Особенности рециклирования синаптических везикул в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши

Захаров, Андрей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности рециклирования синаптических везикул в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности рециклирования синаптических везикул в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши"

На правах рукописи

Захаров Андрей Викторович

003488157

ОСОБЕННОСТИ РЕЦИКЛИРОВАНИЯ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ ЛЯГУШКИ И МЫШИ.

03.00.13 - физиология 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Казань-2009 1 О ДЕК 2009

003488157

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации и кафедре радиоэлектроники государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный университет им. Ульянова-Ленина».

Научные руководители:

чл.-корр. РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор

Зефиров Андрей Львович;

доктор физико-математических наук, профессор Котов Николай Викторович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Волков Евгений Михайлович

доктор физико-математических наук, доцент Скоринкин Андрей Иванович

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение

«Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (г. Москва).

Защита состоится « 22 » декабря 2009 г. в 12:00 на заседании диссертационного Совета Д 212.078.02 при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, д2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, 32.

Автореферат разослан «22 » 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

Зефиров Т.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Секреция медиатора из нервных окончаний (НО) происходит порциями - квантами - в результате экзоцитоза синаптических везикул [Heuser J.E. et al., 1979; Зефиров А.Л. Черанов С.Ю., 2000; Sudhof Т.С. 2004]. Образование новых везикул из фрагментов везикулярной мембраны осуществляется в процессе эндоцитоза [Gundelfingen et al., 2003; Зефиров А. Л., 2007; Hinrichsen et al., 2006]. Вновь образованные везикулы снова подвергаются экзоцитозу. Кругооборот везикул и их повторное вовлечение в процесс секреции медиатора называется везикулярным циклом или рециклированием [Зефиров А.Л. 2007; Rizzoli S.O., Betz W.J, 2005; Heuser J.E. and Reese T.S., 1973; Richards D.A., et all., 2003; Kavalali E.T. 2006]. Важность его велика при высокочастотной активности синапсов как центральной так и периферической нервной системы, т.к. благодаря повторному использованию везикул становится возможной продолжительная секреция медиатора. [Heuser J.E. et al., 1979; Ceccarelli В. et al., 1979; Зефиров А.Л., 2007].

Определение параметров и свойств везикулярного цикла в настоящее время является сложной задачей, и пока нет единого мнения об общих принципах устройства и функционирования механизма рециклирования везикул. Предполагаются разные варианты разделения везикул на функциональные или структурные группы, называемые везикулярными пулами. Обсуждаются разные варианты участия везикулярных пулов в секреции медиатора [Elmqvist D., Quastel D. M. J., 1965; Scheggenburger R., et al., 2002; Rizzoli S.O., Betz W.J., 2005].--Также выдвигаются предположения о существовании различных видов эндоцитоза и путях восполнения везикулярных пулов.

В настоящее время наиболее часто для исследования процессов везикулярного цикла применяются электрофизиологические методы и флуоресцентная микроскопия. Однако, несмотря на существенное развитие этих подходов, сами по себе они не могут раскрыть всех особенностей процессов, протекающих внутри нервного окончания, хотя и отражают их. Так с помощью электрофизиологических экспериментов по характеру изменения амплитуды постсинаптических ответов можно судить о скорости расходовании квантов медиатора. Применение флуоресцентных красителей (FM 1-43 и др.) даёт возможность прямого наблюдения как экзоцитоза, так и эндоцитоза везикулы. Однако эти методы не позволяют проследить, как происходит взаимодействие различных пулов везикул при секреции медиатора во время высокочастотной активности, ответить на вопрос об их количестве и путях возобновления пулов [Betz W.J., Bewick G.S., 1992; Betz W.J., Bewick G.S., 1993; Зефиров А.Л. и др. 2003].

Более детально изучить механизмы рециклирования везикул возможно благодаря применению описанных подходов в комплексе с математическим моделированием, которое позволяет обобщать экспериментальные данные и анализировать предположения о причинах экспериментально наблюдаемых явлений. В данной работе проведено исследование процессов экзо- эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул с применением комплекса методов, включающего электрофизиологию, флуоресцентную микроскопию и математическое моделирование.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в исследовании пресинаптического везикулярного цикла в двигательных нервных окончаниях холоднокровных и теплокровных животных, лягушки и мыши.

В соответствие с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Провести электрофизиологические эксперименты по исследованию динамики амплитуды и квантового состава ПКП в ходе длительного высокочастотного раздражения, отражающей истощение и возобновление запасов синаптических везикул, участвующих в секреции медиатора.

2. Провести анализ загрузки флуоресцентного красителя РМ1-43 в нервные окончания в процессе и после завершения высокочастотного раздражения для определения динамики эндоцитоза синаптических везикул во время и после высокочастотного раздражения.

3. Проанализировать динамику выгрузки красителя из НО при высокочастотной активности для оценки интенсивности экзоцитоза синаптических везикул.

4. Определить скорость рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши.

5. Построить различные варианты модели везикулярного цикла, позволяющие описать экспериментальные результаты, полученные с помощью электрофизиологического метода и флуоресцентной микроскопии.

6. Разработать метод поиска оптимальных значений параметров различных вариантов модели везикулярного цикла для определения степени согласованности этих вариантов с экспериментальными данными.

Положения, выносимые на защиту.

1. Везикулы в двигательных нервных окончаниях лягушки образуют три взаимодействующих пула. Восстановление везикул при высокочастотной активности обеспечиваю два типа эндоцитоза, и включение везикул в пулы происходит по двум различным путям.

2. Везикулы двигательных нервных окончаний мыши разделены на два пула, а восстановление везикул при высокочастотной активности обеспечивает один тип эндоцитоза. Скорость эндоцитоза прямопропорциональна общему количеству везикул, встроенных в пресинаптическую мембрану.

3. Разработаны модели везикулярных циклов в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши, позволяющие с высокой точностью описать динамику квантового состава ПКП и захват красителя нервными окончаниями при высокочастотной активности.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование экзо-эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончания теплокровных и холоднокровных животных (лягушки и мыши). Рассчитаны времена рециклирования синаптических везикул. Созданы модели цикла синаптических везикул в нервных окончаниях лягушки и мыши, которые согласуются с данными электрофизиологических и оптических экспериментов. Разработан оригинальный программный комплекс, позволяющий эффективно решать задачу поиска оптимальных значений параметров модели везикулярного цикла и определять степени согласованности различных моделей с опытными данными. Отличительной особенностью разработанного математического подхода

является система описания процесса захвата и потери красителя нервными окончаниями, которая дополняет традиционное описание взаимодействие везикулярных пулов.

Обосновано разделение везикул в двигательных нервных окончания лягушки на три пула, восстанавливающихся посредством двух типов эндоцитоза. Также показано, что в двигательных нервных окончания мыши везикул разделены на два пула, которые возобновляются посредство эндоцитоза одного типа.

Впервые благодаря сравнению и совместному анализу результатов электрофизиологических экспериментов и экспериментов с применением флуоресцентного красителя FM 1-43 показана возможность параллельной работы везикулярных пулов в двигательных нервных окончаниях лягушки. Кроме того, проведено разделение между двумя типами эндоцитоза, дающими начало разным путям рециклирования синаптических везикул.

Научно-практическая ценность. Настоящая работа является фундаментальным исследованием в области физиологии и биофизики синапсов. Теоретическое значение исследования заключается в расширении представлений об устройстве везикулярного цикла в нервно-мышечных синапсах. Результаты проведённого исследования позволяют развить современные представления о механизмах рециклирования синаптических везикул.

Накопление знаний о процессах рециклирования, транспорта и кластеризации синаптических везикул, позволит выйти на новые механизмы регуляции силы нейронов и синаптических контактов, их формирования и сохранения. Это может явиться важным ключом в понимании многочисленных интегративных функций головного мозга, лежащих в основе памяти и когнитивных процессов, а также разобраться в патогенезе некоторых психических и неврологических заболеваний.

Созданная модель везикулярного цикла и разработанный метод оптимизации параметров модели могут быть применены в различных исследованиях, связанных изучением передачи сигналов между возбудимыми клетками.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2005, 2007, 2008), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2006, 2007), Пятом форуме европейской нейронауки (Вена -Австрия, 2006), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальные исследования и практика» (Пущино, 2006), Восточноевропейской конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Казань, 2006), Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007).

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из которых 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация объемом 99 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, описания и обсуждения результатов исследования, заключения и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 158 названий, из них 8 отечественных и 150 иностранных работ. Диссертация содержит 19 рисунков и 2 таблицы.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты проведены на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы озерных лягушек (Rana Ridibunda) в осенне-зимний период и диафрагмальной мышцы белых мышей. Мышцу растягивали и фиксировали в стеклянной ванночке объемом 5 мл в условиях непрерывной перфузии. В экспериментах на мышце лягушки использовался стандартный раствор Рингера для холоднокровных следующего состава (в ммоль/л): NaCl-115,0, КС1-2.5, СаС12-1.8, NaHC03-2.4. В экспериментах на мышце мыши использовали раствор Кребса для теплокровных животных следующего состава (в ммоль/л): NaCl-144.0, КС1-5.0, MgCb-O.l, CaClr2.0, NaH2P04-1.0, NaHC03-2.4, глюкоза-11.0. Данный раствор насыщали кислородом. рН растворов поддерживался на уровне 7,2-7,4; эксперименты проводили при комнатной температуре (+20 С0). Для блокирования сокращений и потенциалов действия мышечных волокон использовали тубокурарин в концентрации 2 - 5 • 10"6 М. В экспериментах использованы вещества фирмы SIGMA (США).

Электрофизиология. Для внутриклеточной регистрации потенциалов концевой пластинки (ПКП) использовали стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 2-5 МОм, заполненные раствором КС1 (3 моль/л). Введение микроэлектрода в мышечное волокно осуществляли в области НО под визуальным контролем с использованием интерференционно-поляризационного микроскопа «БИОЛАР». Для усиления и регистрации ПКП использовали автоматизированную систему созданную на базе АЦП L-CARD 1250 и персонального компьютера. Раздражение двигательного нерва осуществляли прямоугольными импульсами длительностью 0,1-0,2 мс с частотой 20 имп/с (высокочастотное раздражение). После высокочастотного раздражения двигательный нерв раздражали с частотой 0,3-0,1 имп/с в течение 5-10 минут. При амплитуде ПКП более 5 мВ применяли коррекцию на нелинейность суммации [McLachlan Е. М. and Martin A. R., 1981]. Уровень мембранного потенциала покоя контролировали при помощи милливольтметра. Эксперименты, в которых происходило уменьшение мембранного потенциала покоя, не учитывались. Электрофизиологические эксперименты выполнены совместно с Р.Д. Мухамедзяновьш (ст. преп. каф. норм, физиологии КГМУ, к.б.и.).

После регистрации ПКП при длительном высокочастотном раздражении рассчитывали квантовый состав (m) каждого ПКП. Для этого применён метод определения квантового размера (q) по дисперсии амплитуды ПКП [Elmqvist D. and Quastel D. M. J. 1965]. В рамках этого метода предположено, что количество медиатора в везикулах неизменно, чувствительность постсинаптической мембраны к медиатору в процессе длительного раздражения постоянная, а амплитуда ПКП пропорциональна количеству высвобождаемых квантов медиатора. В массиве значений амплитуд ПКП, полученном при длительном высокочастотном раздражении, выбирали участок, в котором рассчитывали квантовую величину по

формуле: g2 , где а2 -дисперсия амплитуды ПКП на выбранном участке,

ч~ <v>

<У>-средняя амплитуда ПКП на том же участке. Далее определяли квантовый

состав каждого ПКП в серии: т. - Yl, где m¡ и V¡ - квантовый состав и амплитуда i-

го ПКП соответственно. Наиболее точное значение q получается для участка с

плавно изменяющейся амплитудой [Hubbard J. I. and Wilson D. F., 1970; Рубин А.Б., 1999]. Анализ наших экспериментальных данных показывает, что q меняется незначительно на протяжение практически всего периода высокочастотной активности нервно-мышечного синапса как лягушки, так и мыши.

Флуоресцентная микроскопия. В экспериментах использовали флуоресцентный краситель FM 1-43 («Biotium», США) в концентрации 2-4 мкмоль/л. Краситель обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся синаптических везикул («загружается» в НО). При загрузке красителя в НО появляются светящиеся пятна, отражающие скопления меченых FM 1-43 везикул в области активных зон, прошедших цикл экзо-эндоцитоза [Betz W. J. et а!., 1992; Betz W. J. and Bewick G. S. 1993; Зефиров A. JI. и др., 2003]. С целью уменьшения неспецифического свечения, появляющегося при связывании красителя с поверхностными мембранами, использовали ADVASEP-7 в концентрации 1мкм/л («Biotium», США). Загрузку красителя в НО осуществляли при частоте раздражения 20 имп/с (см. раздел «Результаты исследования»). После этого препараты отмывались в течение 40 минут в стандартном растворе при температуре 5° С.

Флуоресценцию наблюдали с помощью микроскопа МИКМЕД-2 («J10M0», Санкт-Петербург) или Olympus BX-51WI. Все наблюдения проводили только на поверхностно лежащих НО. Для регистрации картин флуоресценции использовали чёрно-белую видеокамеру (WAT-902H, «Watec со., LTD», Япония), совмещенную с персональным компьютером. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах (o.e.), принимая максимальное свечение пикселя за единицу. Флуоресцентно-микроскопические эксперименты выполнены совместно с A.M. Петровым (асс. каф. норм, физиологии КГМУ, к.б.н.).

Математическое моделирование. Для моделирования везикулярного цикла в двигательных НО предположено, что везикулы в них разделены на группы -везикулярные пулы. Сливающиеся с пресинаптической мембраной в результате экзоцитоза везикулы образуют кластер мембранного материала восстанавливаемые везикулы. Переходы между пулами описываются кинетическими уравнениями первого порядка, т.е. скорость перехода везикул из пула А в пул Б пропорциональна числу везикул в А (коэффициент пропорциональности - это константа скорости). При анализе и моделировании захвата и потери красителя нервными окончаниями мы полагали, что светимость нервных терминален прямопропорциональна числу везикул, захвативших краситель, т.е. все везикулы захватывают одинаковое количество красителя и являются прозрачными для излучаемого красителем света. На основании сделанных предположений составлялись дифференциальные уравнения, выражающие скорости изменения числа везикул во всех пулах и кластерах рассматриваемой модели. Затем производилось совместное решение полученной системы численным методом.

При изучении свойств разных вариантов модели везикулярного цикла, производился поиск таких значений параметров этих моделей, при которых обеспечивается наиболее точное повторение электрофизиологических и оптических экспериментальных данных. Для этого применялся оптимизационный метод, представляющий собой комбинацию циклического покоординатного «спуска» и генетического алгоритма поиска экстремума многомерной целевой

функции. В качестве целевой функции брали выражение аналогичное среднеквадратичному отклонению:

где E(t,) и M(tj) - соответственно экспериментальное и модельное значения измеряемой величины в момент времени t; , п — количество экспериментальных точек, а является многомерной функцией параметров модели, имеющей локальные минимумы. Применяемый генетический алгоритм поиска позволяет выходить из этих минимумов в процессе поиска [Гладков Л.А. и др., 2006]. Поиск оптимальных значений параметров производился в ограниченном пространстве параметров.

При сравнении модельных и экспериментальных значений светимости терминален применяли нормирование их к единице по собственным максимальным значениям.

Программы разработаны в среде Borland на языке С + +. Модельные расчёты проводились с использованием вычислительного кластера на базе пяти компьютеров с процессорами Intel Core2 Duo 2,3 ГГц.

Изменения квантового состава ПКП при длительной высокочастотной активности.

Раздражение двигательного нерва кожно-грудинной мышцы лягушки с частотой 20 имп/с в течение 3 минут сопровождалось снижением квантового состава ПКП (рис. 1А). Первоначально (в течение первых 10-15 раздражений) квантовый состав ПКП падал до 50-70% исходного. Затем, на кривой снижения образовывался излом, после которого квантовый состав ПКП в течение 5-15 секунд изменялся медленно (состояние плато). В дальнейшем наблюдалось постепенное уменьшение квантового состава ПКП, который через 3 минуты раздражения составлял 9 ± 1% (п = 5) исходного. Восстановление квантового состава ПКП после прекращения раздражения происходило достаточно медленно (в течение 4-8 минут) с временем полувосстановления 2,3 + 0,6 мин, п = 4 (рис. 1 А).

При длительном раздражении двигательного нерва диафрагмальной мышцы мыши с частотой 20 имп/с первоначально (в течение первых 10-15 раздражений) наблюдалось выраженное снижение квантового состава ПКП (рис. 1В). Затем падение его замедлялось, на кривой снижения образовывался излом, после которого квантовый состав ПКП на длительное время (1-2 мин) стабилизировался на уровне 20-40 % исходного значения (состояние плато). Через 3 минуты раздражения квантовый состав ПКП составлял 27 ± 2 % исходного (п = 6). Восстановление квантового состава ПКП после прекращения раздражения происходило очень быстро. Так, после трёхминутного раздражения он возвращался до исходного уровня в течение нескольких секунд (время полувосстановления - 6,3 ±0,6 сек, п = 4) (рис. 1В).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

0.3 имп/с

100 S 80

А,

О 2 4 6 8 10 12 14 время, мин

с м с

0.3 имп/с

100 150 200 250 время, с

1 2 3 4 5 6 7

время, мин

Рис. 1. А и В - изменение квантового состава ПКП при длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушки и мыши соответственно (данные отдельных экспериментов). Б и Г - изменение флуоресценции НО при поминутной аппликации красителя в процессе и после высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушки и мыши соответственно. Горизонтальной линией обозначен период раздражения с частотой 20 имп/с.

Динамика загрузки красителя при длительном высокочастотном раздражении.

Для выяснения динамики захвата красителя нервными окончаниями применена одноминутная аппликация красителя. Краситель добавляли на одну минуту при одноминутном раздражении, на вторую минуту при двухминутном и на третью минуту при трёхминутном раздражении с частотой 20 имп/с. Такая схема позволяет предотвратить потерю загруженного красителя связанную с повторным участием везикул в секреции медиатора [Betz W. J. and Bewick G. S., 1992; Betz W. J. and Bewick G. S., 1993] и более точно оценить интенсивность эндоцитоза. Для наблюдения динамики эндоцитоза после прекращения стимуляции, краситель добавляли на одну минуту в разные моменты после завершения трёхминутного раздражения (рис. 1 Б и Г).

При поминутной аппликации красителя интенсивность флуоресценции НО лягушки в процессе высокочастотного раздражения постепенно возрастала, что свидетельствует о постепенном увеличении числа восстановленных в результате эндоцитоза везикул. Яркость свечения в первую, вторую и третью минуты раздражения составила соответственно 68±6, 76±5 и 80±5 o.e. (п = 5). После прекращения трёхминутной стимуляции яркость свечения продолжала возрастать, достигая максимума в течение первой минуты (92 ± 5 o.e., п=5), после чего медленно снижалась, возвращаясь к фоновому значению через 9-11 минут (рис.

1Б). Это свидетельствует о том, что в НО лягушки процесс эндоцитоза начинается в период раздражения и длится значительное время после его окончания.

При одноминутной аппликации красителя интенсивность флуоресценции НО мыши нарастала быстрее и была выше в абсолютных значениях, чем в НО лягушки, а максимум флуоресценции наблюдался уже на 1-2 минуте раздражения. Средние показатели яркости свечения на первой, второй и третьей минутах составили 94±5, 121 ±4, 111+7 o.e. (п = 6). В первую минуту после окончания раздражения интенсивность флуоресценции резко падала до 51+3 o.e., п= 6, а через 5-6 мин флуоресценция НО практически не выявлялась (рис. 1Г). Это говорит о том, что в НО мыши эндоцитоз происходит преимущественно в период раздражения и быстро прекращается после окончания раздражения.

Динамика выгрузки FM1-43 из двигательных НО при длительном высокочастотном раздражении.

Для наблюдения динамики экзоцитоза синаптические везикулы предварительно метили красителем. Для этого двигательный нерв нервно-мышечного препарата раздражали в течение трёх минут. FM 1-43 присутствовал в растворе как во время стимуляции так и в течение 5-15 минут после её окончания. Такой протокол позволяет загрузить красителем практически все везикулы, участвующие в секреции медиатора [Richards D. A. et al., 2000]. Далее осуществляли выгрузку красителя путём раздражения нервно-мышечного препарата с частотой 20 имп/с в течение 10 минут, анализируя снижение интенсивности флуоресценции.

Проведённые эксперименты показали, что с снижение флуоресцентного свечения НО лягушки при раздражении с частотой 20 имп/ происходило в две фазы - сначала быстро (на 20 % за 15 секунд раздражения), а затем более медленно (рис. 2А, кривая AF). К третьей минуте стимуляции интенсивность свечения падала до 26±2% исходного (п=7), а через 8-10 минут свечение исчезало. Усреднённая кривая спада флуоресценции может быть описана суммой двух экспонент с характерными временами спада 8 + 3 и 121 + 5 секунд, соответственно.

На рисунке 2Б (кривая AF) представлена динамика потери красителя (снижения флуоресценции) нервными окончаниями мыши. Практически во всех экспериментах кривая уменьшения свечения описывалась моноэкспоненциальной кривой (характерное время спада 161 ±5 секунд). Через 3 минуты раздражения интенсивность флуоресценции падала до 27±3% исходной величины, а через 6 мин свечение исчезало (п=7).

Наличие двух компонент спада флуоресценции нервных окончаний лягушки, первая из которых более быстрая, свидетельствует о преобладании процессов расходования везикул над их восстановлением в начальный период раздражения. Однофазность кривой спада флуоресценции НО мыши говорит о приблизительном равенстве интенсивностей экзо- и эндоцитоза уже в начальный период раздражения.

Определение времени рециклирования синаптических везикул.

Для определения времени повторного вовлечения везикул в секрецию медиатора в НО лягушки и мыши мы использовали данные по выгрузке красителя и динамике секреции медиатора. Исходя из квантово- везикулярной теории можно предполагать, что динамика снижения квантовой секреции медиатора при ритмическом раздражении будет соответствовать динамике потери красителя

(уменьшения флуоресценции) [Зефиров A.J1., Черанов С.Ю., 2000; Betz W. J. and Angelson J. K„ 1998; Betz W. J. and Bewick G. S. 1992; Reid B. et al., 1999]. Действительно, синаптические везикулы в предварительно загруженных красителем НО содержат как медиатор, так и FM 1-43. Раздражение, приводящее к экзоцитозу везикул, должно вызывать освобождение квантов медиатора и потерю красителя из синаптических везикул.

Для анализа мы накладывали кривую потери красителя на кумулятивную кривую секреции квантов медиатора (сумму квантовых составов ПКП) при длительном высокочастотном раздражении [Reid В., et al., 1999]. Затем масштабировали кривую потери красителя так, чтобы начальные части кривых совпадали (рис. 2). Если бы загруженные FM 1-43 НО теряли краситель пропорционально количеству везикул, подвергшихся экзоцитозу, то мы получили бы полное совпадение кривых. Действительно, при оптимальном масштабировании в начале раздражения кривые совпадали (различия были незначительны). Однако добиться полного совпадения кривых не удаётся ни для лягушки ни для мыши. Начиная с определённого момента времени раздражения (tr), расхождение кривых становится явным и выраженным для обоих объектов, т.е. скорость выгрузки красителя начинает отставать от скорости секреции медиатора. Расхождение кривых объясняется рециклированием везикул, потерявших краситель, поступлением их в НО, где они смешиваются с мечеными везикулами, заполняются медиатором и участвуют в секреции медиатора вместе с ними [Betz W.J., Bewick G.S., 1993; Reid В. et al., 1999; Зефиро А.Л. и др., 2008]. При этом выгрузка красителя из НО замедляется, а время, при котором расхождение кривых становится явным соответствует минимальному времени рециклирования (tr) такого количества везикул, которое необходимо для эффективного конкурирования вновь образованных везикул с окрашенными. Временной интервал совпадения кривых интерпретируется как период, когда в экзоцитозе принимают участие только меченые красителем везикулы. Длительность его в наших экспериментах оказывалась равной приблизительно 50 секундам (рис. 2). Т.е. в НО лягушки и мыши минимальные времена рециклирования везикул приблизительно равны.

Сопоставление кумулятивной кривой секреции медиатора и кривой потери красителя позволяет определить количество везикул в нервном окончании, участвующих в секреции медиатора (VP). Действительно при однородном распределении окрашенных везикул в общем массиве везикул НО и незначительности вклада рециклирования везикул (до времени tr) доля потери красителя (AF(tr)) равна доле везикул подвергшихся экзоцитозу (£m(tr)) - сумме освободившихся квантов медиатора. Значит до момента tr, справедлива следующая пропорция:

Y,т('г) . _ из кпт0рпй получаем: vp_ 100% Y„,r> ч> vp 100% af( ,r)lkr>

где AF(tr) - доля красителя (в %) выгружаемая за время рециклирования tr (50 секунд), a Xm(tr) - количество везикул, слившихся с пресинаптической мембраной за то же время.

А Б

время, с

Рис. 2. Кумулятивные кривые квантового состава ПКП (£т) и потери красителя (ДР) при длительном высокочастотном раздражении двигательного нерва нервно-мышечного препарата лягушки (А) и мыши (Б). Кривые масштабированы.

Графические расчёты для показали, что для НО лягушки АР((:Г) = 32%, Хт(1;г)= 171 ООО квантов, а УР = 535 ООО везикул. Для НО мыши аналогичные параметры составили: ДР(1Г) = 30%, Хт(А)= 23 ООО квантов, а УР = 76 600 везикул. Полученные результаты указывают на то, что поддержание секреции медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки возможно благодаря большому запасу везикул, а из НО мыши - благодаря большей эффективности процесса возобновления относительно малого запаса везикул.

Моделирование процессов рециклирования синаптических везикул.

В данной работе исследованы свойства моделей, состоящих из одного, двух или трёх пулов везикул. Кроме того, применено два подхода для описания эндоцитоза. В первом случае скорости восстановления везикул пропорциональны общему числу встроенных в мембрану фрагментов синаптических везикул, подвергшихся экзоцитозу и образующих кластер восстанавливаемых везикул (Уе) (рис. ЗА и ЗБ), в другом - зависимость более сложная (рис. ЗВ и ЗГ, варианты с двумя кластерами).

Показаны варианты с одним пулом везикул (А), с двумя пулами (Б), с двумя пулами и двумя типами эндоцитоза (В), с тремя пулами и двумя типами эндоцитоза (Г).

Пределы изменения размеров пулов задавались с учётом литературных данных, что позволило ускорить поиск оптимальных значений: общее количество везикул в НМС лягушки порядка 300 тысяч, из которых около 10 тысяч - локированные [Heuser J.E. and Reese T.S., 1973; Richards D. A. et al., 2000, 2003; Rizzoli S.O., Betz W.J, 2004], для мыши - приблизительно 200 тысяч и 1 - 3 тысячи соответственно [Schneggenburger R. et al., 1999; SakabaT. andNeherE., 2001].

Модель с одним пулом везикул.

Один из наиболее простых вариантов описания электрофизиологических экспериментов заключается в представлении всех везикул нервной терминапи одной однородной популяцией. Важной особенностью такой системы является равная для всех везикул вероятность участия в экзоцитозе. На рисунке ЗА приведена такая схема везикулярного цикла, состоящего из одной популяции везикул, обозначенной символом Vcom, и кластера восстанавливаемых эндоцитозом везикул, - Ve. Стрелками обозначены пути взаимодействия групп везикул: пунктирной стрелкой обозначен процесс слияния везикул с пресинаптической мембраной и переход их в кластер мембранного материала, а стрелкой есош - процесс эндоцитоза, в результате которого формируются новые везикулы, и возобновляется пул Vcom. Число высвобождаемых квантов медиатора (ех) определяется вероятностью экзоцитоза (psr) и количеством везикул, готовых в данный момент к слиянию (Vcom): ex(psr, Vcom) = psr • Vcom. Аналогично записывается количество восстанавливаемых в единицу времени везикул: ecom • Ve. Для исследования циркуляции красителя, захватываемого при эндоцитозе, вводим переменную PdvVcom(t), которая соответствуют количеству везикул, содержащих в данный момент краситель. Скорость изменения количества окрашенных везикул описывается так же как для неокрашенных.

Ниже приведены уравнения для скоростей изменения количества везикул во всех состояниях и уравнение материального баланса.

d(PdvVcom) . ,, ( PdvVcom

d(Vcom) , „ , „ -;-= -cx(psr,Vcom)—--+ есот 4е ■ d(t)

—-- = -ex(psr,Vcom) + ecm,-Ve, dt Vcom

i^à. = ex(psr, Vcom) - ecom ■ Ve, Vcom + Ve = N,

где d(t) - функция, равная единице в период присутствия красителя в омывающем растворе; в остальное время она равна нулю; ex(psr, Vd) - функция экзоцитоза, которая равна числу высвобождаемых квантов медиатора в моменты возникновения импульса стимуляции и нулю в остальное время. Начальные условия: Vcom(O) = VsO, Ve(0) = 0. PdvVcom(O) = 0. Эта система приводит к следующим результатам (рис. 4, показаны результаты для двух наборов параметров, приводящих к наиболее приемлемым значениям целевой функции):

12 Б

200 100

100 200 300 400 500 600 время, с

10 12 14

время, мин

с а. с

0 100 200 300 400

время, с

1.0-

0,8

я х _

X * 0,6-

я X

СО о § 0,4-

С. 1)

X §■0.2

О. >1

О X 4.0,0.

Рис. 4. Результаты моделирования в рамках модели с одним пулом везикул и одним общим эндоцитозом (А, Б - лягушка, В, Г - мышь). А. В - электрофизиология, Б, Г - загрузка красителя. Белые кружки - экспериментальные данные. Треугольники, соответствуют первому набору параметров, закрашенные кружки - второму (см. таблицы 1 и 2).

Видно, что для НО лягушки, нельзя добиться совместного согласования модельных результатов с электрофизиологическими и оптическими экспериментами (рис. 4А, 4Б, сте = 40,25 (40,95), аг = 0,254 (0,153)). Что касается синапсов мыши, то согласование наблюдается только с данными по загрузке красителя (рис. 4Г, сг = 0,129 (0,127)). Полученные модельные данные далеки от качественного согласования с электрофизиологическими экспериментами (рис. 4В, ое = 6,22 (11,51)).

Модель с двумя пулами везикул и с одним типом эндоцитоза.

На рисунке ЗБ представлена схема модели с двумя пулами везикул. Ус! - пул локированных в области активности зон везикул, Уе - пул резервных везикул. к(1+ и к<1 - скоростные константы локирования и обратного процесса соответственно. В этой схеме в результате эндоцитоза оба пула, Ус1 и Уб, восстанавливаются параллельно, причём скорости восстановления пропорциональны объёму кластера Уе с коэффициентами ее! и еэ соответственно. Рассматриваемой схеме будут соответствовать следующие дифференциальные уравнения.

= + Ш(Ус1)-У*-1«1_ Ус!+ е<1 1тсЦУ<1)-Уе, <*(Уе)

л Л

= Ус1 + е*-Уе-М+ 1тт(Ус1)У>-, Ус/ + Ух+Уе*

- = ех{р$г,Ус!) - ее/ ■ 1тё(Ус1) ■ Уе - е$-Уе,

СЦРЛУУЛ*)

с1/ с1(РС1УУ сЧ

= -ех(р.',г. Ус!)

Ус/

Ы+ ■ 1тс1(уа) • Рд\-У* + ее! ■ Ш(У<1) ■ Уе ■(!(/)- Ы_ ■ РЛуУЛ,

ЛЛ' Ус! - кс!+ ■ 1тт(У<1) ■ Рс1\- Уз.

где РёуУс! и Р(1уУз - количество окрашенных везикул в локированном и резервном

пуле соответственно. Функция /д^нлл- ^0-^(0 отражает факт ограниченности

УМ

числа сайтов экзоцитоза в активных зонах. Эта функция изменяется в интервале от нуля до единицы; при Ус1(1) = Ус10, скорость перехода везикул в пул Ус! обращается в ноль (все сайты прикрепления везикул в активных зонах заняты), т.е. дальнейшее увеличение числа локированных везикул не возможно. Начальные условия: Уё(0) = Ус10, Уэ = УбО, Уе(0) = 0, Рс1уУс1(0) = РауУБ(О) = 0.

Варьируя значения параметров модели, можно воспроизвести временной ход спада и восстановления квантового состава ПКП, полученный в электрофизиологических экспериментах на лягушке (рис. 5А, ае = 15,94 (7,379)). Но, не смотря на улучшение количественного показателя (а£), данная схема также приводит к существенным отклонениям от эксперимента. В частности, получен очень большой квантовый состав первых ПКП и аномально быстрый спад в начале раздражения, который существенно расходится с экспериментальными наблюдениями.

С 70° 600

я 500 о 400

3 200

100 200 300 400 500 время, с

1.0 0.8 0,6 0,4 0,2

0 2 4 6 8 10 12 14 время, мин

100 200 300

время, с

2 4

время, мин

Рис. 5. Результаты моделирования в рамках модели с двумя пулами везикул (локированные и резервные) и одним общим эндоцитозом (А, Б - лягушка, В, Г - мышь). А, В -электрофизиология, Б, Г - загрузка красителя. Белые кружки - экспериментальные данные. Треугольники, соответствуют первому набору параметров, чёрные кружки - второму (см. таблицы 1 и 2).

Кроме того, эта схема приводит к существенным количественным расхождениям с экспериментами по загрузке красителя. Модель предсказывает

гораздо более низкую интенсивность свечения в период стимуляции по сравнению с наблюдаемой в эксперименте (рис. 5Б, а( = 0,331 (0,196)). Таким образом, данная модель не соответствует действительносит.

Что касается нервно мышечных синапсов мыши, то представленная модель приводит к очень хорошему согласованию расчётных данных с экспериментальными (рис. 5В, 5Г, се = 5,22 (5,23), of= 0,123 (0,129)). Это говорит о том, что везикулярный цикл в НО мыши эффективно использует два пула везикул и преимущественно один тип восстановления мембранного материала после экзоцитоза, которой хорошо описывается традиционным подходом (скорость восстановления прямопропорциональна объёму кластера везикулярного мембранного материала).

Дальнейшее усложнение модели производим только для НМС лягушки.

Детализация эндоцитоза в НО лягушки: модель с двумя пулами везикул и двумя типами эндоцитоза.

В рассмотренных ранее моделях скорость эндоцитоза пропорциональна числу фрагментов везикулярных мембран, ожидающих восстановления (Ve) (рис. 4А, 4Б и 5А, 5Б). Данное представление допускает, что интенсивность эндоцитоза может достигать очень высоких значений, которые, однако, не наблюдаются в экспериментах на нервно-мышечных синапсах лягушки. Поэтому в выражения для восстанавливающихся везикул следует ввести ограничение скорости эндоцитоза. Мы предположим, что существует не один, а два кластера мембранных фрагментов и, по крайней мере, один из них имеет ограниченную ёмкость. То есть в нём одновременно может находиться лишь некоторое количество слившихся везикул, а избыточные везикулы становятся частью второго кластера. На рисунке ЗВ показана схема, соответствующая такому принципу описания эндоцитоза. В этом случае получим следующую систему уравнений:

^^ = -ex(psr,Vd) + kd+-lmd(Vd)Vs + ed-lmJ(Vd)-Ved-kd,-Vd, d(Ves) , , , ,

dt у * -i-'- = exs(t) + k2endo-Ved-es-Ves,

dIVs) dl

-= kd_ -Vd + es-Ves-kd+ ■lmd(Vd)-Vs, Vd + Vs + Ved + Ves = N

= eXd (,) - eddmd(Vd) ■ Ved - klendo ■ Ved,

d(PdvVd) = _ex{psrydy + kdt -lmd(Vd) ■ PdvVs + ed ■ lmd(Vd) ■ Ved • rf(<) - kd_ ■ PdrVd,

d(PdvVs) _ pJrVJ + _ ,/mí/((/(/j pdvVs.

где Ved и Ves - количество восстанавливающихся везикул в двух кластерах (введены вместо Ve). При каждом импульсе стимуляции экзоцитозу подвергаются ex(psr, Vd) везикул. В кластер Ved попадают exd(t) < (efe - Ved(t)) везикул, а остальные exs(t) = ex(psr, Vd) - exd переходят в Ves. efe - «ёмкость» первого кластера эндоцитоза или максимальное число везикулярных фрагментов, которые могут быть одновременно подвергнуты эндоцитозу в кластере Ved. Этот путь можно назвать быстрым эндоцитозом, т.к. он непосредственно пополняет локированные везикулы. Начальные условия: Vd(0) = VdO, Vs = VsO, Ved(0) = 0, Ves(0) = 0, PdvVd(O) = PdvVm(O) = PdvVs(O) = 0. Сразу после слияния большая часть везикул становится объектом медленного эндоцитоза (Ves), вместе с тем рассматривается возможность перехода везикул из Ved в Ves (стрелка к2е). На

рисунке 6 представлены результаты моделирования в рамках схемы с двумя пулами везикул и двумя типами эндоцитоза.

О 100 200 300 400 500 600 время, с

0 2 4 6 8 10 12 14 время, мин

Рис. 6. Результаты моделирования в рамках модели с двумя пулами везикул (докированны и резервные) и двумя разделёнными путями эндоцитоза. Нервно-мышечный препарат лягушки. Слева - электрофизиология, справа - загрузка красителя. Белые кружки -экспериментальные данные. Треугольники, соответствуют первому набору параметров, чёрные кружки - второму (см. таблица 2).

Видно, что сделанное дополнение модели значительно улучшает согласование модельных и экспериментальных данных (рис. 6, ое = 30,98 (26,82), of = 0,047 (0,109)).

Модель с тремя пулами везикул.

Электрофизиологические эксперименты на лягушке позволяют предполагать разделение везикул на три популяции: пул локированных везикул, мобилизационный пул и резервный [Rizzoli S. О., Betz W. J., 2005; Зефиров A.JL, и др., 2008]; хотя с точки зрения математического моделирования системе из трёх пулов можно отдать лишь небольшое предпочтение. Несмотря на большее число степеней свободы, модель с тремя пулами везикул не показывает существенного улучшения результатов по сравнению с моделью, состоящей из двух пулов, если и в той и в другой предусмотрен один тип эндоцитоза. Поэтому на следующем шаге исследуется схема циркуляции везикул, состоящая из трёх пулов везикул и двух типов эндоцитоза (рис. ЗГ). Для упрощения в ней принято, что везикулы, отщепляющиеся от активных зон, переходят в резервный пул (стрелка kd_), а не мобилизационный. С целью исследования потенциальной возможности параллельной работы резервного и мобилизационного пулов в данную модель введена взаимосвязь пула резервных везикул с локированными (стрелка ksd).

Приведённой на рисунке ЗГ схеме соответствует следующая система уравнений для скоростей перехода везикул между состояниями:

= -ex(psr, Vd) + ■ lmd(Vd) ■ Vm + ksd ■ lmd(Vd) ■Vs + ed ■ !md(Vd) • Ved - kd_ ■ Vd,

Í^Oi = to . ¡mmíVm) ■ Vs + em • lmn,(Vm) ■ Ved - kd+ ■ Imd(Vd) ■ Vm - km_ ■ Vm, di

= km. ■ Vm + kd_ ■ Vd + es ■ Ves - km+ • lmm{Vm) ■ Vs - ksd+ ■ lmd(Vd) ■ Vs,

</(Fgrf) = exd{í) - ed ■ lmd(Vd) ■ Ked - em ■ ImdiVtrí) ■ Ved -klendo • Ved, dt

d(Ves)

—-- -e:t Л') + klendo ■ Ved - es ■ Ves,

Vd + Vm + Vs + Ved + Ves = N. d(PdvVd) _ _ex(psr Vd). PdvVd + ы pJvVm + . . pdvVs + eí/. /т</(Г1/). Ved. _ kd_. Fd¡Vd,

di Vd

díPdvVm)

—-- = km+ ■ !mm(Vm) ■ PdvVs + em ■ lmm(Vm) Ved •</(()- kdt ■ !md(Vd) ■ PdvVm - km. ■ PdvVm,

</(/V"l-J'') = kni_ ■ PdvVm + kd. ■ PdvVd + es ■ Ves d(l)~ kmt ■ lmm(Vm) ■ PdvVs - ksdt ■ lmd(Vd) ■ PdvVs. di

где Vm - количество везикул в мобилизационном пуле, kd+ и km+ - скоростные константы локирования и мобилизации, kd _ и km_ - скоростные константы обратных процессов, PdvVm - количество окрашенных везикул в мобилизационном пуле. Остальные обозначения совпадают с предыдущими схемами. Наряду с функцией, ограничивающей скорость локирования везикул,

¡mJiVJ)- Vcl0~Vcl(lh введено ограничение скорости приращения числа везикул

VdO

мобилизационного пула: ¡mm¡Vm\ _Vw0 ~Vm ■ Это ограничение можно связать с

VmO

структурной обособленностью везикул данного пула. Например, если принадлежность везикулы мобилизационному пулу определяется тем, что она захвачена специфической системой транспортировки к активным зонам, то функция lmm(Vm) характеризует пропускную способность такой системы. При Vm = VmO, количество везикул мобилизационного пула увеличиваться не может. Начальные условия: Vd(0) = Vd0, Vm = VmO, Vs = VsO, Ved(0) = 0, Ves(0) = 0, PdvVd(O) = PdvVm(O) = PdvVs(O) = 0.

На рисунке 7 представлены результаты моделирования в рамках схемы с тремя пулами везикул и двумя типами эндоцитоза. Можно видеть, что получено лучшее качественное согласование с экспериментальными данными. Количественная мера отклонения от графиков сравнения также свидетельствует о необходимости рассматривать данную модель как наиболее полную (рис. 7, af = 0,044 (0,122), ае = 35,4 (44,95)).

С м 350 i

с 300 I

CQ •

сз (- 250 •

о о 200

« 150

са о 100 \ ¿

н 50

X оз XSí

02 0

m §

2 « CL QJ

100 200 300 400 500 600 время, с

/А,

2 4 6 8 10 12 14 время, мин

Рис. 7. Результаты моделирования с использованием схемы с тремя пулами и двумя типами эндоцитоза. Нервно-мышечный препарат лягушки. Слева - электрофизиология, справа -загрузка красителя. Белые кружки - экспериментальные данные. Треугольники, соответствуют первому набору параметров, чёрные кружки - второму (см. таблица 2).

В ходе изучения поведения модели при вариации параметров было обнаружено, что функция резервного пула везикул, скорее всего, не ограничивается простым пополнением мобилизационного пула. Оказалось, что прописанный на схеме путь, идущий в обход мобилизационного пула - ksd, - может полностью заменить восполнение за счёт мобилизованных везикул (kd+). Это значит, что данная схема безразлична к способу, которым везикулы резервного пула участвуют в экзоцитозе: оба типа эксперимента одинаково хорошо воспроизводятся в обоих случаях (рис. 7, второй набор параметров, kd+=0). Получается, что везикулы не обязательно должны проходить последовательно из резервного пула в мобилизационный, а могут непосредственно локироваться в активных зонах, т.е. имеют прямой доступ к сайтам экзоцитоза в обход мобилизационного пула.

Также было обнаружено, что процесс локирования резервных везикул (ksd), скорее всего, имеет не второстепенное значение, а происходит наравне с локированием везикул мобилизационного пула (kd+). На это указывает то, что зануление параметра km+ (переход резервных везикул в мобилизационный пул) может быть до определённой степени скомпенсировано за счёт остальных параметров (рис. 8, km+ = 0). В этом случае получаем два полностью независимых везикулярных цикла: Vd—►Ved—>Vm—>Vd и Vd—>Ves—>-Vs—>Vd.

400

200

100

0 100 200 300 400 500 6 время, с

x -в-г

2 4 6 8 10 время, мин

Рис. 8. Результаты моделирования с использованием схемы с тремя пулами и двумя типами эндоцитоза при krru = 0. Нервно-мышечный препарат лягушки. Слева -электрофизиология, справа - загрузка красителя. Белые кружки - экспериментальные данные, чёрные - модельный результат для следующего набора параметров: kd+ = 0.0075, kd. = 0.7065, kds = 0.0324, km* = 0, km. = 0, ed = 0.2776, em = 0.4729, psr = 0.1006, VdpO =4795, Vm0 = 20672, VsO = 134480, es = 0.0026, k2endo = 1.1268, cfe = 13675; oc = 16,05 (26,82), or = 0,050.

Таблица 1. Параметры исследованных схем везикулярного цикла в двигательных нервных окончанях мыши и численные оценки их согласованности с экспериментальными данными (в

параметр, размерность 1 пул везикул 2 пула везикул

VdO, шт - 2049(4241)

VsO, шт 45104(92984) 47424 (105700)

kd+, с"' - 0,0062 (0,0019)

kd_, с"' - 0,0004(0,0019)

psr 0,0006 (0,0004) 0,0287 (0,0139)

ed, с' - 0,0783 (0,1302)

es, с'1 0,0499 (0,044) 0,0356 (0,0305)

0С (эл-физ) 6,22(11,51) 5,22 (5,23)

af (флуор) 0,129 (0,1272) 0,123 (0,129)

Таблица 2. Параметры исследованных схем везикулярного цикла в двигательных НО лягушки и численные оценки их согласованности с экспериментальными данными (в скобках

параметр, размерность 1 пул везикул и 1 общи1 эндоцитоз 2 пула везикул и 1 общий эндоцитоз 2 пула везикул и 2 вида эндоцитоза 3 пула везикул и 2 пула эндоцитоза

VdO, шт - 10 000 10 000 10 000

VmO, шт - - - 80 000

VsO, шт 200 000 200 000 200 000 200 000

efe - - 3435 (19130) 34135 (41785)

kdt, с"1 - 0,031 (0,0254) 0,0271 (0,0322) 0,0001 (0)

kd _, с1 - 0,2783 (5,9445) 1,1272 (0,8574) 1,7832 (0,5243)

ksd, с' - - - 0,0636 (0,1685)

krrw, с"1 - - - 0,0643 (5,4605)

km _, с"1 - - - 0,0673 (0,0143)

psr 0,0019 (0,0005) 0,0903 (0,7159) 0,1186 (0,.089) 0,0783 (0,0327)

ed, с"1 - 0,0001 (0) 0,5924 (0,7865) 0,1124 (0,6126)

em, с'1 - - - 1,664 (0,2001)

es, с"' 0,0052 (0,0036) 0,0008 (0,0019) 0,0026 (0,002) 0,0026 (0,0018)

k2endo - - 1,0484(1,641) 5,1094 (0,8162)

Ос (эл-физ) 40,25 (40,95) 15,94 (7,379) 30,98 (26,82) 35,4 (44,95)

Of (флуор) 0,254 (0,153) 0,331 (0,196) 0,047(0,109) 0,044(0,122)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведённое исследование показало значительную разницу рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши. Математическое моделирование позволило объяснить причину имеющихся различий в терминах взаимодействующих пулов синаптических везикул. В двигательных нервных окончания лягушки везикулы разделены на три пула, а в НО мыши - на два. Полученные данные позволяют считать, что в двигательных НО лягушки и мыши существует два вида рециклирования синаптических везикул, однако они по-разному выражены в данных синапсах. В двигательных НО лягушки сосуществуют быстрое (секунды) и медленное (десятки секунд) рециклирование синаптических везикул, причём второй процесс преобладает, и ведёт к восполнению преимущественно резервного пула везикул. В двигательных НО мыши превалирует быстрое рециклирование с восполнением готового к освобождению пула. Различия в скорости рециклирования связаны с неодинаковой скоростью эндоцитоза синаптических везикул и подготовки их к последующему экзоцитозу.

Возможно, что медленный эндоцитоз и рециклирование по длинному пути в НО лягушки не является самостоятельным механизмом, а связан с высоким уровнем экзоцитоза и ограниченными возможностями молекулярной машины быстрого эндоцитоза [Зефиров A.J1., 2007; Sudhof Т.С., 2004]. В НО мыши при относительно низом уровне экзоцитоза (примерно 30 - 40 тысяч квантов в минуту при частоте раздражения 20 имп/с) эффективность машины эндоцитоза достаточно высока, чтобы обеспечить быстрое восстановление всего мембранного материала сливающихся везикул. В НО лягушки первоначальный уровень экзоцитоза очень высок (100 - 300 тысяч везикул в минуту), поэтому большая часть встроенных везикулярных мембран не успевает пройти стадию быстрого эндоцитоза. Эта часть мембранного материала долго присутствует в плазматической мембране и образует глубокие инвагинации, из которых позже формируются новые везикулы [Miller Т. М. and Heuser J. Е„ 1984; Gad Н. et al., 1998].

Можно думать, что эволюция двигательных НО от холоднокровных к теплокровным животным шла по пути сокращения протяжённости НО, уменьшения размеров везикулярных пулов и более экономного их расходования. Уменьшение диаметра мышечных волокон и, соответственно, увеличение его входного сопротивления в свою очередь позволило сохранить сверхпороговую амплитуду постсинаптического потенциала в ответ на одиночный пресинаптический потенциал действия, несмотря на резкое уменьшение пула везикул готовых к освобождению и соответственно, количества синаптических везикул участвующих в секреции медиатора. Вместе с этим значительно возрастает эффективность повторного использования синаптических везикул при высокочастотной активности за счёт высокой скорости эндоцитоза и рециклирования. Вследствие этого быстрый кругооборот везикул может обеспечивать в НО теплокровных длительное поддержание достаточно высокого уровня секреции медиатора (состояние плато амплитуды ПКП) для генерации сверхпороговых постсинаптических сигналов и сохранения надежности синаптической передачи.

2003]. Мы предполагаем существование механизмов, раздельно контролирующих работу мобилизационного и резервного пулов. При этом везикулы данных пулов независимо друг от друга подвергаются экзоцитозу и восстанавливаются разными путями, вновь попадая в свой пул. Модельное исследование показало непротиворечивость и высокую вероятность существования параллельных везикулярных циклов в двигательных нервных терминапях лягушки. Одним из важнейших пунктов разделения путей рециклизации является процесс эндоцитоза, который имеет два основных режима работы: быстрый и медленны.

Вообще необходимо отметить, что детальное описание процесса эндоцитоза очень важно для корректного анализа динамики спада и восстановления амплитуды постсинаптических ответов. Ещё более важным оно является для описания захвата красителя при высокочастотной активности НМС. Два типа эндоцитоза не достаточно представить двумя скоростными константами, необходимо более точно представлять зависимости скорости эндоцитоза от числа встроенных в пресинаптическую мембрану везикул.

ВЫВОДЫ.

1. Продолжительная высокочастотная активность (3 минуты, 20 имп/с) нервно-мышечного синапса лягушки сопровождается снижением квантового состава ПКП, которое характеризуется тремя фазами: быстрый начальный спад (на 30- 50% за первые 10-15 раздражений), период стабилизации или замедления спада и вторичный медленный спад практически до нулевого уровня. Восстановление амплитуды происходит медленно: время полувосстановления составляет приблизительно 2,5 минуты.

2. Высокочастотная активность нервно-мышечного синапса мыши приводит к резкому начальному спаду квантового состава ПКП в течение первых 5-10 раздражений и длительное плато, характеризующееся медленным изменением амплитуды ответов на уровне 20 - 40 % начального значения. После окончания раздражения происходит быстрое восстановление амплитуды с временем полувосставления около 6 секунд.

3. На протяжении трёхминутной высокочастотной стимуляции квантовая величина остаётся практически неизменной в нервно-мышечных синапсах как лягушки, так и мыши.

4. Поминутная аппликации флуоресцентного красителя РМ 1-43 во время высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушки приводит к постепенному увеличению захвата красителя нервными окончаниями. После прекращения стимуляции наблюдается медленное уменьшение количества захватываемого красителя в течение 9-10 минут.

5. При поминутной аппликации красителя РМ 1-43 во время высокочастотной активности нервно-мышечного синапса мыши наблюдается интенсивный захват красителя с первых минут. После окончания стимуляции захват быстро снижается на 50 % (и более) в первую минуту после окончания стимуляции, а через 5-6 минут захват красителя не наблюдается.

6. Спад флуоресценции предварительно загруженных красителем РМ 1-43 нервных окончаний лягушки при высокочастотном раздражении двигательного нерва, происходит в две фазы, первая из которых имеет характерное время 8 ± 3 секунд, а вторая 121 ± 5 секунд.

7. Спад флуоресценции предварительно загруженных красителем FM 1-43 нервных окончаний мыши при высокочастотном раздражении двигательного нерва происходит однофазно с характерным временем 161±5 секунд.

8. Сопоставление графика снижения секреции медиатора и кривой потери красителя при высокочастотной активности нервно-мышечного синапса обнаруживает различия между кинетиками высвобождения медиатора и потери красителя. Расхождение кривых является свидетельством повторного участия вновь образованных в результате эндоцитоза везикул в процессе секреции медиатора. В синапсах и лягушки и мыши минимальное время рециклирования составляет приблизительно 50 секунд.

9. Модель с одним пулом везикул и общим эндоцитозом и для лягушки и для мыши не позволяет достичь приемлемого согласования ни с электрофизиологическими экспериментами, ни с экспериментами по поминутной загрузке красителя.

10. В рамках модели с двумя пулами везикул и одним типом эндоцитоза для лягушки можно достичь хорошей степени согласования с электрофизиологическими экспериментами, но нельзя воспроизвести результаты поминутной загрузки красителя (и наоборот).

11. В рамках модели с двумя пулами везикул и одним типом эндоцитоза для мыши можно достаточно точно воспроизвести и электрофизиологические эксперименты и поминутную загрузку красителя совместно, т.е. с одним набором параметров.

12. Совместное описание временного хода квантового состава ПКП при длительной стимуляции и поминутной загрузки красителя для лягушки можно получить только в модели с двумя раздельными путями эндоцитоза. Лучшее согласование наблюдается для модели с тремя пулами везикул.

13. Модельное исследование позволяет предположить, что везикулы мобилизационного и резервного пулов в НО лягушки могут параллельно и одновременно участвовать в секреции медиатора, образуя два везикулярных цикла.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Захаров A.B. Исследование процессов экзо- и эндоцитоза нейромедиатора и моделирование постсинаптических токов / Захаров A.B., Зефиров А.Л., Котов Н.В // Сборник статей XII Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем». - Яльчик. - 2005. - С.297-300.

2. Zakharov A.V. Analysis of miniature EPC on the assumption of restricted neurotransmitter secretion from synaptic vesicle / Zakharov A.V., Zefirov A.L., Kotov N.V. // 5th Forum of European neuroscience. V ienna - Austria. -2006. - P.470.

3. Zakharov A.V. Modeling and analysis of miniature end plate currents on the assumption of restricted neurotransmitter secretion from synaptic vesicle / Zakharov A.V., Kotov N.V., Zefirov A.L. // International Symposium. Biological Motility: Basic Research and Practice. - Pushchino. - 2006. - P.66.

4. Захаров A.B. Моделирование и анализ миниатюрных токов концевых пластинок в предположении ограниченной секреции нейромедиатора из синаптической везикулы // XI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине». - Казань. - 2006.

5. Захаров A.B. Моделирование динамики амплитуды ПКП в ходе стимуляции и интенсивности свечения флуоресцентного красителя в НМС лягушки

// XII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые учёные в медицине». - Казань. - 2007. - С.294.

6. Zakharov A.V. Relationship between time course of МЕРС and fusion pore opening in the frog NMJ // VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology Simpler Nervus Systems. - Kazan. - 2006. - P. 106.

7. Захаров A.B. Исследование механизма рециклизации везикул в нервно-мышечном синапсе лягушки // Захаров A.B., Зефиров А.Л., Котов Н.В. // Сборник статей XIV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». - Яльчик. - 2007.

8. Захаров A.B. Процессы истощения и пополнения везикулярных пулов в нервно-мышечных синапсах лягушки / Захаров A.B., Мухамедзянов Р.Д., Котов Н.В., Зефиров АЛ.// XX Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова.

9. Захаров A.B. Метод расчёта динамики захвата и выброса красителя двигательным нервным окончанием / Захаров A.B., Котов Н.В. // Сборник статей XV Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». -Яльчик. - 2008. - С. 120-123.

10. Зефиров A.JI. Везикулярный цикл в двигательных нервных окончаниях диафрагмы мыши / A.J1. Зефиров, A.B. Захаров, Р.Д. Мухамедзянов, A.M. Петров, Г.Ф. Ситдикова II Российский физиологический журнал им. Сеченова. - 2008. - Т. 94, № 2. - С.129-141.

11. Зефиров A.J1. Особенности везикулярного цикла в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши / А.Л. Зефиров, A.B. Захаров, Р.Д. Мухамедзянов, A.M. Петров // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2008. - Т. 44, № 6. - С.603-612.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захаров, Андрей Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цель и задачи исследования.

Положения, выносимые на защиту.

Научная новизна.

Научно-практическая ценность.

Апробация работы.

Структура и объём диссертации.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение и функция синапса. Деление везикул на группы и подвижность их в нервном окончании.

1.2. Основные этапы везикулярного цикла.

1.2.1. Экзоцитоз. Докирование, праймирование, полное и частичное слияние синаптических везикул.

1.2.2. Эндоцитоз. Основные свойства процесса восстановления мембранного материала, судьба вновь образованных везикул.

1.2.3. Движение везикул между кластерами.

1.3. Моделирование как способ обобщения знаний о синаптической передаче и как метод исследования везикулярного цикла.

1.3.1. Теоретические подходы к изучению синаптического проведения.

1.3.2. Описание динамики красителя.

1.3.3. Современные подходы к моделированию процессов экзо-эндоцитоза.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Электрофизиология.

2.2. Квантовый анализ.

2.3. Флуоресцентная микроскопия.

2.4. Математическое моделирование.

Ограничения модели.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1. Изменение квантового состава ПКП при длительной высокочастотной активности.

3.1.2. Количественная оценка квантовой секреции медиатора при длительном высокочастотном раздражении.

3.1.3. Динамика загрузки красителя при длительном высокочастотном раздражении.

3.1.4. Динамика выгрузки FM 1-43 из двигательных НО при длительном высокочастотном раздражении.

3.1.5. Соотношение экзо- и эндоцитоза синаптических везикул при длительном высокочастотном раздражении.

3.1.6. Сопоставление кинетики секреции медиатора и динамики выгрузки красителя при длительном ритмическом раздражении. Определение минимального времени рециклирования синаптических везикул.

3.2. Моделирование рециклирования синаптических везикул.

3.2.1. Везикулярный цикл с точки зрения математического описания. Переменные и параметры модели.

3.2.2. Развитие модельного представления.

3.2.3. Модель с одним пулом везикул.

3.2.4. Модель с двумя пулами везикул и с одним типом эндоцитоза.

3.2.5. Детализация эндоцитоза в НО лягушки: модель с двумя типами эндоцитоза и двумя пулами везикул.

3.2.6. Модель с тремя пулами везикул.

3.2.8. Моделирование потери красителя FM 1-43 двигательными нервными окончаниями при высокочастотной активации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности рециклирования синаптических везикул в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши"

Актуальность исследования.

Секреция медиатора из нервных окончаний происходит порциями - квантами - в результате экзоцитоза синаптических везикул [Heuser J.E. et al., 1979; Зефиров А.Л. Черанов С.Ю., 2000; Sudhof Т.С. 2004]. Образование новых везикул из фрагментов везикулярной мембраны осуществляется в процессе эндоцитоза [Gundelfinger et al., 2003; Зефиров A. Л., 2007а; Hinrichsen et al., 2006]. Вновь образованные везикулы снова подвергаются экзоцитозу. Кругооборот везикул и их повторное вовлечение в процесс секреции медиатора называется везикулярным циклом или рециклированием [Зефиров А.Л. 20076; Rizzoli S.O., Betz W.J, 2005; Heuser J.E. and Reese T.S., 1973; Richards D.A., et all., 2003; Kavalali E.T. 2006]. Важность его велика при высокочастотной активности синапсов как центральной, так и периферической нервной системы, т.к. благодаря повторному использованию везикул становится возможной продолжительная секреция медиатора. [Del Castillo J. and Katz В., 1954a; Heuser J.E. et al., 1979; Ceccarelli B. et al., 1979; Зефиров А.Л., 2007].

Определение параметров и свойств везикулярного цикла в настоящее время является сложной задачей, и пока нет единого мнения об общих принципах устройства и функционирования механизма рециклирования везикул. Предполагаются разные варианты разделения везикул на функциональные или структурные группы, называемые везикулярными пулами. Обсуждаются разные варианты участия везикулярных пулов в секреции медиатора [Elmqvist D., Quastel D. М. J., 1965; Scheggenburger R., et al., 2002; Rizzoli S.O., Betz W.J., 2005].

В настоящее время непрерывно ведутся исследования в данной области. Для изучения разных этапов рециклирования синаптических везикул наиболее часто применяются электрофизиологические методы и флуоресцентная микроскопия. Однако, несмотря на существенное развитие этих подходов, сами по себе они не могут раскрыть всех особенностей процессов, протекающих внутри нервного окончания, хотя и отражают их. Так с помощью электрофизиологических экспериментов по характеру изменения амплитуды постсинаптических ответов можно судить о скорости расходования квантов медиатора. Применение флуоресцентных красителей (FM 1-43 и др.) даёт возможность прямого наблюдения как экзоцитоза, так и эндоцитоза, везикул. Однако эти методы не позволяют проследить, как происходит взаимодействие различных пулов везикул во время высокочастотной активности синапса, ответить на вопрос об их количестве и путях возобновления [Betz W.J., Bewick G.S., 1992; Betz W.J., Bewick G.S., 1993; Зефиров А.Л. и др. 2003].

Процессы перехода везикул между пулами остаются практически неизученными. Более детально исследовать механизмы рециклирования везикул возможно благодаря применению описанных подходов в комплексе с математическим моделированием, которое позволяет обобщать экспериментальные данные и анализировать предположения, о причинах экспериментально наблюдаемых явлений. В данной работе проведено исследование процессов экзо- эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул с применением комплекса методов, включающего электрофизиологию, флуоресцентную микроскопию и математическое моделирование.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключается в исследовании пресинаптического везикулярного цикла в двигательных нервных окончаниях холоднокровных и теплокровных животных, лягушки и мыши.

В соответствие с этой целью были поставлены следующие задачи:

2. Провести анализ загрузки флуоресцентного красителя FM 1-43 в нервные окончания в процессе и после завершения высокочастотного раздражения для определения динамики эндоцитоза синаптических везикул во время и после высокочастотного раздражения.

5. Построить различные варианты модели везикулярного цикла, позволяющие описать экспериментальные результаты, полученные с помощью электр о физиологического метода и флуоресцентной микроскопии.

Положения, выносимые на защиту.

Научная новизна.

Впервые проведено сравнительное исследование экзо- эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончания теплокровных и холоднокровных животных (лягушки и мыши). Рассчитаны времена рециклирования синаптических везикул. Созданы модели везикулярного цикла в нервных окончаниях лягушки и мыши, которые согласуются с данными электрофизиологических и оптических экспериментов. Разработан оригинальный программный комплекс, позволяющий эффективно решать задачу поиска оптимальных значений параметров модели везикулярного цикла и определять степени согласованности различных моделей с опытными данными. Отличительной особенностью разработанного математического подхода является система описания процесса захвата и потери красителя нервными окончаниями, которая дополняет традиционное описание взаимодействия везикулярных пулов.

Научно-практическая ценность.

Настоящая работа является фундаментальным исследованием в области физиологии и биофизики синапсов. Теоретическое значение исследования заключается в расширении представлений об устройстве везикулярного цикла в нервно-мышечных синапсах. Результаты проведённого исследования позволяют развить современные представления о механизмах рециклирования синаптических везикул.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2005, 2007, 2008), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2006, 2007), Пятом форуме европейской нейронауки (Вена - Австрия, 2006), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальные исследования и практика» (Пущино, 2006), Восточноевропейской конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Казань, 2006), Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007).

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из которых 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации.

Диссертация объемом 99 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, описания и обсуждения результатов исследования, заключения и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 158 названий, из них 8 отечественных и 150 иностранных работ. Диссертация содержит 19 рисунков и 2 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Захаров, Андрей Викторович

ВЫВОДЫ.

1. Продолжительная высокочастотная активность (3 минуты, 20 имп/с) нервно-мышечного синапса лягушки сопровождается снижением квантового состава ПКП, которое характеризуется тремя фазами: быстрый начальный спад (на 30- 50 % за первые 10 - 15 раздражений), период стабилизации или замедления спада и вторичный медленный спад практически до нулевого уровня. Восстановление амплитуды происходит медленно: время полувосстановления составляет приблизительно 2,5 минуты.

4. Поминутная аппликации флуоресцентного красителя FM 1-43 во время высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушки приводит к постепенному увеличению захвата красителя нервными окончаниями. После прекращения стимуляции наблюдается медленное уменьшение количества захватываемого красителя в течение 9-10 минут.

5. При поминутной аппликации красителя FM 1-43 во время высокочастотной активности нервно-мышечного синапса мыши наблюдается интенсивный захват красителя с первых минут. После окончания стимуляции захват быстро снижается на 50 % (и более) в первую минуту после окончания стимуляции, а через 5-6 минут захват красителя не наблюдается.

6. Спад флуоресценции предварительно ■ загруженных красителем FM 1-43 нервных окончаний лягушки при высокочастотном раздражении двигательного нерва, происходит в две фазы, первая из которых имеет характерное время 8 ± 3 секунд, а вторая 121 ± 5 секунд.

9. Модель с одним пулом везикул и общим эндоцитозом и для лягушки и для мыши не позволяет достичь приемлемого согласования ни с. электрофизиологическими экспериментами, ни с экспериментами по поминутной загрузке красителя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведённое исследование показало значительную разницу рециклирования синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши. Математическое моделирование позволило объяснить причину имеющихся, различий в терминах взаимодействующих пулов синаптических везикул. В двигательных нервных окончания лягушки везикулы разделены на три пула, а в НО мыши - на два. Полученные данные позволяют считать, что в двигательных НО лягушки и мыши существует два вида рециклирования синаптических везикул, однако они по-разному выражены в данных объектах. В двигательных НО лягушки сосуществуют быстрое (секунды) и медленное (десятки секунд) рециклирование синаптических везикул, причём второй процесс преобладает, и ведёт к восполнению преимущественно резервного пула везикул. В двигательных НО мыши превалирует быстрое рециклирование с восполнением готового к освобождению пула. Различия в скорости рециклирования связаны с неодинаковой скоростью эндоцитоза синаптических везикул и подготовки их к последующему экзоцитозу.

Возможно, что медленный эндоцитоз и рециклирование по длинному пути в НО лягушки не является самостоятельным механизмом, а связан с высоким уровнем экзоцитоза и ограниченными возможностями молекулярной машины быстрого эндоцитоза [Зефиров А.Л., 2007; Sudhof Т.С., 2004]. В НО мыши при относительно низом уровне экзоцитоза (примерно 30 - 40 тысяч квантов в минуту при частоте раздражения 20 имп/с) эффективность машины эндоцитоза достаточно высока, чтобы обеспечить быстрое восстановление всего мембранного материала сливающихся везикул. В НО лягушки первоначальный уровень экзоцитоза очень высок (100 - 300 тысяч везикул в минуту), поэтому большая часть встроенных везикулярных мембран не успевает пройти стадию быстрого эндоцитоза. Эта часть мембранного материала долго присутствует в плазматической мембране и образует глубокие инвагинации, из которых позже формируются новые везикулы [Miller Т. М. and Heuser J. Е., 1984; Gad Н. et al., 1998].

Сегодня преобладает модель последовательного вовлечения везикулярных пулов в секрецию медиатора при длительной высокочастотной активности [Rizzoli S.O., Betz W.J, 2005; Richards D. A. et al., 2003; Aristizabal F. and Glavinovic M. I., 2003]. Мы предполагаем существование механизмов, раздельно контролирующих работу мобилизационного и резервного пулов. При этом везикулы данных пулов независимо друг от друга подвергаются экзоцитозу и восстанавливаются разными путями, вновь попадая в свой пул. Модельное исследование показало непротиворечивость и высокую вероятность существования параллельных везикулярных циклов в двигательных нервных окончаниях лягушки. Одним из важнейших пунктов разделения путей рециклирования является процесс эндоцитоза, который имеет два основных режима работы: быстрый и медленны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захаров, Андрей Викторович, Казань

1. Albillos A., Dernick G, Horstmann H, Aimers W, Alvarez de Toledo G, Lindau

2. M. The exocytotic event in chromaffin cell revealed by amperometry // Nature. 1997. - V.389. - № 6650. - P.509-512.

3. Alvarez de Toledo G., Fernandez-Chacon R., Fernandez J. M. Release ofsecretory products during transient vesicle fusion // Nature. 1993. - V.363. -P554-558.

4. Aristizabal F. and Glavinovic M. I. Simulation and parameter estimation ofdynamics of synaptic depression // Biol. Cybern. 2003.

5. Betz W. J. and Angelson J. K. The synaptic vesicle cycle // Annu. Rev. Physiol.1998. V.60. - P.347-363.

6. Betz W. J. and Henkel A. W. Okadaic acid disrupts clusters of synaptic vesiclesin frog motor merve terminals // J. Cell Biology. 1994. - V.124. - № 5. -P.843-854.

7. Betz W. J. Depression of transmitter release at the neuromuscular junction of thefrog / J. Physiol. 1970. - V.206. - № 3. - P.629-644.

8. Betz W. J., Mao F., Bewick G. S. Activity-dependent fluorescent staining anddestaining of living vertebrate motore nerve terminals // J. Neurosci. 1992. -V.12. - № 2. - P.363-375.

9. Betz W. J., Ridge R. M. and Bewick G. S. Comparison of FM 1-43 stainingpatterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 1993. - V.87. - № 3. - P. 193-202.

10. Betz W.J., Bewick G.S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frogneuromuscular junction // Science. 1992. - Y.255. - № 5041. - P200-203.

11. Betz W.J., Bewick G.S. Optical monitoring of transmitter release and synapticvesicle recycling at the frog neuromuscular junction // J.Physiol. Lond. 1993. - V.460. - P.287-309.

12. Birks R. and Macintosh F. C. Acetylcholine metabolism of a sympatheticganglion // Canad. J. Biochem. Physiol. 1961. - V.39. - P.787-827.

13. Blum J J. Lawler G., Reed M., Shin I. Effect of cytoskeletal geometry onintracellular diffusion // Biophys. J. 1989. - V.56. - P.995-1005.

14. Brodin L., Low P., Shupliakov O. Sequential steps in clathrin-mediated synapticvesicle endocytosis // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. - V.10. - № 3. - P.312-320.

15. Burgoyne R. D. and Barclay. J. W. Splitting the quantum: regulation of quantalrelease during vesicle fusion // Trends Neurosci. 2002. - V.25. - № 4. -P.176-178.

16. Burrone J. and Lagnado L. Synaptic depression and the kinetics of exocytosis inretinal bipolar cells // J. Neurosci. 2000. - V.20. - № 2. - P.568-578.

17. Ceccarelli В., Grohovaz F., Hurlbut W. P. Freeze-fracture studies of frogneuromuscular junction during intense release of neurotransmitter // J. Cell Biol. 1979. - V.81. - P.163-192.

18. Ceccarelli В., Hurlbut W. P., Mauro A. Turnover of transmitter and vesicles atthe frog neuromuscular junction // J. Cell Biol. 1973. - V.57. - № 2. -P.499-524.

19. Conner S. D. and Schmid S. L. Identification of an adaptor-associated kinase,

20. AAK1, as a regulator of clathrin-mediated endocytosis // J. Cell Biol. 2002.- V.156.-P.921-929.

21. Cousin M. A. and Nicholls D. G. Synaptic vesicle recycling in cultured cerebellargranule cells: role of vesicular acidification and refilling // J. Neurochem. -1997. V.69. - P.1927-1935.

22. Cousin M. A. and P J.Robinson P. J. The dephosphins: dephosphorylation bycalciuneurin triggers synaptic vesicle endocytosis // Trends Neurosci. 2001.- V.24. P.659-665.

23. Cousin M. A. and Robinson P. J. Ba does not support synaptic vesicle retrieval inrat cerebrocortical synaptosomes //Neurosci. Let. — 1998. V.253. - № 1. -P. 1-4.

24. Cremona O. and De Camilli P. Synaptic vesicle endocytosis // Curr. Opin.

25. Neurobiol. 1997. - V.7. - № 3. - P.323-330.

26. Dai Z. and Peng H. B. Dynamics of synaptic vesicles in cultured spinal cordneurons in relationship to synaptogenesis //Mol. Cell. Neurosci. 1996. -V.7. - № 6. - P.443-452.

27. Del Castillo J. and Katz B. Quantal components of the end-plate potential // J.

28. Physiol. (Gr. Brit.). 1954a. - V.124. - P.560-573.

29. Del Castillo J. and Katz B. Statistical factors involved in neuromuscularfacilitation and depression // J. Physiol. 1954b. - V.124. - № 3. - P.574-585.

30. Dittmann J. S., Kreitzer A. C., Regehr W. G. Interplay between facilitation,depression, and residual calcium at three presynaptic terminals // J. Neurosci. -2000.-V.20. -№ 4.-P. 1374-1385.

31. Dobrunz L. E. and Stevens C. F. Heterogeneity of release probability, facilitationand depletion at central synapses // Neuron. 1997. - V.18. - P.995-1008.

32. Dobrunz L. Ею and Stevens C. F. Heterogeneity of release probability,facilitation, and depletion at central synapses // Neuron. 1997. - V.18. -P.995-1008.

33. Doherty P., Hawgood B. J. and Smith I. C. Changes in miniature end-platepotentials after brief nervous stimulation at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 1984. - V.356. - P.349-358.

34. Dunaevsky A and Connor E. A. F-actin is concentrated in nonreleas domains atfrog neuromuscular junctions // J. Neurosci. 2000. - V.20. - № 16. - P.6007-6012.

35. Elmqvist D. and Quastel D. M. J. A quantitative study of endplate potentials inisolated human muscle // J. Physiol. 1965. - V.178. - P.505-529.

36. Fesce R., Grohovaz F., Valtorta F., Meldolesi J. Neurotransmitter release: fusionor "kiss-and-run" // Trends Cell Biol. 1994. - V.4. - № 1. - P. 1-4.

37. Fisher S. A., Fischer Т. M., Carew T. J. Multiple overlapping processesunderlying short-term synaptic enhancement // Trends Neurosci. 1997. -V.20. - № 4. - P. 170-177.

38. Gad H., Low P., Zotova E., Brodin L., Shupliakov O. Dissociation between Catriggered synaptic vesicle exocytosis and clathrin-mediated endocytosis at a central synapse // Neuron. 1998. - V.21. - № 3. - P.607-616.

39. Gaffield M. A., Rizzoli S. O., Betz W. J. Mobility of synaptic vesicles indifferent pools in resting and stimulated frog motor nerve terminals // Neuron. -2006. V.51. -P.317-325.

40. Gennaro J. F, Nastuk W. L. and Rutherford D. T. Reversible depletion ofsynaptic vesicles induced by application of high external potassium to the frog neuromuscular junction // J. Physiol, (bond.). 1978. - V.280. - P.237-247.

41. Greengard P, Valtorta F,. Czernik A. J, Benfenati F, Synaptic vesiclephosphoproteins and regulation of synaptic function // Science (New York, N.Y.). 1993. - V.259. - № 5096. - P.780-785.

42. Guatimosim C, Romano-Silva M.A, Cruz J.S, Beirao P.S, Kalapothakis E,

43. Moraes-Santos T, Cordeiro M.N, Diniz C.R, Gomez M.V, and Prado M.A. A toxin from the spider Phoneutria nigriventer that blocks calcium channels coupled to exocytosis // Br. J. Pharmacol. 1997. - V.122. - № 3. - P.591-597.

44. Gundelfmger E. M, Kessels M. M, Qualmann B. Temporal and spatialcoordination of exocytosis and endocytosis // Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V.4. - P.127-139.

45. Harata N, Ryan T. A, Smith S. J, Buchanan J. and Tsien R. W. Visualizingrecycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P. 1274812753.

46. Haucke V. and De Camilli P. AP-2 recruitment to synaptotagmin stimulated bytyrosin-based endocytic motifs // Science. 1999. - V.285. - № 5431. -P.1268-1271.

47. Heinemann С., von Ruden L., Chow R. H., Neher E. A two-step model ofsecretion control in neuroendocrine cells // Eur. J. Physiol. 1993. - V.424. -№ 2. - P.105-112.

48. Henkel A. W. and Betz W. J. Monitoring of black widow spider venom (BWSV)induced exo- and endocytosis in living frog motor nerve terminals with FM1-43//Neuropharm.- 1995.-V.34. -№ 11.-P.1397-1406.

49. Henkel A. W. and Betz W. J. Staurosporine blocks evoked release of FM1-43 butnot acetylcholine from frog motor nerve terminals // J. Neurosci. 1995. -V.15. -№ 12. - P.8246-8258.

50. Henkel A. W., Lubke J., Betz W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization inand release from frog motor nerve terminals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996a. V.93. - P.1918-1923.

51. Henkel A. W., Simpson L. L., Ridge R. M. A. P., Betz W. J. Synaptic vesiclemovements monitored by fluorescence recovery after photobleaching in nerve terminals stained with FM1-43 // J. Neurosci. 1996b. - V.16. - № 12. -P.3960-3967.

52. Hessler N. A., Shirke A. M. and Malinow R. The probability of transmitterrelease at a mammalian central synapse // Nature. 1993. - V.366. - № 6455. -P.569-572.

53. Heuser J. E., Reese T. S., Dennis M. J., Jan L. Synaptic vesicle exocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release // J. Cell Biology.- 1979. V.81. - P.275-300.

54. Heuser J.E. and Reese T.S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membraneduring transmitter release at the frog neuromuscular junction // J. Cell Biol. -1973,-V.57.- P. 315-344.

55. Hilfiker S., Pieribone V.A., Czernik A.J., Kao H.-T., Augustine G.J., Greengard

56. P. Synapsins as regulators of neurotransmitter release // Phil. Trans. R.Soc. Lond. (Series B, Biological sciences). 1999. - V.354. - № 1381. -P.269-279.

57. Hilfiker S., Schweizer F. E., Kao H.-T., Czernik A. J., Greengard P., Augustine

58. G. J. Two sites of action for synapsin domain E in regulating neurotransmitter release //Nature neurosci. 1998. - V.l. - № 1. -P.29-35.

59. Hinrichsen L., Meyerholz A., Goos S., Ungewickell E. J. Bending a membrane:

60. How clathrin affects budding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V.l03. -P.8715-8720.

61. Holtzman E., Freeman A. R., Kashner L. A. Stimulation-dependent alterations inperoxidase uptake at lobster neuromuscular junctions // Science. 1971. -V.173. - № 3998. - P.733-736.

62. Huang E. P. and Stevens C. F. Estimating the distribution of synaptic reliabilities

63. J. Neurophysiol. 1997. - V.78. - P.2870-2880.

64. Hubbard J. I. and Wilson D. F. Reduction of the quantum content of endplatepotentials by atropine // Cell. Mol. Life Sci. 1970. - V.26. - № 11. - P. 12341235.

65. Humeau Y., Doussau F., Vitiello F., Greengard P., Benfenati F., Poulain B.

66. Synapsin controls both reserve and releasable synaptic vesicle pools during neuronal activity and short-term plasticity in Aplysia // J. Neurosci. 2001. -V.21. - № 12. - P.4195-4206.

67. Kavalali E. T. Synaptic vesicle reuse and its implications // Neuroscientist.2006. V.12. -№ 1. -P.57-66.

68. Klingauf J., Kavalali E. Т., Tsien R. W. Kinetics and regulation of fastendocytosis at hippocampal syanpses // Nature. 1998. - V.394. - P.581-585.

69. Kraszewski K., Daniell L., Mundigl O., De Camilli P. Mobility of synapticvesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence // J. Neurosci. 1996. - V.l6. - № 19. -P.5905-5913.

70. Kriebel M. E. and Gross С. E. Multimodal distribution of frog miniature endplatepotentilas in adult, denervated, and tadpole leg muscle // J. Genegal Physiol. -1974.-V.64.-№ 1. P.85-103.

71. Kuromi H. and Kidokoro Y. Tetanic stimulation recruits vesicles from reservepool via a cAMP-mediated process in Drosophila Synapses // Neuron. 2000. — V.27. - № 1. — P.133-143.

72. Kuromi H. and Kidokoro Y. The optically determined size of exo/endo cyclingvesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae // J. Neurosci. 1999. - V.19. - № 5. - P.1557-1565.

73. Kuromi H. and Kidokoro Y. Two distinct pools of synaptic vesicles in singlepresynaptic boutons in a temperature-sensitive drosophila mutant, shibire // Neuron. 1998. - V.20. - № 5. - P.917-925.

74. Kusano K. and Landau E. M. Depression and recovery of transmission at thesquid giant synapse // J. Physiol. 1975. - V.245. - № 1. - P. 13-32.

75. Li C., Ullrich В., Zhang J. Z., Anderson R. G., Brose N., Sudhof Т. C. Ca2+dependent and -independent activities of neural and non-neural synaptotagmins // Nature. 1995. - V.375. - № 6532. - P.594-599.

76. Li L., Chin L. S., Shupliakov O., Brodin L., Sihra T. S., Hvalby O., Jensen V.,

77. Zheng D., McNamara J. O., Greengard P. Impairment of synaptic vesicle clustering and of synaptic transmission, and increased seizure propensity, in synapsinl-deficient mice // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. - V.92. - № 20. -P.9235-9239.

78. Liley A. W. and North К. A. K. An electrical investigation of effects of repetitivestimulation on mammalian neuromuscular junction // J. Neurophysiol. 1953. -V.16.-№5.-P.509-527.

79. Lu В., Czernik A. J., Popov S., Wang Т., Poo M.-M., Greengard P. Expression ofsynapsinl correlates with maturation of the neuromuscular synapse // Neurosci. 1996. - V.74. - № 4. - P. 1087-1097.

80. Lu В., Greengard P., Poo M.-M. Exogenous synapsinl promotes functionalmaturation of developing neuromuscular synapses // Neuron. 1992. - V.8. -№ 3. - P.521-529.

81. Luby-Phelps K. Taylor D. L. and Lanni F. Probing the structure of cytoplasm // J.

82. Cell Biol. .- 1986. V.102. -P.2015-2022.

83. Mansvelder H. D. and Kits K. S. The relation of exocytosis and rapid endocytosisto calcium entry evoked by short repetitive depolarizing pulses in rat melanotropic cells II J. Neurosci. 1998. -V. 18. - № 1. -P.81-92.

84. Marks B. and McMahon H. T. Calcium triggers calcineurin-dependent synapticvesicle recycling in mammalian nerve terminals // Curr. Biology. 1998. -V.8. - P.740-749.

85. Matveev V. and Wang X.-J. Implications of all-or-none synaptic transmissionand short-term depression beyond vesicle depletion: a computation study // J. Neurosci. 2000. - V.20. - № 4. - P.1575-1588.

86. McLachlan E. M. and Martin A. R. Non-linear summation of end-plate potentialsin the frog and mouse // J. Physiol. 1981. - V.311. - P.307-324.

87. Meffert M. K, Premack B. A, Schulman H. Nitric oxide stimulates Caindependent synaptic vesicle release // Neuron. 1994. - V. 12. - P. 12351244.

88. Merrifield C. J, Feldman M. E, Wan L, Aimers W. Imaging actin and dynaminrecruitment during invagination of single clathrin-coated pits //Nat. Cell Biol. 2002. — V.4. - P.691-698.

89. Miller Т. M. and Heuser J. E. Endocytosis of synaptic vesicle membrane at thefrog neuromuscular junction // J. Cell Biol. 1984. - V.98. - № 2. - P.685-698.

90. Mochida S, Kobayashi H, Matsuda Y, Yuda Y, Muramoto K, Nonomura Y.

91. Myosin 2 is involved in transmitter release at synapses formed between rat sympathetic neurons in culture // Neuron. 1994. -V.13.-№5.-P.1131-1142.

92. Monck J. R. and Fernandez J. M. The exocytotic fusion pore andneurotransmitter release // Neuron. 1994. - V.12. - № 4. - P.707-716.

93. Murthy V. N. and Stevens C. F. Reversal of synaptic vesicle docking at centralsynapses // Nature Neurosci. 1999. - V.2. - № 6. - P.503-507.

94. Murthy V. N. and Stevens C. F. Synaptic vesicle retain their identity throughretain their identity through the endocytic cycle // Nature. 1998. - V.392. -№ 6675. -P.497-501.

95. Murthy V. N., Sejnowski T. J. and Stevens C. F. Heterogeneous releaseproperties of visualized individual hippocampal synapses // Neuron. 1997. -V.18.-№4.-P.599-612.

96. Murthy V., Schikorski Т., Stevens C., Zhu Y. Inactivity produces increases inneurotransmitter release and synapse size // Neuron. 2001. - V.32. - № 4. -P.673-682.

97. Naves L. A. and Van der Kloot W. Repetitive nerve stimulation decrease theacetylcholine content of quanta at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 2001. - V.532. - № 3. - P. 637-647.у»

98. Neher E. Vesicle pools and Ca microdomains: new tools for understanding theirroles in neurotransmitter release // Neuron. 1998b. - V.20. - P.389-399.

99. Parsons R.L., Calupca M. A., Merriam L. A. and Prior C. Empty synapticvesicles recycle and undergo exocytosis at vesamicol-treated motor Nerve Terminals // J. Neurophysiol. 1999. - V.81. - № 6. - P.2696-2700.

100. Petrov A. M., Giniatullin A. R. and Zefirov A. L. Role of the cAMP cascade inthe turnover of synaptic vesicle of the frog motor nerve terminal // Neurochem. J. 2008. - V.2. - № 3. - P. 175-182.

101. Pfenninger K, Sandri C, Akert K, Eugster C.H. Contribution to the problem ofstructural organization of the presynaptic area // Brain Res. 1969. - V.12. -№ 1. -P.10-18.

102. Pieribone V. A., Shupliakov O., Brodin L., Hilfiker-Rothenfluh S., Czernik A J.,

103. Greengard P. Distinct pools of synaptic vesicles in neurotransmitter release // Nature. 1995. - V.375. - № 6531. - P.493-497.

104. Prior I. A. and Clague M. J. Glutamate uptake occurs at an early stage of synapticvesicle recycling // Curr. Biol. 1997. - V.7. - № 5. - P.353-356.

105. Prior I. A. and Clague M. J. Glutamate uptake occurs at an early stage of synapticvesicle recycling // Curr. Biol. 1997. - V.7. - № 5. - P.353-356.

106. Pyle J. L., Kavalali E. Т., Piedras-Renteria E. S., Tsien R. W. Rapid reuse ofreadily releasable pool vesicles at hippocampal synapses // Neuron. 2000. -V.28. - P.221-231.

107. Ramaswami M., Krishnan К. S., Kelly R. B. Intermediates in synaptic vesiclerecycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions //Neuron. 1994. - V.13. - № 2. - P.363-375.

108. Rawson J. A. and Tilokskulchai K. Suppression of simple spike discharge ofcerebellar Purkinje cells by impulses in climbing fibre afferents // Neurosci. Lett. 1981. - V.25. - № 2. - P.125-130.

109. Rea R., Li J., Dharia A., Levitan E. S., Sterling P., Kramer R. H. Streamlinedsynaptic vesicle cycle in cone photoreceptor terminals // Neuron. 2004. -V.41. -P.755-766.

110. Reid В., Slater C. R. and Bewick G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast andslow motor nerv terminals // J. Neurosci. 1999. - V. 19. - № 7. - P.2511-2521.

111. Richards D. A., Guatimosim C. and Betz W. J., Two endocytic recycling routesselectively fill two vesicle pools // Neuron. 2000. - V.27. - P.551-559.

112. Richards D.A., Guatimosim C., Rizzoli S. O., Betz W. J. Synaptic vesicle poolsat the frog neuromuscular junction // Neuron. 2003. - V.39. - P.529-541.

113. Rizzoli S. O., Betz W. J. Synaptic vesicle pools // Nature rev. Neurosci. 2005.1. V.6. P.57-69.

114. Rizzoli S. O., Richards D. A., Betz W. J. Monitoring synaptic vesicle recycling infrog motor nerve terminals with FM dyes // J. Neurocytology. 2003. - V.32. -P.539-549.

115. Roos J. and Kelly R.B. The endocytic machinery in nerve terminals surroundssites of exocytosis // Current Biology. 1999. - V.9. - № 23. - P.1411-1414.

116. Rosenmund C. Clements J. D. and Westbrook G. L. Nonuniform probability ofglutamate release at a hippocampal synapse // Science. 1993. - V.262. - № 5134. - P.754-757.

117. Ryan T. A. and Smith S. J. Vesicle pool mobilization during action potentialfiring at hippocampal synapses // Neuron. 1995. - V.14. - P.983-989.

118. Ryan T. A. Inhibitors of myosin light chain kinase block synaptic vesicle poolmobilization during action potential firing // J. Neurosci. 1999. — V.19. — P.1317-1323.

119. Ryan Т. A., Li L., Chin L. S., Greengard P., Smith S. J. Synaptic vesiclerecycling in synapsinl knock-out mice // J. Cell Biol. 1996a. - V.134. - № 5. -P.1219-1227

120. Ryan T. A., Reuter H., Smith S. J. Optical detection of a quantal presynapticmembrane turnover // Nature. 1997. - V.388. - P.478-482.

121. Ryan T. A., Reuter H., Wendland В., Schweizer F. E., Tsien R. W., Smith S. J.

122. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons //Neuron. 1993.- V.l 1.-P.713-724.

123. Ryan T. A., Smith S. J. Reuter H. The timing of synaptic vesicle endocytosis //

124. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996b. - V.93. - P.5567-5571.

125. Sakaba T. and Neher E. Quantitative relationship between transmitter release andcalcium current at the calyx of held synapse // J. Neurosci. 2001. - V21. - № 2. -P.462-476.

126. Sara Y., Mozhayeva M. G., Liu X. and Kavalali E. T. Fast vesicle recyclingsupports neurotransmission during sustained stimulation at hippocampal synapses // J. Neurosci. 2002. - V.22. - P. 1608-1617.

127. Schikorski Т., and Stevens C.F. Morphological correlates of functionally definedsynaptic vesicle populations // Nature Neurosci. 2001. - V.4. - P.391-395.

128. Schneggenburger R., Meyer A. C. and Neher E. Released fraction and total sizeof a pool of immediately available transmitter quanta at a calyx synapse // Neuron. 1999. - V.23. - № 2. -P.399-409.

129. Schneggenburger R., Sakaba Т., Neher E. Vesicle pools and short-term synapticdepression: Lessons from a large synapse // Trends Neurosci. 2002. - V.25. -P.206-212.

130. Shupliakov O., Bloom O., Gustafsson J. S., Kjaerulff O., Low P., Tomilin N.,

131. Pieribone V. A., Greengard P., Brodin L. Impaired recycling of synaptic vesicle after acute perturbation of the presynaptic actin cytoskeleton // Proc. Natl, Acad. Sci. USA. -2002. -V.99. № 22. - P. 14476-14481.

132. Slepnev V. I., Ochoa G.-C., Butler M. H., Grabs D., De Camilli P. Role ofphosphorylation in regulation of the assembly of endocytic coat complexes // Science. 1998. - V.281. - № 5378. - P.821-824.

133. Smith С. В. and Betz W. J. Simultaneous independent measurement ofendocytosis and exocytosis //Nature. 1996. - V.380. - P.531-534.

134. Stevens C. F. and Tsujimoto Т. T. Estimates for the pool size of releasable quantaat a single central synapse and for the time required to refill the pool // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V.92. - № 3. - P.846-849.

135. Stevens C. F. and Williams J. H. Kiss-and-run exocytosis at hippocampalsynapses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97. - № 23. - P. 1282812833.

136. Stevens C.F. and Wesseling J. F. Activity-dependent modulation of the rate atwhich synaptic vesicles become available to undergo exocytosis // Neuron. — 1998. Y.21. - № 2. — P.415-424.

137. Steyer J. A., Horstmann H., Aimers W. Transport, docking and exocytosis ofsingle secretory granules in live chromaffin cells // Nature. — 1997. — V.388. -№ 6641. -P.474-478.

138. Sudhof T.C. / The synaptic vesicle cycle // Annu. Rev. Neuroscience. 2004.1. V.27. P.509-547.

139. Takei K. and Haucke V. Clathrin-mediated endocytosis: Membrane factors pullthe trigger // Trends Cell Biol. 2001. - V.l 1. - № 9. - P.385-391.

140. Takei K., Mundiql O., Daniell L. and De Camilli P. The synaptic vesicle cycle: asignle vesicle budding step involving clathrin and dynamin // J. Cell Biol. -1996. V.133. - № 6. - P.1237-1250.

141. Torri T. F., Bossi M., Fesce R., Greengard P., and Valtorta F. SynapsinI partiallydissociates from synaptic vesicles during exocytosis induced by electrical stimulation // Neuron. 1992. - Y.9. - № 6. - P. 1143-1153.

142. Trommershauser J., Schneggenburger R., Zippelius A., Neher E. Heterogeneouspresynaptic release probabilities: functional relevance for short-term plasticity // Biophysical J. 2003. - V.84. - P.1563-1579.

143. Tsodyks, M. V. and Markram H. The neural code between neocortical pyramidalneurons depends on neurotransmitter release probability // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P.719-723.

144. Valtorta F., Iezzi N., Benfenati F., Lu В., Poo M.-M., Greengard P. Acceleratedstructural maturation induced by synapsinl at developing neuronuscular synapses of Xenopus laevis // Eur. J. Neurosci. 1995. - V.7. - № 2. - P261-270.

145. Van der Kloot W. and Molgo J. Quantal acetylcholine release at the vertebrateneuromuscular junction // Physil. Rev. 1994. - V.74. - P.899-991.

146. Van der Kloot W., Colasante C., and Molgo J. Recycling and refilling oftransmitter quanta at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. — 2000. — V.523. -№ 1. — P.247-258.

147. Varela J. A., Sen K., Gibson J., Fost J., Abbott L. F., Nelson S. B. A quantitativedescription of short-term plasticity at excitatory synapses in layer 2/3 of rat primary visual cortex // J. Neurosci. 1997. - V. 17. - № 20. - P.7926-7940.

148. Von Gersdorff H. and Matthews G. Depletion and replenishment of vesicle poolsat a ribbon-type synaptic terminal // J. Neurosci. 1997. - V.17. - № 6. -P.1919-1927.

149. Von Gersdorff H. and Matthews G. Dynamics of synaptic vesicle fusion andmembrane retrieval in synaptic terminals // Nature. 1994. - V.367. - № 6465. -P.735-739.

150. Von Gersdorff H. and Matthews G. Inhibition of endocytosis by elevated internalcalcium in a synaptic terminal // Nature. 1994. - V.370. - № 6491. - P.652-655.

151. Von Gersdorff H., Schneggenburger R., Weis S. and Neher E. Presynapticdepression at a calyx synapse: the small contribution of metabotropic glutamate receptors // J. Neurosci. 1997. - V.17. - № 21. - P.8137-8146.

152. Walmsley В., Edwards F. R. and Tracey D. J. Nonuniform release probabilitiesunderlie quantal synaptic transmission at a mammalian excitatory central synapse // J. Neurophysiol. 1988. - V.60. - № 3. - P889-908.

153. Wang L. Y. and Kaczmarek L. K. High-frequency firing helps replenish thereadily releasable pool of synaptic vesicles // Nature. 1998. - V.394. - № 6691. - P.384-388.

154. Weis S., Schneggenburger R., Neher E. Properties of a model of Ca^-dependentvesicle pool dynamics and short term synaptic depression // Biophysical J. -1999. V.77. - P.2418-2429.

155. Wu L.-G. and Betz W. J. Kinetics of synaptic depression and vesicle recyclingafter tetanic stimulation of frog motor nerve terminals // Biophis. J. 1998. -V.74. - P.3003-3009.

156. Wu L.-G. and Betz W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determinesthe time course of endocytosis // Neuron. 1996. - V.17. - P.769-779.

157. Wu L.-G. and Borst J. G. G. The reduced release probability of releasablevesicles during recovery from short-term synaptic depression // Neuron. -1999. V.23. - P.821-832.

158. Wu L.-G. and Saggau P. Presynaptic inhibition of elicited neurotransmitterrelease // Trends Neurosci. 1997. - V.20. - № 5. - P.204-212.

159. Wu W., Xu J., Wu X.-S., Wu L.-G. Activity-dependent acceleration ofendocytosis at a central synapse // J. Neurosci. 2005. - V.25. - № 50. -PI 1676-11683.

160. Yoshina-Ishii C., Chan Y.-H. M., Johnson J. M., Kung L. A., Lenz P., Boxer S.

161. G. Diffusive dynamics of vesicles tethered to a fluid supported bilayer by single-particle tracking // Langmuir. 2006. - V.22. - № 13. - P.5682-5689.

162. Zador A. M. and Dobrunz L. E. Dynamic synapses in the cortex // Neuron.1997.-V.19.-P.1-4.

163. Zengel J. E. and Sosa M. A. Changes in MEPP frequency during depression ofevoked release at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 1994. -V.477. - № 2. - P.267-277.

164. Zucker R. S. Calcium- and activity-dependent synaptic plasticity // Curr. Opin.

165. Neurobiol. 1999. - V.9. - № 3. - P.305-313.

166. Zucker R. S. Short-term synaptic plasticity // Ann.Rev. Neurosci. 1989. - V12.-P.13-31

167. Волькенштейн M.B. Общая биофизика // M.: Наука. 1978. - С.590.

168. Гладков JI.A., Курейчик В .В., Курейчик В.М. Генетические алгоритмы //

169. М.: Физматлит. 2006. - С.320.

170. Зефиров A. JI. Везикулярный 1щкл в пресинаптическом нервном окончании

171. Российский физиологический журнал. 20076. - Т.93. - № 5. - С.544-562.

172. Зефиров А. Л. Механизмы эндоцитоза в синаптических образованиях //

173. Восьмые Анохинские чтения. Москва. 2007а. - С.23-32.

174. Зефиров А. Л., Григорьев П. Н., Петров А. М., Минлебаев М. Г., Ситдикова

175. Г. Ф. Прижизненное флуоресцентное исследование двигательного нервного окончания лягушки с использованием эндоцитозного маркера FM 1-43 //Цитология. 2003. - Т.45. - № 12. - С. 1163-1171.

176. Зефиров А. Л., Черанов С. Ю. Молекулярные механизмы квантовойсекреции медиатора в синапсе. // Успехи физиол. наук. 2000. - Т.31. -№ 3. - С.3-22.

177. Зефиров А.Л., Абдрахманов М.М., Григорьев П.Н. "Kiss-and-run" механизмсекреции кванта медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. - Т. 137. -№ 2. - С.124-129.

178. Петров A.M., Зефиров А.Л. Кинетика рециклирования синаптическихвезикул в двигательном нервном окончании лягушки // Сборник статей "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино. 2005. - С. 178181.

179. Рубин А.Б. Биофизика // МГУ. 1999. - т.2. - С.464.

Информация о работе

Захаров, Андрей Викторович
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Особенности рециклирования синаптических везикул в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы