Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы влияния гаммааминомасляной кислоты на мембранный потенциал покоя соматической мускулатуры дождевого червя Lumbricus terrestris

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы влияния гаммааминомасляной кислоты на мембранный потенциал покоя соматической мускулатуры дождевого червя Lumbricus terrestris"

на правах рукописи

Сабирова Айгуль Ринатовна

Механизмы влияния гаммааминомасляной кислоты на мембранный потенциал покоя соматической мускулатуры дождевого червя ЬитЬпсш 1еггеэ»:п8

Специальность 03 00 13 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань 2007

003162817

Работа выполнена в ГУО ВПО «Казанский Государственный Медицинский Университет»

Научный руководитель доктор медицинских наук,

профессор Волков Евгений Михайлович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук,

профессор Зефиров Тимур Львович

доктор биологических наук, профессор Гайнутдинов Халил Латыпович

Ведущая организация - « Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН»

Защита состоится «14 » ноября 2007 г в_часов на заседании диссертационного

Совета Д 208 034 01 при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (420012, Казань, ул Бутлерова, д 49)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» по адресу г Казань, ул Бутлерова, д 49 «б»

Автореферат разослан « » _2007 г

Ученый секретарь

диссертационного Совета, —

доктор биологических наук,

профессор Нигматуллина Р Р

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Согласно современным представлениям, тип кольчатые черви или аннелиды, по эволюционному положению находятся у истоков филогенетической линии первичноротых, таких как членистоногие и моллюски, и возможно хордовых, развитие которых привело к возникновению наиболее высокоорганизованных представителей животного мира Кроме того, кольчатые черви наиболее древняя филогенетическая группа, у которой впервые появляется мускулатура, по строению близко напоминающая поперечнополосатую мускулатуру высших животных, в том числе позвоночных (Давид О Ф , 1990) В этой связи, исследования, направленные на изучение базовых механизмов генерации потенциала покоя и систем их физиологической регуляции на примере дождевого червя, представляют особый интерес, поскольку позволяют создать более полную филогенетическую картину становления основополагающих механизмов электрогенеза в мембране возбудимых клеток животных

Известно, что величина МПП соматических мышечных клеток дождевого червя определяется трансмембранным электрохимическим градиентом основных потенциалобразующих ионов и, прежде всего, ионов К, а также вкладом электрогенного компонента Ма, К-насоса в интегральную величину МПП (Волков Е М, Нуруллин Л Ф , Никольский Е Е, 1999) Вклад электрогенных ионных насосов в величину МПП мышечных клеток дождевых червей является чрезвычайно большим и создается работой уабаинчувствительного Ма, К-насоса Помимо этого, в формировании величины МПП мышечных клеток принимает постоянное участие вторичноактивный Иа, К, С1 котранспорт, изменяющий внутриклеточное содержание ионов С1 Этот транспорт является как уабаин, так и фуросемидчувствительным и осуществляется только при условии наличия в среде всех переносимых им ионов, то есть ионов Ма, К, С1 Мембрана соматических мышечных клеток дождевого червя обладает чувствительностью к КХ и ГАМК Предполагается, что АХ является основным деполяризующим медиатором, а ГАМК основным гиперполяризующим медиатором в нервно-мышечной системе дождевого червя (Волков Е М. Нуруллин Л Ф , Никольский Е Е , 2001)

Однако механизмы гиперполяризующего влияния ГАМК на соматическую мускулатуру дождевого червя, на работу электрогенных ионнотранспортных систем, в том числе и на активность фуросемидчувствительного С1-транспорта, а также роль активного транспорта С1 мышечных клеток дождевого червя в регуляции осмотического гомеостаза остаются неизвестными

Цели и задачи исследования

Целью данной работы явилось изучение механизмов влияния гаммааминомасляной кислоты на мембранный потенциал покоя и ионотранспортные системы соматической мускулатуры дождевого червя, д также уточнение физиологической роли активного транспорта С1~ В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи.

1 Установить тип ГАМК-рецепторов соматической мускулатуры дождевого червя

2 Исследовать внутриклеточные механизмы реализации влияния ГАМК-и адренергических препаратов

3 Определить влияние ГАМКергических и адренергических препаратов на активность хлорного котранспорта

4 Изучить зависимость котранспорта С1 от активности Иа,К—насоса в мышечных клетках дождевого червя

5 Исследовать роль активного транспорта С1 мышечных клеток дождевого червя в регуляции осмотического гомеостаза

Положения, выносимые на защиту

1 ГАМК увеличивает МПП соматической мускулатуры дождевого червя за счет активации работы амперогенных ионных насосов при участии структур, сходных с А- и В-рецепторами позвоночных, с преобладанием последних

2 В соматических мышечных клетках дождевого червя, наряду с Иа,К-насосом, существует активный С1 транспорт, являющийся одним из физиологических механизмов внутриклеточного поддержания осмотического гомеостаза

3 ГАМК, баклофен, адреналин, норадреналин вызывают гиперполяризацию мышечной мембраны дождевого червя только в условиях работы №,К-насоса и активного симпорта С1

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые показано, что постсинаптическая мембрана соматических мышечных клеток дождевого червя содержит гамкергические структуры, аналогичные рецепторам А- и В-типа, с преобладанием последних Подтверждено, что в соматических мышечных клетках дождевого червя, наряду с Ыа,К-насосом, существует трансмембранный электрогенный фуросемидчуствительный С1 транспорт, работа которого создает потенциал, увеличивающий величину МПП Интенсивность работы данной системы напрямую не зависит от активности Ка,К-АТФазы, что указывает на ее функциональную и, возможно, морфологическую самостоятельность. Впервые установлено,

что хлорный транспорт является одним из физиологических механизмов внутриклеточного поддержания осмотического гомеостаза Также показано, что внутриклеточные механизмы реализации влияния адреналина и норадреналина на ионные насосы и МПП практически идентичны действию ГАМК, за исключением собственного адренергического входа

Научно-практическая ценность

Наши исследования показывают, что мышечный препарат дождевого червя является удобной моделью для изучения базовых механизмов работы ГАМК-рецегггоров, а также базовых механизмов электрогенеза в скелетных мышцах высших животных

Также полученные данные позволяют дополнить картину эволюционного становления основных механизмов работы ГАМК-рецепторов Известно, что ГАМК принимает участие в регуляции многих функций организма Установление факта контролирования гамкергической иннервацией МПП мышечных клеток дождевого червя позволит ближе подойти к решению проблемы патогенеза заболеваний, связанных с нарушением функционирования ГАМКергических систем.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговой конференции медико-биологического факультета РГМУ (Москва, 2003), 8-ой Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2004), 78-ой всероссийской студенческой научной конференции, посвященной 190-летию КГМУ (Казань, 2004), конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005), 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006) и 8-ой региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных (Казань, 2006)

Структура и объем диссертации

Диссертация объемом 94 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы Список цитируемой литературы включает 111 источников, из них 86 -иностранных авторов Диссертация содержит 25 рисунков

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на дождевых червях Lumbncus terrestris в осенне-зимний период (с октября по апрель месяц) Свежеприготовленные препараты фрагмента длиной 10-15 сегментов кожно-мускульного мешка помещали в экспериментальную ванночку из оргстекла обьемом 5 мл Эксперименты проводили на поверхностных волокнах продольных мышечных пучков внутренней стороны кожно-мускульного мешка

В качестве основного раствора в опытах с дождевым червем использовали модифицированный раствор Древеса-Пакса [Drewes, Pax, 1974] следующего ионного состава (ммоль/л) Na-163,0, Са-6,0, Cl-93,0, S04-43,0, трис-2,0, сахароза-167,0, осмолярность-478,0 мосмоль/л, ионная сила-229,0 ммоль/л, с рН 7,4 комнатной температуры Применение данного раствора свело к минимуму спонтанно возникающие сокращения соматической мускулатуры дождевого червя Для поддержания рН раствора использовали буфер трис гидрохлорид (фирма «Sigma», США)

При работе использовали также растворы с измененным ионным составом Модификацию состава растворов производили с учетом постоянства их ионной силы и осмолярности В растворах с увеличением ионов К в два или три раза (8 и 12 ммоль/л), соответственно понижали содержание ионов Na В бесхлорных растворах ионы С1~ заменяли на ионы N03 и S04 Бескальциевый раствор содержал увеличенное количество ионов Na Для изучения механизмов влияния ГАМК на МПП и особенностей работы активных ионных транспортных систем в мембране мышечных клеток в данном исследовании применяли следующие препараты адреналин, норадреналин, пропраналол, хлорпромазин (рабочая концентрация для всех 1х10~5 моль/л), баклофен, верапамил, ГАМК. изогувацин, уабаин, факлофен, фуросемид, цис-4-аминокротоновая кислота, D609, N-этилмалеимид, U73122 (рабочая концентрация для всех 1х10~4 моль/л), бикукуллин (5x10-4) (все «Sigma», США)

Внутриклеточное измерение электрических потенциалов на мембране мышечных клеток осуществляли с использованием стеклянных микроэлектродов, заполненных 2,5моль/л раствором КС1 с сопротивлением Мом В каждом мышечном препарате производили по 30-40 измерений МПП Средние значения и стандартные ошибки величины МПП для каждой серии определяли по результатам экспериментов на 4-6 животных Для статистической обработки полученных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента в программе Origin 6 1 (OriginLab Corporation, 1991-2000)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

механизмы гиперполяризующего влияния гамк на потенциал покоя соматических клеток мышечной

стенки дождевого червя шмвыст шшш5

В наших экспериментах добавление в омывающий мышцу раствор ГАМК увеличивает МПП мышечных клеток дождевого червя Данный прирост трансмембранной разности потенциалов весьма значителен и, по нашим данным, приближается к 20% от исходной величины Влияние ГАМК на мышечные клетки реализуется через активацию семейства ГАМКергических рецепторов, к которому относятся рецепторы А-, В- и С-типа [Зефиров АЛ, Ситдикова Г Ф, 2002] Проведенные эксперименты с активаторами ГАМКергических рецепторов позволяют сделать вывод, что мембрана мышечных клеток дождевого червя обладает наибольшей чувствительностью к баклофену - активатору рецепторов В-типа, наименьшей - к изогувацину -селективному агонисту А-рецепторов и совсем не чувствительна к цис-4-аминокротоновой кислоте (С-рецепторы) (табл 1)

Следовательно, мышечная мембрана дождевого червя содержит семейство рецепторов А- и В-типа и не содержит С-рецепторы Возможна и другая трактовка в сарколемме присутствует единая ГАМКергическая рецепторная структура, которая обладает наибольшей аффинностью к баклофену, более слабой - к изогувацину и нечувствительна к цис-4-аминокротоновой кислоте Это относится только к структурам, по своим фармакологическим свойствам сходным, прежде всего, с рецепторами В- и в меньшей степени А-типа Для дальнейшего анализа селективности постсинаптической ГАМКергической чувствительности мышечных клеток были проведены исследования с применением соответствующих антагонистов Так, добавление в раствор бикукулина - неспецифического ингибитора чувствительности к ГАМКергическим препаратам, деполяризует мышечную мембрану Однако факлофен - специфический ингибитор В-рецепторов - не влияет на МПП (табл 1) Установлено, что в интегральной величине МПП мышечных клеток дождевого червя существенную роль играет потенциал, создаваемый работой активных ионных транспортных систем [Волков ЕМ, Нуруллин ЛФ, Никольский ЕЕ, 2001] Гиперполяризующее мембрану влияние ГАМК обусловлено активирующим влиянием на амперогенные ионные насосы [Волков ЕМ, Нуруллин ЛФ, Гришин СП, Зефиров АЛ, 2003] Также известно, что соматические мышечные клетки червя имеют двойную иннервацию возбуждающую (деполяризующую) - с медиатором ацетилхолином и тормозную (гиперполяризующую) - с медиатором ГАМК [Давид ОФ, 1990] Можно предположить, что деполяризующее влияние бикукулина на МПП мышечных клеток обусловлено устранением влияния ГАМКергической иннервации Однако отсутствие влияния факлофена на МПП свидетельствует или о возможном прямом влиянии бикукулина на механизмы, ответственные за генерацию потенциала покоя, или о неспособности факлофена полностью устранить влияние ГАМКергической

иннервации Изогувацин и баклофен в присутствии бикукулина не влияют на МПП мышечных клеток Баклофен на фоне факлофена также неспособен гиперполяризовать мышечную мембрану (табл 1) Следовательно, ГАМКергические структуры постсинаптической мембраны мышечных клеток дождевого червя по фармакологическим свойствам ближе всего к В-рецепторам клеток позвоночных, или, что более вероятно, имеются рецепторы как А-, так и B-типа, но популяция последних преобладает в данном клеточном фенотипе В генерации МПП мышечных клеток дождевого червя существенную роль играют С1~ [.Волков ЕМ, Нуруллин ЛФ, 2001, Volkov ЕМ, Nurullin LE, Svandova I et al, 2000] Рецепторы A-типа сопряжены с С1-каналами, активация которых ГАМК обеспечивает входящий С1-ток, вызывающий гиперполяризацию мембраны [.Зефиров А Л, Ситдикова Г Ф, 2002] Поэтому одним из механизмов влияния ГАМК на МПП может быть изменение хлорной проводимости мембраны Однако более значимую роль в процессе увеличения МПП играет активация ИаД-помпы, в том числе и хлорного котранспорта [ Volkov ЕМ, Nurullin L F, Nikolsky ЕЕ et al, 2003] Рецепторы B-типа, которые, по нашим данным, являются преобладающими, через G белки связаны, в частности, с кальциевыми каналами мембраны {Зефиров АЛ, Ситдикова Г Ф, 2002] Ca играет ключевую роль в передаче сигнала с рецепторов на ионотранспортные системы [Волков Е М, Нуруллин Л Ф, Обухова АС и др, 2002] В наших экспериментах баклофен в бескальциевом растворе оказался неэффективным (табл. 1), что подтверждает данное мнение Верапамил - блокатор Са-каналов также препятствует влиянию баклофена на МПП Полученные данные позволяют предположить, что пусковым механизмом в активации ионных насосов является вход Ca Входящий Са-ток вызван активацией ГАМКергических рецепторов, предположительно, B-типа Обязательным звеном между ГАМК-рецепторами В типа и Са-каналами являются G-белки [Зефиров А Л, Ситдикова Г Ф, 2002] Присутствие в среде "деструктора" G-белков N-этилмалеимида [Shapiro MS, Wollmuth LP, Hille В, 1998] деполяризует мышечную мембрану Баклофен на фоне N-этилмалеимида утрачивает способность влиять на МПП При этом МПП оказывается сниженным Эксперименты с N-этилмалеимидом, как и опыты с бикукулином, подтверждают гипотезу о важной роли ГАМКергической иннервации в поддержании МПП мышечных клеток дождевого червя Препараты U73122 (блокатор PI-фосфолипазы С [Ralevic V, Burns took G ,1998]), D609 (блокатор РС-фосфолипазы С [Balboa MA , Insel PA , 1998]), хлорпромазин (ингибитор кальмодулина [Сергеев TIB, Шимановский НЛ, Петров В И, 1999]), взятые по отдельности, не влияют на МПП мышечных волокон Присутствие в растворе U73122 или D609 не устраняют гиперполяризации, тогда как хлорпромазин снимает действие баклофена на МПП мышечных клеток Увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ или цГМФ не увеличивает МПП мышечных клеток дождевого червя [Волков Е М, Нуруллин Л Ф, Обухова А С и др, 2002] Следовательно, в

цепи процессов передачи внутриклеточного сигнала с ГАМКергических рецепторов на ионные насосы не вовлечены аденилат- и гуанилатцикдазные системы, а также пути, связанные с синтезом ионизитолтри-фосфата и диацилглицерола, тогда как значительную роль играет кальмодулин или подобные ему кальцийакцепторные белки

Таким образом, постсинаптическая мембрана соматических мышечных клеток дождевого червя содержит ГАМКергические структуры, аналогичные рецепторам А- и В-типа, с преобладанием последних Активация В-рецепторов при посредничестве в-белков обеспечивает вход Са из межклеточных пространств в цитоплазму клетки с последующим вовлечением в процесс кальмодулина или подобных ему белков, обеспечивающих активацию амперогенных ионных насосов, что выражается в увеличении трансмембранной разности потенциалов Данный механизм не исключает возможности увеличения МПП под действием активации А-репепторов, обеспечивающих входящий хлорный ток Можно утверждать, что МПП мышечных клеток дождевого червя в значительной степени контролируется ГАМК-ергической иннервацией

Таблица 1 Влияние ГАМК, баклофена, бикукуллина, верапамила, изогувацина, факлофена, хлорпромазина, отсутствия Са2+, цис-4-аминокротоновой йислоты, Б609, ТЯ-зтилмалеимида, 1173122 на МПП соматических мышечных клеток дождевого червя __

Условия эксперимента МПП, мВ,(М±т) Число клеток

Контроль 48 7±0 6 400

ГАМК, 1х10-4 моль/л 58 1±0 8* 240

Баклофен, 1x10-4 моль/л 61 0±0 9* 160

Изогувацин, 1х10-4моль/л 52 4± 0 9* 160

Цис-4-аминокротоновая кислота, 1x10-4 моль/л 51 3±1 1 160

Бикукулин, 5x10-4 моль/л 42 5±1 0* 160

Бикукулин, 5x10-4 моль/л+баклофен, 1x10-4 моль/л 49 2+1 0 120

Бикукулин, 5х 10-4 моль/л+изогувацин, 1х10-4 моль/л 46 3±1 1 120

Факлофен, 1 х Ю-4 моль/л 48 6±1 2 160

Баклофен,ЪсЮ-4 моль/л+факлофен,1х10-4 моль/л 47 1±1 1 160

Хлорпромазин, 1х10-4 моль/л 48 0±0 9 120

Ы-этилмалеимид,1х Ю-4 моль/л 43 0±1 2 * 120

1173122, 1х10-4 моль/л 51 1±1 0 120

0609, 1 х10-4 моль/л 49 2±1 2 120

Баклофен, 1x10-4 моль/л в среде без Са2+ 49 8±1 0 120

Баклофен, 1 х10-4 моль/л+верапамил, 1х10-4 моль/л 48 5±1 2 120

Баклофен, 1х10-4 моль/л+хлорпромазин, 1х10-4 моль/л 49 1±1 1 120

Баклофен, 1 х 10-4 моль/л+И-этилмалсимид, 1х10-4 моль/л 44 1 ±1 1* 120

Баклофен, 1 х10-4моль/л+0609, 1х10-4 моль/л 60 5±0 9* 120

Баклофен, 1 х 10- 4 моль/л +1173122, 1 х 10-4 моль/л 59 9±0 9* 120

Примечание, *-величины, статистически значимо отличающиеся от контроля (контроль - значения МПП в стандартном растворе) даны средние значения ± стандартные ошибки величины МПП в мВ, п - число исследованных клеток (в каждой серии мышцы от 4 - 6 животных)

9

РОЛЬ КОТРАНСПОРТА ИОНОВ ХЛОРА В РЕГУЛЯЦИИ ПОТЕНЦИАЛА ПОКОЯ И ОСМОТИЧЕСКОГО ГОМЕОСТАЗА СОМАТИЧЕСКИХ МЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК ДОЖДЕВОГО ЧЕРВЯ

Согласно результатам наших экспериментов присутствие в растворе уабаина - ингибитора №,К-АТФазы, или фуросемида - блокатора вторичноактивного котранспорта С1, либо удаление из раствора С1 примерно в равной степени снижают МПП мышечных клеток Инактивация Ыа,К-помпы изъятием из раствора Иа приводит к аналогичным последствиям, тогда как блокада натриевой или хлорной проводимости не влияет на МПП [Волков ЕМ, Нуруллин ЛФ, Никольский ЕЕ, 2001] Таким образом, работа уабаинчувствительного и фуросемидзависимого ионного насоса создает потенциал, который в состоянии покоя (нормальная ионная среда) составляет около 10% от суммарной величины МПП [Волков Е М, Нуруллин Л Ф, Никольский Е Е , 2001] Полученные данные создают впечатление о том, что противотранспорт Ыа и К, с одной стороны, и симпорт С1, с другой, осуществляются единым молекулярным субстратом, способным быть активным только в присутствии всех трех потенциалобразующих ионов, а именно К и С1 Однако такой взгляд противоречит общепринятой концепции, в соответствии с которой противотранспорт ИаиКи симпорт Иа, К и 2С1 осуществляется разными транспортными системами и независимо друг от друга, по крайней мере, у позвоночных животных [Уразаев А X , 1998, АкЖш С С , 1989] Двукратное увеличение [К+] в растворе снижает МПП мышечных клеток, однако дальнейшее увеличение [К+] уже не влияет на величину потенциала покоя (рис 1, табл 2) Кривая зависимости величины МПП от [К4] в растворе в бесхлорной среде практически параллельна таковой в присутствии С1, но со смещением в сторону деполяризации почти на одни и те же величины около 5 мВ (рис 1, табл 2) Фуросемид также смещает график зависимости МПП от [К+] в растворе в сторону меньших значений (рис 1, табл 2) и данная кривая очень близка предыдущей и статистически значимо от нее не отличается В присутствии же уабаина данная зависимость приобретает иной характер (рис 1) Так, смещение в сторону деполяризации в нормальном растворе [К+] - 4 ммоль/л составляет в среднем 10%, [К"] - 12 ммоль/л - 28% от исходной величины Графики зависимости МПП от [К+] в растворе в условиях инактивации №,К-насоса уабаином либо удалением из раствора На [Волков Е М, Нуруллин Л Ф , Никольский Е Е , 2001] фактически идентичны и, только в этом случае, приближаются к классической зависимости в соответствии с моделью потенциала покоя Гольдмана - Ходжкина - Катца [Волков Е М, Нуруллин Л Ф , Никольский Е.Е , 2001] Ионы К оказывают на МПП двоякое влияние Увеличение экстраклеточной [К+] снижает электрохимический градиент и, тем самым деполяризует мембрану, с другой стороны, К активирует ИаД-АТФазу, увеличивает вклад «насосного» потенциала в МПП В условиях нашего эксперимента «насосная»

составляющая практически полностью компенсирует калиевую деполяризацию мембраны, возрастая по мере увеличения внешней [К+] (рис 1) Таким образом, если в условиях «покоя» [К+] - 4 ммоль/л блокада №+,К+-насоса и транспорта СГ приводят к деполяризации мембраны одинаковой выраженности, то при мобилизации активности Ыа+,К+-АТФазы увеличением [К+] - 12 ммоль/л, вклад электрогенных антипорта № и К и симпорта С1 в величину МПП становится различимым (рис 1) Вклад уабаинчувствительного насоса составляет около 28%, тогда как С1 и фуросемидзависимого транспорта только 9% от исходной величины, то есть почти втрое меньше Полученные данные позволяют предположить, что активный трансмембранный перенос СГ напрямую не зависит от активности Ыа,К-помпы и, как у позвоночных животных, противотраиспорт N3 и К и симпорт С1 осуществляются отдельными транспортными системами [УразаевАХ, 1998, Агскт СС, 1989] Это, в свою очередь, предполагает наличие, как минимум, хлоракгивируемой субъединицы в составе интегрального белка «транспортера» [Драбкина Т М, Кривой И И , 2004], либо морфологически самостоятельной ферментативной структуры

Известно, что в мышечных волокнах позвоночных симпорт С1 принимает участие в регуляции внутриклеточного водного гомеостаза [Ситдиков Р Ф, Уразаев А X, Волков Е М, Полетаев Г.И, Хамитов X С, 1991] Увеличение осмотического давления активирует, а его уменьшение, наоборот, снижает активность электрогенного транспорта СГ В наших исследованиях увеличение вдвое осмотического давления вызывает гиперполяризацию мембраны В присутствии фуросемида в растворе увеличение МПП под действием гиперосмотического раствора не наблюдается Гипоосмотический раствор, наоборот, деполяризует мембрану Фуросемид не устраняет этот эффект и не усугубляет снижение МПП Можно думать, что транспорт С1 наряду с участием в поддержании величины МПП, является компонентом системы внутриклеточной осморегуляции, которая у дождевого червя более выражена по сравнению с таковой в мышцах позвоночных

Проведенные эксперименты позволяют сделать следующее заключение В соматических мышечных клетках дождевого червя наряду с Иа,К-насосом существует активный трансмембранный электрогенный

фуросемидчувствительный С1 транспорт, работа которого создает потенциал, увеличивающий величину МПП Интенсивность работы данной системы напрямую не зависит от активности ЫаД-АТФазы, что указывает на ее функциональную и, возможно, морфологическую самостоятельность Гиперосмотические растворы усиливают, а гипоосмотические, наоборот, ингибируют трансмембранный СГ перенос, что, в свою очередь, отражается в увеличении или, соответственно, уменьшении величины МПП мышечных клеток Можно думать, что хлорный транспорт, как и у позвоночных животных [Ситдиков Р Ф , Уразаев А X, Волков Е М, Полетаев Г И., Хамитов X С 1991, Уразаев А X 1998], является одним из физиологических механизмов внутриклеточного поддержания осмотического гомеостаза

[К+], ммоль/л

Рисунок 1. Зависимость величины МГ1П мышечных клеток дождевого червя от [К1], в бесхлорных растворах, в присутствии фуросемида (ЛхЮ"4 ммоль/л), в присутствии уабаина (1x10"4 ммоль/л).

По оси абсцисс - величина МПП в мВ, по оси ординат - [К"] в ммоль/л.

Таблица 2. Влияние изменения [К+]. [СГ], увеличения или уменьшения концентрации сахарозы, уабаина или фуросемида на величину мембранного потенциала покоя (МПП) соматических мышечных клеток дождевого червя.

Условия эксперимента МПП (мВ) М±ш п Р

[Кч]=4 ммоль/л, контроль 48,710,6 600

[К+]"8 ммоль/л 44.910,9 180 0,01

[К ]-12 ммоль/л 46,3+1,1 180 0,05

[Ю]=4 ммоль/л + уабаин (1x10"4 моль/л) 43,110.9 80 0.01

[К"]=8 ммоль/л + уабаин (1x10"4 моль/л) 43,710,9 80 0,01

[К+]=12 ммоль/л + уабаин (1x10" моль/л) 33,411,0 80 0,001

[К+]=4 ммоль/л + фуросемид (1x10"4 моль/л) 43,0+0,9 80 0,01

[К"]=8 ммоль/л + фуросемид (1x10^ моль/л) 44,2+0,9 80 0,01

[К_}=12 ммоль/л + фуросемид (1х104 моль/л) 42,110,9 80 0,01

[К+]=4 ммоль/л, [СГ]=0 ммоль/л 44,410,9 80 0,01

[К*]=8 ммоль/л, [СГ]=0 ммоль/л 39,9+1,1 80 0,001

[КГ]^12 ммоль/л, [СГ]=0 ммоль/л 40,6+0,9 80 0,001

[К"]=4 ммоль/л, сахароза (334 ммоль/л) 56,7±0,9 120 0,01

[К ]=4 ммоль/л, сахароза (334 ммоль/л) ■+ фуросемид (1 х 10 4 моль/л) 50,7+0,9 80

[К*]=4 ммоль/л, сахароза (84 ммоль/л) 45,710,9 100 0,01

[К+]=4 ммоль/л, сахароза (84 ммоль/л) + фуросемид (1x104 моль/л) 43,711,1 80 0,01

Примечание даны средние значения ± стандартные ошибки величины МПП в мВ, п - число исследованных клеток (в каждой серии мышцы от 4 - 6 животных), Р - достоверность по отношению к контролю

ВЛИЯНИЕ ГАМКЕРГИЧЕСКИХ И АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА АКТИВНОСТЬ ^Ж-НАСОСА И КОТРАНСПОРТА СЬ В СОМАТИЧЕСКИХ МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ ДОЖДЕВОГО ЧЕРВЯ ШМВЫСШ ТЕЯКЕБТШЗ

По нашим данным ГАМК и баклофен увеличивают МПП мышечных клеток дождевого червя, причем последний агент был более эффективен Данное влияние связано с активацией рецепторов преимущественно В-типа [Волков ЕМ, Сабирова АР, Гришин СН, Зефиров АЛ 2005, Зефиров АЛ, Ситдикова Г Ф, 2002], последующим входом в клетку Са, который приводит к усилению работы электрогенных ионных насосов при посредничестве кальмодулинподобных внутриклеточных систем [Волков Е М Нуруллин Л Ф, Обухова А С и др 2002, Волков Е М, Сабирова А Р, Гришин С Н, Зефиров АЛ 2005] В мембране мышечных клеток дождевого червя наряду с №К-антипортом имеется активный С1-симпорт, их работа непосредственно влияет на интегральную величину МПП, создавая так называемый "насосный" потенциал [Волков ЕМ, Нуруллин ЛФ, Никольский ЕЕ 2001, Го1коу ЕМ, ШгиПт ЬР, ИгкоЬку ЕЕ еГ а1, 2003] Остается неясным, что является объектом дополнительной активации ИаД-АТФаза или механизм хлорного переноса Выключение хлорного транспорта соразмеримо с влиянием уабаина - ингибитора №,К-АТФазы ГАМК в присутствии фуросемида, как и уабаина [Волков ЕМ, Нуруллин ЛФ, Гришин С Н, Зефиров А Л 2003, Волков Е М, Сабирова А Р, Гришин С Н, Зефиров А Л, 2005], утрачивает возможность увеличивать МПП Фуросемид или удаление из раствора С1 устраняет способность баклофена гиперполяризовать мышечную мембрану Можно предположить, что активность симпорта С1 является обязательным условием для способности ГАМК и баклофена гиперполяризовать мышечную мембрану Доля "насосного" потенциала в величине МПП, создаваемого симпортом С1, сравнительно невелика по сравнению со способностью ГАМК и баклофена увеличивать МПП [Волков ЕМ, Сабирова АР, Гришин СН, Зефиров АЛ, 2005] Его величина относительно постоянна и напрямую не зависит от степени активности Иа,К-АТФазы Активность ШД-насоса зависит от концентрации К в растворе и при 12 ммоль/л К приближается к своему максимуму [Волков Е М, Нуруллин Л Ф, Никольский Е Е 2001] На этом фоне потенциал покоя под действием ГАМК и баклофена не меняется Адреналин и норадреналин (в большей степени) также гиперполяризуют мембрану соматических мышечных клеток дождевого червя [Волков ЕМ,

Нуруллин ЛФ, Блохина ГИ, Никольский ЕЕ, 2002] Внутриклеточные механизмы реализации влияния катехоламинов на ионные насосы и МГПТ практически идентичны действию ГАМК [.Волков ЕМ Нуруллин ЛФ, Обухова АС и др 2002, Волков ЕМ, Сабирова АР, Гришин СН, Зефиров АЛ, 2005], за исключением собственного адренергического рецепторного входа [Волков ЕМ, Нуруллин ЛФ, Блохина ГИ, Никольский Е Е, 2002, Волков ЕМ Нуруллин Л Ф, Обухова А С идр 2002] Присутствие фуросемида устраняет способность адреналина и норадреналина влиять на МПП, как и в случае с ГАМК и баклофеном Устранение из раствора любого потенциалобразующего иона приводит к инактивации ионных насосов соматических мышечных клеток дождевого червя Блокатор ГАМКергических рецепторов широкого спектра действия бикукуллин снижает МПП мышечных клеток На его фоне норадреналин гиперполяризует мышечную мембрану (табл 3), что подтверждает специфичность рецепторного входа адреномиметиков В то же время, бета-адреноблокатор пропранолол не влияет на МПП, но устраняет действие норадреналина и баклофена (табл 3) Можно предположить, что в адренергических и ГАМКергических механизмах влияния на МПП с единым внутриклеточным путем реализации имеется звено, на которое способны влиять адреноблокаторы типа пропранолола Однако данный феномен требует специального исследования

Таким образом, ГАМК, баклофен, адреналин и норадреналин способны гиперполяризовать мышечную мембрану только в условиях работающих электрогенных Na,K-Hacoca и активного симпорта С1 Объектом воздействия ГАМКергических и адренергических механизмов, вероятно, является Na,K-АТФаза, поскольку в условиях ее максимальной активации данные вещества утрачивают способность влиять на МПП Обязательным условием реализации влияния является сохраненная активность С1-симпорта Можно предположить, что в условиях его инактивации происходит стехиометрическая перестройка переноса ионов транспортными системами, которые утрачивают амперогенность Это приводит к потере "насосного" потенциала в величине МПП и, следовательно, к утрате возможности быстрого влияния на него посредством активации электрогенеза ионной помпы

Таблица 3 Влияние ГАМК, баклофена, адреналина, норадреналина, уабаина, фуросемида, бикукуллина, пропранолола, увеличения концентрации в растворе К, удаления из раствора С1 на МПП соматических мышечных клеток дождевого червя

Условие эксперимента МПП,мВ п

Контроль 48 7±0 6 400

ГАМК, 1х10-4 моль/л 58 0±0 8 80***

Баклофен, 1x10-4 моль/л 61 0±0 9 80***

Фуросемид, 1x10-4 моль/л 45 0±0 6 80*

ГАМК, 1х10-5 моль/л+фуросемид, 1х10-4 моль/л 44 0±0 5 80*

Баклофен, 1x10-4 моль/л+фуросемид, 1х10-4 моль/л 47 3±0 4 80

[С 11=0 ммоль/л 45 4±1 1 100*

Баклофен, 1х10-4моль/л+[С1~1=0 ммоль/л 46 0±1 2 80

ГК]=12 ммоль/л 46 3±1 1 120

[К]=12 ммоль/л+ГАМК, 1x10-" моль/л 46 8±0 9 80

[К]=12ммоль/л+баклофен, 1 х 10-4 моль/л 45 9±0 7 80

Уабаин, 1х10-4 моль/л 44 8+0 9 100*

[К]=12 ммоль/л+уабаин, 1x10-4 моль/л 33 6±0 9

Адреналин, 1х Ю-5 моль/л 52 2±0 9 140**

Норадреналин, 1х Ю-5 моль/л 55 8±1 1 80***

Адреналин, 1 х 10-5моль/л+фуросемид, 1х 10-4 моль/л 49 8±0 8 80

Норадреналин, 1x10-5 моль/л+фуросемид, 1x10-4 моль/л 47 0±0 5 80

Пропранолол, 1 х10-5 мопь/л 80 1±1 2 80

Пропранолол, 1 х Ю-5 моль/л+баклофен, 1x10-5 моль/л 50 1±1 2 80

Бикукуллин, 1х10-4моль/л 43 0±1 1 80**

Бикукуллин,1х10-4 моль/л+норадреналин, 1x10-5 моль/л 53 0±1 2 80***

Примечание даны средние значения ± стандартные ошибки величины МПП в мВ, и - число исследованных клеток (в каждой серии мышцы от 4 - 6 животных *р<0 05 **р<0 01, ***р<0 001 по сравнению с контролем, п -число исследованных клеток

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование посвящено изучению механизмов влияния ГАМК на соматическую мускулатуру дождевого червя, на работу электрогенных ионотранспортных систем, в том числе и на активность фуросемидчувствительного С1-транспорта, а также роли активного транспорта С Г мышечных клеток дождевого червя в регуляции осмотического гомеостаза

Проведенные эксперименты с активаторами ГАМКергических рецепторов позволяют сделать вывод, что мышечная мембрана дождевого

червя содержит семейство рецепторов А- и B-типа и не содержит С-рецепторы

В генерации МПП мышечных клеток дождевого червя существенную роль играют ионы С1 [.Волков ЕМ, Нуруллин Л Ф ,2001, Volkov EM, Nurullin LE, Svandova I et al, 2000] Рецепторы А-типа сопряжены с С1-каналами, активация которых ГАМК обеспечивает входящий С1-ток, вызывающий гиперполяризацию мембраны [Зефиров АЛ, Ситдикова ГФ 2002] Поэтому, одним из механизмов влияния ГАМК на МПП может быть изменение хлорной проводимости мембраны Однако более значимую роль е. процессе увеличения МПП играет активация Na.K-помпы, в том числе н хлорного котранспорта [Volkov ЕМ, Nurullin ЕЕ, Nikolsky ЕЕ et al 2003] Рецепторы B-типа, которые, по нашим данным, являются преобладающими., через G белки связаны, в частности, с кальциевыми каналами мембраны [Зефиров АЛ, Ситдикова ГФ 2002] Ca играет ключевую роль в передаче сигнала с рецепторов на ионотранспортные системы [Волков ЕМ, Нуруллин Л Ф, Обухова АС и др 2002] Полученные данные позволяют предположить, что пусковым механизмом в активации ионных насосов является вход Ca Входящий Са-ток вызван активацией ГАМКергических рецепторов предположительно B-типа Обязательным звеном между ГАМК-рецепторами B-типа и Са-каналами являются G-белки [Зефиров АЛ, Ситдикова ГФ 2002] Присутствие в среде "деструктора" G-белков N-этилмалеимида [Shapiro MS, Wollmuth LP, Hille В 1998] деполяризует мышечную мембрану Так как увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ или цГМФ не увеличивает МПП мышечных клеток дождевого червя [Волков Е М, Нуруллин Л Ф, Обухова А С и др 2002], следовательно, в цепи процессов передачи внутриклеточного сигнала с ГАМКергических рецепторов на ионные насосы не вовлечены аденилат- и гуанилатциклазные системы, а также пути, связанные с синтезом инозитолтри-фосфата и диацилглицерола, тогда как значительную роль играет кальмодулин или подобные ему кальцийакцепторные белки

В соматических мышечных клетках дождевого червя наряду с Na,K-насосом существует активный трансмембранный электрогенный фуросемидчувствительный С1 транспорт, работа которого создает потенциал, увеличивающий величину МПП Интенсивность работы данной системы напрямую не зависит от активности Ыа,К-АТФазы, что указывает на ее функциональную и, возможно, морфологическую самостоятельность Гиперосмотические растворы усиливают, а гипоосмотические, наоборот, ингибируют трансмембранный С1 перенос, что, в свою очередь, отражается в увеличении или, соответственно, уменьшении величины МПП мышечных клеток Можно думать, что хлорный транспорт, как и у позвоночных животных [Ситдиков Р Ф , Уразаев А X, Волков Е М, Полетаев Г И, Хамитов X С 1991, Уразаев А X 1998], является одним из физиологических механизмов внутриклеточного поддержания осмотического гомеостаза

выводы

1. ГАМК способна увеличивать мембранный потенциал покоя соматических мышечных клеток дождевого червя за счет активации работы мембранных амперогенных ионных насосов

2. Чувствительность мышечной мембраны к ГАМК обеспечивается при участии структур, сходных с А- и В-рецепторами позвоночных, с преобладанием последних

3. Внутриклеточная передача сигнала с ГАМК-ергических рецепторов на ЫаД-АТФазу возможна лишь в присутствии в среде ионов кальция и устраняется деструкторами в-белков, блокаторами кальциевых каналов и ингибиторами кальмодулина

4 В соматических мышечных клетках дождевого червя, наряду с Иа,К-насосом, существует вторичноактивный трансмембранный электрогенный фуросемидчувствительный хлорный котранспорт Вклад последнего в величину МПП напрямую не зависит от степени активности №,К-АТФазы

5. Активность трансмембранного хлорного переноса зависит от осмолярности среды, что указывает на его роль в механизмах внутриклеточного поддержания осмотического гомеостаза.

6. ГАМК и адреномиметики способны гиперполяризовать мышечную мембрану только при условии активного симпорта ионов хлора

7. Внутриклеточные механизмы передачи сигнала с мембранных рецепторов на №,К-АТФазу практически идентичны, где запускающим механизмом является вход экстраклеточных ионов кальция Различия определяются только на уровне автономных (ГАМК-ергических и адренергических) мембранных рецепторных структур

8. Объектом воздействия ГАМК-ергических и адренергических агонистов в соматических мышечных клетках дождевого червя является №,К-АТФаза, а не хлорный симпорт

9. Возбудимость соматических мышечных клеток дождевого червя находится под влиянием двойной холинергической и ГАМК-ергической иннервацией, где ГАМК претендует на роль основного гиперполяризующего медиатора

Список опубликованных работ по теме диссертации

1 Гришин СН Влияние блокаторов пуринорецепторов на параметры спонтанных синаптических ответов соматических мышечных клеток дождевого червя / Гришин С Н , Сабирова АР// Журнал российского государственного университета Материалы конференции медико-биологич Факультета РГМУ - М, 2004 -С 183

2 Волков Е М Влияние ГАМК на мембранный потенциал покоя соматических мышечных клеток дождевого червя / Волков Е М, Гришин С Н., Нуруллин Л Ф , Сабирова А Р , Зефиров АЛ// Сборник

тезисов 8-я междунар Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология-наука21-говека" - Пущино, 2004 -С 78

3 Латыпова В Т Выявление подтипа GABA - рецептора соматических клеток дождевого червя / Латыпова В Т, Омарова П К, Сабирова А.Р // Сборник тезисов 78-ая всероссийская студенческая научная конференция, посвященная 190-летию КГМУ -Казань, 2004 - Т 1 -С 59

4 Волков Е М Сравнительный анализ внутриклеточных механизмов действия норадреналина и ГАМК на ионные насосы мембраны соматических мышечных клеток дождевого червя / Волков ЕМ, Нуруллин Л Ф, Сабирова АР, Обухова АС // Материалы конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» - Пущино -

2005 -С 115-116

5 Волков Е М Механизмы гиперполяризующего влияния ГАМК на потенциал покоя соматических клеток мышечной стенки дождевого червя / Волков ЕМ, Сабирова АР, Гришин СН, Зефиров АЛ// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - М, 2005 -Т 139.-№ 2 -С 219-222

6 Сабирова АР Влияние баклофена и ГАМК на активность ионных насосов мембраны соматических мышечных клеток дождевого червя / Сабирова А Р, Гришин С Н, Волков ЕМ// Вестник молодых ученых Тезисы всероссийской конференции молодых исследователей - С -Пб, 2005-С 102

7. Нуруллин ЛФ Механизмы чувствительности к нехолинергическим медиаторам мембраны соматических мышечных клеток дождевого червя / Нуруллин Л Ф , Сабирова АР , Волков ЕМ// Сборник тезисов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых -Пущино -

2006 -С 157

8 Волков ЕМ Влияние ГАМКэргических препаратов на активность Na/K - насоса и котранспорта С1 в соматической мышечной клетке дождевого червя / Волков Е М , Сабирова А Р , Нуруллин Л Ф, Гришин СН, Зефиров АЛ// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -М 2006 -Т 141 -№5 -С 572-574

9 Волков Е М Роль котранспорта иона С1 в регуляции МПП и осмотического гомеостаза соматической мускулатуры дождевого червя 1 Волков Е М, Нуруллин Л Ф , Сабирова А Р , Зефиров АЛ// Доклады академии наук - 2006 -Т 406 -№1 -С 118-120

10 Nurullin L Mechanisms of sensivity to noncholmergic mediators of membrane of somatic muscle cells of earthworm/ Nurullin L, Volkov M, Sabirova A , Volkov E // 8 East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, Kazan, September 13-17, 2006 - P 56

11 Sabirova A Influence of agonists and antagonists of GABA-receptors on value of resting membrane potential of somatic muscle cells of earthworm/ Sabirova A, Volkov M, Nurullin L, Volkov E // 8 East European

Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, Kazan, September 13-17,2006 - P 65

12 Волков EM Функциональная неоднородность «транспортера» электрогенного ионного насоса мембраны соматических мышечных клеток дождевого червя / Волков Е М, Сабирова А Р , Нуруллин JIФ , Зефиров A JI // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2006 -Т 142 -№12 -С 678-680

13 Сабирова АР Регуляция амперогенных ионных насосов соматических мышечных клеток дождевого червя / Сабирова А Р, Волков М Е, Волков ЕМ // Сборник тезисов 10 съезда физиологического общества им И П Павлова -М, 2007 - С 402

Общий объем публикаций 1,37 у п л, в том числе авторский вклад 0 5 у п л

Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать ризографическая Печл 1,06

Тираж 125 Заказ № 1175_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «GulaPrmt» 420073, г Казань, ул А Кутуя, 88