Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция эндоцитоза рецепторов эпидермального фактора роста

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Корнилова, Елена Сергеевна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие принципы функционирования рецепторных тирозинкиназ.

2,1.1. Структура РТК.

2.1.2 Активация РТК.

2.1.3 Механизм активации сигнальных белков.

2.1.4. Внутриклеточные сигнальные пути.

2.1.5. Механизмы регуляции сигнала.

2.2. Рецептор ЭФР - член семейства рецепторных киназ егЬВ.

2.2.1. Структура эпидермального фактора роста и его рецептора.

2.2.2. Лиганды и рецепторы семейства егЬВ.

2.2.3. Аффинность рецептора ЭФР.

2.2.4. Пути диверсификации сигнала, стимулируемого рецептором ЭФР.

2.3. Механизмы регуляции везикулярного транспорта.

2.3.1. Белки окаймления.

2.3.2. Регуляция слияния мембран.

2.3.2.1. \5=-8\АР^АНЕ комплексы.

2.3.2.2. КаЬ-белки и их эффекторы.

2.3.2.3. Функции РаЬ-белков.

2.3.3. Роль липидов в регуляции транспортной функции мембран.

2.3.3.1. Фосфатидилинозитол-З-киназы.

2.3.4. Убиквитинирование и везикулярный транспорт.

2.3.5. Роль цитоскелета в регуляции везикулярного транспорта.

2.4. Эндоцитоз.

2.4.1. Общие представления об эндоцитозе.

2.4.2. Компартменты эндоцитозного пути.

2.4.3. Рецептор-опосредованный эндоцитоз ЭФР.

2.4.4. Молекулярные аспекты функционирования эндосом. Принцип мозаичности.

2.5. Эндоцитоз и передача сигнала.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Клеточные линии.

3.2. Лиганды и их производные.

3.2.1. Получение ЭФР и его производных.

3.2.2 Иодирование лигандов.

3.3. . Исследование динамики эндоцитоза ЭФР.

3.3.1. Стимуляция эндоцитоза по схеме с предварительным связыванием лиганда.

3.3.2. Стимуляция эндоцитоза по схеме "импульсной" загрузки лигандов.

3.3.3. Определение степени деградации лиганда.

3.3.4. Рециклирование ЭФР.

3.4. Субклеточное фракционирование.

3.4.1. Фракционирование органелл в градиентах плотности Перколла.

3.4.2. Очистка фракций на градиенте сахарозы.

3.5. Обработка результатов экспериментов по динамике эндоцитоза с применением меченых лигандов.

3.6. Фосфорилирование материала фракций.

3.7. Электронно-микроскопические исследования фракций.

3.8. Обработка клеток ингибиторами.

3.9. Анализ популяции поверхностных рецепторов методом Скэтчарда.

3.10. Исследование распределения клеток по фазам клеточного цикла с помощью проточной флюорометии.

3.11. Исследование включения 14С-тимидина в ДНК клеточных ядер.

3.12. Антитела.

3.13. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток.

3.14. Иммунопреципитация.

3.15. Электрофорез.

3.16. Иммуноблоттинг.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Характеристика основных компартментов эндоцитозного пути ЭФР-рецепторных комплексов.

4.1.1. Идентификация эндоцитозных компартментов.

4.1.2. Морфология фракций, содержащих ЭФР.

4.1.3. Состояние рецептора ЭФР в эндосомах.

4.2. Рециклирование ЭФР-рецепторных комплексов.

4.3. Внутриклеточный процессинг рецепторов ЭФР с различной аффинностью.

3.2. Лиганды и их производные.

3.2.1. Получение ЭФР и его производных.

3.2.2 Иодирование лигандов.

3.3. . Исследование динамики эндоцитоза ЭФР.

3.3.1. Стимуляция эндоцитоза по схеме с предварительным связыванием лиганда.

3.3.2. Стимуляция эндоцитоза по схеме "импульсной" загрузки лигандов.

3.3.3. Определение степени деградации лиганда.

3.3.4. Рециклирование ЭФР.

3.4. Субклеточное фракционирование.

3.4.1. Фракционирование органелл в градиентах плотности Перколла.

3.4.2. Очистка фракций на градиенте сахарозы.

3.5. Обработка результатов экспериментов по динамике эндоцитоза с применением меченых лигандов.

3.6. Фосфорилирование материала фракций.

3.7. Электронно-микроскопические исследования фракций.

3.8. Обработка клеток ингибиторами.

3.9. Анализ популяции поверхностных рецепторов методом Скэтчарда.

3.10. Исследование распределения клеток по фазам клеточного цикла с помощью проточной флюорометии.

3.11. Исследование включения 14С-тимидина в ДНК клеточных ядер.

3.12. Антитела.

3.13. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток.

3.14. Иммунопреципитация.

3.15. Электрофорез.

3.16. Иммуноблоттинг.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Характеристика основных компартментов эндоцитозного пути ЭФР-рецепторных комплексов.

4.1.1. Идентификация эндоцитозных компартментов.

4.1.2. Морфология фракций, содержащих ЭФР.

4.1.3. Состояние рецептора ЭФР в эндосомах.

4.2. Рециклирование ЭФР-рецепторных комплексов.

4.3. Внутриклеточный процессинг рецепторов ЭФР с различной аффинностью.

4.4. Насыщаемость процессов интернализации и сортировки ЭФР.

4.5. Нестабильность параметров эндоцитоза.

4.6. Влияние базального уровня фосфорилирования рецептора ЭФР на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов в клетках А431.

4.7. Эндоцитоз ЭФР в клетках эпителия молочной железы мыши линии НС11.

4.7.1. НС11 - ЭФР-зависимые клетки.

4.7.2. Эндоцитоз ЭФР в клетках НС 11.

4.7.3. Влияние ЭФР на метаболизм с-егЬВ2 в клетках НС11.

4.7.4. Эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов на разных стадиях клеточного цикла.

4.7.5. Влияние условий культивирования клеток НС11 на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов.

4. 8. Идентификация доменов рецептора ЭФР, принимающих участие в регуляции его эндоцитоза.

4.9. Влияние внутриэндосомального pH на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов.

4.10. Роль тубулинового цитоскелета в эндоцитозе ЭФР-рецепторных комплексов.

4.11. Малая ГТФ-аза Rab7 как организатор пространственной структуры эндоцитозного пути ЭФР-рецепторных комплексов.

4.12. ФИ-З-К принимает участие в регуляции сортировки ЭФР-рецепторных комплексов.

4.13. Участие киназ Src-семейства в регуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

7. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция эндоцитоза рецепторов эпидермального фактора роста"

Все клетки многоклеточного организма постоянно подвергаются воздействию разнообразных внешних сигналов, призванных обеспечивать адекватный ответ на изменения микроокружения. Реакция клетки на внеклеточные сигналы осуществляется через набор рецепторов на плазматической мембране (ПМ), специфически реагирующих на каждый конкретный стимул. Мембранные рецепторы могут быть разделены на ряд семейств на основе общности лигандов, которые они узнают, биологических ответов, которые они индуцируют, или на основе их первичной структуры, что стало возможным лишь в последние годы.

Рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР) является одним из наиболее ярких и наиболее изученных представителей семейства рецелторных тирозинкиназ (РТК). Он опосредует чрезвычайно широкий спектр клеточных ответов, от регуляции пролиферации и дифференц'ировки, до клеточного выживания или подвижности клетки. Одной из первых реакций на связывание ЭФР со своим рецептором на мембране является активация рецепторной ТК. Сейчас уже считается общепризнанным, что это событие, так же как и последующее автофосфорилирование тирозиновых остатков на С-терминальном домене рецептора, абсолютно необходимо для стимуляции сигнальной передачи (Ullrich, Schiessinger, 1990).

С другой стороны, образование ЭФР-рецепторных комплексов на ПМ инициирует процесс, называемый эндоцитозом. В ходе эндоцитоза ЭФР и рецептор попадают внутрь клетки через так называемые окаймленные ямки, проходят через ряд эндосомальных компартментов и деградируют в лизосомах (Dunn et al., 1986). Исследования эндоцитоза рецептора ЭФР начали бурно развиваться в начале 80х годов. Были описаны основные структуры, в которых обнаруживаются ЭФР-рецепторные комплексы после интернализации: периферические тубуловезикулярные эндосомы и крупные мультивезикулярные тела (МВТ) в основном околоядерной локализации (Miller et al., 1986). Если относительно первых существует общее согласие - это ранние сортирующие эндосомы (РЭ), то представление о функции вторых зависит от теории биогенеза эндосом, которой придерживается данный исследователь. Так, одни считают, что ранние эндосомы, постепенно перемещаясь к ядру, превращаются в поздние («созревают»), причем степень зрелости определяется количеством внутренних везикул, куда попадают молекулы, направляемые на деградацию. Таким образом, МВТ и есть поздние эндосомы (ПЭ). Жизненный цикл МВТ заканчивается их взаимодействием с лизосомами (Murthy,

1991). Представители другой школы (Griffiths, Gruenberg, 1991) рассматривают ранние и поздние эндосомы как предсуществующие компартменты, связь между которыми осуществляют эндосомальные везикулы-переносчики, которыми, по мнению авторов гипотезы, и являются МВТ. Формирование этих переносчиков на РЭ требует наличия сниженного внутриэндосомального рН, а слияние с ПЭ - интактных микротрубочек (МТ). Следовательно, перемещение в околоядерную область является непременным условием попадания в ПЭ. В контексте этой гипотезы именно ПЭ, а не лизосомы, рассматриваются как основной деградационный компартмент клетки. Следует отметить, что споры вокруг этих теорий ведутся до сих пор, что связано во-первых, с неопределенностью границы между РЭ и ПЭ, а во-вторых, с использованием различных экспериментальных систем и маркеров эндоцитоза. Таким образом, вопрос о том, что такое поздние эндосомы, как осуществляется переход из ранних эндосом в поздние и как этот переход регулируется, остается открытым.

В течение многих лет путь лизосомальной деградации для ЭФР-рецепторных комплексов считался ультимативным, единственно возможным (Carpenter, 1987). Эндоцитоз, таким образом, рассматривался как механизм негативной регуляции сигнала, стимулируемого ЭФР. Также жестко запрограммированными считались скорости интернализации и деградации ЭФР и рецептора для каждого типа клеток. Однако данные о роли ТК рецептора и сайтов его автофосфорилирования в регуляции разных стадий эндоцитозного пути в начале предпринятой нами работы были ограниченны и чрезвычайно противоречивы. Так, относительно стадии интернализации существовали 2 точки зрения:(а) - лишенные ТК активности рецепторы не интернализуются (Wells et al., 1990);(б) - такие рецепторы интернализуются, но рециклируют. Активация рецептора при этом необходима для направления его на путь деградации (Honneger et al. 1987а). С другой стороны, Вайли и соавторы (Wiley et al., 1991) в кинетических экспериментах не обнаружили необходимости активации рецепторной ТК для вступления на путь деградации. Таким образом, вопрос об участии ТК рецептора и его доменов в регуляции собственного эндоцитозного пути оставался открытым.

Практически неизученными являются проблемы связи между эндоцитозом ЭФР-рецепторных комплексов и такими общеклеточными регуляторными механизмами и системами, как уровень рН в эндосомах и цитоскелет. Также не исследованы взаимоотношения между рецептором и системой универсальных клеточных регуляторов везикулярного транспорта, таких, как, например, Rab белки. Отсутствует понимание того, одни и те же или разные механизмы вовлечены в регуляцию рецептор-опосредованного эндоцитоза ЭФР и жидкофазного эндоцитоза. Неизвестно, какие еще белки вовлечены в регуляцию эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов.

Только решение всех этих проблем позволит понять ту роль, которую эндоцитоз действительно играет в регуляции проведения сигналов, стимулируемых ЭФР.

1.1.Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось выяснение основных механизмов регуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов. В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

1. Охарактеризовать основные компартменты эндосомального пути, выяснить состояние рецептора ЭФР в эндосомах, определить, насколько ультимативным для ЭФР-рецепторных комплексов является деградационный путь.

2. Выяснить, участвуют ли ТК рецептора и его домены, в том числе содержащие основные сайты автофосфорилирования, в регуляции эндоцитоза.

3. Охарактеризовать эндоцитоз рецептора ЭФР в ЭФР-зависимых клетках линии НС11.

4. Выяснить, каким образом влияют на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов такие регуляторные механизмы и системы, как уровень рН в эндосомах и микротрубочки. Сравнить их влияние на жидкофазный эндоцитоз (пиноцитоз), используя в качестве маркера пероксидазу хрена (ПХ).

5. Исследовать роль, которую играют в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР такие белки, как малая ГТФаза Rab7, а также фосфатидилинозитол-3-киназа (ФИ-З-К) и киназы Src-семейства.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Корнилова, Елена Сергеевна

6. ВЫВОДЫ

1. Путь лизосомальной деградации не является ультимативным для ЭФР-рецелторных комплексов. Часть активированных рецепторов ЭФР после интернализации рециклирует обратно в плазматическую мембрану, причем существуют два пути - из ранних и из поздних эндосом. Рециклирование характерно для всех типов клеток, вне зависимости от их природы, степени зависимости от ЭФР и уровня экспрессии рецептора ЭФР.

2. Тирозинкиназа рецептора и его С-терминальный домен являются необходимыми для сортировки ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, что означает вступление на путь деградации. ТК-зависимая сортировка насыщается при относительно невысоких значениях концентрации ЭФР. Участок рецептора с 1022-го по 1123-й аминокислотный остаток обеспечивает максимальную скорость ТК-зависимого перехода в ПЭ, в то время как домен, состоящий из последних 63 остатков, играет модуляторную роль.

3. Все параметры эндоцитоза рецептора ЭФР, а именно скорости интернализации, рециклирования, сортировки и деградации, могут изменяться в широких пределах в клетках одной и той же линии в зависимости от внешних условий. Способность клетки регулировать соотношение между путями деградации и рециклирования обеспечивает возможность контроля времени жизни активированного рецептора.

4. Анализ эндоцитоза рецептора ЭФР в ЭФР-зависимых клетках эпителия мыши линии НС11 показал, что нет никаких различий в параметрах эндоцитоза ЭФР в ранней и поздней G1-фазах, различающихся по потребности в присутствии ЭФР в среде для их прохождения. Однако эндоцитоз ЭФР полностью блокируется в митозе на стадии интернализации.

5. Активация рецептора ЭФР в клетках НС11 приводит к активации гомологичного рецептора с-егЬВ2, не имеющего собственного лиганда, и стимуляции его эндоцитоза по деградационному пути. Таким образом, эндоцитоз вовлечен в модуляцию процесса передачи сигналов не только с собственного рецептора, но и с с-егЬВ2, что может являться одной из причин плейотропности действия этого ростового фактора.

6. Ингибитор вакуолярной протонной помпы Бафиломицин А1 и нокодазол, деполимеризующий микротрубочки, практически не влияют на динамику доставки ЭФРрецепторных комплексов в ПЭ и лизосомы. Однако, эти агенты блокировали поступление в поздние эндосомы пероксидазы хрена (ПХ), маркера пиноцитоза. Рецепторы ЭФР, интернализованные в условиях насыщения ТК-зависимой сортировки, демонстрировали поведение, сходное с поведением ПХ. Эти данные предполагают существование различных механизмов регуляции ТК-зависимой и ТК-независимой компонент эндоцитоза рецепторов ЭФР.

7. Малая ГТФаза Rab7 не участвует в регуляции слияния мембран в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР. Скорее, Rab7 опосредует взаимодействие рецептор-содержащих структур с микротрубочками, обеспечивая их перемещение из периферии в околоядерную область и организуя тем самым архитектуру эндоцитозного пути.

8. Подавление активности ФИ-З-киназы вортманнином блокирует рецептор в ранних эндосомах, но не препятствует перемещению рецептор-содержащих структур в околоядерную область. Одновременно вортманнин вызывает укрупнение везикул, содержащих рецептор ЭФР. Эти, а также другие представленные в диссертации данные, свидетельствуют в пользу того, что переход ЭФР-рецепторных комплексов из РЭ в ПЭ связан с их доставкой во внутренние пузырьки МВТ, в формировании которых, по видимому, ключевую роль играет ФИ-З-киназа. Этот переход может осуществляться и непосредственно в околоядерной области.

9. Совокупность полученных нами данных позволяет говорить о том, что биогенез эндосом происходит по механизму созревания, т. е. постепенного превращения ранних эндосом в поздние.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Корнилова, Елена Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский H.H. (1987). Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология, 29:904-910.

2. Teslenko L.V, Kornilova E.S., Sorkin A.D., Nikolsky N.N. (1987). Recycling of epidermal growth factor in A431 cells. FEBS Letters, 221 (1): 105-109.

3. Корнилова E.C., Боброва Д.Ф., Нестеров A.M., Никольский H.H., Сорокин А.Б. (1988) Выявление интактного рецептора ЭФР в эндосомах клеток А431. Цитология, 30:291-297.

4. Sorkin A., Kornilova E, Teslenko L., Sorokin A., Nikolsky N. (1988). Recycling of epidermal growth factor-receptor complexes in A431 cells. BBA, 1011: 88-96.

5. Нестеров A.M., Вдовина И.Б., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. (1991). Прямое доказательство фосфорилирования по тирозину рецепторов эпидермального фактора роста, интернализованных в эндосомах клеток А431. Цитология, 33:26-31.

6. A. Sorkin, E.Kornilova, S. Krolenko. (1992) Two recycling pathways of epidermal growth factor receptor complexes in A431 cells. NATO ASI Series, Vol H62: (180-186) Endocytosis. Ed. by P. J. Courtoy, Springer Verlag, Berlin- Heidelberg.

7. E.S. Kornilova, D. Taverna, W. Hoeck and N.E.Hynes. (1992) Surface expression of erb B-2 protein is post-transcriptionally regulated in mammary epithelial cells by epidermal growth factor and by culture density. Oncogene, 7: 511-519.

8. Вдовина И.Б., Бурова Е.Б., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. (1993) Сравнительный анализ раннего и позднего эндоцитоза эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология, 35:60- 67.

9. Благовещенская А.Д., Соколова И.П., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. (1994). Зависимость эндоцитоза эпидермального фактора роста от степени занятости рецепторов. Цитология, 36:664-674.

10. Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. (1995). Эндоцитоз эпидермального фактора роста (ЭФР) в ЭФР-зависимых клетках эпителия молочной железы мыши линии НС11. Цитология, 37:883-892.

11. Авров А.К., Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. (1996). Зависимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня активности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология, 38:1084-1091.

12. Kornilova Е., Sorkina Т., Beguinot L., Sorkin А. (1996) Carboxyl-terminal receptor domain 10221123 is responsible for the lysosomal targeting of EGF receptors. J.B.C., 271:30340-30346.

13. Авров К.О., Аксенов Н.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. (1998) ЭФР-зависимые клетки эпителия молочной железы линии НС11 демонстрируют высокую степень синхронизации клеточного цикла при запуске эпидермальным фактором роста. Цитология, 40:958-963.

14. Соколова И.П., Арнаутов A.M., Благовещенская А.Д., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. (1998а) Влияние нокодазола на эндоцитоз рецептора эпидермального фактора роста. Цитология,40:855-861.

15. Соколова И.П., Арнаутов A.M., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. (19986). Исследование ассоциации малой ГТФазы Rab7 с эндосомами клеток, экспрессирующих нормальную и мутантные формы рецептора ЭФР. Цитология, 40:862-868.

16. Авров К.О., Аксенов Н.Д, Меликова М.С., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. (1999). Исследование эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов на разных стадиях клеточного цикла. Цитология, 42:1007-1013.

17. Арнаутов A.M., Арнаутова И.П., Железнова Н.Н., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. (1999). Ассоциация МАР-киназы с эндоплазматическим ретикулумом в клетках NIH3T3 (HER 14) и А431. Цитология, 41:380-385.

18. Железнова Н.Н., Никольский Н.Н. Корнилова Е.С. (2001а). Влияние вортманнина на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов в клетках А431. Цитология, 43:156-165.

19. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

20. Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л. Наука. 200 с

21. Соркин А.Д., Богданова Н.П., Никольский Н.Н. Сорокин А.Б. 1985. Влияние аминов на рН в лизосомах клеток ЗТЗ. Цитология. 27: 203 208.

22. Решетникова Г.Ф., Нестеров A.M., Никольский Н.Н. 1990. Фосфорилирование и тирозинкиназная активность интернализованного комплекса эпидермального фактора роста и его рецептора. Цитология. 32 :140-146.

23. Achiriloaie М., Barylko В., Albanesi J.Р. 1999. Essential role of the dynamin pleckstrin homology domain in receptor-mediated endocytosis. Mol. Cell Biol. 19: 1410-1415.

24. Adamson, P., Paterson, H. P., and Hall, A. 1992. Intracellular localization of the P2I rho proteins. J. Cell Biol. 119:617-627.

25. Ahn S„ Maudsley S., Luttrell L, Lefkowitz R., Daaka Y. 1999. Scr-mediated tyrosine phosphorylation of dynamin is required for Рг-adrenergic receptor internalization and mitogen-activated protein kinase signaling. J. Biol. Chem. 274 :1185-1188.

26. Alexandrov K, Horiuchi H, Steele-Mortlmer 0, Seabra MC, Zerial M: 1994/Rab escort protein-1 is a multifunctional protein that accompanies newly prenylated rab proteins to their target membranes. EMBO J. 13:5262-5273/

27. Aimers W, 2001. Fusion needs more than SNAREs. Nature. 409: 567-568.

28. Amerik.A. Y., Nowak J., Swaminathan S., and Hochstrasser M. 2000. The Doa4 deubiquitinating enzyme is functionally linked to the vacuolar protein-sorting and endocytic pathways. Mol. Biol. Cell 11:3365-3380.

29. Amsler K., Kuwada S.K. 1999. Membrane receptor location defines receptor interaction with signalling proteins in a polarized epithelium. Am. J. Physiol. 276:C91-C101.

30. Anderson K., Coadwell J., Stephens L, Hawkins P. 1998. Translocation of PDK-1 to the plasma membrane is important in allowing PDK-1 to activate protein kinase B. Curr. Biol. 8:684-691.

31. Andres D.A., Seabra M.C., Brown M.S., Armstrong S.A., Smeland Т.Е., Cremers F.PM., Goldstein J.L. 1993. cDNA cloning of component A of Rab geranylgeranyl transferase and demonstration of its role as a Rab escort protein. Cell 73:1091-1099

32. Anlento P., Emans N., Griffiths G, Gruenberg J. 1993. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol. 123 :1373-1388.

33. Aniento F., Gu F., Parton R.G., Gruenberg J. 1996. An endosomal beta COP is involved in the pH-dependent formation of transport vesicles destined for late endosomes. J. Cell Biol. 133: 2941.

34. Apodaca G., Katz LA., Mostov K.E. 1994. Receptor-mediated transcytosis of IgA in MDCK cells is via apical recycling endosomes. J Cell Biol. 125 : 67-86.

35. Araki N., Johnson M.T., Swanson J.A. 1996. A role for phosphoinositide 3-klnase in the completion of Macropinicytosis and phagocytosis by macrophages. J. Cell Biol. 135 :1249-1260.

36. Atsumi T., Hosoi K., Ueha T. 1994. Involvement of high-affinity binding site for EGF receptor in formation of rounding in A-431 epidermoid carcinoma cells. Horm. Metab. Res. 26:141-144.

37. Ayad N., Hull M., Mellman I. 1997. Mitotic phosphorylation of rab4 prevents binding to a specific receptor on endosomes membranes.EMBO J. 16:4497-4507.

38. Babst M., Odorizzi G., Estepa E.J., Emr S.D. 2000. Mammalian tumor susceptobility gene 101 (TSG101) and the east homologue, Vps23p, both function in late endosomal trafficking. Traffic. 1: 248-258.

39. Backer J. M. 2000. Phosphoinositide 3-Kinases and the Regulation of Vesicular Trafficking. Mol. Cell Biol. Res. Commun. 3 :193-204.

40. Bae Y, Kang S„ Seo M., Baines I., Tekle £, Chock P., Rhee S. 1997. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. J. Biol. Chem. 272:217-221.

41. Baenzinger J.U., Fiete D. 1986. Separation of two populations of endocutic vesicles Involved in receptor-ligand sorting in rat hepatocytes. J. Biol. Chem. 261: 7445-7454.

42. Bailly E, McCaffrey M, Touchot N, ZahraouiA, Goud B, Bornens M: 1991. Phosphorylation of two small GTP-binding proteins of the Rab family by p34cdc2. Nature. 350:715-718

43. Balch W.E., Dunphy W.G., Braell W.A., Rothman J.E. 1984. Reconstitute of the transport of protein between succesive compartments of the Golgi measured by coupled incorporation of N-acetylglucoseamine. Cell. 39:405-416.

44. Baldini G., Hohl T., Lin H.Y., Lodish H: 1992. Cloning of a Rab3 isotype predominantly expressed in adipocytes. Proc. Natl. Acad.Sci.USA.89:5049-5052

45. Barbieri M.A., Li G„ Colombo M.I., Stahl P.D: 1994. Rab5, an early acting endosomal GTPase, supports in vitro endosome fusion without GTP hydrolysis. J. Biol. Chem. 269:18720-18722.

46. Barlowe C, Orci L., Yeung T., Hosobuchi M., Hamamoto S., Salama N., Rexach M. F, Ravazzola M.F., Amherdt M., Shechman R. 1994. COPII: a membrane coat formed by Sec proteins that drive vesicle budding from the endoplasmic reticulum. Cell. 77: 895907.

47. Barr F.A., Nakamura N., Warren G. 1998. Mapping the interaction between GRASP65 and GM130, components of a protein complex involved in the stacking of Golgi cisternae. EMBO J. 17:3258-3268.

48. Barr V.A., Phillips S.A., Taylor S. I., Haft C.R. 2000. Overexpression of a novel sorting nexin, SNX15, affects endosome morphology and protein trafficking. Traffic. 1 : 904-916.

49. Barrowman J., Sacher M., Ferro-Novick S. 2000. TRAPP stably associates with the Golgi and is required for vesicle docking. EMBO J. 19: 862-869.

50. Bastiaens P., Majoul I., Verveer P., Soling H.-D., Jovin T. 1996. Imaging the intracellular trafficking and state of the AB5quaternary structure of cholera toxin . EMBO J. 15:4246-4253.

51. Bauerfeind R., Takei K., De Camilli P. 1997. Amphiphysin I is associated with coated endocytic intermediates and undergoes stimulation-de-pendent dephosphorylation in nerve terminals. J .Biol. Chem. 272: 30984-30992.

52. Baulida J., Kraus M.H., Alimandi M„ Di Fiore P.P., Carpenter G. 1996. All ErbB receptors other than the epidermal growth factor receptor are endocytosis impaired.J Biol Chem . 271:.5251-7.

53. Beerli R., Hynes N. 1996. Epidermal growth factor-related peptides activate distinct subsets of ErbB receptors and differ in their biological activities. J.Biol. Chem. 271: 6071-6076.

54. Beerly R., Graus-Porta D., Woods-Cook K„ Chen X., Yarden Y., Hynes N. 1995. Neu differentiation factor activation of ErbB-3 and ErbB-4 is cell specific and displays a differential requirement for ErbB-2. Mol. Cell. Biol. 15: 6496-6505.

55. Beguinot L, Liall R.M., Willingham M. C., Pastan I. 1984. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells in due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol.81. P.2384-2388.

56. Benmerah A., Lamase C., Begue B., Schmid S., Dautry-Varsat A., Cerf-Bensussan. 1998. AP-2:Eps15 interaction is required for receptor-mediated endocytosis. J. Cell Biol.140:1055-1062.

57. Bergeron J.J.M., Cruz J., Khan M.N., Posner B.J. 1985. Uptake of insulin and other ligands into receptor-rich endocytic components of target cells: the endosomal apparatus. Ann. Rev. Physiol. 47: 383-403.

58. Bergeron. J.J., Di Guglielmo G.M., Baass P.C., Authier F., Posner B.I. 1995. Endosomes, receptor tyrosine kinase internalization and signal transduction. Biosci. Rep. 15:411-418.

59. Bertis P.J., Chen W.S., HublerL., Lazar C.S., Rosenfeld M., Gill G. 1988. Alteration of epidermal growth factor receptor activity by mutation of its primary carboxy-terminal site of tyrosine self-phosphorylation. J. Biol. Chem. 263: 3610-3617.

60. Boll W., Gallusser A., Kirchhausen. T. 1995. Role of the regulatory domain of the EGF-receptor cytoplasmic tail in selective binding of the clathrin-associated complex AP-2. Curr. Biol. 5: 1168— 1178.

61. Boni-Schletzler M., Pilch P. 1987. Mechanism of epidermal growth factor receptor autophosphorylation and high-affinity binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:7832-7836.

62. Boonstra J., van der Saag P.T., Feijen A., Bisschop A., de Laat S. 1985. Epidermal growth factor, but not nerve growth factor, stimulates tyrosine-specific protein-kinasee activity in pheochromocytoma (PC12) plasma membranes. Biochimie. 67:1177-1183.

63. Bourne H.R., Sanders D.A., McCormick F. 1991.The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature. 349:117-127.

64. Bowman E, Siebers A., Altendorf K. 1988. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7972-7976.

65. Branch W.J., Mullock B.M., Luzio P. 1987. Rapid subcellular fractionation of the liver endocytic compartments involved in transcytosis of polymeric immunoglobulin A and endocytosis of asialofetuin. Biochem. J. 244: 311-315.

66. Bridges K., Harford J., Ashwell G., Klausner R.D. 1982. Fate of receptor and ligand during endocytosis of asialoglycoproteins by isolated hepatocytes. Prot. Nat. Acad. Sci. USA. 79: 350354.

67. Brown D., London E. 2000. Structure and function of spingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275:17221-17224.

68. Bruns D., Jahn R. 1995 .Real-time measurement of transmitter release from single synaptic vesicles. Nature. 377:62-5.53