Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b

Попова, Надежда Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

на правах рукописи

Попова Надежда Викторовна

Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером ТШР8Ь

специальность-03.01.03-молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 6 Ос В

Москва 2012

005009933

биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН)

Научный руководитель

Официальные оппоненты

доктор химических наук, руководитель лаборатории клеточной биологии рецепторов ИБХ РАН Петренко Александр Георгиевич

кандидатфиз.-мат. наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточной биологии рецепторов ИБХ РАН Деев Игорь Евгеньевич

доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории клеточных взаимодействий ИБХ РАН Сапожников Александр Михайлович

доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярной онкогенети ки ИБГ РАН Коробко Игорь Викторович

Ведущая организация: Московский государственный университет имени

М.В. Ломоносова

Защита состоится «14» марта 2012 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. .

Автореферат разослан « і » февраля 2012 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, доктор физико-математических наук

Актуальность проблемы

Эндоцитоз является фундаментальным процессом, обеспечивающим поступление в цитоплазму внеклеточных или расположенных на мембране макромолекул. Эндоцитоз необходим для поступления в клетку питательных веществ, регуляции активности трансмембранных рецепторов, а также рециркуляции синаптических пузырьков. Основным механизмом, по которому происходит интернализация липидов, белков и макромолекул, является клатрин-опосредованный эндоцитоз.

При передаче сигнала для обеспечения цикличности процесса требуется баланс двух явлений - экзоцитоза и эндоцитоза. Экзоцитоз необходим для выброса нейромедиатора в синаптическую щель. В свою очередь, эндоцитоз требуется как для поддержания постоянства поверхности пресинаптической мембраны и повторного заполнения синаптических пузырьков нейромедиатором, так и для повторной активации рецепторов постсинаптической мембраны. Эндоцитоз синаптических пузырьков после сильной стимуляции нейромышечного синапса происходит по клатрин-зависимому механизму.

При эндоцитозе активированных рецепторов по клатрин-зависимому механизму с рецептором взаимодействуют различные белки-адаптеры, в частности адаптерный комплекс АР-2, которые опосредуют связывание мембранных белков с молекулами клатрина, образующими оболочку пузырька. На настоящий момент известны многие адаптерные белки, принадлежащие к разным классам.

Хотя механизм эндоцитоза в общих чертах известен, постоянно появляются новые данные о регуляции этого процесса, и поиск и изучение новых адаптерных белков, которые могут обеспечивать направленность процесса, является актуальной на сегодняшний день задачей.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлся поиск и идентификация белков, взаимодействующих с адаптерным белком ТК1Р8Ь, а также дальнейшая характеристика этого взаимодействия. Первоначальный поиск показал, что мажорным белком, связывающимся с ТШР8Ь, является клатрин, поэтому были сформулированы следующие задачи:

1. Найти в молекуле ТШР8Ь структурные детерминаты, отвечающие за связывание с клатрином;

2. Получить очищенные препараты клатрина и ТШР8Ь, чтобы подтвердить их прямое взаимодействие;

3. Подтвердить совместную локализацию ТШР8Ь и клатрина с использованием живых клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы

Были найдены и идентифицированы 16 белков и белковых комплексов, взаимодействующих с ТШР8Ь, и показано, что клатрин и субъединицы адаптерного комплекса АР-2 являются мажорными белками в элюатах с ТШР8Ь-Сефарозы. Проведены эксперименты, подтверждающие, что белок ТЯ1Р8Ь напрямую взаимодействует с клатрином. Так, компьютерным анализом аминокислотной последовательности ТШР8Ь было выявлено два потенциальных сайта связывания с тяжёлой цепью клатрина, а эксперименты по связыванию очищенного клатрина и мутантов ТШР8Ь, в которых аминокислотные остатки этих сайтов были заменены остатками аланина, подтвердили, что такая замена приводит к нарушению связывания. Также была выделена фракция клатрин-покрытых пузырьков и обнаружено, что ТРЯР8Ь присутствует в этой фракции. Полученные данные указывают на независимое взаимодействие ТШР8Ь с клатрином и мембранными белками, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка. Таким образом, способность ТЖР8Ь взаимодействовать как с клатрином, так и с мембранными белками позволяет предполагать, что ТЯ1Р8Ь может осуществлять регуляцию поверхностной экспрессии этих белков за счет модуляции клатрин-опосредованного эндоцитоза.

Полученные в рамках настоящей работы результаты способствуют расширению представлений об участвующих в клатрин-опосредованном эндоцитозе белках-адаптерах, и результаты данной работы могут быть использованы при дальнейшем исследовании механизмов эндоцитоза.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.

Апробация работы

Результаты настоящего исследования были представлены на следующих российских и международных конференциях: на 12-й и 13-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2008 и 2009); на XXI зимней молодежной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009); на XVI международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009); на Международной научной конференции, посвящённой 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); на IV и V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009; Петрозаводск, 2011); на XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Гурзуф, 2010); на 40-й ежегодной конференции Общества по нейронаукам (США, Сан-Диего, 2010).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах; содержит

£9 рисунков и 1 таблицу; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка, включающего 16S>~ наименований.

Связывание TRIP8b с С-концевой частью рецептора CIRL

Ранее в нашей лаборатории был проведён поиск внутриклеточных молекулярных партнеров рецептора CIRL с помощью дрожжевой SR-системы (SOS recruitment system). Скрининг позволил выявить 17 предположительно позитивных клонов. Секвенирование их ДНК показало, что 7 из них кодируют С-концевые фрагменты белка TRIPSb (AAK38S80).

Рисунок 1. Проверка взаимодействия TRIP8b и CIRL-1.

Глутатион-Сефарозу, на которой были сорбированы цитоплазматическая часть CIRL-1 (202 аа), слитого с GST (GST-CT2), или GST (контроль) инкубировали с лизатом клеток COS, экспрессирующих TRIP8b. Связавшиеся белки элюировали буфером с глутатионом. Равные части элюатов разделяли в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с антителами к TRIP8b.

Для подтверждения взаимодействия CIRL и TRIPSb использовали преципитацию их фрагментов, полученных искусственной экспрессией. В клетках Е. coli экспрессировали С-концевую часть CIRL-1 (1269-1471 аа), соединенную с глутатион-Б-трансферазой (GST-CT2), и GST. Затем лизат клеток наносили на глутатион-Сефарозу и промывали фосфатно-солевым буфером. Аликвоту смолы, на которой были сорбированы цитоплазматическая часть C1RL-1, слитого с GST (GST-CT2), или GST (контроль) инкубировали с лизатом клеток COS, содержащим TRIPSb. Связавшиеся белки элюировали буфером с глутатионом. Равные части элюатов разделяли электрофорезом в SDS-ПААГ, затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, и TRIP8b детектировали специфичными антителами. На представленном рис. 1 видно, что TRIР8Ь отсутствует в элюате с контрольной смолы, но окрашивается в элюате со смолы, на которой сорбирован С-концевой фрагмент CIRL-1.

Vе

kDa

-170

-130

-100

- 72

- 55

- 40

I - 33

Поиск и идентификация белков, взаимодействующих cTRIP8b

TRIP8b (TPR-containing Rab8b interacting protein) был впервые найден и идентифицирован как белок, взаимодействующий с малой ГТФазой Rab8b. Также было показано, что TRIP8b взаимодействует с мембранным белком HCN (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-regulated channel). В то же время, физиологическое значение и детальные механизмы функционирования белка TRIP8b остаются неясными.

Фракции Фракции

элюции с TRIP8b- элюциисТад-Сефарозы Сефарозы

Рисунок 2. Результат хроматографии белков солюбилизата мембран мозга крысы на ТР?1Р8Ь-Сефарозе.

Белки солюбилизата мембран мозга крысы наносили на ТШР8Ь- или Тад-Сефарозу, смолу промывали стартовым буфером, связавшиеся белки элюировали высокосолевым буфером, разделяли в градиентном ПААГ (8-20%) и детектировали окраской Кумасси И-250. Стрелками отмечены: (1) Сазрг, (2) а2 субъединица АР-2 комплекса, (3) М(Ма9, (4) цитохром с1, (5) белок, подобный белку 1\Нр5пар2, (6) В-цепь АТФ-синтазы, (7) 0-цепь АТФ-синтазы, (8) О субъединица АТФ-синтазы, (9) белок, подобный белку, ассоциированному с рецептором у-аминомасляной кислоты.

Для получения дополнительной информации о ТЯІР8Ь мы провели поиск взаимодействующих с ним белков методом аффинной хроматографии на смоле с ковалентно пришитым ТР1Р8Ь, содержащим на (М-конце Тгх-таг,

His-таг и S-таг. В качестве контрольной смолы (Tag-Сефароза) использовали сорбент с пришитыми Trx-, His- и S-тагами. На смолу наносили фракцию растворимых белков мозга крысы или детергентный экстракт грубой фракции мембран, которая помимо цитоплазматических мембран содержала также ядра и митохондрии. Смолу промывали стартовым буфером, связавшиеся белки элюировали высокосолевым буфером и подвергали электрофоретическому разделению в ПААГ с SDS (рис. 2, 3).

{О

а> ^ ^ £>

£ 8%^ CD г*>

I U

* ^ ///

I ///

О Л

■JL & & Ы

аз <у гъ

* ^ ///

. 1 шкш її!!! II!! ||| ill || $ж- I а 1

Н| ШІІШ С..У " -'

1111 ' тттітїшшт * «8 1 ц

Мг% шш

kDa

-170 -130

-100 - 72

h 55

Рисунок 3. Результат хроматографии 40 растворимых белков мозга крысы на TRIP8b-Сефарозе.

Растворимые белки мозга крысы наносили на I .. TRIP8b- или Тад-Сефарозу в стартовом буфере с r Tris-HCI (А) или с Hepes-KOH (Б), смолу промывали стартовым буфером, связавшиеся белки элюировали высокосолевым буфером, разделяли в градиентном ПААГ (8-20%) и детектировали окраской Кумасси R-250. Стрелками отмечены: (1) тяжелая цепь клатрина, (2) FERM, (3) pi субъединица АР2-комплекса, (4) а2 субъединица АР2-комплекса, (5) фосфофруктокиназа, (6) гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин Н1, (7) смесь тРНК-

нуклеотидилтрансферазы и 2',3‘-циклический нуклеотид З'-фосфодиэстеразы, (8) белок, подобный белку NipSnap2, (9) каталаза.

Из геля вырезали кусочки белковых полос, присутствующих только

во фракциях элюции с TRIPSb-Сефарозы, но не с контрольной смолы, и

г 17

данные образцы использовали для проведения масс-спектрометрического анализа. Список белков, которые были достоверно идентифицированы масс-спектрометрией, приведен в табл. 1, также эти белки указаны стрелками на рис. 2,3. Нужно отметить, что в присутствии буфера, содержащего Тгіб, эффективность связывания клатрина с ТК1Р8Ь-Сефарозой значительно снижается (рис. ЗА и ЗБ), возможно, это объясняется тем, что ТпБ-буфер вызывает деполимеризацию клатрина, образующего клатриновые пузырьки. Таким образом, мы идентифицировали 16 белков и белковых комплексов, специфично сорбирующихся на ТЖР8Ь-Сефарозе.

Табл. 1. Результаты масс-спектрометрического анализа белков, выделенных на ТШРЭЬ-Сефарозе.

Название белка Номер последовательности в PubMed Масса, kDa Score*

Белки клатриновых пузырьков

Тяжелая цепь клатрина Р11442 193 380

а2 субъединица АР2-комплекса Р18484 104 366

субъединица АР2-комплекса NP_542150 105 . 268

Белки дыхательной цепи митохондрий

митохондриальная АТФ-синтаза ЕС 3.6.3.14

цепь В Р19511 29 109

цепь D Р31399 19 98

субъединица О Q06647 23 186

Ndufa9 (субкомплекс NADH дегидрогеназы 1 альфа). ААН911Э2 42 223

ЕС 1.6.5.3

Цитохром с1 . Q9D0M3 35 99

Пероксисомальные белки

Каталаза, ЕС 1.11.1.6 Р04762 60 194

Метаболические ферменты

Фосфофруктокиназа, ЕС 2.7.1.11 Q52KS1 86 164

Мембранные белки

Casprl, белок, ассоциированный с контактином Р97846 157 354

Сигнальные белки

Фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназа типа 1у, Q3M1D5 73 112

ЕС 2.7.1.68

FERM - белок, содержащий плекстриновые и RhoGEF Q91VS8 121 70

домены

Другие белки

Белок, подобный белку NipSnap2 мыши Q5RK08 33 145

Белок, подобный белку, взаимодействующему с Q8R3R8 14 77

рецептором у-аминомасляной кислоты

Активированной РНК полимеразы It транскрипционный Q63396 14 87

коактиватор р15

тРНК нуклеотидилтрансфераза, добавляющая Q4VBH2 50 237

последовательность ССА

hnRNP H' - Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин Н‘ Q6AY09 49 72

2',3'-циклический нуклеотид-З'-фосфодиэстераза, Р13233 46 155

ЕС 3.1.4.37 ■

*Score параметр, характеризующий достоверность результатов идентификации конкретного белка. В общем случае, при значении Score >60-70, результат идентификации можно считать достоверным.

Можно видеть, что на аффинной смоле сорбируются как белки цитоплазматической мембраны (Caspr) и митохондрий (субъединицы АТФ-синтазы, цитохром cl, NADH-дегидрогеназа), так и белки клатриновых пузырьков (клатрин, АР-2 комплекс), пероксисом (каталаза), белки цитоплазмы (например, фосфофруктокиназа, фосфатидилинозитол-4-фосфат-5-киназа), ядерные белки (транскрипционный коактиватор р15 активированной РНК-полимеразы II), белки, участвующие в процессинге тРНК (тРНК нуклеотидилтрансфераза) и некоторые другие белки. Весьма вероятно, что часть белков взаимодействует с TRIР8Ь опосредовано; также нельзя исключать возможность неспецифичной сорбции белков.

Элюаты

kDa

0 0 X

аз

Q-

аз

-8-

а)

-Q

СО

а.

(Ґ.

Сі-

ГО

-8-

kDa

аз

-8-

СО

CL-

а.

аз

-8-

170 — •— Ml 4-СНС X -ч 0 1 I 1

130 — 130— •

-Caspr

40—

33—1

CLC

Рисунок 4. Идентификация белков антителами.

Белки указанных на рисунке фракций разделяли в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную

мембрану, которую затем инкубировали с антителами к (А) тяжёлой (СНС) и лёгким (СЮ) цепям клатрина или (Б) белку Саврг.

Так как было обнаружено взаимодействие ТЖР8Ь с мембранными белками, а также получены данные об участии ТШР8Ь в регуляции поверхностной экспрессии НС1Ч, наибольший интерес среди

идентифицированных белков представляли другие мембранные белки (Caspr), а также белки, опосредующие эндоцитоз (клатрин, АР-2).

Для подтверждения результатов масс-спектрометрического анализа, а также специфичности взаимодействия обнаруженных белков с TRIPSb, белки фракций элюции после электрофоретического разделения в ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с антителами к легким и тяжёлой цепям клатрина или к белку Caspr (рис. 4). На представленном иммуноблоте видно, что антителами детектируются клатрин и Caspr, которые присутствуют только во фракциях элюции с TRIPSb-Сефарозы, но не с Tag-Сефэрозы.

Определение в молекуле TRIP8b участка, отвечающего за связывание с клатрином

Для подтверждения специфичности взаимодействия TRIP8b с клатрином, а также для определения в молекуле участков, отвечающих за это взаимодействие, были сделаны несколько мутантов белка TRIP8b, содержащие GST в N-концевой части молекулы (рис. 5).

GST-TRIP8b

SCM2

Рисунок 5. Схематическое изображение полученных мутантов белка TRIP8b.

Белки, полученные экспрессией в клетках Е. соН, иммобилизовали на глутатион-Сефарозе. Аликвоты смолы инкубировали с фракцией растворимых белков мозга крысы, связавшиеся со смолой белки элюировали, разделяли в ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану для проведения Вестерн-блота. Видно, что полноразмерный ТВ1Р8Ь, а также конструкции 1-237 и 42-567 связывают клатрин из фракции растворимых белков мозга, тогда как с конструкциями 145-567 и 238-567 он не взаимодействует (рис. 6А). Можно предположить, что сайт связывания с клатрином в молекуле ТВ1Р8Ь находится между 42-м и 145-м А ш вБТ-ТИРвЬ ш ввТ-ТИРвЬ

0) h- CD Ю in <D . I4-

sfes ® = 5 Й S

kDa 1 ° ^ ^ ^ - kDa X U -

130170— ||g| «-СНС 95_

130-

130- ' 130-

»п со ___________________

GST-TRIP8b Щ GST-TRIP8b

го со о О О = го со О О О =

kDa X О сл со Q a kDa X CD сл со Q а

130130— 95- !

-Р АР

Рисунок 6. Определение в молекуле TRIP8b сайтов связывания с клатрином.

Растворимые белки мозга инкубировали с равным количеством GST, укороченных конструкций GST-TRIP8b (А) или многоточечных мутантов GST-TRIP8b (Б), сорбированных на глутатион-Сефарозе. Связавшиеся со смолой белки анализировали Вестерн-блотом с антителами к тяжёлой цепи клатрина (СНС), р-адаптину, усубъединице АР-1 или а-субъединице АР-2.

аминокислотным остатком. В отличие от тяжёлой цепи клатрина, субъединицы АР-комплексов присутствуют во всех элюатах, содержащих GST-TRIP8b белки, но отсутствуют в контроле с использованием GST.

Анализ аминокислотной последовательности TRIP8b выявил два потенциальных сайта связывания с тяжёлой цепью клатрина slDLLDL и 107LDLD, которые находятся в N-концевой части молекулы. Мы заменили эти аминокислотные остатки остатками аланина (рис. 5). Аналогичные эксперименты по связыванию клатрина из фракции растворимых белков мозга с полученными мутантами подтвердили, что такая замена приводит к нарушению связывания TRIP8b с клатрином (рис. 6Б). Следует отметить, что мутации этих сайтов не вызывают заметного нарушения связывания с TRIPSb субъединиц адаптерных комплексов.

Влияние мутаций сайтов связывания с клатрином в молекуле TRIP8b на поверхностную экспрессию HCNl-канала

Ранее было показано, что при совместной экспрессии в клетках эукариот TRIP8b вызывает перемещение HCN1 канала с клеточной мембраны в крупные внутриклеточные структуры, предположительно, за счёт эндоцитоза (рис. 7Б). С помощью антител к тяжёлой цепи клатрина мы показали, что клатрин также содержится в этих структурах (рис. 7В). Чтобы исследовать влияние мутаций сайтов связывания с клатрином в молекуле TRIP8b на поверхностную экспрессию HCN1 был использован белок TRIPSb, в котором аминокислоты двух найденных сайтов связывания с клатрином были заменены остатками аланина - TRIP8b DCM. Клетки НЕК293 трансфецировали плазмидами, кодирующими GFP-HCN1 и TRIP8b дикого типа (WT) или TRIPSb DCM. Оказалось, что мутации сайтов связывания с клатрином в молекуле TRIPSb не блокируют эндоцитоз HCN1 (рис. 7Г), но приводят к исчезновению в этих структурах клатрина (рис. 7Д).

GFP-HCN1

TRIP8b

Merged

GFP-HCN1

Clathrin

Merged

GFP-HCN1 i TRIP8b WT

GFP-HCN1 & TRIP8b DCM

GFP-HCN1 TRIP8b DCM

Merged

GFP-HCN1 & TRIP8b DCM

GFP-HCN1

Clathrin

Merged

Рисунок 7. Анализ взаимодействия ТИ1Р8Ь с клатрином в трансфецированных клетках НЕК293.

Клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими СРР-НС1М1 (А), ОРР-НСМ и ТР1Р8Ь (Б,В), вРР-НСМ1 и ТИРвЬ ОСМ (Г,Д). Клетки после фиксации окрашивали антителами к ТР!Р8Ь (Б,Г) или клатрину (А,В,Д).

Чтобы установить в каких именно структурах локализуется GFP-HCN1, мы использовали внутриклеточные маркеры ранних эндосом (ЕЕА1) и лизосом (LysoTracker Dye). Окрашивание антителами к ЕЕА1 выявило только частичную ко-локализацию канала с маркером ранних эндосом (рис. 8А, Б), тогда как окрашивание лизосом показало значительную ко-локализацию с HCNl-каналом (рис. 8В, Г).

А Трансфекция

GFP-HCN1 г TRIP8b WT

GFP-HCN1 ЕЕА1 Merged

GFP-HCN1 Lysosomes Merged

GFP-HCN1 & TRIP8b DCM

GFP-HCN1 & TRIP8b WT

GFP-HCN1 & TRIP8b DCM

GFP-HCN1 Lysosomes Merged

Рисунок 8. Анализ локализации GFP-HCN1 в трансфецированных клетках НЕК293.

Клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими GFP-HCN1 и TRIP8b (А,В) или GFP-HCN1 и TRIP8b DCM (Б,Д). Внутриклеточные структуры окрашивали антителами к маркеру ранних эндосом ЕЕА1 (А,Б) или краской для детекции лизосом LysoTracker Red (В,Г),

Полученные данные указывают на независимое взаимодействие TRIP8b с клатрином и HCN1, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка: с каналом TRIP8b взаимодействует TPR-содержащей С-концевой частью, а с клатрином - с помощью двух сайтов, расположенных в N-конце молекулы.

Совместная локализация TRIP8b с клатрином во внутриклеточных структурах

Методом дифференциального центрифугирования были выделены клатрин-покрытые пузырьки (clathrin-coated vesicles, CCV) (рис. 9А). Белки

сл О- > т- см см О О О

СО СО CL СО СО О

kDa

170 — 130 —

95 — ; 72 — :

55 —I

: ЩШт

Рисунок 9. Выделение клатрин-покрытых пузырьков (ССУ).

(А) Схема выделения СС\/. в1 и Р1 - супернатант и осадок после низкоскоростного центрифугирования; БСэ и Эвр - супернатант и осадок после центрифугирования в градиенте концентрации фиколла/сахарозы. (Б) Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли Б05-гель ЭФ в ПААГ и окрашивали Кумасси Я-250. Стрелкой указана тяжёлая цепь клатрина.

фракций разной степени очистки разделяли в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, после чего ТЯ!Р8Ь, белки клатриновой оболочки и синаптических пузырьков детектировали соответствующими антителами. Значительная часть ТЯ1Р8Ь окрашивается в микросомальной фракции 5бр, которая также содержит синаптотагмин и синаптофизин. Фракции Бйэ и ССУ - фракции, обогащённые клатрином - это препараты сравнительно чистых клатрин-покрытых пузырьков (рис. 9Б), в которых ТК!Р8Ь также детектируется антителами (рис. 10).

кОа ^

170130- I

о о 00 60

СНС

(Л о. >

. р. см см О О о

кйа со со о. ел со о

130-’*' *•'* г?-\ ’ ,

95_; г*- «■«-

_ —«

55^-: : ■ ..

40-

33-

Р АР

■ ЄТ

ЭРИ

Рисунок 10. Выделение клатрин-покрытых пузырьков (СС\/).

Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли бОБ-гель ЭФ в ПААГ. Белки затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану и детектировали антителами к тяжёлой цепи клатрина (СНС), ТКІР8Ь, р-адаптину, синаптотагмину (БТ) или синаптофизину

(ЭРЬ).

Ша ' 1 2 3

170-1

130- 1

130 _ I

95- ! V

72-

;| 5£ - 1

43 — I

34—і

буфер А 4 5 6 7 8 9 10

кОа

-СНС 170_ 130-1

130-: 9572— “

5543— 34—

1 2

ТгІБ-буфер 3456789 10

СНС

-рАР

гТР1Р8Ь

Ч-П АР

ТЯ1Р8Ь

-ЭР11

1 23456789 10 низ верх

1 23456789 10

низ верх

фракции

Рисунок 11. Ассоциация ТІЗІРвЬ с ССУ.

ССУ инкубировали в буфере А или Тпв-содержащем буфере, а затем разделяли в 2050% градиенте концентрации сахарозы, приготовленной на буфере А или Тпг-буфере, соответственно. Фракции собирали со дна пробирки, белки наносили на ЭРЗ-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и анализировали Вестерн-блоттингом с антителами к тяжёлой цепи клатрина (СНС), ТР1Р8Ь, р-адаптину и синаптофизину (БРЬ).

Известно, что белки оболочки клатрин-покрытых пузырьков могут

быть удалены с них обработкой щелочным ТгІБ-содержащим буфером.

Молекула ТЯ1Р8Ь не содержит гидрофобных участков, и сам белок

содержится во фракции растворимых белков, то есть, связывание ТЮРвЬ с

мембраной пузырьков может быть опосредовано белок-белковыми

взаимодействиями. Клатрин-покрытые пузырьки инкубировали в буфере А

с pH 6.5 (буфер, используемый при очистке (XV) или в Тт-буфере с pH 7.8, а затем разделяли в градиенте концентрации сахарозы. При седиментации ССУ в «нативных» условиях (буфер А) пик клатрина и субъединиц адаптерного комплекса находится в 5-7 фракциях градиента (рис. НА). Окрашивание антителами к синаптофизину выявило присутствие в этих фракциях также синаптических пузырьков. Распределение ТИ1Р8Ь в сахарозном градиенте похоже на распределение синаптофизина, что указывает на возможность связывания ТЖР8Ь как с СС\/, так и с синаптическими везикулами. В условиях Тт-содержащего буфера клатрин находится в верхней части градиента (максимум во фракции 10, рис. 11Б). ТВ1Р8Ь также перемещается в верхнюю область градиента, но значительная его часть мигрирует вместе с синаптофизином. Полученный результат позволяет предположить, что Т(}1Р8Ь может быть ассоциирован как с клатрином, так и с интегральными белками везикул.

Рисунок 12. Очистка клатрина из кпатрин-покрытых пузырьков.

Клатрин-покрытые пузырьки (ССУ) инкубировали в буфере для диссоциации клатриновой оболочки, а затем центрифугировали для отделения от мембран пузырьков («пузырьки»). Супернатант («клатриновая оболочка») использовали для очистки клатрина на Єирегозе 12. Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли БОБ-гель ЭФ в ПААГ и окрашивали Кумасси 14-250 (А) или серебром (Б). Звездочкой отмечен Нзс70.

кОа

•^-СНС

95 — 72 —

55 -

43-

43 —

34 —

34 _

17 —

ТИ1Р8Ь напрямую взаимодействует с очищенным клатрином

Чтобы подтвердить, что взаимодействие ТЯ1Р8Ь с клатрином не опосредовано другими белками, в частности, субъединицами адаптерных комплексов, методом гель-фильтрации на Бирегозе 12 клатрин был отделен от других белков оболочки СС\/. Чистоту полученного препарата клатрина определяли окрашиванием геля Кумасси И-250 или серебром после проведения ЭФ (рис. 12 А,Б), а также Вестерн-блот анализом с антителами к адаптерным белкам (рис. 13). Видно, что адаптерные белки отсутствуют в препарате очищенного клатрина, но окрашивание серебром показало наличие дополнительной белковой полосы массой примерно 70 кДа (рис. 12Б).

4 СНС рисунок 13. Очистка клатрина из клатрин-покрытых пузырьков.

Клатрин-покрытые пузырьки инкубировали в буфере для диссоциации клатриновой оболочки, а затем центрифугировали для отделения от мембран пузырьков. Супернатант («клатриновая оболочка») использовали для очистки клатрина на вирегоБе 12. Аликвоты, равные по количеству белка, разделяли

__ БОв-гель ЭФ в ПААГ и переносили на

^ нитроцеллюлозную мембрану. Белки детектировали

указанными антителами.

Данный белок был идентифицирован масс-спектрометрией как Н5С70. Известно, что он связывается с С-концевой частью тяжёлой цепи клатрина и одной из его функций является участие в диссоциации клатриновой оболочки. Интенсивность полосы Нзс70 составляет примерно 1% от интенсивности полосы тяжёлой цепи клатрина.

Очищенный клатрин инкубировали с аликвотами смолы, на которых были сорбированы 65Т-ТВ1Р8Ь дикого типа (\Л/Т) или СБТ-ТК1Р8Ь ОСМ, а затем связавшиеся со смолой белки детектировали Вестерн-блот анализом с антителами к клатрину. Чтобы оценить гипотетический вклад Нбс70 или других белков во взаимодействие клатрина с ТЖР8Ь, в ПААГ

разделяли равные части нанесения, проскоков и элюатов. Примерно 2/3 клатрина, используемого в эксперименте, детектируется антителами в элюате со смолы, содержащей ТК1Р8Ь дикого типа (рис. 14), но не с контрольной смолы, что указывает на прямое взаимодействие ТЖР8Ь с клатрином.

I проскок элюат 8

Рисунок 14. Прямое взаимодействие ТШР8Ь с клатрином.

Клатрин, очищенный на вирегозе 12, инкубировали с аликвотами смолы, с сорбированными СБТ-ТИРвЬ \АЯ или СЗТ-ТК1Р8Ь ОСМ. 1/10 части нанесения, проскоков и элюатов разделяли БОЗ-гель ЭФ в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с антителами к тяжёлой цепи клатрина (СНС).

выводы

1. С помощью аффинной хроматографии обнаружено образование комплексов белка ТЖР8Ь с клатрином.

2. Показано, что взаимодействие ТЯ1Р8Ь с клатрином является непосредственным.

3. Локализованы участки, определяющие взаимодействие ТШР8Ь с клатрином, которые находятся в М-концевой части ТШР8Ь.

4. В живых клетках наблюдается синхронное перемещение ТШР8Ь с клатрином при эндоцитозе мембранного белка НС1\11.

5. Полученные данные позволяют предположить роль ТЖР8Ь в нейрональном эндоцитозе путём его независимых взаимодействий с мембранными белками и компонентами оболочки клатрин-покрытых пузырьков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Popova NV, Deyev IE, Petrenko AG, "Association of adaptor protein TRIP8b with dathrin", J Neurochem., 2011,118:988-998.

2. H.B. Попова, A.H. Плотников, P.X. Зиганшин, И.Е. Деев, А.Г. Петренко, "Анализ белков, взаимодействующих с адаптером TRIP8b", Биохимия, 2008, т. 73, вып. 6, с. 804-812

3. Н.В. Попова, А. Плотников, И.Е. Деев, А.Г. Петренко, "Взаимодействие кальций-независимого рецептора латротоксина с внутриклеточным адаптерным белком TRIP8b", Доклады Академии наук, 2007, том 414, № 5, стр. 710-712

Тезисы докладов на конференциях

1. Попова Н.В., Плотников А.Н., Зиганшин Р.Х., Деев И.Е., Петренко А.Г. «Анализ белков, взаимодействующих с адаптером TRIP8b» 12-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 10-14 ноября

2008 г.

2. Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. «TRIP8b - новый клатрин-связывающий белок», IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 23-27 июня

2009 г.

3. Попова Н.В., Плотников А.Н., Серова О.В., Деев И.Е., Петренко А.Г., «Анализ белков, взаимодействующих с адаптером TRIP8b», XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-11 февраля 2009 г.

4. Попова Н.В. «TRIP8b: белок-адаптер, взаимодействующий с клатрином», XVI международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ», Москва, 13-18 апреля 2009 г.

5. Popova N.V., Deyev I.E., Petrenko A.G., "TRIP8b is a novel dathrin-binding protein", International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th

anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov, Moscow - Pushchino, September 28-October 2, 2009.

6. Попова H.B., Деев И.Е., Петренко А.Г. «TRIP8b - новый клатрин-связывающий белок», 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 28 сентября - 02 октября 2009 г.

7. Попова Н.В., Деев НЕ., Петренко А.Г. «Характеристика взаимодействия белка-адаптера TRIP8b с клатрином» XVIII международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", Украина, Гурзуф, 31 мая -10 июня 2010 г.

8. N.V. Popova, I.E. Deyev, A.G. Petrenko, "Association of brain-specific adapter protein TRIP8b with clathrin." 40th annual meeting society for neuroscience, USA, San Diego, 10-13 November 2010.

9. Попова H.B., Деев И.Е., Петренко А.Г., «Взаимодействие белка-адаптера TRIPSb с клатрином» V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г.

Подписано в печать: 02.02.2012

Заказ № 6598 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Надежда Викторовна, Москва

на правах рукописи

61 12-3/692

Попова Надежда Викторовна

Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером ТШР8Ь

специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

диссертация

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.х.н., зав. лаб. А.Г. Петренко

к.физ-мат.н., с.н.с. И.Е. Деев

Москва 2012

Оглавление

Введение..............................................................................................................................4

Обзор литературы................................................................................................................7

1.1. 6-белоксопряжённые рецепторы..............................................................................7

1.2. Семейство адгезионных рецепторов........................................................................8

1.2.1. Кальций-независимые рецепторы латротоксина СИ*1-..................................9

1.3. Эндоцитоз 6-белоксопряжённых рецепторов после связывания слигандом... 13

1.4. Механизм клатрин-опосредованного эндоцитоза...............................................15

1.5. Основные белки, участвующие в клатрин-опосредованном эндоцитозе.........17

1.5.1. Киназы 6-белоксопряжённых рецепторов и (3-арестины...........................17

1.5.2. Клатрин............................................................................................................18

1.5.3. Адаптерные белковые комплексы АР...........................................................22

1.5.4. Ауксилин..........................................................................................................25

1.5.5. Нбс70.................................................................................................................26

1.6. Другие белки, взаимодействующие с клатрином.................................................27

1.7. Характеристика белка ТИ1Р8Ь.................................................................................30

Экспериментальная часть..................................................................................................34

2.1. Материалы.................................................................................................................34

2.2. Методы.......................................................................................................................37

Результаты исследований и их обсуждение.....................................................................47

3.1. Связывание ТР11Р8Ь с С-концевой частью рецептора СШ1....................................47

3.2. Поиск и идентификация белков, взаимодействующих с ТМР8Ь..........................49

3.3. Определение в молекуле ТИ1Р8Ь участка, отвечающего за связывание с клатрином............................................................................................................................57

3.4. Влияние мутаций сайтов связывания с клатрином в молекуле ТЯ1Р8Ь на поверхностную экспрессию НСМ1-канала........................................................................60

3.5. Совместная локализация ТШР8Ь с клатрином во внутриклеточных

структурах..........................................................................................................................64

3.6. ТШР8Ь напрямую взаимодействует с очищенным клатрином..........................68

Выводы..............................................................................................................................72

Список литературы............................................................................................................73

Приложение.......................................................................................................................83

Введение

Так, для обеспечения цикличности процесса передачи сигнала требуется баланс двух явлений - экзоцитоза и эндоцитоза. Экзоцитоз необходим для выброса нейромедиатора в синаптическую щель. В свою очередь, эндоцитоз требуется как для поддержания постоянства поверхности пресинаптической мембраны и повторного заполнения синаптических пузырьков нейромедиатором, так и для повторной активации рецепторов постсинаптической мембраны. Эндоцитоз синаптических пузырьков после сильной стимуляции нейромышечного синапса происходит по клатрин-зависимому механизму.

Целью настоящей работы являлся поиск и идентификация белков, взаимодействующих с адаптерным белком ТШР8Ь, а также дальнейшая характеристика этого взаимодействия. Первоначальный поиск показал, что мажорным белком, связывающимся с ТВ1Р8Ь, является клатрин, поэтому были сформулированы следующие задачи:

1. Найти в молекуле ТК1Р8Ь структурные детерминаты, отвечающие за связывание с клатрином;

2. Получить очищенные препараты клатрина и ТР1Р8Ь, чтобы подтвердить их прямое взаимодействие;

3. Подтвердить совместную локализацию ТШР8Ь и клатрина с использованием живых клеток.

В результате проведённой работы были найдены и идентифицированы 16 белков и белковых комплексов, взаимодействующих с ТК1Р8Ь, и показано, что клатрин и субъединицы адаптерного комплекса АР-2 являются мажорными белками в элюатах с ТК1Р8Ь-Сефарозы. Проведены эксперименты, подтверждающие, что белок ТШР8Ь напрямую взаимодействует с клатрином. Так, анализ аминокислотной последовательности ТШР8Ь выявил два потенциальных сайта связывания с тяжёлой цепью клатрина, а эксперименты по связыванию очищенного клатрина и мутантов ТШР8Ь, в которых аминокислотные остатки этих сайтов были заменены остатками аланина, подтвердили, что такая замена приводит к нарушению связывания. Также обнаружено, что ТШР8Ь присутствует во фракции выделенных клатрин-покрытых пузырьков. Полученные данные указывают на независимое взаимодействие ТШР8Ь с клатрином и мембранными белками, так как это взаимодействие обеспечивается разными частями молекулы белка. Таким образом, способность ТШР8Ь взаимодействовать как с клатрином, так и с мембранными белками позволяет предполагать, что ТШР8Ь может осуществлять

регуляцию поверхностной экспрессии этих белков за счет модуляции клатрин-опосредованного эндоцитоза.

Обзор литературы

1.1. G-белоксопряжённые рецепторы

Суперсемейство G-белоксопряжённых рецепторов (GPCR) является одним из самых

разнообразных белковых семейств (Pierce, Premont et al. 2002). GPCR присутствуют практически во всех эукариотических организмах, включая насекомых (Hill, Fox et al. 2002) и растения (Josefsson 1999). Лигандами GPCR являются ионы, органические одоранты, амины, пептиды, белки, липиды, нуклеотиды и фотоны. Рецепторы этого суперсемейства участвуют в регуляции многих физиологических процессов. Семейство GPCR - наиболее крупная группа белков, которые являются мишенями лекарственных препаратов: приблизительно 30% всех присутствующих на рынке лекарственных средств направлены на GPCR (Hopkins and Groom 2002; Klabunde and Hessler 2002).

Общей структурной особенностью GPCR является наличие семи а-спиральных трансмембранных гидрофобных сегментов, образованных 25-35 аминокислотными остатками (Ovchinnikov Yu 1982). Эти сегменты пронизывают мембрану, образуя компактную эллиптическую структуру. N-концевая часть и три петли между трансмембранными сегментами расположены снаружи клетки, а С-концевая часть и три другие петли обращены в цитоплазму.

Лишь для небольшой доли известных G-белоксопряженных рецепторов доказано их прямое взаимодействие с G-белками. Также имеются данные, что передача сигнала может быть опосредована не только G-белками (Wei, Ahn et al. 2003; Rajagopal, Lefkowitz et al. 2005). Поэтому в последнее время также получил распространение термин семитрансмембранные ("seven-transmembrane") рецепторы.

Существует несколько попыток классифицировать рецепторы внутри семейства GPCR. В настоящее время принята классификация, предложенная Фредриксоном и

коллегами на основании филогенетических критериев (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). Согласно этой классификации (акроним GRAFS), большинство GPCR можно отнести к одному из пяти классов: рецепторы группы глутаматного рецептора, группы родопсина, адгезионные рецепторы, так называемые рецепторы Frizzled/Taste2 и рецепторы секретинового семейства.

1.2. Семейство адгезионных рецепторов

Согласно классификации GRAFS к адгезионным рецепторам - второму по

численности классу рецепторов после рецепторов группы родопсина - относят 33 белка (Millar and Newton 2010), для большей части которых лиганд до сих пор неизвестен. Как правило, адгезионные рецепторы имеют протяжённую N-концевую внеклеточную часть, которая обычно сильно гликозилирована (Baud, Chissoe et al. 1995). Анализ аминокислотной последовательности выявил наличие в этой области разнообразных структурных доменов, а именно EGF-подобных доменов, тромбоспондиновых повторов, лейцин-богатых повторов (LRR), лектиновых доменов, иммуноглобулин (^)-подобных доменов, а также кадхериновых повторов. Известно, что в других белках многие из этих доменов вовлечены в белок-белковые взаимодействия и клеточную адгезию. Таким образом, данные рецепторы представляют собой природные гибриды двух классов белков-сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии (Yona, Lin et al. 2008).

За N-концевым доменом располагается семитрансмембранный домен (7ТМ), а между ними, в непосредственной близости от первого трансмембранного сегмента, находится цистеин-богатый мотив, пол учивший название GPS (G-protein-coupled receptor Proteolysis Site). GPS присутствует во всех адгезионных рецепторах, за исключением GPR123 (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). Наличие GPS домена определяет эндогенный протеолитический процессинг рецепторов, который происходит непосредственно после синтеза рецептора в эндоплазматическом ретикулуме (Krasnoperov, Lu et al. 2002;

Volynski, Silva et al. 2004) или ранних отделах Гольджи (Gray, Haino et al. 1996). Процессированный рецептор представляет собой расположенный на клеточной мембране комплекс, состоящий из двух, не связанных ковалентно, субъединиц (Krasnoperov, Bittner et al. 1997).

В семействе адгезионных рецепторов выделяют также подсемейства EGF-содержащих гибридных рецепторов иммунной системы (CD97, EMR1, EMR2, EMR3 и EMR4), рецепторов BAI (BAI-1, BAI-2 и BAI-3), рецепторов flamingo/CELSR (CELSR1, CELSR2 и CELSR3), lgG-подобных рецепторов (GPR116, GPR124, GPR125), а также рецепторов латротоксина CIRL (CIRL1, CIRL2 и CIRL3).

1.2.1. Кальций-независимые рецепторы латротоксина CIRL

Одним из представителей группы адгезионных рецепторов является рецептор CIRL,

также называемый латрофилином (Lph) или лектомедином (Lee) (Sudhof 2001). Семейство

CIRL состоит из трех высокогомологичных белков - CIRL1, CIRL2 и CIRL3. CIRL1 является

высокоаффинным рецептором нейротоксина латротоксина.

Альфа-латротоксин - нейротоксин, содержащийся в яде паука черная вдова.

Латротоксин вызывает массовый выброс различных нейромедиаторов из

пресинаптических окончаний путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул (Gorio,

Rubin et al. 1978; Tzeng, Cohen et al. 1978; Tzeng and Siekevitz 1978; Tzeng and Siekevitz 1979;

Tzeng and Siekevitz 1979; Ceccarelli and Hurlbut 1980). Также латротоксин стимулирует

экзоцитоз в секреторных клетках, таких как хромафинные и панкреатические клетки

(Bittner, Krasnoperov et al. 1998; Lang, Ushkaryov et al. 1998; Bittner and Holz 2000).

CIRL состоит из двух, не связанных ковалентно, субъединиц (Krasnoperov, Bittner et

al. 1997; Lelianova, Davletov et al. 1997). Субъединица pl20 является гидрофильным

внеклеточным белком, а субъединица р85 - интегральный мембранный белок, состоящий

из семи трансмембранных сегментов и внутриклеточной части. Обе субъединицы

рецептора кодируются одним геном, и двухсубъединичная структура СШЬ является результатом эндогенного протеолиза белка-предшественника рецептора (Кгаэпорегоу, Вгйпег е1 а1. 1997; Krasnoperov, 1_и е1 а1. 2002). В составе большой внеклеточной части С1т идентифицированы домены, характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый (рис. 1.1).

01Й

1П

|Ш

1да

те

V V V

( С

с С

ййу

Субъединица р120

Субъединица р85

СИ^Ы С^ЬЗ С\И1-2

«кв. вРЭ |: 1 ЭТР-бОГаТЫЙ домвн

Лектиновый рщкшцма Олфактомединовый

домен домен

0 Ы-концевой домен С^ЬЗ

Рисунок 1.1. Схематическое изображение рецепторов СИЗ!..

С-концевая цитоплазматическая область не содержит никаких определённых доменных структур, за исключением множественных сайтов пальмитоилирования и фосфорилирования, а также нескольких PEST-последовательностей (последовательности, богатые пролином, глутаминовой кислотой, серином и треонином) (Matsushita, Lelianova et al. 1999). Предполагается, что наличие PEST-последовательностей связано со свойством быстрой деградации белков за счёт протеолиза (Rogers, Wells et al. 1986; Roth, Sullivan et al. 1998; Sekhar and Freeman 1998), поэтому содержащие их белки считаются короткоживущими.

CIRL-1 имеет два близких гомолога в геномах млекопитающих: CIRL-2 и CIRL-3. Анализ тканеспецифичного распределения мРНК рецепторов CIRL показал, что CIRL-1 и CIRL-3 находятся преимущественно в головном мозге и других тканях нервной системы, в то время как CIRL-2 обнаруживался практически во всех анализированных тканях (Sugita, Ichtchenko et al. 1998; Ichtchenko, Bittner et al. 1999; Matsushita, Lelianova et al. 1999).

Было показано, что с цитоплазматической частью CIRL-1 из солюбилизатов мозгов крыс соочищаются G-белки, а именно Ga0 (Lelianova, Davletov et al. 1997; Rahman, Ashton et al. 1999) и Gaq/n (Rahman, Ashton et al. 1999). Другими белками, которые взаимодействуют с внутриклеточным С-концевым фрагментом рецепторов CIRL, являются растворимые белки семейства ProSAP/SSTRIP/Shank, принадлежащие к классу мультидоменных скаффолд-белков с PDZ доменами (Kreienkamp, Zitzer et al. 2000; Tobaben, Sudhof et al. 2000; Kreienkamp, Soltau et al. 2002). Считается, что белки этого класса играют ключевую роль в образовании мультимолекулярных комплексов мембранных и цитоскелетных белков в синапсах. Их взаимодействие с CIRL, по всей видимости, определяет расположение рецепторов в зонах экзоцитоза.

Возможно, что CIRL-2 играет роль в развитии злокачественных опухолей молочной железы. Было показано, что его ген находится в районе частой потери гетерозиготности

хромосомы 1р31.1. Анализ различных клеточных линий опухолей молочной железы показал, что уровень рецептора в них сильно различается: повышен в одних, уменьшен или отсутствует в других (White, Varley et al. 1998). Также были получены данные об участии CIRL-2 в процессе миграции эндотелиальных клеток при формировании сердца (Doyle, Scholz et al. 2006).

Было также высказано предположение, что рецепторы CIRL участвуют в нейродегенерации. Анализ влияния ишемического инсульта на нейроны гиппокампа показал, что нейроны слоя CAI увеличивают экспрессию CIRL, в то время как в слое САЗ уровень экспрессии снижается (Bin Sun, Rúan et al. 2002). Остается непонятным, являются ли данные эффекты непосредственным следствием ишемии или отражают общие некротические и апоптотические процессы в поврежденных нейронах.

Кроме того, было продемонстрировано, что у мышей с отсутствием CIRL-1 снижена забота о потомстве, что приводило к повышенной смертности потомства, хотя по внешним признакам мутантные мыши не отличались от мышей дикого типа (Tobaben, Sudhof et al. 2002). Данный результат позволяет предположить, что нокаут гена CIRL-1 не вызывает существенных нарушений функции мозга, но имеет некоторые поведенческие последствия.

В 2010 г. впервые была показана связь между рецепторами CIRL и СДВГ (синдром дефицита внимания и гиперактивности) (Arcos-Burgos, Jain et al. 2010). СДВГ - наиболее распространённое расстройство поведения у детей, которое встречается у 8-12% детей по всему миру (Biederman and Faraone 2005). Экспрессия CIRL-3 в областях мозга, наиболее затрагиваемых при СДВГ, - миндалине, хвостатом ядре полосатого тела, гиппокампе, коре головного мозга и клетках Пуркинье мозжечка (Krain and Castellanos 2006; Arcos-Burgos, Jain et al. 2010) - подтверждает предложенную роль рецептора.

Таким образом, появляются данные, позволяющие связать рецепторы CIRL с физиологией мозга. И хотя точная функция этих рецепторов до сих пор неизвестна, их участие в экзоцитозе нейромедиаторов, профиль экспрессии, а также уникальные структурные свойства выступают в поддержку гипотезы об участии данных белков в межнейронной коммуникации (Martinez, Muenke et al. 2011).

1.3. Эндоцитоз G-белоксопряжённых рецепторов после связывания с л и га н дом

При связывании лиганда с рецептором и его активации образуется комплекс с G-белками, происходит обмен связанного ГДФ на ГТФ и диссоциация G-белков на а субъединицу, связанную с ГТФ, и комплекс из ß и у субъединиц. В настоящее время доказано, что как а субъединица, так и комплекс ßy служат передатчиками сигналов, активируя или ингибируя ферменты и ионные каналы (Clapham and Neer 1993). После взаимодействия с эффектором происходит гидролиз связанного ГТФ и вос

Информация о работе

Попова, Надежда Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Надежда Викторовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология