Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация и транспорт в ядро МАР-киназы под действием эпидермального фактора роста (ЭФР) в клетках с различными мутациями рецептора ЭФР

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арнаутов, Алексей Михайлович, Санкт-Петербург

¿ч j % (Л и ш •

*

ИНСТИТУТ цитологии РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 576.362:576.535.5

АРНАУТОВ Алексей Михайлович

АКТИВАЦИЯ И ТРАНСПОРТ В ЯДРО МАР-КИНАЗЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА (ЭФР) В КЛЕТКАХ С РАЗЛИЧНЫМИ МУТАЦИЯМИ

РЕЦЕПТОРА ЭФР

03.00.25 - клеточная биология

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, академик H.H. Никольский

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ.

1. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................8

2.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор...8

2.2. Связывание с лигандами и активация ЕгЬВ.................11

2.3. Передача сигнала с ЭФР-Р...........................................14

2.4. МАР-киназный каскад....................................................17

2.4.1. Активация МАР-киназного каскада рецептором ЭФР..............................................................................17

2.4.2. Регуляция МАРК каскада...........................................18

2.4.3. Мишени МАР-киназы..................................................20

2.4.4. Субклеточное распределение участников ЕГЧК каскада.........................................................................22

2.5. Участие цитоскелета в проведении сигнала................23

2.6. Взаимодействие сигнальных путей..............................27

2.7. Транспорт в ядро сигнальных молекул.......................29

2.7.1. Классический путь.......................................................29

2.7.2. Альтернативные пути транспорта..............................32

2.7.3. Регуляция транспорта в ядро....................................34

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................37

3.1. Культивирование клеток...............................................37

3.2. Обработка клеток нокодазолом, цитохалазином Д,

колхицином, таксолом и циклогексимидом...............38

3.3. Антитела.........................................................................38

3.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток............39

3.5. Конъюгация пероксидазы с антителами......................40

3.6. Получение антител........................................................40

3.7. Иммунопреципитация....................................................41

3.8. Субклеточное фракционирование...............................41

3.9. Аффинная хроматография............................................44

4. РЕЗУЛЬТАТЫ..............................................................................46

4.1. МАР-киназа активируется различными агонистами....46

4.2. Исследование роли тирозинкиназы и С-терминального домена рецептора в активации и ядерном транспорте МАР-киназы................................47

4.3. Влияние нокодазола и цитохалазина на активацию и транспорт МАР-киназы в ядро................54

4.4. МАР-киназа ассоциирована с эндоплазматическим ретикулумом...............................61

4.5. Транспорт МАР-киназы в ядро не

опосредуется кариоферином а.....................................68

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................71

6. ВЫВОДЫ.....................................................................................83

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................84

1. ВВЕДЕНИЕ

Действие эпидермального фактора роста (ЭФР) на клетки реализуется через специфический рецептор - крупный трансмембранный белок, обладающий тирозинкиназной (ТК) активностью и несколькими сайтами автофосфорилирования, находящимися на С-конце рецептора. Связывание ЭФР с рецептором приводит к стимуляции ТК и инициирует два ряда событий: активацию сигнальных путей и интернализацию ЭФР-рецепторных комплексов. Среди сигнальных путей, стимулируемых ЭФР, особое место занимает МАР-киназный каскад, которому в последнее время отводится едва ли не самая главная роль в опосредовании клеточного ответа на внешний стимул. Этот каскад включает ряд серин-треониновых протеинкиназ и состоит из двух способов активации МАР-киназы (МАРК) разных субклассов. В настоящее время выделяют три субкласса МАР-киназ: ERK, JNK(SAPK) и р38МАРК (Marshall, 1994). Активация так называемого ERK-пути происходит посредством активации малой ГТФазы Ras. Сигнал с активированного Ras передается на каскад серин-треониновых протеинкиназ, первой из которых явялется c-Raf киназа. Сигнал с c-Raf передается на киназу МАРК (МАРКК или МЕК), которая в свою очередь активирует фосфорилированием МАР-киназу. Активная форма МАР-киназы транслоцируется затем в ядро, где фосфорилирует белки Elk-1 и Elf-1, входящие в тернарный комплекс транскрипционных факторов, а также транскрипционный фактор Sapla. В настоящее время описано семь различных изоформ ERK, две из которых являются основными - р42 и р44 МАР-киназа (или ERK1, 2). Другие два субкласса МАРК активируются клеточным стрессом по

механизму "стресс - Rho - МАРКК4.6 - р38МАРК; SAPK ". Активные формы этих киназ также регулируют работу генов раннего ответа через Elk-1 (Landeret al., 1996).

Известно, что связывание лиганда с рецептором ЭФР приводит к димеризации рецепторов и активации тирозинкиназы, которая фосфорилирует пять тирозинов, расположенных на карбоксильном конце рецептора (Никольский и др., 1987). Эти фосфорилированные тирозины являются сайтами для ассоциации с сигнальными белками. Различные изменения (точечные мутации и делеции в регуляторных и функциональных зонах рецептора) приводят к нарушению работы этой цепочки. Проводимые исследования на клетках линии К721, экспрессирующих рецептор ЭФР с неактивной ТК, продемонстрировали отсутствие активации таких важнейших клеточных регуляторов, как белки STAT1, р62, Gap, однако, вопрос о статусе фосфорилирования МАРК остается открытым. О роли С-конца рецептора в процессе активации сигнальных каскадов можно судить по данным, полученным на клеточных линиях, экспрессирующих рецепторы, лишенные 123, 165, 196 и 214 С-концевых аминокислот. Эти результаты свидетельствуют о том, что отсутствие или замена всех сайтов автофосфорилирования не снимают лиганд-зависимое активирование МАР-киназ, которые, возможно, используют некоторые клеточные белки, фосфорилированные по тирозину, как суррогат (Li et al., 1994).

Несмотря на определенные успехи в идентификации белков, участвующих в активации ERK, существует мало сведений о ядерной транслокации этой протеинкиназы. Было показано, что транспорт ее в ядро при стимуляции клеток эмбриональной сывороткой достигает максимума через 3 ч, в то

время как стимуляция клеток ростовыми факторами или непосредственными активаторами МАРК приводит к быстрому ее накоплению в ядре уже к 15-ой минуте (Sano et al., 1995). Была продемонстрирована способность ERK активироваться и перемещаться в ядро под действием TGF в пролиферативной части цикла и не активироваться в ответ на тот же митоген в процессе дифференцировки фибробластов (Sauma et al., 1995). Безусловно, небольшое количество данных о ядерной транслокации МАР-киназы объясняется тем, что в настоящий момент совершенно неизвестен механизм ядерного импорта этого фермента. Поскольку у ERK не обнаружена ни одна из известных последовательностей ядерного импорта (NLS), существует несколько предположений относительно способов транспорта МАР-киназы в ядро. Так как известно, что только фосфорилированная форма МАРК способна к ядерной транслокации, был предложен механизм ассоциации МАРК и МАРКК, как необходимое условие для импорта в ядро. Однако этот механизм не может быть универсальным, поскольку он не объясняет, например, процесс транспорта микроинъецированной активной МАРК (Fukuda et al., 1997). Но какими бы ни были разногласия относительно механизмов транслокации ERK в ядро, все исследователи единодушны в одном - для этого процесса необходимо наличие фосфорилированнной ERK.

Регуляция транспорта в ядро белковых молекул может происходить на нескольких уровнях, в том числе и на уровне заякоривания комплекса на ядерной поре и его транслокации в ядро. Следует отметить, что именно этот способ регуляции может зависеть от целостности клеточного цитоскелета, поскольку белки ядерного порового комплекса тесно связаны как

с ядерными ламинами (промежуточные филаменты), так и с цитоплазматическим актином и, возможно, с тубулином.

В настоящее время существует мало данных о роли как актинового, так и тубулинового цитоскелета в регуляции активации и транспорта в ядро различных сигнальных молекул. Недавно было продемонстрировано, что ядерный транспорт протеинкиназы С, не имеющей последовательности ядерной локализации, требует наличия интактного цитоскелета (Schmalz et al., 1996). Также показана роль микротрубочек в транспорте капсидов вируса герпеса от плазматической мембраны в ядро (Sodeiketal., 1997).

Следует отметить, что ни в одной из работ, касающихся активации МАР-киназы в клетках, экспрессирующих мутантный рецептор ЭФР, не исследовался ее транспорт в ядро, то есть на вопрос требуется ли для транспорта в ядро МАР-киназы активация всех (или некоторых) сигнальных путей, стимулируемых ЭФР, ответа пока не получено. Таким образом, очевидно, что процессы ЭФР-стимулированной активации и ядерного транспорта МАР-киназы в клетках, несущих рецептор ЭФР с различными мутациями рецептора либо противоречивы, либо слабо изучены, а механизм ее ядерной транслокации остается неизвестным.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и его рецептор.

Сигнальная сеть, которую образуют рецепторы ЭФР-семейства, регулирует пролиферацию и дифференцировку множества типов тканей. Нарушения регуляции этой сети являются причиной возникновения и прогрессии многих онкозаболеваний (Hynes, Stern, 1994). Исследования, проведенные на клетках с трансформированными рецепторами ЭФР-семейства позволили сделать выводы о том, каким образом эта сигнальная сеть регулируется, и как регуляция и взаимодействие различных белков нарушены при малигнизации.

Существует по крайней мере 8 различных гормонов, принадлежащих к семейству ЭФР: сам ЭФР, TGFa, HB-EGF, амфирегулин, эпирегулин, бетацелулин, неорегулины, глиальный фактор роста и другие (Riese, Stern, 1998). Большинство белков этого семейства синтезируются как трансмембранные предшественники, которые могут образовывать растворимую форму гормона после протеолиза или функционировать в мембране. Растворимые гормоны могут состоять всего из 50 аимнокислотных остатков и имеют общий домен. Особенностью этого домена является наличие 6 цистеинов, образующих 3 дисульфидных мостика, формируя таким образом вторичную структуру молекулы гормона. Этот домен необходим и достаточен для связывания с ErbB семейством рецепторов (Chang et al., 1997).

В настоящее время описаны 4 типа рецепторов, относящиеся к семейству ErbB: ЭФР-Р (HER), ErbB2 (HER2); ЕгЬВЗ (HER3) и ErbB4 (HER4), структуру которых мы рассмотрим

на примере рецептора ЭФР. Это трансмембранный гликозилированный белок, состоящий из 1186 аминокислотных остатков (АО) и 10-12 олигосахаридных цепей, ковалентно связанных с белковым остовом. Некоторые авторы считают, что гликозилирование рецепторов ErbB семейства важно для обеспечения связывания с лигандом и тирозинкиназной активности (Soderquist, Carpenter, 1984). Экстраклеточный домен рецептора обогащен цистеинами, которые образуют два кластера. На основании функционального анализа лиганд-связывающего (экстраклеточного) домена в опытах с "химерными" рецепторами и электронно-микроскопического изучения очищенного рецептора было выдвинуто предположение о четырехдоменной организации внешнего участка молекулы рецептора ЭФР (Ullrich, Schlessinger, 1990). Согласно этой модели субдомены 2 и 4 содержат участки, богатые цистеинами, а последовательности, которые ответственны за связывание с лигандом, локализованы в субдоменах 1 и 3.

Трансмембранный домен рецептора выполняет пассивную функцию в проведении сигнала, что было подтверждено многочисленными заменами аминокислотных остатков в результате точечных мутаций (Kashles et al., 1988). Можно предположить, что трансмембранный участок обеспечивает лишь "заякоривание" рецептора в плазматической мембране (Heldin, 1995).

Трансмембранный домен рецептора отделяется от цитоплазматического так называемым подмембранным участком. Полагают, что подмембранный домен участвует в модуляции функций рецептора. Так, треонин 654, который локализован в этом районе, является сайтом

фосфорилирования протеинкиназой С (РКС), что в конечном счете приводит к ингибированию собственной киназной активности рецептора и потере им способности связывать ЭФР (Davis, 1988). Также были идентифицированы несколько других остатков серина и треонина, которые локализованы в подмембранном домене и являются дополнительными сайтами фосфорилирования РКС (Carpenter, 1992).

Отличительной особенностью цитоплазматического домена рецептора ЭФР является участок, обладающий ферментативной тирозинкиназной активностью. Этот участок имеет высокую гомологию с белками Src-семейства, которые также являются тирозиновыми протеинкиназами (Downward et al., 1984). Связывание ЭФР с рецептором приводит к активации ТК самого рецептора. Наиболее важную роль для стимуляции ТК активности рецептора ЭФР играет лизин 721. Было показано, что при замене лизина 721 на фенилаланин наблюдалось полное нарушение ТК активности рецептора как in vitro, так и in vivo (Honneger et al., 1987; Chen et al., 1987). На концевом участке цитоплазматического домена рецептора ЭФР расположены пять сайтов ЭФР-зависимого автофосфорилирования по тирозину: три основных (Y1068, Y1148 и Y1173) и два минорных (Y992 и Y1086). Этот участок имеет молекулярный вес около 20 кДа и легко отщепляется под действием протеаз (Margolis et al., 1989). По-видимому, в результате автофосфорилирования рецептор приобретает особую конформацию, при которой облегчается его взаимодействие с внутриклеточными субстратами.

Также было обнаружено, что в цитоплазматическом домене рецептора локализованы еще два функциональных участка. Один, состоящий из 164 АО (1022-1186), можно охарактеризовать как ингибиторный домен, поскольку его

делеция приводит к увеличению ЭФР-зависимого фосфорилирования внутриклеточных субстратов рецептора ЭФР. Этот домен взаимодействует с ТК рецептора, маскируя при этом последовательность с 973 по 1022 АО, составляющих второй домен -"домен интернализации". Автофосфорилирование трех тирозинов в ингибиторном домене приводит к конформационным изменениям, при которых освобождается ТК домен и домен интернализации. Кроме того, в домене интернализации была обнаружена последовательность из 18 АО (973 - 991), необходимая как для интернализации, так и для увеличения концентрации цитозольного кальция. Авторы назвали этот участок "Cain", подчеркивая его связь с регуляцией потоков кальция и интернализацией (Chen et al., 1989).

2.2. Связывание с лигандами и активация ErbB рецепторов.

Несколько механизмов вносят свой вклад в образование и взаимодействие сигнальной сети, образуемой ErbB семейством рецепторов. Например, бетацеллулин, HB-EGF и эпирегулин активируют как рецептор ЭФР, так и ЕгЬВ4; а неорегулины 1 и 2 типов связываются с ЕгЬВЗ и ЕгЬВ4. Каждый из этих рецепторов (за исключением ЕгЬВ2) способен связывать множество гормонов. С рецептором ЭФР связывается как сам ЭФР, так и TGF-a, HB-EGF, бетацеллулин и эпирегулин (Sliwkowski et al., 1994; Lemmon et al., 1997). Здесь необходимо отметить, что связывание лиганда с рецептором не всегда означает активацию последнего. Гормоны этой группы различаются по их способности связывать и активировать различные участки индивидуальных рецепторов.

Рецепторы, не способные к связыванию одиночного гормона, могут быть кросс-активированы, при условии присутствия компетентного рецептора для связывания. Например, ЭФР не способен связываться с ЕгЬВ2, но способен индуцировать автофосфорилирование как ЭФР-Р, так и ЕгЬВ2 посредством образования гетеродимеров (Stern, Kamps, 1988). Однако существует возможность и трансктивации рецепторов, например, через Src. Подобные гетеротипические взаимодействия характерны для всех рецепторов этой группы. Таким образом можно заключить, что присутствия одиночного рецептора, способного связываться с гормоном вполне достаточно для активации почти всех членов ErbB семейства. Такие отношения характерны, по-видимому, только для этого семейства, так как до сих пор в литературе нет данных о трансактивации между ErbB и PDGF-рецептором или рецептором инсулина (Graus-Porta et al., 1997).

Следует отметить, что в большинстве клеток экспрессируются почти все члены семейства ErbB, что подразумевает достаточно сложные конкурентные взаимоотношения, которые недостаточно хорошо изучены к настоящему времени и представляют несомненный интерес и перспективное поле для исследований.

Каждый рецептор этой группы имеет уникальную способность к активации сигнальных каскадов, что впервые было показано при исследовании передачи сигнала через ЭФР-Р и ЕгЬВ2, при котором активация этих рецепторов приводила к синергичному действию на трансформацию фибробластов (Alimandi et al., 1995; Cohen et al., 1996). Весьма показательными явились работы по исследованию клеточного ответа в Ba/F3 линии, для которой "естественным" эффектором является IL-3.

Данные, представленные на схеме 1 демонстрируют, что активация рецептора ЭФР ведет к IL-3-независимому "выживанию" клеток, а образование комплексов (ЭФР-Р)-НЕР2 или (ЭФР-Р)-НЕР4 приводило к IL-3-независимой пролиферации (Riese et al., 1996). Более того, ингибирование HER2 рецептора приводило к отсутствию эффе�