Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синхронизация освобождения квантов медиатора как один из механизмов облегчающего действия норадреналина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ким, Кира Хаймуновна, Казань

4»/ / V п/ / / ^

КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И БИОФИЗИКИ КАЗАНСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Ким Кира Хаймуновна

СИНХРОНИЗАЦИЯ ОСВОБОЖДЕНИЯ КВАНТОВ МЕДИАТОРА КАК ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ ОБЛЕГЧАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ

НО РАД РЕ НАЛ И НА

Специальность 03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

- доктор медицинских наук профессор Е.Е. Никольский,

- кандидат биологических наук старший научный сотрудник Э.А. Бухараева

Казань - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие представления о механизме синаптической передачи.......10

2.1.1.Квантовая теория синаптической передачи. Спонтанное и вызванное освобождение медиатора.......................................................................10

2.1.2. Взаимодействие квантов медиатора с постсинаптической мембраной. Генерация постсинаптических ответов и их амплитудно -временные характеристики......................................................................................14

2.2. Модуляция освобождения медиатора как механизм, обеспечивающий надежность и пластичность синаптической передачи......18

2.2.1. Регуляция размера кванта....................................................................18

2.2.2. Регуляция величины среднего квантового состава вызванного сигнала........................................................................................................................20

2.2.3. Временной ход вызванной секреции медиатора..............................23

2.2.3.1. Явление асинхронности освобождения квантов медиатора........23

2.2.3.2. Временной ход вызванной секреции квантов медиатора.

Способы оценки синхронности секреции квантов медиатора........................26

2.2.3.3. Вклад степени синхронности освобождения медиатора в амплитудно-временные параметры многоквантовых ответов..............................28

2.3. Влияние катехоламинов на нервно-мышечную передачу...............31

2.3.1. Участие норадреналина в реализации феномена Орбели-Гинецинского.............................................................................................................32

2.3.2. Роль норадреналина в процессе выхода зимнеспящих

животных из состояния спячки............................................................................34

2.3.3. Влияние катехоломинов на пассивные свойства и чувствительность постсинаптической мембраны к ацетилхолину...................35

2.3.4. Механизм влияния катехоламинов на процессы секреции квантов медиатора из двигательного нервного окончания..................................................37

2.3.4.1. Влияние норадреналина на размер кванта и на величину среднего квантового состава ПКП...........................................................................37

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объект исследования................................................................................40

3.2. Растворы. Система перфузии..................................................................40

3.3. Электрофизиологические исследования................................................41

3.4. Отведение синаптических потенциалов.................................................41

3.5. Усиление и регистрация синаптических потенциалов.........................42

3.6. Оценка величины среднего квантового состава ТКП.........................44

3.7. Математическая реконструкция многоквантовых ТКП......................44

3.8. Оценка временного хода вызванных сигналов и степени синхронности их освобождения...........................................................................45

3.9. Статистическая обработка.......................................................................46

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Амплитудно-временные характеристики вызванных одноквантовых ТКП в интактном синапсе.........................................................47

4.2. Временной ход секреции вызванных одноквантовых ТКП в интактном синапсе.................................................................................................48

4.3. Влияние норадреналина на частоту и параметры МТКП...................51

4.4. Влияние норадреналина на амплитудно-временные

параметры, величину квантового состава ТКП и размер кванта....................51

4.5. Влияние норадреналина на временной ход вызванной секреции квантов медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки................52

4.6. Математическая реконструкция многоквантовых ТКП......................60

4.7. Зависимость синхронизирующего эффекта норадреналина от концентрации ионов Са2+ в среде.......................................................................62

4.8. Влияние норадреналина на временной ход вызванной

секреции медиатора при снижении температуры окружающей среды...........65

4.9. Определение типа адренорецепторов, опосредующих синхронизирующее действие норадреналина на вызванную секрецию квантов медиатора...................................................................................................... 7 3

4.9.1. Исследование влияния специфических а-адренергических веществ на временной ход секреции вызванного освобождения медиатора...................73

4.9.1.1. Влияние специфических а-адреномиметиков.................................73

4.9.1.2. Влияние специфических а-адренолитиков......................................77

4.9.2. Исследование влияния специфических р-адренергических веществ на временной ход секреции вызванного освобождения медиатора......79

4.9.2.1. Влияние специфических Р-адреномиметиков.................................79

4.9.2.2. Влияние специфических р-адренолитиков......................................83

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................90

6. ВЫВОДЫ.............................................................................................................96

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................98

1.ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Известно, что нейромедиаторы наряду со своей основной функцией передачи информации от клетки к клетке выступают в качестве модуляторов синаптической передачи. Норадреналин (НА), являясь нейромедиатором вегетативной нервной системы, обладает способностью через пресинаптические адренорецепторы модулировать процесс квантовой секреции в вегетативных ганглиях (Gillespie, 1980; Langer, 1981; Kalsner, Quillan, 1984). Кроме того, известна его способность облегчать проведение возбуждения с нерва на скелетную мышцу (Орбели, 1923; Полетаев, 1973; Burn, 1945). В настоящее время нет единого представления как о механизмах облегчения нервно-мышечной передачи в присутствии НА, так и о типах пресинаптических адренорецепторов, участвующих в его реализации (Jenkinson et al., 1968; Miyamoto, Mote, 1988; Wessler, Anschuetz, 1988; Wessler, et al, 1990; Vizi, 1991; Kawakami et al., 1995). Ряд авторов связывает действие НА с процессами, происходящими на уровне двигательных нервных окончаний: увеличением квантового состава (т) потенциалов концевых пластинок (ПКП) (Наследов, 1961 а, б; Полетаев, 1972; 1973; Kuba, Tomita, 1971) и (или) изменением размера кванта (W.Van der Kloot, Т. Van der Kloot, 1986). Кроме того, существуют данные о влиянии НА на постсинаптические структуры нервно-мышечного синапса (Hutter, Loewenstein, 1955; Moravec, et al., 1973; Svoboda et al., 1986).

В последние годы на основании модельных работ к числу пресинаптических факторов, модулирующих процесс передачи возбуждения от нерва к мышце, наряду с изменением количества освобождающихся квантов и

размером кванта стали относить изменение временного хода секреции, который отражает степень синхронности их освобождения (Matzner et al., 1988, Van der Kloot, 1988, 1990; Lustig et al., 1990; Giniatullin et al., 1995; Зефиров, Гафуров, 1997). Экспериментально временной ход секреции медиатора оценивается путем анализа степени флуктуации величин истинных синаптических задержек вызванных одноквантовых токов концевых пластинок (ТКП) (Barrett, Stevens, 1972а, 1972b; Katz, Miledi, 1965 а, 1965 b). Влияние НА на временной ход вызванного освобождения квантов медиатора из двигательных нервных окончаний не изучено. Определение вклада каждого из возможных компонентов пресинаптического действия НА в облегчение нервно-мышечной передачи позволит ближе подойти к пониманию механизмов модуляции процессов квантовой секреции медиатора.

Цель и основные задачи исследования

Целью работы явилась оценка вклада изменения квантового состава ТКП, величины кванта и степени синхронности освобождения медиатора в облегчающее действие норадреналина в нервно-мышечном синапсе лягушки. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи.

1. Исследовать влияние норадреналина на величину квантового состава ТКП и размер кванта в условиях сниженной концентрации ионов Са2+ в окружающей среде.

2. Исследовать влияние норадреналина и других адреномиметиков на временной ход вызванного освобождения квантов медиатора из двигательных нервных окончаний.

3. Исследовать влияние норадреналина на временной ход вызванной квантовой секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе в условиях, определяющих различную степень асинхронности освобождения квантов медиатора (изменение температуры среды, различное содержание ионов Са2+ во внешней среде).

4. Изучить фармакологические свойства пресинаптических адренорецепторов, опосредующих синхронизирующее влияние норадреналина.

5. Оценить вклад изменения степени синхронности освобождения квантов медиатора в параметры многоквантового ответа.

Положения, выносимые на защиту

1. В нервно-мышечном соединении лягушки в условиях низкого уровня вызванной секреции основным пресинаптическим эффектом норадреналина является увеличение синхронности освобождения квантов медиатора, выделяемых в ответ на нервный импульс.

2. Выраженность синхронизирующего эффекта норадреналина возрастает по мере увеличения асинхронности вызванного освобождения квантов медиатора.

3. Норадреналин увеличивает синхронность освобождения квантов медиатора в синапсах лягушки, активируя пресинаптические (В^-адренорецепторы.

Научная новизна

В результате проведенных исследований впервые показано, что основным компонентом пресинаптического влияния НА в нервно-мышечном синапсе лягушки в условиях низкого уровня квантовой секреции является

увеличение степени синхронности освобождения квантов медиатора, выделяемых в ответ на нервный импульс. Увеличение синхронности секреции квантов медиатора и, соответственно, рост амплитуды многоквантового ТКП имеют место при действии НА в концентрациях, не оказывающих влияния на квантовый состав ТКП и размер кванта. Впервые установлено, что влияние НА на временной ход вызванной секреции квантов медиатора опосредуется через пресинаптические (З^адренорецепторы. Обнаруженный механизм облегчения нервно-мышечной передачи может играть принципиальную роль в тех ситуациях, когда имеет место значительное снижение исходного квантового состава ПКП: «утомленный» нервно-мышечный препарат, секреция медиатора из регенерирующих аксонов и в синапсах животных, находящихся в состоянии зимней спячки.

Научно-практическая ценность

Полученные данные о существенном вкладе синхронности секреции квантов в формирование амплитудно-временных характеристик многоквантовых ТКП заставляют с большей осторожностью относиться к результатам расчета квантового состава ТКП прямым методом (путем деления средней амплитуды ТКП на среднюю амплитуду миниатюрных ТКП, поскольку изменение синхронности секреции вызывает нелинейность суммации квантов медиатора, формирующих многоквантовый ответ. Тот факт, что НА на пресинаптическом уровне обеспечивает рост ПКП без влияния на количество квантов АХ, освобождающихся в ответ на нервный импульс, дает основание вести направленный поиск лекарственных препаратов с

аналогичным механизмом действия для лечения некоторых форм нервно-мышечных расстройств, связанных с нарушением синтеза медиатора.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физическим и умственным нагрузкам» (Казань, 1996), Итоговых конференциях КИББ РАН (Казань, 1996, 1997), XXXIII Международном Физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997), Симпозиуме «Модуляция синаптической передачи», (Жиф-сюр-Иветт, 1997), Конференции «Физиология сигнальных молекул» (Москва, 1998), V Всероссийской школе «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 1998).

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 117 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 195 источников, из них 143 иностранных авторов. Диссертация содержит 19 рисунков и 4 таблицы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМЕ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ

2.1.1. Квантовая теория синаптической передачи. Спонтанное и вызванное освобождение медиатора В основе представлений о механизме освобождения медиатора из моторных нервных окончаний лежит квантово-везикулярная гипотеза, согласно которой ацетилхолин (АХ) хранится в нервной терминали внутри синаптических везикул (Del Castillo, Katz, 1954; Boyd, Martin, 1965; Kuffler, Yoshikami, 1975; Miledi et al., 1983) и выделяется в синаптическую щель в процессе экзоцитоза в виде отдельных квантованных порций, содержащих около 10000 молекул медиатора (Cecarelly, Hurlbut, 1980; Lupa, 1988). Синаптические везикулы располагаются неравномерно, группируясь у периодически выступающих в аксоплазму утолщений пресинаптической мембраны - активных зон (Hubbard, Kwanbunbumpen, 1968). В покое, в отсутствие нервного импульса, отмечается спонтанное выделение квантов медиатора из терминалей. Вероятность спонтанного выхода каждого кванта АХ мала и не зависит от освобождения любого другого кванта (Fatt, Katz, 1952, Gage, Hubbard, 1966).

Электрический импульс, распространяющийся по нервному волокну, увеличивает вероятность освобождения каждого кванта, что ведет к практически одновременному выходу до 100-300 квантов (у лягушки) (Del Castillo, Katz, 1954; Magazanik et al., 1984). Для процесса вызванной секреции медиатора существенна только создаваемая нервным импульсом

деполяризация терминали, а не ионные потоки, лежащие в основе потенциала действия нерва (Katz, Miledi, 1967).

В соответствии с современными представлениями, высвобождение везикул из терминали аксона осуществляется посредством взаимодействия протеинов мембраны синаптических везикул с протеинами пресинаптической мембраны нервно-мышечного синапса при участии АТФ и определенной концентрации ионов кальция (Sudhof, 1995). Установлено, что эффект Са2+ на нейросекрецию не связан с изменением характеристик пресинаптического потенциала действия (Hubbard, Schmidt, 1963), а является следствием входа Са2+ в нервное окончание (Katz, Miledi, 1968). Согласно везикулярной гипотезе деполяризация нервных терминалей активирует потенциалзависимые Са-каналы, что ведет к локальному увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ (Augustine et al., 1985). Принято, что основной функцией кальциевых каналов является сопряжение электровозбудимости с внутриклеточными процессами (Jessel, Kandel, 1993, Geppert et al 1994; Sudhof, 1995, Burgoyne, Morgan, 1995). Например, участие Ca2+ в секреторных процессах может быть обусловлено активацией актомиозиновых филаментов цитоскелета, мембранной фосфолипазы А2, аденилатциклазы, Са2+/ кальмодулин-зависимых протеинкиназ и ряда других Са2+-связывающих белков. Известно, что связывание Са2+ с кальмодулином индуцирует фосфорилирование ряда белков синаптических везикул. Мембраны синаптических пузырьков характеризуются специфическим набором белков, к которым относятся синапсины - фосфопротеины, фосфорилируемые цАМФ- и Са2+-зависимыми протеинкиназами, синаптофизин-гликопротеин,

пронизывающий мембрану; синаптобревин - негликозилированный белок, находящийся на цитоплазматической поверхности пузырьков; синтаксин,

синаптогамин, синаптопорин и др (Цит. по кн. «Нейрохимия», 1996). Большая роль в сближении синаптического пузырька с активной зоной принадлежит синапсину белку ассоциированному с цитоплазматической поверхностью »/ пузырька. Микроинъекция фосфорилированной формы синапсинов в пресинаптическое окончание гигантского аксона кальмара вызывает увеличение секреции медиатора. Дефосфорилированные формы белка не вызывали аналогичного эффекта (Karlin, 1967; Gordon et al., 1977). Увеличение секреции медиатора происходит также при микроинъекции Са2+/кальмодулина. Существует следующая гипотеза участия синапсинов в экзоцитозе: при низкой концентрации Са2+ в цитоплазме, в отсутствие деполяризации пресинаптического окончания дефосфорилированный синапсин взаимодействует с цитоскелетом, обеспечивая резервирование и иммобилизацию пузырька. Приход нервного импульса ведет к деполяризации пресинаптической мембраны. Ионы Са2+ входят в пресинаптическое окончание, активируя Са2+/кальмодулинкиназы; синапсин I фосфорилируется, что ведет к ослаблению связи между синапсином и пузырьком, а также синапсином и F-актином цитоскелета. Синаптический пузырек движется вдоль микротрубочек к активной зоне. Далее идут реакции, обеспечивающие контакт пузырька с пресинаптической мембраной и его плавление. Механизм соединения мембран регулируется комплексом, состоящим из двух протеинов терминали аксона: синтаксина (SNAP-25) и одного из протеинов синаптической везикулы (вероятнее всего синаптобревина), которые в присутствии АТФ обеспечивают слияние мембран в области активных зон нервного окончания. В заключение происходит активация белка синаптопорина,