Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сигнальные механизмы, опосредующие действие эпидермального фактора роста в клетках ранних зародышей вьюна (Misgurnus fossilis)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сигнальные механизмы, опосредующие действие эпидермального фактора роста в клетках ранних зародышей вьюна (Misgurnus fossilis)"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. В. ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи

Ю Р Ж Е Н К О Вадим Сергеевич

СИГНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ, ОПОСРЕДУЮЩИЕ ДЕЙСТВИЕ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА В КЛЕТКАХ РАННИХ ЗАРОДЫШЕЙ ВЬЮНА (Misgurnus {(квШв)

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КИЕВ - 1992

Работа выполнена во Львовском отделении Института биохимии им. A.B. Палладина АН Украины в отделе биохимии клеточной дифференцировки

Научный руководитель: кандидат биологических наук ' ДРОБОТ Л.Б.

Официальные.оппоненты: доктор биологических наук,

член-корр. АН- Украины ; ГУШ Н.М..

доктор биологических шук,

профессор

ВЕЛИКИЙ Н.Н. '

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии и генетики АН Украины /г. Киев/

Защита состоится марта 1992 г. в 10.00

на заседании-специализированного совета К 016.07.01 в Институте биохимии им. A.B. Палладина АН .Украины

/252601, ГСП,г. Киев -30, ул. Леонтовича/9/

* "

G диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан " февраля 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета КИРСЕНКО-О.В.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Изучение молекулярных механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки клеток в настоящее время прочно утвердилось как одно из основных направлений в современной экспериментальной биологии.

Успехи в решении названной проблемы во многом сдерживаются отсутствием унмг реальной модели, позволяющей воспроизводить те ■или иные ситуации, -имеющие место in vivo.

Удобной моделью для анализа закономерностей пролиферации клеток и координированных изменений активности генов в течение дифференцировки являются.развивающиеся эмбрионы позвоночных.

Осооый интерес представляет изучение влияния на указанные . процессы таких важных регуляторов как полипептидные факторы роста (ПФР), которые запасаясь еще в оогенезе [Thery et al., 1989], вовлекаются в контроль развития клеток в составе эмбриона уже на стадии первых делений.- Способность эмбриональных клеток к стадие- и тканеспвцифическому синтезу собственных ПФР [Slack et al., 1989, Akhurst et al., 1989] сближают их с клетками злокачественных новообразований, что еще более повышает значимость исследования молекулярных механизмов регуляции клеточных делений на начальных стадиях эмбрионального развития животных.

Контроль многоступенчатых процессов, обеспечивающих мито-генный ответ на воздействие ПФР, осуществляется за счет стимуляции ряда тесно сопряженных систем преобразования и передачи ре-гуляторного сигнала внутрь клетки.- В результате исследований . последних лет стало ясно, что метаболическую основу усиления и внутриклеточного преобразования сигнала составляют каскадные

- процессы фосфорилирования-дефосфорилироьания клеточных белков [Никольский и соавт., 1987, James et al., 1984].,

Для клеток ранних эмбрионов Позвоночных данный аспект проблемы к настоящему времени является практически неизученным как на уровне определения роли конкретного ПФР в раннем эмбриогенезе, так и характеристики сигнальных процессов, опосредующих эффекты ПФР на пролиферацию и дифференцировку. клеток-мишеней.

' ЦЕЛЬ Й ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы явилось изуче-

- ние роли каскадных процессов фосфорилированкя-дефосфорилкрования белков в сигнальных механизмах, опосредующих действие ЭФР в клетка« зародышей йюстистой рыбы вьюна (Misgrurnus fossil is), изолированных йа" стадий ранней гаструлы.

В связи с этим; в работе были поставлены следующие задачи: \ i.. Выявить способность клеток зародышей вьюна на стадии

- г -

ранней аструлы специфически связывать ЭФР и охарактеризовать кинетические параметры лиганд-рецепторного взаимодействия.

2. Установить функциональность рецепторов ЭФР.

3. Исследовать возможность вовлечения ЭФР в регуляцию про-лиферативной активности эмбриональных клеток.

4. Изучить влияние ЭФР на фосфоршшрование белков клеток зародышей вьюна.

5. Частично очистить, охарактеризовать свойства и механизмы регуляции ферментативной активности ЭФР-стимулируемой проте-инкиназы ри.осомного белка 36. /

' б. Исследовать возможный механизм сопряжения рецепторов ЭФР с активацией Бб киназы. Экспериментально проверить предположение о рецептор-зависимой транслокации из плазматической мембраны в цитозо.*ь зародышевых клеток фосфэтирозин-содержащего белка(-ов), принимающего участие в регуляции активности Б6 киназы.

. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЕ В представленной работе впервые на стад;!., ранней гаструлы удалось не только выявить, но и охарактеризовать рецепторы ЭФР. . До последнего времени клетками, экспрессирующими рецепторы ЭФР на ранних стадиях эмбрионального развития, считались трофобласты - клетки внеэмбриональной ткани 5-дневных блаетоцист мыши [ Ас1атс1оп еЬ а1., 19841. Установлено, что выявленные рецепторы являются- функциональными и способны преобразовывать сигнал о взаимодействии с лигандом в активацию кас...адных процессов фосфоршшрования-дефосфорилированил внутриклеточных белков. Принципиально важным является вывод о вовлечении ЭФР-подобных белков в регуляцию митотической активности эмбриональных .клеток уже на ранних, этапах развития, .характеризующихся первыми индукционными событиями.

Впервые частично очищена и охарактеризована-митоген-стимулируемая Б6 киназа из развивающихся эмбрионов позвоночных класса рыб. Показано сходство фермента с аналогичными белками представителей других классов позвоночных животных.

Впервые для исследования механизмов регуляции активности митоген-стимулируемой Б6 киназы была предложена и использована реконструированная система, включаюиш ' .отдельные' компоненты цепи переноса регуляторного сигнала. На'основанш- 'проведенных экспериментов сделан вывод о том,' что ЭФР стимулирует транслокацию из плазматической мембраны в цитозоль фосфотироэин-сбдер^шцего белка', вовлекаемого в регуляцию активности' Зб кйназь!. '

"\УЧН^-ПГЛКГИ'1КеКАЯ -¡ЗНАЧИМОСТЬ " РАБОТЫ.' ■ Пол/чённые данные

- Э -

дополняет и расширяют наши представления о закономерностях регуляции деления клеток на ранних этапе эмбрионального развития животных. Шряду с данными литературы их можно рассматривать как основу для более глубокого анализа аутокринной регуляции роста злокачественных новообразований, что открывает пути для рационального поиска онкотерапевтических. средств направленного ■ действия.

Предложенная реконструированная система и схема опыта могут быть использованы при проведении экспериментов in vitro по изучению молекулярных механизмов трансдукции регуляторных сигналов.

АГИТАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований долоэкены на VII Всесоюзном совещании по эмбриологии (г. Ленинград, 1985), на V Украинском биохимическом сьезде (г. Ивано-Франковск, 1S87), IV Всесоюзном съезде эндокринологов (г. Львов, 1987), Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффек-торные клетки" (г. Суздаль, 1988), Шхдународном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии (г. Таллия, 1988), Всесоюзном совеиднии по актуальным вопросам клеточной биологии (г. Ленинград, 1989), Международном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии (г. Львов, 1990), Советско-финском симпозиуме по биологии развития (г. Суздаль, 1991), конференциях и семинарах во Львовском отделении Института биохимии АН Украина

ПУБЛИКАЦИИ. Пэ материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. ' Диссертация состоит из введения. обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, списка использованных сокращений, выводов и списка цитируемой литературы. • ,

' Текст диссертации изложен на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирован . 1 таблицей и ¿Jf рисунками. Библиография включает 200 наименований.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМ® НА ЗАЩИТУ:

1. Клетки зародышей вьюна, изолированные ва стадии ранней гаструлы специфически связывают ЭФР. Рецепторы ЭФР клеток ранних гародышей вьюна являются функциональными и подвергаются ли-ганд-стимулируемому аутофосфоршмрованию. •

2. ЭФР-подобные вещества вовлекаются в регуляцию пролиферации клеток зародышей вьюна уже на стадии ранней гаструлы.

3.. Протеинкиназы и протеинфосфатазы плазматических мембран ' клеток зародышей выона вовлекаются в опосредование плейотропного

действия ЭФР в раннем эмбриогенезе.

4.. В .цитозоле клеток зародышей вьюна присутствует в активном состоянии ЭФР-стимулируемая протеинкиназа, специфичная к ри-Сосомному белку S6.

5. ЭФР. стимулирует транслокацию из плазматической мембраны в цитозоль фосфотирозин-содержащего белка(-ов), способного активировать частично очищенную S6 киназу клеток зародышей вьюна.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И ' МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. При выполнении настоящей работы в качестве объекта исследования нами использовались бластодермы,' а .также клетки зародышей . вьюна (Misgurnus fossil is), изолированные на стадии ранней гаструлы (10 -12 часов развития)' С Костомарова, 19751. Икру получали и оплодотворяли по методике Костомаровой и Нейфаха [Костомарова и соавт., 1964). Бластодермы зародышей вьюна получали по методу, предложенному Луциком и соавт. [Луцик и соавт., 1983].

Выделение фракции плазматических мембран клеток зародышей вьюна осуществляли по методу Луцика и соавт. СЛуцик и соавт., 1986).

40S субьединицы рибосом выделяли из печени крысы по методу Томаса и соавт. [Thomas et al., 1978).

Термостабильный ингибитор сАМР-аависмой протеинкг^ааы выделяли по методу Уолша и соавт. [Valsh et al., 19713.

N-гидроксисукцинимид получали по методу Андерсона и соавт. [Anderson et al 1964). Реакцию этерификации между N-гидроксисук-цинимидом и субериновой кислотой проводили по методике, предложенной Пильч и соавт. [Pilch et al., 19791. •

q

Для изучения влияния ЭФР на включение [ Шттимидина в ДНК клеток зародышей вьюна бластодермы инкубировали в солевом раст-. воре Стейнберга двойной концентрации (буфер А), содержащем ЭФР в концентрациях, указанных .в подписях к рисункам, и [3Ш-тимидин (0.5 мкКи/мл), в течение. 4 часов, при 19°С. Включение, [3Н]-тими-дина в ДНК.определяли с помощью-стандартной методики. Кислотоне-растворимый материал солюбилизировали в 0.3 н. ' МаОН. и измеряли радпоактивнооть в жидкостном . сцинтилляциоь-.ом счетчике "Mark. Ш" в сцинуилляторе,.- содержащем тритон Х-100. Результаты экспериментов выражали в имп/мин/мг белка.

■ < о t. '

Для определения специфического , связывания •, 1-ЭФР клетки . л;бьхчп Ю. 5-1' млн клеток/пробу) инкубировали с воз-

растающими концентрациями 1251-ЭФР в течение 2 часов при 19°С в 0.5 мл буфера А, содержащем 1%' BSA. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 500-кратного избытка немеченного ЭФР. По окончании времени инкубации клеточную суспензию разводил!! 2 мл холодного 10 мМ трис-фосфатного буфера, содержащего 100 мМ NaCl и центрифугировали' при 1500 g в. течение 2-х минут. После .двукратной промывки.этим же буфером, осадок меток просчитывали на гамма-счетчике. •

Аффинное мечение белков плазматических мембран клеток заро-1

дышей вьюна 1-ЭФР осуществляли с помощью бифункционального сшвающ .' агента - дисукцинимидилсуберата [Pilch et al., 197Sj.

Влияние ЭФР на фосфорилирование белков плазматических мембран клеток зародышей вьюна анализировали двумерным электрофорезом по методу О'Фаррела [O'Farrel, 19753.

Аутофосфорилирование рецепторов ЭФР изучали в препарате, частично-очищенном аффинной ■ хроматографией солкйилиэированных белков плазматических мембран клеток зародышей вьюна на WGA-ce-фароэе CVertblad et al., 1977].

Получение цитоз^л клеток- зародышей вьюна, -S6 киназную реакцию, а также частичную очистку Бб-*"<назы хроматографией на DEAE-целлюлозе проводили как описано з раооте Дробот и соавт. СДробот и соавт., 1988j.

Двумерный электрофорез рибосомных белков осуществляли по методу Кальшмидта и Виттмана' CKalschmidt et al., 19701.

Для изучения механизма передачи сигнала от рецептора ЭФР к ' S6 киназе использовали реконструированную систему, которая вклк>-чала отдельные компоненты цепи передачи сигнала. Аликвоту плазматических мембран клеток зародышей вьюна (1 мг белка) инкубировали в среде, содержащей 50 мМ трис-HCl рН. 7.0, 30 мМ NaCl, 10 мМ MgClg, 1 мМ Mn(CHgCOO)2, 100 мкМ ортованадат Na, 50 мкМ АТР, 50 нг/мл ЭФР при 20°С в течение 15 мин. По окончании времени инкубации пробирки переводили на ледяную баню и через 5 мин центрифугировали при 30 000g 30 мин. Шлученную надосадочную жидкость использовали для выявления веществ, способных модулировать активность частично-очищенной методом ионообменной хроматографии ЭФР-стимулируемой Бб-киназы цитозоля зародышей вьюна

Для определения природы агента, модулирующего активность ; Бб-киназы, мы проводили предобработку полученных супернатантов в следующих . условиях ;1) Аликвоту (100 мкг белка) инкубировали при 95°С 10 мин. Денатурированные белки осаждали центрифугированием.

- б -

а.в растворимой фракции тестировали модулирующую активность. 2) Алр. воту супернатанта инкубировали в присутствии трипсина (1 мкг) при 37°С в течение 60 мин. По окончании, к смеси добавляли 2 мкг ингибитора трипсина из сои и проводили в дальнейшем тестирование как описано выше. 3) Аликвоту супернатанта инкубировали при 4°С в течение 2-х часов в присутствии преиммунной сыворотки кролика (20 мкг белка) и поликлональной антисыворотки, специфичной к фосфотирозину. По окончании времени инкубации проводили тестирование как описано выше.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури CLowry et al., 1951]. Радиоактивность измеряли в жидкостном сцинтилляцкон-нбм счетчике "Mark III".

Все опыты проводили 3-5 раз. В работе приведены средние значения величин и стандартные ошибки (х - б).".

•• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУВДЕНЙЕ

В настоящее- время идет интенсивный поиск веществ, ответе зенных за регуляцию лролиферации и дифференцировки клеток .на ранних стадиях эмбрионального развития. Имеющиеся экспериментальные данные дают основание считать, что главными претендентами на роль этих регуляторов являются ПФР tBradshaw et al., 1980, James et al., 1984]; К сожалению, установление функциональной значимости не только, каждого новонайденного эмбрионального, но даже и такого хорошо охарактеризеланного ФР как ЗФР, в регуляции ук занных процессов идет не столь успешно.

Важным элементом в понимании значимости ЭФР в регуляции пролиферации эмбриональных клеток является определение момента вовлечения данного фактора роста в механизмы, регулирующие процессы развития зародыша.

Анализ компетентности эмбриональных клеток к. экзогенным факторам роста и, в частности, к ЭФР позволяет эффективно' решать данную проблему,- поскольку 'в эволюционном и онтогенетическом аспектах структура рецептора ЭФР является -более консервативной, чем структура самого фактора роста. Учитывая это обстоятельство, на первом этапе работы нами 'проведено изучение связывания ЭФР.. изолированными клетками зародышей вьюна. .... : ...*-.

1. Анализ кинетики связывания ЭФР изоли; ванными клетками зародышей вьюна

Показано, что при 19°С равновесие между свободным и связан- . ним с клетками ЭФР наступает .к 2 часам .инкубации, /Насыщение цент ^в. связывания ЭФР на поверхности клеток.зародышей вьюна

наблюдается при концентрации лиганда в инкубационной смеси около 12 нМ. Эти данные .преобразованные в координатах Скэтчарда свиде-

.-< Связанный 1-ЗФР, пИ

Рис. 1 Анализ кинетики специфического связывания 1251-ЭФР изолированными клетками зародышей вьюна: А - кривая специфического связывания; ^ - те же 'данные, преобразованные в координатах Скэтчарда.

тельствуют о существовании одного класса рецепторов с И- 0.72 ± 0.15 нМ и плотностью около 5.46 ± 1.05 х 103 рецепторов на клетку (рис. 1).

Столь невысокая усредненная плотность рецепторов на поверх-■ ности клеток зародышей вьюна, вполне возможно, обусловлена тем обстоятельством, что не все клетки зародыша на стадии ранней ' гаструлы в равной мере обладают способностью связывать ЭФР. Полученные к настоящему времени экспериментальные данные свидетельствуют, что на ранних этапах развития эмбриона мыши появление рецепторов ЭФР связано с началом дифференцировки клеток САс1алБ0П еЬ а1., 1984]. '

Сравнительно низкое сродство к лиганду рецепторов клеток зародышей вьюна можно объяснить их более высокой специфичностью в отношении эндогенных ЭФР-подобных полипептидов, как это было показано ранее [Мгз1апо . е1 а1., 1985].

Успех в установлении значимости ЭФР (или его эмбриональных гомологов) как регулятора пролиферации клеток на ранних этапах эмбрионального развития в значительной мере связан с решением вопроса, в какой мере системы.. принимающие участие в преобразо-'

ваши внешнего сигнала, подвергаются качественным изменениям в зависимости от изменений аффинности рецептора и структуры лиган-да

о

Индекс мечения клеток С Н]-тимидином можно отнести к основным внутриклеточным параметрам, подвергающимся изменениям при взаимодействии рост-регулирующего соединения с клеткой-мишенью.

о

II. Изучение влияния ЭФР на включение С Н]-тимидина в ДНК клеток зародышей вьюна

Наш установлено, что ЭФР дозозависимым способом Елияет на интенсивность включения С -тимидина в ДНК клеток бластодерм вьюна (рис. 2).

ЭФР в концентрации 50 нг/мл обеспечивает максимальный уровень стимуляции включения метки, который на 33 % превытает уровен' контроля. ЕС50 для ЭФР-стимулируемого прироста скорости синтеза ДНК равна около 3 нг/мл или 0.5 .нМ. ■ При увеличении концентрации ЭФР в инкубационной смеси до 250 нг/мл, включение ме-ченно! о тимидина снижается практически до уровня контроля, что может быть связано с негативной регуляцией 'рецепторов ЭФР в присутствии высоких концентраций лиганда. Аналогичный характер зависимости митогенного . ответа клеток тканей эмбрионов мыши от концентрации ЭФР в инкубационной среде был описан Адамсон и соавт. САс!ал1зоп еЬ а1., 1981].

Первым и одним из наиболее важных звеньев в цепи трансдук-ции .игнала являются компоненты плазматической мембраны клет-

Концентрация ЗФР, нг/мл

< ' - о

Рис. 2 Влияние"ЭФР,на включение гМ-тимидина в ДНК "клеток р -^одьгаей вьюна "''' ' ■ " ;

ки-мишени. Процессы фосфорилирования-дефосфорилирования белков плазматических мембран являются одни"и из ключевых событий, обеспечивающих усиление и многонаправленность процессов трансдукции сигнала. Для ЭФР к настоящему времени охарактеризован ряд белков и, в частности, рецептор ЭФР, фосфорилирование которых еидетельствует о 'прохождении сигнала внутрь клетки.

III. Влияние .ЭФР на процессы фосфорилирования-дефосфорилирования белков плазматических мембран клеток зародышей вьюна

Для анализа влияния . ЭФР на процессы фосфорилирования-де-фосфорилирования мембранных белков, нами была получена и очищена фракция плазматических мембран клеток зародышей вьюна, изолированных на стадии ранней гаструлы.

Для частичной очистки рецептора ЭФР мы использовали аффинную хроматографию солюбилизированных белков плазматических мембран клеток зародышей вьюна на МЗА-сефарозе. В полученном препарате экзогенный лиганд дозо-зависимым способом индуцировал фосфорилирование белк с мол. массой 180 № (рис. 3). Эти данные несколько превышают величину мол. массы рецептора ЭФР - 170 kD, охарактеризованного на поверхности кл. jok эпидермоидной карциномы человека А-431 [Chan et al., 1988], клеток линии N'RK [Chua et al.,' 1984], мышиных ЗТЗ клеток'[Das et al., 1978) и ряде других объектов.

Для того, чтобы установить соответствует•ли белок с мол.

• массой 180 kD белку, принимающему участие в специфическом связывании ЭФР, нами был синтезирован бифункциональный сшивающий

1 ?s

• агент - дисукцинимидилсуберат. - С его. помощью I-ЭФР был пришит к белкам плазматических мембран клеток зародышей вьюна.

При электрофорезе ковалентных комплексов белков плазмати-

1 ОС

ческих мембран зародышевых клеток со I-ЭФР, полученных с помощью дисукцинимидилсуберата. молекулярная масса белка, специфически связывающего лиганд, оказалась равной 180 kD (рис. 4).

Таким образом, данные по изучению влияния ЭФР' на фосфорилирование белков в VßA-элюате и результаты ковалентного мечения белков плазматических мембран клеток зародышей вьюна 1251-ЭФР, позволяют идентифицировать белок с мол. массой' 180 kD как рецептор ЭФ? клеток-ранних зародышей вьюна. ' ■ .

Влияние ЭФР на изменения1 в спектре фоефобелков плазматических мембран клеток зародышей5 вьюна изучали методом двумерного' электрофореза в ШАГ.

ilon. масса kD

220-

67 -60 —

"г- 4" f*1-^ ' '' i, i

í . . —plBO

Мол. масса кс

220-

67 — 60 —

• plBO

36-,

20-

36 —

20 — í

Концентрация Л-;-•

Э«Р о

РИС. 3

W- ' 'i и гГи'Д

i 10 50 100

нг/мл

Немеченный

ЭФР

- + Рис. 4

Рис. 3 Влияние ЭФР на фосфорилирование .белков в ША-злюате солюбшшзированных белков плазматических мембран клеток зародышей вьюна

Рис. 4 Ковалентная сшивка белков плазматических мембран

1 ОС

клеток зародышей вьюна с 1-ЭФР при помощи дисукцинимидилсубе-рата.

Показано, что экзогенный фактор роста смещает равновесие реакций фосфоршшровашш-дефосфорилирования мембранных белков. При этом стимулируется фосфорилирование белков с мол. массами 26 (а), 31 (Ь), 34 (с), 42 (с1), 4б (е), 64 (П и 86 (е) кр, а также подавляется фосфорилирование белка с мол. массой 43 к0 (Ь) (рис. 5).

Таким образом, на стадии ранней гаструлы В составе зародышей вьюна присутствуют клетки, способные специфически связывать 'ЭФР,. и, которые, очевидно, являются мишенями для митогенного действия этого 'ПФР. Связывание лиганда рецептором индуцирует ау-тофосфоршшрование молекулы рецептора, а также вызывает изменения в спектре мембранных фосфобелков, что в дальнейшем обеспечивает специфичность'формирования митогенного'ответа эмбриональных клеток. _ ■ "'

В литературе описан ряд процессов, происходящих в цитоплазме клеток при обработке.'митогеном. •Одним-иа тчких процессов яв-

иэ$

Hon. масса

kD

U1 1Л 'in in о '

m to in CO Г4

r^- LT Ю in LI

I 1 I I I

КОНТРОЛЬ

• < о

<04

; 20"»

Мол. масса kD

92-

±1

ЭФР

67Г-;

4530

* V:

&

>h*d

<45

i3*

• v Я

Рис. 5 Влияние ЭФР на фосфорилирование белков ' плазматических мембран клеток зародышей вьюна.

ляется активация протеинкиназы, специфичной в отношении рибосо- • много белка S6. ЭФР-сткмулируемая 26-киназа ранее была охарактеризована в мышиных Swiss ЗТЗ фибробластах [Novak-Hofer et al/, 1985] и клетках феохромоцитомы линии РС-12 fMatsuda et al., 1987], для которых ЭФР является митогеном.

IV. Влияние ЭФР на SS-киназную активность •цитозоля клеток зародышей вьюна

После обработки бластодерм зародышей вьюна ЭФР нами был получен цитозоль, в котором определялась Бб-киназная активность.

Для определения кинетических закономерностей влияния ЭФР на S6 киназную активность мы использоали цитозоль, полученный после обработки бластодерм ЗФР, в концентрации 25-30 мкг/мл.

Как-следует из данных, представленных на рис. 6, с увеличе-

л b V

о s

о к ■ ъ а n¡

к ч к о й в к к

« с

•щ

о и Í

SOr

Концентрация ЭФР,

60 ЮС нг/мл РИС. 7

Время инкубации о ЭФР, мин рис. 6 Зависимость Бб-киназной активности цитозоля-зародышей вьюна от концентрации ЭФР в инкубационной смеси.

Рис. 7 Зависимость Бб-киназной активности цитозоля зародишь,i вьюна от времени инкубации бластодерм с ЭФР.

нием концентрации ЭФР в инкубационной смеси от 1 до 20 нг/мл Бб-киназная активность цитозоля возрастает на 25-45% по сравнению с базальным уровнем ферментативной активности. " При дальнейшем увеличении концентрации ЭФР до .100 нг/мл величина Бб-киназ-ной активности практически не изменяется.

Зависимость Бб-киназной активности от времени инкубации •бластодерм с ЭФР при концентрации последнего в инкубационной смеси 10 нг/мл представлена на рис. 7. Видно, что стимулирующий эффект достигает максимума между 20 и 30 минутами инкубации с ЭФР. При более продолжительной инкубации с фактором роста веиь Бб-киназной активности цитозоля бластодерм' вьюна ниже базаль'ного уровня.

Данные электрофоретического анализа белков 40S субьединиц рибосом в условиях, позволяющих обнаруживать формы белка S6 различной степени модификации, позволяют сделать вывод,

уро-снижается

что 56-ш-

нааа как из контрольных, так и обработанных ЭФР бластодерм катализирует включение 4-5 остатков фосфгг л в белок S6. При этом, эффект стимулирующего агента находит отражение не в изменении специфичности модификации субстрата по различным центрам, а лишь в количественном выражении ферментативной активности.

Многочисленные данные литературы свидетельствуют, что орто-ванадат Na - ингибитор фосфотирозин-специфических фосфопротеин-фосфатаз способен имитировать эффекты некоторых ПФР на процессы, происходящие в клетке-мишени, и, в частности, на 36-кинааную активность цитозоля CNovak-Hofer et al., 1985]. В связи с этим, мы проанализировали влияние ортованадата На на активность Бб-киназы цитозоля зародышей вьюна и сравнили его с эффектом ЭФР.

После г-бработки бластодерм зародышей вьюна ортг-анадатом Na в концентрации 50 мкМ в течение 30 мин прирост Бб-кикааной активности составил 20% по сравнению с уровнем контроля. Пр- одновременной обработке бластодерм в тех же условиях ортованадатом Na и ЭФР (20 нг/мл) Sö-киназная активность цитозоля возрастала на 59При увеличении концентрации ортованадата Na в реакционной смеси до 500 мкМ прирост Sö-киназной активности составляет 75% и практически не изменяется при обработке бластодерм в этих же условиях ортованадатом Na и ЭФР (рис. 8).

КОНТРОЛЬ

гоо

CZ3- .

¡77)-ЭФР

(50 вг/мл)

5S2—Na3V04 (50 323 -Na3V04 + ЭФР

(ХЗ-КаЛг04 (500 мкМ) EZ3— Na^VC^ т эфр'

Рис. 8 Влияние ортованадата Na и ЭФР на Зб-киназную активность цитозоля клеток зародышей вьюна. ..

Таким образом, полученные наш данные свидетельствуют, что кинетические параметры активации 56-киназы цитозоля клеток зародышей вьюна в присутствии ЭФР пратическианалогичны rat вым для ЭФР-стимулируемой Бб-киназы из бесклеточных экстрактов мышиных Swiss ЗТЗ клеток. Более того, включение в инкубационную смесь

ингибитора фосфотирозин-специфических фос^протеинфосфатаз - ор-тованадата Na, приводит к потенциированию аффекта ЭФР на активность фермента. Аналогичные данные с использованием ортованада-та Na, полученные для Swiss ЗТЗ фибробластов CNovak-Hofer et al., 1985], стали одним из экспериментальных доказательств предположения, что активация митоген-стимулируемой Бб-киназы происходит в результате каскада протеинкиназных реакций и одну из ключевых ролей в этом каскаде играют Туг-специфические протеин-киназы.

С целью определения молекулярной массы ЭФР-стимулируемой Бб-кинааы нами было проведено 2-х этапное хроматографическое разделение бе-„ .ов цитозоля клеток зародышей вьюна На первом этапе S6 киназа была очищена методом ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе (рис. 9). Фракции элюзта, содержащие активный фермент концентрировали и подвергали гель-проникаюшэй хроматографии- на сефадексе G-150 (рис. 10). -

г 0.000

Рис. 9

10 15 SO 25 30 35 4046 БО 65 Номер фракции

0.000

Анализ Бб-мназ-во фрак-при

разделении белков цитозоля зародышей вьюна методом ионообменной хроматографии на БЕДЕ-целлюлозе

о.воо о ной активности

n циях, полученных <

о AM а

••0.200

. Как следует из наших данных, в результате фракционирования на ОЁАЕ-целлюдозе выявляются 3 фракции, обладавшие способностью фосфорилировать 36 белок. Эти фракции элюируюгся последоват тьно 10 мкМ сАМР в стартовом буфере (фракция 1), '0.12-0.18 ' М- МаС1 (фракция 2) и 0.25-0.30 М ИаМ (фракция 3). Можно предположить, что 56-киназная активность фракции 1 принадлежит каталитической субьединице сАМР-зависимой протеинкиназы. Необходимо также отметить, что феномен множественности форм Бб-киназы при фракционировании методом ионообменной хроматографии является достаточно

распространенным С Hecht et al. , 1988, Erikson et al., 19863, хотя- природа этого феномена, как и фуш .иональная значимость различных форм фермента практически не известны.

После обработки бластодерм зародышей вьюна ЭФР в концентрации bd нг/мл в течение 30 минут Зб-киназная активность во фракции 1 уменьшается в 2 раза, во фракции 2 увеличивается в 4 раза и ¡фактически не изменяется во фракции 3 (рис. 10).

Е< U

0

в: Si я

ь «

«

я п й'

§7

X, 1

1 ;

ю!

и;

S

о п

gisl

к er

я

Й 8

ш о

и

О

ФРАКЦИИ 1

С~3 - КОНТРОЛЬ

ет -эфр

л!

Рис. 10 Влияние ЭФР на Бб-киназную активность во фраед «.полученных в результате разделения б'елков цк озоля методом ионообменной хроматографии

Таким образом, на основании этих данных можно сделать вывод о том, что ЗФР-"тимулируемая 36-киназа цитозоля зародышей вьюна элюируется в наших условиях фракционирования 0.12-0,18 М ЫаС1.

А Е< Ü

0

1

И 3000 т

в

1000

5-4

I

1000..

160 1

07

I

45 25 И) I I

<Я5

Г"

10 15 НОМЕР''

го 25 аз «ракц'ки

35 40

O.i60

0.100

W <

о

0.050 1

о.ооо

Рис. 11 Определение мол. массы' ЭФР-стиму-лируемой Бб-киназы цитозоля клеток зародышей . йьюна методом гель-хроматографии . на сбфадексе ' 6-150. .

На рисунке:;11 видно; что кажущаяся мол!, масса фермент,а составляет около-, 70 ,kD., -Дшшш' Величина'дбейточко1 хорошо соответствует мол. массе; митогек^стимулирУемых' зб-кинаа/ описании/ в мышиных Swiss ЗГЗ клетках (70 kD) tBallou et'al-.; 1988] и раавиваю-иаихся эмбриона* курицы (65"kD):' t'Brenis:%:t'!al., iSiBrJ-

В ряде экспериментальных работ, иапг ^зленных на изучение механизмов стимуляции SS-киназной активности митогенами, были высказаны предположения, что как сама SS-киназа, так и структуры, преобразующие взаимодействие ыитогена со специфическим рецептором в изменение SS-киназной активности, обладая некоторыми уникг .ьными особенностями, являются универсальными для различных объектов. В преобладающем большинстве случаев механизмом, по которому активируется митоген-стимулируемая Бб-киназа, является каскад реакций фосфоршшрования-дефосфоршшрования внутриклеточных белков tBallou et al., 1988]. Не смотря на выявление ферментов, способных изменять активность SG-киназы в условиях in vitro CBallou et al., 1987, Sturgill et al., 1983], идентифицировать их с элементом, передающим сигнал от плазматической мембраны к Бб-киназе, пока не представляется возможным.

Одним из основных механизмов, поддерживающих функциональную связь между компонентами плазматических мембран и цитозоля является транслокация белков [Kikkawa et al.. 1986, Morrison et al., 1088].

С учетом данных литературы относительна методических подходов, используемых при изучении механизмов транслокации белков [Mallon et al., 1986], нами была разработана реконструированная система для выявления соединений плазматических мембран клеток зародышей вьюна, способных модулировать активность S6 киназы при переходе последних иа мембраносвязанного в растворимое состояние. С этой целью очинённые плазматические мембраны инкубировали с ЭФР и АТР, а затем центрифугировали при 30 ООО g. Полученный супернатакт использовали в дальнег эм для обнаружения компонентов сигнальной цепи, опосредующих действие на активацию S6 кинавы.

Преимущгством экспериментальной модели в условиях in vitro является то обстоятельство, .что некоторые звенья цепи и, в частности. Tyr-специфическая протеинкинава рецептора ЭФР. опосредующие передачу сигнала от рецептора к Бб-киназе, оказываются доступными для экзогенных реагентов. Таким образом, удается проследить функциональную связь между стартовым звеном (или другими фрагментами в цепи трансдукции сигнала), инициирующим каскад реакций фосфорилирования-дефосфорилирования в присутствии ЭФР, с дистальными внутриклеточными эффекторньми системами, одной иа которых является Зб-киназа.

Принимая во внимание высокий уровень лабильности S6 киназы и

связанную с этим потерю ферментативной активности в процессе 2-х этапной очистки фермента, в данной сери экспериментов мы тестировали S6 киназу, частично-очищенную хроматографией на DEAE-целлюлозе.

V. Исследование химической природы и некоторых свойств модуляторов активности Бб-киназЫ) освобождающихся из плазматических мембран клеток зародышей вьюна при инкубации с ЭФР

Полученные нами данные (рис. 12) свидетельствуют, что в результате прединкубации мембран с АТР в супернатаите плазматических мембран появляется(-ются) компонент(-ы) оказывающий-ие) стимулирующий эффект на ЭФР-стимулируемую S6 киназу. Эта способность супернатанта утрачивается в результате обработки трипсином или прогревания при 95°С, что может свидетельствовать о белковой природе модулятора

Рис. 12 Тестирование модулирующей активности в супернатаите плазматических мембран клеток зародышей вьюна в : отношении частично-очищенной ЭФР-стимулируемой Бб-киназы. 1- Бб-киназная активность фракции II; 2- Бб-киназная активность фракции II в присутствии трипсина и ингибитора трипсина; .3-.Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна; 4- Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматически' мембран клеток зародышей вьюна, прединкубированного с трипсином .фи 37иС в 'течение 60 мин; 5- Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, прединкубированного при 95 С в тр -ение 10 минут.

Из данных, полученных ' в следующей серии опытов следует, что кверцетин - вещество флавоноидной природы, обладающее инги-бирующш свойством при взаимодействии с каталитическим центром Туг-специфической протеинкиназы рецептора ЭФР, в концентрации 100 мкМ практически полностью подавляет в МЗА-элюате фосфорили-роват..- белка с мол. массой 180 kD (рис.14). В этой же концентрации кверцетин не влияет на активность частично-очищенной

Мол, масса » ■ ,„ --

д

0 01 я 1000-

0 к

В ш

0 ю 600 <

у VD

у <л а BOO'

а

к

5 гН 1 403'

¡0 Я

ч я

X д а BOO

к 1 ■п 2

g 0

и

kD

220-

6760-

1

3-р180

36-

- i •!' I

1 ' 2 ' 3

РИС. 13

Рис. 14

Рис. 13 Модуляция компонентами супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна активности ЭФР-стимулир емой Бб-киназы после прединкубации мембран с ЭФР и АТР. 1- Бб-киназ-ная активность фракции И; 2- Бб-киназная активность во фракции II в присутствии кверцетина в концентрации 100 мкМ; 3-Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, прединкубирован-ных без АТР; 4- Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, прединкубированных в присутствии 50 мкМ АТР; 5- Бб-киназ-ная активность фракции 11 в прис. тствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, преА .нкубированных в присутствии 50 мкМ АТР и кверцетина в концентрации 100 мкМ; 6-Бб-киназная . активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, прединкубированных без АТР, в присутствии 50 нг/мл ЭФР; 7- Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, прединкубированных в присутствии 50 мкМ АТР и ЭФР (50 нг/мл); 8- Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран к'"ток зародышей вьюна, прединкубированных в присутствии 50 мкМ АТг, 50 нг/мл ЭФР и 100 мкм кверцетина.

Рис. 14 Влияние кверцетина в концентрации 100 мкМ на ауто-рилирование частично-очищенного на \йЗА-сефарозе рецептора ФР клеток зародышей вьюна. 1- эндогенное фосфорилирование в УВА-элюате; 2- фосфорилирование в УВА-элюате в присутствии ЭФР (50 нг/мл); 3- фосфорилирование вЛйЗА-элюате в присутствии ЭФР (50 нг/мл) и кверцетина (100 мкМ).

ЭФР-стимулируемой Бб-киназы цитозоля клеток зародышей вьюна После прединкубации плазматических мембран с кверцетином модулирующая активность супернатанта практически не изменяется в контроле, в то время как ЭФР-зависимое стимулирование Бб-киназной активности снижается в 1. 5 раза.

Эти данные дают нам основание для следующего предположения: между аутофосфоршшрованием рецептора ЭФР и транслокацией в растворимую фазу компонента(-ов) плазматической мембраны, способного(-ых) стимулировать активность Бб-киназы,• существует прямая связь.

В литературе есть сведения, что продукт протоонкогена raf-1, локализованный в плазматической мембране, при обработке метки-мише"и митогенами, в том числе и ЭФР, в резу.г,.тате рецептор-опосредованного фосфорилирования ' по остаткам тирозина С Morrison et al. , 19881 переходит из мембраносвязанного в растворимое состояние. Процесс перехода сопровождается индукцией Ser-, Thr-специфической протеинкиназной активности белка, которая, очевидно, направлена на белки цитозоля.

Принимая во внимание эту информацию, мы задались вопросом является ли предполагаемый модулятор Бб-киназы одним из звеньев, на уровне которого осуществляется регуляция фосфорилирования внутриклеточных белков по остаткам серина и треонина субстратами тирозин-спе: :фических протеинкиназ. Для анализа активности фосфотирозин-содержащих белков наиболее распространенным явлется подход с использованием антител, специфичных к. остаткам фосфоти-розина.

Как следует из данных, представленных на рис. 15 ни преим-мунная сыворотка, г i анги Р-Туг-антисыворотка не влияют,на ба-зальный уровень активности частично-очшценной Бб-киназы цитозоля зародышей вьюна (рис. 15: пробы 1-3).

В результате прединкубации супернатанта плазматических мембран в контроле и после обработки ЭФР с преиммунной сывороткой прирост активности ЭФР-стимулируемой Бб-киназы .составляет 45.6 и -75.3Z соответственно (рис. 15: • пробы 4, 6V После аналогичной обработки¡супернатанта анти P-Tyr-антиеывороткой активность Бб-киназы. не; только не возратает, а наоборот снижается на 60% в контроле и на 47.5% после обработки плазматически" мембран-ЭФР (рис.. 15: пробы 5, 7). Эти данные позволяют сделать предположение: транслоцируемый из плазматической мембраны ' компонент опосредует один из механизмов актива ш Бб-киназы при воздейт

ствии митогена на зародышевые клетки. В ставе транслоцирован-ного компонента присутствуете-ют) . остаток(-и) фофосфотирозина. При взаимодействии анти-Р-Туг-специфического антитела с этим остатком транслоцированный компонент сохраняет способность связываться с Бб-киназой, но при этом не повышает, а даже наоборот-нет ;ько ингибирует ее активность.

500-г

А

8 ; и Й

§ § 400 --

~ .л

В м

г Й аоо--

Й I 200

Я а

100-■

.12-3 4 с 67

Рис. 15 Анализ влияния супернатантов плазматических мембран клеток зародышей вьюна после прединкубации с поли1 ональной антисывороткой, специфичной к фосфотирозину, иа активность .стич-но-очищенной ЭФР-стимулируемой Б6-киназы цитозоля клеток зародышей вьюна. 1- Бб-киназная-активность фракции II; 2-Бб-киназная активность фракции II в присутствии преиммунной сыворотки; 3-Бб-киназная активность фракции II в присутствии анти-Р-Туг-ан-тисыворотки; 4- Б6-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, пре-динкубированного в присутствии 50 мкМ АТР и преиммунной сыворотки; 5- Б6-кийазная активность фракции II в присутствии суперна. танта плазматических мембран клет^. зародышей *ыона, прединкуби-рованного в присутствии 50 мкМ АТР и анти-Р- г-антисыворотки; 6- Бб-киназная активность фракции II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, прединкубирован-ного в присутствии 50 мкМ АТР, 50 нг/мл ЭФР и'преиммунной сыворотки; 7- Бб-киназная активность фракциг II в присутствии супернатанта плазматических мембран клеток зародышей вьюна, ■ прединку-бированного в присутствии 50 мкМ АТР, 50 нг/мл ЭФР и ан-ти-Р-Туг-антисыворотки.

Таким образом, на основании представленных данных, можно сделать следующий основной вывод: в составе зародышей вьюна на стадии ранней гаструлы присутствуют клетки, в которых экспресси-рованы не только рецепторы ЭФР, но и структуры, участвующие в преобразовании регуляторного сигнала внутрь клетки. Эти обстоятельства создают объективные предпосылки для вовлечения ЭФР или

его эмбриональных гомологов в регуляцию пролиферации клеток на ранних стадиях эмбрионального развития.

Обобщая наши данные, можно предложить следующую схему молекулярных механизмов регуляторного действия ЭФР на компетентные клетки ранних зародышей вьюна (рис. 16). На начальном этапе специфическое связывание ЭФР с рецептором индуцирует конформацион-ные изменения последнего, что сопровождается стимуляцией ауто-фосфорилирования и усилением ферментативной активности каталитического домена молекулы рецептора по отношению к внутриклеточным белкам. В качестве первичных мишеней выступают белки плазматических мембран. В результате данной ковалентной модификации из-

репептор ЭФР

р\

/

плазматическая мембрана

Туг-ПК

трансляция

Гри^

\_у\ Туг-ПК I

грапслокация

5ег,ХЬг-Пк

мРНК

+ иРНП

1

" __) / 55-киназа

ДНК ЯДРО

Рис. 16 Схема молекулярных механизмов действия ЭФР на клетки ранних зародышей вьюна.

меняются структоряо-функциональные свойства белков. Некоторые из них, обладающие амфипатическими свойствами, могут изменять свою топологию в клетке, т. е. - переходить из мембраносвязанного в растворимое состояние .и,-уже в цитоаоле, инициировать дистальные по отношению к рецептору ЭФР процессы." Одной из функций трансло-цированного(-ых) белка(-ов) является' прямая или опосредованная активация киназы рибосомного белка Б6. Этот фермент в различных модельных системах охарактеризован как звено, активируемое в

системе преобразования сигнала уже на ; тих этапах стимуляции митогенами клеток к пролиферации CBallou et al., 1S88, Erikson et al. , 1989 и др.]. Наши данные позволяют предположить, что механизм транслоции белока(-ов) плазматических мембран клеток зародышей вьюна связан с фосфорилированием последнего по остаткам' тиро. лна Вероятно, данная модификация катализируется либо кина-аой самого рецептора ЭФР, либо мембранной Туг-специфической про-теинкиназой, активируемой по рецептор-зависимому механизму.

Функциональная значимость активации митогенами Бб-киказы к настоящему времени окончательно не установлена. Есть свидетельства, что данный процесс имеет непосредственное отношение к регуляции избирательной трансляции клеточных мРНК С Hecht et al., 1988, Palen et al., 19871. Более того, детальный анализ субстратной специфичности Бб-киназы, показал, что кроме белка S6 этот фермент фосфорилирует в условиях in vitro гликоген-синта-8У,тдоозин-гидрок"'лазу, тропонин I, _ ламин С [Erikson et al., • 19881 и некоторые факторы инициации трансляции CMarley et al., 19901. На этом основании можно предположить, что. активация S6 киназы сопряжена не только с повышением степени фосфорилирования белка S6, ■ но и обеспечением метаболической активности других звеньев в системе плейотропных эффектов митогенов на клет-.и-мишени.

. В заключение, следует отметить, что при изучении молекулярных механизмов действия экзогенного ЭФР в эмбриогенезе весьма трудно дискриминировать ответ клеток, компетентных к данному фактору роста, от модулирующего влияния межклеточных контактов, эндогенных рост-регулирующих со> .мнений, включая соединения, синтез которых был инициирован ЭФР. Тем не менее полученные нами данные о молекулярных механизмах действия ЭФР наряду с данными литературы могут быть положены в основу картирования отдельных участков сигнальных путей, что открывав! возможности идентификации ключевых метаболических звеньев, опосредующих прохождение сигнала от плазматической мембраны к ядру.

ВЫВОДИ •

1. Обнаружено специфическое связывание 1251-ЭФР клетками зародышей вьюна, изолированными на стадии ранней гаструлы. Зависимость величины сязывания от концентрации меченного лиганда в координатах Скэтчарда имеет линейный характер, что соответствует одному

классу связывающих мест с Kd-O. 72 - 0.15 нМ и плотности 5. 4б±1.05

о

х 10 рецентров на клетку. Показано, чт выявленные рецепторы ЭФР являются функциональными и подвергаются лиганд-стимулируемому аутофосфорилированию. Молекулярная масса рецепторов ЭФР, установленная с помощью 2-х независимых подходов составляет около 180 kD.

2. Изучена дозовая зависимость влияния ЭФР на митотическую активность эмбриональных клеток. ЕС50 для ЭФР-стимулируемого усиления включения [3Ю-тимидина в ДНК клеток равна 0.5 нЦ Сделан вывод о вовлечении ЭФР-подобных веществ в регуляцию пролиферации клеток зародышей вьюна уже на стадии ранней гаструлы.

3. Идентифицированы белки плазматических мембран зародышевых клеток, уровень фосфорилирования которых изменяется под влиянием ЭФР. Это позволяет считать протеинкиназы и протеинфосфатазы, а также их специфические белки-субстраты медиаторами плейотропного действия ЭФР в раннем эмбриогенезе.

4. В цитозоле клеток зародышей вьюна выявлена ЭФР-стимулируемая протеинкиназа,специфичная к рибосомному белку S6. Изучены временные и дозовые зависимости активации S6 киназы. Показано, что фермент включает до 4-5 остатков фосфата в экзогенный белок S6. ■ Молекулярная масса частично-очищенной митоген-стимулируемой S6 киназы составляет около 70 kD.

5. Разработана и предложена реконструированная система, включающая отдельные компгченты переноса регуляторного сигнала, для изучения механизмов ЭФР-индуцируемой активации 'S6 киназы. Впервые показано, что ЭФР стимулирует транслокацию из плазматической мембраны в цитозоль йосфотирозйн-содержащего белка(-ов), способного активировать частично-очищенную S6 киназу клеток зародышей вьюна. ~

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Луцик М. Д., Дробот Л. Б., Крженко R С., Кусень С.Й. Влияние инсулина на фосфорилирование белков и липидов плазматических мембран клеток зародышей вьюна // VII Все ^юзное совещ. эмбриологов "Закономерности индивидуального развития живых организмов": Тез., докл. (г. . „Ленинград, 1986). -М. , Наука, 1986 - с. 75.

,2. ДЬобот.Л. Б., Юрженко В. .С., Коваль JL R , Ну нь С. Й. Са2+-, фосфолипид-зависимое , фосфорилирование белков плазмати-'иеских мембран клеток зародышей вьюна // V Украинский биохим.

т 24 -

сьезд: Тез. докл. (г. Ивано-Франковск, .987). - Киев, Наукова думка, 1987 - ч. 2. - с. 322.

3. Drobot L. В., Yurzhenko V. S. , Kusen S. J. Insulin and phorbol-12-mirystate-13-acetate activate phosphorylation of loach t .bryonal cells protein with molecular mass of 350 kD // Abstr. of 4th Internftional Congress of cell biology, Montreal (1988).- p. 75.

4. Drobot L. B., Stoika R. S., Yurzhenko V. S. , Fedyshin Ya. Ya. , Kusen S. J. Polypeptide growth factors extracted from loach embryo stimulate the phosphorylation of plasma membrane proteins of loach embryo cells on the tyrosine residues // Abstr. of 4th. Internftional Congress'of cell biology, Montreal' (1988). - p. 108.

5. Дробот JL Б. , Юрженко В. С., Котельник Е- Р., Кусень С. Я. Идентификация и свойства рецепторов инсулина клеток ранних зародышей вьюна // Всесоюзная конф. "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки" Тез. докл. (г. Суздаль, 1988).-Суздаль, Суздаль, 1989.- с. 59.

6. Дробот Л. Б. , Юрженко Е С. , Кусень С. И. Фосфорилирование белков плазматических мембран клёток зародь::пей вьюна. Назальное фосфорилирование // Виол, мембраны - 1989.- т. 6,- с. 275-282.

7. Дробот Л. Б., Юрженко В. • С., Кусень С. Я Эпидермильный фактор роста стимулирует протеинкиназную активность специфичную к рибосомальному белку S6 в бластодермах зародышей вьюна // Мол биология - 1989. - т.23,- с. 872-878

8. Drobot L. В., Yurzhenko V. S., Kusen S. J. Stimulation of S6 kinase, activated by EGF is mediated by the phosphorylation of loach embrional cells proteins on the tyror^ne residues // Abstr. 19-th ' Meeting of Federation of European Biochemical Societies, Rone (1989).-TU - IÜ6.

9. Дробот JL Б., Юрженко В. С., Кусе-ь С. Й. Митоген-стимулируемая S6 киназа ранних зародышей вьюна: . свойства и регуляция ферментативной активности // Всесоюзн. Совещ, "Актуальные вопросы клеточной биологии" Тез. докл. (г. Ленинград, 1989). Цитология т. XXXI, N 9.- с. 1101-1102

10. Drobot L. В., Yurzhenko V. S. Mi togen-st i mu 1 at ed S6-kinase from loach embryos: properties and mechanism of the activity control // Abstr. Soviet-Finish ., Symposium on Developmental Biology "Signal molecules and cell differentiation",' Siizdal (1991).- онтогенез - 1991 - т. _ 22,- N 4.- С. 410-411. . ■■;■■