Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Амплитудно-временные характеристики миниатюрных токов концевой пластинки при пластической перестройке нервно-мышечного синапса и после денервации

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Амплитудно-временные характеристики миниатюрных токов концевой пластинки при пластической перестройке нервно-мышечного синапса и после денервации"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ЗЕМСКОВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВ! 1А

АМПЛИТУДНО-В1 'ЕМ Е ИНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИНИАТЮРНЫХ 'ГОКОВ КОН1ШООИ ПЛАСТИНКИ ПРИ ПЛАСТИЧЕСКОЙ ПЕРЕСТРОЙКЕ НЕРВНО-МЫШЕЧНОГО СИНЛПСА и ПОСЛЕ ДЕНЕРНАИИИ

03. 00. 13 — физиология человека к животных

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1992

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Казанского государственного медицинского института п м. С. В. Ку ра 111 ов о

Научный руководитель: доктор медицинских наук

профессор Зефиров А.Л.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Каталымов Л.Л.

доктор медицинских наук профессор Полетаев Г.И.

Ведущая организация - Институт эволюционной физиологии

и биохимии им. И.М.Сеченова

Зашита состоится " э1Ъ " ¡¡О-^Лли^ 1992 г.

и часов на заседгнши специализированного сонета

К. 113.19.02 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13- физиология человека и животных при Казанском ордена Трудового Красного Знамени государственном педагогическом институте по адресу: 420021, Казань, ул.М.Межлаука, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного педагогического института по адресу: Казань, ул.Межлаука, д.1.

Автореферат разослан

"Л 3 " ЛЛ^И^иЛ 1992 г.

Ученый секретарь с пен H'.i;Hf3iif «ванного совета, капл.биол.наук, доцент

И.Ш.Макалеев

. ... ВВЕДЕНИЕ

"■" Актуальность темы. Вопросы, касаодиеся пластичности, этого неотъемлемого и универсального свойства нервной системы, никогда не переставали интересовать исследователей, поскольку пластичность нейрональних систем лежит в основе таких основополагающих свойств центральной нервной системы как обучение и память. Этой теме посвящено огромное количество работ, однако клеточные механизмы, лежащие в основе пластичности, все еше изучены недостаточно.

По современным представлениям механизмы пластических перестроек локализованы, главным образом, в синапсах, как центральных, так и периферических. В последнее время в качестве одного из подходов к данной проблеме все чаще стали использовать изучение пластических перестроек периферических синапсов, в частности, нервно-мышечного соединения амфибий.

Представление о том, что нервно-мышечное соединение не является застывшей, статичной структурой, сложилось постепенно, по мере накопления данных о структурной и функциональной неоднородности нервно-мышечного синапса скелетных мышц позвоночных (Зефиров, 1983; Bieser et al., 1984; Anzil el al., 1984; Robílaille, Tremblay, .1987; Wernig, Dorlochter, 1389). В частности, были изучены сезонные и возрастные измененения морфологии и функции синапса холоднокровных (Grinnell, Herrera, 1981; Wernig, Fischer, 1986; Dobretsow el al., 1990), а также выявлены различия между проксимальными и дистальными участками нервной терминали по ряду характеристик, определявших секрецию ацетилхолина (АХ) (Зефиров, 1983; Безгина и др., 1985; Ко, 1985; Tremblay el al., 1989). 'Если о пресинапти-ческих механизмах пластичности принято говорить, как об основном механизме пластических перестроек в синапсе, то свойства постсинаптической мембраны в этом плане почти не изучены.

Необходимо отметить, что одним из подходов к исследовании пластических перестроек (или ремоделирования)является изучение постденервационных изменений свойств нервно-мыиеч-чного синапса. Этой теме посвящено большое количество работ (Birks el al., 1960; Fambrough, 1979; Rieser, Miledi,

1989). Однако большинство исследований проведено на теплокровных животных с использованием, главным образом, ультраструктурных, биохимических и радиоавтографических методов и на поздних сроках денерваиии.

В связи с этим, нам представлялось интересным изучить с помсщьв электрофиэиологических методов (регистрация амплитудно-временных характеристик спонтанных синаптических сигналов) свойства постсинаптической Ыембраны скелетных мышечных волокон I норме и при различных воздействиях, вызывающих ре-моделирование синапса. Ото позволило Сы вскрыть почти не изученные постсинаптические механизмы пластичности.

Цель н задачи исследования. Целью данного исследования

9 ______,__

было изученье развития процессов пластической перестройки кервно-мьшечкого .синапса интернированных и денервированных скелетных мышц с помощью анализа параметров миниатюрных токов концевой пластинки (МТКП).

Для выполнения этой цели были поставлены следующие конкретные ьадачи - произвести анализ амплитуды и длительности миниатюрных токов концевой пластинки : 1) в ишервчрованных мышцах у холоднокровных

а) з различных участках одиночного синапса; б~) ъ синапсах зимних и летних лягушек; в денервированных скелетных мышечных волокнах у холоднокровны« и теплокровных животных; 3) в процессе реиниервааии у теплокровных.

Научная новизна. В работе впервые изучены эмплктудно-времэнже характеристики МТКП при таких воздействиях, которые приводят к пластической перестройке периферического синапса.

Впервые, с помощью комплекс*-чго применения электрофизиологических и электронно-микроскопических методов получены данные о гетерогенности свойств лостсинаптическои мембраны з пределах одного синапса. Показано наличие проксимо-дистально- , го 1радиента не только амплитуды и частоты МТКП, но и времени полуспада МТКП. Эти исследования позволили сделать вывод о' нал;.'-»;;: гракигрла плотности холинорецёпторов СХР), а такяе плотности и глубины постсинаптическпх складок от проксимальны;; к д;:сгальн1л,! участкам одного и того же синапса.

_ з -

ПроЕеден сравнительный анализ спонтанной активности в синапсах у зимних и летних лягушек, что позволило выявить существенные различия свойств постсинаптическсш мембраны ска-летных мышечных волокон амфибий в зависимости от времени года. Было показано, что зимой нервно-мышечный синапс амфибии претерпевает активные процесса ремоделировакил, которые прежде всего проявляются в дистальных участках синапса.

Исследована также динамика изменений параметров МТКП в ходе развития процессов де- и реиннервации у холоднокровных и теплокровных животных. Впервые выявлены четкие злектрофи-зиологические критерии наличия или отсутствия процессов ремодеяирования в каждом отдельном синапсе и, следовательно, в целой мышце. К таким критериям можно отнести увеличение длительности спада МТКП, "расщепление" гистограмм распределения длительностей спонтанных сигналов на несколько классов, указывающее на появление нескольких групп сигналов с разной длительностью, а также увеличение количества сигналов с длительностью, превышающей длительность нормальных сигналов в 310 раз. Проанализированы свойства ионных каналов ХР, появляющихся после денервации.

Положения, выносимые на защиту.

1. В процессе пластической перестройки нервно-мышечного синапса холоднокровных и теплокровных животных происходит изменение амплитудных и временных характеристик МТКП.

• 2. Изменения параметров МТКП в ходе пластической перестройки и после денервации обусловлены следующими постсинапти-ческими механизмами: а) изменением плотности холинорецепто-ров; б) появлением холинорецепторов, ионные каналы которых обладают большим временем открытого состояния и меньшей по-тенциалозависимостыэ.

Научно-практическая ценность. Применение электрофизиологических методов для изучения процессов пластических перестроек синапса позволило выявить наиболее ранние признаки этих процессов в скелетных мышцах позвоночных, а также вскрыть некоторые клеточные механизмы, лежащие в основе пластических перестроек периферического синапса.

В результате проведенных исследований были обнаружены

четкие электрофизиологические критерии наличия пластических перестроек в синапсах холоднокровных и теплокровных животных. Очевидно, что постоянному ремоделированию подвержены не только синапы денервированных мышц, но и интактных мышц. Следовательно, электрофизиологические изменения синаптической активности, сопутствующие пластическим перестройкам, могут быть использованы ь качестве критерия интенсивности пластических преобразований в данной мышце, а также наличия или отсутствия денерьационно- реиннервационньгх процессов, что может быть важно при лечении нервно-мышечных патологий.

Полученные данные позволяют расширить и углубить понятие "пластическая перестройка", кроме того их можно аппроксимировать на аналогичные процессы, происходящие в синапсах ЦНС, что будет способствовать лучшему пониманию таких сложных и малоизученных явлений, как обучение и память.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всесоюзной конференции по нейронаукам, посвященной ЮО-летию со дня рождения академика АН УССР Д.С. Воронцова СКиев, 1986); на ХУ съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Кишинев, 1987); на Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффек-торные клетки" ССуздаль, 1989); на Всесоюзном совещании "Одиночные ионные каналы в биологических мембраных" 'СПущино-на-Оке, 1987); на 1 Международном конгрессе патофизиологов (Москва, 1991); на заседаниях кафедры нормальной физиологии Казанского медицинского института и Татарского отделения Всесоюзного физиологического общества им. И. П. Павлова (Казань, 1991), на заседаниях кафедры физиологии и анатомии Казанского педагогического института.

Реализация результатов исследования. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ. Материалы диссертации включены в лекционный курс по нормальной физиологии для студентов Казанского медицинского института.

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 115 страниц состоит из введения, обзора литературы, глав "Объект и методы исследования", "Результаты исследования и их обсуждение", заключения и выводов. Список цитируемой литературы

включает 130 названий, из них 110 - иностранных авторов. Диссертация содержит 13 рисунков и 5 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты на холоднокровных животных проводили на нервно-мшечном препарате кожно-грудинной мышцы лягушки Капа Е1сИЬипс!а. Часть экспериментов проведена на эи.шгих лягушках с ноября по апрель, а часть - на летних лягушках с июня по август. Животных содержали в террариуме при температуре 4-6° С. Эксперименты на теплокровных животных проводили на нервно-мышечном препарате диафрагмы белых лабораторных мышей.

Нервно-мышечный препарат выделяли и помечали в ванночку из органического стекла с рабочим объемом 2 мл. Все эксперименты выполнены в условиях постоянной перфузии препарата со скоростью 5 МЛАШН.

Для работы с холоднокровным!! животными использовали стандартный раствор Риигера следующего состава Св ммоль/л): №01.-115,0; КС1,-2,5; СаС^-О.З; ИдС12-2,0; КаНС03-2,4. Все эксперименты проводили при температуре 20±Р С; рН раствора поддерживали на уровне 7,2-7,4. Левый полудиафрагмальныя препарат мышей содержали в ванночке с перфуэируемым раство-Кребса для теплокровных животных следующего состава (в ммоль/ л): №0.-136,8; Ка-5,0; ЩС12~ 1,2; 0'аСТ.2-2,0; МаН2Р04-1,0; ИаНС0д-24,0; глюкоза-11,0. До начала опыта раствор в течение 40-50 минут насыщали карбогеном (0^-957., С02-5'0.

В части экспериментов под неглубоким наркозом в стерильных условиях производили денервацию кохно-грудинной мышцы лягушки, а также одностороннюю перерезку или передавливакиэ (для изучения процесса реинкервации) левого диафрагмалыюго нерва у мышей на расстоянии 10 мм.

Биопотенциалы регистрировали внутри- и внеклетсчно, используя обкчнув микроэлектроднув установку СКостск, 1950").

Методика внеклеточного отведения спонтанных сигналов позволила регистрировать МТКП в проксимальных и дистальнш: участках одного синапса, которые идентифицировались яо ферме ьнеклеточно регистрируемого тока действия нервного скончания СЗефиров, Халклов, 1934).

В некоторых экспериментах МТКП отводили в условиях фиксации мембранного потенциала с помощью двухэлектродного метода (Fedorov et al., 1983). Данная методика позволила определить зависимость спада МТКП от потенциала фиксации в диапазоне от -110 до -50 мВ. которая подчиняется экспоненциальному закону и характеризуется параметром Н. Параметр Н -это значение, на которое необходимо изменить мембранный потенциал. чтобы изменить х спада МТКП в е раз. Кроме этого, ь условиях двухэлектродной фиксации мембранного потенциала исследовалась автокорреляционная функция ацетилхоллнового шума, которая позволяла судить od изменениях в работе ионных каналов постсинаптической мембраны, активируемых ацетилхоли-ном.

Электронно-и;;кр5£-копическое исследование структуры различных участков одного и того же синапса у лягушек производили на серийных продольных и поперечных ультратонких срезах, получаемых на ультрамикротоме LtCB-З. Для изучения срезов использовали электронный микроскоп "Tesla BS-500" Исследования проведены в лаборатории "Ультраструктуры нейрона" института биофизики г. Пущино Сэав. - Л-А.- Мошков) совместно с Л.А. Кашаловой и E.H. Безгиной.

При статистической обработке экспериментальных 'данных использовали t,-критерий Стьвдента СПлохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ХОЛОДНОКРОВНЫХ В НОРМЕ.

Анализ амплитудно-временных характеристик МТКП в разных участках отдельного нервно отечного соединения лягушки.

При внеклеточной регистрации МТКП от различных участков одиночного нервно-мышечкого синапса г.ягушек было показано, что МТКП, зарегистрированные от проксимальных участков, имеют более высокую амплитуду и время полуспада Ctnc). Различия в амплитуде и были достоверными СР<0,05, п=25) и составляли, соответственно, 25,2% и 12,17. в среднем, хотя необходимо отметить, что в отдельных экспериментах разница была

- ? -

гораздо более значительной. Гистограммы распределения времени полуспада ОТКП в интактных мышцах обычно были одномодаль-ными и компактными. Однако в ряде синапсов наряду с основной популяцией МТКП, имеющих 1пс в районе 1 мс, наблюдались сигналы с очень большой длительностью, 1пс которых превышало модальное значение в 3-10 раз ' С так называемые "медленные" МТКП. Эти сигналы составляли 1-3% всех регистрируемых МТКП. Исключение таких сигналов из гистограммы распределения 1ПС приводило к увеличению разницы в 1ПС между проксимальными и дистальными участками до 14,0%.

Добавление в перфузируемый раствор сЬтубокурарина С в концентрации Г Ю^г/ыл) приводило к уменьшению амплитуды и 1ПС МТКП. Однако выраженность этого снижения была неодинакова в разных участках:в проксимальных отделах амплитуда падала на 54,2%, а 1по - на 21,8%, тогда как в дистальных - на тогда как в дистальных - на 42,6 и 15,6''. соответственно (Р< 0,05, п= 20). Таким образом, на фоне действия тубокурари-на СТБЮ разница в амплитуде и 1пс МТКП, зарегистрированных от разных участков синапса, исчезала (становилась недостоверной). Выдерживание мышцы в растворе с армином (1"10~\оль/ л) приводило к значительному увеличению амплитуды и длительности сигналов как в проксимальных, так и в дистальных участках. Однако эффект был более выражен в проксимальных участках. .Здесь амплитуда МТКП возрастала на 60,8%, а 1пс - на 303,2%, тогда как в дистальном - всего лишь на 16,27. и 223,0'/. соответственно (Р<0,01, п=16).

Полученный нами феномен укорочения спада МТКП от проксимального к дистальному участкам синапса можно объяснить различием во времени открытого состояния ионных каналов ХР, однако неодинаковый эффект ТБК на длительность МТКП в разных участках синапса позволяет отказаться от этого предположения. Другой причиной различия в амплитуде и длительности МТКП по ходу отдельного синапса может яеляться различие в условиях повторного связывания молекул АХ с ХР (Ка1г, МПесЯ,- 1973; Магазаник, 1979). О том, что повторное связывание молекул АХ с ХР дает вклад в различия амплитуды и Ь 0 МТКП говорит и тот факт, что рассчитанный нами коэффициент корреляции (г) между

амплитудой и I МТКП был положительным в 95V. исследованных проксимальных участках синапса и только в 60% случаев - в дистальных. Известно, что повторному связыванию молекул АХ с ХР способствуют все факторы, препятствующие удалению АХ из сина-птической цели. К ним относятся: повышенная плотность ХР, недостаточная активность АХЭ, удлинение диффузионного пути молекул медиатора СМагазаник, 1979). Полученное нами более выраженное укорачивающее действие ТБК на спад МТКП в проксимальных районах, по сравнению с дистальными, позволяет сделать вывод о более высокой плотности ХР в постсинаптической мембране проксимальных участков синапса амфибий. Об этом же свидетельствует и серия экспериментов с ингибированием АХЭ, поскольку известно, что если разница в спаде МТКП связана с различной плотностью ХР, то она должна еще более возрасти на фоне действия армина, что мы и получили. Резкое увеличение различий в амплитуде и I МТКП в проксимальных и дистальных участках в армине позволяет считать, что активность АХЭ в разных участках синапса лягушки примерно одинакова.

Ультраструктурное исследование проксимальных и дистальных участков синапса амфибий.

Анализ серийных срезов портняжной и кожно-грудинной мышц лягушки позволил проанализировать ультраструктурные особенности проксимальных и дистальных участков синапса. Оказалось, что различные отделы синапса характеризуются некоторыми особенностями строения пре- и поетеинаптических структур. Активные зоны и, соответственно, устья постсинаптических складок в проксимальных участках располагались более часто, чем в дистальных. Первичная синаптическая щель в проксимальных участках была несколько шире. За счет резкого уменьшения диаметра нервной терминали протяженность синаптического контакта в дистальных участках значительно уменьшалась. При используемом увеличении отличий в размерах устья постсинаптических складок и в размерах сикаптических везикул обнаружено не было. Таким образом, данная серия экспериментов позволила нам с уверенностью гоьооить о наличии проксшо-дистального градиента амплитуды и I МТКП в пределах одного синапса, котооый обусловлен

I ю •

различиями ь плотности холинорецепторов и в геометрии синап-

тлческой щели.

Сезонные изменения амплитуды и длительн сти МТКП.

Известно, что одним из проявлений пластических преобразований, происходящих в физиологических условиях, являются сезонные изменения нервно-мышечного синапса, наиболее ярко выраженные у амфибий.

Сравнительный анализ амплитуды и 1ПС МТКП в синапсах лягушек в различное время года показал, что как зимой, так и летом проксимо-дистальный градиент амплитуды и длительности спонтанных сигналов сохранялся, однако летом он был ¿олее выражен, чем зимой. В летнее время 1ПС МТКП в дистальных районах был ниже, чем в проксимальных, на 23,2'/., а зимой - всего лишь на 18,7%. Среднее значение 1пс ИТКП в синапсах летних лягушек составило 0,94±0,07 мс (проксимальные участки), тогда как зимой наблюдалось достоверное увеличение среднего значения МТКП до 1,1210,08 мс СР<0,05,п=10). Летом гистограммы распределения Цс №101 были компактны и одномодалыш. В синапсах же зимних лягушек довольно часто встречались гистограммы, имеющие несколько пиков Сили модальных значений). Кроме того зимой, особенно в дистальных районах синапса, увеличивалось количесво "медленных" МТКП. Интересно отметить, что "укорачивающий" эффект ТБК на спад МТКП в синапсах зимних лягушек был менее выражен, чем в синапсах летних лягушек. Так, при действии ТБК амплитуда МТКП в проксимальных участках синапса снижалась летом с'547,5*36,5 мкВ в норме до 175,4*25,3 мкВ в ТБК, 1пс МТКП также уменьшалось с 0,97*0,04 мс Снорма) до 0,81 ±0,02 мс С ТБК), тогда как зимой - с 482,4±100,2 до 235,1±43,1 мкВ и с 1,12±0,08 до 0,95±0,13 мс, соответственно. Этот феномен ми сочли возможным объяснить низкой чувствительностью ХР постсинаптической мембраны синапсов зимних лягушек к ТБК.

Полученные данные мы должны рассматривать, исходя из того, что зимой, по данным УегШд А. и соавт. С198С), в нервно-мышечных синапсах наблюдаются явные признаки спраутинга, то есть синапс активно перестраивается, а летом налицо признаки ретракции. Анализ сезонных изменений параметров МТКП хорошо согласуется с данными представлениями. Кт обнаружили в спнат-

- 1 о -

сах зимних лягушек, и особенно в дистальных районах, характерные изменения параметров МТКП,. которые были расценены нами как признаки наличия процессов пластических перестроек. ПОСГДЕНЕРВАШОНШЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ СПОНТАННОЙ

АКТИВНОСТИ НЕРВНО-МЫШЕЧНОГО СИНАПСА. Анализ амплитудно-временных характеристик МТКП на ранних стадиях после перерезки двигательного нерва. Еще одной моделью изучения механизмов, лежащих в основе пластического реюкелирования синапса, может служить хирурги-гическая денервация скелетных мышечных волокон.

Эксперименты проводились в период с ноября по декабрь. В норме амплитуда МТКП составила 505,±54,5 мкВ и - 1,27t 0,04 мс. После перерезки двигательного нерва, иннервирующего ко/тно-грудиннуи мышцу лягушки, начиная со 2-3-го дня, происходило уменьшение амплитуды и частоты МТКП. Через 8-10 дней постсиналтические сигналы полностью исчезали. Этот процесс б разных синапсах происходит крайне неравномерно, то есть в одной и той же мышце можно было встретить синапсы с совершенно нормальной спонтанной активностью и синапсы, в ко-которых амплитуда и частота МТКП были.резко снижены.

Летальный анализ постденервационных изменений длительности МТКП позволил выявить две фазы развития данного процесса. В первые 3-4 дня денервация приводила к достоверному укорочении спада МТКП, так, на 4-й день tnc МТКП уменьшалось на 18,1% (Р<0,05, п=20). Начиная с 4-5-го дней денервации происходило удлинение спада МТКП и на 8-й день среднее значение tno МТКП возрастало на 52,9% по сравнению с 4-м днем. Причем значительно увеличивались не только значения t'

ПС

МТКП основной популяции, но и количество "медленных" сигналов, по сравнению с нормой их количество возросло до 12%. Начиная с 5-6 дней после перерезки двигательного нерва в гистограмме распределения t основной популяции МТКП довольно четко выделялось несколько пиков, свидетельствующих о появлении нескольких групп сигналов, каждая из которых имела сьое модальное значение .

Первоначальное укорочение спада МТКП может быть вызвано либо снижением уровня мембранного потенциала покоя (МПП) мы-

шечных волокон, либо уменьшением плотности ХР постсинаптичес-кой мембраны. Снижение МПП не может, по-видимому, быть причиной исследуемого феномена, поскольку мы наблюдали фазу укорочения спада МТКП даже тогда, когда потенциал на мембране был фиксирован Сна уровне -70 мЮ. Для проверки второго предположения был проведен сравнительный анализ степени денерва-ционного укорочения постсинаптических сигналов в контроле и в условиях ингибирования АХЭ. Укорочение спада МТКП в денер-вированньгх мышцах с ингактной АХЭ составило 18,1'/., тогда как на фоне действия армина оно достигало уже 53,4'i. Однако известно, что если укорочение спада МТКП вызвано уменьшением плотности ХР,. то в условиях ингибированноЯ АХЭ оно должно быть более выраженным, так как в этом случае отсутствует фактор повторного связывания. Следовательно, можно сделать вывод, что в кожно-грудинной мышце лягушки примерно со 2-го дня после денервации начинается процесс снижения плотности ХР в синаптической области. Увеличение времени полуспада МТКП можно объяснить несколькими причинами. Известно, что в процессе денервации снижается активность АХЭ, однако проведенное нами биохимическое исследование активности АХЭ в кожно-грудинной мышце лягушки не выявило каких-либо достоверных изменений на исследуемых нами сроках денервации. Наблюдаемое нами удлинение спада. МТКП можно обьяснить теь\ что после денервации образуются новые ХР CMiledi, 1960b; Kallo, Steinhardt, 1583). ионные каналы которых имеют более длительное время открытого состояния (Gage, Hamill, 1980). Такие вновь синтезированные ХР встраиваются, по-видимому, не только в экстрасинаптическую область синапса CFambrough, 1979), но и в синзптическу». Вполне вероятно, что появление нескольких пиков в гистограмме распределения tno ЮТП свидетельствует о наличии двух видов ХР в синаптической области. Для более прямого подтверждения этой гипотезы мы провели сравнительный анализ АХ-шума в синапсах нормальных и денервированкых скелетных шиш у амфибш'!. Эта методика, основанная на регистрации автокорреляционной функции АХ-шума в условиях двухзлектродной фиксации мембранного потенциала, позволила нам сулить о времени открытого состояния ионных каналов, активируемых ацетилхолинсм.

Оказалось, что на 8-9-й дни после денервации, когда постде-нервационные изменения ужа ярко выражены, встречались синапсы, в которых время открытого состояния ионных каналов ХР превышало в 2-3 раза таковое в иннерьированных мышцах.

При анализе потенциалозависимости времени полуспада МТКП было показано, что сигналы, имеющие наиболее длительный спад, характеризуется меньшей потенциалозависимостью. Необходимо такке отметить, что ХР денервированных мышц, также как и ХР постсмнаптической мембраны у зимних лягушек, обладают сниженной чувствительностьо к ТБК.

Динамика изменений параметров МТКП в ходе развития процессов де- и реикнервааии у теплокровных.

Динамика постденервационных изменений амллитудно-вреыен-них характеристик МТКП в синапсах полудиафрагмы мыши после перерезки френико-диафрагмального нерва была такой же, как и в синапсах амфибий, но вйе изменения протекали гораздо быстрее. После перерезки нерва такзе наблюдалось резкое и быстрое уменьшение амплитуды и частоты МТКП, и, спустя 12 часов, спонтанные сигналы .полностью исчезали.

Изменения времени полуспада МТКП также носили двухфазный характер, однако первоначальное укорочение было более выражено ( с 1 ДОЮ,03 ыс в норме до 0,78±0,02 мс спустя 4 часа после перерезки), а последующее удлинение - менее значительно С1 МТКП, зарегистрированных спустя 10-12 часов составило в среднем 0,8810,05 мс). Примерно до 4-го часа после перерезки двигательного нерва гистограммы распределения 1ПГ МТКП оставались компактными и одноыодальныыи. Количество "медленных" сигналов составляло всего лишь'0,64% от всех зарегистрированных в данном синапсе сигнаг'в. Необходимо отметить, что гистограммы распределения амплитуд и 1пс МТКП в синапсах у мьгаей всегда были более компактны, чем в синапсах лягушек и сигналы о очень .большой длительностью встречались довольно редко. Начиная с б-го часа после денервации в основной популяции МТКП на гистограмме распределения 1ПС можно было выделить несколько мод.

В процессе реикнерваиии полудиафрагмалькой мышцы мьетп С после передавливания фрэнико-дмафрагмалького нерва) ;»ь; не

смогли зарегистрировать какую-либо постсинаптическуи активность. МТКП появились только на 17-й день после передавлива-ния нерва, что согласуется с данными литературы СGregoriо F.Di et al., 1989, 1990). Амплитуда наблвдаемих МТКП 'была невелика Св среднем 119,58il9,79 мкВ), а гистограммы распределения амплитуд были скошенными, так называемые "skew" -гистограммы, характерные для эмбриональных и регенерирующих синапсов СVautrin, 1990). Частота МТКП была очень низкой и составляла в среднем 0,098±0,02 с' . Среднее время полуспада таких ОТКП было достоверно выше, чем в контроле (Р<0,03, п=6). Кроме этого, гистограммы распределения t МТКП были во всех исследованных синапсах весьма характерными: они как бы "распадались" на несколько классов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ■ Синапсы нормальных, шшервнрованных мышц, претерпевающих пластические перестройки, а также мышц, находящихся в стадии денервации или реиннервации, обнаруживает весьма характерные и схожие изменения свойств постсинаптической мембраны, что отражается, прежде всего, на амплитудных я временных параметрах МТКП. Изменения характеристик спонтанных пост-синаптических сигналов обусловлены изменением плотности холи-норецепторов, а также появлением холинорецепторов, ионные каналы которих обладают большим временем открытого состояния и меньшей потенциалозавискмостью.

• Наше исследование позволило выявить четкие электрофизиологические критерии наличия или отсутствия пластических перестроек в нервно-мышечных синапсах холоднокровных и теплокровных животных. К ним относятся, прежде всего, уменьшение амплитуды и увеличение длительности полуспада МТКП, "расщепление" гистограммы распределения tnc МТКП на несколько классов, каждый со своим модальным значением, а также снижение чувствительности к действие ТБК. На наличие процессов реко-

делирования может указывать также увеличение количества "медленных" МТКП.

ВЫВОДЫ

1. В нервно-мышечном синапсе амфибий существует прокси-

- и -

ыо-дистальнш! градиент амплитуды и длительности спада МТКП. Амплитуда и время полуспада МТКП. зарегистрированных от проксимальных участков синапса, превышают аналогичные параметры МТКП ь ддетальных районах.

2. Проксимальные отделы синапса, по сравнению с дисталь-ными, характеризуются повышенной плотностью ХР и постсинапти-ческих складок СПССЗ, а также большей длийой синаптического контакта и меньшей разветвленностью ПСС.

3. Сезонные пластические перестройки синапсов амфибий наиболее отчетливо проявляются зимой в дистальных участках: это выражается в уменьшении амплитуды и увеличении 1по КГКП,

' а также в увеличении количества "медленных" МТКП. ХР постси-наптической мембраны синапсов у зимних лягушек менее чувствительны к ТБК, чем у летних.

4. Изменения времени полуопада МТКП в ходе денервации включают две фазы: первоначальное укорочение спада МТКП (начиная со 2-4-го дней) сменяется его удлинением, продолжающимся вплоть до исчезновения спонтанной активности С8-9-й дни после денервации).

5. В синапсах у мышей наблюдается.аналогичная динамика изменений времени полуспада МТКП в условиях денервации, однако все изменения протекали гораздо быстрее Св течение 12 часов).

6. Через 4-5 дней после денервации в постсинаптической мембране появляются ХР, характеризующиеся сниженной чувствительностью к тубокурарину, а их ионные каналы обладают большим временем открытого состояния и меньшей потенциалозави-симостью.

7. Изменения амплитудно-временных характеристик МТКП, зарегистрированных в синапсах полудиафрагмальной мышцы мыши в процессе реиннервации, были аналогичны таковым в синапсах денервированных мышц.

8. Признаками наличия процессов пластической перестройки (ремоделирования) в синапсах холоднокровных и теплокровных ;швоткых являются:

1) увеличение времени полуспада МТКП;

2) "расцепление" гистограммы распределения 1пс МТКП н;

несколько классов;

3) увеличение количества "медленных" спонтанных сигналов;

4) снижение чувствительности к действии тубокурарина. СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Зефиров А. Л. , Земскова С. II. Особенности освобождения медиаторов в нервно-мышечных синапсах крупных и мелких мышечных волокон скелетной мышцы лягушки // В кн.: Физиология двигательного аппарата и физиология труда. - Казань, 1978. - С. 57-63.

2. Зефиров А.Л., Земскова С.Н. Освобождение медиатора в нервно-мышечных соединениях портняжной мышцы лягушки при ритмическом раздражении // Фиэиол. журнал СССР. - 1979. -Т. 65,' N 8. - С. 1220-1225.

3. Земскова С.Н., Зефиров А.Л. Амплитудные и временные характеристики миниатюрных токов в различных отделах нервно-мышечного соединения // Маг. Всесоюзной конф. по нейронаукам. -Киев, 1986. - С. 83.

4. Беэгина E.H., Кашапова Л.А., Мошков Д.А., Драбкина Т.М. . Земскова С.Н. , Зефиров А. Л. , Халилов И. А. Особенности временного течения миниатюрных■токов концевой пластинки в разных участках нервно-мышечного соединения лягушки Нейрофизиология. - 1987. - Т. 19, N 6. - С. 778-769.

5.' Волкова И. П., Зефиров А. Л., Ахтямова Д. А., Земскова С. Н., Халилов И. А. Особенности электрогенеза и секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе // В кн.: ХУ Сгезд Физиологического общества. Тез. докл. - 1987. - С. 120- 121.

Б. Земскова С. Н. , Эдер К., Зефиров А. Л Декервацпонные изменения свойств постсинаптической мембраны мышечных волокон лягушки // Тез. докл. Всесоюзн. конфер. "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки". - 2G-28 сентября Суздаль. - 1989: - С. 78.

7. Земскова С.Н., Эпер К., Гчииатуллик Р,А. , Зефиров А.Л., Хазилов Р.К. Ранние постдекервэционные изменения свойств постсинаптической мембрана мышечного волокна ам$жбий л* Физиол. журк. СССР. - 1991. Т. 77, N' 2. - С. 57-05.

•8.' гемскоьа С. Н. . Б-;эг::н;\ E.H.. Компас Л. А. , Вллксг-а

И. H. О возможном участии Шванновских клеток в спонтанной освобождении медиатора // В кн. : Тез. докл. У1 Всесоюзной конф. "Физиология медиаторов. Периферический синапс". - Казань, 1991. - С. 46.

9. Zefirov A.L., Zemskova S. N., Eder К. Early postdene-rvat.ion alterations of the skeletal muscle postsynaptic membrane // Proceedings of Congress of Int. Society for Pathophysiology. - Moskcw, May 28-June 1, 1991. - P. 73-75.

Подписано к печати 13.I.92. Тир.100 Зак.12-92

Лаборатория офсетной печати Казанского госиединстигута 420015 r.IiaaaHb, уд .Пушкина, I.