Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние асинхронности секреции медатора на амплитудно-временные параменты постсинаптического ответа в нервоно-мышечном синапсе лягушке

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние асинхронности секреции медатора на амплитудно-временные параменты постсинаптического ответа в нервоно-мышечном синапсе лягушке"

На правах рукописи

РГБ ОД

ГАФУРОВОЛЕГШАМИЛЬЕВИЧ 1 8 ЯН9

ВЛИЯНИЕ АСИНХРОННОСТИ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА НА

АМПЛИТУДНО-ВРЕМЕННЫЕ ПАРАМЕТРЫ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОГО ОТВЕТА В НЕРВНО-МЫШЕЧНОМ СИНАПСЕ ЛЯГУШКИ

Специальность 03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 1999

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета.

Научный руководитель:

-доктор медицинских наук профессор А.Л. Зефиров

Официальные оппоненты: -доктор медицинских наук

профессор Е.Е. Никольский - кандидат биологических наук доцент A.M. Еремеев.

Ведущая организация - Московский государственный университет

заседании диссертационного Совета К.113.19.02 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных при Казанском государственном педагогическом университете (420021, Казань, ул. Межлаук, д.1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского Государственного педагогического университета по адресу: Казань, ул. Межлаук, д.1

Автореферат разослан « 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук,

профессор И.Ш. Макалеев

Защита состоится

2000г. в

часов на

ЕМ- Я, о

1 1

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Изучение механизмов . синаптической передачи является одной из фундаментальных проблем современной нейрофизиологии. Передача возбуждения в нервно-мышечном синапсе представляет собой сложный многоэтапный процесс, который начинается с момента деполяризации пресинаптической мембраны распространяющимся потенциалом действия (ПД). Деполяризация нервного окончания (НО) приводит к открыванию потенциалозависимых кальциевых каналов, входу ионов кальция в НО и освобождению квантов медиатора в области активных зон (A3) (Fatt, Katz, 1951; Brown, Shmit, 1966; Каменская, 1972; Глебов, Крыжановский, 1975; Магазаник, 1979; Зефиров, 1984; Зефиров,1995). В результате взаимодействия медиатора с постсинаптической мембраной возникает ток концевой пластинки (ТКП), вызывающий падение напряжения на мембране мышечного волокна и появление потенциала концевой пластинки (ГЖП). При достижении ПКП пороговой величины в мышечном волокне возникает ПД (Fatt, Katz, 1951; Sandow, 1952; Костюк, 1955).

Амплитуда и временные характеристики ТКП и ПКП определяются множеством факторов, одним из которых является асинхронность секреции медиатора. Методом внеклеточного отведения было установлено, что существующая в НО асинхронность секреции медиатора определяется распределением синаптических задержек вызванных одноквантовых сигналов, т.е. дисперсией во времени моментов секреции квантов медиатора в A3 (Katz, Miledi, 1965; Зефиров, 1983; Миненко, Магазаник, 1986; Van der Kloot,1988; Гиниатулин, Хируг, 1993; Bucharaeva et al, 1999). В тоже время асинхронность секреции квантов медиатора в нервно-мышечном синапсе должна определяться и рядом других факторов. Известно, что НО лягушки представляет из себя протяженную и разветвленную структуру, а активные зоны располагаются по ходу НО с некоторым интервалом (Horstmann, Meves, 1959; Couteaux, Pecot-Dechavassine, 1970; Dreyer et al.,1973; Peper et al, 1974: Ko,1981; Зефиров и др., 1986). Следовательно, ПД, который распространяется по НО с определенной скоростью (Katz, Miledi, 1965), активирует A3 не одновременно (Зефиров, Куртасанов, 1993). Кроме этого, скорость ПД уменьшается по ходу НО за счет уменьшения плотности ионных каналов (Зефиров, Гафуров, 1996) и ПД задерживается в узлах ветвления (Зефиров, Куртасанов, 1993). На асинхронность секреции медиатора должен влиять и определенный пространственный профиль секреции медиатора в НО. Было установлено, что уровень вызванной секреции вдоль НО не однороден, а снижается от проксимальных к дистальным отделам (Зефиров, Куртасанов, 1993). Все выше перечисленные факторы должны оказывать большое влияние на асинхронность секреции медиатора и амплитудно-временные параметры ПКП, оценить которое можно при помощи математического моделирования и электрофизиологических подходов.

Большинство проводимых в настоящее время исследований направлены на изучение влияния асинхронности на амплитудно-временные параметры ТКП (Магазаник и др., 1983; Wan der Kloot, 1988; Гиниатуллик, Хируг,1993, Зефиров Гафуров, 1995), в то время как вклад асинхронности в уменьшение амплитуды и затягивание временных характеристик ПКГ1 не оценивался. Предполагается, что

КС цепочка мембраны мышечного волокна приводит к уменьшению влияния асинхронности на амплитудно-временные параметры ГЖП в результате затягивания временного хода постсинаптического ответа.

Таким образом, в настоящее время многие факторы, формирующие асинхронность секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе остаются мало исследованными. Их изучение позволит оценить влияние асинхронности на амплитудно-временные параметры постсинаптического ответа и надежность синаптической передачи, а также определить реальный временной ход вызванной секреции медиатора в синапсе.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось модельная оценка влияния некоторых пресинаптических факторов на асинхронность секреции медиатора и амплитудно-временные параметры постсинаптического ответа, а также экспериментальное определение асинхронности в нервно-мышечном синапсе лягушки с последующей проверкой работоспособности модели.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Разработать математическую модель формирования асинхронности секреции медиатора в НО;

2. Оценить влияние некоторых пресинаптических факторов на асинхронность секреции медиатора и амплитудно-временные параметры ТКП и ГЖП. К этим пресинаптическим факторам можно отнести; длину и разветвленность НО; скорость распространения ПД по НО; задержку ПД в узле ветвления; плотность АЗ; распределение вероятности секреции медиатора в каждой активной зоне, пространственный профиль секреции медиатора в НО.

3. Электрофизиологически оценить реальный временной ход (асинхронность) секреции медиатора в синапсе и провести экспериментальную оценку адекватности модели.

Положения, выносимые на защиту:

1. Временной ход (асинхронность) секреции медиатора и амплитудно-временные характеристики вызванных постсинаптических сигналов в нервно-мышечном соединении лягушки определяются многими пресинапгическими факторами. Протяженность НО, плотность АЗ, конечная скорость распространения ПД, задержка ПД в узлах ветвления и наличие распределения вероятности секреции кванта медиатора в АЗ увеличивают асинхронность, в то время как различная вероятность освобождения по ходу НО и наличие дополнительных ветвлений уменьшают асинхронность.

2. Влияние асинхронности на амплитудно-временные параметры ТКП более выражено чем на аналогичные параметры ПКП.

3. Временной ход секреции медиатора .в НО представляет из себя кривую, временные фронты которой имеют большую длительность, чем временные фронты распределения синаптических задержек одноквантовых вызванных потенциалов, полученных при внеклеточном отведении.

Научная новизна. Впервые разработана модель, позволяющая оценить влияние многих пресинаптических факторов (длина НО, плотность АЗ, скорость распространения ПД по НО, ветвления НО, распределение вероятности секреции медиатора в активной зоне) на асинхронность секреции медиатора и амплитудно-временные параметры ТКП и ПКП в нервно-мышечном синапсе лягушки. Показано, что усложнение НО, происходящее в процессе роста животного и представляющее из себя совокупное изменение многих факторов, приводит к уменьшению асинхронности секреции медиатора. Было установлено, что влияние асинхронности на амплитудно-временные параметры ТКП значительно выше, чем на аналогичные параметры ПКП. Проведена оценка реального временного хода секреции медиатора в НО лягушки.

Научно-практическая ценность. Проведенное исследование имеет фундаментальное теоретическое значение, поскольку позволяет раскрыть механизмы, лежащие в основе освобождения медиатора из НО и регуляции надежности синаптической передачи. Результаты проведенного исследования могут найти применение в теоретической и экспериментальной нейрофизиологии, в исследованиях по изучению синаптических функций и моделированию нейронных сетей.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях: Научная конференция молодых ученых и специалистов., Санкт Петербург, 19-21 сентября 1995; 2 Республиканская конференция молодых ученых и специалистов, Казань, 28 июня -1 июля 1996; XXXIII Международный конгресс физиологических обществ, С. Петербург, 30 июня —5 июля 1997г; 3 Съезд физиологов Сибири и Дальнего востока, Новосибирск, 24 сентября 1997г; Научно-практическая конференция молодых ученых КГМУ, Казань, 19 июня 1997г; 3-я Республиканская конференция молодых ученых и специалистов, Казань, 10-11 октября 1997г; Юбилейная конференция центральной научно-исследовательской лаборатории Казанского государственного медицинского университета, Казань, 26 декабря 1997г; Международный конгресс "Развитие и смерть нейронных систем", Швейцария, 1998г; Конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 27-30 апреля 1998г; Симпозиум и школа-семинар молодых ученых и учителей, Казань, июнь 1998г; 12 Европейский съезд нейрохимического общества, С. Петербург, 1998г; Форум Европейский нейронаук, Берлин, 27 июня-3 июля, 1998г.; XVII Съезд физиологов России, Ростов-на-Дону, 1998г.; 9 международный конгресс Чехословацкого нейрохимического общества, Словакия, Мартин, 6-10 сентября 1998г.; У-ая Всероссийская школа молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии" Казань, 11-12 ноября 1998г.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Математическая модель. Для построения математической модели и оценки асинхронности секреции медиатора мы использовали существующие литературные данные о структуре и функции нервно-мышечного синапса

холоднокровных (Katz, Thesleff, 1957; Sakmann et al., 1980; Neubig et al., 1982; Зефиров, Куртасанов, 1993). В рамках данной абстракции наша модель достаточно хорошо отвечала функциональному строению НО лягушки, и позволила нам оценить вклад ряда параметров в асинхронность секреции медиатора.

Моделирование возникновения электрических ответов на постсинаптической мембране в зависимости от определенной выше асинхронности. секреции медиатора проводилось с тем допущением, что выделение кванта медиатора вызывает появление МТКП и МПКП на постсинаптической мембране (Fatt, Katz, 1952; Liley, 1956). Таким образом, зная степень асинхронности секреции всех квантов медиатора и характер реакции постсинаптической мембраны на один квант медиатора, можно рассчитать общий суммарный ток и потенциал концевой пластинки (Van der Kloot,1988).

Электрофизиологические исследования. Опыты проводили на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы озерных лягушек. Препарат непрерывно перфузировали раствором следующего состава (в ммоль/л): NaCl-115, KCl-2,5, СаС12-1,8, NaHC03-2,4, рН-7,2-7,4, температура - 20° С.

Для блокирования мышечных сокращений использовали метод утомления (Katz, Miledi, 1965; Bartner, Неп-ега,1986; Никольский, 1974). Для этого двигательный нерв раздражали прямоугольными импульсами тока сверхпороговой амплитуды длительностью 0,25 мс с частотой 1 имп/с до полного прекращения потенциалов действия (около 20 мин).

Отведение многоквантовых ПКП и МПКП осуществляли при помощи внутриклеточных стеклянных электродов, заполненных 2 моль/л раствором КС1, с внутренним диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 10-20 МОм. В каждом сигнале анализировали амплитуду, время роста и постоянную спада. Экспериментальные данные регистрации потенциалов отбирались для анализа и обработки, только в том случае, если мембранный потенциал мышечного волокна был не менее 70 мВ, а его дрейф во время эксперимента не превышал 5 мВ.

Вызванные и спонтанные сигналы, регистрируемые микроэлектродом усиливались с помощью усилителя постоянного тока, оцифровывались посредством аналого-цифрового преобразователя. Зарегистрированные ПКП и МПКП усреднялись с помощью пакета программ Microsoft Excel по 10 и 20 сигналов соответственно.

Квантовый состав (количество квантов медиатора, освобождающихся в ответ на возбуждение двигательного нерва) рассчитывался двумя способами: 1) из отношения амплитуд ПКП и МПКП и 2) из отношения площадей ПКП и МПКП (Van der Kloot,1988).

В нескольких экспериментах для анализа распределения синаптических задержек производили внеклеточную регистрацию 100-300 одноквантовых ТКП, при ритмическом раздражении с частотой 1 имп/с. В каждой реализации синаптическую задержку определяли, как интервал времени между пиком отрицательной фазы ответа пресинаптического НО и началом одноквантового ТКП (Katz, Miledi, 1965).

• i 5

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Построение модели.

В рамках модели (рис.1.А) НО было представлено в виде, линейной структуры, по ходу которой через одинаковые интервалы располагаются A3. Каждая A3 в ответ на распространяющийся ПД способна освободить квант медиатора с вероятностью, соответствующей расположению A3 в НО. В нашей модели эта вероятность задавалась пространственным профилем распределения вероятности (ПРВ). При этом количество квантов медиатора, освобождаемых в ответ на нервный импульс равнялось 10% от максимально возможного (Banner, Herrera, 1986). Каждая A3 освобождает квант медиатора не мгновенно, а с определенным распределением вероятности, названным нами распределением вероятности секреции кванта медиатора в активной зоне (РВС A3). Эта вероятность соответствует распределению синаптических задержек одноквантовых вызванных сигналов. Кроме того, в нашей модели мы предположили, что A3 функционируют независимо (Зефиров, Столов, 1982; Banner, Herrera, 1986; Dudel et al., 1993).

Рис. 1. Модель нервно - мышечного синапса лягушки и последовательность расчета ТКП и ПКП в .модели.

А) Модель: НО - нервное окончание, АЗ- активная зона, ПД- потенциал действия, стрелкой показано направление распространения потенциала действия. Б) Эквивалентная электрическая схема постсинаптической мембраны: 1(0 миниатюрный ТКП, 110) - миниатюрный ПКП, g(í) ионная проводимость, Е -мембранный потенциал, С и Я -емкость и сопротивление постсинаптической мембраны. В) Рассчитываемые функции модели. РВС АЗ - распределение вероятности секреции кванта медиатора в активной зоне, РВС НО - распределение вероятности секреции квантов медиатора в НО, \ТГКП - миниатюрный ток концевой /ыастинки, МПКП - миниатюрный потенциал концевой пластинки, ТКП - ток концевой пластинки и ПКП - потенциал концевой пластинки.

Потенциал действия, распространяясь по НО со скоростью 0,3м/с, которая уменьшалась в два раза к концу терминали (КаГг, МНесН, 1965;Зефиров, Куртасанов, 1993), последовательно активирует АЗ. Было принято, что каждый квант медиатора вызывает появление на постсинаптической мембране одного МТКП с определенными амплитудно-временными параметрами: время

б

достижения максимума амплитуды -0,3мс; время роста от 10 до 90 % максимальной амплитуды (в дальнейшем - время роста) -0,12мс; постоянная времени спада амплитуды сигнала, т.е. время, за которое амплитуда сигнала уменьшается в е раз (в дальнейшем - постоянная спада) -1мс (Barrett, Stevens, 1972; Baldo et al, 1986; Зефиров, Гафуров, 1995; Зефиров, Гафуров,1997).

Для описания временного хода МТКП, возникающего на постсинаптической мембране в ответ на выделившийся квант медиатора, в нашей модели была предложена функция следующего вида:

ад = '

<Л kl J + ¿ k2 ;

где Z - константа нормирования, а - константа, определяющая положение пика, kl - константа роста и к2 - константа спада.

Аналогичной по форме функцией представлялось РВС A3 (рис.1.В), с тем отличием, что РВС A3 нормировалось и приводилось к ПРВ перемножением РВС A3 на значение ПРВ, соответствующее конкретному положению A3 в НО. В свою очередь ПРВ описывалось функцией:

f(x) = Z • (Z - х) • (а * L + х) • к,

где Z - константа нормирования, а - константа, определяющая положение пика, L - длина терминалы и к - константа, определяющая квантовый состав постсинаптического сигнала. ПРВ было представлено кривой, нарастающей до максимального значения на 1/3 длины терминали, и спадающей до нуля к ее концу. Такое распределение соответствует изменениям вызванного освобождения медиатора по ходу НО, полученным в электрофизиологических опытах (Зефиров, Куртасанов, 1993). Таким образом, квантовый состав равнялся интегралу ПРВ. Для дальнейших расчетов ПРВ трансформировалось из пространственной зависимости во временную с помошью замены переменных:

х = v(t) • î

>

где - скорость распространения ПД по НО.

Для получения распределения вероятности секреции квантов медиатора в нервном окончании (РВС НО) суммировали РВС A3 по всему НО. Данная суммация проводилась с учетом времени активации A3 распространяющимся ПД (рис.1.А):

W(i . dt) = ¿ V((i - j) . dt), 1-0

где W- искомое распределение, V- распределение вероятности секреции кванта медиатора в каждой активной зоне, dt- интервал времени между активациями соседних активных зон, определяемый скоростью распространяющегося ПД.

Модельный ТКП получали из суммы пошагового произведения РВСНО с МТКП (рис.1.В) :

E(i.dt) =¿l(j.dt).W((i-j).dt)

, или

Е (t) = I 1(0 . W (t - г) . d г.

где Е- ТКП, I- миниатюрный ТКП. Как видно, ТКП получается из свертки РВСНО с МТКП.

Расчет МПКП, исходя из МТКП (рис. 1.В) осуществляли с помощью дифференциального уравнения, описывающего зависимость изменения во времени потенциала и тока в эквивалентной электрической схеме постсинаптической мембраны (рис.1.Б).

К сд

где и 0)- функция, описывающая миниатюрный ПКП в зависимости от времени, постоянные Я и С- сопротивление и емкость постсинаптической мембраны. Временные характеристики МПКП целиком зависят от величины произведения сопротивления и емкости постсинаптической мембраны (постоянная КС- цепочки). Этот параметр подбирался таким образом, чтобы временные характеристики рассчитанного МПКП соответствовали значениям реальных сигналов в электрофизиологических экспериментах (Stefaш, 51етЬасИ, 1969; Еес1ого\' е1 а1., 1982).

Расчеты показали, что наиболее адекватные, соответствующие литературным данным, временные параметры МПКП (т.е. время достижения максимума 0,6-1,5 мс и постоянная спада 2-4 мс) наблюдались при значениях 11С в пределах от 1 до 2,5 мс. Все результаты, представленные ниже, получены при значении ЯС=1 мс. В дальнейшем, используя процедуру свертки МПКП и РВСНО (см. расчет ТКП), получали модельный ПКП (рис.1.В).

В модельных ТКП и ПКП определяли амплитуду (в условных единицах), время достижения максимума, время роста и постоянную спада. Аналогичным образом обозначали амплитудно-временные параметры задаваемых и рассчитываемых функций.

Амплитудно-временные характеристики рассчитанных в рамках нашей модели ТКП и ПКП сравнивали в процентном отношении с параметрами ТКП и ПКП, полученных при синхронном (одномоментном) освобождении квантов. Таким образом, асинхронность освобождения медиатора оценивалась по изменению амплитудно-временных параметров рассчитываемых ТКП и ПКП. В данном случае главным показателем асинхронности освобождения медиатора в синапсе являлось "потеря" амплитуды и затягивание переднего фронта ТКП по сравнению с одномоментным освобождением медиатора..

Влияние пресинаптических факторов на амплитудно-временные параметры постсинаптического ответа.

Базовая модель. В первую очередь были проведены эксперименты для оценки асинхронности освобождения медиатора и влияния ее на амплитудно-временные параметры постсинаптических ответов с использованием базовой модели НО. Базовая модель представляла из себя НО, состоящие из 100 активных зон, расположенных линейно с интервалом 1 мкм. Параметры РВС АЗ составляли - время роста 0,09мс и постоянная спада 0,24мс. Из модельных экспериментов видно (рис.1.В), что учет последовательной активации АЗ приводит к трансформации распределения вероятности секреции: происходит сдвиг моды распределения вправо и увеличение времени роста от 0,09 до 0,24мс.

S '

Постоянная спада при этом не меняется (0,24мс). Расчет ТКП по базовой модели показал, что по сравнению с ТКП, полученным при синхронном выделении квантов медиатора, амплитуда ТКП падает до 71% (т. е. теряется 29% амплитуды ТКП по сравнению с синхронным выделением квантов), время роста увеличивается до 325% (от 0,12 до 0,39мс), а постоянная спада до 110% (от 1 до 1,1 мс). В то время, как амплитуда ПКП падает всего до 96% (т.е. теряется только 4%), а время роста увеличивается до 138% (от 0,58 до 0,8мс), постоянная спада не изменяется (2,14мс).

Длина НО. Увеличение длины НО от 50 до 400 мкм приводит к монотонному уменьшению относительной амплитуды ТКП до 57%, по сравнению с ТКП, полученным при синхронном выделении квантов и резкому увеличению времени роста ТКП до 833% (от 0,12 до 1 мс) без изменения постоянной спада. Относительная амплитуда ПКП при этом уменьшалась всего на 9% (до 91%), а время роста увеличивалось до 198% (от 0,58 до 1,15 мс). Постоянная спада ПКП не менялась.

Скорость распространения ПД. Увеличение скорости ПД от 0,1 до 0,3 м/с приводило к увеличению относительной амплитуды ТКП от 62 до 71%, а ПКП от 93 до 96%. Кроме того, было отмечено укорочение переднего фронта ТКП и ПКП: время роста ТКП уменьшалось с 633 до 323%, а ПКП - с 172 до 134%. Постоянная спада ТКП и ПКП при этом не изменялась. Увеличение скорости проведения потенциала действия от 0, 3 до 0, 5 м/с практически не влияло на амплитудно-временные параметры ТКП и ПКП.

Поскольку скорость проведения потенциала действия зависит от диаметра терминали и плотности натриевых каналов (Зефиров, Гафуров, 1996), можно предположить, что максимальный вклад этого фактора имеет место в дистальных участках НО, где скорость ПД падает из-за уменьшения диаметра терминали и плотности натриевых каналов (Зефиров, Халилов,1985, Зефиров и др., 1986). В то же время узлы ветвления НО также приводят к увеличению асинхронности, что является следствием замедления распространения возбуждения во время заряда емкости мембраны узла (Зефиров , Куртасанов, 1993).

Плотность A3. Уменьшение плотности A3, т.е. увеличение расстояния между ними приводило к аналогичным изменениям, что и удлинение терминали и уменьшение скорости распространения ПД. Увеличение расстояния между активными зонами от 0,6 до 3,0 мкм приводило к потере 9% амплитуды ТКП.

Форма РВС A3. Для изучения влияния формы РВС A3 на асинхронность производилось изменение временных параметров РВС. Из литературных данных известно, что распределение РВС A3 описывается кривой, восходящая часть которой имеет s- образную форму, а нисходящая часть представляет собой экспоненту (Barret, Stevens,1972; Dudel,1986; Van der Kloot,1988; Van der Kloot, 1994). Время достижения максимума этой кривой лежит в пределах 0,15-0,25 мс, время роста - 0,09- 0,.15мс, а постоянная спада составляет 0,2-0,3 мс (при 20°С). Именно такие параметры были заложены нами в базовую модель. Изменения РВС A3 осуществляли двумя способами: 1) варьированием времени роста и 2) времени спада. При этом максимальная амплитуда распределения уменьшалась или увеличивалась, так как РВС A3 нормировалось. Варьирование времени

роста не приводило к существенными изменениям амплитудно-временных параметров ТКП и ПКП. Так, например, изменение времени роста распределения вероятности от 0,04 до 0,19 мс приводило к потере 1,2% амплитуды ТКП и 0,5% амплитуды ПКП, время роста ТКП и ПКП увеличивалось на 65 и 25% соответственно. Затягивание заднего фронта распределения вызывало очень сильное снижение относительной амплитуды и увеличение времени роста ТКП, а также увеличение постоянной спада ТКП. Так, при увеличении постоянной спада распределения РВС A3 от 0,09 до 0,5мс, относительная амплитуда ТКП падала от 84,2 до 56,5%, время роста увеличивалось от 260 до 414% (0,5 мс), а постоянная спада от 105 до 132% (1,32мс). Амплитудно-временные параметры ПКП претерпевали менее значительные изменения: амплитуда уменьшалась от 99,1 до 87,8%, время роста увеличивалось от 114 до 163% (0,95мс), а постоянная спада от 101 до 103% (2,22мс).

Как известно, РВС A3 определяется изменениями концентрации ионов Са2+ у активной зоны при возбуждении НО (Зефиров,1983; Van der Kloot,1994). Поэтому факторы и воздействия, затягивающие временной ход входящего кальциевого тока и нарушающие процесс захвата и утилизации ионов Са2+ из аксоплазмы НО, должны увеличивать асинхронность.

Ветвление НО. Для изучения влияния роста и ветвления НО на асинхронность секреции медиатора и амплитудно-временные параметры постсинаптических ответов были построены четыре модели разветвленности НО. Оценивалось влияние увеличения суммарной длины НО в моделях, состоящих из одной, двух, трех и четырех веточек. В перечисленных моделях вторичная веточка брала свое начало примерно на одной трети терминали и была короче первичной, аналогичное соответствие выдерживалось и при построении последующих ветвлений. При увеличении суммарной длины НО длина вторичных веточек изменялась пропорционально удлинению первичной.

Оказалось, что при увеличении суммарной длины в модели с одной веточкой на 480 мкм происходило уменьшение относительной амплитуда ТКП от 12,6% до 37,6% (на 35%) (рис.2), относительная амплитуда ПКП при этом падала от 96,6% до 73,1% (рис.2). При увеличении на такую же величину суммарной длины НО в модели с четырьмя веточками относительная амплитуда ТКП падала от 62,2 до 55,5%, при этом относительная амплитуда ПКП уменьшалась от 95,3 до 85,2%.

Таким образом, наличие нескольких параллельных терминалей в составе одного НО приводит как к увеличению квантового состава постсинаптического сигнала, так и к уменьшению асинхронности, по сравнению с НО, имеющим одну терминалы Это подтверждается двумя нашими наблюдениями. Во-первых, увеличение суммарной длины НО приблизительно на одну и ту же величину (около 450 мкм, рис.2) в синапсах с 1,2,3, и 4-мя терминалями ведет к "потере" амплитуды ТКП на 35, 23, 16 и 10%, соответственно. Оказалось, что в синапсах с одинаковой суммарной длиной НО (500 мкм, указано на рис.2 вертикальной сплошной линией) относительная амплитуда ТКП для терминалей, состоящих из одной, двух, трех и четырех веточек составила 38,1, 50,8, 57,9 и 61,1% соответственно. В то же время в моделях с большим количеством веточек

наблюдаются более короткие временные фронты. При одинаковой суммарной длине НО (500 мкм) время роста ТКП в синапсах с 1-4 терминалями составило 1,16, 0,76, 0,6, 0,53мс, а постоянная спада 1,94, 1,6, 1,45, 1,38мс, соответственно.

Рис2. Зависимость относительной амплитуды ТКП и ПКП от суммарной длины НО с различным количеством терминалей.

По оси абсцисс: сверху- квантовый состав ТКП (ПКП), снизу- суммарная длина НО (в мкм); по оси ординат; амплитуда ТКП (темные символы) и амплитуда ПКП (светлые символы) в % к амплитуде ТКП и ПКП, полученной при одномоментной суммации МТКП и МПКП, соответственно. Цифрами обозначено количество терминалей в НО.

Экспериментальная о1{енка реального временного хода секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки.

Амплитудно-временной анализ ПКП и МПКП. Для оценки временного хода секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки регистрировали внутриклеточные отведения спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки (рис.3. А). Анализ проведенных экспериментов показал, что амплитуда ПКП в наших условиях составляла 36,2 ±4,7 мВ, время роста -1,16±0,08мс, а постоянная спада - 3,45±0,16 мс (п=9). Для МПКП эти параметры, соответственно, равнялись - 0,17±0,01мВ, 0,73±0,05мс, и 3,01 ± 0,09 мс (п=9). Обращает на себя внимание, что ПКП имело более длительные временные параметры, чем МПКП - время роста ПКП составляло 162 ± 12,2%, а постоянная спада - 116 ± 5,1% по отношению к аналогичным параметрам МПКП. Эти различия могут свидетельствовать о наличии асинхронности освобождения медиатора при формировании ПКП. Достоверной корреляционной зависимости амплитуды ПКП от времени роста и постоянной времени спада ПКП в проведенных экспериментах обнаружено не было (Р >0,1).

Квантовый состав ПКП. Классическим способом определения количества квантов медиатора, освобождающихся из НО в ответ на сверхпороговое

. . u

раздражение является отношение амплитуд Г1КП и МПКП (Van der Kloot, Molgo,1994). При этом предполагается, что все кванты медиатора освобождаются из НО одномоментно, т.е. асинхронность отсутствует. В наших экспериментах (п=9) квантовый состав ПКП, определенный по этому методу варьировал от 116 до 427 квантов, составляя в среднем 232 ± 37 квантов.

Другим способом определения квантового состава является отношение площадей ПКГ1 и МПКП. Это отношение показывает количество квантов медиатора, формирующих ПКП с учетом асинхронности секреции во времени. Оказалось, что в этом случае квантовый состав колебался от 124 до 458 квантов (в среднем 255 ±40 квантов). Во всех экспериментах квантовый состав ПКП, определенный по второму методу был достоверно больше (р<0,002, п=9), чем по первому. Если взять этот квантовый состав за 100%, то "потери" амплитуды ПКП за счет асинхронности составили примерно 9%.

Распределение синаптических задержек. В 5 экспериментах исследовали распределение синаптических задержек одноквантовых ПКП при внеклеточном отведении (см. методику). Синаптические задержки вариировали в диапазоне 1,2-2,0 мс, а их распределение имело вид кривой с S-образным подъемом (время роста 0,09= 0,005 мс) и экспоненциальным спадом с постоянной времени 0,25 ± 0,06 мс.

Временной ход секреции медиатора в НО (РВС НО). Используя зарегистрированные ПКП, МПКП (рис.3 .А) определяли временной ход секреции медиатора (рис.З.Г.) во время ПКП, используя метод подбора. В этом случае РВС НО описывали следящей функцией:

ад-

(а-0 ¡W| f

е -ь е 2/1 + е

("ь-л

k3 J

где Ъ - константа нормирования, а и Ь - константы, определяющие положение пика функции (г), к1 и кЗ- константы роста и к2 - константа спада.

С помощью процедуры свертки РВС НО и усредненных экспериментальных МПКП получали ПКП. Изменяя параметры РВС НО добивались того, чтобы полученный из свертки ПКП был идентичен усредненному экспериментальному ПКП. Данные расчеты производились с помощью пакета программ Ма11к^ 7. ...

Таким образом было показано, что распределение имеет вид кривой с Б-образным ростом (время роста 0,18±0,02мс) и экспоненциальным спадом (постоянная спада 0,55±0,03мс (п=9)). На рис.З.Г представлено распределение вероятности секреции при квантовом составе ПКП, равном 138 квантам, рассчитанном по способу Б. Параметры распределения составили: время роста -0,23мс, постоянная спада -0,47мс.

Оценка временного хода секреции медиатора во время многоквантового ПКП показала (рисЗ.Г), что он резко отличается от распределения синаптических задержек одноквантовых вызванных ПКП (рис.3 .Б,В) и характеризуется более длительными передним и задним фронтами. Это связано с тем, что РВС НО зависит от РВС АЗ и временной последовательности срабатывания активных зон всего НО при их активации распространяющимся потенциалом действия (Зефиров, Гафуров,1995; Зефиров, Гафуров,!997).

Пространственные характеристики модельного НО. Адекватносгь модели. Зная квантовый состав ГЖП, экспериментальные распределения временного хода секреции медиатора в НО и синаптических задержек, с использованием построенной нами модели подбирали пространственные характеристики модельного НО (рис.3.Д). В этом случае добивались того, чтобы при определенной разветвленности и протяженности модельного НО, модельное РВС НО соответствовало экспериментальному. На рис.3.Г представлено (а) экспериментальное распределение и (б) распределение, полученное в модели НО, схематично изображенного на рис З.Д. Видно, что экспериментальное и модельное распределения полностью совпали. Параметры экспериментального распределения: квантовый состав ГЖП - 188 квантов, время роста - 0,24, постоянная спада - 0,59, а модельного - 190 квантов, 0,23мс, 0,58мс, соответственно. Пространственные характеристики модельного НО при этом составили: суммарная длина НО- 950мкм, количество веточек - 8, две веточки имеют длину по 350мкм, две- по 70мкм, две 40мкм, две - по 15мкм. Для разных экспериментов суммарные длины модельных НО варьировали от 600 до 2200мкм, а количество веточек от 4 до 10. Естественно, данные параметры являются приближенными. Полученные нами данные позволяют считать , что созданная нами модель функционирования синапса является адекватной.

A i,oi!

мпкп

пкп

ГОГ

MC

- экспериментальное

- теооетическое

MC

Рис.3. Экспериментальное и теоретическое распределения вероятности секреции медиатора во время ПКП

A) Усредненные ПКП и МПКП (наложены и нормированы) при внутриклеточном отведении в отдельном эксперименте. Внеклеточная кот^нтрация ионов Са -1,8 ммоль/л. Б) Одноквантовые TKJI (20 раздражений, наложены друг на друга) при внеклеточном отведении. Внеклеточные концентрации ионов Са и Mg - 0,4 и 4,0 ммоль/л, соответственно. Стрелкой показаны ответы НО, двумя стрелками - ТКП.

B) Гистограмма распределения синаптических задержек одноквантовых ТКП в эксперименте, представленном на Б (за точку отсчета взята минимальная синоптическая задержка) Г) Экспериментальное (стоишая линия - а) и теоретическое (пунктирная линия - б) распределения РВС НО. Д) - схематическое изображение модельного НО соответствующего экспериментальному распределению, (pud.Г, линия б). РВС A3 взято из рис. З.В. Подробнее в тексте.

В отличие от литературных данных (Van der Kloot,l988), временной ход вызванной секреции медиатора во время многоквантового ПКП, определенный в

наших экспериментах, несколько короче (время роста 0,12-0,24мс, постоянная спада 0,45- 0,68мс). Так, Van der Kloot (1988) в своих исследованиях представил данные по времени роста и постоянной спада РВС НО, рассчитанные с помощью Фурье преобразования ТКП, которые составили 0,4-0,8 мс и 0,6-1,5 мс, соответственно. Однако эти исследования были проведены при пониженной температуре и/или сниженной концентрации ионов Са2+, что должно было значительно увеличить асинхронность (Barret, Stevens, 1972). В этих исследованиях также предполагалось, что МТКП растет мгновенно, что не соответствует действительности и приводит к затягиванию определяемого временного хода секреции медиатора. Кроме того, суммирование МТКП с такой острой вершиной приводит к увеличению потерь в ТКП и, следовательно, к большим ошибкам при оценке квантового состава. С другой стороны, при использовании реальных сигналов невозможно применить Фурье преобразование. Поэтому мы и использовали метод подбора для сравнения рассчитанных и регистрируемых в опыте сигналов. Мы считаем, что полученные в нашем моделировании параметры РВС НО отражают реальный временной ход вызванной секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на основе моделирования можно предположить, что к увеличению асинхронности ведет увеличение длины НО, уменьшение скорости проведения пресинаптического ПД и задержка ПД в узлах ветвления. Эти факторы ведут к более поздней активации дистальных участков НО. Увеличение расстояния между активными зонами также приводит к увеличению асинхронности.

В то же время пространственная неоднородность вероятности секреции в различных участках НО приводит к синхронизации секреции за счет того, что проксимальный и центральный участки НО, имеют большую вероятность освобождения (Зефиров, 1983; Зефиров, Кургасанов, 1993). Достаточно значимым фактором синхронизации является ветвление. Наличие нескольких параллельных терминале?! в составе одного НО приводит, наряду с увеличением квантового состава постсинаптического сигнала, к уменьшению асинхронности, по сравнению с НО, имеющим одну терминалы

Асинхронность секреции медиатора в НО лягушки оказывает различное влияние на потери амплитуды и временной ход ТКП и ПКП. Представленные данные свидетельствуют, что амплитудно-временные параметры ТКП более чувствительны к изменениям асинхронности чем аналогичные параметры ПКП. В основном это связано с пассивными электрическими характеристиками мышечного волокна (сопротивление и емкость) (Stefani, Steinbach, 1969).

Определение реального временного хода секреции медиатора показало, что распределение вероятности секреции медиатора в НО более длительное, чем распределение синаптических задержек, полученных при внеклеточной регистрации одноквантовых вызванных сигналов, что говорит об асинхронности секреции медиатора, связанной со структурными особенностями НО.

ВЫВОДЫ

1. Создана модель оценки асинхронности освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе, учитывающая такие характеристики НО как протяженность, скорость распространения ПД по НО, плотность АЗ, изменение вероятности секреции квантов медиатора по ходу НО и временной ход секреции медиатора в АЗ.

2. Показано, что асинхронность секреции медиатора оказывает существенное влияние на амплитуду и передний фронт ТКП и ПКП. В модели НО длиной ЮОмкм амплитуда ТКП и ПКП за счет асинхронности секреции медиатора уменьшается на 29% и 4%, соответственно. Время роста ТКП и ПКП увеличивается до 325% и 138%, соответственно.

3. К увеличению асинхронности секреции медиатора приводит удлинение НО, уменьшение скорости распространения ПД по НО, задержка ПД в узлах ветвлений, увеличение расстояния между АЗ и удлинение временного хода секреции кванта медиатора в АЗ.

4. К уменьшению асинхронности приводит образование вторичных ветвлений и гетерогенность секреции квантов медиатора в НО.

5. Асинхронность более значительно сказывается на амплитудно-временные параметры ТКП, чем на амплитудно-временные параметры ПКП, что связано с более длительными временными фронтами МПКП за счет сопротивления и емкости мембраны мышечного волокна.

6. Экспериментально показано, что длительность времени роста и постоянной спада многоквантовых ПКП больше, чем время роста и постоянная спада МПКП, что указывает на наличие асинхронности секреции медиатора в НО.

7. Квантовый состав ПКП, рассчитанный из отношения амплитуд ПКП и МПКП, меньше, чем рассчитанный из отношения площадей сигналов. Эта разница позволяет определить реальные потери в амплитуде ПКП, обусловленные наличием асинхронности секреции медиатора.

8. Метод подбора позволяет на основе амплитудно-временных параметров ПКП и МПКП, а также распределения синаптических задержек определить реальный временной ход секреции квантов медиатора в НО и реконструировать протяженность и разветвленность НО.

9. Временной ход секреции медиатора в НО представляет из себя кривую с Б-образным подъемом и экспоненциальным спадом, время роста от 10 до 90% амплитуды- 0,18±0,02мс, время роста до максимума- 0,41±0,05мс и постоянная спада - 0,55 ± 0,03мс.

10.Временной ход синаптических задержек, определенных при внеклеточном отведении одноквантовых ТКП, соответствующий временному ходу секреции медиатора в АЗ, примерно в 2 раза короче временного хода секреции медиатора в НО, определенного при внутриклеточном отведении многоквантовых ПКП.

, , и

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

I.Зефиров А.Л., Гафуров О.Ш. Анализ пре- и постсинапгических факторов влияющих на асинхронность секреции медиатора и амплитудно-временные параметры постсинаптического ответа в нервно- мышечном синапсе, статья, Нейрофизиология, 1995, N3, с. 163-170.

2.Гафуров O.LII. Факторы определяющие ток концевой пластинки, тезисы докладов, Научная конференция молодых ученых и специалистов, Санкт Петербург, 19-21 сентября 1995, с 44.

3.Гафуров О.Ш. Гафуров Б.Ш Анализ пре- и постсинаптических факторов влияющих на амгоппудно-временные параметры тока и потенциала концевой пластинки, тезисы докладов, 2 Республиканская научная конференция молодых ученых и специалистов, Казань, 28 июня -1 июля 1996, т.1, сЗО.

4.Зефиров А.Л., Гафуров О.Ш. Влияние асинхронности секреции медиатора на амплитудно-временные параметры вызванного постсинаптического тока и потенциала в нервно- мышечном синапсе, статья, Физиологический ж. им. Сеченова.т.83, N9, 1997, с.22-31.

5.Gafurov O.Sh., Zefirov A.L. Numerical estimate of influence of synaptic factors on the endplate current, Abstr, 33 International congress of physiological sciences, SPB, june30-julyS, 1997, p076.04.

6.Гафуров О.Ш., Зефиров А.Л., Асинхронность секреции медиатора в нервно-мышечном соединении и надежность синаитической передачи, тезисы докладов, 3 Съезд физиологов Сибири и дальнего востока, Новосибирск, 24 сентября 1997г, с.81.

7.Гафуров О.Ш., Зефиров А.Л., Модельное исследование влияния асинхронности секреции медиатора в нервно- мышечном соединении на надежность синаптической передачи, тезисы докладов, Научно-практическая конференция молодых ученых КГМУ, Казань, 19 июня 1997г, с. 52-53.

8.Гафуров О.Ш., Зефиров А.Л., Влияние роста и усложнения нервного окончания на ток и потенциал концевой пластинки в нервно- мышечном синапсе холоднокровных, тезисы докладов. 3-я Республиканская конференция молодых ученых и специалистов, 1£эзань, 10-11 октября 1997г, С. 23.

9.Гафуров О.Ш., 'Гелина Э.Н., Зефиров А.Л., Применение математического моделирования для оценки влияния роста и усложнения нервного окончания на надежность синаптической передачи, тезисы докладов, Юбилейная конференция центральной научно-исследовательской лаборатории Казанского государственного медицинского университета, Казань, 26 декабря 1997г, с.ЗЗ.

10.Zefirov A.L., Gafurov O.Sh. Growth and complication of nerve ending modify robust of synaptic transmission in neuromuscular junction, Abstr., International Congress on "Growth and Death in the Nervous System", 1998, p. 34.

II.Гафуров О.Ш., Гафуров Б.Ш., Зефиров А.Л. Моделирование возникновения вызванного ответа в нервно-мышечном синапсе, тезисы докладов, Симпозиум и школа-семинар молодых ученых и учителей, июнь 1998г., стр.30.

12.Зефиров А.Л., Гафуров О.Ш, Телина Э.Н., Оценка влияния роста и усложнения двигательных нервных окончаний на надежность синаптической передачи, тезисы докладов, Симпозиум и школа-семинар молодых ученых и учителей, июнь 1998г., стр.44.

13,O.Sh. Gafurov, A.L. Zefirov. Correlation between the complication and asynchrony in the model of a frog neuromuscular junction, Abstr, 12 General meeting of European society for neurochemistry, Saint-Petersburg, j\ilel9-24,1998, J. Neurochemistry, 1998, v. 71, suppl. 1.P.S17C

16 'г •

lAZefirov, O.Sh. Gafurov Model of growth and branching of a frog neuromuscular junction. Abstr., Forum of European neuroscience, Berlin June 27- July 1998, P 62.19.

15.B.Sh. Gafurov, D.M. Shakiryanova, A.L.Zefirov, O.Sh. Gafurov, Simulation of postsynaptic electrical activity of amphibian neuromuscular junction, Abstr., Forum of European neuroscience, Berlin, June 27- July 1, 1998, P 62.20.

16.3ефиров A.Jl., Гафуров О.Ш., Гафуров Б.Ш. Моделирование синаптической передачи в процессе роста и усложнения двигательных нервных окончаний, тезисы докладов, XVII Съезда физиологов России, Ростов на Дону, 1998 , стр. 223.

17.Gafurov O.Sh., Zefirov A.L Changes of both the transmitter secretion asynchronism in a neuro-muscular synapse caused and time-course of evoked postsynaptic signals during growth and branching of the frog nerves ending, Abstr., 9th International congress of the Czech and Slovak neurochemical society, Martin, Slovakia, sept 6-10,1998.

18.Гафуров О.Ш., Гафуров Б.Ш., Зефиров A.JI. Влияние усложнения нервных окончаний на синаптическую передачу, тезисы докладов, V-я Всеросийская школа молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии" 11-12 ноября 1998г, стр. 37.

19.Gafurov O.Sh., Zefirov A.L. Model of time - cours of evoked postsynaptic signals during and branching of the frog nerves ending, 17th ISN/13th ESN meeting, Berlin, J. Neurochem., Vol.73,Suppl.,1999, pS126A.

20.3ефиров A.JI., Гафуров O.ILI. Изменения асинхронности освобождения медиатора и амплитудно-временных параметров вызванных постсинаптичесих сигналов в процессе роста и ветвления нервного окончания лягушки, статья, Биофизика ж., в печати.

21.Зефиров A.JI., Гафуров О.Ш. Временной ход квантовой секреции медиатора во время потенциала концевой пластипки в нервно-мышечном синапсе, статья, Физиологический ж. им. Сеченова, в печати.