и за 30 сек в Ва-растворах. Примерно 225000 квантов освобождалось за 1,5 мин в Са-растворах и 4 мин в Бг- растворах.

7.) Гиперкалиевый раствор (40 мМ), содержащий ионы Са, Б г, Ва или приводил к загрузке красителя только при использовании ионов Са, 8г или Ва. Выгрузка РМ 1 -43 наблюдалась при использовании ионов Са, 8г, В а или М^.

8.) Высокочастотное раздражение в условиях одинакового экзоцитоза (около 180000 квантов) приводит к захвату красителя при использовании ионов Са или Ва. Загрузка в 8г-растворах возможна при увеличенном времени раздражения, но при этом остается более слабой, чем при использовании Са-растворов. Выгрузка красителя наблюдается при использовании как ионов Са, так и Бг или Ва.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В механизмах вызванного, синхронного экзоцитоза, по всей видимости, происходит активация высокопорогового сайта, которая осуществляется Са-микродоменом в области открытого Са- канала, на что указывают данные о различном влиянии быстрого и медленного кальциевого хелатора. Сайт фазного экзоцитоза оказался чувствителен только к ионам Са и Бг, с меньшей аффиностью к катионам Бг, и не чувствителен к ионам Ва и Вероятно, данный сайт представлен низкоаффинной изоформой, синаптотагмином I, который обладает такими свойствами [203].

Оказалось, что независимо от способа экзоцитоза (спонтанного или вызванного) процесс эндоцитоза запускается универсальным Са-зависимым механизмом, который активируется в области Са-микродомена и характеризуется чувствительностью к ионам Са, Бг и Ва, с наименьшей аффинностью к ионам Бг и не обладает чувствительностью к ионам М£. Это отличает эндоцитоз от экзоцитоза, в осуществлении которого принимают участие несколько различных по своим свойствам Са- сенсоров. Са-зависимый сайт эндоцитоза, может быть представлен целой группой белков, участвующих к клатриновом эндоцитозе. Не исключено, что внутриклеточный кальций запускает процессы дефосфорилирования/фосфорилирования амфифизина, API 80, динамина, Eps 15, эпсина, PIP5K, синаптоянина и др., которые осуществляются с участием Са-связывающих белков кальмодулина и кальциневрина [188; 56; 44].

Можно считать, что вход внеклеточных ионов Са с одной стороны, обеспечивает запуск спонтанного или вызванного экзоцитоза, а с другой -эндоцитоза синаптических везикул. Ионы Са могут служить необходимым фактором, поддерживающим сохранение соотношения процессов экзо- и эндоцитоза синаптических везикул.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Григорьев, Павел Николаевич, Казань

1. Балезина О. П. Роль внутриклеточных кальциевых каналов нервных терминалей в различиях секреции медиатора / О. П. Балезина // Успехи физиол. наук. 2002. - Т. 33, № 3. - С. 38-56.

2. Зефиров A. JL Везикулярный цикл в пресинаптическом нервном окончании /А.Л. Зефиров // Росс. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова -2007. Т. 93, № 5. - С. 544-562.

3. Зефиров А.Л. Выявление точек освобождения медиатора в двигательной нервной терминали / А.Л. Зефиров, Т.В. Бениш, Н.Ф. Фаткуллин // Нейрофизиология. 1990. - Т. 22, №3. - С. 309-318.

4. Прижизненное флуоресцентное исследование двигательного нервного окончания лягушки с использованием эндоцитозного маркера FM1-43. / Зефиров А.Л., Григорьев П.Н., Петров A.M. и др. // Цитология. 2003. -Т. 45, №12.-С. 34-40.

5. Зефиров А. Л. Молекулярные механизмы квантовой секреции медиатора в синапсе / А.Л. Зефиров, С.Ю. Черанов // Успехи физиол. наук. 2000. -Т. 31, № 3. - С. 3-22.

6. Кубасов И.В. Роль Na /K -АТФазы в пресинаптическом последействии экзогенного ацетилхолина // И.В. Кубасов, И.И, Кривой, Е.В, Лопатина. Биофизика и Биохимия. - 1997. - Т. 123, №5. - С. 531-534.

7. Семченко В. В. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты) / В.В, Семченко, С.С, Степанов, Н.Н. Боголепов. Омск: Омская областная типография, 2008. -408с.

8. Харакоз Д.П. О возможной физиологической роли фазового перехода «жижкое-твердое» в биологических мембранах / Д.П. Харакоз // Успехи биол. химии. 2001. - Т. 41. - С. 333-364.

9. Alien intracellular calcium chelators attenuate neurotransmitter release at the squid giant synapse / E.M. Adler, G.J. Augustine, S.N. Duffy, M.P. Charlton //J. Neurosci.- 1991,-V. 11, N6. P. 1496-1507.

10. Angelson J.K. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction / J.K. Angleson, W.J. Betz // J Neurophysiol. -2001. V. 85.-P. 287-94.

11. Regulation of dense core release from neuroendocrine cells revealed by imaging single exocytic events / Angleson J.K., Cochilla A.J., Kilic G., at. al. // Nat. Neurosci. 1999. - V. 2. - P.440-446.

12. Artalejo C. R. Calmodulin is the divalent cation receptor for rapid endocytosis, but not exocytosis, in adrenal chromaffin cells / C. R. Artalejo, A. Elhamdani, H. C. Palfrey //Neuron. 1996. - V. 16. - P. 195-205.

13. Rapid endocytosis coupled to exocytosis in adrenal chromaffin cells involves Ca, GTP, and dynamin but not clathrin / C.R. Artalejo, J.R. Henley, M.C. McNiven, H.C. Palfrey // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 8328-8332.

14. Atwood H.L. Diversification of synaptic strength: presynaptic elements / H.L. Atwood, S. Karunanithi // Nat Rev Neurosci. 2002. - V. 3. - P. 497-516.

15. Augustine G.J. How does calcium trigger neurotransmitter release? / G. J. Augustine // Curr Opin Neurobiol. 2001. - V. 11. - P. 320-326.

16. Augustine G.J. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals / G.J. Augustine, E.M. Adler, M.P. Charlton // Ann N Y Acad Sci.-1991.-V. 635.-P. 365-81.

17. Augustine G.J. Local calcium signaling in neurons / G.J. Augustine, F. Santamaria, K. Tanaka // Neuron. 2003. - V. 40. - P. 331-346.

18. Muncl3-1 is essential for fusion competence of glutamatergic synaptic vesicles. / I. Augustin, C. Rosenmund, T.C. Sudhof, N. Brose // Nature. -1999.-V. 400.-P. 457-461.

19. Auld D.S. Perisynaptic Schwann cells at the neuromuscular junction: nerve-and activity-dependent contributions to synaptic efficacy, plasticity, and reinnervation / D.S. Auld, R. Robitaille // The Neuroscientist. 2003. - V. 9.- P.144-157.

20. Baez, L. M. Endocytosis adaptors: recruitment, coordinators and regulators / L.M. Baez, B. Wendeland // TRENDS Cell Biol. 2006. - V. 16. - P.505-513.

21. Modulation of the kinetics of evoked quantal release at mouse neuromuscular junctions by calcium and strontium / E.A. Bukharaeva, D. Samigullin, E.E. Nikolsky and L.G. Magazanik // Journal of Neurochem. 2007. V. 100. P. 939-949.

22. Bauerfeind, R. Molecular mechanisms in synaptic vesicle recycling / R. Bauerfeind, T. Galli, P. De Camilli // J.Neurocyt. 1996. - V. 25. - P. 701715.

23. Beccherer U. Effects of staurosporine on exocytosis and endocytosis at frog motor nerve terminal / U. Becherer, C. Guatimosim, W.J. Betz // J. Neurosci.- 2001.-V. 21.-P. 782-787.

24. Becherer U. Vesicle pools, docking, priming and release / U. Becherer, J. Rettig // Cell Tissue Res. 2006. - V. 326. - P.393-407.

25. Benmerah A. The ear of alpha-adaptin interacts with the COOH-terminal domain of the Eps 15 protein / A. Benmerah, B. Begue, A. Dautry-Varsat // J.Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 111-116.

26. Bernstein B.W. Actin disassembles during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons / B.W. Bernstein, M. DeWit, J.R. Bamburg // Brain Res. 1998 - V.53 - P. 236-250.

27. Betz W. J. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction / W. J. Betz, G. S. Bewick // J. Physiol. 1993. - V. 460. - P. 287-309.

28. Betz W.J. Okadaic acid disrupt clusters of synaptic vesicles in frog motor nerve terminals / W.J. Betz, A.W. Henkel // J. Cell. Biol. 1994. V. 124. - P. 843-854.

29. Betz W.J. Imaging exocytosis and endocytosis / W.J. Betz, F. Mao, C.S. Smith // Curr. Opin. Neurobiol. 1999. - V. 6. - P. 365-371.

30. Calcium dependence of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse / D. Beutner, T. Voets, E. Neher, T. Moser // Neuron. -2001,-V. 29.-P. 681-690.

31. Birks R. The fine structure of neuromuscular junction / R. Birks, H.E. Huxley, B. Katz // J.Physiol. Lond. 1960. - V. 150. - P. 134-144.

32. Bollmann J. Calcium sensitivity of glutamate release in a calyx-type terminal / J. Bollmann, B. Sakmann, J. Borst / Science. 2000. - V.289. - P. 953-957.

33. Borst J.G. Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse / J.G. Borst, B. Sakmann //Nature. 1996. -V. 383. - P. 431-434.

34. Boyd J.A. Spontaneous subthreshold activity at mammalian neuromuscular junction / J.A. Boyd, A.R. Martin// J. Physiol. 1956. - V. 132. - P.61-73.

35. Syntaxin and synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila / K. Broadie, A. Prokop, H.J. Bellen et al. // Neuron. 1995. - V. 15.-P. 663-673.

36. Brodin L. Actin-dependent steps the synaptic vesicle recycling / L. Brodin // Biochimic. 1999. - V. 81. - P.49.

37. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles / F.M. Brodsky, C.Y. Chen, C. Knuehl et al. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. -2001,-V. 17. P.517-568.

38. Burgoyne R. D. Splitting the quantum: regulation of quantum release during vesicle fusion / R. D. Burgoyne, J. W. Barclay // Trends in Neurosci. 2002. -V. 25, N4.-P. 176-178.

39. Calacos N. Vesicle-associated membrane protein and synaptophysin are associated on the synaptic vesicle / N. Calacos, R. H. Scheller // J.Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 24534-24537.

40. The structure of synapses / P. De Camilli, V. Haucke, K. Takei, E. Mugnaini // Synapses. Baltimore, 2001. - P. 89-133.

41. Ceccarelli B. Freeze-fracture studies of frog neuromuscular junction during intense release of neurotransmitter / B. Ceccarelli, F. Grohovaz, W.P. Hurlbut //J. Cell Biol. 1979,-V. 81.-P. 163-192.

42. Ceccarelli B. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction / B. Ceccarelli, W.P. Hurlbut, A.J. Mauro // Cell. Biol. 1973. - V. 57. - P. 499-524.

43. Chapman E. R. Synaptotagmin: a Ca2+ sensor that triggers exocytosis? / E. R. Chapman // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. - V. 3. - P. 498-508.

44. Chapman E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release? / E. R. Chapman // Annu. Rev. Biochem. 2008. - V. 77 - P. 615-641.

45. Chieregatti, E. SNAP25 and synaptotagmin 1 function in Ca2+-dependent reversible docking of granules to the plasma membrane / E. Chieregatti, J.W. Witkin, G. Baldini // Traffic. 2002. - V. 3. - P. 496-511.

46. Conner D.S. Regulation portals of entry into cell / D.S. Conner, S.L. Sclimid // Nature. 2003. - V. 422. - P. 37-44.

47. Conner D.S. Differential requirements for AP-2 in clathrin-mediated endocytosis / D.S. Conner, S. L. Schmid // J. Cell Biol. 2003. - V. 162, № 5. -P. 773-779.

48. Conner S. D. Identification of an adaptor-associated kinase, AAK1, as a regulator of clathrin-mediated endocytosis / S. D. Conner, S. L. Schmid // J.Cell Biol. V. 156. - P. 921-29.

49. Cousin M.A. Use of FMI-43 and other derivatives to investigate neuronal function. / M.A. Cousin // Curr Protoc Neurosci. 2008. - V. 22. - P. 55-67.

50. Cousin M.A. Synaptic vesicle resycling in cultured cerebellar granule cells role of vesicular acidification and refilling. / M.A. Cousin, D.G. Nicholls // J Neurochem. 1997. - V. 68. - P. 1927-1935.

51. Cousin M.A. Mechanisms of synaptic vesicle recycling illuminated by fluorescent dyes / M.A. Cousin, P.J. Robinson // J. Neurochem. 1999. - V. 73. - P. 2227-2239.

52. Cousin M.A. The dephosphins: dephosphorylation by calcineurin triggers synaptic vesicle endocytosis / M.A. Cousin, P.J. Robinson // Trends Neurosci. -2001.-V. 24. P.659-665.

53. Couteaux D. E. M. Vesicules synaptiques et poches au niveau des «zones actives» de la jonction neuromusculare / D.E.M. Couteaux, M. Pecot-Dechavassine // C. R. Acad. Sei. 1970. - V. 74. - P. 411-416.

54. Cowan W.M. Synapses / W.M. Cowan, T.C. Sudhof, C.F. Stevens // Baltimore. John Hopkins, 2001. 1047P.

55. Cremona O. Phosphoinositides in membrane traffic at the synapse / O. Cremona, P.J. DeCamilli //J. Cell Sei. 2001. - V. 114,№ 6. - P. 1041-1052.

56. Damke H. Induction of mutant dynamin specifically blocks endocytotic coated vesicle formation / H. Damke, T. Baba, D. E. Warnock, S. L. Schmid // J. Cell Biol. 1994. - V. 127. - P. 915-934.

57. Structure and Asn-Pro-Phe binding pocket of the Epsl5 homology domain -T. DeBeer., R.E. Carter, K.E. Lobel-Rice et. al. // Science. 1998. - V. 281. -P. 1357-1360.

58. DeBello W. M. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release / W. M. DeBello, V. O'Connor, T. Dresbach // Nature. 1995. - V. 373. - P. 626-630.

59. Del Castillo J. Quantal components of the end-plate potential / J. Del Castillo, B. Katz // J. Physiol. (Gr. Brit.). 1954. - V. 124. - P. 560-573.

60. DiGregorio D.A. Measurement of Action Potential-Induced Presynaptic Calcium Domains at a Cultured Neuromuscular Junction / D.A. DiGregorio, A. Peskoff, J.L. Vergara // J. Neurosci. 1999. V. 19. - P. 7846-7859

61. Dodge F.A. Co-operative action a calcium ions in transmitter release at the neuromuscular junction / F.A. Dodge, R. Rahamimoff // J Physiol. 1967. -V. 193. - P. 419-432.

62. The presynaptic cytomatrix of brain synapses / T. Dresbach, B. Qualmann, M.M. Kessels et al. / Cell Mol. Life Sci. 2001.-V. 58.-P. 94-116.

63. Ultrastructure of the «active zone» in the frog neuromuscular junction / F. Dreyer, K. Peper, K. Akert et al. // Brain Res. 1973. - V. 62. - P. 373-380.

64. Dunaevsky A. F-actin is concentrated in nonrelease domains at frog neuromuscular junctions / A. Dunaevsky, E.A. Connor // J. Neurosci. 2000. -V. 20.-P. 6007-6012.

65. Eccles J. C. The physiology of synapses / J. C. Eccles // Springer-Verlag Berlin Gottingen, 1963. P. 396.

66. Elmqvist D. A quantitative study of endplate potentials in isolated human muscle / D. Elmqvist, D.M. Quastel // J. Physiol. 1965. - V. 178. - P. 505529.

67. The actin-binding protein HiplR associates with clathrin during early stages of endocytosis and promotes clathrin assembly in vitro / A.E. Engqvist-Goldstein, R.A. Warren, M.M. Kessels, et al. // J.Cell Biol. 2001. - V. 154. -P. 1209-1223.

68. A putative role for intramolecular regulatory mechanisms in the adaptor function of amphiphysin in endocytosis / K. Farsad, V. Slepnev, G. Ochoa et al. // Neuropharmacol. 2003. -V. 45. - P. 787-796.

69. Fatt P. Some observations on biological noise / P. Fatt, B. Katz // Nature. -1950. -V. 166.-P. 597-598.

70. Fernandez-Chacon R. Genetics of synaptic vesicle friction: toward the complete functional anatomy of an organelle / R. Fernandez-Chacon, T.C. Sudhof // Annu. Rev. Physiol. 1999. - V. 61. - P. 753-776.

71. Curvature of clathrincoated pits driven by epsin / M. G. Ford, I.G. Mills, J.B. Peter et al. //Nature. 2002. - V. 419. - P. 361-366.

72. Fukuda M. Regulation by bivalent cations of phospholipid binding to the C2A domain of synaptotagmin III / M. Fukuda, T. Kojima, K. Mikoshida // Biochem. J. 1997. - V. 323. - P. 421-425.

73. Dissociation between Ca triggered synaptic vesicle exocytosis and clathrin-mediated endocytosis at a central synapse / H. Gad., P. Low, E. Zotova et al. // Neuron. 1998,-V. 21.-P. 607-616.

74. Fission and uncoating of synaptic clathrin-coated vesicles are pertrurbed by disruption of interactions with the SH3 domain of endophilin / H. Gad, N. Ringstad, P. Low et al. // Neuron. 2000. - V. 27. - P. 301-312.

75. Gaidarov I. Phosphoinositide-AP-2 interactions required for targeting to plasma membrane clathrin-coated pits /1. Gaidarov, J. H. Keen // J. Cell Biol. 1999,-V. 146.-P. 755-764.

76. Gallop J.L. Endophilin and CtBP/BARS are not acyl transferases in endocytosis or Goldgi fission / J.L. Gallop, P.J. Blutler, T. McMalion // Nature. 2005. - V. 438. - P. 675-678.81. Synaptotagmin I: a major

77. Ca2+ sensor for transmitter release at a central synapse / M. Geppert, Y. Goda, E. R. Hammer et al. // Cell. 1994. - V. 79. -P. 717-727.

78. The small GTP-binding protein Rab3A regulates a late step in synaptic vesicle fusion / M. Geppert, Y. Goda, C.F. Stevens, T.C. Sudhof// Nature. 1997. -V. 387.-P. 810-814.

79. Gandhi S.P. Three modes of synaptic vesicular recycling revealed by single-vesicle imaging / S.P. Gandhi, C.F. Stevens // Nature. 2003. - V. 423. - P. 607-613.

80. Modeling of quantal neurotransmitter release kinetics in the presence of fixed and mobile calcium buffers / I.R. Gilmanov, D.V. Samigullin, F. Vyskocil et al. // J Comput Neurosci. 2008. - V. 25, №2. P. 296-307.

81. Glavinovic M. I. Changes in miniature end-plate currents due to high potassium and calcium at the frog neuromuscular junction / M. I. Glavinovic // Synapse. 1988. - V. 2. - P. 636-643.

82. Goodman O.B. The alpha chain of the AP-2 adaptor is a clathrin binding subunit / O. B. Goodman, J. H. Keen // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 768-773.

83. A dynamin-3 spliced variant modulates the acrin/cortactin-dependent morphogenesis of dendritic spines / N.W. Gray, A.E. Kruchten, J. Cheng, M.A. McNiven // J. Cell Sci. 2005. - V. 118. - P. 1279-1290.

84. A toxin from the spider Phoneutria nigriventer that blocks calcium channels coupled to exocytosis / C. Guatimosium, M.A. Romano-Silva, J.S. Cruz, et al. Br. J. Pharmacol. 1997. - V. 122. - P. 591-597.

85. Recycling of synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction in the presence of strontium / C. Guatimosim, M.A. Romano-Silva, M.V. Gomez, M.A. Prado // J Neurochem. 1998. - V. 70. - P. 2477-2483.

86. SAC 1-like domains of yeast SAC1, INP52, and INP53 and of human synaptojanin encode polyphosphoinositide phosphatases / S. Guo, L.E. Stolz, S.M. Lemrow, J.D. York // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - P. 990-995.

87. Haar E.T. Peptide-in-groove interactions link target proteins to the betapropeller of clathrin / E.T. Haar, S.C. Harrison, T. Kirchhausen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P.1096-1100.

88. Transmembrane segments of syntaxin line the fusion pore of Ca2+-triggered exocytosis / X. Han, C.T. Wang, J. Bai et al. // Science. 2004. - V. 304. - P. 289-292.

89. API80 and AP-2 interact directly in a complex that cooperatively assembles clathrin / W. Hao, Z. Luo, L. Zheng et al. // J.Biol. Chem. 1999. - V. 274. -P. 785-794.

90. The architecture of active zone material at the frog's neuromuscular junction / M. L. Harlow, D. Ress, A. Stoschek et. al. // Nature. 2001. - V. 409. - P. 479-484.

91. Hartl F.U. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein / F. U. Hartl, M. Hayer-Hartl // Science. 2002. - V. 295. - P. 18521858.

92. Haucke V. Phosohoinositide regulation of clathrin-mediated endocytosis / V. Haucke // Biochem. Soc. Tranactions. 2005. - V. 33, № 6. - P. 1285-1289.

93. Haucke V. AP-2 recruitment to synaptotagmin stimulated by tyrosine-based endocytic motifs / V. Haucke, P. De Camilli // Science. 1999. - V. 285. - P. 1268-1271.

94. Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal / R. Heidelberger, C. Heinemann, E. Neher, G. Matthews // Nature. 1994. - V. 371.-P. 513-515.

95. Heilker R. Recognition of sorting signals by clathrin adaptors / R. Heilker, M. Spiess, P. Crottet // BioEssays. 1999. - V. 21. - P. 558-567.

96. Herskovits J.S. Effects of mutant rat denamin on endocytosis. / J.S. Herskovits, C.C. Burgess, R.A. Obar, R.B. Vallee // J. Cell Biol. 1993. - V. 122.-P. 565-578.

97. Heuser J. Effect of lanthanum ions on function and structure of frog neuromuscular junctions / J. Heuser, R. Miledi // Proc. R. Soc. 1971. - V. 179.-P. 247-260.

98. Heuser J. E. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction / J. E. Heuser, T. S. Reese // J.Cell Biology. 1973. - V. 57. - P. 315-344.

99. Heuser J. E. Review of electron microscopic evidence favouring vesicle exocytosis as the structural basis of quantal release during synaptic transmission / J.E. Heuser // J. Exp. Physiol. 1989. - V.74. - P. 1051-1069.

100. The role of dynamin and its binding partners in coated pit invagination and scission / E. Hill, J. van Der Kaay, C.P. Downes, E. Smythe // J. Cell Biol. -2001.-V. 152.-P. 309-323.

101. Bending a membrane: How clathrin affects budding / L. Hinrichsen, A. Meyerholz, S. Goos, E.J. Ungewickell // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. -V. 103. - P. 8715-8720.

102. Hinshaw J. E. Dynamin selfassembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding / J. E. Hinshaw, S. L. Schmid // Nature. 1995. - V. 374. - P. 190-192.

103. Hirst J. Clathrin and adaptors / J. Hirst, M. S. Robinson // Biochim. Biophys. Acta.-1998.-V. 1404.-P. 173-193.

104. Hsu S.F. Adaptation of Ca2+-triggered exocytosis in presynaptic terminals / S.F. Hsu, G.J. Augustine, M.B. Jackson // Neuron. 1996. - V. 17. - P. 501512.

105. A post-docking role for synaptobrevin in synaptic vesicle fusion / J.M. Hunt, K. Bommert, M.P. Charlton et al. // Neuron. 1994. - V. 12. - P. 1269-1279.

106. Jahn R. Membrane fusion / R. Jahn, T. Lang, T.C. Sudhof// Cell. 2003. - V. 112.-P. 519-533.

107. Jessell T. M. A bidirectional and self-modifiable form of cell-cell communication / T. M. Jessell, E. R. Kandel // Cell. 1993. - V. 72. - P. 1-30.

108. Katz B. The statistical nature of the acetylcholine potential and its molecular components / B. Katz, R. Miledi // J. Physiol. 1972. - V. 224. - P. 665-699.

109. Katz B. The Release of Neurotransmitter Substances / B. Katz // Springfield, 1969.

110. Kavalali E.T. Multiple vesicle recycling pathways in central synapses and their impact on neurotransmission / E.T. Kavalali // J Physiol. 2007. - V. 585. - P. 669-679.

111. Kelly R. B. Storage and release of neurotransmitters / R. B. Kelly // Cell. -1993,-V. 72.-P. 43-53.

112. Klivotchev M. Pharmacology of neurotransmitter release: measuring exocytosis / M. Khvotchev, E.T. Kavalali // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. -V. 184. - P. 23-43.

113. Sustained stimulation of exocytosis triggers continuous membrane retrieval in rat pituitary somatotrophs / G. Kilic, J.K. Angleson, A.J. Cochilla et al. // J. Physiol. 2001. - V. 532. - P. 771-783.

114. Klingauf G. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses / J. Klingauf, E.T. Kavalali, R.W. Tsien // Nature. 1998. - V. 394. -P. 581-585.

115. Ko, C. P. Electophysiological and freeze-fracture studies of changes following denervation at frog neuromuscular junctions / C. P. Ko // J.Physiol. Lond. -1981,-V. 321.-P. 627-639.

116. Properties of exocytotic response in vertebrate photoreceptors / M. Kreft, D. Krizaj, S. Grilc, R. Zorec // J Neurophysiol. 2003. - V. 90. - P. 218-225.

117. Molecular mechanisms that control initiation and termination of physiological depolarization-evoked transmitter release / Y.M. Kupchik, G. Raslikovan, L. Ohana et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. - V. 105. - P. 4435-4440.

118. Kuromi H. Two distinct pools of synaptic vesicles in single presynaptic boutons in a temperature-sensitive Drosophila mutant, shibire / H. Kuromi, Y. Kidokoro//Neuron. 1998. - V. 20. - P. 917-925.

119. Lagnardo L. Continuous vesicle cycling in the synaptic terminal of retinal bipolar cell / L. Lagnardo, A. Gomis, C. Job // Neuron. 1996. - V. 17. - P. 957-967.

120. Lando L. Ca cooperativity in neurosecretion measured using photolabile Ca2+ chelators / L. Lando, R.S. Zucker // J Neurophysiol. 1994. - V. 72. - P. 825-830.

121. Legendre-Guillemin V. ENTH/ANTH proteins and clatlirin mediated membrane budding / V. Legendre-Guillemin, S. Wasiak, N.K. Hussain // J. Cell Sci.-2004.-V. 117.-P. 9-18.

122. Lichman J.W. Multiple innervation of tonic endplates revealed by activity-dependent uptake of fluorescent probes / J.W. Lichman, R.S. Wilkinson, M.M. Rich //Nature. 1985. - V. 314. - P. 357-359.

123. Lichman J.W. Properties of motor units in the transversus abdominis muscle of the garter snake / J.W. Lichman, R.S. Wilkinson // J Physiol (Lond). -1987,-V. 393.-P. 355-374.

124. Magazanik L.G. Blockade of ion channels as an approach to studying AMPA receptor subtypes / L.G. Magazanik // Neurosci Behav Physiol. 2000. - V. 30, №1,-P. 27-35.

125. Marks B. Calcium triggers calcineurin-dependent synaptic vesicle recycling in mammalian nerve terminals / B. Marks, H. T. McMahon // Curr. Biol. 1998. - V. 8. - P. 740-749.

126. GTPase activity of dynamin and resulting conformation change are essential for endocytosis / B. Marks, M.H. Stowell, Y. Vallis et al. // Nature. 2001. V. 410. -P. 231-35.

127. Martelli A.M. Rab3A and RAb3D control the total granule number and the fraction of granules docked at the plasma membrane in PC 12 cells / A.M. Martelli, G. Baldini, G. Tabellini // Traffic. 2000. - V. 1. - P. 976-986.

128. Martinez-Serrano A. Caffeine-sensitive calcium stores in presynaptic nerve endings: a physiological role / A. Martinez-Serrano, J. Satrustegui // Biochem. and Biophys. Research Communications. 1989. - V. 161, № 3. - P. 965-971.

129. A presynaptic inositol-5-phosphatase / P.S. McPherson, E.P. Garcia, V.I. Slepnev et. al. // Nature. 1996. - V. 379. - P. 353-357.

130. Miledi R. Electrophysiological and chemical determination of acethylholine release at the frog neuromuscular junction / R. Miledi, P.C. Molenaar, R.L. Polak // J. Physiol. 1983. - V. 334. - P. 245-254.

131. Morgan A. A role for soluble NSF attachement proteins (SNAPs) in regulated exocytosis in adrenal chromaffin cells / A. Morgan, R. D. Burgoyne // EMBO J. 1995. - V. 14. - P. 232-239.

132. Moser T. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse ot the mouse / T. Moser, D. Beutner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 883-888.

133. Clathrin-dependent endocytosis / S.A. Mousavi, L. Malerod, T. Berg, R. Kjeken // Biochem. J. 2004. - V. 377. - P. 1-16.

134. Muhlberg A. B. Domain structure and intramolecular regulation of dynamin GTPase / A. B. Muhlberg, D. E. Warnock, S. L. Schmid // EMBO J. 1997. -V. 16.-P. 6676-6683.

135. Mukherjee S. Endocytosis / S. Mukherjee, R.N. Ghosh, F.R. Maxfield // Physiol. Rev. 1997. - V. 77, №3. - P. 759-803.

136. Murthy N.V. Cell biology of the presynaptic terminal / N.V. Murthy, P. DeCamilli // Annu. Rev. Neurosci. 2003. - V. 26. -P.701-728.

137. Functional organization of clathrin in coats: combining electron cryomicroscopy and X-ray crystallography / A. Musacchio, C.J. Smith, A.M. Roseman et al. // Mol. Cell 1999. - V. 3. - P. 761-770.

138. Naves L. A. Repetitive nerve stimulation decrease the acetylcholine content of quanta at the frog neuromuscular junction / L. A.Naves, W. Van der Kloot // J. Physiol. 2001. - V. 532, N 3. - P. 637-647.I

139. Neher E. Vesicle pools and Ca microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release / E. Neher // Neuron. 1998. - V. 20. -P. 389-399.

140. Neher E. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release / E. Neher, T. Sakaba // Neuron. 2008. - V. 59. - P. 861-872.

141. Neves G. Calcium influx selects the fast mode of endocytosis in the synaptic terminal of retinal bipolar cells / G.Neves, A. Gomis., L. Lagnado // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98.-P. 15282-15287.

142. Neves G. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells / G. Neves, L. Lagnado // J. Physiol. 1999. V. 515.-P. 181-202.

143. Neves G. The actions of barium and strontium on exocytosis in the synaptic terminal of goldfish bipolar cells / Neves G., Neef A., Lagnado L. // J. Physiol. -2001. V. 535.-P. 809-824.

144. Newmyer S.L. Auxilin-dynamin interactions link the uncoating ATPase chaperone machinery with vesicle formation / S.L. Newmyer, A. Christensen, S. Sever // Dev. Cell. 2003. - V. 4, № 6. - P. 929-940.

145. Nicholls D. G. Proteins, transmitters and synapses / D. G. Nicholls // Oxfrod, 1994.-P. 253.

146. Nicholson-Tomishima K. Kinetic efficiency of endocytosis at mammalian CNS synapses requires synaptotagmin I / K. Nicholson-Tomishima, T.A. Ryan// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101.-P. 16648-16652.

147. UNC-11, a Caenorhabditis elegans AP180 homologue, regulates the size and protein composition of synaptic vesicles / M.L. Nonet, A.M. Holgado, F. Brewer et al. // Mol. Biol. Cell. 1999. - V. 10. - P. 2343-2360.

148. Nossal, R. Assembly of clathrin basket / R. Nossal // Macromolecular Symp. -2005,-V. 219.-P. 1-8.

149. Parnas H. Neurotransmitter release at fast synapses / Parnas H, Parnas I. // J Membr Biol. 1994. - V. 142, №3. - P. 267-279.

150. Molecular mechanisms that control initiation and termination of physiological depolarization-evoked transmitter release / Y.M. Kupchik, G. Rashkovan, L. Ohana // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. -V. 105, №11. - 4435-4440.

151. Pawson P.A. Quantitative freeze-fracture analysis of the frog neuromuscular junction synapse I II / P.A. Pawson, A.D. Grinnell, B. Wolowske // J. Neurocytol. - 1998. - V. 27. - P. 379-391.

152. Structure and ultrastructure of the frog motor end-plate / K. Peper, F. Dreyer, C. Sandri, K. Akert // Cell Tiss. Res. 1974. - V. 149. - P. 437-455.

153. Phillips G.R. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution and reconstitutions / G.R. Phillips // Neuron. 2001. - V. 32. - P. 63-67.

154. Poskanzer K.E. Discrete residues in the C2B domain of synaptotagmin I independently specify endocytic rate and synaptic vesicle size / K.E. Poskanzer, R.D. Fetter, G.W. Davis // Neuron. 2006. - V. 50. - P. 49-62.

155. Potter L. T. Synthesis, storage and release of C14 acetylcholine storage in cholinergic nerve terminals / L. T. Potter // J. Physiol. 1970. - V. 206. - P. 145-166.

156. Pumplin D. W. Are the presynaptic membrane particles the calcium channels? / D. W. Pumplin, T. S. Reese, R. Llinas // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. -V. 78.-P. 7210-7213.

157. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. / J.L. Pyle, E.T. Kavalali, E.S. Piedras-Renteria, R.W. Tsien //Neuron. 2000. - V. 28. - P. 221-231.

158. Richards D.A. Two endocytic recycling routes selectively fill two vesicle pools in frog motor nerve terminal / D.A. Richards, C. Guatimosim, W.J. Betz //Neuron. -2000. -V. 27.-P. 551-559.

159. Endophilin/SH3P4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis / N. Ringstad, H. Gad, P. Low et al. // Neuron. 1999. - V. 24. - P. 143-154.

160. Rizolli S.O. Synaptic vesicle pools / S.O. Rizzoli, W. J. Betz // Nat Rev Neurosci. 2005. - V. 6. - P. 57-69.

161. Rizolli S.O. Kiss-and-run, collapse and 'readily retrievable' vesicles / S.O. Rizzoli, R. Jahn // Traffic. 2007. - V. 8. - P. 1137-1144.

162. Implication of frequenin in the facilitation of transmitter release in Drosophila / R. Rivosecchi, O. Pongs, T. Theil, A. Mallart // J Physiol. 1994. - V. 474. - P. 223-232.

163. Roberts W.M. Localization of calcium signals by a mobile calcium buffer in frog saccular hair cells / W.M. Roberts // J. Neurosci. 1994. - V. 14. - P. 3246-3262.

164. Robertson J.D. The ultrastructure of reptilian myoneural junction / J.D. Robertson // Ann. Rev. Biochem. 1983. - V. 52. - P. 871-926.

165. Functional colocalization of calcium and calcium-gated potassium channels in control of transmitter release / R. Robitaille, M.L. Garcia, G. J. Kaczorowski, M.P. Charlton//Neuron. 1993. -V. 11. - P. 645-655.

166. Roos J. Is dynamin really a pinchase? / J. Roos, R.B. Kelly // Trends Cell. Biol. 1997. - V. 7. - P. 257-259.

167. Rosahl T.W. Essential functions of synapsins I and II in synaptic vesicle regulation / T.W. Rosahl, D. Spillane, M. Missler et.al. // Nature. 1995. - V. 375. - P. 488-493.

168. Ross-Canada G. Synaptic vesicles and nerve-muscle preparation is resinless section / G. Ross-Canada, R. P. Becker, G. Pappas // J.Neurocyt. 1983. - V. 12. - P. 817-830.

169. Rothmann J. E. Mechanisms of intracellular protein transport / J. E. Rothmann // Nature. 1994. - V. 372. - P. 55-63.

170. Rothman J.E. The machinery and principles of vesicle transport in the cell / J.E. Rothman// Nat. Med. 2002. - V. 8. - P. 1059-1062.

171. Royle S.J. Endocytosis at the synaptic terminal / S.J. Royle, L. Lagnado // J. Physiol. 2003. - V. 553. - P. 345-355.

172. Rose C.R. Stores not just for storage: intracellular calcium release and synaptic plasticity / C. R. Rose, A. Konnerth // Neuron. 2001. - V. 31. - P. 519-522.

173. Ryan, T. A. Endocytosis at nerve terminals: timing is everything / T. A. Ryan // Neuron. 1996. - Vol. 17. - P. 1035-1037.

174. Ryan T.A. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons / T.A. Ryan, H. Reuter., B. Wendland // Neuron. 1993. -V. 11.-P. 713-724.

175. Ryan T.A. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses / T.A. Ryan, S.J. Smith // Neuron. 1995. - V. 14. - P. 983-989.

176. Santini F. A glimpse of coated vesicle creation / F.A. Santini, J.H. Keen // Nat. Cell. Biol. 2002. - V. 4. - P. E230-E232.

177. The EH and SH3 domain Ese proteins regulate eridocytosis by linking to dynamin and Epsl5 / A.S. Sengar, W. Wang, J. Bishay et al. // EMBO J. -1999,-V. 18. P. 1159-1171.

178. Schneggenburger R. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion / R. Schneggenburger, E. Neher // Curr. Opin. Neurobiol. 2005. - V. 15. - P. 266-274.

179. RIMla forms a protein scaffold for regulating neurotransmitter release / S. Schoch, P.E. Castillo, T. Jo et al. // Nature. 2002. - V. 415. - P. 321-326.

180. A role for clathrin light chains in the recognition of clathrin cages by "uncoating ATPase" / S.L. Schmid, W.A. Braell, D.M. Schlossman, J.E. Rothman // Nature. 1984.—V. 311. - P. 228-231.

181. Endophilin I mediates synaptic vesicle formation by transfer of arachidonate to lysophosphatidic acid / A. Schmidt, M. Wolde, C. Thiele et al. // Nature. -1999.-V. 401.-P. 133-141.

182. Shupliakov O. The synaptic vesicle cluster: a source of endocytic proteins during neurotransmitter release / O. Shupliakov // J. Neurosci. 2008. - V. 28. - P. 5950-5963.

183. Silinsky E.M. Can barium support the release of acetylcholine by nerve impulses? / E.M. Silinsky // Br. J. Pharmac. 1977. - V. 59. - P. 215-217.

184. Silinsky E.M. On the role of barium in supporting the asynchronous release of acetylcholine quanta by motor nerve impulses / E.M. Silinsky // J. Physiol. -1978.-V. 274.-P. 157-171.

185. Role of phosphorylation in regulation of the assembly of endocytic coat complexes / V.I. Slepnev, G.C. Ochoa, M.H. Butler al. // Science. 1998. -V. 281.-P. 821-824.

186. Slepnev V.I. Accessory factors in clathrin-dependent synaptic vesicle endocytosis / V.I. Slepnev, P. De Camilli // Nat. Rev. Neurosci. 2000. - V. l.-P. 161-72.

187. Smith J. E. Coated vesicle morphology and sub-populations at the neuromusclular junction / J. E. Smith, D. O. Smith // Brain Res. 1984. - V. 299. - P. 383-388.

188. Smith C.B. Simultaneous independent measurement of endocytosis and exocytosis / Smith C.B., Betz W.J.//Nature. 1996. - V. 380. - P. 531-534.

189. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals /S.J. Smith, J. Buchanan, L.R. Osses et al. // J. Physiol. 1993. - V:^472. - P. 573593.

190. Sollner, T.A. Protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequental steps of synaptic vesicle docking, activation, and fusion / T.A. Sollner, M.K. Bennett, S.W. Whiteheart // Cell. 1993. - V. 75.- P.409-418.

191. Differential control of the re leasable vesicle pools by SNAP-25 splice variants and SNAP-23 / Sorensen J.B., Nagy G., Varoqueaux F. et. al.// Cell. 2003. -V. 114.-P. 75-86.

192. Stanley E.F. The calcium channel and the organization of the presynaptic transmitter release face / E.F. Stanley // Trends Neurosci. 1997. - V. 20. - P. 404-409.

193. Evidence for interaction of the fusion protein alpha-SNAP with membrane lipid / G.J. Steel, G. Bucheim, J.M. Edwardson, P.G. Woodman // Biochem.J.- 1997,-V. 325.-P. 511-518.

194. Stevens C.F. Neurotransmitter Release at Central Synapses / C.F. Stevens // Neuron. 2003. - V. 40. - P. 381-388.

195. Stevens C.F. «Kiss and run» exocytosis at hippocampal synapses / C.F. Stevens, J.H. Williams // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97, №12. -P. 828—833.

196. Sudhof T.C. Neurotransmitter release / T.C. Sudhof // Handb Exp Pharmacol. -2008,-V. 184.-P. 1-21.

197. Sudhof T.C. The synaptic vesicle cycle / T.C. Sudhof // Annu. Rev. Neurosci. -2004. -V. 27.-P. 509-547.

198. Sun J.-Y. Single and multiple vesicle fusion induce different rates of endocytosis at a central synapses / J.-Y. Sun, X.-S. Wu, L.-G. Wu // Nature. -2002.-V. 417.-P.555-559.

199. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal / S. Suzuki, M. Osanai, M.

200. Murase et al. // Pflugers Arch. 2000. - V. 440. - P. 351-365.• ♦ * * *

201. Synaptotagmins form a hierarchy of exocytotic Ca sensors with distinct Ca~ affinities / S. Sugita, O.H. Shin, W. Han et al. //EMBO J. 2002. - V. 21. - P. 270-280.

202. Tubular membrane invaginations coated by dynamin rings are induced by GTP-gamma S in nerve terminals / K. Takei, P.S. McPherson, S.L. Schmid, De P.Camilli//Nature. 1995. - V. 374. - P. 186-190.

203. Generation of coated intermediates of clathrin-mediated endocytosis on protein-free liposomes / K. Takei, V. Haucke, V. Slepnev, et al. // Cell. -1998.-V. 94.-P. 131-141.

204. Crystal structure of the alpha appendage of AP-2 reveals a recruitment platform for clathrin-coat assembly / L.M. Traub, M.A. Downs, J.L. Westrich, D.H. Fremont // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 8907-8912.

205. Tsien R.Y. A non-disruptive teclmique for loading calcium buffers and indicators into cells / R.Y. Tsien // Nature. 1981. - V. 290, № 5806. - P. 527-528.

206. Tsien R.Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures / R.Y. Tsien // Biochemistry. 1980. - V. 19, № 11. - P. 23962404.

207. Tsuboi T. The polybasic sequence in the C2B domain of rabphilin is required for vesicle docking step in PC 12 cells / T. Tsuboi, E. Kanno, M. Fukuda // J. Neurochem. 2007. - V. 100. - P.770-779.

208. Dissecting docking and tethering of secretory vesicles at the target membrane / R.F. Toonen, O. Kochubey, H. de Wit et al. // Embo J. 2006. - V. 25. - P. 3725-3737.

209. Van der Kloot, W. Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction / W. Van der Kloot, J. Molgo // Physiol. Rev. 1994. -V. 74.-P. 899-991.

210. Synaptojanin is recruited by endophilin to promote synaptic vesicle uncoating / P. Verstreken, T.W. Koh, K.L. Schulze et al. // Neuron. 2003. - V. 40. - P. 733-748.

211. VonGersdorf H. Inhibition of endocytosis by elevated internal calcium in a synaptic terminal / H. VonGersdorf, G. Matthews // Nature. 1994. - V. 370. -P. 652-655.

212. RIM: a purtative Rab3a-effector in regulating synaptic vesicle fusion / Y. Wang, M. Okamoto, F. Schmitz et al. // Nature. 1997. - V. 388. - P.593-598.

213. A family of RIM-binding proteins regulated by alternative splicing: implications for the genesis of synaptic active zones / Y. Wang, X. Liu, T. Biederer, T. C. Sudhof// Proc. Natl. Acad. Sei. 2002. - V. 99. - P. 1446414469.

214. Weimer M.R. Controversies in synaptic vesicle exocytosis / M.R. Weimer, E.M. Jorgensen//J. Cell Science. 2003. - V. 116. - P. 3661-3666.

215. Weraig, A. Quantum hypothesis of synaptic transmission / A. Wemig // J .Neural Transmission. Suppl. 1975. - V. 12. - P. 61-74.

216. Wood S.J. Safety factor at the neuromuscular junction / S. J. Wood, C. R. Slater // Prog Neurobiol. -2001. -V. 64. P. 393^29.

217. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis / P. Washboume, P.M. Thompson, M. Carta et. al. // Nat. Neurosci 2002. - V. 5. - P. 19-26.

218. Wenk M.R. Protein-lipid interactions and phosphoinositide metabolism in membrane traffic: insight from vesicle recycling in nerve terminals // M.R. Wenlc, P. DeCamilli // PNAS. 2004. - V. 101. - P.8262-8269.

219. Wu L.G. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction / L.G. Wu, W.J. Betz // Neuron. 1996. - V. 17. - P. 769-779.

220. Wu L.G. Kinetics of synaptic depression and vesicle recycling after tetanic stimulation of frog motor nerve terminals / L.G. Wu, W.J. Betz // J. Biophys. 1998. - V. 74. - P. 3003-3009.

221. Clathrin exchange during clathrin-mediated endocytosis / X. Wu, X. Zhao, L. Baylor et al. // J. Cell Biol. 2001. - V. 155. - P. 291-300.

222. Intersectin, a novel adaptor protein with two Epsl5 homology and five Src homology 3 domains / M. Yamabhai, N.G. Hoffman, N.L. Hardison et al. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 401-407.

223. Yamada W.M. Time course of transmitter release calculated from simulations of a calcium diffusion model / W.M. Yamada, R.S. Zucker // Biophys J. -1992,-V. 61, N3.-P. 671-682.

224. Yarar D. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stage of clathrin-mediated endocytosis / D. Yarar, C.M. Waterman-Storer, S.L. Schmid // Mol. Biol. Cell. 2005. - V. 16. - P.964-975.

225. Clathrin self-assembly is mediated by a tandemly repeated superhelix / J. A. Ybe, F.M. Brodsky, K. Hofmann et al. // Nature. 1999. - V. 399. - P.371 -375.

226. Ye W. Bacterially expressed F1-20/AP-3 assembles clathrin into cages with a narrow size distribution: implications for the regulation of quantal size duringneurotransmission / W. Ye, E. M. Lafer // J.Neurosci. 1995. - V. 41. - P. 15-26.

227. Yoshihara M. Is synaptotagmin the calcium sensor? M. Yoshihara, B. Adolfsen, J. T. Littleton // Curr Opin Neurobiol. 2003. - V. 13. - P. 315323.

228. Yoshihara M. Synaptotagmin I functions as a calcium sensor to synchronize neurotransmitter release / M. Yoshihara, J.T. Littleton // Neuron. 2002. - V. 36. - P. 897-908.

229. Young J.C. More than folding: localized functions of cytosolic chaperones / J.C. Young, J.M. Barrel, U. Hartl // TRENDS Biochem. Sci. 2003. - V. 28, № 10. - P.541-547.

230. The role of extracellular calcium in recycling of synaptic vesicles at the frog motor nerve terminals / A.L. Zefirov, M.M. Abdrakhmanov, M.A. Mukhamedyarov, P.N. Grigoryev // Neuroscience. 2006. - V. 143, № 4. - P. 905-910.

231. Localization of active zones / A. L. Zefirov, T. Benish, N. Fatkullin et al. // Nature. 1995. - V. 376. - P. 393-394.

232. Zenisek D. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. / D.Zenisek, J.A. Stever, W. Aimers // Nature. 2000. - V. 406. - P. 849-854.

233. Zhai R.G. The Architecture of the Active Zone in Preynaptic Nerve Terminal. / R.G. Zhai, H.J. Bellen // J. Physiology. 2004. - V. 19. - P. 262-270.

234. Zimmerberg J. How proteins produce cellular membrane curvative / J. Zimmerberg, M.M. Kozlov // Nature rev. 2006. - V. 7. - P. 9-19.

235. Synaptic vesicle size and number are regulated by a clathrin adaptor protein required for endocytosis / B. Zhang, Y.H. Koh, R.B. Beckstead et al. // Neuron. 1998. - V. 21. - P. 1465-1475.

236. Calcium- and dynamin-independent endocytosis in dorsal root ganglion neurons. / Zhang C., Xiong W., Zheng H. et al. // Neuron. 2004. - V. 42. -P. 225-236.

237. Zucker R.S. Relationship between transmitter release and presynaptic calcium influx when calcium enters through discrete channels / R. S. Zucker, A. L. Fogelson // Proc. Nati. Acad. Sei. USA. 1986. - V. 83. - P. 3032-3036.

238. Zucker R.S. Exocytosis: a molecular and physiological perspective / R. S. Zucker//Neuron. 1996. - V. 17. - P. 1049-1055.

239. Частота миниатюрных токов Частота миниатюрных токовконцевой пластинки, имп/сек, концевой пластинки, имп/сек, опыта в растворе с нормальной в растворе с увеличенной концент рацией ионов К (2.5 мМ) концентрацией ионов К (40 мМ)

240. Средн 0.23 ± 0.21 ± 0.20 ± 0.03 7.25 ± 4.9 ±0.80 5.33 ±ее 0.03 0.03 0.91 0.72

241. Исходный квантовый состав (квантовый состав на первое раздражение) при высокочастотном раздражении в стандартном растворе, в том числе при использовании мембранпроникающих Са-буферов ВАРТА-АМ и ЕСТА-АМ.опыта Исходный квантовый состав

242. Са.о=1.8 мМ Са]о=1.8 мМ ВАРТА-АМ [Са]0=1.8 мМ ЕвТА-АМ1 949 345 1702 417 774 473 512 540 694 351 267 925 234 220 616 571 205 557 392 8 325

243. Среднее по опытам 470±80 390±90 80 ±20

244. Среднее 0.31 ±0.02 0.24 ±0.03 0.11 ±0.01

245. Среднее 0.126 ±0.009 0.098 ±0.010 0.055 ±0.005

246. Исходный квантовый состав (квантовый состав на первое раздражение) при высокочастотном раздражении в Бг-растворе.опыта Исходный квантовый состав, имп/сек1 262 373 894 355 416 20.51. Среднее по 41.4 ± 10опытам

247. Среднее 0.158 ±0.017 0.26 ±0.019 0.072 ± 0.009

248. Среднее 0.040 ± 0.004 0.113 ±0.027

249. Средняя интенсивность свечения нервных терминалей при загрузке с использованием высокочастотного раздражения в Са- и Бг- растворах при увеличенном времени раздражения (раздел 3.3.6.).

250. Среднее 0.21 ±0.012 0.150 ±0.011

Информация о работе

Григорьев, Павел Николаевич
кандидата медицинских наук
Казань, 2008
ВАК 03.00.13

Диссертация

Свойства и топография внутриклеточных кальций-связывающих сайтов экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы