Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль холестерина мембраны в секреции медиатора и экзоцитозе синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль холестерина мембраны в секреции медиатора и экзоцитозе синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях"

На правах рукописи

Тараканова Оксана Ивановна

РОЛЬ ХОЛЕСТЕРИНА МЕМБРАНЫ В СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА И ЭКЗОЦИТОЗЕ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В ДВИГАТЕЛЬНЫХ НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЯХ

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005020084

Г ДПР Ш

Казань-2012

005020084

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Научный руководитель: член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Зефиров Андрей Львович

Официальные оппоненты:

Гайнутдинов Халил Латыпович, доктор биологических наук, профессор, в.н.с., зав. лабораторией клеточных механизмов формирования памяти биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) Федерального Университета Исакова Лариса Сергеевна, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой нормальной физиологии Ижевской Государственной Медицинской Академии

Ведущая организация: - ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита состоится «17» апреля 2012 г. в «_ » часов на заседании

Диссертационного совета Д 212.078.02 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Федерального агентства по образованию и науке РФ но адресу: 420008, г. Казань, ул. Левобулачная, д. 44

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35.

Автореферат разослан «-/ó> Л ҐСі'/'ГГ?^ 2012 г. Ученый секретарь

диссертационного совета

Зефиров Тимур Львович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Секреция медиатора в химическом синапсе происходит в результате экзоцигоза — слияния мембраны синоптической везикулы (СВ) с пресгаштпиеской мембраной, в результате которого порция (квант) медиатора выделяется в синшттическую щель (Sudhof Т. С., 2004). В естественных условиях для инициации этого процесса потенциалом действия (ГЩ) необходима деполяризация, вход ионов Са в нервное окончание (110) и координированная активность многих белков (Зефиров А.Л., Петров A.M., 2010.). Затем с помощью клгприн-опоередованного эидоцитоза происходит захват мембранного фрагмента слившейся везикулы внутрь НО — образование новой везикулы, которая после заполнения медиатором может повторно участвовать в секреции медиатора. Процессы эюо - и эидоцитоза СВ составляют везикулярный цикл, который определяет уровень секреции медиатора при высокочастотной активности синапса (Betz WJ„ et. at., 2005; Зефиров АЛ, 2007; Levitan E.S., et al., 2010).

Исторически так сложилось, что белкам, вовлеченным в процессы экзо- и эидоцитоза СВ, уделялось больше внимания; но в последние время, благодаря развитию нопых методов исследования, стало совершенно ясно, что липиды мембран также вносят существенный вклад в пресинаптичсские функции. (Rohrbough J., et al., 2005; Зефиров A.JL, Пегров A.M., 2010). Например, мембранный холестерин помогает контролировать текучесть и кривизну мембран, что важно для способности мембран деформироваться и сливаться. Внедряясь между хвостиками сфинголипидов мембраны, холестерин может определять свободу передвижения погруженных d мембрану белков и даже изменять их функцию (Зефиров А.Л., Петров A.M., 2010; Levitan I., et al., 2010; Rosa P., et al., 2010). Присутствие холестерина необходимо для поддержания свойственной синапсу структуры и функционирования мозга (Herring D., et al., 2003; Pfrieger F.W., 2003; Salami С., et al.. 2004; Rohrbougli J., et al., 2005). Показано, что во время развития мозга, холестерин, вырабатываемый глией, усиливает процесс синашогенеза (Mauch D.H., et al., 2001; Pfrieger F.W., 2003; Gorilz С., et al., 2005). В хромаффинных клетках удаление холестерина из плазматических мембран разрушает кластеры синтаксина. тем самым уменьшая секрецию катсхоламииов

(Chamberlain L.H., et al., 2001; Lang T., et al„ 2001; Gil С., et al., 2005; Salaun C., et al., 2005). Велико содержание холестерина и в мембранах СВ (Deutsch Е., et al., 1981), где он взаимодействует с несколькими везикулярными белками (синапгобревни, синалтофизин) (Thiele С., et al., 2000).

На поверхности мембраны существуют, так называемые, «липидные плотики» - маленькие (10-200нм), динамичные, гетерогенные домены с высокой концентрацией холестерина и сфинголипидов, предназначенные для компартментализации клеточных процессов (Pike L.J., 2006). Показано, что холестерин «липидных плотиков» модулирует многие клеточные функции, изменяет активность ряда белков, например: Na/K-АТФазы. аденилатциклазы, метаботропных рецепторов, Са-канапов, NO-синтазы, НАДФН -оксидазы и т. д. (Pftieger F. W., 2003;' Taverna E., et al, 2004;- Weixing H., et al.. 2008). Недавно липидные плотики были обнаружены и в пресинаптических мембранах двигательных нервных окончаний лягушки и мыши в областях, где протекают экзо-и эндоцкгоз СВ (Петров A.M., и др., 2011). Сегрегация белков экзоцитоза и Са-каналов, в так называемые «липидные плотики», содержащие холестерин в высокой концентрации, может быть важным механизмом, управляющим слиянием везикулы (Зефиров АЛ., Петров A.M., 2010).

В настоящей работе делается попытка оцештгь влияние холестерина плазматических мембран на функционирование нервно-мышечного синапса холоднокровных и теплокровных животных и процессы секреции медиатора из двигательных НО. Цель и задачи исследования:

Целью данного исследования явилось изучение роли холестерина плазматической мембраны в процессах секреции медиатора и экзоцитоза СВ в двигательных нервных окончаниях лягушки и мыши. Для этого использовали два подхода: удаление холестерина из мембраны метил-р-циклодекстрином (МЦД) и ферментативное окисление мембранного холестерина холссгерол оксидазой (ХО). В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи: 1. Оценить изменение содержания холесгсрина в мембранах нервно-мышечных препаратов лягушки и мыши, обработанных МЦД в различных концентрациях.

2. Исследовать эффекты МЦД на параметры спонтанной секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши.

3. Проанализировать влияние МЦД на вызванную секрецию медиатора и электрогенез НО при редком и высокочастотном раздражении в условиях пониженной внеклеточной концентрации ионов кальция.

4. Исследовать влияние МЦД на динамику секреции медиатора при высокочастотном раздражении в условиях высокой (нормальной) внеклеточной концентрации ионов кальция.

5. Изучить динамику экзо - и эндоцитоза СВ при помощи флуоресцентного метода на фоне действия МЦД.

6. Исследовать эффекты ХО на спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе.

Положения, выносимые на защиту:

1. Холестерин пресинаптической мембраны является фактором, ограничивающим спонтанное освобождение медиатора. Удаление более 50% холестерина из мембран при действии больших доз МЦД (10 ммоль/л) вызывает Са - независимое увеличение частоты миниатюрных одноквантовых постсинаптических сигналов.

2. Секреция медиатора и процессы кратковременной пластичности в синапсе чувствительны даже к небольшим изменениях» содержания холестерина в мембране. Небольшое (10-20%) вымывание холестерина из мембран с помощью малых концентраций МВД (1 ммоль/л) приводит к угнетению экзоцитоза СВ и вызванной секреции медиатора в ответ на одиночные раздражения, уменьшению выраженности облегчения и увеличению выраженности депрессии при высокочастотной активности.

Научная новизна

Впервые показана важность холестерина в контроле соотношения спонтанной и вызванной секреции медиатора в двигательных НО лягушки и мыши. Обнаружено усиление спонтанной секреции при удалении большого количества холестерина из мембран. Показано, что повышение интенсивности спонганной секреции при действии МЦД не зависит от вне- и внутриклеточной концентрации ионов Са. Умеренная экстракция холестерина из плазматических мембран угнетает

вызванную секрецию, уменьшает выраженность облегчения и депрессии секреции медиатора при высокочастотном раздражении. Резкое уменьшение пула мембранного холестерина блокирует проведение ПД по нерву, тем самым полностью подавляя вызванную секрецию.

В работе впервые сделана попытка сравнить эффекты прямого удаления холестерина из плазматических мембран с ферментативным окислением холестерина мембраны на секрецию медиатора из двигательных НО. Оказалось, что в отличие от удаления холестерина из мембран, его окисление не имеет выряженных эффектов на интенсивность спонтанной секреции, но увеличивает время спада миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП), и незначительно угнетает вызванное освобождение медиатора. Научно-практическая ценность

Данная работа носит фундаментальный характер. Полученные результаты позволяют дополнить знания в понимании механизмов, управляющих такими витальными процессами, как сгю1гтшшая и вызванная секреция, экзоцитоз и транспорт СВ, внутриклеточная сигнализация, электрогенез нервных волокон. Результаты работы могут быть полезны для объяснения явлений, происходящих в нейронах центральной нервной системы и клетках, активно использующих процессы экзо - и эндоцитоза Полученные данные позволяют считать, что холестерин плазматической мембраны выступает как организатор спонтанной и вызванной секреции в нервно-мышечном синапсе. Исследование может помочь разобраться в механизмах, лежащих в основе патологических состояний, связанных с нарушением кругооборота холестерина. Работа поддержана грантами Министерства образования и науки Российской Федерации (НШ-5250.2010.4 и МК-3840.2010.4), Российского фонда фундаментальных исследований (№ 11-04-00422-а, №09-04-97015-р).

Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех аланах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных, и оформление публикаций.

Апробация работы

Результаты исследований, выполненные по теме диссертации, доложены па конференциях и форумах: III международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения-2009" (Санкт-Петербург, 2009); на XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (г. Калуга, 2010): международном симпозиуме «Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Пущино, 2010); XV международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2011); международном молодежном научном форуме «Ломоносов», (Москва, 2010, 2011); международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2011); VII международном междисциплинарном консрессе «Нейронауха для медицины и психологии» (Крым, Украина, 2011); всероссийских конференциях с международным участием "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2010,2011); на заседании кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета (2011).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликопано 14 печатных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых журналах (нз списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном медицинском университете. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологам Казанского государственного медицинского университета.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация объемом 125 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 328 источника, из них 14 отечественных и 314 -иностранных. Диссертация содержит 20 рисунков, 2 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-грудшшой мышцы лягушки (Rana ridibunda) и диафрагмальной мышцы мышей (дикий тип). После выделения нервно-мышечный препарат помещали в ванночку объемом 7 мл. Все эксперименты выполнены при постоянной наружной перфузии препарата раствором Рингера для холоднокровных следующего состава (ммоль/л): NaCl — 115.0; К Cl — 2.5; СаС12 — 1.8; NaHCOj — 2.4. Дня теплокровных животных использовали раствор Кребса (мМмь/л): NaCl —.144,0; КС1 — 5,0; MgCl2

- 1,0; СаСЬ- 2,0; NaH2P04 — 1,0; NaHCOj —2,4; СбНІ206— 11,0. В экспериментах с высокой концентрацией CaJf (1,8 ммоль/л) блокирование мышечных сокращений достигалось за счет добавленій d-тубохурарина (3-5 мкмоль/л). В некоторых экспериментах использовались модифицированные растворы Рингера и Кребса с пониженной концентрацией Ca2t (03-0,5 ммоль/л) и добавлением MgJt" (4,0 ммоль/л). Все эксперименты проведены при температуре 20°С, рН поддерживался на постоянном уровне 7.2-7.4. Раздражение двигательного нерва осуществляли прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой силы с частотой 0,5

- 50 нмп/с.

В экспериментах применяли следующие фармакологические препараты: МІЩ в концентрации 0,1; 1; 5; 10 ммоль/л который вымывает холестерин га мембраны (Yancey P.G., et al., 1996); холестерол оксидаза (ХО) (из бактерий рода Streptomyces sp,l активная едітица) - окисляющая холестерин до образования холест -4- ен-3- она; ионы Cd 1 ммоль/л; ВАРТА-АМ (l,2-b¡s(2-Am¡nophenoxy)ethane - N,N,N\N'-teiraacetic acid acetoxymethyl ester) - «быстрый» мембранопроникающий кальциевый буфер. Нервно-мышечные препараты выдерживались в инкубационном растворе (концентрация буфера - 100 мкмоль/л, DMSO - 0,1%, Pluoronic - 0,01%), в течение 1 часа. Филипин III - флуоресцентный антибиотик, специфически связывающийся с холестерином (0.05 мг/мл в PBS) (Mukherjee D., et al., 1998); для фиксации препаратов - параформальдегид (3%), фосфатный буфер (PBS), содержащий 1,5 мг/мл глицина. Все использованные вещества фирмы «SIGMA» (США).

Регистрация сииаптических сигналов. Метод внеклеточного отведения использовался в экспериментах с пониженной внеклеточной концентрацией ионов

Са и увеличенной концентрацией ионов М§ (Зефиров АЛ., и др., 1990). Для внеклеточной регистрации использовали стеклянные микроэлектроды, заполненные раствором ЫаС1 (2 моль/л), с диаметром кончика 1-2 мкм и сопротивлением 1 -5 МОм. Электрод прижимали к поверхностно лежащему НО и регистрировали спонтанные, миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП) и вызванные раздражением двигательного нерва ответы нервного окончания и токи концевой пластинки (ТКП). Частоту МТКП определяли по среднему интервалу времени между соседними МТКП (в с"1). Квантовый состав ТКП рассчитывали, используя метод выпадений, по формуле ш = 1п(Ы/Ы0), где N - общее количество раздражений, а N0 - количество раздражений, не вызвавших появления ТКП. Синаптическую задержку определяли как интервал времени между пиком пресинаптического ПД (ответ НО) и началом одноквантового ТКП. Для анализа использовали 250-600 ТКП или МТКП. При длительном высокочастотном раздражении (10 или 50 имп/с- 300 раздражений) рассчитывали среднюю амплитуду ТКП в ответ на каждые 50 раздражений в серии.

Метод внутриклеточной регистрации использовали при высоких внеклеточных концентрациях ионов Са. Исрвио-мышечный препарат лягушки раздражали 20 имп/с. Использовали стеклянные микртлектроды с диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 2-10 МОм, заполненные 3 модь/л раствором КС1. Введение микроэлеюрода в мышечное волокно осуществляли в области НО под визуальным контролем. Этот вид отведения использовался для анализа вызванных, многоквантовых потенциалов концевой пластинки (ПКП), возникающих в ответ на длительное высокочастотное раздражение двигательного нерва. После регистрации ПКП рассчитывали квантовый состав (ш) каждого ПКП при определение квантового размера (с^ через дисперсию амплитуды ПКП. (Штср^ а, е1 а1., 1965; НиЬЬап! 1.1., е1 а1, 1973; Зефиров А.Л., и др., 2008). В основе метода лежат предположения о неизменности количества медиатора в везикуле, неизменности чувствительности постсинапгической мембраны к медиатору в процессе ритмического раздражения и пропорциональности амплитуды ПКП количеству освободившихся квантов. В массиве значений

амплитуд ПКП, полученном при длительном ритмическом раздражении, выбирали

участок, в котором рассчитывали квантовую величину по формуле: q = .

где о2 -дисперсия амплитуды ПКП на выбранном участке, <У>-средняя амплитуда ПКП.

Флуоресцентная микроскопия. Для выявления холестерина применяли флуоресцентный антибиотик фнлипнн III, связывающийся с холестерином в соотношении 1 к 1. Мышцы погружали на 1 час в 3% раствор параформальдегида, после чего на 10 мин помещали в раствор фосфатного буфера (PBS), содержащий 1,5 мг/мл тлицииа, затем в течение 2 часов выдерживали в растворе филипииа III (0.05 мг/мл в PBS). В заключении, тщательно промывали препарат в растворе PBS. Для регистрации флуоресценции фшшпина III использовался набор светофильтров Olympus: U-MNU2; для регистрации свечения FM 1-43 - U-MNB2. В экспериментах для анализа экзоцитоза СВ, использовали флуоресцентный краситель - FM 1-43 C'BiotiunT США) в концентрации 2 мкмоль/л. Краситель обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся СВ ("загружается" в ПО). При загрузке красителя в НО появляются светящиеся пятна, отражающие скопления меченых FM 1-43 везикул в области A3, прошедших цикл экзо-эндоцигоза (Betz W. J. et al., 1992, 1993; Зефиров А. Л., и др., 2003). С целью уменьшения неспецифичсского свечения за счёт связывания красителя с поверхностными мембранами использовали ADVASEP-7 в концентрации 1 мкмоль/л (Biotium, США). За«рузку красителя в НО осуществляли при частоте раздражения 20 имп/с. После этого препарат отмывался в течение 40 мин в стандартном растворе. Чтобы выяснить динамику экзоцитоза, СВ предварительно метили красителем (загружали краситель в НО). Для этого двигательный нерв нервно-мышечного препарата раздражали в течение трёх минут. FM1-43 присутствовал в растворе как во время стимуляции, так и в течение 5-15 минут после её окончания. Такой протокол позволяет загрузить красителем практически все везикулы, участвующие в секреции медиатора (Richards D. A., et al., 2000).

Для анализа процессов экзоцитоза и рециклирования СВ осуществляли выгрузку красителя. Для этого нервно-мышечный препарат стимулировали с

частотой 20 имп/с в течение 10 минут, анализируя снижение интенсивности флуоресценции. Флуоресценцию наблюдали с помощью микроскопа МИКМЕД-2 ("ЛОМСГ, Санкт-Петербург) или Olympus BX-51WI. Все наблюдения проводили только на поверхностно лежащих НО. Для фиксирования картин флуоресценции использовали CCD чёрно-белую видеокамеру (F-View II), совмещенную с персональным компьютером. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах (o.e.), принимая максимальное свечение пикселя за единицу. Фоновое свечение оценивали при аппликации красителя в омывающий раствор на одну минуту в отсутствии стимуляции. Фоновое значение впоследствии вычитали из каждого пикселя полученного после изображений.

Достоверность полученных данных достигалась использованием достаточного и представительного объема экспериментальных исследований, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием математического анализа и статистического метода. Достоверность различий между популяциями оценивали по критерию Стыодента.

Флуоресцентно-микроскопические эксперименты выполнены совместно с A.M. Петровым (ст. преподавателем каф. норм, физиологииКГМУ, к.б.и.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения концентрации холестерина в мембранах нервно-мышечных препаратов лягушки и мыши, обработанных МЦД.

Для оценки вымывания холестерина из мембран мы использовали флуоресцентный антибиотик фшжпил III (см. методику), флуоресценция которого служит индикатором содержания холестерина в поверхностных мембранах. Свечение поверхностных мембран препаратов лягушки, обработанных 1 ммоль/л МЦД, уменьшалось до 79.2±6.4% (п=5). Увеличение концентрации МЦД до 5 и 10 ммоль/л приводило к еще более значительному снижению флуоресценции до 50,2±4.5 и 40,3±5.1% (п=5), соответственно. Флуоресценция плазматических мембран препарата мыши после обработки 1 ммоль/л МЦД составило 863±6.5% (п=5) . В случае применения 5 и 10 ммоль/л МЦД, свечение падало до 50.2±4.5% и 20,3±5.1% (п=5), соответственно (рис. 1).

Таким образом, МЦЦ дозозависимо вызывает удаление холестерина из поверхностных мембран нервно-мышечных препаратов: при этом 1 ммоль/л МЦД вымывает 10-20% холестерина, а 10 ммоль/л МЦЦ удаляет более 50% холестерина из мембран. В экспериментах с филипином III в препаратах лягушек и мышей окрашивались как мембраны мышечных волокон, так и аксонов. Следует отметить, что удаление холестерина из поверхностных мембран с помощью 10 ммоль/л МЦД приводило к особенно сильному снижению флуоресценции в мембранах аксонов.

Влияние МЦД на спонтанную секрецию медиатора из двигательных НО.

В растворе с пониженной концентрацией ионов Са, частота МТКП в контроле в синапсах лягушки и мыши составляла 0,33 ± 0,04 с'1 (п=10) и 1.15 ± 0,21 с'1 (п=10). Время нарастания и полуспада МТКП составляли 0,25 ± 0,01 и 1,00 ± 0,05 мс у лягушки и 0,27 ±0,01 и 0,98 ± 0,04 мс, у мыши. Получасовая аппликация МЦД в концентрации 0,1-1,0 ммоль/л не изменяла частотных и амплитудно-временных параметров МТКП. Более высокая концентрация (10 ммоль/л) приводила к значительном)" увеличению частоты МТКП (р < 0.01), которая у лягушки составила 2,16 ± 0,37 с"1 (п=5), а у мыши 3,21 ± 0.38 с"1 (п=5), (рис. 2). В таких концентрациях МЦД не влиял на амплитуду МТКП, но увеличивал время полуспада МТКП у лягушки до 1,47+0,33 мс, а у мыши до 1,1+ 0,03 мс.

Представленные данные, свидетельствуют о том, что существенное вымывание холестерина из мембран оказывает пресинаптический эффект, приводя к усилению спонтанной секреции медиатора. Небольшое увеличение длительности полуспада МТКП свидетельствует и о постсшшггичеком действии МЦД. Возможно, что значительное вымывание холестерина из постсинаптической мембраны изменяет кинетику работы каналов холинорецепторов.

Рис. 1. График изменения флуоресценции филипина III в нервно-мышечных соединениях лягушки и мыши, обработанных МЦД.

На графике показана интенсивность свечения филипина III (%) в мембранах нервно-мышечных препаратов лягушки и мыши в контроле (100%) и после удаления холестерина из мембран МЦД 1,0:5,0:10,0 ммоль/л. Концентрация 1 ммоль/л МЦД вымывает 10-20%, 5 ммоль/л МЦД около 40-50%, а МЦД в концентрации 10 ммоль/л удаляет более 50% холестерши из мембран, как у лягушки, так и у мыши.

Эффекты МЦД на частоту МТКП при уменьшении концентрации ноиов Са в НО.

Для выяснения механизма усиления спонтанной секреции медиатора при значительном снижении содержания холестерина в мембранах были проведены дополнительные эксперименты. Повышение частоты спонтанной секреции медиатора при высоких концентрациях МЦД может быть связано с увеличением внутриклеточной концентрации ионов Ca(Anglcson J.K., et al., 2001), при удалении из мембраны значительного количества холестерина. Для выяснения роли внутриклеточных ионов Са на частоту МТКП, мы провели эксперименты с использованием блокатора Са -каналов - ионов Cd (1 ммоль/л) или бес кальциевых растворов. При этих воздействиях нарушается поступление ионов Са в НО из внеклеточной среды. В ряде экспериментов использовали хелатор ионов Са (ВАРТА-АМ), который эффективно и быстро связывает ионы Са (Adler Е.М., et al., 1991). Добавление МЦД (10 ммоль/л) на фоне действия ионов Cd (1 ммоль/л) или ВАРТА-АМ (100 мкмоль/л) в синапсах лягушки приводило к увеличению частоты МТКП до 4±0,7 с"1 и 6±1,1 с'1 (п-5), соответственно. В бескальциевых растворах

аппликация МЦЦ в синапсах мыши вызывала увеличение частоты МТКП до 2,7±0,6 с"'(п=5). которое не отличалось от увеличения в растворах с ионами Ca.

Таким образом, можно считать, что усиление спонтанной секреции медиатора при действии высоких концентраций МЦЦ имеет кальций-независимый характер. Возможно, что истощение холестерина может увеличивать вероятность спонтанного слияния везнкул путем простого изменения биофизических свойств мембраны.

Действие МИД ия элестрогенез двигательного НО.

В условиях с пониженной концентрацией ионов Ca в растворе, раздражение двигательного нерва МЦЦ в концентрациях 0,1 и 1,0 ммоль/л не оказывало каких-либо эффектов на амплитуду н форму электрического ответа нервного окончания (отражающего ионные токи при распространении пресинаптического ПД) (п=6). Однако при концентрации 5 ммоль/л происходило некоторое уменьшение амплитуды и расширение ответа НО, а при 10 ммоль/л ответ ИО резко уменьшался (п=6) и примерно в 2/3 экспериментов исчезал (рис. 2). Это свидетельствует о том, что значительное уменьшение холестерина в мембране аксона и НО приводит к нарушению генерации и распространения ПД. Причины снижения возбудимости неизвестны и требуют дальнейших исследований. Можно предполагать, что истощение холестерина изменяет функцию Na- и К- каналов и/или снижает активность Na-K насоса (Cornelius F., 2001). Поскольку высокие концентрации МЦЦ (5-10 ммоль/л) приводят к нарушению электрогенеза НО, все дальнейшие эксперименты проводились при концентрации 1 ммоль/л.

Влияние МЦД на квантовый состав ТКП.

Вслед за ответом 110 (пресинаптическим ПД) регистрируются преимущественно одноквантовые ПСП, отражающие вызванное освобождение медиатора. В контроле, при низкой внеклеточной концентрации ионов Ca (0,3 ммоль/л), средний квантовый состав ТКП в синапсах лягушки составлял 0,52±0,07 (п=10). а в синапсах мыши - 0,96±0,16 (п-10). Обнаружено, что при концентрации 1 ммоль/л происходило достоверное (р < 0.05) снижение квантового состава ТКП до

0,33±0,07 (и=5) и 0,21±0,11 (п=5) в синапсах лягушки и мыши, соответственно (рис. 2).

Как известно, низкие концентрации МЦД (1 ммоль/л) вымывают холестерин преимущественно из мембранных микродоменов (плотиков) (Besenicar М.Р., 2008), присутствующих в сайтах жзоцитоза (Петров A.M., и др., 2011), в то время как высокие (10 ммоль/л и более) - из всех мембран. Возможно, что при низких концентрациях МЦЦ происходит дезорганизация активных зон, ведущая к снижению активности и/или колокализации белков экзоцитоза и Са- каналов (Тараканова О.И, и др., 2011; Rosa Р., el al., 2010), в результате снижается вызванная секреция медиатора.

<М|1

Контроль ЮмМ МЦД

I^wíhJMK»*» iiid »uln iiJlLl

Контроль

J*

ЮмМ МЦД і*

ч

Контроль I'

1 ММ МЦ Д V ЮмМ МЦД

a/V.

Рис. 2. Влияние МЦД на спонтанную и вызванную секрецию медиатора из двигательных НО лягушки (А) и мыши (Б).

На верхней панели изображено изменение частоты МТКП при действии 10 ммоль/л МЦД. На нижней панели представлены усредненные (50 реализаций) ответы при раздражении двигательного нерва (пресниаптический ПД указан одной стрелкой, а ТКП - двойной) в контроле и на фоне действия 1 и 10 ммоль/л МЦД.

Выраженность облегчения секреции медиатора при высокочастотном ритмическом раздражении на фоне действия МЦД.

Опыты проводили на нервно-мышечных препаратах лягушки. В контроле при низкой внеклеточной концентрации ионов Ca (0,3 ммоль/л) высокочастотное ритмическое раздражение (10 или 50 имп/с) сопровождалось развитием облегчения, которое выражалось в постепенном увеличении средней амплитуды и квантового состава ТКП. Выраженность облегчения оценивали по средней амплитуде ТКП, которую определяли на каждые 50 раздражений в ритмической серии (1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300 раздражения). В дальнейшем определяли % увеличения средней амплитуды ТКП по сравнению с первыми 50 раздражениями. При раздражении с частотой 10 имп/с средняя амплитуда ТКП (рассчитанная в ответ на 250-300 раздражение) возрастала до 144,02±32,6 % (п=10). При частоте 50имп/с рост амплитуды был более значигелен-доч535,4±75,5 %. На фоне действия МВД (I ммоль/л) выраженность облегчения секреции медиатора резко уменьшалась, что выражалось в уменьшении роста средней амплитуды ТКП в процессе высокочастотной активности. В конце высокочастотного раздражения средняя амплитуда ТКП возрастала до 118,Oil 0,4 % (10имп/с) и 251,7±24,3 % (50имп/с) (п=10) (рис.3).

По последним данным, в развитии облегчения принимают участие высокоаффшшые сайты связывания ионов Ca - "сайты облегчения" (Fisher SA., et а!.. 1997; Zhang L, et al., 1996: Zuckcr R. S., et al„ 2001). относительно удаленные от Ca-каналов (по сравнению с белками экзоцитоза). Можно думать, что экстракция холестерина и дезорганизация активных зон нарушает взаимодействие этих сайтов с остаточными ионами Ca, что и ведет к резкому снижению облегчения.

лягушся

Шіімш/С 5»ЯН№

мыть

Рис. 3. Динамика изменений амплитуды ТКП при высокочастотной активности в контроле и под действием МЦД 1 ммоль/л.

Показано развитие облегчения секреции медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки в контроле (черные квадраты) и на фоке действия МЦД (1 ммоль/л) (белые кружки) при раздражении с частотой 10 и 50 имп/с.

Влияние МЦД на депрессию секреции медиатора при длительном высокочастотном раздражении.

Опыты проводили на нервно-мышечных препаратах лягушки. В данных экспериментах использовали серию длительного (300 стимулов) высокочастотного (10 или 20 ими/с) раздражения. В контрольных экспериментах длительное высокочастотное раздражение двигательного нерва сопровождалось характерными изменениями. Вслед за коротким периодом облегчения наблюдалось быстрое уменьшение амплитуды и квантового состава ПКП, которое сменялось более медленным спадом. Квантовый состав первого ГЖП в серии составил 1145±230 (п=15). К 300 раздражению с частотой 10 имп/с квантовый состав ПКП был 2,2±0,2 раза меньше квантового состава первого ПКП (рис. 4). Выдерживание препарата в растворе с МЦД (I ммоль/л) приводило к снижению квантового состава ІЖГІ первого ПКІ1 до 907+85 (п=15), а выраженность депрессии возрастала (квантовый состав 300 ПКП был в 3,4±0,4 раза меньше первого). Аналогичная ситуация наблюдалась при частоте раздражения 20 имп/с (п=15). Количество квантов медиатора, освободившихся при высокочастотном раздражении в контроле, составило 195306±63975 и 129275*30374 для 10 и 20 имп/с. соответственно. При

получасовой аппликации препаратов в МЦЦ 1 ммоль/л количество квантов медиатора, освободившихся при стимуляции с частотами 10 и 20 имп/с существенно снижалось, и составило 125664±10076 и 99669±15046, соответственно.

Полученные данные позволяют считать, что вымывание холестерина при высоких внеклеточных концентрациях ионов Са, наряду со снижением квантового состава ПКП, усиливает выраженность депрессии секреции медиатора при высокочастотном раздражении. Снижение квантового состава ПКП обычно сопровождается уменьшением выраженности депрессии секреции медиатора при высокочастотной активности (Зефиров А.Л., Мухамедьяров М.А., 2004), что отличается от эффектов МИД, полученных в наших экспериментах. Можно думать, что вымывание холестерина приводит к угнетению мобилизации квантов медиатора из резервного в готовый к освобождению пул, что ведет к уменьшению секреции медиатора в процессе высокочастотной активности.

лягушка

1®вш&

Дниш/с

т ш

I 2 « • I щ>мя«ааяхж! время, сек.

»рема, да«.

Рис. 4. Влияние МЦЦ на депрессию секреции медиатора при длительном высокочастотном раздражении.

Выдерживание препарата в растворе с МЦД (1 ммоль/л) и стимуляция частотой 10 имп/с приводила к снижению квантового состава ПКП, а выраженность депрессии возрастала. Аналогичная ситуация наблюдалась при частоте раздражения 20имп/с.

Изменения загрузки красителя FM1-43 в НО на фоне действия МЦД.

В контрольных условиях интенсивность свечения загруженных красителем НО (20 имп/с, 3 мин) составила 120±5 o.e. (п=7), свечение пятен 145±4 o.e. (п=7). Морфометрическнй анализ показал, что диаметр нервных терминалей составляет 1.25±0.15 мкм (п=7). светящиеся пятна относительно равномерно распределены по терминали на расстоянии 1—3 мкм друг от друга н обычно имеют характерную овальную форму (Зефиров АЛ., и др., 2003). Мосле предварительного (30 мин) действия МДЦ интенсивность флуоресценции загруженных IIO была значительно меньше - 60±5 o.e.. свечение пятен 75±3 o.e. (п=7, рис. 5). При этом размеры и топография пятен не отличались от контрольных. Для нервно-мышечного синапса мыши в контроле интенсивность свечения загруженных красителем ПО (20 нмп/с, 3 мин) составила 188±5 o.e. (п=7), свечение пятен 198±5 o.e. (п=7). Пекле предварительного (30 мин) действия МДЦ интенсивность флуоресценции загруженных НО была значительно меньше - 89±5 o.e. свечение пятен 98±4 o.e. (п=7. рис. 5).

лягушка

мышь

контроль

МЦД

контроль МЦД

Рис. 5. Загрузка маркера FM1-43 в двигательные НО лягушки и мыши.

Нервно-мышечные препараты загружались стимуляцией 3 мин 20 Гц при этом краситель FM1-43 присутствовал как во время раздражения, так и 15 мин после завершения стимуляции. Предварительная получасовая экспозиция иервно-мышечных препаратов в физиологическом растворе с 1 ммоль/л МЦЦ приводила к снижению интенсивности зшрузки. По оси ординат - интенсивность флуоресценции пятен в контроле и в опыте (o.e.).

Нарушение загрузки красителя в НО при действии 1 ммоль/л МЦД скорее всего свидетельствует не о нарушении процесса эндоцитоза, а об уменьшении количества СВ, подвергшихся экзоцитозу в процессе высокочастотной активности.

Динамика выгрузки красителя РМ1 -43 из НО на фоне действия МЦД.

В котроле при длительной высокочастотной стимуляции (20 имп/с, ] 0 минут) двигательного нерва препаратов лягушки, НО которых были предварительно зшружены Краси101ем, снижение интенсивности флуоресценции происходило в дне фазы — сначала быстро, а затем медленнее. Через 3 мин. стимуляции интенсивность свечения падала до 42 ± 2 % (п = 7) (рис.6). Обработка нервно-мышечного препарата МЦД 1 ммоль/л заметно замедляла выгрузку красителя особенно вначале высокочастотной стимуляции. Поэтому через 3 мин стимуляции яркость свечения снижалась только до 57±3 %.

Рис. 6. Динамика выгрузки красителя РМ1-43 из двигательных НО лягушки и мыши при высокочастотном раздражении в контроле и на фоне действия

МЦЦ 1 ммоль/л.

Показаны графики снижения интенсивности флуоресценции НО, загруженных РМ1-43 при высокочастотной стимуляции в контроле (черные квадраты) и в оньгге (белые кружки). Обработка нервно-мышечных препаратов МИД 1 ммоль/л заметно замедляла выгрузку красителя из двигательных НО. как лягушки, 'гак и мыши.

Для нервно-мышечного синапса мыши в контроле интенсивность свечения через 3 минуты стимуляции составила 41,9+4 % (п=5). Предварительная обработка

НО мыши 1 ммоль/л МЦД, также как в случае с НО лягушки приводила к замедлению выгрузки красителя. Через 3 минуты стимуляции яркость флуоресценции падала до - 60,4±5 %.

Замедленная выгрузка красителя при высокочастотной стимуляции, так же как и более выраженная депрессия амплитуды ТКП (рис. 4), скорее всего, результат нарушений процессов локирования (или праймироваиия) и доставки синаптических везикул в сайты экзоцигоза, вызванных удалением холестерина из мембраны.

Эффекты ХО на спонтанную и вызванную секрецию медиатора.

Для дальнейшего определения роли холестерина, в условиях с пониженной концентрацией ионов Са в растворе, мы ферментативно окисляли холестерин мембраны, применяя ХО (1 акт. сд.). Холестерин под действием ХО окисляется до образования кетона (холестенон-3), который вероятно может нарушап. липидные функциональные микродомены (Xu J.,et all, 2000; Samsonov М., et all, 2001). Оказалось, что окисление холестерина, также как в случае с МЦД не изменяет амплитуду и время нарастания, но несколько увеличивает время полуспада МТКП, для лягушки - до 1,33+0,08 ме. а для мыши- до 1,11+0,05 мс. На фоне действия ХО частота МТКП не изменялась, составляя 0,28+0,12 с"' для лягушки и 0.88+0.19 с'1 для мыши.

Окисление мембранного холестерина ХО не влияло на амплитудно-временные параметры ответа НО как лягушки, так и мыши. В отличие от удаления холестерина из мембран с помощью МЦД, ферментативное окисление холестерина приводило к небольшому снижению квантового состава ТКП. Под влиянием ХО происходило небольшое снижение квантового состава ТКП до 0,41+0,12 (п=5) и 0,81+0,13 (п-5) в синапсах ляіушкн и мыши, соигвсгегвенно.

Можно думать, что для эффективного осуществления вызванной секреции медиатора важно не только количество присутствующего холестерина в мембране, но и его качественное состояние.

ЛЯГУШКА

Рис. 7. Эффект ХО на секрецию медиатора из НО.

Наложенные друг на друга усредненные (50 реализаций) ответы при раздражении двигательного нерва (пресинагггическнй ПД указан одной стрелкой, а ТКП - двойной) в контроле и на фоне действия ХО (звездочки).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вытеснение холестерина из состава пресииаптической мембраны приводит к снижению секреции медиатора в ответ на одиночные раздражения как при высокой, так и низкой внеклеточной концентрации ионов Са, что свидетельствует об угнетении экзоцитоза СВ. Это угнетение сопровождается более выраженной депрессией секреции медиатора при высокочастотной активности, в результате чего при высокочастотном раздражении освобождается меньше медиатора, чем в контроле. Замедление выгрузки красителя также свидетельствует о нарушении экзоцитоза СВ и их доставки из резервного пула в готовый к освобождению пул. Экстракция холестерина из пресииаптической мембраны приводила к примерно двукратному уменьшению захвата красителя. Однако эта данные нельзя рассматривать как следствие угнетения эндоцитоза СВ. Уменьшение захвата красителя объясняется снижением экзоцитоза СВ (количества освобожденных квантов медиатора) при высокочастотной активности.

Значительное вымывание холестерина из мембраны аксона приводит к нарушению генерации и распространению ПД, и усилению спонтанной секреции медиатора.

Эффекты, реализуемые холестерином плазматической мембраны аналогичны, как в нервно-мышечном синапсе лягушки, так н в нервно-мышечном синапсе мыши.

Резюмируя вышесказанное, можно говорить, что холестерин плазматической мембраны является эндогенным модулятором секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах.

ВЫВОДЫ

1. МВД эффективно вымывает холестерин из плазматических мембран нервно-мышечных препаратов как лягушки, так и мыши.: 1 ммоль/л МЦЦ вымывает 10-20% холестерина, а 10 ммоль/л МВД удаляет более 50% холестерина из мембран.

2. Экстракция холестерина из мембраны двигательных НО лягушки и мыши низкими концентрациями МВД (0,1;1 ммоль/л) не вызывает изменений частоты и амплитудно-временных параметров МТКП, тогда как высокие концентрации МЦЦ (5; 10 ммоль/л) приводят к увеличению частоты МТКП и увеличению времени их полуспада.

3. Блокирование Са-каналов ионами С«3, применение мембранопроипкающкх хелагоров Са (ВАРТА-АМ), а также отсутствие ионов Са в окружающем растворе, не устраняет усиливающий эффект высоких доз МЦЦ на частоту МТКП в нервно-мышечных соединениях лягушки и мыши.

4. Значительное вымывание холестерина из мембран (10 ммоль/л МЦЦ) приводит к нарушению генерации и проведения ПД в НО лягушки и мыши.

5. В растворах, как с низким содержанием ионов Са (0,3 ммоль/л), так и с высоким (1,8 ммоль/л) на фоне действия 1 ммоль/л МЦЦ происходит снижение квантового состава ТКП и ПКП. Эффекты реализуемые I ммоль/л МЦД в нервно-мышечных препаратах лягушки и мыши идентичны.

6. При высокочастотной стимуляции двигательного нерва в условиях низкой внеклеточной концентрации ионов Са, удаление холестерина из мембраны (1 ммоль/л МЦД) вызывает менее выраженное облегчение секреции медиатора.

7. Удаление холестерина из поверхностных мембран (1 ммоль/л МЦЦ) при высоких внеклеточных концентрациях ионов Са ведет к усилению депрессии секреции медиатора при высокочастотном раздражении.

8. Экстракция холестерина из мембраны НО (1 ммоль/л МЦД) приводит к угнетению процессов экзоцитоза СВ и нарушению транспорта везикул к местам экзоцитоза.

9. Окисление холестерина мембраны ХО не влияет на частоту' спонтанной секреции МТКП, но увеличивает время полуспада МТКП.

10. Ферментативное окислснис холестерина мембраны приводит к небольшому уменьшению квантового состава ТКП.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Тараканова О.И. Роль холестерина в процессах экзо-и эндоцитоза синоптических везикул в двигательном нервном окончании лягушки/ А. М. Петров, М. Р. Касимов, А. Р. Гиниатуллин, О. И. Тараканова, АЛ.Зефиров //Российский Физиологический Журнал им. И.М. Сеченова т.957,2009, С. 762-772

2. Тараканова О.И. Роль мембранного холестерина в процессах секреции медиатора из двигательных нервных окончаний/О.И. Тараканова, A.M. Петров, А .Л .Зефиров //Доклады Академии Наук, т.438, №2, 2011, С. 279-281

3. Тараканова О.И. Механизм сопряжения квантовой и неквантовой секреции медиатора в двигательном нервном окончании диафрагмы крысы/ О.И. Тараканова, A J1 .Зефиров, A.M. Петров, Н.В. Науменко, А.Р. Гиниагтуллин, Ю.Г. Одношивкина// Экспериментальная и прикладная физиология, т. 16, 2011, С. 175-187

4. Тараканова О.И. Холестерин в секреции медиатора из диафрагмальной мышцы мышн/ Тараканова О.И. A.M. Петров, АЛ.Зефиров // XXI съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова, Калуга,2010, С. 594

5. Тараканова О.И. Холестерин в экзоцитозе синаптических везикул/ Тараканова О .И. А.М. Петров, А.Р. Гиниатуллин, Р.Д. Мухамедзянов, АЛ.Зефиров // XXI съезд Физиологического общества им. И.П.Г1авлова, Калуга, 2010, С. 595

6. Тараканова О.И. Эффекг экстракции холестерина из мембраны двигательного нервного окончания с помощью мстил-Р-циклодекстрнна/ Тараканова О.ИУ/Международный молодежный научный форум «Ломоиосов-2010», МоскваДОЮ, С.36

7. Tarakanova O.I. Removing of cholesterol from of the motor nerve ending membrane of frog changes the neurotransmitter secretion/ Tarakanova O.U/International Symposium «Biological Motility: from Fundamental achievements to Nanotechnologies» Pushchino,201 0, P.412

8. Тараканова О.И. Холестерин плазматической мембраны в процессах передачи нервных импульсов у позвоночных животных/ О.И. Тараканова, А.Л.Зефиров//Санкг-Петербургскне научные чтения, III Международный молодежный медицинский конгресс, Сапкт-Петербург.2009, С.310-311

9. Тараканова О.И. Участие холестерина мембраны в спонтанной секреции медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши/Тараканова О.И., А.Л.Зефиров//ХУ1 Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине». Казань,2011, С. 135

10. Тараканова О.И. Холестерин плазматической мембраны в процессах передачи нервных импульсов у позвоночных животных/ Тараканова О.И., А.Л.Зефиров//Х\'1 Всероссийский научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине», Казань,2010, С.296

11. Тараканова О.И. Эффект холесгеролоксидазы на секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки/ Тараканова О.И., АЛ-Зефироа'/ Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2011», Москва,2011, С. 32

12. Тараканова О.И. Эффект холесгеролоксидазы на секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши/ Тараканова О.И., А.Л.Зефиров// XV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», Пущино, 2011, С. 154

13. Тараканова О.И. Эффекты холесгеролоксидазы на рециклирование синаптических везикул/ Тараканова О.И., Касимов М.Р., Кудряшова К.Е.. Одношивкина Ю.Г.. Петров А.М.//Мевду народная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино,2011, СЛ14

14. Тараканова О.И. Влияние холесгеролоксидазы на секрецию медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши/ Тараканова О.И., А.Л.Зефиров/Д'Н Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Украина, Судак, 2011, С.410

Подписано в печать 14.03.12 Бумага офсетная. Печать ризографическая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,6 Тираж 100 экз. Заказ 74/3

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. 233-73-59,292-65-60

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тараканова, Оксана Ивановна, Казань

61 12-3/1131

ГБОУ ВПО «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

I

Тараканова Оксана Ивановна

РОЛЬ ХОЛЕСТЕРИНА МЕМБРАНЫ В СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА И ЭКЗОЦИТОЗЕ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В ДВИГАТЕЛЬНЫХ

НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЯХ

03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук профессор А.Л. Зефиров

Казань-2012 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................7

1.1. Актуальность исследования................................................................................7

1.2. Цель и задачи исследования:...............................................................................8

1.3. Научная новизна.....................................................................................................9

1.4. Положения, выносимые на защиту:..................................................................10

1.5. Научно-практическая ценность........................................................................10

1.6. Апробация работы.................................................................................................11

1.7. Реализация результатов исследования............................................................12

1.8. Структура и объем диссертационной работы..................................................12

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................12

1. Нервно-мышечный синапс..................................................................................... 12

1.1. Пресинаптическая область...................................................................................13

1.2. Основные белки активной зоны............................................................................13

1.3. Активная зона двигательного нервного окончания лягушки.............................14

1.4. Активные зоны в двигательных НО крыс и мышей...........................................16

1.5. Синаптические везикулы.......................................................................................17

1.6. Постсинаптическая область нервно-мышечного синапса...............................19

1.7. Квантово-везикулярная теория секреции медиатора........................................19

2. Экзоцитоз...................................................................................................................20

2.1. Этапы экзоцитоза СВ...........................................................................................20

2.2. Сцепление.................................................................................................................21

2.3. Докирование.............................................................................................................21

2.4. Прайминг СВ. SNARE-комплекс............................................................................22

2.5. Регуляция сборки SNARE-комплекса.....................................................................24

2.6. Ионы Са, сенсоры кальция в экзоцитозе ..........................................................26

2.7. Разборка SNARE комплекса...................................................................................28

2.8. Холестерин липидных плотиков и его роль в экзоцитозе СВ.......................30

2.8.1. Что такое липидные плотики...........................................................................30

2

2.8.2. Как образуются липидные плотики..................................................................33

2.8.3. Зачем нужны липидные плотики............................ ...........................................34

2.8.4. Липидные плотики в синоптической передаче................................................35

2.9. Фосфоинозитиды в экзоцитозе СВ....................................................................38

З.ЭндоцитозСВ............................................................................................................39

3.1. Белки вовлеченные в эндоцитоз СВ......................................................................41

3.2. Снятие клатринового покрытия............................... ............................................45

3.3. Механизмы транспорта везикул........................................................................48

3.3.1. Механизмы транспорта везикул и роль актинового цитоскелета...............48

3.3.2. Пути рециклирования и пулы синаптических везикул............... .......................49

3.4.место эндосомальной сортировочной станции в рециклировании везикул...........................................................................................................................52

3.5. ХОЛЕСТЕРИН И эндоцитоз СВ................................................................................53

3.6. Фосфоинозитиды в эндоцитозе..........................................................................55

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................57

1.1. Регистрация синаптических сигналов.............................................................58

1.2. Флуоресцентная микроскопия...........................................................................59

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................61

1.1. Изменения концентрации холестерина в мембранах нервно-мышечных препаратов лягушки и мыши, обработанных МОД...............................................61

1.2. Влияние МЦД на спонтанную секрецию медиатора из двигательных НО. 63

1.3. Эффекты мттд на частоту МТКП при уменьшении концентрации ионов

СавНО...........................................................................................................................65

1.4. Действие МЦД на электрогенез двигательного НО.........................................66

1.5. Влияние МЦД на квантовый состав ТКП........................................................67

1.6. Выраженность облегчения секреции медиатора при высокочастотном ритмическом раздражении на фоне действия МЦД..............................................68

1.7. Влияние мттд на депрессию секреции медиатора при длительном

высокочастотном раздражении................................................................................70

3

1.8. Изменения загрузки красителя ¥М 1 -43 в НО на фоне действия МЦД........71

1.9. Динамика выгрузки красителя КМ 1 -43 из НО на фоне действия МЦД.......72

2. Эффекты ХО на спонтанную и вызванную секрецию медиатора....................75

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ................................77

1.1. Получасовая аппликация нервно-мышечных препаратов в МЦД приводит к дозозависимому вымыванию холестерина из поверхностных мембран..........................................................................................................................77

1.2. Экстракция большого количества холестерина из мембран приводит к усилению спонтанной секреции медиатора. .........................................................78

1.3. Окисление холестерина мембраны не оказывало влияния на секрецию медиатора в покое.......................................................................................................80

1.4. Усиление интенсивности спонтанной секреции не связано с ионами

Са.....................................................................................................................................81

1.5. Эффект удаления и окисления холестерина мембраны на

постсинаптическую область синапса....................................................................81

1.6. Действие МЦ Д на электрогенез двигательного НО.........................................82

1.7. Экстракция холестерина из мембраны 1 ммоль/л МЦД приводит к снижению секреции медиатора при редкой стимуляции.....................................82

1.8. Выраженность облегчения секреции медиатора при высокочастотном ритмическом раздражении на фоне действия МЦД..............................................83

1.9. Влияние МЦД на депрессию секреции медиатора при длительном

высокочастотном раздражении................................................................................84

2. Вымывание холестерина мембраны 1 ммоль/л МЦД вызывает ухудшение

загрузки красителя в двигательные НО лягушки и мыши...................................85

2.1. Удаление холестерина мембраны 1 ммоль/л МЦД приводит к

нарушению экзоцитоза СВ........................................................................................86

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................88

7. ВЫВОДЫ.........................................-....................................................................90

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................92

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СВ - синаптическая везикула; НО - нервное окончание; A3 - активная зона; АХ - ацетилхолин; ФИ - фосфотидилинозитол;

ФИЗ(или 4)Ф - фосфотидилинозитол-3(или 4)-фосфат; ФИ4,5Ф - фосфотидилинозитол-4,5-бифосфат; ФИ-3(4 или 5)-К - фосфотидилинозитол-3(4 или 5) -киназа; МЦД - метил-Р-циклодекстрин; ХО - холестерол оксидаза;

МТКП - миниатюрные токи концевой пластинки; ПКГТ - потенциал концевой пластинки; ТКП - ток концевой пластинки; Са2+ - кальций;

л I

Cd - кадмий;

FM1-43 - флуоресцентный эндоцитозный маркер; J - интенсивность флуоресценции; o.e. - относительные единицы.

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность исследования

Секреция медиатора в химическом синапсе происходит в результате экзоцитоза — слияния мембраны синаптической везикулы (СВ) с пресинаптической мембраной, в результате которого порция (квант) медиатора секретируется в синаптическую щель [Sudhof Т. С., 2004]. В естественных условиях для инициации этого процесса потенциалом действия необходима деполяризация, вход ионов Са в нервное окончание (НО) и координированная активность многих белков [Зефиров А.Л., Петров A.M., 2010]. Затем с помощью клатрин-опосредованного эндоцитоза происходит повторный захват мембранного фрагмента слившейся везикулы внутрь НО — образование новой везикулы, которая после заполнения медиатором может повторно участвовать в секреции медиатора. Процессы экзо - и эндоцитоза СВ составляют везикулярный цикл, который за счет рециклирования СВ обеспечивает сохранение высокого уровня секреции медиатора при высокочастотной активности синапса [Betz W.J., et. al., 2005; Зефиров А.Л., 2007; Levitan E.S., et al., 2010].

Исторически так сложилось, что белкам вовлеченным в процессы экзо- и эндоцитоза СВ уделялась львиная доля внимания; но в последние время, благодаря развитию новых методов исследования, стало совершенно ясно, что липиды мембран также вносят существенный вклад в пресинаптические функции. [Rohrbough J., et al., 2005; Зефиров А.Л., и др., 2010].

Например, мембранный холестерин помогает контролировать текучесть и кривизну мембран, что важно для способности мембран деформироваться и сливаться. Внедряясь между хвостиками сфинголипидов мембраны, холестерин может определять свободу передвижения погруженных в мембрану белков и даже изменять их функцию [Зефиров А.Л., 2010; Levitan I., et al., 2010; Rosa P., et al., 2010]. Присутствие холестерина необходимо для поддержания свойственной синапсу структуры и функционирования мозга [Herring D., et al., 2003; Pfrieger F.W., 2003; Salaun С., et al., 2004; Rohrbough J., et al., 2005].

Показано, что во время развития мозга, холестерин, вырабатываемый глией, усиливает процесс синаптогенеза [Mauch D.H., et al., 2001; Pfrieger F.W., 2003; Göritz С., et al., 2005]. Удаление холестерина в хромаффинных клетках разрушает кластеры синтаксина, тем самым уменьшает секрецию катехоламинов [Chamberlain L.H., et al., 2001; Lang T., et al., 2001; Gil С., et al., 2005; Salaun C., et al., 2005]. Велико содержание холестерина и в мембранах СВ [Deutsch Е., et al., 1981], где он взаимодействует с несколькими везикулярными белками (синаптобревин, синаптофизин) [Thiele С., et al., 2000].

Недавно стало известно, о существовании на поверхности мембран, так называемых «липидных плотиков», маленьких (10-200нм), динамичных, гетерогенных доменов с высокой концентрацией холестерина и сфинголипидов, предназначенных для компартментализации клеточных процессов [Pike L.J., 2006]. Показано, что холестерин модулирует многие клеточные функции, изменяет активность ряда белков, например Na/K-АТФазы, аденилатциклазы, метаботропных рецепторов, Ca - каналов, NO-синтазы, NADH-оксидазы и т. д. [Pfrieger F. W., 2003;' Taverna E., et al, 2004;' Weixing H., et al., 2008]. Недавно липидные плотики были обнаружены в пресинаптических мембранах двигательных нервных окончаний лягушки и мыши в областях, где протекают экзо-и эндоцитоз СВ [Петров A.M., и др., 2011]. Сегрегация белков экзоцитоза и Са-каналов в так называемые «липидные плотики», содержащие холестерин в высокой концентрации, может быть важным механизмом управляющим слиянием везикулы [Зефиров A.JL, и др., 2010].

В настоящей работе делается попытка оценить влияние холестерина мембран на функционирование нервно-мышечного синапса холоднокровных и теплокровных животных и процессы секреции медиатора из двигательных НО.

1.2. Цель и задачи исследования:

Целью данного исследования явилось изучение роли холестерина плазматической мембраны в процессах секреции медиатора и экзоцитоза СВ из

8

двигательных нервных окончаний лягушки и мыши. Для этого использовали два подхода: удаление холестерина из мембраны метил-|3-циклодекстрином (МЦД) и ферментативное окисление мембранного холестерина холестерол оксидазой (ХО).

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить изменение содержания холестерина в мембранах нервно-мышечных препаратов лягушки и мыши, обработанных МЦД в различных концентрациях.

2. Исследовать эффекты МЦД на параметры спонтанной секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах лягушки и мыши.

3. Проанализировать влияние МЦД на вызванную секрецию медиатора и электрогенез НО при редком и высокочастотном раздражении в условиях пониженной внеклеточной концентрации ионов кальция.

4. Исследовать влияние МЦД на динамику секреции медиатора при высокочастотном раздражении в условиях высокой (нормальной) внеклеточной концентрации ионов кальция.

5. Изучить динамику экзо - и эндоцитоза СВ при помощи флуоресцентного метода на фоне действия МЦД.

6. Исследовать эффекты ХО на спонтанную и вызванную секрецию медиатора в нервно-мышечном синапсе.

1.3. Научная новизна

Впервые показана важность холестерина в контроле соотношения спонтанной и вызванной секреции медиатора в двигательных НО лягушки и мыши. Обнаружено усиление спонтанной секреции при удалении большого количества холестерина из мембран. Показано, что повышение интенсивности спонтанной секреции при действии МЦД не зависит от вне - и внутриклеточной концентрации ионов Са. Умеренная экстракция холестерина из плазматических мембран угнетает вызванную секрецию, уменьшает выраженность облегчения и депрессии секреции медиатора при высокочастотном раздражении. Резкое

9

уменьшение пула мембранного холестерина блокирует проведение ПД по нерву, тем самым полностью подавляя вызванную секрецию.

В работе впервые сделана попытка сравнить эффекты прямого удаления холестерина из плазматических мембран с ферментативным окислением холестерина мембраны на секрецию медиатора из двигательных НО. Оказалось, что в отличие от удаления холестерина из мембран, его окисление не имеет выраженных эффектов на интенсивность спонтанной секреции, но увеличивает время спада миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП), и незначительно угнетает вызванное освобождение медиатора.

1.4. Положения, выносимые на защиту:

1. Холестерин пресинаптической мембраны является фактором, ограничивающим спонтанное освобождение медиатора. Удаление более 50% холестерина из мембран при действии больших доз МЦД (10 ммоль/л) вызывает Са - независимое увеличение частоты миниатюрных постсинаптических сигналов.

2. Секреция медиатора и процессы кратковременной пластичности в синапсе чувствительны даже к небольшим изменениям содержания холестерина в мембране. Небольшое (10-20%) вымывание холестерина из мембран с помощью малых концентраций МЦД (1 ммоль/л) приводит к угнетению экзоцитоза СВ и вызванной секреции медиатора в ответ на одиночные раздражения, уменьшению выраженности облегчения и увеличению выраженности депрессии при высокочастотной активности.

1.5. Научно-практическая ценность

Данная работа носит фундаментальный характер. Полученные результаты позволяют дополнить знания в понимании механизмов, управляющих такими витальными процессами, как спонтанная и вызванная секреция, экзоцитоз и

транспорт СВ, внутриклеточная сигнализация, электрогенез нервных волокон. Результаты работы могут быть полезны для объяснения явлений, происходящих в нейронах центральной нервной системы и клетках, активно использующих процессы экзо - и эндоцитоза. Полученные данные позволяют считать, что холестерин плазматической мембраны выступает как организатор спонтанной и вызванной секреции в нервно-мышечном синапсе. Исследование может помочь разобраться в механизмах, лежащих в основе патологических состояний, связанных с нарушением кругооборота холестерина. Работа поддержана грантами Министерства образования и науки Российской Федерации (НШ-5250.2010.4 и МК-3840.2010.4), Российского фонда фундаментальных исследований (№ 11-04-00422-а, №09-04-97015-р).

1.6. Апробация работы

Результаты исследований, выполненные по теме диссертации, доложены на конференциях и форумах: III международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения-2009" (Санкт-Петербург,

2009); на XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (г. Калуга,

2010); международном симпозиуме «Biological Motility: from Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Пущино, 2010); XV международной Пушинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011); международном молодежном научном форуме «Ломоносов», (Москва, 2010, 2011); международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2011); VII международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Крым, Украина, 2011); всероссийских конференциях с международным участием "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2010, 2011); на заседании кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета (2011).

1.7. Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых журналах (из списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном медицинском университете. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.

1.8. Структура и объем диссертационной работы

Диссертация объемом 125 страницы состоит из введ