Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция эндоцитозного пути рецепторов эпидермального фактора роста (ЭФР)

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция эндоцитозного пути рецепторов эпидермального фактора роста (ЭФР)"

На прапах рукописи 5.535.5

БЛАГОВЕЩЕНСКАЯ Анастасия Донатовна

РЕГУПЯИМЯ ЭНйОННТОЗНОГО П¥ТИ РЕЦЕПТОРОВ ЭПИПЕРП^ПЬНОГО Ч>вИТОРв Р0С7Я (ЭФР)

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, академик

Н.Н.Никольский Институт цитологии РАН, С.-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ЯЛО.Комиссарчик Институт цитологии РАН, С.-Петероург

доктор биологических наук Б.НЛейбуш

Институт эволюционной физиологии и биохимии им.Сеченова РАН, С-Петербург

Ведущее учреждение: Пиолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета, С.-Петербург

Защита состоится к_1996 года в

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института

цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН оу

Реферат разослан "ЗУ« года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.б.н.

Актуальность проблемы.

В настоящее время процесс рсисптор-опосредопанного эмдонитоза (1'ОЭ) ростовых фактороя является предметом интенсивных исследований, поскольку оказалось, чго поступающие в клетку в холе РОЭ рецепторы, в том числе и рецептор эпнлермалыюго фактора роста (ЭФР), обладают лигаид-стимулнрованиой тирозиикнназной активностью (1.а! с( а1., 1989; Гч'сЛегоУ е( а!., 1990) и участвуют в каскадных- реакциях фосфорклнроваиня/дсфосфорилнронання внутриклеточных белков, что в конечном счете приводит к передаче митогенного сигнала (I)! Си£1|'с1то е< а1., 1994).

Применение нммунофлюоресиогпюго, электронно-микроскопического к биохимического анхтмэов позволяю в значительной степени охарактеризовать различные этапы внутриклеточного прокессиига ЭФР-рспспторных комплексов. Считается устанопленным, что связывание ЭФР со своим рецептором на плазматической мембране (ПМ) нндуцнр\ет иитернхниаиню ЭФР-рснепторных комплексов - эффективное поступление во внутриклеточные компэртменты через клатрин-оканмленные ямки. Первым компартмептом, в котором обнаруживаются интсрнх1нзованныс ЭФР-репепторные комплексы, являются ранние эндосомы. Они составляют главный сортирующий компартмент эндошпозного пути, поскольку в нем определяется внутриклеточная судьба ЭФР-рспспторных комплексов: рециклирование на ПМ (Теяк-пко е1 а)., 1987; 5огк('п с1 а)., 1989), либо поступление на дорадацпоннмй путь в лизосомы (Мик!т1п&, БЬнтги, 1982; Ве£шпо1 е1 а1., 1984). Те лигаид-рснепторные комплексы, которые направляются (сортируются) на деградации», поступают дхзее в поздние эндосомы, локхтзующнсся в области пара-Гольджн, н затем в лизосомы. В лнзосомах происходит деградация как ЭФР, так и его рецептора.

Лнхтиз связывания ЭФР с клетками продемонстрироохт существование двух классов рецепторов, различающихся по сродству к ЭФР: высоко- к ннзкоаффинных. Существуют доказательства о преимущественном автофосфорнлнровании и основном вкладе высокоаффннных рецепторов в процессы передачи мнтогенного сигнхта, в то время как данные о внутриклеточном процсссинге разных популяции рецепторов отсутствуют.

Сейчас становится очевидным, 'по прохождение всех этапов эндоцнтозного нугн ЭФР-репепторных комплексов контролируется многими факторами. Так, обнаружено, что некоторые участки в молекуле рецептора ответственны за прохождение определенных стадий эндоинтоза. Среди этих участков оснопну-) регуляторную функцию выполняет тирозинкина « (ТК) рецептора. Считается установленным, что рецепторная ТК, осуществляя фосфорнлнрованне внутриклеточных белков, опосредует передачу ЭФР-индупнрованного митогенного сигнхта. Однако, литературные данные об участии ТК в регуляции эндошгтоза неполны и противоречивы.

К настоящему моменту известен ряд боков, функционирующих в качестве регуляторов внутриклеточнот мембранного транспорта, частым случаем которого яаляется эндошггоз. К ним относятся аниексины, белки СОР, АГ^Г, КаЬ-семейств. Последнее семейство особенно интересно тем, что обладает нмеокон структурной и функциональной гомологией с Каз-белком • ключевым звеном в ЭФР-зависимом сигнальном каскаде. Вопрос о том, вовлекаются ли (ЪЬ-бслки в регуляцию ЭФР-опосредованного энлои>ггоза, остается открытым.

В ходе рсцептор-оносредованного и жидкофазного эндотгтоза лнганды, направляющиеся в лизосомы, проходят через серию эндосомальных компартментов. Однако, неизвестно, различаются ли эти компзртме|ГГы и регуляторные механизмы, коррелирующие доставку в них лиганда, для двух типов эпдоцитоза. До сих пор этой проблеме не уделялось особого внимания.

Ешс одним обстоятельством, придающим значимость рассматриваемой проблеме, является полное отсутствие данных по регуляции ЭФР-опосредованного эпдоцитоза в клетках, экспрессирующих низкое, "физиологическое" количество рецепторов. Изучение этого вопроса может дать точное представление о роли ЭФР-заонснмого эпдоцитоза в проведении митогенного сигнала.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы является выявление факторов, необходимых для регуляции различных этапов эндоцитозного пути рецепторов ЭФР.

В связи с этим, задачи исследования определены следующим образом:

1. Сравнить внутриклеточную судьбу высоко- и низкоаффшшых рецепторов

ЭФР.

2. Исследовать внутриклеточный процессннг рецепторов, обладающих активированной и неактивированной ТК в клетках Л431.

3. Изучить взаимоотношения маркера поздних эндосом 1Ы>7 с эидосомальнымн компартментамн, содержащими рецептор ЭФР, в ходе эпдоцитоза в клетках А431.

4. Проанализировать пути внутриклеточного процессннга ЭФР н пероксидазы хрена (ПХ) в условиях разборки микротр)бочек мокодазолом и ингибироваиия вакуолярной Н*-АТФазы бафнломицином А1 (Баф А1) в клетках А431.

5. Сравнить эндоцнтоз ЭФР-реиепторных комплексов в ЭФР-завнснмых клетках НСП, растущих в присутствии и отсутствии ростового фактора.

Научная новизна полученных результатов.'

Установлено, что тирозинкнназная активность рецептора участвует в регуляции, по крайней мере, двух ключевых этапов эндоцкгоза ЭФР-рецепторных комплексов: интернализации и сортировки (перехода из ранних эндосом в

поздние). Однако, требование активации ТК рецептора для его аффективной сортиронкн является более жестким.

Впервые нсслсдопаиы взаимоотношения эндосомальных комнартментов, содержащих рецепторы ЭФР, с маркером поздних эндосом Rab7 в ходе ГОЭ. Показано, что Rab7 ассоциируется не только с поздним, но и сортирующим энлосомальнммм компартментами, содержащими рецепторы ЭФР.

Продемонстрированы рахпнчня механизмов, регулирующих дна основных типа эндоццтоза: жидкофазного (мнкропннощггоза) к РОЭ. Обнаружено, что система интактных мнкротрубочек к активность вакуолярной Н*-ЛТФазы, которая создаег градие1гг рН вн>три органелл эндоцитозного пути, являются необходимыми условиями эффективной сортировки жидкофазного маркера ПХ. Напротив, на сортировку ЭФР-рснепторных комплексов эти факторы ме оказывают влияния.

В ЭФР-завнсимых клетках эпителия маточной железы мыши НСП продемонстрировано, что эффективность перехода ЭФР-рснепторных комплексов из ранних в поздние эндосомы зависит от того, росли ли клетки в присутствии или отсутствии ЭФР в среде.

Практическая ценность работы.

Применение моноклональных антител, специфически узнающих высоко- и низкоаффинные рецепторы, является идеальным подходом, с помощью которого можно изучать функционирование каждого класса рецепторов разных факторов роста в любых клеточных линиях.

Неспособность моноклонхзьных антител стимулировать ТК активность после связывания с соответствующим» рецепторами ростовых факторов является одним из преимуществ использования антител в качество нейтральных зондов для изучения рати ТК активности в натнвной системе и поэтому позволяет избежать неспецнфических эффектов, возможных при использовании трансфектаитных клеточных линий, мутантных по ТК активности.

Новый специфический блокатор вакуолярной Н*-АТФазы - бафнломиинн AI - представляет самый лучший на сегодняшним день агент для изучения роли рН в эндоцитозмом транспорте в любых клеточных линиях, поскольку позволяет избежать побочных эффектов, вызываемых ионофорамн и слабыми основаниями.

Система понторного центрифугирования субклеточных органелл » градиентах с различной концентрацией Перколла может быть с успехом применена хтя максимального разделения любых органелл эндоцитозного пун различных белков.

Япробаиоя работы.

По теме днссертации'онубликовано 7 работ.

Матернхчы диссертации докладывались на Международной школе lio внутриклеточному транспорту (Эспиньо, Португалия, 1994), ежегодном Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994), конференции Европейского общества клеточных биологов (Хейдельберг, Германия, 1995), Европейской научной конференции "Мембранная динамика и эндоцнтозе" (Итарнн, Ирландия, 1995), в Европейской молекулярно-бнологической лаборатории (Хейдельберг, Германия, 1995) и на научных семинарах лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН..

Объем а структура аиссертаиии.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 211 публикаций. Работа изложена на ÍÍT3 страницах машинописного текста н иллюстрирована 22 рисунками и 3' таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы псслеяованпп.

Клеточные линии и их культивирование.

В работе использовались клетки эпидермальной карциномы человека линии А431, полученные из Банка клеточных культур (Институт цитологии РАН) и минимально трансформированные клетки эпителия молочной железы мыши, полученные из лаборатории Н.Хайнес (Институт им. Ф.Мишера, Брзель, Швейцария). Клетки А431 культивировали в среде Игла с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота, а клетки НС11 • в среде RPMI, содержащей 8%-ную эмбриональную бычью сыворотку, инсулин (10 нг/мл) , в присутствии (НС11*клетки) или отсутствии (НС11" клетки) ЭФР (10 нг/мл).

Для опытов клетки сеялн на пластиковые чашки Петри диаметром 35 мм или 100 мм с плотностью 25-50 тыс./см\ В опыт 6pxiu монослойные культуры на 2-3 сутки после посева.

Получение иодированных лиганаов.

Иодирование ЭФР, МаЫ08 и ПХ процедили по модифицированной методике с использованием йодогена и Nal125 (Wiley, Cunningham, 1982).

Опыты по оинамике »ндоиитоза в условиях предварительного связывания лиганаов.

Дли достижения равновесного связывании лнганда с реиегггорзчи клетки ннкубнропалк в рабочей среде (ДМЕМ, содержащая 0,1 Тс ПСА и 20 мМ MEPES, 1>М = 7.4) при +4°С 60 мин с |251-ЭФР или 120 мин с |,51-МаЫ08. 15 случаях, когда jtoto требовали условия эксперимента, клетки предварительно инкубировхш при +4°С с МаЬ2Е9 (45 нг/мл) или ЭФР (5-200 нг/мл). После отмывки неснизампегося лнганда эндоцитоз стимулировали переводом клеток в рабочую среду, не содержащую ^иганд, при +37°С на определенное время. По окончании инкубации клетки помещали на лед, а среду сливали и использовали для определения степени деградации лнгаидов методом осаждения высокомолекулярных пептидов смесью 1 %-1ЮГ> раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты и 57е-ной ТХУ. Для удаления поверхностно-связанного (неинтернализованного) лнганда клетки обрабатывали на льду 0,2 М натрий-ацетатным буфером, содержащим 150 мМ NaCl, рН в 4.5 для 1М1-ЭФР к рН = 2.5 в случае ,г51-МаЫ08 3 раза по 2 мин. После уксусно-кислотнои экстракции клетки промывали холодной рабочей средой и фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до восстановления нейтрхтьных значений рН н использовали для субклеточного фракционирования и иммуиофлюорсснеттюй окраски. В опытах по изучению динамики внутриклеточного накопления меченых лигандов клетки затем лизировали в ] М ,4'аОН к )|елосредствснно использовали для определения количества ннтернхтизоваиного лнганда.

Опыты по динамике »ндоиитоза в условиях "импульсной загрузки" лигандоо.

Клетки инкубировали в рабочей среде, содержащей 1231-ЭФР (5нг/мл) или 1251-ПХ (2 мг/мл) при +37°С в течение 20 мин. В последнем случае концентрация меченой ПХ составляла 0,4 мг/мл, тогда как конечная концентрация (2 мг/мл) достигалась за счет добавления немеченого лнганда. После окончания инкубации клетки промывхпи 5 раз рабочей средой и помешали на лед. Отмывку неинтернхтизоьанного л и ганда с плазматической мембраны проводили натрнй-анетатным буфером, рН = 4.8 (в случае '"'ЬЭФР) либо рабочей средой, содержащей 10% сыворотки (в случае 1И1-ПХ), 2 раза по 2 мин. Дхтее продолжали инкубацию в рабочей среде, не содержащей лиганд, при +37°С в течение определенного времени и повторяли кислотную экстракцию либо отмывку рабочей средой, клк описано выше. Затем клетки промывали рабочей средой до установления нейтральных значений рН и ополаскивали в ФСБ. При пархтлельном проведении иммунофлюоресиснтных опытов покровные стекла вынимхти и переносили в другие чашки.

Исследование эндоиитоза в присутствии Баф fll или нокодазола.

Опыты по энлошггозу в присутствии Паф А1 или нокодазола проводили в

coo merci ни н со схсмой "импульсной загрузки" лшиндов. Клетки предьинкубнровалн 60 мни при +37"С в рабочей среде, содержащей 2Ü мкг/мл жжодазола (Sigma) либо 0,1 мкг/мл бафнломиципа Al (Sigma) и все дальнейшие инкубации проводили в постоянном присутствии агентом н рабочей срсде.

Субклеточно« фракционирование d градиенте плотности Перколла.

Клетки с чашек соскребали раббером в буфер ТЭС (10 мМ триэтаноламиновын буфер, рН = 7.3, содержащий 1 м,М ЭД'ГА, 0,25 M сахарозы и 0,2% азида натрия). Мнкросомальную фракцию получали путем 30 пипстироцаний с помощью автоматической пипетки и центрифугировал» 2 раза по 10 мин при IООО об/мин. Суммарный супсрнатант добавляли к раствору Псрколла таким образом, чтобы в конечном обье.ме (12 мл) содержалось 17% паточного раствора Псрколла (1 часть 2,5 N1 сахарозы и 9 частей суспензии Перколла). Градиент формировали центрифугированием в угловом роторе Р65 в течение 25 мин при 50 000 g. Фракционирование проводили со дна пробирки через иглу. Для повторного центрифугирования в градиенте ЗОСс-ного Перколла объединяли первые семь фракций исходного градиента и с таким количеством 21%-пого Псрколла в ТЭС буфере, чтобы конечный обьем составлял 12 мл. Центрифугирование и фракционирование проводили как описано для 17%-ных градиентов. Радиоактивность проб измеряли с помощью гамма-счетчика Miiii-GAMMA (LKB).

Измерение ферментативной активности маркерных ферментов а субклеточных фракииях.

Фермснтативную активность ¡Ч-аистнлглюкозамннндазы измерили по модифицированному методу Лсффлера (Loffler et al., 19S4). Анализ ферментативной активности катепенна D проводили по модифицированному меч оду, используя и качестве субстрата 3Н-ацетил1смоглобин, который был синтезирован в реакции Баррета и Хнта (Дингл, 1980).

Иммунофоюоресиентное окрашивание клеток.

Клетки на покровных стеклах фиксировали 4'.»-ним раствором формалина в ФСБ в течение 15 мин. После отмывок в ФСБ kj»-iki¡ пермеабилнзнровали в 0,2%-ном растворе сапонина, приготовленном на ФСБ и содержащем 10 мг/мл БСА. В этом же растворе проводили последующие стадии окраски первичными и вторичными (конъюгированными с флюорссцеинизогионноиатом или родамином) антителами. После каждой инкубации с антителами клетки промывали в течение 15 мин. Для визуализации окраски покровные стекла обрабатывали, используя Slow-Fade Antifade Kit (Molecular Probes). Препараты наблюдали в

люминесцентный микроскоп "Опгон" с объективом 1,25x100 (масляная иммерсии) и фотографировали па пленку А2 или К01)АК-400.

Электрофорез и иммуноблотшнг.

Белки разделяли методом диск-viс кт р< и[>ореза в ;ienai урирующнх условиях и ПААГ по системе Лэммли (Lai-rwnli, 1970). Электропереиос белков на нитроцеллюлозу проводили и камере для электроперсноса (Дна-М), используя трис-глишфовый буфер с метанолом (20 мМ трис; 0,2 М глипчн и ЗГс метанол). Для забивки активных нитропеллюлозных групп фильтры мнкубировхти в растворе БСА (10 мг/мл) в ТБС (20 м.М 'Грнс, 150 мМ NaCl, рН = 7.6). При инкубаннях с первичными и вторичными (конъюгированнымн с ПХ) антителами использовали этот же буфер. Отмывку несвязавшихся первичных и вторичных антител проводили в ТПС, содержащем 0,05^0 Твин-20. Для детекции белков фильтры окращнвхпи дначинобензидиновым методом.

Результаты исследования.

1, Зависимость энаоиитоза ЭФР от степени занятости реиептороо и их ТК активности.

Для анализа эндоинтоза высокоаффинных рецепторов ЭФР было применено три основных подхода. Во-первых, исполыовхти 1М1-ЭФР в низких (менее 5 нг/мл) и высоких (50-100 нг/мл) концентрациях, когда оккупированными оказываются высоко- и низкоаффинные репепторы, соответственно. Во-вторых, проводили предъннкубацню клеток с моноклональнымн антителами МаЬ2Е9, которые препятствуют дальнейшему связыванию ЭФР с ннзкоаффинными рецепторами. В-третьнх, использовали моноклонхтьные антитела МаЫОЯ, специфически связывающиеся с высокоаффниными рецепторами и не активирующие их ТК.

Ранее было показано, что эндосомхзьный компартмент клеток А431 представлен двумя фракциями, различающимися по плавучей плотности в градиенте плотности 17%-ного Перколла: легкими (1,04 г/мл) и тяжелыми (1,06 г/мл) эндосомами. Субклеточное фракционирование в этих градиентах продемонстрировало значительные различия в комнартментхтнзации энлоиитнрованного лнгаща при инкубации клеток с 1151-ЭФР в концентрациях 0,5 и 95 нг/мл (Рис.Ъ. Хотя в обоих вариантах через 5 мин после стимуляции эндоинтоза ,г51-ЭФР оказывхчея связанным преимущественно с легкими эндосомами, дхтьнейшая инкубация клеток при +37"С приводила к значительному перераспределению радиоактивности в область тяжелых эндосом а случае низкой концентрации лиганла. При использовании высокой концентрации меченого лнгэкда подобной динамики не обнаруживается: и через 60 мин более 80% метки седнмснтирует в легких эндосомах.

%

15

10

8

0,5 нг/мл 95 нг/мл

а а" 6

ЭНЛ А

^ /А ЗНТ . ух? «* 1.1 ■!■> 1 П 1 ....... ■

5 10 15 5 10 15

№ фракции

•-• 5 МНН

о—о 60МИН

,231-ЭФР в градиенте плотности 177и-стимуляции эндоцктоза л и ганда в

Рис. 1. Распределение иитернализованного ного Перколла через 5 и 60 мин после концентрации 0,5 (а) и 95 (б) нг/мл. По оси абсцисс - номер фракции градиента; по оси ординат . радиоактивность фракции, выраженная радиоактивности всех фракций.

ЭН, и ЭН., .'фракции тяжелых и легких эндосом, соответственно,

в % от суммарной

% 5

ЭН. ЭНА

А а р1 б

£ 1ь ЭНТ м \

р V /\Jf\b

ЭНуГ \\ -1 1-1 \Ч

1 •—+2Е9

2 о—о-2Е9

10 15

10 15

Рис.2. Влияние моиоклональных антител МаЬ2Е9 на распределение шггернализованиого 1И1-ЭФР в градиенте плотности 17%-ного Перколла через 5 (а) и 60 (б) мин после стимуляции эндоцитоза. По оси абсцисс • номер фракции градиекта;

по оси ординат • радиоактивность фракции, выраженная в % от суммарной радиоактивности всех фракций. 1 • клетки прединкубировали в присутствии МаЬ2Е9 2 часа при -1*С; 2 - клетки не прединкубировали с этими антителами. ЭН, И ЭН,- фракции тяжелых и летних "ниосоч. оюгпгтстпенн«».

Следует отметить, что даже при использовании низких концентраций ЭФР до 30% лиганда может связываться с низкоаффинными рецепторами. Для ограничения вклада этих сайтов в общее связывание 1251-ЭФР была проведена предварительная обработка клеток антителами МаЬ2Е9. Субклеточно«' фракционнровнне подтвердило описанные выше закономерности: в клетках, предварительно обработанных МаЬ2Е9, через 1 ч инкубации с 1251-ЭФР около половины лиганда оказалось связанной с тяжелыми эндосомамн и лнзосомамн, тогда как в не обработанных МаЬ2Е9 клетках в те же фракции перераспределяется около 30% всей метки (Рнс.2). Таким образом, дополнительная' блокировка ¡шзкоаффинных рецепторов приводит к более эффективному попаданию 1-ЭФР-рецегтгорных комплексов в тяжелые энлосомы, чем просто при использовании низкой концентрации ЭФР. Из этого следует, что ЭФР, связанный с низкоаффннымк рецепторами, предпочтительно задерживается в легких эндосомах.

В качестве другого радиоактивного зонда высокозффнннмх рецепторов были использованы иодированные моноклонханые антитела МаЬ108. Поскольку эти антитела не стимулируют ТК рецептора и не конкурируют с ЭФР за связывание с рецептором, то представляется возможным сравнение внутриклеточного процессннга рецепторов с активированной и неактивированмой ТК в нативной системе. С этой целью была проанализирована зависимость как относительной начальной скорости ннтерналнзашш, так и внутриклеточной компартментализаини |И1-МаЫ08 от предварительной стимуляции рецептора разными концентрациями ЭФР. Вначале проводили предварительную инкубацию клеток в среде, не содержащей лиганда либо содержащей 10 или 100 нг/мл немеченого ЭФР, и далее клетки инкубировали с 1151-МаЫ08. Для кинетического анализа начального внутриклеточного накопления эидоцитоз ,г51-МаЫ08-реиепторных комплексов стимулировали переводом клеток в среду с температурой +37°С, не содержащую лига плов, на 2, 4, 6, 8 н 10 мни и определяли связанную с клетками радиоактивность путем лизиса клеток в 1М ¡Ч'аОН, как описано в "Материхтах и методах". Полученные результаты показывают, что в клетках, предъинкубированных с 10 нг/мл ЭФР, чнтернхтнзация ,::51-МаЫ08 происходит в 3,2 раза быстрее, чем в контрольных клетках (Рис.3). Однако, предъинкубация клеток с ЭФР в концентрации 100 нг/мл увелнчнвхта эту скорость менее эффективно (в 1,7 раза), что может быть следствием более низкой ТК активности низкоаффинных рецепторов. Анализ компартментхтнзлпнн 1-МаЬ108 в градиенте 17%-ного Перкалла продемонстрировхт. что предварительная инкубация клеток с 10 нг/мл немеченого ЭФР приводила через 60 мин к резкому возрастанию доли '"'ЬМаЫОЗ, ассоциированных с тяжелыми фракциями градиента (Рнс.4). На

Рис.З. Динамика начального внутриклеточного накопления 1и1-МаЫ08 в клетках . А-Ш, предникубированных с 0 (а), 10 (б) к 100 (в) нг/мл немеченого ЭФР. По оси абсцисс • время после стимуляции эндошлоза;

по оси ординат • отн.ед. ( отношение радиоактивности, связанной с внутренними компаргментами клетки, к обшей радиоактивности, первоначально связанной с клетками).

Рис.4. Распределение шгтернализованных ш1-\1аЫ08 в градие1гге плотности 17%-иого Перколла через 5 (а) и 60 (б) мин после 'стимуляции эндоиитоза в клетках А431, предъинкубированных и не предъинкубированных с 10 нг/мл немеченого ЭФР.

По оси абсцисс - номер фракции градиента;

по оси ординат • радиоактивность фракции, выраженная в Тс от суммарной ■ радиоактивности всех фракции.

этом основании можно заключить, чго ТК рецептора вовлечена и регуляцию двух основных этапов эндоцптоза: ннтерналнзаннн н сортировки. Если первый Э1ап может быгь пройден без участия 1 К, то для второго этапа - сортировки - ТК является основным критическим фактором.

2. Локализация белкового регулятора внутриклеточного мембранного транспорта - Г{аЬ7 и рецепторов ЭФР п хоае эндоиитоза п клетках Я431.

Был проведен сравнительный анализ компаргментхчизацни рецепторов ЭФР, обладающих как активированной, так к неактипированноп ТК, и 1Ы>7 -маркера поздних эидосом - п ходе эндоцптоза методом двойной непрямой нммупофлюорссценннн г параллельным субклеточным фракционированием в градиенте плотности 17%-цого Перколла. Для этой цели рецептор-опосредованный эндоцптоз индуцировали двумя типами лигапдов: 1. ЭФР, которьч"! активирует ТК рецептора и 2. моноклональными антителами МаЬ108, которые не активируют ТК. В качестве первичных антител для вынпления рецепторов в опытах по ЭФР-нцдуцированпому эндоцнтозу были использованы моноклоиалыше антитела 5Л9. Детекцию рецепторов в опытах по МаМОЗ-индуцированпому экдоцитозу проводили только вторичными антителами, конъюгированнымн с флюоресцентной меткой.

Иммунофлюоресцентные опыты продемонстрировали значительное перекрывание эндосомальных компартментоп, содержащих КаЬ7 и рецепторы ЭФР с активированной ТК, на поздних (60 мин) стадиях эндоиитоза, что может быть следствием частичной ко-локализацни этих белков на нммунофлюоресцентном уровне. Рассматриваемые компартмситы предстаплены компактными "пятнами", концентрирующимися в районе пара-Гольджн, что является характерной особенностью поздних сроков эндоиитоза ЭФР в клетках /4431. Выше было упомянуто (Рнс.2), что при центрнфупфоианин в градиенте 17%-ного Перколла 1-ЭФР эффективно перераспределяется на поздних сроках эндоцптоза в область тяжелых эидосом, которые по предшествующим данным нашей лаборатории соответствуют поздним эндосомам н составляют постсортирующнй эндосомальный компартмент, тогда как легкие эндосомы -ранним (Зогкт е( а1., 1989).

Напротив, при анализе динамики компартменталпзации 1 1-МаЫ08-рецепторных комплексов в градне1гте 17%-Пого Перкатла наблюдалось лишь незначительное перераспределение радиоактивности в область тяжелых эидосом даже через 120 мин, прошедших после стимуляции эндоцптоза, что отражает замедленную сортировку на деградацнонный путь в лнзосомы рецепторов с неакгивпровэпнон ТК (Рнс.4). Поскольку эти рецепторы медленнее сортируются, то преимущественно они накапливаются в предсортнруюшем эндосомальном компа^тменте, который по плотности в градиенте 17'.'< -кого Перколла

соответствует легким эндосомам. Иммунофьтюорссцентное окрашивание таких клеток выявило, что морфология комнартмента, содержащею рецептор ЭФР с неактивированной ТК, отлнчастсч от компактных "цс1лров", характеризующих поздние сроки ЭФР-опосредованного эидоцитоза. Тем не менее, этот компартмент окрашивается а«ггп-КаЬ7, что доказывает частичную ко-локалнзапню этих белков. Таким образом, можно сделать вывод о том, что ЛаЬ7 узнает два эндосомальных комнартмента, которые локализуются в околоядерной области. Эти компартменты содержат рецепторы ЭФР не только с активированной, но и с неактивированной ТК н представлены постсортируюшими (поздними) и предсортирующнми (ранними) эндосомами, соответственно.

3. Влияние Баф Я1 и нокоаазола на »нлоиитоз ЭФР и ПХ в клетках Д431.

Большинство исследователей считают, что на своем пути в лизосомы лиганды последовательно проходят через ранний н поздний эндосомальный компаргменты, однако на сегодняшний день остается спорным вопрос о том, каким образом осуществляется транспортировка лигаида из ранних в поздние эндосомы. В соответствии с гипотезой Гринберга (СгиепЬсгй е1 а1., 1989) предполагается, что этот процесс опосредуется эндосомальнымц везнкуламн-персносчиками, формирование и функционирование которых, по мнению авторов, определяется двумя основными факторами: активностью вакуолярнон Н*-АТФазы, создающей градиент рН в органеллах эндоцитозного пути, и шггактной системой микротрубочек. Гринберг с коллегами полагают, что в случае блокирования вакуолярнон АТФазы Баф А1 везикулы-переносчики не образуются, тогда как при обработке клеток нокодазолом, дсполнмернзуюшем мнкротрубочки, лиганд накапливается в везикулах-переносчиках, что сопровождается ингабнрованисм дальнейшего транспорта в поздние эндосомы. Мы использовали описанные авторами приемы для проверки справедливости гипотезы существования везикул» псрсносчнков в случае ЭФР-опосредованного эидоцитоза. С этой целью при параллельном использовании субклеточного фракционирования и нммунофлюоресценгной окраски интактных клеток было проведено сравнение жидкофазного эидоцитоза (микропиноиитоза) ПХ и ЭФР-индуцированного эндотггоза в условиях обработки клеток ингибитором вакуолярной АТФазы • Баф А1 и после разборки мнкротрубочек нокодазолом.

Субклеточное фракционирование в граднеиге 17%-ного Перкатла иоказхто (Рис.5), что 1г51-ЭФР через 30 мин после стимуляции эндотггоза накапливается в двух основных фракциях: ле1ких и тяжелых эндосомах независимо ог присутствия Баф А1 в инкубационной среде. По данным иммунофлюорссцентной окраски В)ино, что в контрольных и обработанных Баф А1 клетках в тот же момент

125

X 10' •2

I

30 мин

1-П.Х

а

180 мин

б

ДФ

ЮК

И

5 Ю 15

s 10 15

л

х 10"

ЗОмнн

'1-ЭФ1

180 мин

Л

3»,

зи.

д А е л

А

J \ 1

■ L 1

+ БАФ

+ НОК

ж А ■ 3 •

A I- \1\

л л м

W W

5 10 15

э Ю 15

Рис.5. Распределение интернализованных Ш1-ПХ (а, б, д, е, и, к) и Ш1-ЭФР (в, г, ж, з, л, м) в градиенте 17%-ного Перколла через 30 (а, д, и. в, ж, л) и 180 (б, е, к, г, з, м) мин после стимуляции эндоцитоза в клсгках А431. а-г - контрольные клетки; д-з • клетки, обработанные баф А1; и-м - клетки, обработанные нокодазолои. По оси асцисс - номер фракции; по оси ординат - радиоактивность фракции, отн.ед.

времени аниисла SA9 выявляют нсшкулярные структуры и области пара-Гольджн. Эп( структуры в значительной степени ассоциируются с Rab7. Напротив, на но).¡них стадиях эндоцитоза (180 мин) эффект Баф А1 является более выраженным, I! контрольных клетках происходит эффективная сортировка I-ЭФР в область тяжелых эндосом и лизосом. Кроме того, наблюдается резкое паление радиоактивности в обоих фракциях, что по данным ТХУ-ос ждення радиоактивности инкубационной среды является следствием деградации |:51-ЭФР. В то же время, в обработанных Баф А1 клетках только часть 1г51-ЭФР перераспределяется из фракции легких эндосом во фракцию тяжелых эндосом и лизосом при полной блокировке деградации |гз1-ЭФР. Повторное центрифугирование объединенной "тяжелой" фракции в градиенте 30%-ного Перколла позволяет максимально разделить тяжелые эидосомы и лнзосомы. С помощью этого подхода было обнаружено, что Баф А1 не влияет на переход ЭФР из тяжелых эндосом d лнзосомы и, напротив, приводит к некоторому накоплению радиоактивности в области лизосом, что может происходить в результате блокировки дсфаданнн. Внутриклеточная локализация рецепторов ЭФР и Rab7 полтиерждает данные субклеточного фракционирования: через 180 мин после стимуляции эндоцитоза ЭФР в контрольных (не обработанных Баф А1) клетках шгтерналнзованные рецепторы собраны в немногочисленные околоядерные структуры, окраска которых антителами 5А9 менее интенсивна по сравнению с обработанными Баф А1 клетками. Окрашивание тех же препаратов антителами на Rab7 почти не выявляет ассоциации Rab7 с эндосомами клеток, не обработанных баф А1, на поздних сроках эндоцитоза. Однако, в присутствии Баф A1 Rab7 образует яркие скопления нал ядром и ко-локхтизустся с рецептором в течение длительного времени, что может происходить только в результате блокировки деградации рецептора.

Динамика внутриклеточной компартмагтализации ,г51-ПХ в условиях обработки клеток Баф А1 в значительной степени отличается от таковой для ,г51-ЭФР (Рис.5). Так, через 30 мин инкубации при +37°С Ш1-ПХ накапливается только во фракции легких эндосом как в присутствии, так и в отсутствии Баф А1. Через 180 мин микрошшоцитоза в обработанных Баф А1 клетках происходит полная задержка лиганда в лс1ких эндосомах, тогда как в контрольных клетках некоторая доля лиганда доставляется во фракцию тяжелых эндосом и лизосом. В присутствии Баф А1 деградация 1М1-ПХ, также как и |И1-ЭФР, полностью блокируется. Пммунофлюорссцентная окраска тех же клеток антителами к Rab7 практически совпадает с фоновой окраскбй этого белка в контрольных клетках, не инкубированных ни с ЭФР, ни с ПХ. Это можно интерпретировать двумя причинами: во-первых, эффективность поступления ПХ в клетку значительно ниже эффективности поступления ЭФР, а, во-вторых, переход ПХ во фракцию

тяжелых эндосом и лнзосом гссьма незначителен даже через ISO мни после стимуляции микропнноцнтоза ПХ.

Вторым агентом, который делает возможным идентификацию везнкул-переносчиков, япляется нокодазол. Субклеточное фракционирование и градиенте 17%-ного Перколяа показхто (Рис.5), что на ранних этапах эндоцнгоза (30 мин) действие нокодазола на транспорт К51-ЭФР аналогично Баф Д1: переход '""'Г-ЭФР нз легких энлосом во фракцию тяжелых эндосом н лнзосом почти не ингнбнруегся. Однако, двойная иммунофлюорссшитная окраска тех же клеток антителами 5А9 н airni-Rab7 продемонстрировала, что после обработки клеток нокодазолом характерное "пятно" Rab7 и нигерналнзованных рецензоров ЭФР не образуется и эндосомы накапливаются ri конгломератах, распределенных по всей цитоплазме. На поздних этапах эндоцнтоза (ISO мин) действие нокодазола на перераспределение '"^-ЭФР нз легких в тяжелые эндосомы и лнзосомы практически не выражено, на основании чего можно заключим., что нокодазол, в отличие от Баф А1, вообще не влияет на сортировку в тяжелые эндосомы. Однако, распределение I-ЭФР при повторном центрифугировании в ЗОСг-ноч ГТерколле различается п обработанных и не обработанных нокодазолом клетках: п присутствии нокодазола происходит накопление ралноактипностн в области лнзосом, что, судя по данным ТХУ-осаждення ралноактивпостн инкубационной среды, объясняется частичной блокировкой деградации '""'ЬЭФР. В кммунофлюоресцентных опытах в случае поздних сроков эндоцнтоза не было обнаружено ко-локалнзпцни рецептора ЭФР н R:ib7, что ипляегеи следствием частичной деградацией рецептора.

Судьба шггернхипованной '* [-ПХ отлнчхтась: через 30 мин после стимуляции мнкропиноцитоза радиоактивность, независимо от обработки клеток нокодазолом, ассоциировалась преимущественно с легкими эндосомамн. Через ISO мин значительная порция лишила перераспределялась во фракцию- тяжелых эндосом н лнзосом, но в присутствии нокодазола соотношение между этой фракцией и фракцией легких энлосом смешено в сторону первой. При повторном центрифугировании "тяжелой" фракции в градиенте 30%-ного Перколла вея 1251-ПХ в обработанных нокодазолом клетках остается во фракции, соответствующей по плотности тяжелым эндосомам, тогда как транспорт в лизбеомы и деградация 1251-ПХ блокировались полностью. Таким образом, можно предположить, что посте обработки клеток нокодазолом во фракции тяжелых эндосом, содержащей 1251-ПХ, седнм'ентнруют везикулы-переносчики, поскольку в присутствии Баф А1 эти структуры не образовывались. Напротив, в холе ЭФР-оносредованного эндоннтоза преимущественного накопления ЭФР ни в одной из фракций после обработки клеток Баф Д1 или нокодазолом зарегистрировано не было за исключением лнзосом, в которых полностью (Баф А1) или частично (нокодазол) блокнровхтась

дефилация рецептора и лнгаида. Исходя из этого, можно предложить существование различных механизмов, обеспечивающих доставку в лизосомы ЭФР-реиеторных комплексов и ПХ. Можно предполагать две возможности. Первая возможность заключается в том, что переход из ранних в поздние эндосомы как для ЭФ!', так и для ПХ опосредуется везнкуламн-переноечнками. Однако, о холе ЭФР-опосредовзнного эндоиитоза сигнал, генерируемый реце!ггором, оказывается достаточно сильным, чтобы компенсировать эффекты разборки мнкротрубочек и повышения pH органсл. В соответствии с другой, н более вероятной возможностью, транспорт ЭФР из ранних в поздние эндосомы не опосредуется везикулами-перноечнками, а осуществляется путем постепенного "созревания" эндосом.

4. Энпошлгоз Ш1-ЭФР о ЭФР-зааи«имых клетках »пителия молочной тлвзы мыши линии НСИ.

Было изучено влияние ЭФР на различные характеристики эндоиитоза о клетках НСИ: интерналнзацию, внутриклеточную компартментализацню н деградацию лигацда. Клетки разделили на две популяции: первую (НС11 ) культивировали в среде, содержащей сыворотку, инсулин и ЭФР; вторую (HCl 1") • в среде того же состава, но не содержащей ЭФР. Обнаружено, что скорость ннтернализации Ш1-ЭФР не зависит от условий роста клеток. При этом около 6080% первоначально связанного с клетками 1151-ЭФР поступает во внутриклеточные компартменты в течение первых 5 мин эндоиитоза. Однако, дальнейшее поведение интернализованного лигацда в значительной степени зависело от того, росли клетки в присутствии ЭФР (HCl I*) кли нет (HCl Г). Особенностью экдошлгоза 1231-ЭФР в клетках НС11" являлось то, что, в отличие от НС11* клеток, через 5 мин ннтернализованный Ш1-ЭФР локализуется в основном в легких эндосомах (Pi. :.6). В дальнейшем количество ,МЬЭФР в тяжелой области фадиента, увеличивалось и достигало максимума между 1S и 30 мин эндоиитоза. Тем не менее, через 30 мин в легких эндосомах этих клеток находилось больше лнгаида, чем в тот же момент в НСИ* клетках. ТХУ-осажденне радиоактивности, содержащейся в инкубационной среде, показало, что наряду с более эффективным переходом Ш1-ЭФР из легких в тяжелые эндосомы в НС11* происходит и более интенсивная деградация лнганда.

Если, оценив с помощью фадпентов Перколла количества радиоактивности в легких эндосомах (л) и в тяжелой области фадиента (т), содержащей тяжелые эндосомы и лизосомы, представить их в виде соотношения Rто с помощью этой величины можно охарактеризовать эффективность перехода '"1-ЭФР из легких эндосом в предлизосомхтьнмй компартмент. Как следует из Рис.7, зависимость величины этого отношения от времени, прошедшего после стимуляции эндоиитоза, рахшчается для НСП* и HCl Г клеток. При сравнении наклона кривых "а"

005

005

0.05- ■

а А X

б ЛЛ„ 15' е лА.

D Л-х. 30' ж ЛЛ.

г Я зн. зи. бо' 3

S 10 15

10 15

R

V*

1.0

15

30

60 МИН

Рнс.7. Изменение отношения ,г51-ЭФР связанной радиоактивности в тяжелых эндосо.мах и лизосомах (т) к радиоактивности в легких эндосомах (л - Rr/n ■ в ходе эндоцнтоза в клетках HCl Г (а) н HCl Г (б). По оси абсцисс - время после стимуляции эндоцнтоза, мнн; по оси ординат • радиоактивность фракции, отн.ед.

Рис.6. Распределение нитерналнзованного

1251-ЭФР в градиенте 17%-ного Перколда

через 5 (а, д), 15 (б, е), 30 (в, ж) и 60 (г, з)

мнн после стимуляции эндоцнтоза в клетках

НС11*(а-г) и НСП'(е-з).

Пс оси абсцисс - номер фракции;

по оси ординат • радиоактивность фракции,

отн.ед.

(11С11*) и "б" (ПСИ") на участке до 15 мни видно, что эффективность перехода '* 1-ЭФР нз легких эндосом в тяжелые или НС11* почти в 2 раза превышает таковую для ПСИ". Далее дигамика кривых совпадает, хотя и через 60 мин эндоннтоза значение И,/., для НС11* клеток остается несколько более высоким по сравнению с НС1Г. Па основании этого можно заключить, что длительная (10 дней) инкубация клеток с ЭФР вызывает значительное ускорение сорыровкн лигаш-рсцепторных комплексов.

На основании изложенных выше экспериментальных и литературных данных можно заключить, что прохождение ЭФР-рсцепгорных комплексов по эндоннтозному' пути ко1гтролируется следующими факторами: ТК активностью рецептора, которая коррелирует со статусом высокой аффинности рецепторов ЭФР; специфическими белками-регуляторами сортировки; сигналами, которые индуцируются активированным рецептором, необходимыми для "созревания" энлосом и ЭФР-завнснмым образом в клетках, являющихся "физиологической" мшпеныо действия ЭФР.

Выводы

1. Обнаружено, что ТК активность рецептора участвует в регуляции, по крайней мере, двух этапов эндоцптозпого пути ЭФР-рецепторных комплексов: ннтерпалнэацин н сортировки (перехода из ранних эндосом в поздние'). Однако, требование активации ТК рецептора для осуществления его эффективной сортировки является более жестким.

2. Сравнение внутриклеточной судьбы высоко- н низкоцффшшых рецепторов ЭФР в клетках Л431 показало, что пысокоаффнпиые рецпторы быстрее интсрналнзуются и эффективнее сортируются па путь дсфалацнн. Высказано предположение, что такой процсссппУ' является следствием более высокой ТК активности рецепторов этого класса.

3. Показано, что НаЬ7, традиционно рассматриваемый как маркер поздних .эндосом, ассоциируется не только с поздними, но и с сортирующимися

1 -и ,

эндосомамн, содержащими рецептор ЭФР, что свидетельствует в пользу участия КаЬ7 в рефляции перехода ранних эндосом в поздние. 1

4. Продемонстрировано, что механизмы, регулирующие дна основных типа эпдоцнтоза: жндкофазного (мпкроннноцнтоза) и рецептор-опосредованного, различаются. Обнаружено, что система ннтактпых мнкротрубочек н активность вакуалярноп 1Г*-АТФазы, которая создаст градиент рН внутри органелл эндоцнтозного пути, являются необходимыми условиями эффектвиой сортировки жндкофазного маркера ПХ. Напротив, на сортировку ЭФР-рсцспторных комплексов эти факторы не оказывают влияния.

5. Нммупофлюорссцснтнын анализ показал, что в нормальных условиях сортировка осуществляется в районе пара-Гольджн и не сопровождаете)! транслокацисЛ рецепторов нз периферии клетки ■ околоядерную область. Однако, при разборке мнкротрубочек нокодазолом сортировка рецепторов может происходить и в периферическом комнартменте клетки, причем ее эффективность пе изменяется. В совокупности эти данные могут рассматриваться как ар1умент ■ пользу модели постепенного "созревания" эндосом, содержащих лнганд-рецепторные комплексы.

6. В клетках эпителия молочном железы мыши НС11, являющихся "физиологической" мншенью ЭФР, длительная инкубацня клеток с ЭФР вызывает значительное ускорение перехода ростового фактора из легких в тяжелые эндосомы. Это означает, что ■ клетках НС11 сортировка ЭФР-рецепторных комплексов па пугь деградации рс|улнруется ЭФР-завпснмым образом.

Публикация по теме ппссертаипп.

1. {¡лаговешенская AJL. Соколова И.П., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. Зависимость эцдоцитоза рецепторов эпидермального фактора роста от степени занятости рецепторов // Цитология. • 1994. - т.36. • С.664-674.

2. Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. Эндощгтоз эпидермального фактора роста (ЭФР) в ЭФР-зависимых клетках эпителия молочной железы мыши линии НС11 // Цитология. - 1995. • т.37. • С.883-892.

3. Авров К.О., Благовещенская АЛ., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. Влияние ионов Мп * и базального уровня активности тирозинкнназы рецептора эпидермального 'фактора роста на эндоинтоз ЭФР-реиепторных комплексов //

Ц»гтолоп.я. - 38." N9.

4. Благовещенская А.Д., Корнилова Е.С., Никольский Н.Н. Ассоциация белкового регулятора внутриклеточного мембранного транспорта - Rab7 • с эндосомами, содержащими рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР) с активированной и неактивировапнон тнрозннкиназой // Цитология. • 1996, - Т.ЗД"

V9.

5. Blagovcshchenskaya A.D., Kornilova E.S. Tyrosine kinase activity I» Implicated in regulation of at least two steps along the EGF-receptor endocytic pathway // 1994. - Abstracts to NATO AS1: Membrane trafficking: from molecular sorting to membrane fusion. Portugal, Espinho.

6. Blagoveshchcnskaya A.D., Sokolova LP., Kornilova E.S., Nikolsky N.N. Dependence of epidermal growth factor endocytosis on ¡(a receptor occupancy // Cell Biology International. • 1994. • P.381.

7. Nikolsky N., Blagovcshchenskaya A., Sokolova 1., Vdovlna I., Kornilova E. Regulation of epidermal growth factor (ECF) receptor intracellular trafficking in different cell lines // Europ. J. Cell Biol. Suppl. Vol. - 1995. - P.130.

Ротп. ААНИИ.Зак. 17-100 Уч.цод,л,0.9 10.03.03