Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Везикулярный цикл в нервно-мышечных синапсах соматических клеток дождевого червя

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Везикулярный цикл в нервно-мышечных синапсах соматических клеток дождевого червя"

£

На правах рукописи

ВОЛКОВ МИХАИЛ ЕВГЕНЬЕВИЧ

/

ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ ЦИКЛ В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ДОЖДЕВОГО ЧЕРВЯ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005557837

'15 2015

Казань-2014

005557837

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: Зефиров Андрей Львович - член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России.

Официальные оппоненты:

Исакова Лариса Сергеевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВПО ИГМА Минздрава России;

Гайнутдинов Халил Латыпович - доктор биологических наук, профессор, старший научный сотрудник «Open Lab Нейробиология» Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО КФУ.

Ведущая организация: - ФГОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», г. Москва.

Защита состоится «13» февраля 2015 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России по адресу: г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49 «б», www.kgmu.kcn.ru

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук.

профессор

Л.Д. Зубаирова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Изучение механизмов передачи возбуждения в синаптических структурах является одннм из актуальнейших и быстро развивающихся направлений в современной нейрофизиологии. В основе секреции медиатора в химических синапсах лежит процесс экзо-эндоцитоза синаптических везикул в активных зонах (Зефиров А.Л., Петров A.M., 2010). Основные механизмы этого процесса хорошо изучены. Однако, представления об особенностях формирования данных механизмов в различных группах животных, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, имеют существенные пробелы. В этом отношении особый интерес представляют аннелиды. В эволюционном плане — это первая группа животных, имеющая соматическую мускулатуру и двигательную иннервацию (Давид О.Ф., 1990).

В синаптических образованиях соматической мышцы дождевого червя определяются везикулярные структуры, сходные с таковыми в двигательных окончаниях позвоночных животных (Shimizu R. et al, 1999), а в мышечных клетках регистрируются миниатюрные спонтанные постсинаптические токи (Volkov Е.М. et al., 2007). При этом сведения о механизмах экзо-эндоцитозного цикла в двигательных нервно-мышечных синапсах первичной двигательной мускулатуры аннелид практически отсутствуют. В этом плане прижизненное изучение особенностей везикулярного цикла и секреции медиатора в холинергических нервно-мышечных синапсах мышечной стенки дождевого червя с применением методов флуоресцентной микроскопии представляется весьма актуальным.

Известно, что секреция медиатора осуществляется при участии большого семейства белков, формирующих «молекулярную машину» экзо-эндоцитоза синаптических везикул (Зефиров A.JL, Петров A.M., 2010). В этом механизме одна из ключевых ролей принадлежит синтаксинам (Sollner Т.А. et al., 1993). В свою очередь, синтаксины взаимодействуют с семейством белков синаптотагминов мембраны синаптических везикул (Sudhof Т.С., 2002).

Синтаксины и синаптотагмины являются главными Са2+-сенсорами экзо-эндоцитоза (Sorensen J.B. et al., 2003; Yao J. et al., 2011) пространственно-сопряженными с Са2+-каналами (Seagar M., Takahashi M, 1998).

В свою очередь, проводящими путями Са2+-тока в пресинаптической мембране являются Са2+-каналы различных подтипов (Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф.,2010).

Белки семейства синтаксинов, синаптотагминов и Са2+-каналов, обладают высокой структурной и фармакологической вариабельностью в периферических синапсах различных типов. От дифференциальной экспрессии набора данных белков и пространственной структуры активных зон нервных окончаний зависят особенности Са2+-чувствительности и синхронности вызванного и спонтанного выброса медиатора. Идентификация ключевых белков везикулярного цикла и определение структурной организации активных зон на примере периферических холинергических синапсов филогенетически первичной соматической мускулатуры дождевого червя не проводилась.

Данное исследование имеет принципиальное значение для создания полноценной картины, отражающей эволюционное формирование базовых механизмов секреции медиатора в двигательных нервно-мышечных синапсах у животных разных систематических групп.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования стало изучение механизмов везикулярного цикла, связи этого процесса с концентрацией ацетилхолина (АХ) в соматической мышце дождевого червя, а также идентификация ряда важнейших белков, участвующих в этом процессе с использованием методов флуоресцентной микроскопии.

В соответствии с целью исследования были сформулированы конкретные задачи, а именно:

1. Определить двигательные нервно-мышечные синапсы в соматической мышце дождевого червя и их связь с нейронами ганглиев брюшной нервной цепочки.

2. Изучить потенциал- и К+ - зависимость экзо-эндоцитозного цикла в двигательных синапсах.

3. Определить роль экстра- и внутриклеточного Са2+ в процессах экзо-эндоцитозного цикла.

4. Прямым количественным методом определить концентрацию АХ в соматической мышце. Установить зависимость между интенсивностью протекания процессов везикулярного цикла и концентрацией АХ в мышце.

5. Выявить зоны расположения ацетилхолиновых рецепторов (АХР) на постсинаптической мембране соматических мышечных клеток.

6. Иммуноцитохимически идентифицировать синаптотагмин 1, синтаксин 1 и альфа 1В субъединицу Са2+ -канала N-типа в холинергических двигательных нервно-мышечных синапсах.

Положения, выносимые на защиту

1. Везикулярный цикл в двигательных нервно-мышечных синапсах соматической мышцы дождевого червя, образующих кластеры «синаптических бутонов», потенциал-, К+- и Са2+ зависимый.

2. Ускорение процессов экзо-эндоцитоза в двигательных синапсах сопровождается увеличением, а замедление - снижением концентрации АХ в соматической мышце. Содержание медиатора в мышце остается относительно высоким и в условиях блокады везикулярного цикла.

3. В синаптических образованиях идентифицируются белки синтаксин 1, синаптотагмин 1 и альфа 1В субъединица Са2+-канала N-типа. Расположение ацетилхолиновых рецепторов, способных связываться с альфа-бунгаротоксином, строго ограничено зоной синаптического контакта.

Научная новизна работы

В мышечной стенке дождевого червя с помощью флуоресцентных эндоцитозных красителей FM1-43, FM2-10, FM4-64 выявлены кластеры «синаптических бутонов».

С помощью мембранного зонда Dil впервые доказана связь данных образований с нейронами ганглиев брюшной нервной цепочки.

Впервые показано, что чем выше содержание К+ в растворе и, соответственно, деполяризация нервных клеток, что контролировалось потенциалчувствительным зондом DiBAGi (3), тем быстрее идет выгрузка маркера FM2-10 и, наоборот, процесс замедляется в отсутствии К+ в среде. В растворах без

Са2+ в присутствии Са2+-буферов ВАРТА или ВАРТА-АМ захват и выгрузка РМ2-10 блокируется, но только после предварительной 40 мин инкубации.

Впервые высказано предположение, что кальциевый сенсор экзо-эндоцитозного цикла работает по принципу «все или ничего».

Впервые установлено, что усиление интенсивности везикулярного цикла в кластерах «синаптических бутонов» приводит к ограниченному увеличению концентрации АХ в соматической мышце дождевого червя. При этом содержание АХ остается значительным как в состоянии «покоя», так и в условиях блокады секреции в бескальциевых растворах в присутствии Са2+-буферов.

В холинергических синапсах в соматической мышце дождевого червя впервые показана экспрессия таких белков как: синтаксин 1, синаптотагмин 1 и альфа 1В субъединица Са2+-канала Ы-типа.

Впервые высказано предположение, что число активных зон в «синаптических бутонах» может быть ограничено в виду их малых размеров (1-2 мкм).

Впервые установлено, что локализация АХР Н-типа, способных связываться с альфа-бунгаротоксином, строго ограничена зоной синаптического контакта.

Научно-практическая значимость работы

Проведенное исследование носит, прежде всего, фундаментальное теоретическое значение для нейрофизиологии передачи возбуждения в периферических нейромоторных синапсах двигательной мускулатуры. Последнее имеет принципиальное значение для понимания процессов формирования нервно-мышечных синапсов в эволюционно незрелых двигательных системах животных, в частности, у кольчатых червей, от которых, предположительно, произошли все высшие беспозвоночные и, по некоторым данным, позвоночные животные.

Как показали наши исследования, базовые механизмы секреции медиатора у дождевого червя и у высших позвоночных, принципиально не отличаются. Данное обстоятельство дает право предлагать дождевого червя в качестве более простого и доступного объекта (лабораторного животного) для изучения особенностей везикулярного цикла, семейства белков, принимающих в нем участие и, соответственно, генетических структур, обеспечивающих экспрессию соответствующих фенотипических свойств.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (09-04-00170а и 12-0431197 мол_а).

Личный вклад диссертанта в исследования

Все данные, приведенные в работе, получены при личном участии соискателя на всех этапах проведения исследования, а именно: составление плана работы, подготовка и проведение экспериментов, анализ и систематизация полученных данных, а также оформление публикаций.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных основана на репрезентативном объеме полученных результатов исследований, использовании адекватных и информативных методических подходов, а также статистической обработки полученных результатов.

Апробация работы

Результаты исследования, вошедшие в диссертационную работу, доложены на следующих конференциях, симпозиумах, съездах: XXI Съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга-Москва 2010); Всероссийской конференции «Механизмы адаптации физиологических систем к факторам среды» (Санкт-Петербург, 2010); 85-Всероссийской студенческой научной конференции (Казань, 2011); VIII Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2012, 2013); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань,

2012); XXII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград,

2013); Материалы XII Международной научной школы «Адаптация растущего организма» (Казань, 2014).

Реализация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 публикации в рецензируемых журналах (списка ВАК). Материалы диссертации докладывались на международных, всероссийских научных съездах, конференциях и симпозиумах.

Полученные данные представляют интерес для нейробиологов, физиологов, нейрогенетиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре «нормальной физиологии», кафедре «медицинской биологии и генетики» ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России и кафедре «анатомии, физиологии и охраны здоровья человека» ФГАОУ ВПО КФУ.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация имеет 91 страницу текста. Состоит из введения, обзора литературы, методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка иллюстративного материала и списка литературы. Список цитируемых источников включает 181 работу, из них 25 - отечественных и 156 - иностранных авторов. Диссертация содержит 15 рисунков и 1 таблицу.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на соматической мышце внутренней стороны кожно-мускульного мешка дождевого червя ЬитЬпсиз 1егге$1п$. Выделение фрагментов кожно-мускульного мешка длиной 10-15 сегментов производили в присутствии модифицированного раствора Древеса - Пакса (Волков Е.М. и др., 2001) следующего ионного состава (моль/л): Ыа+ - 16,0, К+ - 3,0, Са2+ - 6,0, СГ -93,0, 8042" - 43,0, трис — 2,0, с рН — 7,4 комнатной температуры (основной раствор).

Модификацию ионного состава растворов производили с учетом постоянства ионной силы и осмолярности. Увеличение или уменьшение концентрации К+ или Са2+ компенсировали соответствующим изменением концентрации №+. Для связывания экстраклеточного Са2+ использовали ВАРТА, а

внутриклеточного - мембранопроникающий Са2+-буфер ВАРТА-АМ в концентрациях 0,05 и 0,5 ммоль/л.

Для окрашивания нервных окончаний в ряде экспериментов применяли флуоресцентный мембранный зонд Dil, светящийся в зеленом спектре (возбуждающий светофильтр 470 - 500 им, эмиссионный фильтр 530 - 570 нм). Кристалл красителя накладывали на ганглии брюшной нервной цепочки. В дальнейшем системой антероградного аксонального транспорта и латеральной диффузией краситель распространялся из сомы нейронов по нервным проводникам и окрашивал нервные образования (Nguen S. et al., 2007).

Для регистрации изменения МПП нервных окончаний использовали потенциалчувствительный флуоресцентный маркер D1BAC4 (3), связывающийся с внутриклеточными белками цитоплазмы и светящийся в зеленом спектре (Mennerick S. et al., 2010). После выделения мышечного препарата его помещали в ванночку для экспериментов с 2 мл безкалиевого раствора. Далее добавляли 0,5 мкл (2 мкмоль/л) DiBAC4 и выдерживали 40 мин.

Измерения интенсивности флуоресценции производили каждые 2 мин в диапазоне времени 2-10 мин. После чего, последовательно производили замену раствора на следующий (3, 10 и 40 ммоль/л К+) и повторяли процедуру.

В экспериментах использовали флуоресцентные красители - FM1-43, FM4-64 (2-3 мкмоль/л) и FM2-10 (22-24 мкмоль/л) (Betz W.J., Bewick G., 1993; Зефиров A.JI. и др., 2003). Загрузка красителя проводилась в течение 3 мин в основном растворе с повышенным содержанием КС1 (10 ммоль/л) при эквимолярном снижении NaCl, соответственно. В целях уменьшения фонового свечения после загрузки красителя препарат отмывался в течение 10 мин в основном растворе без перфузии. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах свечения пикселя (с применением программы Се11АР и Image Pro). При работе с маркерами использовали следующий способ оценки флуоресценции. Значение фонового свечения определяли как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 х 50 пикселей в участке изображения без нервного окончания. Флуоресценцию нервного окончания определяли после вычитания фоновой флуоресценции (Petrov A.M. et al., 2008). Интенсивность свечения оценивали как среднее свечение всех пикселей в контуре центрального участка (40 мкм) отдельной нервной терминали или как среднее свечение всех пикселей в контуре отдельных пятен (свечение пятен).

В иммуноцитохимических опытах препарат фиксировался 10 мин в 3% растворе параформальдегида в 0,1 моль/л растворе фосфатного буфера (phosphate buffered saline - PBS) с последующей 3-х разовой отмывкой по 10 мин каждая в PBS, далее инкубация в 1% растворе тритон Х-100 в PBS. В дальнейшем 12-часовая инкубация с первичными поликлональными антителами (1) к альфа 1В субъединице Са-канала N-типа, (2) к синтаксину 1 и (3) к синаптотагмину 1 (все фирмы Santa Cruz Biotechnologies, США) в разведении 1:200 в 1% тритоне Х-100 в PBS при 4 градусах Цельсия с последующей 3-х кратной отмывкой по 10 Mira каждая в PBS (NuruIIin L.F. et al., 2011). Инкубация с вторичными антителами (фирма Invitrogen, США) производилась в темноте в течение 1 часа в разведении 1:500 с последующей 3-х разовой отмывкой по 10 мин каждая в PBS. Все процедуры проходили при комнатной температуре. Производили инкубацию препарата (30 мин) с TMR-(tetrametylrh0damin)-am^a-6yHrap0T0KCHH0M в концентрации 20 мкГр/мл в темноте с последующей троекратной отмывкой по 10 Mim в PBS при комнатной температуре (Krause М., Wernig А., 1985; Nurullin L.F. et al., 2011).

Для подтверждения специфичности связывания антител с соответствующими белками проводили контрольные эксперименты. 1) Препарат выдерживали с вторичными антителами без предшествующей инкубации с первичными антителами (негативный контроль). 2) Производили инкубацию препарата с первичными антителами в присутствии иммуногенного пептида, на который вырабатывались первичные антитела (позитивный контроль). Проведенные контрольные эксперименты показали специфичность связывания антител с соответствующими пептидами, о чем судили по отсутствию окрашивания препарата.

Готовые препараты помещали на предметное стекло и заключали в глицерин с PBS в соотношении 1:1 с установкой покровного стекла. Наблюдения проводились на лазерном конфокальном микроскопе LEICA SP5 II TCS MP. Использовался маслоиммерсионный объектив хбЗ.

При работе с эндоцитозными маркерами использовали: FM1-43 — возбуждение линией лазера 488 нм (аргоновый лазер) (эмиссия 577 нм); FM4-64 — возбуждение линией лазера 514 нм (аргоновый лазер) (эмиссия 640 нм); вторичные антитела (кроме TMR-альфа-бунгаротоксина) возбуждение линией лазера 633 нм (гелий-неоновый лазер) (эмиссия 647 нм); TMR-альфа-

бунгаротоксин - возбуждение линией лазера 552 нм (аргоновый лазер) (эмиссия 577 нм).

Оптическая детекция АХ осуществлялась с помощью набора Amplex® Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit (Molecular Probes, США). Применялись следующие концентрации реагентов: ацетилхолинэстераза 1 един. акт. / мл, холиноксидаза 1 един. акт. / мл, пероксидаза хрена 2 един. / мл, реактив Amplex Red 400 мкмоль/л. Для оценки неспецифического свечения, связанного с генерацией экзогенной перикиси водорода в экспериментах использовали смесь из пероксидазы хрена и реактива Amplex Red.

Для работы с Amplex® Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit применялись: возбуждающий светофильтр 560±10 нм, эмиссионный, пропускающий свет с длиной волны более 590 нм. В случае применения набора Amplex® Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit регистрировалось свечение в области 50 X 50 мкм в районе, содержащем скопления «синаптических бутонов». Перерасчет единиц свечения в количественные показатели АХ в мкммоль/л проводили с помощью калибровочной кривой.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента при уровне достоверности Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение везикулярного цикла в нервных образованиях соматической мышцы

Определение нервно-мышечных синапсов. Инкубация в течение 3 минут мышечного препарата в растворе с нормальным содержанием К+ в присутствии красителя РМ1-43 приводила к появлению окрашенных структур, по форме напоминающих «гроздья винограда». При этом отдельная гроздь состояла из нескольких десятков пятен овальной формы 1-2 мкм в диаметре (рисунок 1, а). Полученные данные согласуется с ультраструктурными исследованиями мионевральных синапсов (Рагпез1 R.M., УацпеШ Б., 1975), а также с результатами по оптическому выявлению синаптических структур в мышце дождевого червя

(Mizutani К. et al., 2003).

Поскольку известно, что диаметр синаптических бутонов нервных терминален равен примерно 1 мкм (Fernandes-de-Miguel F., Drapeau P., 1995), то можно предположить, что выявляемые нами светящиеся «гроздья винограда» представляют собой скопления или кластеры «синаптических бутонов», где отдельное пятно соответствует одной или, возможно, нескольким «синаптическим терминалям» (Shimizu R. et al., 1999).

Как показали опыты, свечение помеченных FMI-43 структур в течение 1-2 часов практически не менялось (рисунок 1 а, б).

Наиболее вероятным объяснением этого феномена может быть прочное связывание данного красителя с мембраной, и как результат в ходе экзоцитоза маркер не успевает освободиться от мембраны и повторно захватывается нервным окончанием. Последнее предположение подтверждается опытами с реагентом ADVASEP-7, ускоряющим отделение молекул красителя от наружного монослоя мембраны. Применение данного препарата позволило выявить снижение интенсивности флуоресценции окрашенных образований с течением времени (рисунок 1, в).

Рисунок 1 - Флуоресценция маркера РМ1-43. Масштаб - 5 мкм

а- Мышечный препарат червя, окрашенный красителем РМ1-43; б- флуоресценция окрашенного участка, показанного на рисунке 1, а через час инкубации в растворе с нормальным содержанием ионов К+ ; в - изменение флуоресценции участка, показанного на рисунке 1, а, после отмывки препарата с использованием реагента АОУА5ЕР-7 в течение 30 мин.

Доказательства связи между «синоптическими бутонами» и ганглиями брюшной нервной цепочки. На ганглии брюшной нервной цепочки апплицировали

мембранный зонд Dil, светящийся в зеленом спектре (530-570 нм). Диффундируя в мембране, он в течение суток перемещался от тел нервных клеток к нервным окончаниям, заполняя весь объем. Помеченный Dil препарат загружался эндоцитозным маркером FM4-64, флуоресцирующим в красном (возбуждающий светофильтр 530-570 нм, эмиссионный фильтр 710-750 нм) диапазоне длин волн. При этом, как Dil, так и FM4-64 окрашивали одни и те же структуры.

Данный экспериментальный подход дает основание утверждать, что окрашиваемые эндоцитозными маркерами структуры связаны с нервными элементами брюшной нервной цепочки и являются синаптическими образованиями.

Изменение МПП нервных окончаний при увеличении [К*] в экстраклеточном растворе. Опыты, с применением потенциалчувствительного флуоресцентного маркера DiBAC4 показали, что свечение нервных образований в мышечной стенке червя менее интенсивное по сравнению со свечением соматических мышечных клеток, что говорит о более высоком потенциале покоя нервных окончаний. Увеличение [К+] в растворе (3, 10, 40 ммоль/л) смещает, соответственно, кривые графиков величины свечения нервных окончаний в сторону больших значений (деполяризации мембраны). При этом показатели свечения нервных образований при различных концентрациях К+ практически параллельны в 10 мин. интервале времени после смены раствора, что говорит о переходе МПП нервных образований в новое равновесное состояние каждый раз после уменьшения электрохимического градиента для К+. Таким образом, через 2 мин при переходе от бескалиевого раствора (100%) к раствору с 3 ммоль/л К+ увеличение свечения составляет 104%, при 10 ммоль/л - 121% и при 40 ммоль/л К+ - 156%, соответственно. То есть, чем выше концентрация К+ в растворе, тем более выражено снижение МПП в нервных окончаниях.

Изучение везикулярного цикла с помощью эндоцитозного красителя FM2-10. В дальнейших экспериментах применяли краситель FM2-10, который существенно менее гидрофобный и, соответственно, намного быстрее переходит из связанного с мембраной состояния в омывающий мышцу раствор (Richards D.A. et al., 2000). В физиологическом растворе без К+ или содержащем 3 ммоль/л К+ в синаптической зоне регистрируются светящиеся пятна примерно одинаковой интенсивности флуоресценции, что указывает на высокую интенсивность процессов экзо- и эндоцитоза в нервных окончаниях. При увеличешш

концентрации К+ до 10 или 40 ммоль/л (условия, деполяризующие мембрану) через 2 мин после смены растворов яркость пятен увеличивается примерно на 40 и 60 %, соответственно. Это свидетельствует об усилении процессов экзо- и эндоцитоза при деполяризации мембраны.

Дальнейшие эксперименты с более длительной экспозицией показали, что чем выше в омывающем мышцу растворе содержание К+, тем быстрее наблюдается снижение интенсивности свечения или, иными словами, идет более интенсивная выгрузка маркера (рисунок 2), что согласуется с имеющимися данными (8Ыпиги Я. е1 а1., 1999) и, наоборот, самая медленная по времени выгрузка наблюдается при отсутствии в растворе К+.

Таким образом, высвобождение маркера из везикул (показатель скорости экзоцитоза) зависит от степени деполяризации мембраны.

Рисунок 2 - Загрузка и выгрузка маркера РМ2-10. Масштаб - 5 мкм. А, а — загрузка кластера «синаптических бутонов» при К+ (3 ммоль/л) А, б, в - через 10 и 40 мин в растворе с К+ (10 ммоль/л). Б - Динамика интенсивности флуоресценции загруженных нервных окончаний при различных концентрациях К+ (ммоль/л) растворе. Светлый «значок» - 0, серый «значок» - 3 и темный - 10. По оси ординат - интенсивность флуоресценции в % от исходного уровня, наблюдающегося, непосредственно, после загрузки маркера. По оси абсцисс - время в мин.

Роль вне- и внутриклеточного Са2+ в экзо-эндоцитозном цикле. Считается общепринятым, что в секреторных клетках протекание везикулярного цикла напрямую зависит от концентрации Са2+ как во внеклеточной, так и во внутриклеточной среде (2е11гоу А.Ь. е1 а1., 2006). В бескальциевом растворе загрузка флуоресцентным маркером также происходила, хотя и заметно в меньшей

степени (рисунок 3, а). Только после выдерживания препарата червя в течение 40 минут в растворе с 0.05 или 0.5 ммоль/л ВАРТА (внеклеточный буфер Са2+) аппликация РМ2-10 не приводит к появлению светящихся «пятен», что можно расценить как блокаду процессов экзо-эндоцитоза. Для изолирования внутриклеточного Са2+ был использован мембранопроникающий Са2+-буфер ВАРТА-АМ. Выдерживание препарата в течение 20 мин в растворе с его присутствием не прекращало окрашивание нервных окончаний (рисунок 3, б). И только при 40-60 мин инкубации наблюдалось полное прекращение загрузки ГМ2-10 (рисунок 3, в). То есть, минимальные концентрации внеклеточного и внутриклеточного Са2+ требуются для протекания везикулярного цикла. Данные экспериментов свидетельствуют о высоком сродстве к Са2+ сенсоров, контролирующих экзо-эндоцитозный цикл в синаптических бутонах дождевого червя.

Рисунок 3 - Влияние ионов Са2+ на загрузку маркера FM2-10. Масштаб - 5 мкм а - окрашивание кластера «синаптических бутонов» маркером FM2-10 при инкубации препарата в растворе, не содержащем ионов Са2+; б - загрузка маркера FM2-10 в условиях предварительной выдержки в течение 20 мин в растворе, содержащим Са2+ буфер ВАРТА-АМ (0,05 ммоль/л);. в- то же , что и б, но при инкубации в течении 40 мин.

Зависимость концентрации АХ в соматической мышце от интенсивности протекания везикулярного цикла в нервно-мышечных синапсах

Поскольку метод регистрации уровня АХ во внеклеточной среде основан на определении перекиси водорода, первоначально определяли свечение, которое возникает при инкубации препарата с пероксидазой хрена и реактивом Amplex Red. Уровень свечения не зависел от концентрации К+ и Са2+, а также присутствия

Са2+ буфера ВАРТА в наружном растворе; и составил 40,1 ± 2,5, п=6 (фоновое свечение). В остальных экспериментах применялись все компоненты набора Amplex® Red Acetylcholine/Acetylcholinesterase Assay Kit.

В бескальциевом растворе с 0.5 и 0.05 ммоль/л ВАРТА свечение было 40,2 ± 2,5 и 44,7 ± 2,7 (п=10) соответственно (данные приведены за вычетом неспецифического свечения), что практически соответствует фоновому уровню. При концентрации К+ в наружном растворе 0 и 3 ммоль/л существенного увеличения свечения не произошло (таблица 1). Максимальная яркость флуоресценции наблюдалась при выдерживании препарата в растворе с 10 ммоль/л К+ (таблица 1). В растворе с концентрацией К+ 40 ммоль/л яркость свечения была несколько меньше, но не отличалась достоверно от показателей свечения при 10 ммоль/л К+ Но только свечение при К+ в 10 ммоль/л было достоверно выше по сравнению со значениями в основном растворе. В отсутствии Са2+ в среде показатели свечения были примерно такими же, как и в основном растворе (таблица 1).

При добавлении в такой раствор ВАРТА показатели свечения уменьшались и становились достоверно менее интенсивными по отношению к исходному раствору, но только при 40 мин. инкубации, однако, и в этом случае, не в столь выраженной степени (таблица 1). Таким образом, секрещи АХ клетками червя усиливается при деполяризации мембраны нервных окончаний, однако, достигает максимума уже при 10 ммоль/л К+. Дальнейшая деполяризация мембраны нервных терминалей при 40 ммоль/л К+ к увеличению определяемой концентрации медиатора не приводит. Отсутствие Са2+ в растворе сохраняет уровень АХ сопоставимый с исходным (3 ммоль/л), и лишь 40 мин. инкубация, в присутствии ВАРТА, приводит к его выраженному уменьшению (таблица 1). Таким образом, увеличение деполяризации мембраны нервных элементов сопровождается синхронным убыстрением процессов экзо-эндоцитоза (предположительно, усиление квантового выброса медиатора), а отсутствие Са2+ в среде, наоборот, замедляет эти процессы, что согласуется с данными литературы (Zefirov A.L. et al, 2006). Однако, картина синхронного определения концентрации АХ в мышце не столь однозначна. Так, можно отметить, что процессы экзо-эндоцитоза и выброс АХ, предположительно, из нервных образований, достаточно интенсивны в состоянии покоя и даже в отсутствии Са2+ в растворе.

Деполяризация мембраны с увеличением концентрации К+ до 10 ммоль/л

усиливает процессы как везикулярного цикла, так и повышает содержание АХ, но уже при концентрации в 40 ммоль/л К+ интенсивность экзо-эндоцитоза усиливается, а уровень АХ нет. В условиях, когда в среде без Са2+ при наличии ВАРТА свечение кластеров «синаптическнх бутонов» при окраске FM через 40 мин. достигало минимума, то снижение концентрации АХ в этом же временном интервале хотя и было достоверно меньшим, но не столь выраженным.

Можно думать, что наряду с квантовой секрецией АХ из нервных клеток существует «неквантовая» утечка, подобная той, что имеется в синапсах скелетной мускулатуры позвоночных (Merinery S.D. et al, 1989) Весьма вероятно, что данная форма выделения АХ может быть очень значительной и быть как потенциал-, так и Са2+-независимой.

Таблица 1 - Значения свечения и концентрации АХ в соматической мышце дождевого червя через 2-3 мин после смены растворов, а также после 40 мин. инкубации без Са2+ и в

присутствии ВАРТА.

Растворы (ммоль/л) Показатели свечения в O.E. Концентрация АХ в мкмоль/л

К+-3 80,7 ± 3,9 68 ±3

К+- 10 94,1 ±2,5" 79 ±3'

К 40 87,7 ± 2,0 73 ±3

К+ - 3; Са/+ - 0 84,4 ± 3,9 70± 4

К +- 3, Са2+ - 0 + ВАРТА 0,05 64,9 ±3,3" 61 ±2"

К 3, Caz+ - 0 + ВАРТА 0,5 56,0 ± 1,5" 54 ±3"

Примечание: Даны средние значения и стандартные ошибки (п = 12). * - значення достоверно (Р<0,05) больше, а **- достоверно (Р<0,001) меньше по сравнению с К+ 3 ммоль/л.

Иммуноцитохимическая идентификация Н-холииорецептора, синаитотагмина 1, синтаксина 1, Са2+ -канала 1У-типа в двигательных нервио-мышечиых синапсах соматической мышцы

Определение Н-холинорецепторов в клетках соматической мышцы. Для идентификации постсинаптических АХР нами был выбран общепринятый метод связывания последних с альфа-бунгаротоксином (МигиШп Ь.Р. й а1., 2011).

Проведенные нами эксперименты по оптическому выявлению мест связывания меченного альфа-бунгаротоксина с постсинаптической мембраной соматических клеток показали следующее. Как и в случае применения эндоцитозного маркера РМ1-43, в опытах с альфа-бунгаротоксином были выявлены скопления светящихся «пятен», так же напоминающие собой «грозди винограда». Это дает нам основание считать, что холинергические нервные

терминали формируют кластеры «синаптических бутонов», при этом, постсинаптическая мембрана соответствующего синапса имеет протяженность всего несколько мкм. Для подтверждения нашего предположения нами были проведены эксперименты по одновременному выявлению (метод двойного окрашивания) как пресинаптической, так и постсинаптической областей мионевральных синапсов. В качестве маркеров были выбраны эндоцитозный краситель РМ4-64 (рисунок 4, а), с одной стороны, и ТМЯ-альфа-бунгаротоксин (рисунок 4, б), с другой, как метка для АХР. На фото (рисунок 4, в) представлены светящиеся пятна, образующие единую структуру при колокализации светящихся пятен, имеющих только двойное окрашивание. Это является доказательством выявления синаптических «бутонов» холинергической природы в мышце дождевого червя.

Известно, что кластеры АХР на постсинаптической мембране скелетных мышечных волокон холоднокровных и теплокровных формируются исключительно в месте контакта с нервным окончанием, при этом, наибольшая плотность АХР имеется на постсинаптических складках непосредственно напротив АЗ нервных окончаний (Волков Е.М., 1989). Денервация мышцы снимает данный запрет (нейротрофический контроль) и АХР распространяются по всей поверхности мышечной мембраны (Волков Е.М., 1989). Присутствие АХР исключительно на локальном участке мышечной мембраны, находящейся в непосредственном контакте с синаптическими «бутонами», дает основание считать, что процесс кластеризации АХР исключительно на постсинаптической мембране, так же как и у позвоночных, находится под нейротрофическим контролем (Волков Е.М., 1989).

Рисунок 4 - Мышечный препарат дождевого червя (FM4-64). Флуоресценция маркера FM4-64 (аргоновый лазер, эмиссия 730 нм), - а; TMR-альфа-бунгаротоксина (гелий-неоновый лазер, эмиссия 577 нм) - б и двойное окрашивание: FM4-64 и TMR-альфа-бунгаротоксин (колоколизация светящихся пятен, имеющих только двойное окрашивание) - в. Масштаб для рисунков "а, б, в" - 10 мкм. г - увеличенная часть препарата (1 - окрашивание TMR-альфа-бунгаротоксином, 2 - колоколизация флуоресценции FM4-64 и TMR-альфа-бунгаротоксина, 3 - окрашивание FM4-64. Масштаб для рисунка "г" - 1 мкм.

Определение синаптотагмина 1, синтаксина 1, Са2+ -канала N-типа в двигательных нервно-мышечных синапсах соматической мышцы

Окрашивание нервных окончаний на наличие синтаксина 1 выявило свечение в виде группы пятен (рисунок 5, а). Даная группа светящихся «пятен» сходна с кластерами синаптических «бутонов», выявляемых с помощью эндоцитозных маркеров FM1-43 или FM4-64. Для маркировки холинергических синапсов применили метку с TMR-альфа-бунгаротоксином. Картина окрашивания оказалась сходной (рисунок 5, б). Методом двойного окрашивания выявлены биполярные светящиеся пятна (синтаксин 1 и Н-АХР). На фото (рисунок 5, в, г) представлены пятна, имеющие только двойное окрашивание. Подобные эксперименты с выявлением белка синаптотагмина 1 дали похожие результаты. Светящиеся пятна - синаптотагмин 1 (рисунок 6, а), Н-АХР (рисунок 6, б). Наконец, метод двойного окрашивания выявил светящиеся пятна с двойным совмещенным окрашиванием (рисунок 6, в, г). Проведенные эксперименты позволяют сделать однозначный вывод о наличии в синаптических «бутонах» важнейших белков, контролирующих эндо-экзоцитозный везикулярный цикл, таких как синтаксин 1 (Acuado F. et al., 1999) и синаптотагмин 1 (Cooper R.L. et al., 1995). Последующие эксперименты были направлены на выявление в нервных окончаниях альфа 1В субъединицы Са2+-канала N-типа (Nurullin L.F. et al., 2011). Применение специфических антител привело к появлению светящихся «пятен» на препарате мышцы дождевого червя. Светящиеся «пятна» образовывали группу, сходную с той, что мы получали при выявлении белков синтаксина и синаптотагмина нервных окончаний (рисунок 7, а). Окраска на наличие Н-АХР (рисунок 7, б). Двойное окрашивание выявило структуры с биполярным свечением (рисунок 7 в). На фото (рисунок 7, г) представлены пятна, имеющие двойное окрашивание. Проведенные эксперименты показывают наличие экспрессии альфа 1В субъединицы Са2+-канала в холинергических синапсах соматической мышцы дождевого червя. Известно, что комплекс белков, обеспечивающий экзо-

эндоцитозный цикл при секреции медиатора, включающий в себя синтаксины, синаптотагмины и Са2+-каналы, располагается в областях A3.

A3 нервных окончаний представляют собой специализированные участки, приспособленные для многофакторного регулирования высвобождения медиатора, посредством экзоцитоза (Зефиров АЛ, Петров A.M., 2010). Так, в нервных окончаниях лягушки территория A3 имеет 0,1 мкм в ширину и 1-2 мкм в длину (складка A3 идет поперек нервной веточки), а расстояние между соседними A3 составляет около 1 - 2 мкм (Harlow L.H. et al., 2001; Зефиров A.J1. и др., 2003; Evans R.M., Zamponi G.W., 2006).

Нервные терминали мыши имеют выпячивания (синаптические бутоны) шириной 2-3 мкм и содержащие 10-20 A3 (Slater C.R., 2008; Nagwaney S. et al., 2009). Свечение белков синтаксина, синаптотагмина и Са2+-каналов занимает примерно, такую же площадь, как и «синаптические бутоны» нервных окончаний, выявляемые с помощью эндоцитозных красителей FM1-43 или FM4-64. Принимая во внимание малые размеры «синаптических бутонов» можно предположить, что пресинаптическая мембрана содержит ограниченное число A3.

Са2+-сенсор в нервно-мышечных синапсах дождевого червя работает по принципу «все или ничего» (Волков М.Е. и др., 2011). Данное обстоятельство может указывать на тесную пространственную связь между Са2+-каналами, Са2+-сенсорными белками и сайтами экзоцитоза в A3 (Meire A. et al., 1999).

, „ at. % Г* 4 v -i 1$ W ttfr Щ

е. "Ч ^ ■ • ? 4 * ^ t

Рисунок 5 - Мышечный препарат дождевого червя (синтаксин 1). Флуоресценция синтаксина 1 (гелий-неоновый лазер, эмиссия 670 нм) - а; TMR-альфа-бунгаротоксин, (гелий-неоновый лазер, эмиссия 577) - б; двойное окрашивание: синтаксин 1 и TMR-альфа-бунгаротоксин (колоколизация светящихся пятен, имеющих только двойное окрашивание) -в. Масштаб для рисунков "а, б, в" - 10 мкм. г - увеличенная часть препарата (1 - окрашивание TMR-альфа-бунгаротоксином, 2 - колоколизация окрашивания на синтаксин 1 и флуоресценции TMR-альфа-бунгаротоксина. Масштаб для рисунка "г" - 1 мкм.

Рисунок 6 - Мышечный препарат дождевого червя (синаптотагмин 1). Флуоресценция синаптотагмина 1 (гелий-иеоновый лазер, эмиссия 670 нм) - а; ТМЯ-альфа-бунгаротоксин (гелий-неоновый лазер, эмиссия 577 нм) - б; двойное окрашивание: синаптотагмин 1 и ТМЯ-альфа-бунгаротоксин (колоколизация светящихся пятен, имеющих только двойное окрашивание) - в. Масштаб для рисунков "а, б, в" - 10 мкм. Г - увеличенная часть препарата (I - окрашивание ТМЯ-альфа-бунгаротоксином, 2 - колоколизация окрашивания на синаптотагмин 1 и флуоресценции ТМЯ-альфа-бунгаротоксина. Масштаб для рисунка "г" - 1 мкм.

а ** С*. ' м % Ж гл , * , * % *« 'щ * б ¡к ♦ 1 *

в ■ * — □ \ * 1 ч» *•> ■

Рисунок 7 — Мышечный препарат дождевого червя (альфа 1В-субъединицы Са2+-канапа Ы-типа). Флуоресценция альфа 1В-субъединицы Са2+-канала 1М-типа (гелий-неоновый лазер, эмиссия 670 нм) - а; ТМИ-альфа-бунгаротоксин (гелий-неоновый лазер, эмиссия 577 нм) - б; двойное окрашивание альфа 1В субъединица Са2+-канала 1\|-типа и ТМЯ-альфа-бунгаротоксин (колоколизйация светящихся пятен, имеющих только двойное окрашивание) - в. Масштаб для рисунков "а, б, в" - 10 мкм. г - увеличенная часть препарата (1 -окрашивание ТМЯ-альфа-бунгаротоксином, 2 - колоколизация окрашивания на Са"+-каналы Ы-типа и флуоресценции ТМЯ-альфа-бунгаротоксина, 3 - окрашивание на Са2*-каналы N1-типа). Масштаб для рисунка "г" - 1 мкм

ВЫВОДЫ

1. Прижизненная окраска нервно-мышечных синапсов с помощью эндоцитозных красителей показала наличие в мышечной стенке дождевого червя группы светящихся «пятен». Данные образования являются кластерами «синаптических бутонов» нервных терминалей аксонов, принадлежащих мотонейронам ганглиев брюшной нервной цепочки.

2. В синаптических образованиях интенсивно протекают процессы экзо- и эндоцитоза даже в состоянии «относительного покоя». Данный везикулярный цикл: потенциал-, К+- и Са2+ зависимый.

3. Прямым количественным методом показано наличие АХ в соматической мышце. Усиление процессов везикулярного цикла увеличивает концентрацию АХ.

4. Концентрация АХ в мышце остается значительной как в состоянии «покоя», так и в условиях блокады рециклирования синаптических везикул в безкальциевых растворах в присутствии Са2+-связывающих буферов.

5. Применение альфа-бунгаротоксина, специфически связывающегося с Н-холинорецепторами, показало их наличие в мышечных клетках. При этом локализация Н-холинорецепторов ограничена исключительно областью постсинаптической мембраны.

6. Методами оптической конфокальной микроскопии, иммуноцитохимически, показана экспрессия белков синаптотагмина 1, синтаксина и альфа 1В субъединицы Са2+-канала N-типа в холинергических нервно-мышечных синапсах соматической мышцы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волков М.Е. Изучение квантово-везикулярной природы секреции ацетилхолина в двигательных нервных окончаниях соматической мускулатуры дождевого червя / М. Е. Волков // Всероссийская конференция «Механизмы адаптации физиологических систем к факторам среды» - Санкт-Петербург, 2010. -С. 26.

2. Volkov М. Е. Mechanisms of carbacholine and GABA action on resting membrane potential and Na/K-ATPase of Lumbricus terrestris body wall muscle /

E.M. Volkov, L.F. Nurullin, M.E. Volkov E.E., Nikolsky, F. Vyskocil // J. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. - 2011. - V.158. - P. 520-524.

3. Волков M.E. Анализ квантово-везикулярной природы секреции возбуждающего медиатора в двигательных нервных окончаниях соматической мускулатуры дождевого червя / M. Е. Волков // 85-Всероссийская студенческая научная конференция - Казань, 2011.-С. 158.

4. Волков М.Е. Изучение везикулярного цикла в нервных образованиях соматической мускулатуры дождевого червя (Lumbricus terrestris). / M.E. Волков, A.M. Петров, E.M. Волков, А.Л. Зефиров // Цитология. - 2011. - Т. 53, № 10. - С. 37-43.

5. Волков М.Е. Прижизненная окраска нервных образований флуоресцентными красителями и оптическое определение ацетилхолина в соматической мышце дождевого червя Lumbricus terrestris. / М.Е. Волков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2012. - Т.153, № 7. - С. 112-115.

6. Волков М.Е. Изучение секреции медиатора в нервных образованиях соматической мускулатуры дождевого червя методами флуоресцентной микроскопии / М.Е. Волков, A.M. Петров А.Л. Зефиров и др. // VIII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» - Судак, 2012. - С. 120-121.

7. Volkov М.Е. Immunocytochemical identification of synaptotagmin 1, syntaxin 1, N-type Ca2+-channel and nicotinic cholinorecetor in motor nerve-muscle junctions in earthworm somatic muscle / M. E. Volkov, E.M. Volkov, L.F. Nurullin // Cell and tissue biology. - 2013. - V.7, №1. - P. 64-71.

8. Волков M.E. Фармакологические особенности постсинаптической чувствительности и механизмы секреции медиатора в нейромоторных синапсах соматической мускулатуры дождевого червя / М.Е. Волков, Л.Ф. Нуруллин, Е.М. Волков // IV съезд фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» - Казань, 2012. - С. 37-38.

9. Волков М.Е. Идентификация ряда белков везикулярного цикла методами флуоресцентной микроскопии в двигательных холинергических нервно-мышечных синапсах соматической мышцы дождевого червя. / М.Е. Волков, Л.Ф. Нуруллин, А.П. Киясов, А.Л. Зефиров, Е.М. Волков // IX Международный

междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» -Судак, 2013.-С. 100.

10. Волков М.Е. Прижизненное оптическое определение содержания ацетилхолина в соматической мышце дождевого червя методами флуоресцентной микроскопии / М.Е. Волков, Е.М. Волков // XXII Съезд физиологического общества имени И.П. Павлова. Волгоград, 2013. - С. 105.

11. Волков М.Е. Морфофункциональная организация синаптических бутонов в соматической мускулатуре дождевого червя / М.Е. Волков, Е.М. Волков // Материалы XII Международной научной школы «Адаптация растущего организма» — Казань, 2014. — С. 24.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

A3 - активная зона;

АХ - ацетилхолин;

АХР - ацетилхолиновый рецептор;

МПП - мембранный потенциал покоя;

Н-АХР - никотиновый ацетилхолиновый рецептор;

O.E. - оптические единицы.

Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага офсетная №1 Печать ИБО. Уч.-изд.л.1,2. Тираж 100 экз.

ЦЕНТР ПЕЧАТИ "Линк". Казань, ул. Карла Маркса, 51