Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение кинетики вызванной секреции квантов медиатора как фактор модуляции синаптической передачи

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бухараева, Элля Ахметовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Кинетика вызванной секреции квантов медиатора: методы определения, способы модуляции и значение для обеспечения эффективности синаптической передачи.

2.1. Вызванное освобождение квантов медиатора и его особенности в протяженных синаптических контактах.

2.1.1. Морфо-функциональные особенности протяженных синаптических контактов.

2.1.2. Электрогенез в различных участках нервной терминали. Особенности распределения ионных каналов по ходу двигательного нервного окончания.

2.1.3. Участие синаптических белков в реализации механизма освобождения медиатора.

2.1.4. Особенности процесса секреции квантов медиатора в различных участках нервного окончания.

2.2. Временной ход освобождения квантов медиатора.

2.3. Методы оценки кинетики секреции квантов медиатора при сниженной интенсивности освобождения квантов медиатора.

2.3.1. Экстраклеточная регистрация синаптических ответов - методический подход для исследования кинетики секреции квантов медиатора в отдельном участке синаптического контакта.

2.3.2. Метод измерения истинных синаптических задержек одноквантовых токов концевой пластинки.

2.3.3. Оценка функции вероятности секреции медиатора методом измерения латентных периодов.

2.3.4. Определение синаптических задержек одноквантовых ТКП, формирующих сигнал с низким квантовым составом, при использовании метода дифференцирования тока концевой пластинки.

2.4. Методы оценки кинетики секреции квантов медиатора, формирующих многоквантовый ток концевой пластинки, при «физиологическом» уровне освобождения квантов.

2.4.1. Оценка кинетики секреции квантов медиатора с использованием Фурье преобразования.

2.4.2. Оценка кинетики секреции квантов медиатора методом деконволюции.

2.4.3. Оценка кинетики секреции квантов медиатора методом линейных уравнений.

2.4.4. Оценка кинетики секреции квантов медиатора методом «последовательного вычитания».

2.5. Факторы, модулирующие интенсивность освобождения квантов медиатора и его кинетику.

2.5.1. Влияние температуры на интенсивность и временной ход секреции квантов медиатора.

2.5.2. Влияние ионов кальция на интенсивность и временной ход секреции квантов медиатора.

2.5.3. Эффекты биологически активных соединений на интенсивность и временной ход секреции квантов медиатора.

2.6. Вклад изменения кинетики секреции квантов в формирование параметров постсинаптического ответа. Физиологическая роль модуляции временного хода секреции.

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объект исследования.

3.2.Растворы. Система перфузии.

3.3. Электрофизиологические исследования.

3.3.1. Режим стимуляции.

3.3.2. Микроэлектроды.

3.3.3. Экстраклеточная регистрация токов концевой пластинки.

3.3.4. Внутриклеточная регистрация токов концевой пластинки.

3.4. Оценка параметров временного хода вызванной секреции квантов медиатора.

3.4.1. Анализ временного хода освобождения квантов в разных отделах двигательного нервного окончания при сниженной интенсивности секреции.

3.4.2. Анализ временного хода секреции квантов, формирующих многоквантовый ток концевой пластинки.

3.5. Оценка влияния изменения давления экстраклеточного микроэлектрода на параметры временного хода секреции квантов медиатора.

3.6. Реконструкция многоквантового тока концевой пластинки с учетом особенностей кинетики секреции квантов по ходу нервной терминали.

3.7. Статистическая обработка результатов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Интенсивность и кинетика вызванного освобождения квантов медиатора при сниженном и близком к «физиологическому» уровнях освобождения квантов.

1. Интенсивность и временной ход вызванной секреции квантов медиатора при физиологическом» уровне освобождения квантов.

1.1. Амплитудно-временные параметры одноквантовых и многоквантовых ТКП.

1.2. Временной ход освобождения квантов медиатора, формирующих многоквантовый ТКП.

1.3. Оценка интенсивности секреции квантов медиатора.

2. Интенсивность и кинетика секреции квантов медиатора при сниженном уровне освобождения.

2.1. Скорость распространения возбуждения в разных участках двигательного нервного окончания.

2.2. Амплитудно-временные параметры одноквантовых токов концевой пластинки и интенсивность вызванной секреции квантов в разных отделах синапса.

2.3. Параметры, характеризующие временной ход секреции квантов медиатора при сниженном уровне освобождения.

2.4. Временной ход секреции квантов медиатора в разных отделах синапса.

2.4.1. Минимальная синаптическая задержка.

2.4.2. Модальные значения гистограмм распределений синаптических задержек.

2.4.3. Максимальные синаптические задержки и степень синхронности секреции квантов медиатора.

3. Реконструкция многоквантового ТКП с учетом интенсивности и особенностей временного хода секреции квантов медиатора в разных участках нервного окончания

ГЛАВА 2. Временной ход и интенсивность вызванной секреции квантов медиатора при варьировании температуры среды.

2.1. Влияние температуры на интенсивность и временной ход секреции квантов медиатора в синапсах с исходно высоким уровнем освобождения медиатора.

2.2. Исследование температурной зависимости процессов вызванной секреции квантов медиатора в разных участках нервно-мышечного синапса при сниженной интенсивности освобождения медиатора.

2.2.1. Изменение скорости проведения возбуждения по двигательному нервному окончанию при варьировании температуры.

2.2.2. Влияние температуры на интенсивность секреции квантов в разных участках

2.2.3. Влияние температуры на параметры временного хода секреции в разных участках терминали.

2.3. Оценка вклада изменения интенсивности и временного хода секреции квантов в формирование тока концевой пластинки при изменении температуры среды.

ГЛАВА 3. Временной ход и интенсивность секреции квантов медиатора при варьировании содержания ионов кальция.

3.1. Интенсивность и кинетика вызванной секреции квантов медиатора, формирующих многоквантовый ток концевой пластинки, при варьировании содержания ионов кальция в среде.

3.1.1. Амплитудно-временные характеристики одноквантовых и многоквантовых токов концевой пластинки при разных концентрациях ионов кальция.

3.1.2. Временной ход секреции квантов медиатора при изменении концентрации ионов кальция.

3.1.3. Квантовый состав токов концевой пластинки при изменении содержания ионов кальция.

3.2. Интенсивность и кинетика вызванной секреции квантов медиатора в разных участках нервного окончания при изменении содержания ионов кальция в условиях низкого уровня секреции медиатора.

3.2.1. Влияние изменения концентрации ионов кальция на интенсивность секреции квантов в разных участках терминали.

3.2.2. Изменение параметров временного хода секреции в проксимальных, центральных и дистальных участках синапса при варьировании концентрации кальция.

3.3. Оценка вклада изменения интенсивности и временного хода секреции квантов в формирование тока концевой пластинки при изменении концентрации ионов кальция.

ГЛАВА 4. Влияние холинергических соединений на временной ход и интенсивность секреции квантов медиатора при сниженном и близком к «физиологическому» уровнях освобождения квантов.

4.1. Влияние карбахолина на интенсивность и временной ход секреции квантов при «физиологическом» уровне освобождения квантов.

4.2. Влияние карбахолина на кинетику секреции квантов в разных участках синапса при сниженном уровне освобождения медиатора.

4.3. Оценка вклада пресинаптического действия карбахолина в амплитудно-временные параметры тока концевой пластинки.

4.4. Исследование природы рецепторов, участвующих в реализации влияния карбахолина на кинетику вызванной секреции квантов медиатора.

4.4.1. Исследование влияния агентов, активирующих мускариновые холинорецепторы.

4.4.2. Исследование влияния агентов, активирующих никотиновые холинорецепторы.

4.4.3. Кинетика секреции квантов медиатора в присутствии б локатора никотиновых холинорецепторов.

ГЛАВА 5. Влияние адренергических соединений на временной ход и интенсивность секреции квантов медиатора при сниженном и близком к «физиологическому» уровнях освобождения медиатора.

5.1. Исследование влияния норадреналина на кинетику и интенсивность вызванной секреции в синапсах с высоким уровнем освобождения квантов медиатора.

5.1.1. Влияние норадреналина на амплитудно-временные параметры спонтанных и вызванных токов концевой пластинки.

5.1.2. Влияние норадреналина на временной ход секреции квантов медиатора.

5.1.3. Влияние норадреналина на интенсивность вызванной секреции квантов медиатора.

5.2. Влияния норадреналина на временной ход секреции квантов в разных участках терминали в условиях сниженного уровня освобождения медиатора.

5.3. Оценка вклада пресинаптического действия норадреналина в амплитудно-временные параметры тока концевой пластинки.

5.4. Зависимость влияния норадреналина на временной ход секреции квантов от концентрации ионов кальция в среде.

5.5. Влияние норадреналина на временной ход вызванной секреции медиатора при снижении температуры окружающей среды.

5.6. Определение типа адренорецепторов, опосредующих влияние норадреналина на временной ход вызванной секреции квантов медиатора.

5.6.1. Исследование влияния специфических а-адренергических веществ на временной ход секреции вызванного освобождения медиатора.

5.6.2 Исследование влияния специфических ß-адренергических веществ на временной ход секреции вызванного освобождения медиатора. J

5.7. Исследование влияния на временной ход секреции в разных участках синапса агентов, повышающих содержание циклического АМФ в клетке. ^

5.7.1. Действие db-цАМФ на временной ход секреции в проксимальном, центральном и дистальном участках синапса.

5.7.2. Влияние активатора аденилатциклазы форсколина на временной ход вызванной секреции квантов.

5.7.3. Влияние ингибитора фосфодиэстеразы изобутилметилксантина на временной ход секреции квантов медиатора.

5.7.4. Действие норадреналина на временной ход секреции в присутствии агентов, изменяющих уровень цАМФ.

5.7.5 Влияние ингибитора цАМФ зависимой протеинкиназы А на кинетику секреции квантов медиатора и синхронизирующее действие норадреналина.

ГЛАВА 6. Временной ход вызванной секреции квантов медиатора при развитии утомления нервно-мышечного препарата. Влияние норадреналина на «утомленный» 254 нервно-мышечный синапс.

6.1. Амплитудно-временные параметры спонтанных и вызванных токов концевой 255 пластинки в «утомленном» нервно-мышечном препарате.

6.2. Кинетика вызванной секреции квантов в «утомленном» нервно-мышечном препарате.

6.3. Интенсивность квантовой секреции в синапсе «утомленного» нервно-мышечного препарата.

6.4. Влияние норадреналина на вызванное освобождение квантов медиатора в «утомленном» нервно-мышечном препарате.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение кинетики вызванной секреции квантов медиатора как фактор модуляции синаптической передачи"

Актуальность исследования

Изучение механизмов передачи возбуждения с одной клетки на другую и путей модуляции этого процесса является одной из наиболее актуальных проблем современной нейробиологии. Сегодня совершенно ясно, что без глубокого понимания молекулярных основ функционирования синаптических структур невозможно постичь механизмы таких фундаментальных физиологических процессов как память и обучение, представить патогенез многих заболеваний центральной и периферической нервной системы, создавать фармакологические препараты, избирательно воздействующие на разные этапы передачи информации в синапсах. Общепринято, что модуляция синаптической передачи на пресинаптическом уровне в физиологических условиях, или ее нарушение при разных видах патологии, может реализоваться как за счет изменения числа квантов медиатора, выделяемых в ответ на нервный импульс, так и за счет изменения величины каждого кванта (см. обзоры: Каменская, 1972; Магазаник, 1979; Hubbard, 1963; Van der Kloot, Molgo, 1994; Wood, Slater, 2001). Вместе с тем, освобождение медиатора в нервно-мышечном соединении в ответ на каждый нервный импульс, осуществляемое в отдельных активных зонах пресинаптической мембраны, не происходит одномоментно из-за протяженности терминали (особенно у холоднокровных) вследствие низкой скорости проведения возбуждения по ним (Braun, Schmidt, 1961; Katz, Miledi, 1965), а также благодаря колебаниям вероятности срабатывания каждой отдельной активной зоны секреции, о чем свидетельствует существенный разброс величин истинной синаптической задержки одноквантовых постсинаптических ответов (Katz, Miledi, 1965; Barrett, Stevens, 1972; Миненко, Магазаник, 1986). Таким образом, кинетика процессов секреции квантов медиатора из терминали, наряду с величиной квантового состава и чувствительностью рецепторно-канальных комплексов на постсинаптической мембране, может быть фактором, определяющим амплитудно-временные параметры постсинаптического ответа,

12 и вносить вклад в обеспечение надежности синаптической передачи. Действительно, в ряде исследований, выполненных, в основном, методами математического расчета (Souchek, 1971) и компьютерного моделирования (Giniatullin et. al., 1995; Зефиров, Гафуров, 1995, 1997, 2001) показано, что изменение временного хода секреции квантов медиатора может оказывать влияние на величину амплитуды и длительности постсинаптических ответов. Однако этот вклад оценивается одними авторами (Souchek, 1971; Giniatullin, 1995) как значимый для обеспечения эффективности нервно-мышечной передачи, а другими - как несущественный (Зефиров, Гафуров, 1997). Таким образом, неясно, имеет ли изменение временного хода секреции квантов медиатора (то есть синхронизация или десинхронизация освобождения квантов) физиологическое значение и если да, то в каких условиях функционирования синапса оно проявляется в большей степени. Неизвестны конкретные механизмы, определяющие кинетику вызванной секреции квантов медиатора. Кроме того, неясно, в какой степени изменение временного хода вызванной секреции квантов при различных физических и фармакологических воздействиях будет вносить вклад в изменение амплитуды и временных параметров постсинаптического ответа. Наиболее интересным и актуальным с точки зрения выявления способов пресинаптической модуляции синаптической передачи является вопрос о механизмах, регулирующих количество квантов, освобождаемых на отдельный нервный импульс, и временной ход их выделения. Для решения этих вопросов необходимо получение прямых экспериментальных данных, корректно описывающих временной ход секреции освобождения медиатора при физиологическом уровне секреции медиатора. Основная информация о кинетике освобождения была получена в экспериментах, где анализировалась дисперсия истинных синаптических задержек одноквантовых ответов (Katz, Miledi, 1965; Benoit, Mambrini, 1970; Barrett, Stevens, 1972; Baldo et al., 1986). Очевидно, что параметры кинетики секреции медиатора при многоквантовом выбросе могут существенно отличаться. Разработанные к настоящему

13 времени математические методы оценки временного хода секреции квантов, формирующих многоквантовый сигнал (Van der Kloot, 1988; Auman, Parnas, 1991; Bykhovskaya et al., 1999; Neher, Sakaba, 2001; Zefirov, Abaidoullin, 2001) имеют определенные ограничения. Это стало основанием для разработки нового метода (метода «последовательного вычитания») оценки кинетики секреции квантов при приближающемся к физиологическому уровне освобождения медиатора (Гайнулов и др., 2001). Использование метода «последовательного вычитания» позволяет не только оценить кинетику и количество освобождаемых квантов в ходе многоквантового ответа, но и сопоставить характер изменения этих параметров при воздействиях, модулирующих синаптическую передачу.

Однако для раскрытия молекулярных механизмов, участвующих в регуляции временного хода секреции квантов медиатора, необходимо не только; изучение кинетики выделения квантов в ходе многоквантового ответа, но и исследование характера работы отдельных активных зон и оценка их вклада в формирование общего временного хода освобождения квантов в целом синапсе. В связи с этим актуальным представляется исследование факторов, определяющих величину минимальной синаптической задержки и степень флуктуаций истинных синаптических задержек, поскольку до настоящего времени неизвестно, какие именно звенья работы секреторного аппарата определяют эти параметры и какие внутриклеточные системы участвуют в их регуляции. Кроме того, не выяснено, как коррелируют величина минимальной синаптической задержки и степень дисперсии синаптических задержек с морфо-функциональными особенностями синаптического аппарата, в частности, с его строением и интенсивностью секреции в различных участках протяженной нервной терминали. Раскрытие механизмов, обусловливающих несинхронное освобождение квантов медиатора в ответ на одиночный нервный импульс, и выявление способов их модуляции актуально как для фундаментальной нейрофизиологии, поскольку позволит приблизиться к пониманию

14 молекулярных механизмов работы секреторного аппарата, так и для практической медицины, так как даст основания для целенаправленного поиска фармакологических препаратов, обеспечивающих повышение эффективности синаптической передачи за счет влияния на кинетику освобождения квантов медиатора.

Цель и основные задачи исследования.

Изучение механизмов, определяющих кинетику вызванной секреции квантов медиатора из двигательных нервных окончаний, и оценка роли временного хода секреции в обеспечении эффективности синаптической передачи возбуждения.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать параметры временного хода вызванной секреции квантов медиатора в синапсах холоднокровных в условиях низкого и близкого к физиологическому уровней освобождения квантов медиатора.

2. Изучить зависимость параметров кинетики секреции квантов медиатора от температуры и ионного состава среды. Исследовать корреляцию между интенсивностью секреции квантов и кинетикой их выделения.

3. Исследовать влияние физиологически активных соединений (норадреналин, карбахолин) на параметры временного хода секреции в зависимости от исходного уровня интенсивности освобождения квантов медиатора.

4. Исследовать механизм действия карбахолина на кинетику освобождения квантов медиатора.

5. Исследовать механизм действия норадреналина на временной ход секреции квантов и выявить роль внутриклеточных посредников в его реализации.

6. Выявить роль изменения кинетики секреции медиатора при развитии утомления нервно-мышечного препарата и оценить эффект норадреналина при восстановлении работоспособности «утомленной» мышцы.

15

7. Оценить вклад изменения кинетики выделения квантов медиатора в формирование многоквантового тока концевой пластинки при воздействиях, модулирующих синаптическую передачу.

Научная новизна

Впервые проведен комплексный анализ факторов, определяющих временной ход вызванной секреции квантов медиатора в синапсах холоднокровных как при низком, так и при приближающемся к физиологическому уровнях освобождения квантов медиатора. Впервые получены экспериментальные доказательства того, что количество освобождаемых квантов медиатора и временной ход их секреции регулируются разными механизмами. С помощью методики одновременной трехэлектродной экстраклеточной регистрации токов действия нервного окончания и одноквантовых токов концевой пластинки впервые выявлены особенности кинетики секреции квантов в разных участках нервной терминали, проявляющиеся в разной скорости начала секреции квантов и степени синхронности их выделения по мере удаления от последнего перехвата Ранвье. Использование модифицированного нами метода математической свертки позволило проанализировать вклад особенностей изменения интенсивности и кинетики освобождения квантов по ходу терминали и установить, что проксимо-дистальный градиент параметров кинетики секреции является фактором, уменьшающим потери амплитуды и затягивание переднего фронта интегрального многоквантового ТКП, обусловленные низкой скоростью проведения возбуждения по немиелинизированному нервному окончанию. При исследованиях зависимости параметров кинетики секреции квантов по ходу протяженного нервного окончания от температуры и ионного состава среды впервые установлено, что наиболее значимыми факторами, определяющими кинетику секреции квантов из всей нервной терминали, являются изменение минимальной синаптической задержки и поздней фазы секреции квантов. Впервые с

16 помощью разработанного метода (метод «последовательного вычитания») оценки временного хода освобождения квантов, формирующих многоквантовый ток концевой пластинки, установлено, что при физиологическом уровне освобождения медиатора в условиях нормальной ионной среды в ответ на однократное раздражение двигательного нерва кванты выделяются несинхронно, что проявляется в асимметричном характере распределения латентных периодов одноквантовых ответов, входящих в состав полноквантового сигнала. При исследовании влияния физиологически активных соединений на временной ход секреции квантов установлено, что карбахолин, угнетающий синаптическую передачу, помимо влияния на квантовый состав тока концевой пластинки изменяет кинетику освобождения квантов, приводя к увеличению асинхронности их выделения. Норадреналин, который напротив относится к веществам, облегчающим проведение возбуждения от нерва к мышце, вызывает синхронизацию освобождения квантов, причем без выраженного влияния на количество освобождаемых квантов. Впервые установлена последовательность внутриклеточных событий, происходящих после активации норадреналином пресинаптических (З1-адренорецепторов, включающая в себя активацию аденилатциклазы, повышение внутриклеточного уровня цАМФ, активацию протеинкиназы А и фосфорилирирование синаптических белков, приводящее к ускорению экзоцитоза содержимого синаптических везикул и, вследствие этого, синхронизирующее освобождение квантов медиатора. Впервые установлено, что синхронизирующее действие норадреналина приводит к возрастанию амплитуды многоквантового тока концевой пластинки в «утомленном» нервно-мышечном препарате и может лежать в основе феномена Орбели-Гинецинского.

Положение, выносимое на защиту.

Изменение кинетики вызванной секреции квантов медиатора под действием физических факторов и физиологически активных соединений является важным, а в ряде

17 случаев ведущим механизмом пресинаптической модуляции процесса передачи возбуждения с нерва на скелетную мышцу, приводящим к изменению амплитудно-временных характеристик постсинаптического ответа, определяющих эффективность синаптической передачи.

Научно-практическая ценность.

Основное значение результатов проведенного исследования состоит в получении прямых доказательств наличия ранее не учитываемого пути модуляции процесса синаптической передачи за счет изменения временного хода секреции квантов медиатора. Полученные данные об отсутствии взаимосвязи между изменениями интенсивности и временного хода освобождения квантов дают веские основания для важного в теоретическом отношении вывода о том, что механизмы, регулирующие количество выделяемых квантов и кинетику их секреции, различны, и позволяют вести поиск способов их избирательной модуляции.

Выявление особенностей кинетики секреции квантов медиатора по ходу нервного окончания и оценка их вклада в формирование амплитудно-временных характеристик постсинаптического ответа представляют интерес для сравнительной физиологии и физиологии развития, поскольку различия в кинетике секреции выделения квантов медиатора могут лежать в основе видовых и возрастных особенностей процесса нейросекреции.

Применение нового метода оценки временного хода освобождения квантов медиатора и его интенсивности при полноценном уровне секреции медиатора позволило впервые проанализировать изменение кинетики секреции квантов при различных воздействиях, модулирующих синаптическую передачу. Этот метод может найти применение в практике физиологического эксперимента в лабораториях, занимающихся исследованием процессов синаптической передачи.

18

Некоторые положения работы представляют практический интерес. В частности, получены убедительные доказательства того, что метод прямого расчета величины квантового состава тока концевой пластинки путем деления средней его амплитуды на среднюю амплитуду одноквантового сигнала некорректен, поскольку наличие асинхронности секреции вносит значимый вклад в амплитудно-временные характеристики многоквантового тока концевой пластинки. Это требует пересмотра результатов ряда исследований о степени влияния различных воздействий на процесс нервно-мышечной передачи.

Полученные данные о влиянии физиологически активных веществ на кинетику освобождения квантов, которое приводит к изменению амплитудно-временных параметров многоквантового постсинаптического ответа, могут служить основанием для целенаправленного поиска и синтеза лекарственных препаратов, преимущественно действующих на кинетику освобождения квантов и, таким образом, способных регулировать нервно-мышечную передачу, повышая или снижая ее эффективность. Апробация работы

Основные результаты работы доложены на конференциях КИББ РАН (Казань, 1997, 1999, 2000); Международном симпозиуме «Холинергические механизмы» (Майнц, 1995); 2 Биохимическом съезде РАН (Москва, 1997); XXXIII Международном Физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997); Симпозиуме «Модуляция синаптической передачи» (Жив-сюр-Иветт, 1997); Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998); конференции «Физиология сигнальных молекул» (Москва, 1998); Совместном заседании Британского и Чешского Физиологических Обществ (Прага, 1998); Всероссийской конференции «Физиология нейротрансмиттеров» (Москва, 2000); Международном рабочем совещании «Мембраны и сигнализация» (Киев, 2000); XVIII Съезде Всероссийского Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001).

19

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Кинетика вызванной секреции квантов медиатора: методы определения, способы модуляции и значение для обеспечения эффективности синаптической передачи.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Бухараева, Элля Ахметовна

292 6. Выводы

В нервно-мышечном соединении лягушки в условиях низкого содержания ионов кальция в среде имеют место различия во временном ходе вызванной секреции квантов медиатора из отдельных активных зон по ходу нервного окончания. Наличие проксимо-дистального градиента параметров кинетики секреции квантов медиатора по ходу нервного окончания является фактором, частично компенсирующим падение амплитуды тока концевой пластинки, обусловленное низкой скоростью проведения возбуждения по терминали.

Последовательное вычитание со сдвигом по шкале времени одноквантового ТКП из зарегистрированного в той же клетке многоквантового ответа позволяет описать временной ход секреции и определить количество квантов медиатора, участвующих в его формировании при полноценном физиологическом уровне секреции. При полноценном, близком к физиологическому, уровне освобождения квантов медиатора имеет место несинхронность их выделения в ответ на нервный импульс. Временной ход секреции квантов в этих условиях характеризуется наличием как «раннего» периода освобождения, так и «поздней» его фазы.

Ведущим пресинаптическим фактором, приводящим к снижению амплитуды многоквантового тока концевой пластинки и затягиванию его временных параметров при понижении температуры среды, является возрастание степени асинхронности выделения квантов медиатора, обусловленное как замедлением проведения возбуждения по безмякотному нервному окончанию, так и изменением стохастических характеристик срабатывания каждой активной зоны секреции. Различия параметров кинетики секреции медиатора по ходу нервной терминали возрастают при понижении температуры среды. Вклад проксимо-дистального градиента параметров кинетики секреции, компенсирующий потери амплитуды тока концевой пластинки, обусловленные низкой скоростью проведения возбуждения по терминали, при охлаждении повышается.

В условиях сниженного уровня освобождения квантов медиатора повышение ионов кальция вызывает не только увеличение количества освобождаемых квантов, но и повышает синхронность их выделения, что приводит к возрастанию амплитуды тока концевой пластинки.

Важным компонентом пресинаптического действия карбахолина является увеличение степени асинхронности освобождения квантов медиатора, приводящее к снижению амплитуды многоквантового тока концевой пластинки. Повышение асинхронности секреции квантов под действием карбахолина обусловлено активацией пресинаптических никотиновых холинорецепторов. Ведущим пресинаптическим механизмом, обеспечивающим повышение амплитуды тока концевой пластинки при действии норадреналина, является увеличение синхронности выделения квантов медиатора, которое наиболее выражено в условиях исходно высокой асинхронности секреции.

Синхронизирующее действие норадреналина на процесс вызванного освобождения квантов медиатора обусловлено активацией пресинаптических рг адренорецепторов, последующей активацией аденилатциклазы, повышением уровня внутриклеточной цАМФ и повышением активности цАМФ-зависимой протеинкиназыА, участвующей в фосфорилировании пресинаптических белков, определяющих скорость экзоцитоза синаптических везикул.

Отсутствие взаимосвязи между изменением квантового состава тока концевой пластинки и временным ходом секреции свидетельствует о различиях в механизмах, участвующих в их регуляции.

Снижение работоспособности скелетной мышцы, вызванное длительным непрямым низкочастотным раздражением («утомление»), обусловлено как снижением

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно классическим представлениям о механизме передачи возбуждения с нервной клетки на мышечное волокно, в основе которых лежит квантово-везикулярная гипотеза секреции, процесс передачи возбуждения от нерва к мышечному волокну осуществляется путем выделения из двигательного нервного окончания от нескольких десятков (теплокровные) до нескольких сотен (холоднокровные) квантов медиатора ацетилхолина (см. обзоры Каменская 1972; Магазаник, 1979; Hubbard, 1963; Van der Kloot, Molgo 1994; Wood, Slater 2001). Эффективность синаптической передачи зависит от амплитуды потенциалов концевой пластинки, которая должна превышать критический уровень деполяризации электрогенной мембраны мышечного волокна, необходимый для генерации распространяющегося по сарколемме потенциала действия (Hodgkin, Huxley, 1952, Elmqvist et al. 1964, Wood, Slater 2001). На пресинаптическом уровне амплитуда постсинаптического ответа определяется размером кванта (Van der Kloot, 1991) и количеством квантов, освободившихся в ответ на нервный стимул (Каменская 1972; Магазаник, 1979; Hubbard, 1963; Van der Kloot, Molgo, 1994). Таким образом, изменение количества освободившихся квантов медиатора и содержания самого медиатора в каждом кванте являются факторами модулирующими процесс синаптической передачи. Достаточно долгое время считалось, что процесс освобождения множества квантов в ответ на стимуляцию двигательного нерва освобождение квантов происходит синхронно, в отличие от асинхронной спонтанной секреции медиатора. Однако поскольку в ответ на нервный импульс происходит выделение от нескольких десятков до нескольких сотен квантов медиатора, и в его основе лежит вероятностный характер срабатывания активных зон секреции, то очевидно, что этот процесс не происходит одномоментно (Pamas et el. 1999, 2000). Действительно, еще в 1965 г. В. Katz и R. Miledi показали, что существует значительная дисперсия моментов возникновения отдельных одноквантовых ответов, которая

266 свидетельствует о том, что отдельные кванты медиатора выделяются с разными временными интервалами после возникновения потенциала действия нервного окончания. Эти результаты стали основанием для предположения о том, что существует асинхронность процесса вызванного стимуляцией выделения квантов медиатора. Однако, несмотря на то, что эти данные были получены более 30 лет тому назад, вопрос о том, какие механизмы лежат в основе несинхронного освобождения квантов медиатора, как временной ход их секреции связан с количеством освобождаемых квантов, т.е. с квантовым составом, и какое физиологическое значение может иметь изменение кинетики секреции квантов при различных физических и физиологических воздействиях до сих пор не был решен. Только современные компьютерные технологии, позволяющие накапливать и анализировать большие массивы данных, позволили непосредственно экспериментально подойти к анализу временного хода секреции квантов. С другой стороны, компьютерное моделирование сигналов дало возможность оценивать вклад изменения временного хода секреции квантов в амплитудно-временные характеристики постсинаптического ответа. Именно при использовании компьютерного анализа было показано, что изменение временного хода секреции медиатора оказывает влияние на формирование амплитуды и длительности постсинаптических ответов (Зефиров, Гафуров 1997, 2000; Боисек 1971; ОниаШШп е1 а1., 1995). Увеличение дисперсии возникновения одноквантовых ТКП, формирующих многоквантовый ответ приводит к занижению его амплитуды и затягиванию переднего фронта. Таким образом, на основе результатов модельных исследований была высказана гипотеза о том, что может существовать еще один путь пресинаптической модуляции синаптической передачи, связанный с изменением кинетики выделения квантов медиатора в ответ на каждый нервный импульс. Получению экспериментального подтверждения этой гипотезы и посвящена данная работа. Одной из задач исследования было изучение кинетики вызванной секреции квантов медиатора, формирующих многоквантовый ТКП,

267 при сохраненном физиологическом уровне освобождения медиатора. В течение многих лет основным экспериментальным методом оценки временного хода секреции квантов медиатора из нервного окончания было измерение истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП, которое осуществляли в условиях искусственно сниженного уровня нейросекреции (Katz, Miledi,1965a,d; Barrett, Stevens, 1972). Вместе с тем, очевидно, что для оценки физиологической роли кинетики выделения медиатора интерес представляют результаты исследований, выполненных в условиях, обеспечивающих полноценную, приближенную к физиологической, интенсивность освобождения квантов. Существующие в настоящее время методы, позволяющие математическими методами из экспериментально зарегистрированных ТКП и одноквантовых ТКП получать кривую, описывающую кинетику выделения квантов, формирующих многоквантовый сигнал имеют определенные недостатки (Auman, Pamas 1991; Van der Kloot, 1988; Bykhovskaya et al., 1999; Zefirov, Abaidoullin, 2001). Это привело нас к необходимости разработать собственный метод получения временного хода секреции квантов в целом синапсе, используя экспериментально измеренные в условиях двухэлектродной фиксации мембранного потенциала ТКП и одноквантовые ТКП (Гайнулов и др., 2001). Этот метод, основанный на последовательном вычитании из многоквантового сигнала одноквантового ТКП со смещением последнего по шкале времени, успешно прошел тестирование с использованием как модельных сигналов, максимально приближенных к реальным ТКП и одноквантовым ТКП, так и с реальными сигналами. Метод «последовательного вычитания» позволяет с задаваемой степенью точности получать временной ход секреции квантов для отдельного ТКП, основываясь на наборе вычисленных латентных периодов, и оценивать при этом его квантовый состав. Проверка корректности задаваемой степени точности вычитания осуществлялась путем обратной математической свертки полученного распределения латентных периодов одноквантовых ТКП и усредненного мТКП. Полученный в результате

268 реконструкции ТКП сравнивали с исходным сигналом, из которого проводили вычитание мТКП. Степень совпадения реконструированного и исходного ТКП оценивали по критерию х2.

Проведенный с помощью данного метода анализ временного хода секреции многоквантовых ТКП, зарегистрированных в условиях «рассеченного» нервно-мышечного препарата, когда количество освобождаемых квантов сохранено на физиологическом уровне, показал, что гистограмма вычисленных латентных периодов одноквантовых ТКП, формирующих многоквантовый сигнал, имела асимметричную форму вследствие наличия латентностей, превышающих по величине главное модальное значение гистограммы. Это указывает на существование асинхронности выделения квантов медиатора даже в условиях нормального физиологического уровня секреции квантов. Этот вывод подтверждается при сопоставлении времени нарастания переднего фронта спонтанных мТКП и вызванных ТКП: среднее время нарастания линейной части переднего фронта ТКП превышало время нарастания переднего фронта мТКП в среднем на 30%, что является показателем наличия в исходных условиях определенной степени асинхронности секреции квантов медиатора в ходе многоквантового ответа, поскольку если бы кванты, образующие данный многоквантовый ТКП, выделялись абсолютно синхронно, то время нарастания переднего фронта такого ТКП было бы равно времени нарастания переднего фронта мТКП (Зефиров, Гафуров, 1997; ОииаШШп е1 а1., 1995; Боисек, 1971). Таким образом, при физиологическом уровне секреции квантов медиатора имеет место асинхронность выделения квантов, формирующих многоквантовый ТКП. Анализ кинетики секреции квантов в этих условиях показал, что время нарастания кривой, описывающей временной ход составило 0.30±0.05 мс. Спадающая часть гистограммы латентных периодов описывалась двухэкспоненциальной кривой, т спада первой экспоненты имела значения 0.19±0.03 мс, а второй - 0.69+0.06 мс. Полученные нами параметры, описывающие фазу нарастания и быстрого спада освобождения

269 медиатора, так называемый «ранний» период секреции квантов (Barrett, Stevens, 1972) по своим значениям близки результатам, полученным другими авторами, использовавшими другие способы определения кинетики секреции (Zefirov, Abaidoullin, 2001). Однако мы наблюдали наличие и второй экспоненты, описывающей появление сигналов с большими значениями латентных периодов, которые составляют «позднюю» фазу секреции квантов (Barrett, Stevens, 1972, Van der Kloot, 1988, Slutsky et al. 2001). «Ранний» период освобождения медиатора связан с резким возрастанием вероятности выброса квантов после деполяризации нервного окончания пресинаптическим потенциалом действия и массированным входом ионов кальция в нервное окончание (Barrett, Stevens, 1972 a, Van der Kloot 1988b). Введение термина «ранний период освобождения» было связано с необходимостью отделить этот период секреции квантов от более позднего («поздняя» фаза), при котором вероятность секреции была значительно ниже, но тем не менее не была равна нулю (Barrett, Stevens, 1972 a, Van der Kloot 1988b). «Поздняя» фаза секреции проявляется как длинный «хвост» гистограммы латентных периодов, природа ее возникновения до сих пор не понятна. Вместе с тем амплитудно-временные характеристики одноквантовых ТКП, которые имеют короткие латенции (т.е. представляют «ранний» период освобождения) и ТКП, которые имеют большие значения задержек (освобождающиеся во время «поздней» фазы секреции) имеют одинаковые значения, что свидетельствует, что кванты их формирующие одинаковы по величине и появление «поздних» сигналов не обусловлено их возникновением в более удаленных от микроэлектрода активных зонах секреции. Недавно появились данные о том, что поздняя фаза секреции может быть связана с наличием синаптических везикул, которые более медленно взаимодействуют с пресинаптической мембраной в процессе экзоцитоза (Sakaba, Neher, 2001). «Поздняя» фаза секреции квантов медиатора более выраженно проявляется в условиях низкого уровня секреции квантов при уменьшенной концентрации ионов кальция в среде и при

270 понижении температуры среды (Katz, Miledi 1965а; Barrett, Stevens, 1972 a; Van der Kloot 1988b). Как показали наши исследования с помощью одновременного трехэлектродного отведения одноквантовых ТКП в разных отделах синаптического контакта в проксимальных отделах синапса эта фаза секреции представлена в большей степени, чем в дистальных, что может быть связано как раз с наличием синаптических везикул более медленно взаимодействующих с активными зонами секреции. Это предположение косвенно подтверждается и меньшими значениями минимальной синаптической задержки в дистальных участках синапса. Молекулярные механизмы, определяющие существование и величину минимальной синаптической задержки также остаются до конца не выясненными. Известно, что параметры тока действия нервного окончания изменяются по ходу нервной терминали вследствие неоднородности плотности ионных каналов пресинаптической мембраны (Зефиров, Халилов, 1985; Зефиров, Гафуров1996; Mallart, 1984, Shakiryanova et al., 1994), что может приводить к различному по степени выраженности локальному изменению уровня поляризации участков пресинаптической терминали, расположенных на разной удаленности от последнего перехвата Ранвье. Это может служить основанием для предположения о том, что в регуляции величины синаптической задержки может принимать участие и изменение уровня поляризации мембраны в области активных зон секреции. Это предположение подкрепляется данными о том, изменение величины фокально прикладываемого поляризующего импульса приводит к изменению величины синаптической задержки (Dudel, 1981; 1984) и согласуется с разрабатываемой Н. Pamas и I.Parnas (1986, 1989, 2000) «кальциево-потенциальной» гипотезой регуляции процесса секреции квантов медиатора. На основании полученных нами результатов можно сделать вывод о том, величина минимальной синаптической задержки зависит и от уровня фосфорилирования синаптических белков, которые активируются в результате деполяризации терминали нервным импульсом и входа ионов кальция в терминаль. Об этом свидетельствует

271 наблюдаемое возрастание минимальной синаптической задержки после ингибирования цАМФ-зависимой протеинкиназы А.

Особенностью нервно-мышечного соединения лягушки является значительная протяженность и наличие гетерогенности свойств вдоль нервного окончания (Bennet et al., 1980; Bennet, Lavidis, 1991; Bennet, Robinson, 1990; Grinnel, Pawson, 1989; Grinnell, Trussell, 1983; Robitaille, Tremblay, 1987). Длина немиелинизированной части аксона составляет от 100 до 500 мкм (Безгина и др. 1987; Kashapova et al., 1991; Mattehews-Bellinger, Salpeter, 1978). По мере приближения к дистальному участку имеет место изменение диаметра терминали и плотности ионных каналов, участвующих в генерации потенциала действия, что приводит к существенному замедлению скорости распространения возбуждения по терминали (Ходоров, 1975, Зефиров, Халилов 1985; Katz, Miledi, 1965b). В связи с низкой скоростью проведения потенциала действия по нервному окончанию удаленные его участки включаются в процесс секреции медиатора с запаздыванием, что лежит в основе пространственной асинхронности освобождения квантов медиатора (Зефиров, Гафуров, 1995; 1997; Katz, Miledi, 1965с). Проведенные нами измерения показали, что скорость распространения тока действия нервного окончания в дистальной части на 18% ниже, чем в проксимальной. Расчет времени, необходимого для прохождения возбуждения к дистальным участкам нервного окончания показал, что удаленные отделы синапса, имеющего терминаль длиной 300 мкм, вовлекаются в процесс секреции квантов только через 1 мс после начала секреции в проксимальном отделе.

Наряду с пространственной асинхронностью секреции квантов, имеет место и асинхронность, обусловленная распределением во времени моментов срабатывания каждой активной зоны секреции (Bennet, Lavidis, 1989; Bennet et al., 1989) которую анализируют по распределению истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП, регистрируемых экстраклеточно от отдельного участка терминали (Katz, Miledi, 1965а).

272

Таким образом, временные параметры процесса освобождения квантов из всей нервной терминали при полноценном квантовом составе ТКП определяются как скоростью проведения потенциала действия по нервному окончанию, так и характером работы отдельных активных зон секреции. Оценка вклада асинхронности выделения квантов медиатора в формировании многоквантового ТКП осуществляется методом математической свертки одноквантового ТКП и кривой, описывающей временной ход секреции квантов (Cohen et al. 1981; Demster, 1986; Van der Kloot 1988a,б). До недавнего времени в основе описания временного хода секреции квантов из целой нервной терминали лежало представление о том, что временные параметры срабатывания отдельных активных зон одинаковы по ходу нервного окончания (Зефиров, Гафуров, 1995, 1997; Giniatullin et al, 1995). Однако проведенные нами исследования показали, что временной ход секреции квантов имеет свои особенности в проксимальных, центральных и дистальных отделах нервного окончания. В экспериментах при сниженном уровне секреции квантов, когда можно регистрировать синаптические задержки одноквантовых ТКП, были установлены закономерности изменения интенсивности и временных параметров срабатывания активных зон секреции по ходу протяженной терминали в контроле и при воздействиях, изменяющих секреторный процесс, с целью учета этих закономерностей в определении кинетики процесса выделения квантов из всей нервной терминали. Полученные экспериментальные данные при варьировании расстояния между микроэлекродами, регистрирующими одноквантовые ТКП, показали, что по мере удаления активных зон секреции от окончания миелинизированной части аксона наблюдалось наряду со снижением интенсивности секреции, уменьшение минимальных синаптических задержек и степени флуктуаций синаптических задержек, которое свидетельствовало о возрастании синхронности в каждом участке терминали. Наличие обнаруженных закономерностей изменения параметров секреции квантов вдоль нервного окончания привело к

273 необходимости учитывать их при оценке вклада разных участков нервной терминали в определение временного хода секреции квантов из нервного окончания и в формирование амплитудно-временных характеристик интегрального многоквантового ТКП. Использование модифицированного метода математической свертки с учетом особенностей кинетики секреции квантов вдоль нервного окончания позволило установить какие из них вносят наиболее существенный вклад в формирование общего временного хода освобождения квантов для всей терминали. Если бы временной ход секреции квантов был одинаков по всей длине терминали, то такое запаздывание начала секреции в дистальных участках, как показала реконструкция ТКП, приводило бы к снижению амплитуды постсинаптического ответа на 24% и в 2.7 раза затягивало время нарастания его переднего фронта. Однако, благодаря тому, что по мере удаления от конца миелинизированной части аксона происходит укорочение синаптических задержек и синхронизация секреции квантов медиатора, потери амплитуды и затягивание переднего фронта снижаются. Таким образом, изменение временного хода секреции вдоль нервного окончания можно рассматривать как фактор, частично компенсирующий ухудшение амплитудно-временных характеристик тока концевой пластинки, связанное с низкой скоростью проведения возбуждения.

Холоднокровные животные в естественных условиях вынуждены приспосабливаться к различным температурным режимам, сохраняя при этом двигательную активность. Широкий диапазон температурных изменений среды обитания, при котором существуют эти животные, предполагает наличие мощных адаптивных систем, позволяющих им сохранять жизнедеятельность. В связи с этим исследования влияния варьирования температуры среды на процессы, определяющие интенсивность и кинетику секреции квантов медиатора до сих пор остаются актуальными (Barrett et al., 1978; Wan der Kloot, Molgo, 1994).

274

Изменение температуры среды оказывало существенное влияние на все параметры временного хода секреции квантов, причем эти эффекты были в разной степени выражены в разных участках синаптического контакта. Если при охлаждении до 10° С в проксимальном участке минимальная задержка увеличивалась в 6 раз по сравнению с наблюдаемой при 28° С, то в центральном и дистальном в 5.3 и 4.6 раза, соответственно. При температуре 10° С разница между минимальной задержкой в проксимальном и дистальном участках составляла 66%, а при температуре 28° С она сокращалась до 29%. Таким образом, повышение температуры приводило к приближению значений минимальной задержки в проксимальном отделе к значениям свойственным дистальной области. Иначе говоря, время необходимое для выделения самого «быстрого» кванта в проксимальном участке приближалось к таковому в дистальном. Корректированные значения главной моды гистограмм синаптических задержек в проксимальном участке, не отличавшиеся от дистальных в диапазоне температур 20-28° С, при охлаждении до 10° С становились на 23 % больше, что указывает на более выраженное замедление развития периода раннего освобождения в проксимальном отделе, чем в дистальном. Степень асинхронности секреции квантов, превышающая в проксимальном участке терминали при 10° С, наблюдавшуюся в дистальном отделе на 30%, при повышении температуры становилась равной асинхронности в дистальном участке. Следовательно, при повышении температуры происходит выравнивание параметров временного хода секреции в разных участках терминали. Можно предположить, что когда при нагревании скорость распространения возбуждения по нервному окончанию становится выше, перестают быть значимыми различия в кинетике секреции квантов медиатора в разных частях терминали. И наоборот, менее выраженные изменения параметров временного хода секреции в дистальных участках по сравнению с проксимальными при снижении температуры среды, по видимому, обусловлены необходимостью компенсации замедления

275 проведения возбуждения при пониженной температуре. Отсутствие существенных различий параметра Qio для минимальной синаптической задержки и параметра Р90 свидетельствует о том, что температурная зависимость процессов, определяющих время выделения «наиболее быстрого» кванта и квантов, имеющих большие значения задержек, приблизительно одинакова. Наблюдаемое нами отсутствие изменения квантового состава ТКП при изменении температуры в диапазоне от 10 до 28° С согласуется с данными, полученными другими авторами (Pockett, Macdonald, 1986; Van der Kloot, 1988b; Adams, 1989). Реконструкция многоквантового ТКП, осуществленная с учетом изменения параметров одноквантовых ТКП и кинетики секреции вдоль нервной терминали при варьировании температуры среды показала, что вклад градиента минимальных синаптических задержек был более выражен при снижении температуры среды, когда скорость проведения возбуждения по терминали падала. В модельных исследованиях, проведенных другими авторами (Зефиров, Гафуров, 1995, 1997, 2000; Souchelc, 1971, Giniatullin et al., 1995) при оценке роли временного хода в формировании амплитудно-временных параметров многоквантовых ТКП обсуждался вопрос о том, насколько асинхронность секреции квантов снижает амплитуду ТКП, т.е. ухудшает условия синаптической передачи. Однако, как следует из полученных нами результатов, наличие градиента параметров кинетики секреции квантов (особенно минимальной синаптической задержки и параметра Р90) по ходу терминали не только не ухудшает синаптическую передачу, а напротив, обеспечивает компенсацию замедления скорости проведения потенциала действия по нервному окончанию, приводя к возрастанию амплитуды ТКП и уменьшению времени его нарастания. Поскольку изменение температуры среды помимо снижения скорости проведения возбуждения и увеличения асинхронности секреции квантов, оказывало значительное влияние и на амплитуду и длительность одноквантовых ТКП, то был проанализирован также и вклад изменения этих параметров в характеристики многоквантового ТКП, при этом установлено, что

276 изменение одноквантовых ТКП в меньшей степени сказывается на амплитуде и временных параметрах многоквантового ТКП, чем изменение временного хода секреции квантов.

Исследование кинетики секреции квантов при физиологическом уровне освобождения в зависимости от температуры среды показало, что при охлаждении увеличивается асинхронность выделения квантов, формирующих многоквантовый ТКП, что проявляется в затягивании как «раннего» периода освобождения квантов, так и «поздней» его фазы. Причем анализ амплитудно-временных характеристик ТКП и мТКП, а также сопоставление квантового состава, полученного методом деления площадей сигналов и методом «последовательного вычитания» показало, что интенсивность секреции квантов при понижении температуры среды в диапазоне от 20 до 10 °С достоверно не изменяется. Таким образом, ведущим пресинаптическим фактором, приводящим к уменьшению амплитуды многоквантового ТКП при снижении температуры, является возрастание степени асинхронности выделения квантов медиатора. Это наблюдение подтвердило предположение, высказанное В. Adams в 1986 г. о том, что в синапсах холоднокровных снижение амплитуды вызванных сигналов при охлаждении может быть обусловлено увеличением несинхронности выделения квантов и снижением чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору. Относительная температурная независимость интенсивности освобождения медиатора (Van der Kloot , Molgo 1994), наряду с сильно выраженной вариабельностью кинетики секреции квантов, при изменении температуры среды может быть важным адаптивным механизмом, позволяющим пойкилотермным животным сохранять физиологические функции в широком диапазоне изменения температуры тела (Thska, Lagerspetz, 1994).

Вопрос о регуляции интенсивности вызванной секреции квантов и временного хода их выделения в настоящее время является одним из наиболее обсуждаемых в литературе, касающейся процессов пластических изменений синаптической передачи,

277 поскольку получение ответа на него может стать существенным шагом на пути раскрытия механизма экзоцитоза (Parnas, Parnas 1999, Parnas et al. 2000, Slutsky et al., 2001, Neher, Sakaba, 2001). Главным фактором, определяющим количество освобождаемых из нервного окончания после прихода нервного импульса, как известно, являются ионы кальция (Arnon et al., 1988; Augustine et al., 1987, 1991; Katz, Miledi 1965c; Stanley, 1997). В связи с этим нами была исследована зависимость изменения кинетики секреции и квантового состава как в ходе генерации многоквантовых ТКП в целом синапсе, так и закономерности изменения этих параметров в разных участках нервного окончания.

Проведенные эксперименты по анализу кинетики секреции квантов, осуществленные с помощью двухэлектродной фиксации мембранного потенциала и метода «последовательного вычитания», показали, что в диапазоне изменения концентрации кальция от 1.8 до 1.0 ммоль/л не наблюдалось достоверных изменений гистограммы распределения латентных периодов одноквантовых ТКП, хотя квантовый состав при этом претерпевал существенные изменения. Полученные данные вполне согласуются с описанным ранее отсутствием влияния содержания как вне- так и внутриклеточного кальция на «ранний» период освобождения квантов медиатора (Van der Kloot 1988, Dudel 1994, Datyner, Gage, 1980; Parnas et al, 1989) и подтверждают вывод о том, что механизмы, регулирующие квантовый состав ТКП и временной ход секреции квантов различны (Parnas, Parnas 1999, Parnas et al. 2000). Снижение содержания кальция от 1.0 ммоль/л до 0.4 ммоль/л в отличие от его более высоких концентраций вызывало растягивание гистограммы латентных периодов одноквантовых ТКП, формирующих интегральный ТКП, что свидетельствовало о более выраженном проявлении «поздней» фазы секреции квантов медиатора, хотя параметры «раннего» освобождения при этом существенно не изменялись. Это также согласуется с ранее сделанными наблюдениями о том, что «поздняя» фаза секреции квантов более выражена при сниженном содержании

278 кальция (Barrett, Stevens, 1972b; Van der Kloot, 1988) или при замене кальция на стронций или цинк (Miledi, 1966; Weakly 1973; Correges, Dunant, 1996). Таким образом можно предположить, что повышение концентрации ионов кальция при низких концентрациях (от 0.4 до 1.0 ммоль/л) модулирует кинетику секреции за счет повышения скорости выделения квантов, имевших в низком кальции наиболее затянутые латентные периоды. Отсутствие влияния более высоких концентраций кальция, по-видимому, можно объяснить насыщением систем, определяющих временные параметры выделения квантов (Popoli et al., 1997; Stanley, 1997; Thompson et al., 1995).

Анализ параметров интенсивности и кинетики секреции квантов, осуществленные при экстраклеточном отведении сигналов в диапазоне изменения концентрации кальция (от 0.2 до 0.6 ммоль/л), когда еще можно было корректно отделять одноквантовые ответы, показал, что действительно в отдельных участках терминали по мере повышения содержания кальция повышалась степень синхронности освобождения квантов. Причем это повышение было обусловлено уменьшением количества сигналов с большими значениями синаптических задержек, т.е. составлявших «позднюю» фазу секреции, тогда как минимальные синаптические задержки и модальные значения гистограмм достоверно не изменялись. Анализ ТКП, реконструированных при учете изменения параметров временного хода секреции в разных участках нервного окончания при низком содержании кальция кальция показал, что за счет такой синхронизации наблюдается дополнительное, не обусловленное увеличением квантового состава, возрастание амплитуды ТКП и укорочение его временных параметров. Оказалось, что при повышении концентрации кальция в среде квантовый состав возрастал в большей степени в дистальных отделах терминали, чем в проксимальных. Это приводит к тому, что удаленные участки нервного окончания начинают вносить более существенный вклад в амплитудно-временные характеристики многоквантового ответа, снижая амплитуду тока концевой пластинки и увеличивая

279 длительность его переднего фронта. Однако, возрастание синхронности секреции в большей мере в дистальных участках терминали, приводит к более выраженной компенсации потери амплитуды и затягивания переднего фронта по сравнению с секрецией в условиях пониженной концентрации кальция. Поскольку наши эксперименты были проведены не на самых протяженных из имеющихся в мышцах лягушки синаптических контактах, то есть основания полагать, что по мере увеличения длины терминали значение компенсирующего влияния временного хода секреции в дистальных отделах на амплитудно-временные характеристики постсинаптического ответа должно возрастать.

Исследование физиологически активных веществ, способных модулировать синаптическую передачу интересно в двух аспектах: первый - это изучение механизма собственного действия этих агентов, приводящего к изменению синаптической функции, второй - использование этих веществ как инструментов для раскрытия путей регуляции синаптической передачи. В этом аспекте наиболее обещающим может быть изучение веществ, являющихся эндогенными модуляторами, или их аналогов. Многочисленными исследованиями установлено, что на двигательных нервных окончаниях существуют различные пресинаптические рецепторы, способные реализовать как отрицательные, так и положительные обратные связи, участвующие в регуляции процесса освобождения медаитора (Bowman 1991; Miyamoto, 1977; Steinbach, Stevens, 1979; Strake et al., 1989; Vizi, 1991; Wessler, Anschuetz, 1988; Wessler et al., 1990;). В частности установлено, что ацетилхолин может модулировать синаптическую передачу, поскольку агонисты и антагонисты как никотиновых, так и мускариновых холинорецепторов способны изменять амплитуду вызванных постсинаптических ответов (Никольский, Гиниатуллин, 1979; Ciani, Edwards, 1973; Wessler, 1989; Slutsky 1999, 2001). Показано, что наиболее близкий аналог ацетилхолина карбахолин, негидролизуемый ацетилхолинэстеразой угнетает синаптическую передачу, вызывая снижение амплитуды ТКП. Однако,

280 поскольку дополнительным фактором, приводящим к такому же эффекту, может быть и увеличение асинхронности выделения квантов медиатора, нами была высказана гипотеза о том, что в угнетающем пресинаптическом эффекте карбахолина может присутствовать компонент, связанный с изменением кинетики освобождения квантов. Предпосылкой для этого стали также результаты, полученные Matzner et al (1990), Slutsky et al (2001), демонстрировавшие изменение степени флуктуаций синаптических задержек под действием d-тубокурарина и метоктрамина. Исследования, проведенные в условиях двухэлектродной фиксации мембранного потенциала и с применением метода «последовательного вычитания» показали, что в присутствии карбахолина наряду со снижением квантового состава ТКП, рассчитанного методом деления площадей и по количеству латентных периодов одноквантовых ТКП, и снижением чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору, имело место изменение кинетики выделения квантов, формирующих многоквантовый ответ. Наблюдалось расширение гистограммы латентных периодов одноквантовых ТКП. Анализ изменения кинетики секреции квантов, осуществленный в разных отделах синаптического контакта показал, что карбахолин, не влияя на скорость проведения возбуждения и уменьшая амплитуду одноквантовых ТКП, при этом увеличивал минимальную синаптическую задержку и степень асинхронности секреции квантов, приводя к увеличению числа сигналов с большими синаптическими задержками. Причем этот эффект в большей степени проявлялся в дистальных отделах синапса, где исходная степень асинхронности была более низкой. Реконструкция многоквантового ТКП с учетом изменения параметров кинетики секреции в разных участках синапса показала, что увеличение асинхронности секреции квантов вносит, наряду с уменьшением квантового состава и чувствительности постсинаптической мембраны, дополнительный вклад в уменьшение амплитуды многоквантового ТКП и затягивает его передний фронт. Для того, чтобы выяснить какие же рецепторные структуры опосредуют влияние карбахолина на кинетику освобождения

281 квантов был проведен фармакологический анализ с использованием как никотиновых, так и мускариновых агонистов и антагонистов. Оказалось, что эффектом, аналогичным карбахолину обладал никотин, который способен взаимодействовать только с рецепторами никотинового типа, а мускариновые агонисты - оксотреморин-М, пропаргиловый эфир арекаидина не оказывали такого влияния. Специфический блокатор никотиновых холиноецепторов (1-тубокурарин снимал влияние карбахолина на временные параметры секреции квантов. Это дало нам основание считать, что никотиновые рецепторы принимают участие в регуляции временного хода секреции квантов. По-видимому, этот эффект не связан с изменением уровня поляризации мембраны нервного волокна, поскольку амплитудно-временные параметры тока действия нервного окончания достоверно не изменялись в присутствии никотинового холиномиметика и карбахолина. Возможным объяснением изменения временного хода секреции квантов медиатора при активации пресинаптических никотиновых холинорецепторов может быть изменение внутриклеточного содержания ионов кальция, которое связано либо с прямой модуляцией входа Са через катионпроницаемые ионные каналы ионотропных рецепторов, либо с изменением активности потенциал-зависимых кальциевых каналов (МасБегтоИ й а1., 1999). Изменение внутриклеточного кальция может прямо влиять на работу машины «экзоцитоза» или (и) изменять активность внутриклеточных путей модуляции секреции таких как кальций- и кальмодулинзависимых протеинкиназы или фосфорилирование фосфатаз (МасОегаюй е1 а1„ 1999).

Если холиномиметики, угнетающие процесс синаптической передачи, оказывают влияние на временной ход освобождения квантов медиатора, вызывая повышение асинхронности секреции, и тем самым снижают амплитуду вызванного постсинаптического ответа, то можно предположить, что вещества, обладающие облегчающим эффектом на процесс передачи сигнала с нерва на мышцу, могут иметь

282 противоположный эффект на степень синхронности выделения квантов. Давно известно, что катехоламины способны облегчать синаптическую передачу (Кирзон, Каменская, 1969; Наследов, 1961; Полетаев, 1972 Anderson, Harvey, 1988; Baños et al., 1988 Hutter, Loewestein, 1955; Jenkinson et al., 1968, Langer, 1981). Влияние катехоламинов на амплитуду синаптических сигналов изучается уже достаточно давно, и большинство исследователей отмечали увеличение амплитуды многоквантовых синаптических сигналов в их присутствии (Jenkinson et al, 1968; Hidaka, Kuriyama, 1969; Kuba, 1970; Kuba, Tomita, 1971; Wessler et al., 1990; Vizi, 1991). Однако единого мнения о механизме облегчающего действия норадреналина до сих пор нет. Так в ряде работ было показано, что норадреналин увеличивает амплитуду синаптических потенциалов за счет изменения свойств постсинаптической мембраны без повышения их квантового состава (Кирзон, Каменская, 1969; Магазаник 1989; Hutter, Loewenstein, 1955, Miamoto, Mote, 1988). Другие исследователи, работавшие на нервно-мышечных препаратах животных, находящихся в состоянии зимней спячки, также констатировали в присутствии норадреналина изменение свойств постсинаптической мембраны, приводящих к росту амплитуды сигналов, которое, однако, сопровождалось снижением интенсивности квантовой секреции (Melichar et al., 1973; Moravez et al., 1973). Кроме того есть данные об увеличении под действием норадреналина амплитуды потенциалов концевой пластинки за счет повышения квантового состава (Kuba, 1971; Yawo, 1996; Huang et al., 1999), однако этот эффект наблюдался только в тех синапсах, где в исходных условиях был низкий уровень вызванной секреции квантов медиатора (Наследов, 1961). Проведенное нами исследование показало, что одной из причин, приводящей к противоречивым оценкам механизма пресинаптического действия норадреналина, может быть неверный выбор метода оценки квантового состава, поскольку степень асинхронности выделения квантов существенно влияет на амплитуду многоквантового ТКП (увеличение синхронности повышает амплитуду, снижение - уменьшает). В связи с

283 этим применение «прямого» метода расчета, основанного на сопоставлении амплитуд ТКП и мТКП, неправомочно в тех случаях, когда исследуемый агент изменяет временной ход секреции. Именно эту ситуацию мы и наблюдали при изучении пресинаптического механизма действия норадреналина. Применение для расчета квантового состава в контроле и в присутствии норадреналина в наших исследованиях «прямого» метода показало существенный его рост (на 21%), в то время как использование методов «деления площадей» и «последовательного вычитания», учитывающих изменение временного хода секреции, не дали достоверных изменений квантового состава. Таким образом, норадреналин, увеличивая синхронность секреции квантов, вызывал возрастание амплитуды многоквантового ТКП, что приводило к кажущемуся увеличению квантового состава, определяемого «прямым» методом. По-видимому, именно синхронизирующее влияние норадреналина, ведущее к росту амплитуды ТКП при отсутствии изменения их квантового состава, позволяет объяснить противоречия, имеющиеся в литературе относительно пресинаптического действия норадреналина.

Проведенное исследование показало, что и в условиях достаточно высокого квантового состава ТКП, синхронизация секреции квантов медиатора является ведущим пресинаптическим механизмом облегчающего действия норадреналина. Тот факт, что степень изменения синхронности под действием норадреналин в синапсах с высоким квантовым составом несколько ниже, чем в синапсах с низким квантовым составом может объяснить, почему норадреналин более эффективен при действии на «астенические» синапсы (Кирзон, Каменская, 1969,Наследов, 1961), и подтверждает физиологическую роль пресинаптического действия норадреналина в синапсах «утомленного» нервно-мышечного препарата (Кирзон, Каменская, 1969, Вигп, 1945, ОгЬеИ, 1923), а также в синапсах животных, находящихся в состоянии гибернации

Melichar et al., 1973, Moravez et al., 1973, South, 1961), когда имеет место chhJ^^J интенсивности вызванной секреции квантов. ^В

Прежде чем перейти к изучению механизма синхронизирующего эффекта НА и оценки его вклада в амплитудно-временные характеристики ТКП, надо было убедиться в том, что наблюдаемое изменение распределения значений истинных синаптических задержек под действием НА не является артефактом регистрации, а действительно отражает изменение синхронности выделения квантов. Основным источником артефакта регистрации является возможность регистрации спонтанных мТКП вместо одноквантовых ТКП, которые теоретически, могут имитировать ТКП с большой синаптической задержкой. Однако, во-первых, расчеты показали, что при исходно низкой частоте мТКП, имевшей место в наших экспериментах, вероятность попадания спонтанного сигнала в "окно" (см. Методику), формируемое вычислительным комплексом для измерения ТКП, оказалась мала. Во-вторых, если даже учитывать низкую вероятность попадания мТКП в "окно", необходимо подчеркнуть, что в наших экспериментах норадреналин не оказывал влияния на частоту МТКП и, следовательно, вероятность регистрации спонтанных сигналов вместо вызванных одноквантовых ТКП в контроле и в опыте должна была бы быть одинаковой, что противоречит экспериментальным данным. В-третьих, эффект норадреналина на распределение синаптических задержек был полностью обратимым, и удаление норадреналина из перфузирующего раствора восстанавливало исходный уровень асинхронности выделения квантов медиатора. Все эти факты свидетельствуют о том, что наблюдаемое в присутствии норадреналина изменение характера флуктуации синаптических задержек реально отражает способность адреномиметика изменять временной ход секреции медиатора.

Несомненный интерес представляло выяснить, как изменится синхронизирующий эффект норадреналина при увеличении и снижении исходной степени асинхронности

285 выделения медиатора. С этой целью были проведены эксперименты с увеличением Са2+ в омывающем растворе от 0.2 до 0.6 ммоль/л и снижением температуры среды до 8° С, которое приводило к возрастанию степени асинхронности выделения квантов медиатора.

Концентрация Са 0.6 ммоль/л оказалась максимальной при которой была возможна регистрация одноквантовых ТКП, необходимых для измерения истинных синаптических задержек. Изучение пресинаптического эффекта норадреналина в экспериментах с вариацией ионов Са2+ в растворе выявило снижение синхронизирующего эффекта, по мере увеличения исходной вероятности освобождения медиатора. Зависимость степени синхронизирующего эффекта норадреналина от концентрации ионов кальция трудно связать с изменением входа этих ионов в нервное окончания под действием адреномиметика, поскольку с одной стороны мы не наблюдали изменения квантового состава, а с другой - прямым измерением внутриклеточного Са2+ с помощью конфокальной микроскопии показано отсутствие влияния норадреналина и адреналина на кальциевый ток нервного окончания (Yawo, 1996, Huang et al., 1999). Это позволяет говорить о том, что точкой приложения действия норадреналина может быть либо переход везикул из резервного пула в пул непосредственно готовый к освобождению, либо стадия экзоцитоза везикул, имеющая место уже после входа кальция в нервное окончание (Huang et al., 1999).

Снижение температуры среды, увеличивающее исходную асинхронность выделения квантов, приводило к возрастанию выраженности синхронизирующего эффекта норадреналина. Реконструкция многоквантового ТКП при сниженной температуре выявила, что снижение дисперсии синаптических задержек под влиянием норадреналина увеличивало амплитуду результирующего ТКП на 26% по сравнению с "исходным" ТКП, несмотря на затягивание временных параметров одноквантовых ТКП при пониженной температуре.

286

Для идентификации типа адренорецепторов, опосредующих синхронизирующее влияние норадреналина, был проведен фармакологический анализ. Результаты экспериментов показали, что, подобно норадреналину, на секрецию влияли другие (Зр адреномиметики, в то время как а-адреномиметики были не эффективны. Эти данные позволяют заключить, что синхронизирующее действие симпатомиметиков осуществляется путем активации пресинаптических (3i-адренорецепторов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что основным механизмом модуляции норадреналином вызванного освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки является его способность изменять временной ход секреции медиатора, что выражается в увеличении степени синхронности освобождения квантов в ответ на каждый нервный импульс.

Проведенный нами анализ влияния норадреналина на параметры временного хода вызванной секреции квантов медиатора в разных участках нервного окончания показал, во-первых, норадреналин обладает синхронизирующим действием на процесс выделения квантов медиатора из нервного окончания, не сопровождающимся изменением квантового состава ТКП, и, во-вторых - степень синхронизации, вызываемой норадреналина, зависит от исходной степени асинхронности секреции квантов. Так в дистальных участках, где наблюдалась относительно высокая исходная синхронность секреции, норадреналин не оказывал влияния на параметры временного хода, тогда как в проксимальных участках, он проявлялся в полной мере. Поскольку фармакологический анализ показал, что в реализации синхронизирующего действия норадреналина принимают участие пресинаптические Pi- адренорецепторы, и, известно, что активация этих рецепторов опосредует эффекты катехоламинов путем изменение активности аденилациклазного комплекса (Carlson et al., 1994; Miyamoto, Breckenbridge,1974, Rasmussen, 1970; Rebich et al., 1989; Renger et al., 2000; Sutherland, Robinson, 1996), экспериментально было проверено предположение об участии цАМФ в реализации

287 влияния норадреналина на временной ход секреции квантов (Sulakhe, Vo, 1995). Увеличение содержания в клетке цАМФ разными способами (за счет действия проникающего через мембраны дибутирильного производного цАМФ, путем активации аденилатциклазы форсколином или ингибированием нуклеотидзависимой фосфодиэстеразы изобутилметилксантином) приводило, подобно действию норадреналина, к синхронизации процесса выделения квантов медиатора. Как и в случае с норадреналином, эффекты воздействий, повышающих внутриклеточную концентрацию цАМФ, не оказывали влияния на временной ход раннего периода освобождения медиатора - не менялась минимальная синаптическая задержка и значение главной моды гистограмм задержек, в то время как поздняя фаза секреции изменялась - исчезали ТКП, имеющие большие значения задержек. Подобно эффекту норадреналина, синхронизация при повышении содержания цАМФ в клетке была наиболее выражена в проксимальных участках терминали, для которых характерна исходно высокая степень асинхронности освобождения квантов медиатора, тогда как в дистальных участках нервного окончания, где кванты освобождаются достаточно синхронно, изменения временного хода секреции медиатора не наблюдалось. Полученные данные дают основание думать, что минимальная синаптическая задержка не управляется уровнем активности цАМФ, то есть для самых «быстрых» (т.е. наиболее готовых к секреции) квантов медиатора дополнительное фосфорилирование синаптических белков, в котором участвует цАМФ не является необходимым (Renger, et al. 2000). Наименьшее значение величины минимальной синаптической задержки в дистальных участках терминали, равное 0.3 мс, близко по значению к временному интервалу 0.2мс, рассчитанному для суммы процессов открывания потенциал-зависимых Са -каналов, входа ионов Са и активации аппарата экзоцитоза (Aimers, 1990). Синаптические везикулы, готовые к освобождению, должны либо очень быстро стыковаться с пресинаптической мембраной или находиться в непосредственном

288 контакте с Са2+ каналами для, того чтобы освобождаться с такой скоростью (Stanley, 1997). Наличие ТКП, имеющих высокие значения задержек, по-видимому, может быть обусловлено тем, что везикулы, принимающие участие в их формировании, либо находятся на более удаленном расстоянии от мест локирования, либо не подготовлены должным образом для осуществления стыковки с местами освобождения (Renger et al., 2000). То обстоятельство, что увеличение цАМФ в клетке приводит к уменьшению количества таких ТКП указывает, что для ускорения процесса выделения таких везикул необходимо дополнительное фосфорилирование синаптических белков. Какие именно белки при этом фосфорилируются, сказать пока трудно, однако, можно предположить, что одним из кандидатов на эту роль являются синтаксины, которые участвуют в подготовке везикул к процессу слияния с пресинаптической мембраной (Llinas, et al., 1991; Sufhof, Sheller, 2001).

На основании полученных нами данных о том, что эффект норадреналина реализуется при участии аденилатциклазы нервного окончания и связан с увеличением уровня цАМФ в клетке, и исходя из общей схемы участия системы вторичных посредников в регуляции внутриклеточных процессов (Greengard, Kebabian, 1974; Greengard, 1979; Majewski, Barrington, 1995), можно предположить, что последующим звеном, участвующим в модуляции временного хода секреции квантов медиатора, может быть протеинкиназа А, которая активируется при повышении внутриклеточного цАМФ (Losavio, Muchnik, 2000). Проведенные эксперименты показали, что специфический ингибитор протеинкиназы А - Rp-cAMP вызывал изменение временного хода вызванной секреции квантов медиатора. Это проявлялось в увеличении минимальной синаптической задержки и флуктуаций величин синаптических задержек одноквантовых ТКП, что приводило к возрастанию параметра Р$>о, свидетельствующему о снижении степени синхронности процесса освобождения квантов. Влияние Rp-cAMP на временной

289 ход секреции было наиболее выражено в дистальном отделе нервного окончания, где исходная степень синхронности освобождения квантов была наиболее высокой .

В связи с обнаруженным нами влиянием Ыр-сАМР на временной ход секреции квантов медиатора, приводящим к уменьшению синхронности их выделения, было исследовано изменение амплитудно-временных параметров интегральных многоквантовых ТКП, регистрируемых внутриклеточно от всего протяженного нервно-мышечного контакта. Эксперименты показали, что под действием Бф-сАМР наблюдалось снижение амплитуды многоквантового ТКП по сравнению с исходным значением, при этом увеличивалось время нарастания переднего фронта ТКП на 18% . Анализ миниатюрных ТКП, являющихся результатом спонтанного выделения отдельных квантов медиатора, показал, что время нарастания переднего фронта этих сигналов в присутствии Яр-сАМР не изменяется, а амплитуда снижается только на 7% . Более выраженное снижение амплитуды ТКП по сравнению с амплитудой миниатюрного ТКП под действием Яр-сАМР, обусловлено как увеличением асинхронности секреции квантов, так и снижением количества квантов, освобождаемых в ответ на нервный импульс.

Таким образом, проведенные исследования показали, что если увеличение внутриклеточного содержания цАМФ приводит к возрастанию степени синхронности секреции квантов медиатора, то «выключение» последующего звена, участвующего в осуществлении экзоцитоза синаптических везикул, а именно - ингибирование цАМФ-зависимой протеинкиназы А - вызывает усиление асинхронности освобождения квантов медиатора и, как следствие, затягивает передний фронт интегрального многоквантового постсинаптического ответа. Зависимость временного хода секреции квантов от уровня активности протеинкиназы А позволяет выдвинуть гипотезу о том, что в регуляции кинетики освобождения квантов могут принимать непосредственное участие синапсины, которые осуществляют прикрепление синаптических везикул к элементам

290 цитоскелета, их фосфорилирование приводит к ослаблению этой связи и облегчению процесса экзоцитоза. Основанием для такой гипотезы служат данные о том, что инъекция активного домена синапсина уменьшала интенсивность секреции и замедляла ее кинетику (Hilfiker et al., 1999).

Обнаруженные нами эффекты синхронизации процесса секреции квантов медиатора под действием норадреналина и агентов, повышающих внутриклеточный цАМФ, приводят к тому, что амплитуда суммарного ТКП, реконструированного с учетом изменений степени синхронности процесса секреции квантов медиатора, вызываемых этими веществами, только за счет их действия на кинетику освобождения, становится выше, чем в контроле на, 18-28%. Таким образом, можно полагать, что повышение степени синхронности процесса освобождения медиатора под влиянием норадреналина, может улучшать передачу нервного импульса в тех физиологических условиях, когда квантовый состав ТКП значительно снижен, например в условиях истощения медиатора в результате длительной стимуляции нерва (Ceccareli et al. 1973, Ruzzier и Scuka 1979), в регенерирующем аксоне (Dennis и Miledi 1974; Di Gregorio et al. 1989) или перед выходом зимнеспящих животных из состояния гибернации (South 1961, Moravec et al., 1973), когда уровень норадреналина в крови повышается.

Влияние норадреналина на кинетику секреции квантов, приводящее к увеличению амплитуды ТКП, и возрастание его выраженности в условиях сниженного квантового состава, позволило нам выдвинуть гипотезу о том, что синхронизирующий эффект адреномиметика может приводить к повышению амплитуды ТКП, сниженной в результате длительного низкочастотного непрямого раздражения двигательного нерва, т.е. лежать в основе феномена Орбели-Гинецинского. Проведенное нами исследование показало, что в процессе «утомления» нервно-мышечного препарата наблюдается не только снижение квантового состава (Никольский, Полетаев 1977, Sieck, Prakash, 1995), но и повышение асинхронности выделения квантов. Добавление норадреналина

291 приводило к повышению амплитуды ТКП вследствие вызываемого им изменения временного хода, проявляющегося в повышении степени синхронности выделения квантов медиатора. Таким образом, влиянием норадреналина на кинетику выделения квантов медиатора можно объяснить его способность восстанавливать сокращения мышцы, утомленной длительным низкочастотным непрямым раздражением.

Проведенный анализ временного хода вызванной секреции квантов медиатора показал, что как в условиях сниженной интенсивности освобождения квантов медиатора, так и в условиях полноценного квантового выброса медиатора наблюдается асинхронность выделения квантов медиатора, приводящая к снижению амплитуды и затягиванию временных параметров многоквантового тока концевой пластинки. Проявления асинхронности секреции квантов могут изменяться как при физических воздействиях, так и под влиянием физиологически активных соединений, приводя к повышению или снижению амплитуды многоквантового постсинаптического ответа, что может модулировать эффективность синаптической передачи. Таким образом, изменение кинетики вызванного освобождения квантов медиатора является, наряду с изменением количества освобождаемых квантов и размером отдельного кванта, еще одним пресинаптическим механизмом, способным модулировать процесс нервно-мышечной передачи.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бухараева, Элля Ахметовна, Казань

1. Гайнулов Р.Х., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. (2001) Метод оценки кинетики вызванной секреции квантов медиатора, определяющих генерацию многоквантового тока концевой пластинки. Российс. Физиол. журн. им. И. М. Сеченова, 87, (4), С.556-562.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. (1999) М. Практика.

3. Говырин В. (1964) Адреналин и норадреналин скелетных мышц. Физиол. журн.1. СССР. 50: 171-183.

4. Зефиров A.JI. (1985) Расположение и функционирование точек освобождения медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки Нейрофизиология .17 (2): 152160.

5. Зефиров A.J1. Куртасанов P.C. (1993) Секреция медиатора в нервных окончаниях различной длины и разветвленности. Нейрофизиология. 18: 170-175.

6. Зефиров A.JL, Бениш Т., Фаткуллин Н., Черанов С.Ю. (1990) Анализ секреции медиатора в активной зоне двигательного нервного окончания. Нейрофизиология. 22(3): 318-327.

7. Зефиров А.Л., Гафуров Б.Ш. (1996) Исследование кинетики ионных токов нервного окончания при неоднородном распределении плотности ионных каналов. Биофизика. 41 (2): 384-392.

8. Зефиров А.Л., Гафуров О.Ш. (1995) Анализ пре-и постсинаптических факторов, влияющих на асинхронность секреции медиатора и амплитудно-временные параметры постсинаптического ответа в нервно-мышечном синапсе. Нейрофизиология, 27 (3), 163-170.

9. Зефиров А.Л., Гафуров О.Ш. (1997) Влияние асинхронности на амплитудно-временные параметры вызванного постсинаптического тока и потенциала в нервно-мышечном синапсе. Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 83 (9): 22-31.

10. Зефиров А.Л., Гафуров О.Ш. (2000) Изменения асинхронности освобождения медиатора и амплитудно-временных параметров вызванных постсинаптических сигналов в процессе роста и ветвления нервного окончания лягушки. Биофизика, 45 (3), 556-564.297

11. Зефиров А.Л., Кашапова Л.А., Мошков Д.А. и др. (1986) Электрофизиологическое и ультраструктурное изучение топографии активных зон в двигательной нервной терминали лягушки. Докл. АН СССР. 290 (5): 1277-1280.

12. Зефиров А.Л., Халилов И.А. (1985) Особенности электрической активности в разных участках нервного окончания лягушки. Бюлл. эксперимент, биологии и медицины. 49 (1): 7-10.

13. Зефиров А.Л., Черанов С.Ю. (1995) Изменение топографии секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе как отражение пластических перестроек активных зон нервного окончания. Нейрофизиология. 26 (4): 253-261.

14. Зефиров А.Л., Черанов С.Ю. (2000) Молекулярные механизмы квантовой секреции медиатора в синапсе. Успехи физиол. наук. 31: 3-22.

15. Каменская М. А. (1972) Современные представления о механизме квантового освобождения медиатора из моторных нервных окончаний скелетной мышцы. Успехи физиол. наук. 3: 22-63.

16. Кирзон М.В., Каменская М.А. (1969) Влияние норадреналина на синаптические процессы в скелетной мышцу, утомленной раздражениями двигательного нерва. Доклады высшей школы. 2: 31-36.

17. Магазаник Л.Г. (1979) Передача в периферических синапсах. В кн. Общая физиология нервной системы. Наука. 278-346.

18. Магазаник Л.Г. (1989) Влияние симпатомиметических аминов на десенситизацию постсинаптической мышечной мембраны к действию ацетилхолина. Физиол. жури, им. И.М. Сеченова. 55 (9): 1147-1155.

19. Магазаник Л.Г., Миненко М.Л. (1986) Полимодальность распределения синаптических задержек в нервно-мышечном соединении лягушки. Нейрофизиология. 18 (6): 748-755.298

20. Миненко M.JI., Магазаник Л.Г. (1986) Явления асинхронности вызванного освобождения медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. Нейрофизиология. 18 (3): 346-384.

21. Наследов Г.А. Влияние симпатического нерва на потенциалы двигательной концевой пластинки. ДАН. 137: 1245-1248. 1961.

22. Нейрохимия (1996) Под ред. Акад. И.П. Ашмарина и проф. П.В. Стукалова. Москва, 209-295.

23. Никольский Е.Е., Гиниатуллин Р.А. (1979) Прекращение пресинаптического действия карбахолина тубокурарином. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 87 (2), 171-174.

24. Никольский Е.Е., Полетаев Г.И. (1977) Исследование механизма блокирования передачи возбуждения с нерва на скелетную мышцу при непрямом редком раздражении. Нейрофизиология, 9, №1, 78-85.

25. Полетаев Г.И. (1972) О пресинаптическом механизме модуляции нервно-мышечной передачи. Тез. IV Международ. Биофиз. Конгрес., М., 285-286.

26. Ходоров Б.И. (1975) Общая физиология возбудимых мембран. Наука. М. 1975.

27. Adams В. (1989) Temperature and synaptic efficacy in frog skeletal muscle J.Physiology. 408: 443-455.

28. Aimers W. (1990). Exocytosis. Annual Reviews of Physiology. 52: 607-624.

29. Anderson A., Harvey A. (1988) Effects of the facilitatory compounds catechol, guanidine, noradrenaline and phencyclidine on presynaptic currents of mouse motor nerve terminals. Nayn.-Schmid. Arch. Pharmacol. 338 (2): 133-137.

30. Anderson M., Cohen M. (1974) Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle J.Physiol. 237: 385-400

31. Arnon A., David G, Gevron E, Yaari Y (1988) Calcium currents in frog motor nerve terminals . Soc of Neuroscince Abstract 14: 68.299

32. Augustine G., Adler E., Charlton M. (1991) The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals . Ann. Of N-Y. Acad. Sci 635: 365-381

33. Augustine G., Charlton M., Smith S. (1987) Calcium action in synaptic transmitter release. Ann. Rev. Neurosci. 10: 633-693.

34. Aumann Y. and Parnas H.(1991) Evaluation of the time course of neurotransmitter release from the measured psc and mpsc. Bulletin of Mathematical Biology Vol. 53, No. 4, pp. 537-555

35. Baldo G. J. Cohen I. S., Van der Kloot W. (1986) Estimating the time course of evoked quantal release at the frog neuromuscular junction using end-plate current latencies. J. Physiology 374: 503-513. 1986.

36. Baldo G., Cohen I., Van der Kloot W. (1983). Facilitation and the conduction of the nerve action potential at the frog neuromuscular jucntion Plugers. Arch. 399, 161-165

37. Banos J., Badia A., Jane F. (1988) Facilitatory action of adrenergic drugs on the muscle twich evoked by nerve stimulation in the curarized rat phrenic hemidiaphragm. Arch. Int. Pharmacodyn. Therap. 293 (l):219-227.

38. Barret E.E., Stevens C.F. (1972a) Quantal independence and uniformity of presynaptic release kinetics at the frog nueromuscular junction. J. Physiol. 227: 665-691.

39. Barret E.E., Stevens C.F. (1972b) The kinetics of transmitter release at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 227: 691-708.

40. Barrett E., Barrett J., Botz D., Chang D., Manaffey D.(1978) Temperature sensitivity aspects of evoked and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction. J.Physiol. 279: 253-273.

41. Bennet M., Davey D., Lavadis N.(1980) Variation in the number of quanta secreted at different sites along developing nerve terminals: correlation with release site ultrastructure. Proc.Austr. Physiol.Pharmacol.Soc. 276: 36300

42. Bennet M., Lavidis N. (1991) Probabilistic secretion of quanta from the release sites of nerve terminals in amphibian muscle modulated by seasonal changes Neuroscience Lett. 134: 79-82.

43. Bennet M.R., Robinson J.(1990) Probabilistic secretion of quanta from nerve terminals at synaptic sites on muscle cells: non-uniformity, autoinhibition and the binomial hypothesis. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 239: 329-358.

44. Bennett M. (1983) Development of neuromuscular synapses. Physiol. Rev. 63: 915-1048.

45. Bennett M., Jones P., Lavidis N.(1986) Transmitter secretion varies between vizualized release sites at amphibian neuromuscular junction. Neuroscience 65: 311-315

46. Bennett M., Lavidis N, Lavidis -Armson F. (1989) The probability of quantal secretion at release sites of different length in toad (bufo marinus) muscle J.Physiol. 418: 235-249.

47. Bennett M., Lavidis N. (1989) The probability of quantal secretion at release sites in different calcium concentrations in toad (bufo marinus) muscle .Physiol. 418: 219-233.

48. Benoit P., Mambrini J. (1970) Modification of transmitter release by ions which prolong the presynaptic action. J. Physiol. 210: 681-695.

49. Betz W., Bewick G. (1992) Optical Analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science . 255:200-203.

50. Bieser A, Wernig A, Zucker H. (1984). Different quantal responses within single frog neuromuscular junctions. J.Physiology. 350: 401-412.

51. Birks R. (1966) The fine structure of motor endings at frog myoneural junctions. Ann. Ny.Acad. Sci. 135: 8-26.

52. Birks R., Huxley H., Katz B. (1960) The fine structure of neuromuscular junction of the frog. J.Physiology. 150: 134-144.

53. Blioch Z., Glagoleva I., Liberman E., Nervashev V. (1968) A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.J. Physiology 199: 11-35.301

54. Borges S., Gleason E., Turelli M., Wilson M. (1995) The kinetics of quantal transmitter release from retinal amacrine cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6896-6900.

55. Boudier J.-A., Charvin N., Boudier J-L., et al. (1996) Distribution of components of the SNARE complex in relation to transmitter release sites at the frog neuromuscular junction. Eur.J.Neuroscince. 8: 545-552.

56. Bowman W, Prior C, Marshall I. (1990) Presynaptic receptors in the neuromuscular junction. Ann. of the New York Acad. Scienc. 604, 69-81.

57. Boyd I., Martin A. (1956) Spontaneous subthreshold activity at mammalian neuromuscular junction. J.Physiology. 132: 61-73.

58. Braun M., Schmidt R. (1961)Potential changes recorded from motor nerve terminal during its activation. Pflugers. Arch. 287: 56-80

59. Breckenridge B., Burn J., Matschinsky F. (1967) Thoephylline, epinephrine and neostigmine facilitation of neuromuscular transmission. Proc. Nat. Acad. Sci USA. 57: 1893-1899.

60. Burn J. H. (1945) The relation of adrenaline to acetylcholine in the nervous system. Physiol. Rev. 25: 377-394.

61. Bykhovskaia M, Hackett JT, Worden MK.(1999) Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol 181:2234-42.

62. Bykhovskaia M, Worden MK, Hackett JT. (1996). An algorithm for high resolution detection of postsynaptic quantal events in extracellular records. J Neurosci Methods 65:173-82.

63. Carlson S., Trauth K., Brooks W., Roszman T. (1994) Enhancement of beta-adrenergic-induced cAMP accumulation in activated T-cells. J. Cell. Physiol. 161: 39-48.

64. Ceccarelli B., Hurlbut W. P., Mauro A. (1973) Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. J.Cell. Biol. 57: 499-524.302

65. Chen H., Dryden W. F. and Singh Y. N. (1991) Transduction of the modulatory effect of catecholamines at the mammalian motor neuron terminal. Synapse. 7 (2): 93-98.

66. Cherki-Vakil R., Ginsburg S., Meiri H. (1995) The difference in shape of spontaneous and uniquantal evoked synaptic potentials in frog muscle. J.Physiol. 482: 641-650.

67. Ciani S, Edwards C. (1963) The effect of acetylcholine on neuromuscular transmission in the frog. J.Pharmacol. Exp. Therap. 142,21-23.

68. Cochran, S.L. (1993) Algorithms for detection and measurement of spontaneous events. J. Neurosci. Methods, 50:105-121

69. Cohen I, van der Kloot W, Attwell D (1981) The timing of channel opening during miniature end-plate currents. Brain Res 223:185-189.

70. Cohen I., Hiroshi, K., Van Der Kloot, W. (1974) The intervals between miniature endplate potentials in the frog are unlikely to be independently or exponentially distributed, J. Physiol. (Lond.) 236: 327-339.

71. Cohen M., Jones O., Angelides K.(1993) Distribution of Ca2+ channels on frog motor nerve terminals relevated by fluorescent co-conotoxin. J. of Neuroscience. 11(4): 10321039.

72. Cooper RL, Marin L, Atwood HL.(1995) Synaptic differentiation of a single motor neuron: conjoint definition of transmitter release, presynaptic calcium signals and ultrastructure. J Neurosci; 15:4209-22.

73. Correges P., Dunant Y. (1996) Disorganization of quantal acetylcholine release by zinc at the Torpedo nerve-electroplate junction. Pflugers Arch- Eur. J. Physiol. 432: 859-866.

74. Couteaux R. (1960) Motor endplate structure In The structure and function of muscle Ed. G.H. Bourne , Academic, New-York, 357-380

75. Couteaux R., Pecot-Dechavassine M. (1974) Les zones specialisees des membranes presynaptiques. C.R.Acad. Sci. (Paris) 278: 291-293.

76. D'Alonzo A., Grinnell A. (1984) Profiles of spontaneous release along the frog nerve terminals. Soc.Neurosci. Abstr. 10: 919.

77. D'Alonzo A., Grinnell A. (1985) Profiles of evoked release along the length of frog motor nerve terminals. J. Physiology, 359: 235-258.

78. Datyner N., Gage P. (1980) Phasic secretion of acetylcholine at a mammalian neuromuscular junction. J. Physiol. 303: 299-314.

79. Davey D., Bennett M. .(1982) Variation in size of synaptic contacts along developing and mature terminal branches. Dev. Brain Research 5: 11-22.

80. Del Castillo J, Katz B. (1955) Local activity at depolarized nerve-muscle junction ¿Physiology 128:396-411.

81. Del Castillo J., Katz B. (1954) Statistical factors involved in neuromuscular facilitation and depression. J. Physiol (L). 124: 574-585.

82. Del Castillo J., Katz B. (1956) Localization of active spots within the neuromuscular junction of the frog. ¿Physiology 132: 630-649.

83. Dempster, J. 1986. The use of driving function in the analysis of endplate current kinetics. J. Neurosci. Methods 18,277-285.

84. Dennis M.J., Miledi R.(1974) Characteristics of transmitter release at regenerating frog neuromuscular junction. J. Physiol. 239: 571-594.

85. Desaki J. Uhara Y. (1981) The overall morphology of neuromuscular junctions as revealed by scanning electron microscopy. J. Neurocytol. 10: 101-110.304

86. Di Gregorio F., Fesce R., Cereser S., Favaro G., Fiori M.G. (1989) Spontaneous and nerve-evoked quantal transmission in regenerated motor terminals. Cell Biology International Reports 13: 1119-1126.

87. Diamond J., Jahr C. (1995) Asynchronous release of synaptic vesicles determines the time course of the AMPA receptor-mediated EPC. Neuron 15,1097-1107.

88. Dodge F., Rahamimoff R. (1967) Cooperative action of calcium ions in transmitter release at the neuromuscular junctions. J.Physiol. 193: 419-432.

89. Dreyer F., Peper K., Akert K., Sandri C., Moor H. (1973) Ultrastructure of the active zone in the frog neuromuscular junction. Brain Researsh. 67: 373-380.

90. Dreyer F., Schmitt A. (1983) Transmitter release in tetanus and botulinum A toxin-poisened mammalian motor endplates and its dependense on nerve stimulation and temperature. Plugers. Arch. 399 (3), 228-234.

91. Dryden W., SinghY., Gordon T. Lazarenko G. (1988) Pharmacological evaluation of cyclic AMP and transmitter release at mouse neuromuscular junction. Can. J. Physiol, and Pharmacol. 66 (3): 207-212.

92. Dudel J.(1984) Control of quantal transmitter release at frog's motor nerve terminals. Pflugers. Arch. 402, 225-234.

93. Dudel, J. (1981) The effect of reduced calcium on quantal unit current at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391, 35-40.

94. Elmqvist D., Hofmann W., Kugelberg J, Quastel D. (1964) An electrophysiological investigation of neuromuscular transmission in myasthenia gravis. J.Physiology , 174, 417-434/

95. Fatt P, Katz B. (1952) Spontaneous subthreshold activity t motor nerve endings J. Physiology 117: 109-128.305

96. Fedulova S., Vasilyev D., Veselovsky N. (2000) Temporal regularity of neurotransmitter release at single terminal in cultured hippocampal neurons. Neuroscince. 100 (2) : 229239.

97. Giniatullin R. Kheeroug L.S., Vyskocil F. (1995) Modelling endplate current: dependence on quantum secretion probability and postsynaptic miniature current parameters. Eur. Biophys. J. 23: 443-446. 1995.

98. Greengard P.(1979) Some chemical aspects of neurotransmitter action . Trends Pharmacol. Sci. 1: 27-29.

99. Greengard P., Kebabian J. (1974) Role of cyclic AMP in synaptic transmission in the mammalian peripheral nervous system Fed. Proc. 33: 1059-1067.

100. Grinnell A., Pawson P. (1989) Dependence of spontaneous release at frog junctions on synaptic strength, external calcium and terminal length. J.Physiology 418: 397-410.

101. Grinnell A., Trussell L. (1983) Synaptic length as a function of motor unit size in the normal frog sartorius . J. Physiology, 338: 221-241.

102. Hall Z., Sanes J. (1993) Synaptic Structure and development: the neuromuscular junction Cell. V.72. Neuron v 10 (Suppl) 99-121.

103. Hartzell H., Kuffler S., Yoshikami D. (1975) Post-synaptic potentiation: interaction between quanta of acetylcholine at the skeletal neuromuscular sunapse. J.Physiol. 251, 427-463.

104. Henkel A., Lubke J., Betz W. (1996) FM-43 dye ultrastructural localization in and release from motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 1918-1923.

105. Hidaka T., Kuriyama H. (1969) Effects of catecholamines on the cholinergic neuromuscular transmission in fish red muscle. J. Physiol. (L) 201: 61-71. 1969.

106. Hilfilker S., Pieribone V., Czernik A. et al. (1999) Synapsins as regulators of neurotransmitter release. Phil.Trans.R.Soc.Lond.B. 354,269-279.306

107. Hodgkin A., Huxley A. (1952) A qualitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. 117, 500-544.

108. Hubbard J. (1963) Microphysiology of vertebrate neuromuscular transmission. Physiol. Rev. 53: 674-723.

109. Hubbard J., Jones S., Landau E. (1971) The effect of temperature change upon transmitter release, facilitation and post-tetanic potentiation. J.Physiology. 216: 591-609.

110. Hutter 0., Loewenstein W. (1955) Nature of neuromuscular facilitation by sympathetic stimulation in the frog. J.Physiol. (L) 130: 559-571.

111. Isaacson J., Walmsley B. (1999) Counting quanta: direct measurements of transmitter release at a central synapse. Neuron, 15: 875-884.

112. Jenkinson D., Stamenovic B., Whitaker B. (1968) The effect of noradrenaline ob the endplate potential in twich fibres of the frog. J. Physiol. (L). 195: 743-754.

113. Kashapova L., Moshkov D., Bezgina E. (1991) Active zones and plasticity of motor nerve terminals. In Plasticity of motoneuronal connections. Ed. Wernig A. Amsterdam, 163-173.

114. Katz B, Miledi R. (1968) The role of calcium in neuromuscular facilitation. J. Physiology, 194,481-492.

115. Katz B., Miledi R. (1965 a) The measurement of synaptic delay, and the time course of acetylcholine release at the neuromuscular junction. Proc. R. Soc. B. 161: 483-495.

116. Katz B., Miledi R. (1965b) Propagation of electric activity in motor nerve terminals Proc. R. Soc. B. 161:453-483.

117. Katz B., Miledi R. (1965c) The effect of calcium on acetylcholine release from motor nerve ending. Proc. R. Soc. B. 161: 496-503.

118. Katz B., Miledi R.(1965 d) The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J. Physiol. 181:656-670.

119. Katz B., Thesleff S. (1957) A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. J.Physiol., 138, 63-80.307

120. Katz B. Miledi R. (1979) Estimating of quantal content during "chemical potentiation" of transmitter release Proc.Royal.Soc. B 212, 131-137.

121. Koketsu K., Miyagawa M., Akasu T. (1982) Catecholamine modulates nicotinic ACh-receptor sensitivity. Brain Research, 236 (2): 487-491.

122. Kriebel M., Keller B, (1998) The unitary evoked potential at the frog nerve-muscle junction results from synchronous gating of fusion pores at docked vesicles. Cell Biol. 23, 527-532.

123. Kuba K. (1970) Effects of catecholamines on the neuromuscular junction in the rat diaphragm. J. Physiol.(L) 211: 551-570.

124. Kuba K., Tomita T. (1971) Noradrenaline action on nerve terminal in the rat diaphragm J. Physiol. 217: 19-31.

125. Kuromi H., Kidokoro Y. (1999) The optically determinated size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae J.Neuroscience 19(5), 1557-1563

126. Landau E., Kwanbunbumpen S. (1969) Morphology of motor nerve terminals subjcted to polarizing currents. Nature 221, 271-272.

127. Langer S. (1981) Presynaptic regulation of the release of catecholamines. Pharmacol. Rev. 32, 337-362.

128. Laurenza A., Khadelwal Y., De-Souza N., Rupp R., Metzger H., Seamon K. (1987) Stimulation of adenylate cyclase by water-soluble analogues of forskoline. Mol. Pharmacol. 32 (1): 133-139.

129. Laurie R., Tramblay J. (1982) Boutons originating from the same axon do not participate equally in synaptic transmission. Neuroscience Letters, 29,134-140.

130. Li J., Jahn R., Hou X. Et al. (1996) Distribution of Rab3a in rat nervous system: comparision with other synaptic vesicle proteins and neuropeptides. Brain Res. 706, 103112.308

131. Linial M., Ilouz N, Parnas H. (1997) Voltage-dependent interaction between the muscarinic receptor and proteins of the exocytic machnery. J.Physilogy 504, 251-258.

132. Llinas R., McGuiness T., Leonard C. et al. (1991) Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 3035-3039.

133. Losavio A., Muchnik S., (2000) Facilitation of spontaneous acetylcholine release induced by activation of cAMP in rat neuromuscular junctions. Life Sciences, 66, 2543-2556.

134. Lustig C., Parnas H., Segel I. (1991) Release kinetics as a tool to describe drug effects on neurotransmitter release. J.Theor. Biol. 144, 225-248.

135. MacDermott A., Role L., Siegebaum S. (1999) Presynaptic ionotropic receptors and the control of transmitter release. Ann.Rev. Neurosci. 22,443-485.

136. Macleod G., Gan J., Bennett M. (1999) Vesicle-assotiated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J.Neurophysiol., 82 (3) 1133-1146

137. Magleby K., Pallotta B. (1981) A study of desensitization of acetylcholine receptors using nerve-released transmitter in the frog. J. Physiol. 316, 225-250.

138. Majewski H., Barrington M. (1995) Second messenger pathways in the modulation of neurotransmitter release, In Neurotransmitter release and its modulation, Ed. Powis D., Bunn S., Cambridge: 163-178.

139. Mallart A. (1984) Presynaptic currents in frog motor endings. Pflugers. Arch. 400: 8-20.

140. Martin A. R. (1955) A further study of the statistical composition of the endplate potential.// J.Physiol. 130: 114-122.

141. Matthews-Bellinger J., Salpeter M.(1978) Distribution of acetylcholine receptors at frog nueromuscular junctions with discussion of some physiological implications. J.Physiology. 279: 197-213.309

142. Matzer H., Parnas H., Parnas I. (1988) Presynaptic effects of d-tubocurarine on neurotransmitter release at the neuromuscular junction of the frog.J. Physiol.398: 109-121.

143. Melichar I., Brozek G., Jansky L., Vyskocil F. (1973) Effect of hibernation and noradrenaline on acetylcholine release and action at neuromuscular junction of golden hamster (Mesocricetus auratus). Pflugers Arch. 345: 107-122.

144. Miledi R. (1966) Strontium as a substitute for calcium in the rocess of transmitter release at the neuromuscular junction. Nature. 212 (10): 1233-1234.

145. Miyamoto M, Breckenbridge B. (1974) A cyclic adenosine monophosphate link in the catecholamine enhancement of transmitter release at the neuromuscular junction J. General Physiology. 63: 609-624.

146. Miyamoto M. (1977) The actions of cholinergic drugs on motor nerve terminals. Pharmacol. Rev. 29, 221-247.

147. Miyamoto M., Mote T. (1988) The effect of catecholamine on the neuromuscular blockade induced by several drugs in fast and slow muscles in the dog. Supporo Med. J. 57 (5): 535-546.1988.

148. Molgo J., Siegel L., Tabti N., Thesleff S. (1989) A study of synchronization of quantal transmitter release from mammalian motor ending by the use of botulinal toxins type A and D.J. Physiol. 411: 195-205.

149. Moravec J., Melichar I., Jansky L., Vyskocil F. (1973) Effect of hibernation and noradrenaline on the resting state of neuromuscular junction of golden hamster (Mesocricetus auratus). Pflugers. Arch. 345: 93-106.

150. Neher E. and Sakaba T.(2001) Combining Deconvolution and Noise Analysis for the Estimation of Transmitter Release Rates at the Calyx of Held. The Journal of Neuroscience, January 15, 21(2):444-461

151. Sakaba T. Neher E. (2001) Preferential potentiation of fast-releasing synaptic vesicles by cAMP at the calyx of Held. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98,331-336.310

152. NestlerE., Greengard P.(1993) Protein phosphorylation and the regulation of neuronal function. In: Basic Neurochemistry. Ed. G.Siegel et al., New York, 449.

153. Nicholls J., Martin A., Wallace B. (1992). From neuron to brain. Sin.Ass.Inc. Sanderland.USA. P. 807.

154. Nishimura M, Taquahashi, Fujita K., Satoh E., Shimizu Y. (1996) Dependence on temperature of the effect of dinitrophenol on the release of transmitter quanta at neuromuscular junctions in the mouse diaphragm. Br. J.Pharmacol. 118 (4) 957-960

155. Orbeli L.A. (1923) Die sympatetische Innervation der Skelettmuskeln. Bull. Inst. Sci. Leshaft. 6:194-197. 1923.

156. Parnas H„ Hovav G., Parnas I. (1989) Effect of CaiT diffusionon the time-course ofneurotransmitter release. Biophys. J. 55: 859-574.

157. Parnas H., Segel L., Dudel J., Parnas I. (2000) Autoreceptors, membrane potential and regulation the transmitter release. Trends Neurosci. 23, 60-68.

158. Parnas I., Parnas H. (1999) Different mechanisms control the amount and time course of neurotransmitter release J. Physiol. (L). 517: 629.

159. Parnas, H., I. Parnas and L. Segel. (1986) A new method for determining co-operativity in neurotransmitter release.J. theor. Biol. 119,481-499.

160. Peper K., Dreyer F., Sandri C., Akert K. (1974) Structure and ultrastructure of the frog motor end-plate. Cell Tiss. Res. 149, 437-455.

161. Peper K., McMachan U (1972) Distribution of acetylcholine receptors in the vinicity of nerve terminals on skeletal muscle of the frog. Proc.R.Soc. London Ser. 181,431-440.

162. Pockett S., Macdonald J. (1986) Temperature dependence of neurotransmitter release in the antarctic fish Patogothenia borchgrevinki. Experientia, 42 (4) 414-415.

163. Popoli M., Venegoni A., Buffa L., Racagni G. (1997) Ca2+/phospholipid-binding and syntaxin-binding of native synaptotagmin I. Life Sciences. 61: 711-721.311

164. Provan S., Miyamoto M. (1993) Unibased estimates of quantal release parameters and spatial variation in the probability of neurosecretion. Am. J. Physiol. 264, CI 051-CI 060

165. Pumplin D. (1983) Normal variations in presynaptic active zones of frog nueromuscular junction J. Neurocytology, 12, 317-323.

166. Rasmussen H.(1970) Cell communication, calcium ion and cyclic adenosine monophosphate. Science. 170:404-412.

167. Rebich S., Devine J. Armstead W. (1989) Role of nitric oxide and cAMP in beta-adrenoceptor-induced pial artery vasolidation . Am. J. Physiol. 268, H1071-H1076

168. Robitaille R., Tramblay J, Grenon G. (1987) Non-uniform distribution of miniature endplate potential amplitudes along the length of the frog neuromuscular junction. Neuroscience Lett. 74, 187-192.

169. Ruzzier F., Scuka M.(1979) Effect of repetitive stimulation on the frog neuromuscular transmission. Pflugers Arch. 382: 127-132.

170. Salpeter M. (1987) The vertebrate neuromuscular junction. Neurology and Neurobiology. Ed. Salpeter. A. Liss. New York. 23:1-55.

171. Shakiryanova D.M., Zefirov A. L., Nikolsky E. E., Vyskocil F. (1994) The effect of acetylcholine and related drugs on currents at the frog motor nerve terminal. Eur. J. Pharmacol. 263: 107-114.

172. Sheng Z. Yokoyama C., Catterall W. (1997) Interaction of the synprint site of the N-type Ca channels with C2B domain of synaptotagmine. Proc. Natl.Acad. USA 94, 54055410.

173. Soucek B. (1971) Influence of latency fluctuations and the quantal process of transmitter release on the end-plate potential's amplitude distribution. Biophys. J. 11:127-139.312

174. South F. E. (1961) Phrenic nerve-diaphragm preparation in relation to temperature and hibernation. Amer. J. Physiol. 200: 565-571.

175. Stanley, E.F. (1997). The calcium channel and the organization of the presynaptic transmitter release face. Trends of Neuroscience 20,404-409.

176. Starke K (1989) Modulation of neurotransmitter release by presynaptic autoreceptors. Physiol. Rev. 69, 864-989.

177. Steinbach J., Stevens C. (1979) Neuromuscular transmission. In Frog Neurobiology ed. Llinas R., Precht W. Berlin, Springer. 32-92.

178. Stevens CF, Wesseling JF.(1998) Activity-dependent modulation of the rate at which synaptic vesicles become available to undergo exocytosis. Neuron 21:415-24.

179. Stevens C. F.(1993) Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell 10:55-63.

180. Stevens C. F., Wang Y. (1995) Facilitation and depression at single central synapse. Neuron 14: 795-802.

181. Stiles J., Van Helden D., Bartol T. et al. (1996) Miniature endplate current rise time <100 is from improved dual recordings can be modelled with passive acetylcholine diffusion from a synaptic vesicle. Proc. Natl. Acad.Sci.USA. 93: 5747-5752.

182. Sudhof T.S. (1995) The synaptic vesicle cycle: a cascade of protein-protein interactions. Nature, 375, 645-653.

183. Sudhof T.S., Jahn R. (1991) Proteins of synaptic vesicles involved in exocytosis and membrane recycling. Neuron. 6: 665-677.

184. Sudhof T.S., Scheller H. (2001) Mechanism and regulation of neurotransmitter release. Synapses. Ed. Cowan W., Sudhof T., Stevens C. The Johns Hopkins University, London.

185. Sutherland E., Robinson G. (1996) The role of cyclic 3, 5-AMP in response to catecholamines and other hormones. Pharmacol. Rev. 18: 145-188.

186. Thska A., Lagerspetz Y. (1994) Thermal acclimation, neuromuscular synaptic delay and miniature end-plate current decay in the frog Rana temporaria. J.Exp. Biology. 187, 131142.

187. Tompson F.S., LavidisN. A., Robinson J., Bennet M. R. (1995) Probabilistic secretion of quanta at somatic motor-nerve terminals: the fusion-pore model, quantal detection and autoinhibition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 349: 197-214.

188. Van der Kloot W (1988a) Estimating the timing of quantal releases during end-plate currents at the frog neuromuscular junction. J Physiol (Lond) 402:595-603.

189. Van der Kloot W (1988b) The kinetics of quantal releases during end-plate currents at the frog neuromuscular junction. J Physiol (Lond) 402:605-626.

190. Van der Kloot W. (1991) The regulation of quantal size. Progr. inNeurobiol. 36: 93-130.

191. Van der Kloot W., Molgo J. (1994) Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction. Physiological Rev. 74(4): 899-991.

192. Van der Kloot W., Naves L. A. (1996) Accounting for the shapes and size distributions of miniature endplate currents. Biophysical Journal. 70: 2175-2184.

193. Van der Kloot W., Van der Kloot T. (1986) Catecholamines, insulin and ACTH increase quantal size at the frog neuromuscular junction. Brain Research 376 (2): 378-381.

194. Verma V, (1984) The presynaptic active zones in three different types of fibres in frog muscle, Proc R. Soc. London, B, 221,369-373.

195. Vizi S. (1991) Evidence that catecholamines increase acetylcholine release from neuromuscular junction through stimulation of alpha-1 adrenoreceptors. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 343: 435-438.314

196. Vorobieva O.N., John T. Hackett, Mary Kate Worden, Maria Bykhovskaia.(1999) Evaluation of quantal neurosecretion from evoked and miniature postsynaptic responses by deconvolution method. Journal of Neuroscience Methods 92, 91-99

197. Weakly J. (1973) The action of cobalt ions on neuromuscular transmission in the frog. ¿Physiology 234, 597-612.

198. Werle M, Herrera A., Grinnell A. (1984) Ultrastructural uiformity along branches of frog motor nerve terminals Soc. Neuroscience Abstr. 10. 919.

199. Wernig A. (1976) Localization of active sites in the neuromuscular junction of the frog. Brain Research 118, 63-72

200. Wessler I., Holzer G., Kanstler A. (1990) Stimulation of bi adrenoreceptors enhances electrically evoked H3. acetylcholine release from rat phrenic nerve. Clin. Exp. Pharmacol Physiol. 17: 23-32.

201. Wessler J., Anschuetz S.(1988) Beta-adrenoreceptor stimulation enhances transmitter output from the rat phrenic nerve. Br.J. Pharmacol. 94 (3): 669-674.

202. Wood S., Slater C. (2001) Safety factor at the neuromuscular junction. Progr. In Neurobiol. 64, 393-429.

203. Yawo, H. (1996) Noradrenaline modulates transmitter release by enhancing the Ca2+ sensitivity of exocytosis in the chick ciliary presynaptic terminal. J. Physiol. 493: 385-391.

204. Zefirov A.L., Benish T., Fatkullin N., et al. (1995) Localization of active zones . Nature, 37, 393-394.

205. Zefirov A., Abaidoullin R. (2001) Estimating of the temporal course of evoked secretion of transmitter quanta in the frog neuromuscular junction. Neurophysiology, 33,2, 79-89.