Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ роли малой ГТФ-азы RАВ7 в эндоцитозе рецептора эпидермального фактора роста

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арнаутова, Ирина Петровна, Санкт-Петербург

ИНСТИТУТ цитологии РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 576.362:576.535.5

РОЛЬ МАЛОЙ ГТФ-азы КАВ7 В ЭНДОЦИТОЗЕ РЕЦЕПТОРА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА

РОСТА

03.00.25 - клеточная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ.

1. ВВЕДЕНИЕ...................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................9

2.1. Эпидермальный фактор роста и его рецептор.............9

2.2. Внутриклеточный везикулярный транспорт................13

2.3. Типы эндоцитоза............................................................14

2.4. Рецептор-опосредованный эндоцитоз ЭФР................19

2.5. Основные молекулярные реакции, определяющие процесс везикулярного транспорта.....................................22

2.6. Механизмы регуляции везикулярного транспорта......22

2.7. Регуляция эндоцитоза РаЬ-белками............................28

2.8. Участие цитоскелета в регуляции эндоцитоза............34

2.9. Модели эндоцитозного транспорта.^.,........................37

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................АЩЬШ.:..............41

3.1. Культивирование клеток...............................................41

3.2. Получение иодированного ЭФР....................................42

3.3. Исследование динамики эндоцитоза в условиях предварительного связывания лиганда..............................42

3.4. Исследование динамики эндоцитоза в условиях "импульсной" загрузки лигандов..........................................43

3.5. Обработка клеток нокодазолом и циклогексимидом...44

3.6. Антитела.........................................................................44

3.7. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток............46

3.8. Иммунопреципитация....................................................47

3.9. Электрофорез................................................................48

3.10. Иммуноблоттинг...........................................................49

3.11. Субклеточное фракционирование..............................49

4. РЕЗУЛЬТАТЫ..............................................................................56

4.1. Динамика компартментализации 1251-ЭФР в клетках с нормальным и мутантными рецепторами ЭФР..................56

4.2. Морфологический анализ эндоцитоза нормального и мутантных рецепторов ЭФР.................................................68

4.3. Локализация 1ЧаЬ7 в клетках с нормальным и мутантными рецепторами ЭФР............................................70

4.4. Динамика эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

в условиях разрушения тубулинового цитоскелета...........75

4.5.13аЬ7 в условиях деполимеризации микротрубочек....79

4.6. Идентификация внутриклеточных структур, ассоциированных с РаЬ7......................................................88

4.7. Ассоциация РаЬ7 с ранними/сортирующими эндосомами...........................................................................94

4.8. Анализ ассоциации РаЬ7 с цитоскелетными структурами...........................................................................96

4.9. Перераспределение РаЬ7 в условиях деполимеризации микротрубочек......................................101

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................105

6. ВЫВОДЫ...................................................................................123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................125

1. ВВЕДЕНИЕ.

Эпидермальный фактор роста (ЭФР) поступает в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (Willingham, Pastan, 1981). Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние периферические эндосомы, где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану, а остальные попадают в околоядерные поздние эндосомы, после чего деградируют в лизосомах (Beguinot et al., 1984: Sorkin et al., 1988).

Хотя механизм сортировки точно неизвестен, существуют предположения, что он связан с переходом ЭФР-рецепторных комплексов с внешней мембраны эндосом во внутренние пузырьки, что приводит к образованию так называемых мультивезикулярных тел - структур, весьма характерных для поздних стадий эндоцитоза (Miller et al., 1986). При этом на ранних этапах рецептор остается достаточно долгое время экспонирован в цитоплазму своим С-концевым участком, который содержит активированный тирозинкиназный домен и сайты автофосфорилирования, и способен взаимодействовать с различными внутриклеточными субстратами. Таким образом, изменяя скорость сортировки рецепторного белка (а, следовательно, и уровень его рециклирования), клетка может изменять эффективность и длительность сигнала, идущего с активированного рецептора ЭФР, находящегося в ранних эндосомах. Поэтому механизмы, регулирующие сортировку, вызывают наибольший интерес. Именно сортировка является стадией, лимитирующей скорость доставки рецепторов в

лизосомы, причем ее насыщение происходит при весьма низких концентрациях интернализованного рецептора (Благовещенская и др., 1994; French et al., 1994). Эти данные несомненно свидетельствуют о существовании рецептор-специфической сортирующей системы. Данные о механизмах и белках, вовлеченных в этот процесс, весьма немногочисленны. Ограничены и прочиворечивы сведения относительно участия сайтов автофосфорилирования и тирозинкиназы рецептора ЭФР.

В то же время, эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов является частным случаем внутриклеточного везикулярного транспорта, который несомненно должен быть подвержен регуляции со стороны универсальных транспортных систем.

В настоящее время стало очевидным, что многочисленные везикулярные потоки в клетке находятся под контролем большого количества молекул, обеспечивающих образование, точную доставку, узнавание и слияние донорных и акцепторных везикул. К таким универсальным регуляторам везикулярного транспорта относятся белки окаймления (клатрин, кавеолин, СОР-белки), адаптины, тримерные G-белки, N-этилмалеимид-чувствительные факторы (NSF) и др. (Elferink et al.,1993; Orci et al., 1993; Ikonen et al., 1995). Наиболее многочисленную группу представляют Rab-белки - малые ГТФазы, имеющие высокую степень гомологии с белком p21Ras. К настоящему моменту идентифицировано более 30 членов этого семейства, опосредующих различные этапы транспортных везикулярных путей. Так, было показано, что Rab5 ассоциирован с ранними эндосомами и плазматической мембраной, Rab4 и Rab3 связаны с путями рециклирования и секреции, Rab6, Rab10 и Rabí 2 функционируют в аппарате Гольджи и т.д. (Zerlal, Stenmark,

1993). В поздних эндосомах были обнаружены Rab9 и Rab7, но если Rab9, по всей видимости, опосредует транспорт между транс-Гольджи и поздним эндосомальным компартментом, то функция Rab7 остается до сих пор неизвестной (Chavrier et al., 1990; Shapiro et al., 1993).

Механизм действия Rab-белков относительно изучен только для Rab5, хотя общим, в соответствии с существующим представлением, является то, что в ГТФ-связанной форме они ассоциируются с мембраной, тогда как ГДФ-связанная форма белка локализована в цитоплазме (Bucci et al., 1992). По всей видимости, роль Rab-белков заключается в обеспечении специфического взаимодействия донорного компартмента с соответствующим акцепторным и в опосредовании слияния этих мембран.

Очевидно, что универсальные белки-регуляторы везикулярного транспорта должны каким-то образом взаимодействовать с компонентами специфических транспортных систем, обеспечивая доставку конкретных белков в конечные пункты их назначения, однако исследования, посвященные этой проблеме, практически отсутствуют. Ранее в нашей лаборатории было показано, что в клетках А431 на поздних стадиях эндоцитоза Rab7 весьма эффективно взаимодействует с эндосомами, содержащими интернализованный рецептор ЭФР (Благовещенская и др., 1996). Исходя из этого можно было предположить, что Rab7 может быть вовлечен в регуляцию поздних стадий эндоцитоза рецептора ЭФР.

В связи со всем сказанным выше, в настоящей работе представлялось актуальным изучить роль тирозинкиназы и

сайтов автофосфорилирования рецептора ЭФР в регуляции разных этапов эндоцитоза лиганд-рецепторных комплексов. Установлено, что тирозинкиназная активность рецептора и, в меньшей степени, интактность его С-концевого домена, содержащего основные сайты автофосфорилирования, необходимы для эффективной сортировки лиганд-рецепторных комплексов на путь лизосомальной деградации.

Используя клетки, экспрессирующие мутантные формы рецептора ЭФР, различающиеся по эффективности вступления на путь деградации, метод субклеточного фракционирования органелл в градиенте Перколла и биохимический анализ фракций ранних и поздних эндосом, мы попытались определить, с какими именно фракциями эндосом взаимодействует РаЬ7, а также закономерности этого взаимодействия. Было показано, что стимуляция эндоцитоза ЭФР приводит к увеличению количества РаЬ7, содержащегося как во фракциях ранних, так и во фракциях поздних эндосом клеток, экспрессирующих рецептор ЭФР с интактной тирозинкиназой. Установлено, что уровень ассоциации 13аЬ7 с поздними эндосомами коррелирует с эффективностью сортировки рецептора на путь лизосомальной деградации. В клетках, экспрессирующих рецептор ЭФР с неактивной тирозинкиназой, уровень ассоциации РаЬ7 с эндосомами крайне низкий и не демонстрирует никакой динамики.

Параллельные данные субклеточного фракционирования и иммунофлуоресцентного анализа клеток, обработанных нокодазолом (агентом, деполимеризующим микротрубочки) продемонстрировали, что деполимеризация тубулинового цитоскелета не оказывает никакого влияния на доставку лиганд-рецепторных комплексов в поздние эндосомы, однако резко

изменяет морфологию рецептор-позитивных эндосом и приводит к практически полному исчезновению их ко-локализации со структурами, содержащими КаЫ.

С помощью субклеточного фракционирования впервые было показано, что в нестимулированных ЭФР клетках РаЬ7 локализуется на мембранах эндоплазматического ретикулума. Стимуляция эндоцитоза ЭФР приводит к уменьшению 13аЬ7 в эндоплазматическом ретикулуме и соответствующему увеличению его сначала во фракции ранних, в затем поздних эндосом. Таким образом, показано, что эндоплазматический ретикулум служит внутриклеточным депо для КаЬ7.

Используя метод субклеточного фракционирования, было продемонстрировано, что при стимуляции рецептор-опосредованного эндоцитоза ЭФР увеличивается содержание РаЬ7 во фракции тубулинового цитоскелета, при этом количество полимеризованного тубулина также возрастает.

На основании результатов данной работы была сформулирована гипотеза, согласно которой роль РаЬ7 заключается не в опосредовании реакций слияния везикул, а в организации архитектуры эндоцитозного пути. Мы предполагаем, что РаЬ7 действует наподобие линкерного белка, способствуя ассоциации эндосом и вновь синтезируемых микротрубочек, помогая движению эндосом от периферии клетки к ее центру.

Результаты, полученные в настоящей работе, изменяя традиционные представления о возможных функциях РаЬ-белков, существенно расширяют их.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпидермальный фактор роста и его рецептор.

В процессе изучения особенностей пролиферации нормальных и опухолевых клеток в культуре было установлено, что в регуляции деления клеток определяющую роль играют полипептидные факторы роста, содержащиеся в сыворотке (Carpenter, 1987). Эти факторы роста очень разнообразны по структуре и специфичности. В настоящее время эпидермальный фактор роста (ЭФР) является одним из наиболее хорошо изученных. ЭФР (6000 Да) - одноцепочечный полипептидный фактор - был впервые выделен Козном (Cohen, 1962) из гомогената подчелюстных желез мыши. Он обнаружил, что ЭФР оказывает стимулирующее действие на эпидермальные ткани, вызывая преждевременное открывание глаз и прорезывание зубов у новорожденных мышей. Установлена аминокислотная последовательность ЭФР мыши, крысы и человека (Savage, Cohen, 1972; 1973).

В ответных реакциях клеток на ЭФР проявляются черты, характерные для ответа на многие росотовые факторы. Сейчас можно считать установленным, что воздействие ЭФР на клетки реализуется через его рецептор - крупный мембранный гликопротеин. Были обнаружены клеточные линии, в частности А431, обладающие аномально высоким количеством рецептора ЭФР, что в значительной степени облегчает задачу выявления этого белка и делает его одной из удобных моделей для изучения сигнальных процессов в ходе митогенеза.

Рецептор ЭФР (170 кДа) является трансмембранным гликозилированным белком, состоящим из 1186 аминокислотных

остатков (АО) и 10-12 олигосахаридных цепей, ковалентно связанных с белковым остовом. Некоторые авторы считают, что гликозилирование рецептора важно для обеспечения связывания с лигандом и тирозинкиназной активности рецептора (Soderquist, Carpenter, 1984). Экстраклеточный домен рецептора обогащен цистеинами, которые образуют два кластера. На этом основании было выдвинуто предположение о двухлопастной структуре экстраклеточной части рецептора, образующей некую клешню для захвата лиганда - ЭФР. Далее, на основании функционального анализа лиганд-связывающего

(экстраклеточного) домена в опытах с "химерными" рецепторами и электронно-микроскопического изучения очищенного рецептора было выдвинуто предположение о четырехдоменной организации внешнего участка молекулы рецептора ЭФР (Ullrich, Schlessinger, 1990). Согласно этой модели субдомены 2 и 4 содержат участки, богатые цистеинами, а последовательности, которые ответственны за связывание с лигандом, локализованы в субдоменах 1 и 3.

Трансмембранный домен рецептора выполняет пассивную функцию в проведение сигнала, что было подтверждено многочисленными заменами аминокислотных остатков в результате точечных мутаций (Kashles et al., 1988). Можно предположить, что трансмембранный участок обеспечивает лишь "заякоривание" рецептора в плазматической мембране (ПМ).

Трансмембранный домен рецептора отделяется от цитоплазматического так называемым подмембранным участком. Полагают, что подмембранный домен участвует в модуляции функций рецептора. Так, треонин 654, который локализован в этом районе, является сайтом

фосфорилирования протеинкиназой С (РКС), что в конечном счете приводит к ингибированию собственной киназной активности рецептора и потере им способности связывать ЭФР (Davis, 1988). Также были идентифицированы несколько других остатков серина и треонина, которые локолизованы в подмембранном домене и являются дополнительными сайтами фосфорилирования РКС (Carpenter, 1992).

Отличительной особенностью цитоплазматического домена рецептора ЭФР является участок, обладающий ферментативной тирозинкиназной (ТК) активностью. Этот участок имеет высокую гомологию с белками src-семейства, которые также являются тирозиновыми протеинкиназами (Downward et al., 1984). Связывание ЭФР с рецептором приводит к активации ТК самого рецептора. Наиболее важную роль для стимуляции ТК активности рецептора ЭФР играет лизин 721. Было показано, что при замене лизина 721 на фенилаланин наблюдалось полное нарушение ТК активности рецептора как in vitro, так и in vivo (Honneger et al., 1987 a; Chen et al., 1987). На концевом участке цитоплазматического домена рецептора ЭФР расположены пять сайтов ЭФР-зависимого

автофосфорилирования по тирозину: три основных (Y1068, Y1148 и Y1173) и два минорных (Y992 и Y1086). Этот участок имеет молекулярный вес около 20 кДа и легко отщепляется под действием протеаз (Margolis et al., 1989). По-видимому, в результате автофосфорилирования рецептор приобретает особую конформацию, при которой облегчается его взаимодействие с внутриклеточными субстратами.

Также было обнаружено, что в цитоплазматическом домене рецептора локализованы еще два функциональных участка. Один, состоящий из 164 АО (1022-1186), можно

охарактеризовать как ингибиторный домен, поскольку его делеция приводит к увеличению ЭФР-зависимого фосфорилирования внутриклеточных субстратов рецептора ЭФР. Этот домен взаимодействует с ТК рецептора, маскируя при этом последовательность с 973 по 1022 АО, составляющих второй домен - "домен интернализации". Автофосфорилирование трех тирозинов на ингибиторном домене приводит к конформационным изменениям, при которых освобождается ТК домен и домен интернализации. Кроме того, в домене интернализации была обнаружена последовательность из 18 АО (973 - 991), необходимая как для интернализации, так и для увеличения концентрации цитозольного кальция. Авторы назвали этот участок "Cain", подчеркивая его связь с регуляцией потоков кальция и интернализацией (Chen et al., 1989).

В последнее время большинство молекулярно-биологических исследований по передаче внутриклеточных сигналов, приводящих к экспрессии определенных генов, направлен на идентификацию белковых субстратов активированного рецептора ЭФР и последовательности каскадных реакций, в которые эти субстраты вовлекаются. К настоящему времени охарактеризовано большое количество белков, которые специфически ассоциируются с рецептором после обработки клеток ростовым фактором. К ним относятся фосфолипаза Су (PLCy), активирующий белок ГТФаз (GAP), фосфатидилинозитол-3-киназа, белок, гомологичный коллагену и src (She) (Carpenter, 1992), p91 (Larner et al., 1993; Silvennoinen et al., 1993).

2.2. Внутриклеточный везикулярный транспорт.

Мембранные компартменты клетки в�