Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ роли малой ГТФ-азы RAB7 в эндоцитозе рецептора эпидермального фактора роста

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ роли малой ГТФ-азы RAB7 в эндоцитозе рецептора эпидермального фактора роста"

На правах рукописи

АРНАУТОВА Ирина Петровна

АНАЛИЗ РОЛИ МАЛОЙ ГТФ-азы ЯАВ7 В ЭНДОЦИТОЗЕ РЕЦЕПТОРА ЭПИДЕРМАЛЫЮГО ФАКТОРА РОСТА

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, С.-Петербург

Научные руководители: кандидат биологических наук

Е.С. Корнилова Институт цитологии РАН, С.-Петербург

доктор биологических наук, академик H.H. Никольский Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.А. Кроленко Институт цитологии РАН, С.- Петербург

доктор биологических наук Б.Н. Лейбуш

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН, С.-Петербург

Ведущее учреждение:

Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского Государственного Университета, С.-Петербург

Защита состоится "1±" 1998 года в ЛЬ ч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Реферат разослан " ко^еВ^Я 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.б.н. Л.Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы.

Биологическое действие эпидермального фактора роста (ЭФР) на клетки реализуется через специфический рецептор - крупный трансмембранный белок, обладающий тирозинкиназной (ТК) активностью и несколькими сайтами автофосфорилирования, находящимися на цитоплазматическом конце рецептора. Связывание ЭФР с рецептором приводит к стимуляции ТК и инициирует два ряда событий: активацию сигнальных путей и интернализацию ЭФР-рецепторных комплексов во внутриклеточные компартменты. ЭФР поступает в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (Willingham, Pastan, 1981). Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние периферические эндосомы, где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану, а остальные попадают в околоядерные поздние эндосомы, после чего деградируют в лизосомах (Beguinot et al., 1984: Sorkin et al., 1988). Соотношение рецепторов, вступающих на тот или иной путь, может изменяться в одних и тех же клетках, что указывает на то, что процесс сортировки является регулируемым.

Несмотря на то, что исследования эндощиша ведутся уже не одно десятилетие, механизм перехода из ранних в поздние эндосомы до сих пор является предметом дискуссии.

Известно, что на ранних этапах рецептор остается достаточно долгое время экспонирован в цитоплазму своим С-концевым участком, который содержит активированный тирозиикипазный домен и сайты автофосфорилирования, и способен взаимодействовать с различными внутриклеточными субстратами (Корнилова и др., 1988). Таким образом, изменяя скорость сортировки рецепторного белка в поздние эндосомы (а, следовательно, и уровень его рециклирования), клетка может изменять эффективность и длительность сигнала, идущего с активированного рецептора ЭФР, находящегося в ранних эндосомах. Именно поэтому механизмы, регулирующие сортировку, вызывают наибольший интерес. Имеются данные, несомненно свидетельствующие о существовании рецептор-специфической сортирующей системы (Благовещенская и др., 1994; French et al., 1994). Однако, конкретные белки, опосредующие этот процесс, неизвестны. Одним из подходов к решению этой задачи может стать изучение роли С-терминального домена и ТК рецептора в опосредовании его сортировки. Полученные данные помогут определить некоторые свойства этих "сортирующих белков" (такие, как способ их активации и механизмы взаимодействия с рецептором), что может явиться первым шагом на пути к их идентификации.

В то же время, эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов является частным случаем внутриклеточного везикулярного транспорта. Очевидно, что ЭФР-специфическая сортирующая система должна каким-то образом взаимодействовать с универсальными беяками-регуляторами везикулярного транспорта, обеспечивающими образование, узнавание и слияние донорных и акцепторных везикул. Результатом взаимодействия этих систем является обеспечение доставки конкретных белков в конечные пункты их назначения.

К таким универсальным регуляторам везикулярного транспорта относятся белки окаймления (клатрин, кавеолин, СОР-белки), адаптины, тримерные G-белки, N-этилмалеимид-чувствительные факторы (NSF) и др. (Elferink et al.,1993; Orci et al., 1993; Ikoncn ct al., 1995). Наиболее многочисленную группу представляют Rab-белки -малые ГТФазы, имеющие высокую степень гомологии с белком p21Ras. К настоящему моменту идентифицировано более 30 членов этого семейства, опосредующих различные этапы транспортных везикулярных пугей. Многочисленность этого семейства позволяет предполагать, что именно они обеспечивают специфичность транспортных реакций. В поздних эндосомах были обнаружены Rab9 и Rab7, причем функция Rab7 остается до сих пор неизвестной (Chavrier et al., 1990; Shapiro et al., 1993). С одной стороны, существуют данные об участии Rab7 в опосредовании перехода из поздних эндосом в лизосомы (Chavrier et al., 1995). С другой стороны, появились работы, позволяющие предполагать вовлечение Rab7 в регуляцию перехода из ранних в поздние зндосомы (Mukhopadhuay et al., 1997). С этой точки зрения Rab7 становится одним из основных кандидатов на роль фактора, обеспечивающего сопряжение работы ЭФР-специфической сортирующей системы с общими механизмами регуляции везикулярного транспорта, однако исследования, посвященные этой проблеме, отсутствуют.

Механизм действия Rab-белков относительно изучен только для Rab5. По аналогии с Rab5 предполагают, что роль Rab-белков заключается в обеспечении специфического взаимодействия допорного компартмента с соответствующим акцепторным и в опосредовании слияния этих мембран. Тем не менее, доя окончательных выводов о роли Rab-белков в регуляции везикулярного транспорта необходимы исследования функционирования каждого конкретного члена семейства.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании механизмов сортировки рецепторов ЭФР из ранних в поздние зндосомы и участия в этом процессе малой ГТФ-азы Rab7.

В саязи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Выяснить роль С-терминального домена рецептора ЭФР, содержащего основные сайты автофосфорилирования, и рецепторной тирозшшшазы в сортировке ЭФР-рецепторных комплексов на путь лизосомалыюй деградации.

2. Исследовать взаимоотношения малой ГТФ-азы Rab7 с рецепторами ЭФР в ходе рецептор-опосредованного эндоцитоза.

3. Охарактеризовать внутриклеточные компартменты, с которыми взаимодействует Rab7.

4. Исследовать влияние деполимеризации тубулинового цитоскелета на ход рецептор-опосредованного эндоцитоза ЭФР.

Научная новизна.

Продемонстрировано, что ТК активность рецептора ЭФР и, в меньшей степени, интактность его С-концевого домена, необходимы для эффективной сортировки рецепторов на путь деградации. Таким образом, именно переход из ранних в поздние эндосомы является ключевым сайтом действия интернализованного рецептора ЭФР.

Показано, что интактность тубулинового цитоскелета, опосредующая перемещение ЭФР-ренепторных комплексов с периферии клетки в охолоядернуго область, не является необходимой для лизосомалыюй деградации рецепторов.

Впервые показано, что изменение локализации Rab7 в клетке происходит в результате действия сигнала, стимулируемого не интернализацией рецептора как таковой, а инициируемого активированной рецепторной ТК. Обнаружено, что локализация интериализованных рецепторов с активной ТК и Rab7 в значительной степени совпадает. Тем не менее, в условиях разрушения тубулинового цитоскелета с помощью нокодазола, ко-локализация структур, содержащих активированный рецептор ЭФР и Rab7, практически отсутствует.

Впервые продемонстрировано, что Rab7 локализован в клетке не только на ранних и поздних эндосомах., но и на мембранах эидоплазматического ретикулума (ЭПР). При стимуляции эндоцитоза Rab7 уходит с ЭПР и ассоциируется с ранними, а затем поздними эндосомами. При этом его количество во фракции цитоскелета увеличивается.

Теоретическое и практическое значение работы.

Большинство работ по исследованию механизмов везикулярного транспорта проводится с использованием лигандов, поступающих в клетку путем жщкофазного эндоцитоза. В этом случае сортировка в поздние эндосомы происходит с очень низкой эффективностью. Использование нами в качестве модели ЭФР-стимулируемого рецептор-опосредованного эндоцитоза позволяет экспериментально получить

синхронную волну транспортных событий, в частности, сортировки, что облегчает исследование сопутствующих этим событиям процессов.

Набор клеточных линий, экспрессирующих мутантные рецепторы ЭФР с различной способностью к вступлению на путь деградации представляет собой удобный инструмент изучения молекулярных механизмов сортировки.

Результаты, полученные в данной работе, изменяют традиционные представления о возможных функциях ИаЬ-белков, существенно расширяя их.

Апробация работы.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Материалы диссертации докладывались на ежегодном Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994), Международном конгрессе по клеточной биологии (Сан-Франциско, США 1996), ХХХШ Международном физиологическом конгрессе (Санкт-Петербург, 1997), Европейском Конгрессе по молекулярной и клеточной биологии (Брайтон, Великобритания, 1997), Европейской научной конференции "Динамика мембран в эндоцитозе" (Сан Федю, Испания, 1997), Всероссийском Симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1998), и на научных семинарах лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего публикаций. Работа изложена на страницах

машинописного текста и иллюстрирована 23 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Культивирование клеточных линий. В работе использовали клетки ГОНЗТЗ, трансфецированные плазмидой, которая содержала кДНК, кодирующую человеческий рецептор ЭФР полной длины (НЕШ4), или рецептор с делецией 126 аминокислотных остатков с С-конца молекулы рецептора (клетки С0126), или рецептор, в котором лизин в положении 721 был заменен на алашга, что привело к потере тирозинкиназной активности (клетки К721). Все три клеточные линии были любезно предоставлены Дж. Шлессинджером (Нью-Йоркский Университет, США).

Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением глютамина и 10% фетальной сыворотки. Для опытов по исследованию динамики эндоцигоза и

субклеточному фракционированию клетки сеяли на пластиковые чашки диаметром 100 мм или 150 мм (Corning Costar) из расчета 50 тыс. клеток на 1см2. В опыт брали монослойные культуры на 3 сут после посева, переводя их ка среду, содержащую 0.25% фетальной сыворотки, за 24 ч до начала эксперимента.

Получение иодированного лиганда. Иодирование ЭФР проводили по модифицированному методу Вайли и Каншшгама (Wiley, Cunningham, 1982) с использованием йодогена (1,3,4,6-тетрахлор-3,б-дифенилглюкоурил) (Sigma) и Na125I. Эксперименты по стимуляции эндоцитоза проводили с применением двух схем. В случае исследования динамики компартментализации использовали схему с предварительным связыванием лиганда для достижения максимальной синхронности прохождения различных этапов эндоцитоза. В этом случае для связывания лиганда с рецепторами монослойные культуры клеток инкубировали в рабочей среде ДМЕМ, содержащей 0,1% БСА и 20 мМ HEPES (рН 7,4) при 4°С в течение 60 мин в присутствии П51-ЭФР в концентрации от 5 до 50 нг/мл в зависимости от условий эксперимента. После отмывки несвязавшепося эпидермальяого фактора роста эндоцитоз стимулировали переводом клеток в рабочую среду, не содержащую лиганда, при температуре 37°С на определенное время. По окончанни инкубационного периода клетки помещали на лед, а среду собирали в виалы и использовали для определения степени деградации лиганда методом осаждения высокомолекулярных пептидов раствором, содержащим 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 1% фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК). Дня удаления лиганда клетки обрабатывали на льду 0,2 М Na-ацетатным буфером (рН 4,5), содержащим 150 мМ NaCl, 3 раза по 3 мин. Na-ацетатный буфер также собирали в виалы для определения количества поверхностно-связанного (иеинтернализованного) 1231-ЭФР. После уксусно-кислотной экстракции клетки промывали несколько раз холодной рабочей средой, а затем фосфатно-солевым буфером (PBS) до восстановления нейтральных значений рН и использовали для субклеточного фракционирования. В экспериментах по изучению динамики внутриклеточного накопления 1251-ЭФР клетки затем лизировали в 1М NaOH и переносили в виалы для определения количества интернализованного лиганда.

Вторая схема "импульсной загрузки" лиганда применялась в случаях, когда предварительное связывание при 4°С оказывалось невозможным, поскольку клетки подвергались предобработке (например, нокодазолом), требующей иных условий. В этом случае клетки инкубировали в рабочей среде, содержащей от 5 до 50 нг/мл 1251-ЭФР, непосредственно при 37°С в течение 15 мин, затем отмывали неинтернализованный лиганд и продолжали инкубацию при 37°С, как описано выше. Обработка клеток нокодазолом. Эксперименты по исследованию эндоцитоза в присутствии нокодазола проводили в соответствии со схемой "импульсной" загрузки

лиганда, описанной выше. Клетки предварительно инкубировали в течение 60 мин при в рабочей среде, содержащей 20 мкг/мл нокодазола (Sigma). Все дальнейшие инкубации проводили с постоянным присутствием нокодазола в рабочей среде. Антитела. Для специфического выявления рецептора ЭФР использовали поликлональные антитела, полученные в нашей лаборатории. Для иммунопреципитации рецептора ЭФР использовали антитела МаЬ108. Эти антитела были любезно предоставлены Дж. Шлессинджером- Поликлональные антитела на Rab7 были любезно предоставлены М. Зериалом (Европейская Молекулярно-биологическая Лаборатория, Гейдельберг). Для специфического выявления фосфорилированных по тирозину белков использовали моноклональные антитела против фосфотирозина (Sigma). Для специфического выявления тубулина использовали моноклональные антитела против тубулина (Sigma). Поликлональные антитела против специфического белка эндоплазматического ретикулума СаВРЗ были любезно предоставлены И. Мажуль (Университет Геттингена).

В качестве вторых антител при иммуноблоттинге использовали козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов кролика, сконъюгированные с пероксидазой (GAR-HRP) (Sigma) и козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов мыши, сконъюгированные с пероксидазой (GAM-HRP) (Sigma). Для иммунофлуоресценции в качестве вторых антител использовали коньюгаты GAR-FITC, GAR-TxRed, Gam-FITC, GAM-TxRed (Molecular Probes, Англия) и GAR-Fluorolink Cy2, GAR-Fluorolink СуЗ, GAM-Fluorolink Cy2 (Amersham).

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток. Клетки окрашивали согласно общепринятой методике. Фиксацию проводили 4%-ным раствором формалина в течение 15 мин. Пермеабилизировали клетки 30 мин при комнатной температуре раствором PBS, содержащим 0,2% сапопипа и 1% БСА (с целью блокирования неспецифического связывания). С первыми антителами и вторыми антителами клетки инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Для стабилизации окраски покровные стекла обрабатывали, используя набор Slow-Fade Antifade Kit (Molecular Probes, Англия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Распределение флуоресцентно-меченых белков в клетках изучали с помощью люминисцентного микроскопа Zeis (Германия) с апохроматическим объективом 100x1.25 (масляная иммерсия) и стандартным набором возбуждающих и запирающих светофильтров. Фотографирование проводили на фотопленку KODAK-T-MAX400. Иммунопреципитация. Для получения тотального лизата клетки суспендировали в 1 объеме буфера RIPA и инкубировали в течение 10 мин. После центрифугирования полученный супернатант использовали как тотальный клеточный лизат.

К фракциям с градиента Перколла добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 1%. Тотальный клеточный лизат или фракции с градиента Перколла, обработанные Тритоном Х-100 инкубировали с соответствующими антителами в течение 1 ч. Лизаты фракций, полученных с 1радиента Перколла, инкубировали 5 мин при 100°С в буфере для фореза и центрифугировали при 15000g в течение 20 мин для седиментации Перколла. Супернатант наносили на форез.

Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в 7,5%-ном или 12,5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия в модификации Лэммли (Laemrali, 1970). Каждая проба содержала 50 мкг белка. Концентрацию белка определяли по методу Петерсона (Peterson, 1977), используя бычий сывороточный альбумин (БСА) для построения калибровочной кривой. Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL Western blotting protocols (Amersham). Регистрировали хемилюминисцентное свечение экспонированием на рентгеновскую пленку Kodak Х-ОМАТ AR, Субклеточное фракционирование.

Субклеточное фракционирование в градиенте плотности Перколла.

Анализ внутриклеточного распределения 1251-ЭФР проводили с помощью метода фракционирования органелл в градие!гте плотности 17%-ного Перколла, как описано в (Корнилова и др., 1987; Sorkin et al., 1988), позволяющего разделить внутриклеточный пул везикул на три основные фракции - ранних эндосом (1,04 г/мл), поздних эндосом (1,05 г/мл) и лизосом (1,07 г/мл). Центрифугирование проводили в течение 25 мин при 50000 g.

Получение мембранной, иитоскелетиой и нитоплазматической фракций.

После проведения эндоцитоза клетки дважды промывали холодным PBS и соскребали в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 2 мМ ЕДТА, 1 мМ PMSF, 10 мМ в-меркалтоэтанола, 10% глицерина, 1 мкг/мл апротинина и 1 мкг/мл лейпептина. Клетки инкубировали 10 мин в этом буфере и разрушали с помощью 30 ходов пестика в гомогенизаторе Даунса. Полученный лизат центрифугировали 10 мин при 1500g для осаждения ядер. Супернатант центрифугировали на бакетном роторе SV40 на центрифуге Spinko L2-65K (Beckman) 20 мин при 15000g. Полученный осадок содержал митохондрии. Супернатант центрифугировали 30 мин при 100000g. Полученный супернатант содержал цитоплазматическуто фракцию. Осадок трижды промывали и инкубировали в буфере, содержащем 1% Тритон Х-100 в течение 60 мин. Компоненты, растворимые в тритоне (мембранная фракция) отделяли от нерастворимых в тритоне (цитоскеяетная фракция) центрифугированием при 100000g в течение 15 мин. Супернатант содержал плазматические мембраны, мембраны

эндоплазматического ретикулума (ЭПР), мембраны аппарата Гольджи, эндосомы, лизосомы и пероксиеомы. Осадок содержал цитоскелет.

Клетки соскребали в ТЭС-буфере (рН 7,6), содержащем 1 мМ ИазУО^ 0.5 мМ РМ8Б и по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина, пропускали 20 раз через иглу и центрифугировали 10 мин при 1500g. Полученный супернатант делили на две части, одну из которых наносили на градиент 17%-ного Перколла, как описано выше. Вторую часть центрифугировали при 15000§ в течение 20 мин. Полученный супернатант центрифугировали 20 мин при 100000g на бакетном роторе 8У40. Полученный после высокоскоростного центрифугирования супернатант являлся цитоплазшической фракцией. Осадок ресуспевдировали, инкубировали 30 мин в буфере, содержащем 1% Тритона Х-100 и центрифугировали 20 мин при 1СШХ^ для разделения осадка (цитоскелет) и супернатанта (эндосомы).

Осадок, полученный после первого центрифугирования (10 мин, 15(Х^) ресуспевдировали, гомогенизировали с помощью 30 ходов пестика в гомогенизаторе Даунса для разрушения структур, ассоциированных с ядрами, и центрифугировали при 1500g в течение 10 мин. Полученный осадок содержал чистые ядра. Супернатант делили на две равные части и одну из них центрифугировали 20 мин при 15000§. Полученный в результате супернатант центрифугировали 20 мин при 1000008, при этом осадок содержал ЭПР и цитоскелет, первоначально ассоциированные с ядрами. Вторую половину супернатанта осаждали 20 мин при 1000(Х^ и полученный осадок ресуспевдировали, инкубировали 30 мин в буфере, содержащем 1% Тритона Х-100 и центрифугировали 20 мин при 1(ХХХХ^ для разделения осадка (цитоскелет, ранее ассоциированный с ядрами и ЭПР) и супернатанта, содержащего мембраны ЭПР.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Исследование роли рецепторной ТК и С-терминалъного домена рецептора в сортировке ЭФР-рецепторных комплексов.

Для исследования механизмов сортировки мы использовали набор трансфектантных клеток, экспрессирующихразличные мутаптные формы рецептора ЭФР: нормальный (клетки НЕН.14), лишенный основных сайтов автофосфоршшрования (клетки СО 126) и рецептор, лишенный ТК активности (клетки К721). С помощью фракционирования в градиенте плотности 17%-ного Перколла мы проанализировали динамику компартментализации мутантных рецепторов и обнаружили, что в случае нормального рецептора значительная часть меченного ЭФР оказывается в поздних эндосомах уже через 5 мин после стимуляции эндоцитоза. В клетках, эхспрессирующих рецептор, лишенный основных сайтов

автофосфорилирования, основная часть лиганд-рецепторных комплексов остается связанной с ранними эндосомами и лишь небольшая часть попадает в поздние. В клетках с инактивироЕанной ТК переход в поздние эпдосомы практически отсутствует. Уровень деградации лиганда, определяемый по выходу низкомолекулярных меченых продуктов деградации в инкубационную среду, коррелировал с количеством ЭФР, попадающим в поздние эндосомы.

1Ш EGFR

0' 15' 30' 60' 90' 0' 15' 30' 60' 90'

HERI4 0 И Ы т т ■м - - -

С1)126 wm ... _

К721 Ц11ММ М

ранние поздние

эндосомы эндосомы

шгтИаЬ7

0' 15' 30' 60' 90' 0' 15' 30' 60' 90'

HER14

CD12«

К751 __ „. _

ранние поздние

эндосомы эндосомы

а б

Рис. 1. Выявление рецептора ЭФР (а) и ЯаЬ7 (б) во фракциях ранних и поздних эндосом клеток НЕК14, С0126 и К721 в контроле (0') и после стимуляции эндоцитоза ЭФР.

Такая закономерность справедлива не только для иодированного лиганда, но и для рецепторов ЭФР. На рис. 1, а представлены результаты биохимического анализа фракций ранних и поздних эвдосом. Видно, что количество рецептора ЭФР, появляющегося в поздних эндосомах после стимуляции эндоцитоза, максимально для клеток HER 14, экспрессирующих нормальный рецептор. Количество рецепторов, лишенных сайтов автофосфорилирования, попадающих в поздние эндосомы, незначительно, а рецепторы, лишенные ТК активности, не обнаруживаются там вовсе.

Таким образом, именно переход из ранних в поздние эндосомы является активным процессом, в котором участвует как ТК рецептора, так и домен, содержащий основные сайты автофосфорилирования. Можно. предположить, что рецепторная ТК фосфорилирует некий "сортирующий" белок (или белки), тем самым активируя его и способствуя его взаимодействию с терминальным доменом рецептора, возможно, через вШ-домены. Такой механизм был продемонстрирован для целого

ряда сигнальных белков-субстратов рецепторной ТК. Таким образом, в клетках существует рецептор-специфическая сортирующая система.

Исследование взаимоотношений малой ГТФ-азы ЛаЬ7 и рецепторов ЭФР в ходе эндоцитоза.

Иммунофлуоресцентный анализ показал, что в случае нормального рецептора происходит быстрое перераспределение этого белка из периферии в околоядерную область клетки и образование там крупного светящегося пятна, тогда как укороченный рецептор появляется в околоядерной области с некоторым запаздыванием и в меньших количествах, образуя не пятно, а кольцо вокруг ядра. Рецептор, лишенный ТК активности, и вовсе не демонстрирует никакого перераспределения. В то же вреш, мы обнаружили, что КаЬ7 демонстрирует высокую степень ко-локализации с нормальным рецептором на поздних стадиях эндоцитоза и не окрашивает эндосомальные структуры, содержащие неактивный рецептор. Таким образом, не сам факт стимуляции эндоцитоза, а именно наличие активированного рецептора является сигналом к перераспределению ЯаЬ7 в околоядерную область.

Биохимический анализ фракций ранних и поздних эндосом клеток с нормальным и мутантными формами рецептора показал, что после стимуляции эндоцитоза ЯаЬ7 ассоциируется в основном с ранними эндосомами, а затем с поздними (рис. 1, б). Появление его в поздних эндосомах коррелирует с накоплением там рецептора ЭФР (рис. 1, а). В клетках НЕШ4 количество КаЬ7, выявляемого во фракции поздних эндосом, максимально, а клетки, экспрессирующие рецептор ЭФР с неактивной ТК, демонстрируют очень низкую степень ассоциации 11аЬ7 как с ранними, так и с поздними эндосомами (рис. 1, б).

Рис. 2. Ко-иммунопреципитация тотального лизата клеток ПЕК 14 в контроле (0') и после стимуляции эндоцитоза ЭФР. Иммунопреципитацию проводили антителами против 11аЬ7 с последующей окраской блота антителами против рецептора ЭФР.

тьи» —> . _

Шйшт

О' 5' 15' 30' 60" 90' «Г«** ЧТ.Л5» <**

преципитация НаЪ7 ■ыяхленце ЕСК-К

Наиболее простым объяснением таких взаимоотношений рецептора ЭФР и КаЬ7 могло являться существование непосредственного взаимодействия двух белков. Однако,

результаты ко-иммунопреципитации антителами против ИаЬ7 с последующим выявлением рецептора ЭФР (рис. 2) показали, что прямая ассоциация этих белков отсутствует.

Анализ эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в условиях деполимеризации микротрубочек.

Исследуя динамику эндоцитоза ЭФР в клетках НЕЯ14 в условиях деполимеризации микротрубочек нокодазолом, мы обнаружили, что дезъинтеграция тубулинового цитоскелета не влияет на динамику доставки меченного лиганда в поздние эндосомы (рис. 3). Биохимический анализ фракций поздних эвдосом также показал, что обработка клеток нокодазолом не влияет на переход рецептора ЭФР в поздние эндосомы (рис. 4, я). Однако, при деполимеризации микротрубочек количество ЯаЬ7 в поздних эндосомах не изменяется при стимуляции эндоцитоза, оставаясь таким же, как в нестимулированных ЭФР клетках (рис. 4, б).

-N00 +N00

1Ш 15' А Л.

0.1! ЛА А /Л

30' Г V / V

0.15

60' ЛА_

0.15

90'

» 10 15 Ь Ш 1)

0' 60' 0' 60'

а ЕСМ -> )*< м

б ИаЬТ —

+ \ос

Рис. 4. Влияние нокодазола на содержание рецептора ЭФР (а) и ЯаЬ7 (б) в поздних эндосомах клеток НЕШ4 в контроле (0') и при стимуляции эндоцитоза ЭФР.

Рис. 3. Динамика компартментализации 1-ЭФР в клетках НЕИ14 в ходе эндоцитоза в присутствии и в отсутствии нокодазола.

Иммунофлуоресцентный анализ эндоцитоза в клетках, обработанных нокодазолом показал, что деполимеризация микротрубочек приводит к резкому изменению морфологии рецептор-содержащих компартментов. В этом случае "пятно" не образуется, рецептор локализован в укрупненных везикулярных структурах, разбросанных по цитоплазме. Характер распределения КаЬ7 также изменяется,, однако ко-локалюация с рецептором практически полностью исчезает , даже р клетках, экспрессирующих нормальный рецептор ЭФР. Следовательно, мы заключаем, что ЯаЬ7 не вовлечен непосредственно в регуляцию перехода рецептора из ранних в поздние эндосомы, поскольку этот переход происходит с прежней эффективностью и в отсутствие 11аЬ7 на эндосомах.

Выявление компартментов, содержащих ЛаЬ7.

Как. было показано выше, КаЬ7 практически не обнаруживается во фракциях перкольного градиента до стимуляции эндоцитоза; после же стимуляции его количество в ранних и поздних эндосомах возрастает в течение всего времени эксперимента. Это подтверждают и данные иммуноблоттинга всех фракций перкольных градиентов, обработанных с помощью количественной денситометрии (рис. 5, б). Такая ситуация возможна в том случае, когда стимуляция клеток ЭФР приводит к быстрому увеличению синтеза КаЬ7. Однако количество ЯаЬ7 в тотальных клеточных лизатах не изменялось после стимуляци эндоцитоза ЭФР. Предварительная обработка клеток циклогексемидом также не влияла па суммарное количество ЯаЬ7 в клетках. Таким образом, увеличение количества ЯаЬ7 в микросомальной фракции может быть объяснено, если предположить, что ИаЬ7 в кестимулированных ЭФР клетках связан с некой структурой, играющей роль депо, из которой КаЬ7 переходит на ранние и поздние эндосомы после стимуляции эндоцитоза

Мы предприняли попытку выяснить, с какими еще внутриклеточными структурами, кроме эндосом, оказывается ассоциирован ЯаЬ7. Методика получения микросомальной фракции, включает только одну стадию: после "мягкого" разрушения клеток путем пропускания их через иглу диаметром 25^ гомогенат центрифугируют при 150С^, а затем супернатант (микросомальная фракция), содержащий эндосомы, лизосомы, везикулы плазматической мембраны (ПМ) и аппарата Гольджи, а также небольшую часть периферического эндоплазматического ретикулума (ЭПР), наносят на градиент Перколла. В осадке же остаются менее 20% неразрушенных клеток, крупные обрывки ПМ, ядра и ассоциированные с ними компартменты. Таким образом, только структуры, содержащиеся в этом осадке, и могут быть депо ЯаЬ7. Поскольку ни ПМ, ни ядра не окрашиваются антителами против й.аЬ7, а количество неразрушенных клеток слишком мало, эти структуры из наших поисков исключались.

Мы предположили, что реальными кандидатами на роль депо ПаЬ7 могут быть структуры, ассоциированные с ядрами и не разрушающиеся при "мягкой" гомогенизации клеток, а именно ЭПР и связанный с ним или с ядрами цитоскелет. Чтобы проверить это предположение, мы подвергли клетки более жесткой процедуре разрушения с помощью гомогенизатора Даунса, позволяющей высвободить более 90% ядерно-ассоциированных структур.

Рис. 5. Выявление ИаЬ7 в контроле (0') и при стимуляции эндоцитоза в осадке (а) и микросомапыюй фракции (б, в) клеток НЕЯ14, полученных с помощью "мягкой" и "жесткой" гомогенизации. Микросомальную фракцию

центрифугировали в градиенте 17%-ного Перколла, затем проводили форез и иммуноблоттинг всех фракций фадиента. б, в - результаты количественной денситометрии иммуноблотов.

а

Яг,1)7

"мишдя" "жесткая"

<г зв' о' за'

—*

"жесткая" гомогенизация (гомогенизатор Даунса)

Действительно, анализ осадков после "мягкой" и "жесткой" гомогенизации клеток (рис. 5, а) показал, что в первом случае в осадке нестимулированных ЭФР клеток содержится значительное количество ЯаЬ7, а после стимуляции эндоцитоза он исчезает из осадка, появляясь в микросомалыгой фракции (рис. 5, б). В случае "жесткой" гомогенизации количество ИаЬ7 в осадках как контрольных, так и стимулированных ЭФР клеток становится минимальным, биохимически недетектируемым (рис. 5, а), а содержание его в микросомальной фракции контрольных клеток, наносимой на градиент, значительно увеличивается (рис. 5, в). Это увеличение связано с появлением пика, совпадающего по плотности с ранними эндосомами, что характерно для ЭПР. Интересно отметить, что после стимуляции эндоцитоза суммарное количество ШзЫ на градиенте не изменяется, но распределение его меняется: появляется пик в области поздних эндосом. При этом характер распределения ЯаЬ7 на градиенте в значительной степени совпадает с распределением 1М1-ЭФР, отражая динамику перехода лиганд-рецепторных комплексов из ранних в поздние эндосомы (рис. 5, б, в).

Анализ фракций, полученных с помощью "жесткой" гомогенизации и дифференциального центрифугирования подтвердил, что ИаЬ7 обнаруживается во фракциях, содержащих мембраны и тотальный цитоскелет и отсутствует в ядрах и цитоплазме (рис. 6).

О' 15' 60' 90'

мембраны

ядра — —

цитоскелет

цитоплазми

Рис. 6. Выявление ИаЬ7 во фракциях мембран, ядер, цитоскелета и цитоплазмы клеток линии НЕК14 в контроле (0') и после стимуляции эндоцитоза ЭФР.

Мы использовали и более сложную схему седиментационного анализа, позволяющую разделить цитоплазму, ЭПР, эндосомы и "цитоплазматический" и ассоциированный с ядрами цитоскелет. Центрифугирование этих фракций в градиенте 17%-ного Перколла с последующим электрофорезом и иммуноблоттингом позволило

показать, что в то время, как количество и положение мембран ЭПР, определяемое по содержанию его резидентного белка СаВРЗ, в градиенте не изменяется (рис. 7, а), количество КаЬ7 в ЭПР уменьшается (рис. 7, б), а в эндосомах - увеличивается после стимуляции эндоцитоза (рис. 7, «).

Рнс. 7. Распределение СаВРЗ (а) и Rab7 (б, в) в градиенте 17%-ного Перколла, полученное в результате количественной денситометрии иммуноблотов, в контроле (О') и после стимуляции эндоцитоза ЭФР в клетках HER14.

Таким образом, депо Rab7 в нестимулированных ЭФР клетках является ЭПР, что подтверждает и иммуноблоттинг полученных фракций с последующей окраской антителами против Rab7 (рис. 8), а также данные двойного непрямого иммунофлуоресцентного анализа распределения Rab7 и Конканавалина А.

цитоскелет, ассоциированный с ядрами

цитоплазма ядра дцр

О' 15' 60' 0' 1? & 0' 15' 60' О' 1? 60' СаВРЗ .----" ■■■ ' ■ ■ - ■

тубулин

КаЪ7

Рис. 8. Выявление ЯаЬ7, СаВРЗ и тубулина во фракциях ЭПР, цитоскелета, ассоциированного с ядрами, ядер и цитоплазмы клеток НЕШ4 в контроле (О') и после стимуляции эндоцитоза.

О'

30'

тубулин

тубулин

тубулин + N00

/А

микросомальная фракция

очищенный цитоскелет

микросомальная фракция

Рис. 9. Распределение на градиенте 17%-ного Перколла тубулина, содержащегося ю фракциях микросом и очищенного цитоскелета клеток НЕЯ14 в контроле и после стимуляции эндоцитоза ЭФР. Представлены результаты количественной денситометрии иммуноблотов.

Взаимоотношения ИаЬ7 с цитоскелетом представляются более сложными. Тах, мы выявили, что КаЬ7 обнаруживается во фракции тотального клеточного цитоскелета, причем его количество там увеличивается после стимуляции эндоцитоза (рис. б). При этом КлЬ7 отсутствует во фракции тубулинового цитоскелета, ассоциированного с ядрами (рис. 8). Так как собственная плотность микротрубочек в градиенте 17%-ного Перколла (рис. 9) совпадает с плотностью ранних эндосом, трудно делать заключение о наличии или отсутствии ассоциации МТ с этой мембранной структурой. Однако, появление пика полимеризованного тубулина (переходящего в микросомальную фракцию при мягкой гомогенизации) в области, совпадающей по плотности с поздними эцдосомами (рис. 9, а)., может свидетельствовать в пользу ассоциации МТ с этим компартментом после стимуляции эндоцитоза.

Увеличение же содержания ИаЬ7 в цитоскелетной фракции при стимуляции ЭФР свидетельствует в пользу его взаимодействия с микротрубочками (возможно, вновь синтезируемыми), хотя механизм этого взаимодействия неясен и требует дальнейшего изучения.

Таким образом, полученные нами данные позволяют усомниться в том, что 11аЬ7 участвует в опосредовании процесса слияния мембран, как это предполагается для всех белков 11аЬ-семейства. В соответствии с нашей гипотезой, ЯаЬ7 локализуется на мембранах ЭПР и после стимуляции эндоцитоза действует наподобие линкерною белка, способствуя ассоциации эндосом и вновь синтезируемых микротрубочек, что определяет пространственную организацию эндоцитозного пути и помогает движению эндосом от периферии клетки в околоядериую область. Поскольку из наших данных следует, что перераспределение ЭФР-рецепторных комплексов в околоядерную область не является необходимым для их лизосомалыюй деградации, можно предполагать, что реакция ЯаЬ7 на стимуляцию эндоцитоза ЭФР отражает общие механизмы функционирования везикулярной системы клетки, выработанные в ходе эволюции. При этом несомненно, что сигнал, узнаваемый ЯаЬ7, имеет отношение именно к активации ТК рецептора, а не к стимуляции эндоцитоза как такового, поскольку перераспределение ЯаЬ7 из ЭПР на эндосомы происходит только в клетках, содержащих рецептор с активной ТК, в то время, как уровня интеркализации активного и неактивного рецепторов сравнимы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что тирозинкиназная активность рецептора ЭФР и, в меньшей степени, интактность его С-концевого домена, содержащего основные сайты автофосфоршшрования, необходимы для эффективной сортировки рецепторов на путь лизосомальной деградации.

2. Методом двойной непрямой иммунофлюорссцегщии продемонстрировано, что в клетках, экспрессирующих рецептор ЭФР с активной ТК, на поздних стадиях эндоцитоза наблюдается значительная .ко-локализация малой ГТФ-азы 11аЬ7 с рецептор-содержащими околоядерными эндосомами. В клетках, экспрессирующих инактивированный рецептор, такая ко-локализация практически отсутствует.

3. Показано, что стимуляция эндоцитоза приводит к увеличению количества КаЬ7 как в ранних, так и в поздних эндосомах клеток, экспрессирующих активный рецептор ЭФР, причем уровень ассоциации этого белка с поздними эндосомами коррелирует с эффективностью сортировки рецептора на путь деградации. В клетках, экспрессирующих рецептор ЭФР с неактивной ТК, степень ассоциации КаЬ7 с эндосомами низок и не демонстрирует никакой динамики.

4. Обнаружено, что деполимеризация тубулинового цитоскелета с помощью нокодазола не оказывает никакого влияния на динамику доставки ЭФР-рецепторных комплексов в лизоссмы, однако резко изменяет морфологию рецептор-содержащих эндосом и приводит к практически полному исчезновению их ко-локализации со структурами, содержащими 1*аЬ7.

5. Впервые показано, что К.аЬ7 локализуется также на мембранах ЭПР. Стимуляция эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов приводит к уменьшению количества ЯаЬ7 в ЭПР и соответствующем увеличении его сначала во фракции ранних, а затем поздних эндосом. Таким образом, ЭПР служит внутриклеточным депо КаЬ7.

6. Впервые продемонстрировано, что при стимуляции эндоцитоза ЭФР-рсцепторных комплексов увеличивается содержание ИаЬ7 во фракции тубулинового цитоскслста, при этом количество полимеризованного тубулина также возрастает.

7. На основании полученных данных сформулирована гипотеза, в соответствии с которой роль ЯаЬ7 не заключается в опосредовании реакций слияния мембран, как это предполагается для всех белков 1<аЬ-ссмсйстса. Скорее, ЛаЬ7 действует наподобие линкерного белка, способствуя ассоциации эндосом и вновь синтезируемых микротрубочек, тем самым организуя архитектуру эндоцитозного пути и помогая движению эндосом от периферии клетки к ее центру.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. А.Д.Благовещенская, И.П.Соколова, Е.С.Корнилова, Н.Н.Никольский. Зависимость эндоцитоза рецепторов эпидермального фактора роста от степени занятости рецепторов // Цитология. 1994. Т. 36. № 7. С. 664-674.

2. И.П.Соколова, И.Б.Вдовина, Е.С.Корнилова, Н.Н.Никольсиш. Компартментализация эпидермального фактора роста (ЭФР) в ходе эндоцитоза в клетках, экспрессиругощих нормальный и лишенный основных сайтов автофосфоршшрования рецептор ЭФР // Цитология. 1995. Т. 37. № 9/10. С. 873-882.

3. И.П.Соколова, А.М.Арнаугов, А.Д.Благовещенская, Н.Н.Никольский, Е.С.Корнилова. Влияние нокодазола на эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) // Цитология. 1998. Т. 40. № 10. С. 855-861.

4. И.П.Соколова, А.М.Арнаугов, Н.Н.Никольский, Е.С.Корнилова. Исследование ассоциации малой ГТФ-азы Rab7 с эндосомами клеток, экепрессирующих нормальный и мутантные формы рецептора эпидермального фактора роста // Цитология. 1998. Т. 40. № 10. С. 862-868.

5. И.Б.Вдовина, И.П.Соколова, Е.С.Корнилова, Н.Н.Никольский. Некоторые особенности отставленного эндоцитоза эпидермального фактора роста в клетках А431// Цитология. 1992. Т. 34. С. 56.

6. A.Blagoveshchenskaya, I.Sokolova, E.Komilova, N.Nikolsky. Dependence of epidermal growth factor endocytosis on its receptor occupancy // Cell Biology International. 1994. Suppl. Vol. P.381.

7. N.Nikolsky, A.Blagoveshchenskaya, I.Sokolova, I.Vdovina, E.Komilova. Regulation of epidermal growth factor (EGF) receptor intracellular trafficking in different cell lines // Europ. J. Cell biol. 1995. Suppl. Vol. P. 130.

8. I.Sokolova, I.Vdovina, E.Komilova, N.Nikolsky. Association of Rab7 with endosomal compartments containing normal and mutant EGF-receptor // Molecular Biology of the Cell. 1996. Vol.7. P.593(a).

9. И.П.Соколова, И.Б.Вдовина, Е.С.Корнилова, Н.Н.Никольский. С-концевой участок рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) необходим для вступления ЭФР-рецепторных комплексов путь деградации /'/ Цитология. 1996. Т.38. № 2. С.250.

10. E.S.Komilova, l.P.Sokolova, A.D.Blagoveshchenskaya, K.O.Avrov, N.N.Nikolsky. Regulation of epidermal growth factor receptor trafficking in mammalian cells // P003.15. ХХХГО International Congress of Physiological Sciences (St. Petersburg, 1997).

11. E.Kornilova, I.Sokolova, I.Vdovina, N.Nikolsky. Rab7 recognizes at least two compartments on endocytic pathway of epidermal growth factor receptors (EGF-R) H H-16, European Congress for Molecular Cell Biology (Brighton. 1997).

12. И.П.Соколова, А.М.Арнаутов, Н.Н.Никольский, Е.С.Корнилова. Мутантные рецепторы ЭФР обладают различной способностью стимулировать ассоциацию Rab7 с ранними и поздними эндосомами // Программа Всероссийского Симпозиума "Биология клетки в культуре". 1998. С. 9.