Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие зависимых от убиквитина систем в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Участие зависимых от убиквитина систем в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР"

На правах рукописи

МЕЛИКОВА Мария Сергеевна

УЧАСТИЕ ЗАВИСИМЫХ ОТ УБИКВИТИНА СИСТЕМ В РЕГУЛЯЦИИ ЭНДОЦИТОЗА РЕЦЕПТОРА ЭФР

03.00.25

гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук Корнилова Елена Сергеевна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Константинова Ирина Михайловна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Перцева Марианна Николаевна Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского Государственного Университета

Защита состоится 25 марта 2005 года в 12 час на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр.,

Д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «м» февраля 2005 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

^ЭД^И.И.

Марахова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальностьпроблемы.

Сигналы, стимулируемые эпидермальным фактором роста (ЭФР), играют исключительно важную роль на ранних стадиях формирования клеток эпителиальной линии, в регуляции пролиферации и дифференцировки/дедифференцировки зрелых клеток различных тканей, в регуляции выживаемости и подвижности клеток, а нарушения в их функционировании зачастую приводит к злокачественной трансформации. Биологические эффекты ЭФР опосредуются в клетке его рецептором - трансмембранным белком, цитоплазматический домен которого обладает тирозинкиназной активностью. Рецепторы ЭФР чрезвычайно широко экспрессируются различными типами клеток.

Взаимодействие ЭФР с рецептором стимулирует два ряда событий: с одной стороны, инициируются каскадные сигнальные пути, с другой стороны, происходит поступление ЭФР-рецепторных комплексов внутрь клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние эндосомы (РЭ), где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану (ПМ), а остальные попадают в предлизосомальный компартмент, называемый поздними эндосомами (ПЭ), после чего деградируют в лизосомах (Никольский и др., 1987). В последние годы появляются данные, отводящие рецептору, находящемуся в эндосомах (как ранних, так и поздних), самостоятельную роль в реализации сигнала, стимулируемого ЭФР. В связи с этим изучение механизмов регуляции вступления рецептора на путь деградации и продвижения по нему приобретает большое значение.

Несмотря на длительную историю исследований, ответа на вопрос о том, как именно происходит сортировка ЭФР-рецепторных комплексов на путь лизосомальной деградации (т.е. переход из РЭ в ПЭ), до сих пор нет. Все больше подтверждений получает точка зрения, в соответствии с которой переход из РЭ в ПЭ связан с попаданием белков, направляемых в лизосомы, в везикулярные домены мембраны РЭ, на которых в дальнейшем образуются инвагинации. Эти инвагинации превращаются затем во внутренние пузырьки, что приводит к формированию так называемых мультивезикулярных эндосом (МВЭ), встречающихся на поздних стадиях эндоцитоза практически у всех известных организмов (Felder et al., 1990; Ullrich, Schlessinger, 1990; Dunn, Maxfield, 1992). Образование инвагинаций (и заякоривание в них направляемых на деградацию белков) начинается, по-видимому, уже на стадии РЭ, полностью сформированная МВЭ соответствует по характеристикам ПЭ. Таким образом, РЭ превращаются в ПЭ в ходе процесса, называемого созреванием. Молекулярные основы этого

процесса неясны. В настоящее время можно считать установленным, что для перехода в ПЭ рецептор ЭФР должен обладать активированной тирозинкиназой (ТК) (Благовещенская и др., 1994). Известен также ряд белков и белковых комплексов, нарушения в функционировании которых в той или иной степени нарушают доставку рецепторов в лизосомы. Это фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), убиквитин-лигаза с-СЫ, адапторный белок SNX1, субстрат рецепторной тирозинкиназы HRS, комплексы ESCRT I, II, III и др. Сайты действия этих белков не всегда известны, а механизм координации их действия практически не изучен.

Давно показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию -пострансляционной модификации, заключающейся в ковалентном присоединении убиквитина к остаткам лизина, содержащимся в молекуле рецептора (Galcheva-Gargova et al,, 1995). Убиквитинирование, как известно, является маркером для деградации на протеасомах (Wilkinson, 2000; Myuang et al., 2001), однако в последнее время появились указания на то, что убиквитинирование может быть необходимо также для интернализации и включения лиганд-рецепторных комплексов во внутренние пузырьки МВЭ (Dupre et al., 2001). Показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию убиквитин-лигазой с-СЫ (Levkowitz et al., 1999). Данные о том, на каком этапе с-СЫ ассоциируется с рецептором, как долго сохраняется комплекс, каков статус убиквитинирования рецептора, т.е количество убиквитинов и убиквитиновых цепочек, присоединенных к одной молекуле рецептора, так же как и «молекулярный» смысл этой модификации, противоречивы и неполны. Не исключена вероятность того, что убиквитинированный рецептор узнается протеасомой и подвергается частичному протеолизу, в результате чего он становится доступен белкам, вовлекающим его на путь лизосомальной деградации. Существует ряд работ, авторы которых делают вывод об участии протеасом в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР (Longva et al., 2002), рецептора липопротеинов низкой плотности (Melman et al., 2002) и рецепторов гормона роста (Takagi et al., 2001). Подобное заключение делается ими на основании того, что ингибиторы активности протеасом, в частности, наиболее широко применяемый синтетический ингибитор MG132, подавляют процессинг рецепторов по лизосомальному пути. Этими авторами, однако, не анализируется и не учитывается неоднозначность действия MG132 на клетку. Таким образом, вопрос о том, насколько протеасомы вовлечены в регуляцию внутриклеточного процессинга рецепторов ЭФР на поздних стадиях эндоцитоза, и какова роль убиквитинирования рецептора, остается открытым.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы проанализировать возможное

участие протеасом в регуляции разных стадий эндоцитоза рецептора ЭФР, а также

исследовать поведение убиквитинирующего рецептор белка с-СЫ в процессе зндоцитоза.

В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Проанализировать влияние ингибитора протеасом MG132 на динамику эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, определить, на каком этапе он действует;

2. Изучить поведение убиквитин-лигазы с-СЫ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;

3. Сравнить спектр убиквитинирования рецептора ЭФР в различных эндосомапьных компартментах;

4. Идентифицировать фосфатидилинозитол-3-киназу, участвующую в" • регуляции сортировки рецептора ЭФР в поздние эндосомы;

5. Определить последовательность действия с-СЫ и PI3K в ходе эндоцитоза. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рецептор ЭФР в эндосомах не является непосредственной мишенью действия протеасом.

2. Убиквитинирование рецептора ЭФР в ранних и поздних эндосомах различно; высокоубиквитинированные формы составляют относительно небольшую долю общего пула интернализованного рецептора, и именно эти формы преимущественно сортируются в поздние эндосомы.

3. Синтетический ингибитор протеасом MG132 может замедлять как переход ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, так и взаимодействие поздних эндосом с лизосомами, основной сайт его действия зависит от скорости процесса эндоцитоза в конфетных клетках, а механизм связан в основном с истощением пула свободного убиквитина

4. Убиквитин-лигаза с-СЫ после стимуляции эндоцитоза ассоциируется с рецептором ЭФР как Б ранних, так и в поздних эндосомах, при этом сайт ее первоначального действия находится выше по эндоцитозному пути, чем сайт действия фосфатидилинозитол-3-киназы.

5. В регуляцию перехода рецептора из ранних в поздние эндосомы вовлечена не PI3K I класса р85\р110, a PI3K III класса hVPS34.

Научная новизна.

Впервые показано, что спектр убиквитинирования рецептора ЭФР в ранних и поздних

эндосомах различается.

Впервые подробно изучен механизм действия синтетического ингибитора протеасом MG132 на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов. Впервые показано, что MG132 может действовать на разных этапах эндоцитоза, в зависимости от скорости прохождения рецептора по эндоцитозному пути.

Впервые экспериментально обосновано предположение о том, что ингибиторы протеасом оказывают влияние на эндоцитоз рецепторов ЭФР не непосредственно, а в основном за счет истощения пула свободного убиквитина.

Идентифицирована вортманнин-чувствительная Р13-киназа hVps34, участвующая в регуляции сортировки рецепторов ЭФР на путь лизосомальной деградации Впервые продемонстрировано, что активируемая рецептором ЭФР Р13-киназа р85\р110 не имеет отношения к регуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

Теоретическое ипрактическое значениеработы.

Появившиеся в последнее время данные о возможной самостоятельной роли интернализованных рецепторов ЭФР в проведении и\или инициации сигналов, стимулируемых ЭФР, повышают важность исследований, связанных с регуляцией эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, особенно пути, ведущего к лизосомальной деградации. Понимание молекулярной организации и регуляции внутриклеточного процессинга рецепторов позволит создать обобщенную картину функционирования ЭФР-зависимой системы сигнализации. Учитывая широкий спектр клеточных процессов, регулируемых ЭФР, эти данные могут оказаться весьма важными для выработки практических стратегий при лечении ряда заболеваний и повреждений (от заживления послеожоговых ран до антираковой терапии). Результаты проведенного нами исследования по влиянию MG132 на эндоцитоз показывают, что выводы о вовлечении протеасом в регуляцию того или иного процесса на основании применения только одних ингибиторов протеасом делать неправомочно

Апробация работы.

По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ (4 статьи). Основные положения были доложены и обсуждались на 41-ой конференции Американского общества клеточной биологии (Вашингтон, 2001), на 14-ой Европейской студенческой конференции (Берлин, 2003), на первом съезде Российского общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003) и на научных семинарах Лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована рисунком.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культивирование клеточных линий. В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431, полученные из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки HER14, полученные на основе линии фибробластов мыши NIH3T3, трансфецированные плазмидой, которая содержит кДНК, кодирующую человеческий рецептор ЭФР, любезно предоставлены др. Дж. Шлессинджером (Нью-Йоркский Университет, США). Клетки эндотелия аорты (РАЕ А II), трансфецированные плазмидой, несущей конструкцию EGFR-GFP, получены от др. А.Соркина (Университет Колорадо, США). Все клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки. К клеткам РАЕ АН добавляли антибиотик G418 для поддержания плазмиды.

Клетки для всех опытов сеяли на пластиковые чашки, кроме клеток для иммунофлуоресцентного анализа, которые высевали на покровные стекла. Клетки культивировали в среде DMEM при 37°С в атмосфере 5% СОг. В опыт брали субмонослойные культуры на 3-й сутки после посева, переводя их за 24 часа до начала эксперимента на среду, содержащую 0.1% фетальной сыворотки.

Получение йодированного ЭФР. Йодирование ЭФР проводили по модифицированному методу Вайли и Каннингама (Wiley, Cunningham, 1982) с использованием йодогена (1,3,4,6-тетрахлор-3,6-дифенилглюкоурил) и Na125l. Специфическая активность полученного препарата составляла 200400 тысяч имп/мин на 1 нг ЭФР.

Обработка клеток ингибиторами. Синтетический протеасомный ингибитор MG132 (бензилоксикарбонил-лейцинил-лейцинил-лейцинал) добавляли к клеткам в концентрации ЮмкМ при 37°С за 30 мин в рабочей среде до стимуляции эндоцитоза или, для избежания влияния на начальные стадии эндоцитоза, через 15 минут после начала стимуляции клеток ЭФР или 125!-ЭФР. Природный протеасомный ингибитор лактацистин (ЮмкМ), как и высокоспецифичный ингибитор вакуолярной \/-Н+АТФазы Бафиломицин А1 (0.2мкг/мл) добавляли за 30 мин до стимуляции эндоцитоза. Вортманнин - продукт метаболизма Penicillum fumiculosum, ингибитор PI3K I и III класса, добавляли к клеткам в концентрации ЮОнМ за 40 мин до стимуляции клеток ЭФР. Все дальнейшие инкубации проводили при постоянном присутствии ингибиторов в рабочей среде.

Стимуляцию эндоцитоза при исследовании динамики компартментализации проводили по следующей схеме: к клеткам добавляли 1251-ЭФР (1-10 нг/мл) в инкубационной среде на 60 минут при 4°С для связывания с рецептором. Затем отмывали не связавшийся лиганд и стимулировали эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов, инкубируя в среде, не

содержащей лиганда, в течение различного времени при 37°С. По окончании инкубации клетки помещали на лед. Инкубационную среду при этом использовали для определения количества деградированного лиганда. Деградацию меченых эндоцитозных маркеров оценивали по выходу низкомолекулярных, не осаждаемых смесью 1%-ной ФВК и 5% ТХУ, продуктов протеолиза 1251-ЭФР в инкубационную среду. Затем клетки промывали средой DMEM и подвергали субклеточному фракционированию.

В тех случаях, когда не исследовали компартментализацию с помощью меченого лиганда, клетки запускали ЭФР (50-100 нг/мл).

Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17% Перколла позволяет разделить внутриклеточный пул везикул на три основные фракции - ранних эндосом (1.04 г/мл), поздних эндосом (1.05 г/мл) и лизосом (1.07 г/мл). Для определения внутриклеточного распределения эндоцитированного ЭФР клетки собирали в буфер ТЭС (10 мМ триэтаноламина, 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, рН 6 8) и после осаждения ядер и неразбитых клеток супернатант смешивали с Перколлом, конечная концентрация которого составляла 17%. Градиент формировали 25 мин при 50000д в угловом роторе 65 на центрифуге Spinko L2-65К (Beckman). Фракционирование градиента на 17 фракций проводили со дна пробирки через иглу. Для повторного центрифугирования объединяли первые пять фракций 17% градиента, объем пробы доводили до 6 мл буфером ТЭС и смешивали с 6 мл суспензии 24%-ного Перколла. В результате, поскольку пять объединенных фракций содержали около 50% Перколла, конечная концентрация Перколла оказывалась приблизительно 33%. Градиент формировали аналогично (Корнилова и др., 1987). Измерение радиоактивности проб осуществляли на гамма-счетчике Mini-Gamma (LKB). Количественную оценку радиоактивности интернализованного и деградированного лигандов проводили по программе «Градиент». Резульаты выражали в отн. ед., полученных путем нормировки радиоактивности в каждой фракции на общее количество радиоактивности, первоначально связанного с клетками.

Получение мембранной фракции ранних, поздних эндосом и лизосом. Фракции, соответствующие пикам ранних эндосом (8-11-я фракции 17% Перколла), поздних эндосом (912-я фракции 33% Перколла) и лизосом (2-5-я фракции 33% Перколла) собирали и наносили на 65% сахарозную подложку, а затем центрифугировали при 100000 g в течение 1 часа в бакетном роторе. Полученный после высокоскоростного центрифугирования осадок содержал мембранные фракции и подвергался дальнейшему анализу: иммунопреципитации или электрофорезу.

Иммунопреципитацию, электрофорез и иммуноблотинг проводили по стандартному методу, описанному ранее (Соколова и др., 1998).

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток. По окончании необходимых инкубации клетки на покровных стеклах фиксировали в течение 15 мин 4%-ным раствором формалина в PBS при комнатной температуре. После промывок проводили пермеабилизацию клеток, инкубируя их в течение 15 мин в PBS, содержащем 0.5% Тритона Х-100. Затем отмывали в PBS и проводили инкубацию в течение 30 мин в PBS, содержащем 1% БСА, для предотвращения неспецифического связывания антител. После 30 мин инкубации при комнатной температуре с первыми антителами клетки промывали в PBS и инкубировали следующие 30 мин со вторыми антителами. Распределение флуоресцентно-меченых белков в клетках изучали с помощью конфокального микроскопа Leica.

Антитела. Для специфического выявления рецептора в биохимических исследованиях использовали моноклональные антитела 2760 (1:2000, Sigma, США) и МаЬ108 для иммунофлуоресцентного анализа (1:1000, любезно предоставлены др. Шлессинджером), для выявления белка с-СЫ использовали моноклональные антитела для иммуноблотинга и флуоресцентного анализа (1:1000 и 1:100 соответственно, Transduction Lab, США) и поликлональные антитела для иммунопреципитации (1мкг/пробу, Santa Cruz, США). Для выявления убиквитинированных форм белка использовали моноклональные антитела на убиквитин (1*2000, Convence, Франция). Для выявления фосфорилированных белков в иммуноблотинге применяли моноклональные антитела PY20 (1:1000, Transduction Lab, США). Для выявления Р13К-киназы III класса использовали моноклональные антитела против hVPS34 (1:100, любезно предоставлены доктором Бейкером, США). Для выявления Р13К-киназы I класса использовали поликлональные антитела к белку р85/р110 (1:1000, Sigma, США). Для выявления Rab5 и ЕЕА1 использовали моноклональные антитела (1:100, Transduction Lab, США). В качестве вторичных антител при иммунофлуоресценции использовали коньюгат GAM-Fluorolink суЗ или GAR-Fluorolink cy2 (1:500, Molecular Probes, США), а при иммуноблотинге использовали козьи антитела сконьюгированные с пероксидазой, полученные против иммуноглобулинов мыши, GAM-HRP (1:40000, Sigma, США) или против иммуноглобулинов кролика GAR-HRP (1:10000, Sigma, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Убиквитинирование рецептора ЭФР, также как и ряда других трансмембранных рецепторов и белков, подвергающихся эндоцитозу, является хорошо установленным фактом, так же как и то, что эта пострансляционная модификация служит сигналом деградации белка с помощью протеасом (Wilkinson, 2000; Myuang et a!., 2001). С другой стороны, в случае рецепторов ЭФР таким же несомненным фактом является их деградация в лизосомах (Sorkin

et al., 1993), Это противоречие отчасти разрешают появившиеся в последние годы свидетельства того, что убиквитинирование может быть необходимо для нормального протекания по крайней мере 2х стадий эндоцитоза: интернализации и сортировки лиганд-рецепторных комплексов на путь лизосомальной деградации, В последнем случае убиквитинирование является сигналом для включения белка во внутренние пузырьки МВТ (Dupre et al., 2001). Существует вероятность того, что убиквитинированный рецептор узнается протеасомой, подвергается частичному протеолизу, в результате чего он становится доступен белкам, обеспечивающим его включение во внутренние пузырьки МВТ. Опубликован ряд

10 30 45 60 мин

конгрсмъ

№6132

170 кДа

0 мин 30 ми н 180 мин

Лиз ПЭ РЭ Л из ПЭ РЭ ЛюПЭ РЭ

«м-« ы

170 кДа

Рис.1 Выявление рецептора ЭФР в тотальных лизатах (А) и перколльных фракциях (Б) клеток А431 через различное время после стимуляции эндоцитоза. Гели после иммуноблотинга окрашивали антителами Е2760, специфически узнающими экстраклеточный домен рецептора ЭФР.

РЭ - ранние эндосомы

ГО - поздние лизосомы Лиз - лизосомы

Стрелками указаны молекулярные веса

Рис.2. Иммунофлуоресцентное выявление рецептора ЭФР на разных сроках после стимуляции эндоцитоза ЭФР в клетках А431 в контроле и в присутствии MG132.

работ, авторы которых делают вывод об участии протеасом в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР (Longva et al., 2002), рецептора липопротеинов низкой плотности (Melman et al., 2002) и рецепторов гормона роста (Takagi et al., 2001).

Чтобы проверить эту гипотезу, мы с помощью электрофореза и иммуноблотинга попытались выявить продукты частичной деградации рецептора (например, его укороченную форму) после стимуляции эндоцитоза ЭФР в клетках А431. Как известно, во время прохождения по эндоцитозным компартментам рецептор своим экстраклеточным доменом обращен внутрь везикулы и соответственно не может подвергаться протеасомной деградации с этой стороны, однако цитоплазматический домен рецептора теоретически может быть

доступен для протеасом (Магдо^ et , 1989). Действительно, при иммуноблотинге тотального клеточного лизата (рис.1, А) антителами, узнающими экстраклеточный домен рецептора ЭФР, выявляются слабые полосы в области мол. масс, меньших 170 кДа. Эти полосы наиболее выражены через 30 мин после стимуляции эндоцитоза и практически исчезают к 60 мин -сроку, при котором первые продукты лизосомальной деградации могут начать появляться в среде. Следует отметить, однако, что основной пул рецептора при этом выявляется в виде полноразмерной молекулы. Кроме того, при анализе выделенных с помощью центрифугирования в градиенте Перколла фракций РЭ, ПЭ и лизосом (рис. 1, Б) обнаруживается полоса рецептора меньшего мол. веса только во фракции РЭ. Поскольку при фракционировании в эту фракцию попадает значительная часть плазматических мембран, невозможно утверждать наверняка, в какой именно фракции - РЭ или ПМ, - рецептор является источником производных меньшего мол. веса. Тем не менее, тот факт, что в РЭ, ПЭ и лизосомах рецептор выявляется в интактном, полноразмерном виде, позволяет предполагать, что именно на ПМ этот белок может являться мишенью протеасом и давать начало ряду более низкомолекулярных продуктов. Более того, в ПЭ и лизосомах рецептор ЭФР даже через 180 мин после стимуляции эндоцитоза имеет большую мол. массу по сравнению с рецептором в РЭ и на ПМ, по всей видимости, за счет большей степени фосфорилирования и/или убиквитинирования (рис. 1, Б). Таким образом, можно заключить, что рецептор в РЭ, вступающий на путь деградации, прямой мишенью протеасом не является.

В цитированных выше работах вывод об участии протеасом в регуляции эндоцитоза различных белков был сделан на основании подавления их деградации при инкубации клеток в присутствии ингибиторов протеасомной активности как природного (лактацистин, ЛЦ), так и синтетического происхождения, причем из последних наиболее широко применяется М0132.

Проведенный нами иммунофлюоресцентный анализ продемонстрировал, что различия во внутриклеточном распределении рецептора наблюдаются лишь на поздних сроках и заключаются в том, что в обработанных М0132 клетках рецептор локализуется в несколько более крупных по сравнению с контролем околоядерных образованиях (рис 2). Хотя такая локализация и считается типичной для поздних эндосом и лизосом, мы ранее показали, что в околоядерной зоне могут находиться и ранние эндосомы (Железнова и др., 2001).

Для определения того, на каком именно этапе эндоцитоза Мв132 проявляет свое действие, мы подвергали клетки субклеточному фракционированию в градиентах Перколла, позволяющему разделить основные компартменты эндоцитозного пути - РЭ, ПЭ и Лиз. Оказалось, что деградация |251-ЭФР в присутствии ингибитора действительно подавляется, причем величина этого подавления может значительно различаться от опыта к опыту (в 2-15

раз). Более того действие MG132 на динамику компартментализации также весьма нестабильно, причем это справедливо для всех трех типов исследованных нами клеток - А431, HER14 и РАЕ А II. Во-первых, на основании более чем 30 экспериментов нам не удалось получить статистически достоверных данных о влиянии ингибитора на скорость интернализации, поскольку она была как выше, так и ниже контрольной или не отличалась от нее в приблизительно равной доле опытов. В любом случае различия были невелики и не превышали 30%. Причины этого явления нам неясны. Поскольку нас интересовала регуляция более поздних стадий, то в дальнейшем была использована экспериментальная схема, в соответствии с которой MG132 добавляли к клеткам через 15 мин после стимуляции эндоцитоза, когда основная масса рецепторов уже была интернализована. Во-вторых, мы обнаружили, что в одних экспериментах MG132 замедлял переход 1251-ЭФР из РЭ в ПЗ (рис.4) тогда как в других преимущественно задерживал 1251-ЭФР в ПЭ, не оказывая существенного

в

■ .. Контр

,х -О- №8132

Н" Ш

И I

II ' -... г

ад м

Время, мин

Рис.3. Динамика компартментализации (А, Б) и деградации (В) интернализованного 1251-ЭФР в контроле и при действии MG132 через 30 и 90 минут после запуска эндоцитоза в клетках А431 при условии быстрой динамике эндоцитоза. На 33% градиент наносили тяжелые фракции (ПЭ+Лиз) 17%-ного градиента

РЭ - ранние эндосомы, ПЭ - поздние лизосомы, Лиз-лизосомы

Ранее нами был описан феномен нестабильности динамики эндоцитоза. Мы обнаружили, что в клетках одной и той же линии соотношение между путями деградации и рециклирования, а также скорости интернализации, сортировки в ПЭ и перехода ЭФР-рецепторных комплексов из ПЭ в лизосомы могут различаться в весьма широких пределах (Авров и др.,1996). Можно предполагать, что причины этого явления заключаются в возможном влиянии факторов внешней среды, отличных от ЭФР (например, ингредиентов сыворотки), на компоненты

действия на переход из РЭ (рис.3).

Номер фракции

и

регуляторной транспортной машинерии. В настоящей работе мы имели дело с двумя «типами» эндоцитоза, условно названными нами «быстрым» и «медленным». Представленный на рис.3 эксперимент демонстрирует поведение клеток с «быстрым эндоцитозом»: уже через 30 мин после стимуляции основная масса интернализованных рецепторов находится в поздних эндосомах, и около 50% первоначально связанного с клеткой ЭФР обнаруживается в среде в виде низкомолекулярных ТХУ-осаждаемых пептидов через 90 мин после стимуляции эндоцитоза.

Действие MG132 начинало в этом случае проявляться лишь на поздних стадиях (через 60-90 мин после стимуляции эндоцитоза) и заключалось в некотором замедлении перехода 125|-ЭФР из РЭ в ПЗ и значительном накоплении меченого ростового фактора в тяжелых фракциях 17% градиента (что соответствует ПЭ и Лиз). Фракционирование этой зоны 17%-ного градиента в 33%-ном градиенте показало, что метка накапливается в основном в ПЗ, хотя часть ЭФР все же попадает в наиболее плотные лизосомы (рис. 3, Б). Таким образом, наблюдаемое в представленном эксперименте подавление деградации 1251-ЭФР (рис.3, В) обусловлено замедлением доставки ЭФР-рецепторных комплексов из ПЭ в лизосомы, т.е. проявляется на этапе, предшествующем собственно лизосомальной деградации.

Б ■ Контр

-о- М0132

3 . О.® -I

II I

а ° V ■ ил

|| о]-.11,

А?

Ч. т- Время, мин

Рис.4. Динамика компаргменгализации (А) и деградации (Б) интернализованного Ш1-ЭФР в контроле и при действии МС132 через 30 и 90 минут после запуска эндоцитоза в клетках А431 при условии медленной динамике эндоцитоза.

Когда же подобные эксперименты проводили на клетках с «медленной» динамикой (через 30 мин основная масса ЭФР - в ранних эндосомах, а через 90 мин - не более 20% ассоциированной первоначально с клеткой радиоактивности деградирует), «сайт» действия MG132 на эндоцитоз ЭФР значительно отличался. Так, к 90 мин метка накапливалась в основном в РЭ, а в поздних компартментах ЭФР оказывалось меньше, чем в контроле. Интересно, что через 30 мин после стимуляции эндоцитоза распределение 1251-ЭФР в клетках,

■ ■ Контр

1 1 5 9 13

Номер фракции

обработанных Мв132, практически не отличапось от контрольного как в случае быстрого, так и медленного эндоцитоза. Следует подчеркнуть, что плотность ПЭ при обработке клеток М0132 оказывалась несколько меньшей, чем в необработанных клетках, что может свидетельствовать о замедлении их созревания (рис.3, Б) и, следовательно, снижении способности взаимодействовать с лизосомами.

Суммируя вышеописанные результаты, можно сказать, что действие М0132 заключалось не в полном подавлении той или иной стадии эндоцитоза, а скорее в замедлении ее прохождения, что в конечном счете приводило и к снижению скорости деградации меченого ЭФР. При этом, вне зависимости от скорости прохождения ЭФР-рецепторных комплексов по эндоцитозному пути и стадии, на которую влиял Мв132, его эффект развивался с некоторым запозданием.

Учитывая, что сам рецептор не является прямой мишенью протеасом, можно было бы предположить, что объектом протеасомной деградации является некий белок-регулятор поздних стадий эндоцитоза, удаление которого с эндосом в результате протеасомной деградации является необходимым для прохождения следующего этапа. Однако при этом следовало бы ожидать того, что М0132 действовал бы всегда на одной и той же стадии, вне зависимости от динамики эндоцитоза. Еще одна возможность связана с тем, что ингибитор может подавлять деубиквитинирующую активность не только протеасом, но и деубиквитинирующих ферментов типа йоа4, ассоциированных с эндосомами (Атепк et а1.,

2000). Это также представляется маловероятным потому, что Мв132 ингибирует химотрипсин-подобную активность, а ферменты типа йоа4 обладают другой специфичностью (йирге et а1.,

2001). Сообщалось и о том, что МС132 может обладать побочным действием, ингибируя активность катепсина В в лизосомах (1_огра et а1., 2002).

Еще одно возможное объяснение может быть связано со спецификой действия ингибиторов протеасом. Как известно, эти ингибиторы подавляют не только протеазную активность протеасом, но и деубиквитинирование белков-субстратов протеасом. В результате происходит накопление высокоубиквитинированных форм белков и, как следствие, истощение внутриклеточного пула убиквитина, необходимого для новых циклов убиквитинирования.

Чтобы исследовать эти возможности, был проведен ряд экспериментов. Мы сравнили динамику эндоцитоза 1251-ЭФР в контроле, в присутствии М0132, в присутствии более протеасом-специфичного природного ингибитора ЛЦ и ингибитора вакуолярной протонной помпы Бафиломицина А1 (Баф А1), блокирующего функционирование лизосом, но не препятствующего доставке в лизосомы рецепторов ЭФР (Меликова и др., 2002). Оказалось, что самым сильным был эффест БафА1: он вызывал накопление 1251 -ЭФР в поздних фракциях,

полностью (до контрольного уровня) блокируя деградацию меченого ростового фактора. Действие MG132 имело ту же тенденцию, однако деградация лиганда снижалась не столь значительно ЛЦ практически не оказывал влияния на внутриклеточное распределение ЭФР, несколько понижая деградацию. Следует отметить, что Б некоторых экспериментах действие ЛЦ на деградацию было более выраженным, однако оно всегда было слабее по сравнению с МС132(рис5.А, Б).

М6132

лактаиистин

Баф А1

15 мин 90 мм

т.

у /

15 мин

90 мин

Рис.5. Анализ компартментализации (А) и деградации (Б) П51-ЭФР в клетках HER14, инкубировавшихся в отсутствие или присутствии MG132, лактацистина или Баф А1, в ходе эндоцитоза через 15 и 90 мин после добавления лиганда. А-распределение интернализованного 1251-ЭФР в градиенте 17% Перколла, по оси абсцисс - номер фракции. Б- низкомолекулярные продукты деградации 1251-ЭФР в среде, отн.ед.

Далее мы попытались понять, что происходит с убиквитинированием клеточных белков в выбранных нами экспериментальных условиях. Клетки предобрабатывали указанными агентами в течение 30 мин, затем эндоцитоз стимулировали добавлением ЭФР, а через указанное время получали тотальные лизаты клеток, и после электрофореза и иммуноблотинга мембрану окрашивали антителами на убиквитин, рецептор ЭФР и убиквитин-лигазу с-СЫ, субстратом которой является рецептор (рис.6, А). Оказалось, что если в контроле окраска на убиквитин выражена слабо в течение всего эксперимента, то MG132 и ЛЦ вызывают накопление убиквитинированных форм клеточных белков, причем действие MG132 сказывается уже в момент запуска эндоцитоза, тогда как сравнимый эффект ЛЦ развивается только к 90 мин. Различия эти могут объясняться разницей кинетики двух ингибиторов. Тем не менее очевидно, что возможность истощения пула свободного убиквитина с помощью Мй122 выше, чем с помощью ЛЦ. Даже в случае, когда MG132 добавляли к клеткам через 15 мин

после стимуляции эндоцитоза (рис. 6, Б), его эффект к 60 мин оказывался сравнимым с представленным на рис. 6, А.

Рис.6. Влияние ингибиторов протеасом (М0132, ЛЦ) и ингибитора протонной помпы Баф А1 на уровень убиквигинирования внутриклеточных белков в клетках А431 в контроле и после стимуляции клеток ЭФР.

А - Пул убиквитинированных белков в контроле и при добавлении лактацистина, М0132 и Баф А1 за 30 мин до стимуляции эндоцитоза ЭФР. Иммуноблотинг на с-СЫ, рецептор ЭФР и убиквитин

Б - Пул убиквитинированных белков в контроле и при добавлении М0132 за 30 мин до запуска эндоцитоза (М0132) и после 15 минут эндоцитоза (М0132+15'). Иммуноблотинг на убиквитин.

Стрелкамиуказаны молекулярные веса

Бафиломицин А1, полностью подавляя функционирование лизосом, тем не менее никак не влияет на количество убиквитинированных белков, что свидетельствует в пользу предположения о том, что в норме все белки, направляемые на деградацию в лизосомах, попадают в них уже деубиквитинированными. Необходимо подчеркнуть также, что как количество рецептора, так и с-СЫ во всех случаях остается одинаковым (рис.6, А). Поскольку в данном случае мы имели дело с клетками с медленным эндоцитозом, ожидать значительного падения количества рецепторов в контроле (в течение выбранного нами времени эксперимента) не приходилось, однако оно и не увеличивалось (что было бы, если б значительная часть рецепторов деградировала по протеасомному пути). Относительное постоянство количества рецепторов в полосе, выявляемой антителами на рецептор, и отсутствие соответствующей полосы на рис. 6, Б говорит также о том, что среди убиквитинированных белков модифицированный рецептор составляет минорную часть

Как влияет ингибитор протеасом МЮ132 на взаимоотношения в системе «рецептор ЭФР - с-СЫ» и на убиквитирование рецептора ЭФР? Мы иммунопреципитировали рецептор из контрольных и обработанных МЮ132 клеток через 60 и 90 мин после стимуляции эндоцитоза в клетках А431 и проанализировали уровень фосфорилирования рецептора по тирозину, его ассоциацию с с-СЫ и убиквитинирование рецептора (рис 7). Оказалось, что в контроле фосфорилирование рецептора проходит через максимум (60 мин) и затем снижается к 90 мин В то же время, через 90 мин в клетках, обработанных МЮ132, уровень фосфорилирования рецептора значительно выше, чем в контольных клетках Практически аналогично и поведение ассоциированного с рецептором с-СЫ. в контроле максимум ассоциации наблюдается к 60

V 1В* ЭГ «О Н1 Г1Г4ПГ1Т№№М 1МН

■170кДа

контроль Мв1Э2 ЛЦ БафА1

контроль 1Жл132 к («5132*1 У

мин, тогда как MG132 препятствует диссоциации комплекса Эти факты могут объясняться тем, что, как мы ранее показали, в этом случае (медленный эндоцитоз) ингибитор на поздних стадиях задерживает ЭФР-рецепторные комплексы преимущественно в РЭ, где рецептор высокофосфорилирован. Его фосфорилирование, по литературным данным, является необходимым условием для формирования комплекса с с-СЫ et al., 1999).

Прежде чем обсуждать данные по убиквитинированию рецептора, следует отметить, что к настоящему времени выделяют два типа убиквитинирования. Если к молекуле белка пришивается одна молекула убиквитина, то белок называют моноубиквитированным. Ряд исследований говорит о том, что именно моноубиквитинирование нужно для интернализации и сортировки во внутренние пузырьки МВТ. Однако в большинстве работ убиквитинированный рецептор ЭФР выявляется в виде непрерывного «шлейфа», расположенного на форезе значительно выше самого рецептора, что трактуется как его полиубиквитинирование (т.е.

Рис.7. Иммунопрециголация рецептора ЭФР в контроле (С) и при добавлении ЭФР (60' и 90' мин) в отсутствие и присутствии MGl32 в клетках А431.

А - Иммуноблотгинг на рецептор ЭФР, фосфорилированные и убиквитинированные формы рецептора, с-СЫ

Б - денситограмма иммуноблотинга на убиквитинированные формы рецептора. Серой стрелкой указано направление денситометрирования.

1 - зона низкоубиквитинированюго рецептора, 2 - высокоубиквитинированный рецептор, 3 - очень высокоубиквитинированный рецептор.

По оси абсцисс -область иммуноблота, соответствуюшэя молекулярным массам от 160 до 300 кДа.; по оси ординат - интегрированная оптическая плотность.

присоединение нескольких цепочек убиквитина разной длины к нескольким лизиновым остаткам рецептора). Именно такой характер окраски антиубиквитиновыми антителами и навел исследователей на мысль о возможности протеасомной деградации рецептора,

поскольку протеасомы «узнают» именно длинные цепочки. Однако, в последнее время появились данные, позволяющие предполагать иной характер формирования шлейфа, который может образовываться за счет того, что одиночный убиквитин (или короткие цепочки) присоединяется не к одному, а сразу к нескольким остаткам лизина в молекуле белка. Такой тип убиквитинирования можно называть мультиубиквитинированием, и он может играть роль сигнала,отличного от протеасомного.

Динамика убиквитинирования рецептора ЭФР в контроле представляет значительный интерес. Так, до добавления к клеткам ЭФР антитела на убиквитин выявляют в основном одну полосу в районе чуть выше 170 кДа, соответствующую по положению полосе, окрашиваемой антителами на рецептор, хотя видны и более высокорасположенные слабые полосы. Судя по мол. весу, рецептор в этой полосе моноубиквитирован (рис.7, Б, зона 1). К 60 мин после стимуляции эндоцитоза интенсивность этой полосы возрастает, и появляется также заметный «шлейф», занимающий область значительно выше самого рецептора. Денситометрия позволяет выделить в этом шлейфе еще две зоны: высокоубиквитинированного (2) рецептора и очень высокоубиквитинированного (3). К 60 мин увеличивается интенсивность окраски всех трех зон, что ясно видно на денситограмме иммуноблота (рис 7, Б). В дальнейшем в контрольных клетках интенсивность окраски всех зон уменьшается (видимо, за счет деубиквитинирования), но наибольшее падение наблюдается в области низкоубиквитинированного рецептора. Предобработка клеток МЮ132 вызывает большее по сравнению с контролем убиквитинирование рецептора еще до стимуляции эндоцитоза. Причины этого нам неясны. К 60 мин убиквитичирование рецептора не отличается от соответствующего в контроле, а к 90 мин, напротив, оказывается ниже контрольного преимущественно в области выкокоубиквитинированных форм. Эти результаты означают, во-первых, что МЮ132 не подавляет деубиквитинирующую активность. Во-вторых, более низкий уровень убиквитинирования рецептора в присутствии МЮ132 можно легко объяснить истощением пула свободного убиквитина под действием ингибитора, в результате чего происходит «недоубиквитинирование» некоторой части рецепторов на поздних стадиях эндоцитоза.

В предыдущем опыте мы анализировали поведение общего пула рецептора ЭФР. Чтобы изучить поведение только той части рецептора, которая находится в комплексе с с-СЫ, клетки А431 фракционировали в градиенте 17%-ного Перколла, объединяли фракции, соответствующие РЭ и ПЭ+Лиз. Для выявления рецептора ЭФР аликвоты фракций подвергали иммуноблотингу, затем оставшуюся часть фракций иммунопреципитировали антителами к с-СЫ На рис. 8 представлены результаты этого опыта, МЮ132 добавляли к клеткам через 15

мин после стимуляции эндоцитоза Видно, что стимуляция эндоцитоза приводит к все возрастающему увеличению содержания рецептора ЭФР в поздних эндосомах, причем MG132 несколько подавляет это накопление (что соответствует данным ранее

Рис 8. Выявление рецептора ЭФР (БОРЯ) и с-СЫ во фракциях ранних эндосом (РЭ) и поздних эндосом и лизосом (ТВ) в клетках А431 в контроле (0) и после стимутяции эндоцитоза ЭФР в отсутствие и в присутствии МО132 (90М0)

А - Анализ тотального рецептора ЭФР, иммунопреципитированного общего пула с-СЫ и его убиквитинированных форм, а также ассоциированного с с-СЫ общгго пула рецептора ЭФР и его убиквитинированных форм

Б - денситограмма иммуноблотинга на убиквитинированные формы рецептора. Серой стрелкой указано направление денситометрирования

1 - зона низкоубиквитинированного рецептора, 2 - высокоубиквитинированный рецептор, 3 - очень вьюокоубиквитинированный рецептор

По оси абсцисс -область иммуноблота, соответствующая молекулярным массам от 160 до 300 кДа, по оси ординат - интегрированная оптическая плотность.

описанного опыта на клетках с медленным зндоцитозом) С-СЫ до стимуляции эндоцитоза выявляется только во фракции РЭ, что, однако может означать и ассоциацию с ПМ, поскольку РЭ и ПМ в градиенте 17% Перколла несколько перекрываются Интересно, однако, то, что практически никакой ассоциации рецептора ЭФР и с-СЫ в нулевой точке не обнаруживается Стимуляция эндоцитоза приводит к появлению этого белка и в ПЭ, причем в количествах, сравнимых, а на поздних сроках и превышающих количество с-СЫ в РЭ Такая количественная разница между поведением рецептора ЭФР и с-СЫ может иметь два объяснения во-первых, не весь рецептор в РЭ может быть ассоциирован с с-СЫ, тогда как в поздние эндосомы попадает преимущественно комплекс Во-вторых, поскольку мы проводили иммунопреципитацию белка, не закрепленного в мембране, способного ассоциироваться с большим числом белков, отличных по локализации от рецептора, то нельзя исключать, что высокий уровень с-СЫ в поздних эндосомах обеспечивается не за счет ассоциации с

эндосомами, а благодаря взаимодействию с другими неидентифицированными клеточными структурами, седиментирующими в Перколле вместе с ПЭ и Лиз. Однако иммунофлуоресцентный анализ распределения рецептора ЭФР и с-СЫ в ходе эндоцитоза выявляет на поздних стадиях лишь с-СЫ, локализующийся совместно с рецептор-содержащими околоядерными структурами (рис. 9), причем MG132 приводит к более длительной ассоциации двух белков Таким образом, остается предположить, что с-СЫ может оставаться на эндосомах и после диссоциации с рецептором Действительно, результаты перекрестного окрашивания иммунопреципитированных белков антителами на рецептор, позволяющие судить о поведении комплекса «с-СЫ-рецептор», показывают, что ассоциация

Контроль МЮ132

О'

60'

180'

Е№Я с-СЫ ЕвП* с-СЫ

Рис.9. Иммунофлуоресцентное выявление рецептора ЭФР и с-СЫ на разных сроках после стимуляции эндоцитоза ЭФР в клетках А431 в контроле и в присутствии М0132.

рецептора с с-СЫ коррелирует с поведением рецептора, но не самого с-СЫ. До стимуляции эндоцитоза комплекс не выявляется, затем он в основном связан с РЭ. Максимальный уровень комплекса в ПЭ наблюдается через 30 мин после стимуляции эндоцитоза, а к 90 мин степень ассоциации несколько уменьшается. К этому времени уменьшается и ко-локализация с-СЫ с рецептор-содержащими структурами, выявляемая методом иммунофлуоресценции (рис. 9). Соответственно, в присутствии MG132 к 90 мин после стимуляции эндоцитоза значительно меньше комплексов обнаруживается в ПЭ, поскольку они задерживаются в РЭ.

С-СЫ на электрофорезе часто выявляется в виде двух полос, Из результатов иммуноблотинга следует, что антитела к убиквитину окрашивают именно верхнюю полосу,

причем ее поведение коррелирует с поведением не общего пула с-СЫ или рецептора, а той доли этих белков, которые взаимодействуют друг с другом.

Убиквитинирование рецептора, находящегося в комплексе с с-СЫ (рис.8, Б), в общих чертах совпадает с характером убиквитинирования общего пула рецептора (рис.7, Б). Действительно, можно выделить те же три основные зоны, окрашиваемые антителами на убиквитин. Первая зона могла бы соответствовать моноубиквитированному рецептору, тогда как зоны 2 и 3 представляют пулы высокоубиквитинированного и очень высокоубиквитированного рецептора, соответственно. Интересно, что через 15 мин после стимуляции эндоцитоза распределение между 3 зонами соответствует представленному на рис. 7, Б - основной формой является низкоубиквитированный рецептор. Однако уже через 30 мин, когда начинается активная сортировка в ПЭ, доля высокоубиквитинированных рецепторов в РЭ значительно возрастает, в особенности в 3 зоне. Наиболее интересным представляется тот факт, что спектр убиквитинированных рецепторов в поздних эндосомах отличается от такового в РЭ: отсутствует самая низкоубиквитинированная форма, возможны и иные отличия; для их детальной характеристики, однако, требуются дополнительные исследования. К 90 мин спектр убиквитинированных рецепторов претерпевает дальнейшие изменения: общее убиквитинирование падает, количество рецепторов в первых двух зонах практически сравнивается, а в 3-ей зоне заметно уменьшается по сравнению с 30 мин точкой. Эффект МЮ132 выражается в падении доли высокоубиквитинированных форм, что согласуется с предположением о дефиците свободного убиквитина, сложившимся к этому времени.

Таким образом, изменение профиля убиквитина позволяет предположить, что убиквитинирование рецептора является не «одноразовым» событием, рецепторы могут подвергаться этой модификации несколько раз в течение продвижения по эндоцитозному пути. Такой подход позволяет преодолеть разногласия, связанные с неопределенностью «сайта» убиквитинирования. Ряд авторов утверждают, что рецептор убиквитинируется на мембране, тогда как другие представляют доказательства в пользу эндосом (БМ Б. е1 а1., 2000; Б1апд е1 а1., 2000; [Мо\мЬ О. е1 а1., 1998). Описанное нами изменение статуса убиквитинирования рецептора в ходе эндоцитоза может лежать в основании механизма координации работы белков и белковых комплексов, обеспечивающих прохождение рецептора ЭФР по эндоцитозному пути. Действительно, было показано, что некоторые компоненты комплексов ЕБСЯТ I, II и III обладают доменами, способными узнавать убиквитин и таким образом взаимодействовать с убиквитинированными белками. Если предположить, что они узнают не просто любой убиквитин, а убиквитин/или убиквитины в конкретном молекулярном контексте

(по аналогии с фосфотирозином и белками с БН2-доменами), то последовательное и специфическое добавление убиквитинов к молекуле рецептора (вкупе со специфическим деубиквитинированием) может задавать последовательность взаимодействия рецептора с этими комплексами, необходимую для успешного прохождения всех молекулярных стадий сортировки во внутренние пузырьки МВТ.

Суммируя полученные данные, можно сказать, что наиболее вероятным механизмом действия протеасомного ингибитора MG132 на эндоцитоз рецепторов ЭФР является истощение пула свободного убиквитина. В пользу этого говорит ряд фактов Во-первых, эффект ингибитора развивается в основном на поздних стадиях эндоцитоза. Во-вторых, в этом случае легко объяснить различия во влиянии MG132 на ход «быстрого» и «медленного» эндоцитоза: если предположить, что истощение пула свободного убиквитина происходит приблизительно одинаково во времени, то при медленном эндоцитозе его отсутствие начнет сказываться на ранних стадиях, когда требуется убиквитинирование, т.е. на стадии перехода их РЭ в ПЭ. В случае же быстрого эндоцитоза основная масса рецепторов успевает «проскочить» в ПЭ до достижения критического уровня убиквитина, и его недостаток скажется на более поздней стадии. По всей видимости, этой стадией является созревание полноценных ПЭ. Об этом свидетельствует то, что в присутствии MG132 выявляемые на Перколле ПЭ не достигают плотности, соответствующей плотности ПЭ в контрольных клетках. Таким образом, ПЭ оказываются «некомпетентными» для взаимодействия с лизосомами, что и выражается в падении деградации ЭФР и рецептора. Неполное созревание и «недоубиквитированность» рецептора могут быть связаны между собой. Как уже отмечалось, действие ингибитора выражается не в полной блокировке, а в замедлении той или иной стадии, что также свидетельствует в пользу нашего предположения, поскольку какое-то количество свободного убиквитина в течение эксперимента в клетке все-таки остается.

В соответствии с нашими данными, динамика ассоциации с-СЫ с рецептором ЭФР коррелирует с динамикой убиквитинирования рецептора. Поскольку иных данных на настоящий момент нет, остается предположить, что все последовательные акты убиквитинирования осуществляются именно этой убиквитин-лигазой. Это означает ее «полиспецифичность», т.е. способность пришивать убиквитины и убиквитиновые цепочки к разным лизиновым остаткам одной и той же молекулы. У нас нет ответа на вопрос, возможно ли это, однако известно, что с-СЫ способен убиквитинировать не только рецепторные тирозинкиназы, направляемые на деградацию в лизосомы, но и цитоплазматические киназы Src-семейства, деградирующие с помощью лизосом. Это означает, что один и тот же фермент в принципе способен проводить убиквитинирование по-разному, поскольку существуют данные

о различии убиквитиновых сигналов лизосомной и протеасомной деградации (Dupre and Haguenauer-Tsapis, 2001)

Исследования последних лет показывают, что сортировка рецепторов ЭФР на путь лизосомальной деградации и дальнейшая доставка их в лизосомы является сложноорганизованным процессом, в рефляцию которого вовлечено множество белков, координация действия которых и их иерархия остается во многом неисследованной Так, ранее нами было показано, что вортманнин, ингибитор активности фосфатидилинозитол-3-киназ, блокирует переход ЭФР-рецепторных комплексов из РЭ в ПЭ (Железнова и др, 2001) Мы обнаружили, что PI3K I класса р85\р110 не участвует в регуляции эндоцитозного пути, поскольку мы не наблюдаем ко-локализации рецептора ЭФР и р85/р110 ни до ни после добавления ЭФР как в контроле, так и при действии вортманнина (рис 10) В то же время

Рис.10. Влияние вортманнина на ко-локализацию рецептора ЭФР и РВКI класса p85/pl 10 в клетках А431 до и через 60 мин после

стимуляции эндоцигоза.

Рис.11. Влияние вортманнина на ассоциацию Р Б КI класса Ь\^34 с мембранами эндосом в клетках А431 до стимуляции и через 60 мин после стимуляции эндоцитоза.

стимуляция эчдоцитоза ЭФР приводит к увеличению ассоциации PI3K III класса hVps34 с РЭ и ПЭ, тогда как вортманнин практически полностью эту ассоциацию подавляет, таким образом именно hVps34 является основным кандидатом на роль регулирующей эндоцитоз PI3K (рис.11). Представленные здесь данные косвенно, а ряд литературных данных и непосредственно (Levkowitz G. et a!, 1998) указывают на с-СЫ, как на ключевой регулятор перехода рецепторов в ПЭ Однако взаимоотношения убиквитин лигазы с-СЫ и PI3K в процессе регуляции эндоцитоза неизвестны. Методом непрямой иммунофлуоресценции на клетках РАЕ АН, экспрессирующих рецептор ЭФР слитый с GFP, мы показали, что с-СЫ ассоциирован с рецептор-содержащими эндосомами как в контроле, так и при действии вортманнина (рис. 12, А) Несмотря на то, что вортманнин не препятствует перераспределению рецептора в околоядерную область, структуры, в которых он находится, имеют характеристики РЭ они окрашиваются антителами на маркеры ранних эндосом ЕЕА1 и Rab5 (Железнова и др, 2002)) Иммуноблотинг Перколльных фракции РЭ, ПЭ и лизосом показал, что обработка клеток вортманнином не препятствует ассоциации с-СЫ с РЭ, но подавляет его переход в ПЭ и Лиз (рис 12, Б) На этом основании можно заключить, что убиквитин-лигаза с-СЫ регулирует процессинг ЭФР-рецепторных комплексов раньше, чем PI3K.

Рис.12. Влияние вортманнина на поведение с-СЫ и рецептора ЭФР после стимуляции эндоцитоза ЭФР.

А - Иммунофлуоресцентное выявление с-СЫ на разных сроках после стимуляции эндоцитоза ЭФР в клетках РАЕ II, несущих конструкцию EGFR-GFP в контроле и в присутствии вортманнина.

Б - Иммуноблотинг бежа с-СЫ в мембранных фракциях ранних (РЭ), поздних эндосом (ПЭ) и лизосом (Лиз) в клетках А431 через 60 мин после добавления ЭФР в отсутствие и присутствии вортманнина.

ВЫВОДЫ

1. Рецептор в эндосомах не является прямой мишенью лротеасом.

2. Действие синтетического ингибитора активности протеасом MG132 на прохождение ЭФР-рецепторкых комплексов по эндоцитозному пути с наибольшей вероятностью связано с истощением внутриклеточного пула свободного убиквитина.

3. В ходе эндоцитоза рецептор подвергается нескольким актам убиквитинирования. Появление высокоубиквитинированных форм рецепторов ЭФР существенно как для их сортировки из ранних в поздние эндосомы, так и для полноценного созревания поздних эндосом.

4. Динамика убиквитинирования рецептора ЭФР в эндосомах коррелирует с фосфорилированием рецептора по тирозину и его ассоциацией с убиквитин-лигазой с-СЫ. Стимуляция эндоцитоза ЭФР приводит к образованию комплекса «с-СЫ-рецептор», а диссоциация комплекса происходит в поздних эндосомах, до попадания рецептора в лизосомы.

5. В сортировке рецепторов ЭФР в поздние эндосомы участвует РОК III класса HVPS34, а не рецептор-активируемая PI3KI класса р85/р110.

6. PI3K регулирует более позднюю стадию в процессе перехода ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, чем с-СЫ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Меликова М.С., Благовещенская А Д, Никольский Н Н., Корнилова Е.С. 2002. Влияние ингибитора вакуолярной протонной помпы бафиломицина А1 на внутриклеточный процессинг маркеров рецептор-опосредованного и жидкофазного эндоцитоза. Цитология. 44(8): 807-816.

2. Н.Н.Железнова, Меликова М.С., М.В.Харченко, Н.Н.Никольский, Е.С.Корнилова. 2003. Участие ФИ-3-киназ I и Ш-его типов в регуляции эндоцитоза рецепторов ЭФР. Цитология. 45(6). С. 574-581.

3. Меликова М.С., М.М.Филатова, Е.С.Корнилова. 2003. с-СЫ - полифункциональный регулятор клеточных процессов. Цитология. 45(11): 1134-1148.

4. Меликова М.С., Аксенов А.А., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 2004. Влияние синтетического ингибитора протеасом MG132 на динамику эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в клетках А431. Цитология. 46(7): 601-608.

5. Mellkova M.S., Biagoveshchenskaya A.D., Nikolsky N.N., Komilova E.S. (2001). Influence of vacuolar proton pump inhibitor Bafilomycin A1 on intracellular processing of receptor-mediated ar,d fluid phase endocytosis markers. Mol. Biol. Cell. 12.344a-345a.

6. Меликова M.C., Корнилова Е.С. 2003. Влияние ингибитора протеасом MG132 на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов. Цитология. 45:902.

7. Melikova M.S., Komilova E.S. 2003. The regulation of epidermal growth factor receptor degradation. Abstract book of 14* European students' conference. P.570.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Дерев К.О., Благовещенская АД., Корнилова ЕС, Никольский Н.Н. 1996. Зависимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня активности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 38(10): 1084-1091. Благовещенская АД., Соколова ИЛ, Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1994. Зависимость эндоцитоза эпидермального фактора роста от степени занятости рецепторов. Цитология. 36(7): 664-674. Вдовина И.Б., Бурова Е.Б., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1993. Сравнительный анализ раннего и позднего эндоцитоэа эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 35 (2): 60-67. Корнилова ЕС, СоркинАД, Никольский Н.Н. 1987. Динамика компартментализации эпидермального фактора роста Б клетках А431. Цитология. 29: 904-910. Меликова М.С., Благовещенская АД., Никольский Н.Н., Корнилова ЕС. 2002. Влияние ингибитора вакуолярной протонной помпы бафиломицина А1 на внутриклеточный процессинг маркеров рецептор-опосредованного и жидкофазного эндоцитоза. Цитология. 44(8): 807-816. Соколове И.П., Арнаутов AM, Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 1998. Исследование ассоциации малой ГТФазы Rab7 с зндосомами клеток, экспрессирующих нормальный и мутантные формы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 27(12): 1367-1373. Жвпвзнова Н.Н., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 2001, Влияние вортманнина на эндоцитоз рецепторов эпидермального фактора роста. Цитология. 43 (2): 156-165. Медведева НД. ЕвдонинАЛ., Цупкина Н.В., Константинова ИМ 2002. Рецептор ЭФР деградирует по протеасом-зависимому пути в клетках А431. Цитология. 44 (7): 697-701. Никольский Н.Н., Соркин АД., Сорокин А.Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с. Amerik AY., Nowak J., Swaminathan S, Hochstrasser M. 2000. The Doa4 deubiquinating enzyme is functionally linked to the vacuolar protein-sorting and endocytic pathway. Mol. Biol. Cell. 11:3365-3380. Dupre $., Volland C, Haguenauer-Tsapis R. 2001. Membrane transport ubiquitilation in endosomal sorting. Curr. Biol. 11: R932-R934. Dupre S. and Haguenauer-Taapls ft 2001. Deubiquitination step in the endocytic pathway of yeast plasma membrane proteins: crucial role of Doa4p ubiquitin isopeptidase. MCB. 21(14): 4482-4494. FelderS., Miller K., Moeehren G, Ullrich A., Shclessinger J., Hopkins C.R. 1990. Kinase activity controls the sorting of the epidermal growth factor receptor within the muit'veslcular body. Cell. 61:623-634. Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptors with tyrosone kinase activity. Cell. 61:287-307. Galcheva-Gargova Z, Theroux $., Davis R. 1995. The epidermal growth factor receptor is covalently linked to ubiquitin. Oncogene. 11:2649-2655. Gllckman M. 2000. Gettingin and out of the proteasome. Cell and Dev. Biol. 11:149-158. Levkowltz G., Waterman H., Ettenberg SA., Katz A», TsygankovA.Y., Alroy I., Lavi S, IwaiK., Relss Y., Clechanover A., Upkowiti $., Yarden Y. 1999. Ubiquitin ligase activity and tyrosine phosphorylation underlie suppression of growth factor signaling by c-Cbl/Sli-1. Mol. Cell. 1999.4:1-20. Levkowitz, G., Waterman, H, Zamir, E, Kam, Z, Oved, S, Langdon.W. Y., Begulnot, L, Gelger, В., Yarden, Y. 1998. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12:3663 - 3674. Longva K., Blystad F., Stang E, Larsen A., Johannessen L, Madshus I. 2002. Ubiqiutination and proteasomal activity is required for pransport of the EGF receptor to inner membranes of multivesicular bodies. J Biol.Sci. 156:843-854. Margolis В., Rhee S.G., Felder S., Mervic M., Lyall ft, Levitzkl A., Ullrich A., Zllberstein A., Schlessinger J. 1989. EGF induces tyrosine phosphorylation of phospholipase C-ll: a potential mechanism for EGF receptor signaling. Cell. 57:1101-1107. Melman L, Geuze H.J., Li Y., McCormick LM., Van Kerkhof P., Strous G.J., Schwartz A.L, Bu G. 2002. Proteasome regulates the delivery of LDL receptor-related protein into the degradation pathway. Mol. Biol Cell. 13 : 3325-3335. Myuang J., Kim K., Grows G. 2001. The ubiquitin-proteasome pathway and proteasome inhibitors. Med. Res. Rev. 21: 245-273. Shih $., E.SIoper-Mould K., Hicke L 2000.Monoubiquttin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors. J.EMBO. 19(2): 187-198. Sorkin A., Waters CM 1993. Endocytosis of growth factor receptors. Bioessays. 6c: 375-382. Takagl K, Saito Y, Sawada J. 1.2001. Proteasomes are involved in the constitutive degradation of growth hormone receptors. Biol. Pharm. Bull. 24 : 744-748. Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptors with tyrosone kinase activity. Cell. 61: 287-307. Wiley H.S., Cunningham D.D. 1982. The endocytosis rate constant A cellular parameter for quantitative receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 257:42224229. Wilkinson K.D. 2000. Ubiquitination and deubiquitination: tagretlng of proteins for degradation by the proteasome. Cell Dev. Biol. It: 141-148.

Подписано в печать 18.02.2005. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервио. Печать ризографическая. Заказ № 1/1802. П. л. 1.5. Уч.-изд. л. 1.5. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервио Адрес юр.: 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16. Адрес факт.: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 5. Тел.:(812)327 5098

/

í

■ ' '1СП

22 АПР 2005 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Меликова, Мария Сергеевна

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы 10 2.1 .Общие понятия о везикулярном транспорте

2.2. Рецептор эпидермального фактора роста

2.2.1. Общие сведения о рецепторе ЭФР

2.2.2. Сигнальные молекулы, связанные с рецептором

2.3. Общая схема РОЭ

2.4. Регуляция РОЭ

2.4.1. Белки, участвующие в интернализации ЭФР-рецепторных комплексов

2.4.2. Белки, опосредующие слияние мембран

2.4.3. Белки, участвующие в переходе из ранних в поздние эндосомы

2.5. Фосфатидилинозитол-киназы

2.6. Роль убиквитинирования белков в регуляции РОЭ

2.6.1. Убиквитинирование

2.6.2. Протеасомы и их ингибиторы

2.6.3. Убиквитин-лигаза с-СЫ

3. Материалы и методы

3.1. Культивирование клеточных линий

3.2. Получение йодированного ЭФР

3.3. Обработка клеток ингибиторами

3.4. Стимуляция эндоцитоза

3.5. Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17% Перколла

3.6. Получение мембранных фракций

3.7. Получение тотально-клеточного лизата

3.8. Иммунопреципитация

3.9. Электрофоретическое разделение белков

3.10. Иммуноблотинг

3.11. Иммунофлуоресценция

3.12. Антитела

4. Результаты

4.1. Участие протеасом в эндоцитозном процессинге рецептора ЭФР

4.2. Влияние ингибитора протеасом МС на эндоцитоз рецептора ЭФР

4.3. Влияние М0132 на динамику компартментализации ЭФР-рецепторных комплексов

4.4. Исследование возможного влияния Мв на функционирование лизосом

4.5. Влияние ингибиторов протеасом и ингибитора вакуолярной протонной помпы Баф А1 на убиквитинирование клеточных белков

4.6. Влияние ингибитора протеасом ]УЮ132 на убиквитинирование рецептора ЭФР и его взаимоотношения с убиквитин-лигазой с-СЫ

4.7. Анализ поведения рецептора ЭФР, ассоциированного с убиквитин-лигазой с-СЫ, во фракциях ранних и поздних эндосом/лизосом

4.8. Участие Р13-киназ I и III классов в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР

4.9. Взаимоотношение убиквитин-лигазы с-СЫ и Р13К в процессе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

5. Обсуждение

6. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие зависимых от убиквитина систем в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР"

Сигналы, стимулируемые эпидермальным фактором роста (ЭФР), играют исключительно важную роль на ранних стадиях формирования клеток эпителиальной линии, в регуляции пролиферации и дифференцировки/дедифференцировки зрелых клеток различных тканей, в регуляции выживаемости и подвижности клеток, а нарушения в их функционировании зачастую приводит к злокачественной трансформации. Биологические эффекты ЭФР опосредуются в клетке его рецептором -трансмембранным белком, цитоплазматический домен которого обладает тирозинкиназной активностью. Рецепторы ЭФР чрезвычайно широко экспрессируются различными типами клеток.

Взаимодействие ЭФР с рецептором стимулирует два ряда событий: с одной стороны, инициируются каскадные сигнальные пути, с другой стороны, происходит поступление ЭФР-рецепторных комплексов внутрь клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние эндосомы (РЭ), где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану (ПМ), а остальные попадают в предлизосомальный компартмент, называемый поздними эндосомами (ПЭ), после чего деградируют в лизо.сомах (Никольский и др., 1987). В последние годы появляются данные, отводящие рецептору, находящемуся в эндосомах (как ранних, так и поздних), самостоятельную роль в реализации сигнала, стимулируемого ЭФР. В связи с этим изучение механизмов регуляции вступления рецептора на путь деградации и продвижения по нему приобретает большое значение.

Несмотря на длительную историю исследований, ответа на вопрос о том, как именно происходит сортировка ЭФР-рецепторных комплексов на путь лизосомальной деградации (т.е. переход из РЭ в ПЭ), до сих пор нет.

Все больше подтверждений получает точка зрения, в соответствии с которой переход из РЭ в ПЭ связан с попаданием белков, направляемых в лизосомы, в везикулярные домены мембраны РЭ, на которых в дальнейшем образуются инвагинации. Эти инвагинации превращаются затем во внутренние пузырьки, что приводит к формированию так называемых мультивезикулярных эндосом (МВЭ), встречающихся на поздних стадиях эндоцитоза практически у всех известных организмов (Felder et al., 1990; Ullrich, Schiessinger, 1990; Dunn, Maxfield, 1992). Образование инвагинаций (и заякоривание в них направляемых на деградацию белков) начинается, по-видимому, уже на стадии РЭ, полностью сформированная МВЭ соответствует по характеристикам ПЭ. Таким образом, РЭ превращаются в ПЭ в ходе процесса, называемого созреванием. Молекулярные основы этого процесса неясны. В настоящее время можно считать установленным, что для перехода в ПЭ рецептор ЭФР должен обладать активированной тирозинкиназой (ТК) (Благовещенская и др., 1994). Известен также ряд белков и белковых комплексов, нарушения в функционировании которых в той или иной степени нарушают доставку рецепторов в лизосомы. Это фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), убиквитин-лигаза c-Cbl, адапторный белок SNX1, субстрат рецепторной тирозинкиназы HRS, комплексы ESCRT I, II, III и др. Сайты действия этих белков не всегда известны, а механизм координации их действия практически не изучен.

Давно показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию - пострансляционной модификации, заключающейся в ковалентном присоединении убиквитина к остаткам лизина, содержащимся в молекуле рецептора (Galcheva-Gargova et al., 1995). Убиквитинирование, как известно, является маркером для деградации на протеасомах (Wilkinson, 2000; Myuang et al., 2001), однако в последнее время появились указания на то, что убиквитинирование может быть необходимо также для интернализации и включения лиганд-рецепторных комплексов во внутренние пузырьки МВЭ (Бирге е1 а1., 2001). Показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию убиквитин-лигазой с-СЫ (Ьеук0\уй2 е1 а1., 1999). Данные о том, на каком этапе с-СЫ ассоциируется с рецептором, как долго сохраняется комплекс, каков статус убиквитинирования рецептора, т.е количество убиквитинов и убиквитиновых цепочек, присоединенных к одной молекуле рецептора, так же как и «молекулярный» смысл этой модификации, противоречивы и неполны. Не исключена вероятность того, что убиквитинированный рецептор узнается протеасомой и подвергается частичному протеолизу, в результате чего он становится доступен белкам, вовлекающим его на путь лизосомальной деградации. Существует ряд работ, авторы которых делают вывод об участии протеасом в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР (Longva е! а1., 2002), рецептора липопротеинов низкой плотности (Ме1шап а1., 2002) и рецепторов гормона роста (Так^ & а1., 2001). Подобное заключение делается ими на основании того, что ингибиторы активности протеасом, в частности, наиболее широко применяемый синтетический ингибитор МО 132, подавляют процессинг рецепторов по лизосомальному пути. Этими авторами, однако, не анализируется и не учитывается неоднозначность действия ]УЮ132 на клетку. Таким образом, вопрос о том, насколько протеасомы вовлечены в регуляцию внутриклеточного процессинга рецепторов ЭФР на поздних стадиях эндоцитоза, и какова роль убиквитинирования рецептора, остается открытым.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы проанализировать возможное участие протеасом в регуляции разных стадий эндоцитоза рецептора ЭФР, а также исследовать поведение убиквитинирующего рецептор белка с-СЫ в процессе эндоцитоза.

В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Проанализировать влияние ингибитора протеасом ]УЮ132 на динамику эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, определить, на каком этапе он действует;

2. Изучить поведение убиквитин-лигазы с-СЫ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;

3. Сравнить спектр убиквитинирования рецептора ЭФР в различных эндосомальных компартментах;

4. Идентифицировать фосфатидилинозитол-3-киназу, участвующую в регуляции сортировки рецептора ЭФР в поздние эндосомы;

5. Определить последовательность действия с-СЫ и Р13К в ходе эндоцитоза.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Рецептор ЭФР в эндосомах не является непосредственной мишенью действия протеасом.

2. Убиквитинирование рецептора ЭФР в ранних и поздних эндосомах различно; высокоубиквитинированные формы составляют относительно небольшую долю общего пула интернализованного рецептора, и именно эти формы преимущественно сортируются в поздние эндосомы.

3. Синтетический ингибитор протеасом МС132 может замедлять как переход ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, так и взаимодействие поздних эндосом с лизосомами, основной сайт его действия зависит от скорости процесса эндоцитоза в конкретных клетках, а механизм связан в основном с истощением пула свободного убиквитина.

4. Убиквитин-лигаза с-СЫ после стимуляции эндоцитоза ассоциируется с рецептором ЭФР как в ранних, так и в поздних эндосомах, при этом сайт ее первоначального действия находится выше по эндоцитозному пути, чем сайт действия фосфатидилинозитол-3-киназы.

5. В регуляцию перехода рецептора из ранних в поздние эндосомы вовлечена не Р13К I класса р85\р110, а Р13КIII класса ЬУР834.

2. Обзор литературы

2.1. Общие понятия о везикулярном транспорте.

Эукариотическая клетка состоит из мембранных компартментов, которые взаимодействуют между собой с помощью тубуловезикулярного транспорта. В клетке постоянно происходит отпочковывание мембранных пузырьков, от одного компартмента и последующего слияния их с другим. Ряд возбудителей опасных заболеваний человека и животных способны проникать через отпочковывающиеся везикулы внутрь клетки, при этом микроорганизмы меняют свойства этих пузырьков таким образом, что они теряют способность сливаться с лизосомами, тем самым, приводя к беспрепятственному размножению патогенных микроорганизмов. Кроме того, с помощью везикулярного транспорта экспортируются вновь синтезированные белки и другие молекулы во внеклеточную среду, обеспечивая тем самым регуляцию на уровне организма. Поступление внутрь клетки питательных веществ, транспорт иммуноглобулинов и многие другие процессы также опосредуются перераспределением мембран. Возможно, что с помощью везикулярного транспорта регулируется внутриклеточный и трансмембранный сигналинг, позволяя влиять на такие процессы, как дифференцировка, пролиферация, апоптоз, выброс ионов кальция из внутриклеточного депо и др. Нельзя не сказать, что везикулярный транспорт контролирует гомеостаз мембран в течение всей жизни клетки.

В клетке можно выделить несколько основных везикулярных потоков. Так, вновь синтезированные белки поступают из эндоплазматического ретикулума в цистерны аппарата Гольджи, а затем или переносятся в составе секреторных пузырьков к плазматической мембране, где выделяются во внутриклеточную среду посредством экзоцитоза, или направляются к другим внутриклеточным компартментам. Трансцитоз - транспорт с апикальной поверхности поляризованных клеток к базальной мембране, что характерно для транспорта иммуноглобулинов. Одной из важнейших функций, осуществляемых вакуолярным аппаратом клетки, является эндоцитоз - процесс поглощения клеткой содержащегося в окружающей среде макромолекулярного материала и распределения его между внутриклеточными компартментами.

В настоящее время в клетках выделяют два основных типа эндоцитоза: жидкофазный (пиноцитоз) и рецептор-опосредованный эндоцитоз (РОЭ). В случае пиноцитоза происходит неизбирательное поступление внутрь клетки молекул, присутствующих в межклеточной среде. Этот процесс считают конститутивным, поскольку в общем случае он происходит постоянно в условиях метаболической активности клетки. Строго говоря, это не так, поскольку в ряде случаев клетка способна регулировать эффективность пиноцитоза, например, увеличивая его в ответ на стимулированную секрецию, что обеспечивает нормальный оборот мембран и поддерживает ' постоянный размер клетки. Таким образом, о пиноцитозе следует говорить не столько как о конститутивном, сколько как о неселективном, но регулируемом компенсаторном процессе.

Другим типом является рецептор-опосредованный эндоцитоз, высокоспецифический путь поступления в клетку многих биологически важных молекул после связывания их с соответствующим рецептором на плазматической мембране (ПМ). К таким молекулам относятся белки плазмы (липопротеины низкой плотности), полипептидные гормоны (инсулин), факторы роста (эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов) и др.

На самом деле оба пути в экспериментальных условиях достаточно тесно переплетены между собой. Так, было продемонстрировано, что т ростовые факторы встречаются в пиноцитозных везикулах при * определенных условиях (Hopkins et al., 1985), также как маркер конститутивного эндоцитоза, пероксидаза хрена, может поступать в клетку в одних пузырьках с ростовыми факторами (Synnes et al., 1999).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Меликова, Мария Сергеевна

6. ВЫВОДЫ

1. Рецептор в эндосомах не является прямой мишенью протеасом.

2. Действие синтетического ингибитора активности протеасом 1УЮ132 на прохождение ЭФР-рецепторных комплексов по эндоцитозному пути с наибольшей вероятностью связано с истощением внутриклеточного пула свободного убиквитина.

3. В ходе эндоцитоза рецептор подвергается нескольким актам убиквитинирования. Появление высокоубиквитинированных форм рецепторов ЭФР существенно как для их сортировки из ранних в поздние эндосомы, так и для полноценного созревания поздних эндосом.

4. Динамика убиквитинирования рецептора ЭФР в эндосомах коррелирует с фосфорилированием рецептора по тирозину и его ассоциацией с убиквитин-лигазой с-СЫ. Стимуляция эндоцитоза ЭФР приводит к образованию комплекса «с-СЫ-рецептор», а диссоциация комплекса происходит в поздних эндосомах, до попадания рецептора в лизосомы.

5. В сортировке рецепторов ЭФР в поздние эндосомы участвует Р13К III класса ЬУР834, а не рецептор-активируемая РОК I класса р85/р110.

6. Р13К регулирует более позднюю стадию в процессе перехода ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, чем с-СЫ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меликова, Мария Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Авров К.О., Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1996. Зависимость типа эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов от базального уровня активности тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 38(10): 1084-1091.

2. Благовещенская А.Д., Соколова И.П., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1994. Зависимость эндоцитоза эпидермального фактора роста от степени занятости рецепторов. Цитология. 36(7): 664-674.

3. Вдовина И.Б., Бурова Е.Б., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. 1993. Сравнительный анализ раннего и позднего эндоцитоза эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 35 (2): 60-67.

4. Железнова Н.Н., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 2001. Влияние вортманнина на эндоцитоз рецепторов эпидермального фактора роста. Цитология. 43 (2) : 156-165.

5. Корнилова Е.С., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. 1987. Динамика компартментализации эпидермального фактора роста в клетках А431. Цитология. 29: 904-910.

6. Медведева Н.Д. Евдонин А.Л., Цупкина Н.В., Константинова И.М. 2002. Рецептор ЭФР деградирует по протеасом-зависимому пути в клетках А431. Цитология. 44 (7): 697-701.

7. Меликова М.С., Филатова М.М., Корнилова Е.С. 2003. с-СЫ -полифункциональный регулятор клеточных процессов. Цитология. 45(11) : 11341148.

8. Никольский Н.Н., Соркин А.Д., Сорокин А.Б. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

9. Соколова И.П., Арнаутов A.M., Никольский Н.Н., Корнилова Е.С. 1998. Исследование ассоциации малой ГТФазы Rab7 с эндосомами клеток, экспрессирующих нормальный и мутантные формы рецептора эпидермального фактора роста. Цитология. 27(12): 1367-1373.

10. Achiriloaie М., Barylko В., Albanesi J.P. 1999. Essential role of the dynamin pleckstrin homology domain in receptor-mediated endocytosis. Mol. Cell Biol. 19: 1410-1415.

11. Alwan H. A. J., Everardus J. J. van Zoelen, and Jeroen E. M. van Leeuwen. 2003. Ligand-induced Lysosomal Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Degradation Is Preceded by Proteasome-dependent EGFR De-ubiquitination. J. Biol. Chem. 278: 35781-35790

12. Amerik A.Y., Nowak J., Swaminathan S., Hochstrasser M. 2000. The Doa4 deubiquinating enzyme is functionally linked to the vacuolar protein-sorting and endocytic pathway. Mol. Biol. Cell. 11 : 3365-3380.

13. Andoniou C., Thien C., Langdon W. 1994. Tumour induction by activated abl involves tyrosine phosphorylation of the product of the cbl oncogene.EMBO J. 13:4515-14523.

14. Andoniou C., Thien C., Langdon W. 1996 .The two major sites of cbl tyrosine phosphorylation in abl-transformed cells select the crkL SH2 domain. Oncogene. 12:1981-1989.17.18,19,20,21,22.