Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция глюконеогенеза в раннем развитии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция глюконеогенеза в раннем развитии"

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДША ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРДОВОП) КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСШГСТВЕННШ ЛМВЕРСИТЕГ

На правах рукописи

УДК 577Л24:591.3+577.151.05.

ЕИОЛАЕВА Людмила Петровна РЕГИЩИЯ ГЛШШЕОГЕНЕЗА В РАННЕМ РАЗВИТИИ 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ, диссертащш на соискание^ хщной степени доктора биолощ1й

Л,

к

/

? ту =*

*

■о:

Ленинград -

/0 /О /6

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова АН СССР (директор Института - член-корреспондент АН СССР Н.Г.ХРУЩОВ)

Официальные оппоненты:

член-корреспондент All СССР, профессор И.С.1ШАЕВ доктор биологических наук Ф.Е.1ШШ1ИНА доктор биологических наук М.В.САВИНА

Ведущее учреждение - НИИ экспериментальной медицины АМН СССР

Защита диссертации состоится "_"_1990 г.

__ час на заседании специализированного совета

Д-.063.57.19 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Ленинградском государственном университете (199034, Ленинград, Университетская наб., д. 7/9, аудитория_.),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. ' . А.М.Горького Ленинградского государственного университета. .

Автореферат разослан " "_' _ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Н.Д.Йцонко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выяснение природы и механизмов действия факторов, контролирующих протекание того или иного метаболического процесса и сопрягаодих его с другими процессами, является одной из актуальных проблем биохимии. Основной акцепт исследовании по регуляции метаболических процессов в последние годы смещен в направлении изучения контроля их интегрирования в функциональную систему обмена. Этот акцент проявляется и в исследовании процесса глю-конеогенеза, который рассматривается как составная часть системы обмена, включающей также гликолиз, липогенез, ЦГК.

Заметный успех достигнут в исследованиях регуляции глюконео-генеза и сопряжения его с гликолизом и липогенезом в нечего! взрослых животных при экспериментально вызываемом изменении соотношения между процессами путем изменения режима питания или гормональном воздействием (Krebs, 1973; Wieland et al-, 1973; Romsos, Levellee, 1974; Kohl, Cottam, 1976; Rio et al., 1978; Hers, Van Schaftingen, 1982; NoGuchi et al., 1982).

Однако, несомненно, больший интерес представляет контроль интегрирования метаболической системы, включающей глюконеогенез, при становлении ее в ходо онтогенеза, т.е. когда отсутствует влияние экспериментатора, а изменение соотношения мевду процессами про-1 исходит в ходе реализации генетической информации. Однако, этот аспект проблемы регуляции глюконеогенеза исследован крайне-недостаточно . Немногочисленные сведения по этому вопросу получены в основном при исследовании контроля сопряжении глюконеогенеза с другими процессами при их становлении в печени крысы, т.е. объекта, в котором глюконеогенез появляется относительно.поздно - после рождения животного (Ballard, 1971; Knowles, Ballard, 1974; Back, Angel, 1983). Причем вопросы взаимодействия глюконеогенеза с ЦТК в этих исследованиях практически не затронуты. Данные по контролю сопряжения глюконеогенеза с другими процессами на более ранних стадиях развития еще более ограничены. К началу нашей работы среди такого рода сведений заслуживали внимания результаты Мильмана и Юровицко-го (1973) по энзиматическому контролю координирования глюконеогенеза с гликогенолизом в оогенезв и раннем эмбриогенезе вьюна, а

Используемые сокращения: ЦДГ - пируватдегидрогеназа, ПК -пируватгашаза, ПКК - яируваткарбоксилаза, ФЕГ1 - фосфоенолпируват, ФЕП-КК - фосфоенолпируват-карбоксккиназа

также данные Гудриджа (Ооо<1п.<аее, 1968) по контролю сопряжения глюконеогенеза с липогенезом некоторыми сателлитными ферментами глюконеогенеза в печени эмбриона курицы.

Таким образом, в последних работах не рассматривали регуляцию глюконеогенеза как части метаболической системы, включающей также и гликолиз, и липогенез, и ЦГК, т.е. с точки зрения сопряжения глюконеогенеза со всеми этими процессами. Именно этот аспект проблемы регуляции глюконеогенеза на ранних стадиях развития привлек наше внимание.

Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в исследовании регуляции глюконеогенеза и сопряжения его с другими процессами в зависимости от степени дифференцировки и внутриклеточной локализации первого ключевого фермента глюконеогенеза фосфоенолпируват--карбоксикиназы на ранних стадиях онтогенеза.

В качестве моделей исследования были использованы созревание ооцитов и ранний эмбриогенез вьюна, а также печень развивающегося эмбриона курицы. Такой выбор объектов: ооциты, ранние зародыши вьюна и печень эмбриона курицы, - позволял исследовать регуляцию глюконеогенеза и сопряжения его с другими процессами в недифференцированной клетке и на ранних стадиях дифференцировки, а также в специализированном глшогенном органе на стадии эмбриогенеза. Одновременно эти объекты предоставляли возможность исследовать зависимость регуляции глюконеогенеза на ранних стадиях развития от внутриклеточной локализации ФЕП-КК, так как в ооцитах и яйцах вьюна этот фермент находится в основном в цигозоле, а в печени эмбриона курицы - в митохондриях.

Конкретными задачами работы были следущие:

1) исследовать роль соотношения адениловых нуклеотидов: (АТФ):(АДФ), (АТФ):(АДФ+АМФ) и степени фосфорялирования адениловой системы (величины фосфатного потенциала) в координировании глюконеогенеза и гликолиза;

2) выяснить значение окислительно-восстановительного состояния НАД в цитоплазме и митохондриях, а также соотношения между ци-топлазматическим отношением (НАД+):(НАДН) и фосфатным потенциалом в сопряжении глконеогенеза и гликолиза; •

3) раскрыть механизмы, посредством которых пируваткиназа контролирует изменение соотношения между гликолизом и глюконеоге-незом;

4) исследовать полифункциональность глюкозо-6-фюсфатазы и оценить ее значение в регуляции глюконеогенеза;

5) выяснять роль сателлитных ферментов глюконеогенеза: лируватдегидрогеназы, цитрат-синтазы и других в контроле сопряжения глюконеогенеза с липогенезом и ЦТК;

6) определить динамику содержания некоторых метаболитов, являющихся субстратами или модуляторами активности ключевых или са-теллитных ферментов глюконеогенеза: оксалоадетата, ацетил-КоА, КоА и др.

Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна работы заключается в сопоставлении и выявлении особенностей регуляции глюконеогенеза и сопряжения его с гликолизом (гли-когенолизом), липогенезом и ЦТК на ранних стадиях онтогенеза объектов, различающихся степенью диффере1Щировки й внутриклеточной локализацией ФЕП-КК: ооцитов, зародышей вьюна и печени курицы в эмбриональном и раннем постэмбриональноы развитии.

Впервые показано значение окислительно-восстановительного состояния НАД, величины фосфатного потенциала и соотношения аде-ниловых нуклеотидов в координировании глюконеогенеза и гликолиза в ооцитах, яйцах вьюна и в печени развивающегося эмбриона курицы.

На основании сопоставления данных по величинам фосфатного потенциала и соотношения (НАД+) :(НАДН) в цитоплазме, полученных Hai.ui для ооцитов и яиц вьюна, а также для печени развивающегося эмбриона курицы, и другими авторами - для печени крысы, морской свинки, голубя нами впервые сформулировано положение о том, что I) в объектах с цитозольной локализацией ФЕП-КК изменения соотношения глюконеогенез/гликолиз сопровождаются изменениями величины фосфатного потенциала и цитоплазматического отношения (НА.ПГ,):(НАда), хотя направленность изменений этих показателей в разных объектах этой группы животных может быть неодинаковой; 2) в объектах, в которых ФЕП-КК локализована в основном в митохондриях, отсутствует корреляция между фосфатным потенциалом и отношением (НАД+) :(ШДН) в цитоплазме. г

Впервые установлено, что пируваткиназа в печени развивающейся курицы, представленная М^-изозимом, участвует в координировании глюконеогенеза и гликолиза посредством механизма, основанного на взаимопревращении двух форм фермента, различающихся кинетически, по сродству к субстрату фосфоенолпирувату.

Впервые выявлена карбачил-фосфат- и пирофосфат-глгакозо фосфотрансферазнал активность глюкозо-6-фосфатазы и оценено значение этой, активности, а также степени латентности карбамил--фосфат-, пирофосфат-глюкозо фосфотрансфераз и глюкозо-6-фосфат

^юсфогидролазы в контроле скорости глюконеогенеза в печени разви-вакщегося эмбриона курицы. - *

Для выяснения значения сателлитных ферментов глюконеогенеза в регуляции сопряжения процесса с липогенезом и ЦТК впервые определена динамика активности ЦЦГ, цитрат-синтазы и других ферментов в ооцитах: и зародышах вьюна, а также в печени курицы в эмбриональном и постэмбриональном развитии. Впервые показано, что регуляция глюконеогенеза сателлитными ферментами в ооцитах и зародышах вьюна отличается рядом особенностей от регуляции процесса в печени. Впервые установлено, что ЦЦГ в раннем эмбриогенезе вьюна ив печени курицы в раннем постэмбриональном развитии контролирует изменения соотношения между глюконеогенезом vi сопряжонными с ним процессами посредством изменения активности дефо сформированной формы фермента.

Впервые обнаружено, что в раннем эмбриогенезе вьюна и в печени развивающегося эмбриона курицы скорость цитрат-синтазной реакции (максимальная и внутриклеточная) не является показателем скорости ЦТК. На примере печени развивающегося эмбриона курицы установлено, что им может служить активность о^-кетоглутаратде-гидрогеназы.

Таким образом, полученные нами результаты существенно расширяют теоретические представления о механизмах регуляции глюконеогенеза и интеграции его с другими процессами на разных стадиях онтогенеза позвоночных.

Основные теоретические положения и выводы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по регуляции метаболизма. Они легли в основу спецкурса "Молекулярные механизмы интеграции метаболизма", который читается для студентов 5-го курса Львовского Государственного Университета по специальности биохимия.

Результаты и методы проведенного исследования используются в работе ряда лабораторий Института биологии развития им. Н.К. Кольцова АН СССР, Института биохимии им, A.B.Палладина АН УССР, Института биологии АН Латвийской ССР, Проблемной научно-исследовательской лаборатории фотосинтеза Тбилисского Государственного' Университета, на кафедре биохимии Львовского Государственного Университета. Разработанные нами методические приемы включены в методическое пособие "Методы биологии развития" (Наука, Москва, 1974).

Обнаружение нами лабильности системы активации пируватде-

гидрогеназы в печени курицы в эмбриональном и постэмбриональном развитии и возможность стабилизации ее сывороткой важно с точки зрения разработки методических приемов для выделения пируватде-гидрогеназного комплекса из печени курицы. Установление наш наличия в печени эмбрионов курицы и однодневного цыпленка КоА практически полностью в дисульфэднои форме имеет значение для определенля содержания КоА и ацетил-КоА циклическим Методом в ■ печени кур и, возможно, других птиц.

Полученные нами результаты по механизмам сопряжения глюко-неогенеза с другими процессами в онтогенезе курицы полезны для птицеводческих хозяйств при решении вопросов регуляции углеводно-жирового обмена у птиц.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 111. 1У, У Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974; Ленинград, 1979; Киев, 1986), УП Симпозиуме "Механизмы контроля раннего эмбрионального развития" (Москва, 1974), Симпозиуме "Митохондрии, транспорт электронов и преобразование энергии" (Москва, 1976), Ш Всесоюзной конференции "Экологическая физиология рыб" (Киев,

1976), Всесоюзном Симпозиуме "Регуляторные системы обмена веществ в раннем эмбриогенезе" (Киев, 1979), У1 Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981), У1 Всесоюзном Симпозиуме биохимических обществ СССР и 1ДР "Регуляция метаболизма и биоэнергетика" (Таллинн, 1981), Всесоюзном Симпозиуме "Метаболическая регуляция физиологического состояния" (Пущино, 1984), Симпозиуме по адаптации в перинатальном периоде развития (Лейпциг, 1ДР, 1984), У1 Всесоюзной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб" (Паланга, 1985), П Симпозиуме по печени (Иена, ГДР, 1986), Конференции "Энергетический обмен рыб" (Суздаль, IS86), I Симпозиуме "Экологическая биохимия рыб" (Ярославль,'1987).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 работ в отечественных и зарубежных изданиях, среди них монография "Регуляция глюконеогенеза в онтогенезе" (Наука, Москва, 1987) и раз-цели в книгах: "Современные проблемы оогенеза" (Наука, Москва,

1977) И "Oocyte growth and maturation" (Consult. Bureau, N.Y., b.,1988).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, эбзора литературы, описания материалов и методов исследования, лзлояен ш полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 280 страницах машинописного текста, включая 21 таблицу и 13 рисунков. Список

литературы содержит 555 работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРЛАЛЫ И МЕГОДЦ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были, ооциты, закончившие период большого роста, иеоплодотворенные яйца и зародыши на разных ста-у днях раннего эмбриогенеза костистой рыбы вьюна Kisgurnus fossiiis Ь., а также печень курицы породы Старбро и Леггорн в эмбриональном и постэмбрионалыюм развитии.

Определение активности ферментов. Активность пируваткиназы (КФ 2.7.1.40) определяли по окислению НАДН. Частично очищенную ПК выделяли из печени I-дыевного цыпленка путем фракционирования экстракта сульфитом аммония. Использовали фракцию, осаждаемую при 80% насыщения,. Низкомолекулярные соединения удаляли обработкой сефадексом G-25. Активность пируватдогидрогеназы (КФ 1.2.4.1) печени эмбрионов курицы и цыплят определяли по скорости декарбо-ксилирования 1-^4С-пирувата (Cromer, Teal, 1974), активность ПДГ ооцитов и яиц (зародышей) вьюна - по методу Кур (Coore et ai., 1971). Активность пируваткарбоксилазы (КФ 6.4.I.I) определяли по скорости включения КН СОд в оксалоацетат. Определение активности глюкозо-6-фосфат фрсфогидролазы, пирофосфлт- и карбамид-фосфат -глюкозо фюсфотрансферазы проводили по методу Цордли (Hordlie, Shoke, I9B7). Для определения'степени латентности ферментов изолированные микросомы обрабатывали 0,2% дезоксихолатом. Активность глицерол-3-фо сфатдегидрогеназы, <А -кетоглутаратдегидрогеназы, 3-оксибутиратдегидрогеназы определяли по восстановлению Р1АД+, активность глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, дитрзт-лиазы -по окислению НАДН, активность малик фермента - по прибыли пиру-вата, активность цитрат-синтазы - по методу Шеферда я Гарланда (Shepherd, Garland, 1969). f

Определение содержания метаболитов. Содержание пирувата, лактата, малата, оС-кетоглутарата, глутамата, аммиака, глюкозы, глнкозо-6-фосфата, АТФ, АДФ, АМФ, 3-фосфоглицерата, глицерол-3-фосфата, диоксиацетонфосфата, ацетоацетата, ацетил-КоА, КоА, 3-оксибутирата, НАД+ определяли в нейтрализованных хлорнокислих экстрактах ткани (клеток). Экстракцию НАДН.проводили в щелочной среде. Содержание указанных метаболитов определяли по энзиматичес-кпм методам, осиованнш.! на восстановлении НАД+'(НАДФ+) или окислении НАДН и описанным В руководствах: "Methoden der enzymati-schen Analyse (Ed. U.U.Bergmeyer, 1970) И "Методы биологии развития" (Мильман и др., 1974). Содержание ацетил-КэА и КоА в пече-

ни эмбрионов и однодневных ццплят определяли в циклической системе по методу Оллреда и Гея Uiired, Guy, 1969). Гликоген, определяли по методу Шомоди (Somogyi, 1957), фосфор - по Фиске-Субба-роу и Беренблюму-Чейну (Lindberg, Erns-Uor, 1956), белок - по Лоури.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСЗДШНИЕ

Роль соотношения между окисленной и восстановленной формами НАД в цитоплазме и митохондриях и фосфорилированного состояния адениловок системы в "переключении" глюконеоге-неза на гликогенолиз при созревании ооцитов вьюна

Отношение (НАД+):(НАДН) в цитоплазме ооцитов и яиц вьюна нами было рассчитано по соотношению метаболитов реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой (КФ IЛ.1.27), согласно формуле (НАД+) _ (гшруват) I

(НАДН) _ (лактат) Кщ, где КдцГ - константа равновесия лактатдегидрогеназной реакции.

Использование для этой цели реакции, катализируемой глице-рол-3-фосфатдегидрогеназой (КФ I.I.I.8), оказалось невозможным в связи с отсутствием в ооцитах и яйцах вьюна этого фермента (Ермолаева, Мильман, 1974).

Отношение (НАД+):(НАДН) в митохондриях ооцитов и яиц вьюна было определено только по реакции, катализируемой глутаматдегид-рогеназой (КФ 1.4.1.2), так как в ооцитах и яйцах вьюна не обнаружена активность 3-оксибутиратдегидрогеназы (КФ I.I.I.30) (Ермолаева, 1976). Исходя из глутаматдегидрогеназной реакции, отношение (НАД4}(НАДН) в митохондриях ооцитов и яиц рассчитывали по формуле

(НАД"1") = ( оt -кетоглутарат) • (И1ф I

(НАДН) (глутамат) Кщр

где Кгдг - константа равновесия этой реакции.

Мы обнаружили, что при резком снижении скорости глюконео-генеза и "переключении" его на гликогенолиз при созревании ооцитов (превращении их в зрелые яйца) (Мильман, Юровицкий, 1973) цитоплазматическое отноше1ше (НАД+):(НАДН) уменьшается, тогда как митоховдриальноэ - увеличивается (табл. I).

Характер-изменения митохондриального отношения(ЦАД+):(НАДН) при созревании ооцитов сходен с наблюдаемым в печени крысы при снижении скорости глюконеогенеза (Veech et al., 1969,1970; КгеЪз, 1973).

Таблица I

Цитоплазматическое и митохондриальное (НАД+) :(НАДН) и (АТФ)/(АДФ) •(ПР042-) в ооцитах и яйцах вьюна

Показатель Ооцит Яйцо

(после окончания

у периода большого

роста)

Цитоплазматическое (НАД ) :(1ЩН), рассчитанное из отношения ■ (пируват)

(лактат)

Митохондриальное (НАД+) :(НАДИ), . рассчитанное из отношения, ( Ы,-кетоглутарат) • (NH . ) (глутамат)

(АТФ) /(АДФ) • (11Р042") изморенное

(АТФ) /(АДФ)•(НР042-) / рассчитанное

Содержание НР042~ принимали за 60% от общего содержания неорганического, фосфата (Veech et al., 1970).

Изменение же цитоплазматического отношения (НАД+):(ПАДИ) при созревании ооцитов противоположно отмечаемому в печени крысу при ослаблении глюконеогенеза (Veech et al., 1969,1970; Krebs, 1973). При созревании ооцитов вьюна оно направлено в сторону повышения доли ПАДИ, а в печени крысы - в сторону ее снижения.

Таким образом, согласно нашим данным, глютоиеогенез в ooröi-тах протекает в условиях меньшей степени восстаноиленности НАД в цитоплазме по сравнению с яйцами, в которых скорость глюконеогенеза резко снижена. Тем самым, наши результаты дают основание сомневаться в справедливости существующего в литературе представления, согласно которому интенсификации глюконеогенеза в объектах, у которых ФЕП-КК локализована в основном в цитозоле, соответствует повышение степени восстановлешюсти НАД в этом компартменте, для всех объектов с такой локализацией ФЕП-КК. Указанное представление основано на результатах, полученных в печени крысы (Veech et al., 1969,1970; Krebs, 1973; Pariila et al., 1975; Великий, 1986). Действительно, теоретически для обращения гликолитической оксидоредукции при глюконеогенезе необходимо повышение доли НАДН в цитоплазме. Отсутствие такой закономерности в цитоплазме ооцитов вьюна может быть связано с более высокой, чем в печени крысы,- скоростью утилизации НАДН в процес-

1870 940

62 395

1403 484

864 424

се глюконеогенеза или меньшей скоростью поступления редуцирующих эквивалентов из митохондрий.

Любопытно, что более низкая доля НАДН в ооцитах по сравнению с яйцами обнаружена и при определении общего содержания НАД+ и НАДН (табл. 2).

: Таблица 2 Содержание некоторых метаболитов в ооцитах и яйцах вьюна, нмоль/г сырого веса

Метаболит Ооцит (после окончания периода большого роста) Яйцо

Пируват 17+1,4 21+1,4

Лактат 364+2,4 896+40

АТФ 1040+48 1470+36

АДФ 143+4,7 286+10

АМФ 100+3,4 430+12

(АТФ):(АДФ) 7,3 5,1

(АТФ):(АДФ+АМФ) 4,3 2,1

3-4)0 сфоглицер ат 43+1,0 44+1,0

Глицеральдегвд-З-фосфат 1,5 1,5

Диоксиацетонфосфат 14+1 14+1

Рх 8640+556 17700+1440

щ4+ 19700+900 22400+1800

Глутамат 1070+110 1010+100

-кетоглутарат 13+1,0 69+7,0

3-оксибутират , нет нет

Ацетоацетат нет нет

НАД+ общ. 78+4,6 136+7,0

НАДН общ. 26+1,5 134+7,3

(НАД+) общ.: (НАДН) общ. :3,0 , 1,0

■Изменение цитоплазматического отношения (НАД+):(НАДН) при созревании ооцитов вьюна, так же как в печени крысы, коррелирует с изменением степени фосфорилирования аденнловой системы (величины фосфатного потенциала), т.е. отношения (АТФ)/(АДФ)'(НРО^2""). Двукратному уменыиейию цитоплазматического отношения (НАД4): (НАДН) соответствует примерно сходное снижение величины фосфатного потенциала (табл. I)к

Измеренные (путем непосредственного определения АТФ, АДФ и

Pi) и рассчитанные на основании концентрации лактата, нирувата, глицеральдегид-З-фюсфата, З-фосфоглицерата и объединенной константы равновесия глицеральдегид-3-досфатдегидрогеназной, фосфю-глицераткиназной и лактатдегидрогеназной реакций, равной 53«I04 (Veech et al., 1970), по формуле

(АТФ) _ (пируват) х (глицеральдегид-З-фоспрат) к

(АДФ) • (НР04 ) ~ (лактат) (З-фосфоглицерат) '

' где К -объединенная константа равновесия трех названных реакций, величины фосфатного потенциала в ооцитах и яйцах вьюна близки (табл. I). Это свидетельствует о том, что в ооцитах и яйцах вьюна компоненты вышеназванных реакций, так же пак и в печени крысы (Veech et ai., 1970; Stubbs et al.,~ 1972), находятся в равновесии.

Однако, в отличие от печени крысы более высокой скорости глюконеогенеза в ооцитах по сравнению с яйцами соответствует более ^ысокая величина фосфатного потенциала. Последняя коррелирует так-кё и с более высокими в ооцитах, чем в яйцах, величинами отношений (АТФ) : (АДФ) и (АТФ) :(АДФч-АМФ) (табл. 2) . '

Таким образом, наши результаты подтверждают Еысказанный Кребсом с соавт. (Veech et al ., 1970; Krebs, 1973) постулат о прямой корреляции между изменениями фосфатного потенциала и цито-плазматического отношения (НАД+) :(ШДН). Вместе с тем, они дают основание утверждать, что характер изменения величины фосфатного потенциала, как и отношения (НАД+):(НДЦН) в цитоплазме, при изменении соотношения глюконеогецез/гликолиз в некоторых объектах группы животных, у которых большая часть ФЗЩ-КК находится в цито-золе, может отличаться от наблвдаемого в печени крысы - " классического объекта с ш!алогичной локализацией этого фермента.

■ Сателлитная система глюконеогенеза при созревании ооци-тов и в раннем эмбриогенезе вьюна

В ооцитах, неошюдотворенных яйцах и зародышах разных стадий раннего эмбриогенеза вьюна обнаружено, что активность цитрат-лиазы и малик фермента отсутствует а наименьшей активностью среди других ферментов этой групгш обладает ПДГ. Причем, активность ее изменяется при созревании ооцитов и в ходе последующего эмбрионального . развития (табл. 3).

На основании ряда тестов нами доказано наличие в ооцитах и яйцах (зародышах) вьюна только активной формы фермента (ПДГа) (Ермолаева, Мильман, 1976). Отсутствие интерконверсии ДДГ в ооцитах и яйцах (зародышах) вьюна позволяет полагать, что изменение

Таблица 3

Активность сателлитных ферментов глюконеогенеза в ооцитах и яйцах (зародышах) вьюна,

Е/104 штук

Фермент Ооцит после окончания периода большого роста НеоплодотЕо-ренное яйцо Стадии эмбрионального развития при 21°

2 ч дробление 6-7 ч бластула 13-15 ч 18-20 ч

гаструляция

Пируваткарбокси- ■ лаза* 1,9+0,18 1,8+0,20 • 1,8+0,20 1,8+0,20 1,8+0,20 1,8+0,20

Пирутзатдегидро-геназа 0,06+0,004 0,08+0,005 0,08+0,005 0,08+0,007 0,04+0,002 0,04+0,002

Цитрат-синтаза 4,7+0,5 4,4+0,5 4,4+0,5 4,5+0,5 4,5+0,5 4,5+0,5

Цитрат-лиаза. Малик фермент Отсутствует — Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Малатдегидрогеназа цитоплазматическая 270+13 250+16 250+16 240+15 250+15 265+13

общая 500+12 . 460+12 460+12 460+18 465+14 470+11

*Пируваткарбоксилазу можно рассматривать как сателлитнкй и как ключевой фермент глюконеогенеза

активности ДЦГ при созревании ооцитов и на стадии таструляции/ по-ведимому, отражает изменение,количества фермента.

Повышение активности ГЩГа при созревании ооидтов и начале эмбрионального развития коррелирует с резким снижением скорости глюконеогенеза. Такая же зависимость между активностью этого фермента и скоростью процесса отмечена в печени птиц (см. ниже) и млекопитающих (wie land, et al., 1973; Bailey et al ., 1976) в эмбриональном и постнатальном развитии. Снижение активности фермента на стадии гаструляции указывает на уменьшение скорости генерирования ацетил-КоА из пирувата, т.е. за счет углеводов. По-видимому, источником ацетил-КоА на этой стадии развития является окисление жирных кислот.

Активность другого фермента, участвующего в обмене пирувата, пируваткарбоксидазы. ■ не изменяется при созревании ооцитов и в ходе раннего эмбрионального развития вьюна (табл. 3), несмотря на изменение скорости глюконеогенеза. В то же время в глюкоген-ном органе - печени рыб (French et al., 198I), млекопитающих (Ballard, Hanson, 1967; Soling, Kleineke, 1976) И птиц (Feli-cioli et al., 1967; Soling, Kleineke, 1976) показано, что характер изменещщ активности ПКК и скорости глюконеогенеза совпадает.

При исследовании же регуляторных свойств фермента ооцитов и зародышей вьюна мы обнаружили сходство их со свойствами фермента печешь Так, ПКК ооцитов и зародышей вьюна аналогично ферменту млекопитающих и птиц (Barritt et al., 1976; Walter, 1976) ин-гибируется только теми концентрациями. АДФ, которые превышают концентрацию АТФ (Ермолаева, Мильман, 1974). ПКК ооцитов и зародышей вьюна/ так же как ф)ермент печени млекопитающих и птиц (Dugal, Göpel, 1975; Barritt et al., 1976; Walter, 1976), активируется ацетил-КоА. Кривая зависимости скорости реакции, катализируемой этим ферментом, в изолированных митохондриях от концентрации ацетил-КоА имеет сигмоидный характер/ Величина [A] Q 5 (ацетил-КоА) при физиологическом значении pH (7,0) равна 1,2•I0~'i М (Ермолаева, Мильман, 1974), т.е. соответствует-величинам этого показателя фермента в митохондриях, изолированных из пече™ млекопитающих (Walter, 1976) И птиц (Barritt et al., 1976).

Расчет внутримитохондриалыюй концентрации ацетил-КоА. в ооцитах и яйцах вьюна, произведенный на основании его содержания (табл. 4), показал, что она является насыщающей для ПКК (при условии равномерного распределения ацетил-КоА в митохондриальном матриксе).

Таблица 4

Содержание малата, оксалбацетата, ацетил-КоА в ооцитах и яйцах

вьюна, нмоль на 10 штук

Метаболит Ооцит (после окочания периода большого роста) Яйцо

Малат 40 + 3 300+15

Оксалоацетат (цитоплазма) 2,0 8,0

Оксалоацетат (митохондрии) 0,04 1.6

<РКЮГа,) С цитоплазма) 0,05 0,026

(°КиДГаТ) (миоховдвии). - 0,0017 0,011

Ацетил-КоА 45 + 6 45+6

Концентрация ацетил-КоА в митохондриях оодатов и яиц вьюна является насыщающей и для цитрат-синтазы и поэтому не может играть роли в контроле внутриклеточной скорости цитрат-синтазной реакции. Последняя, по-видимому, регулируется вторым субстратом цитрат-синтазы оксалоацетатом, так как митохондриальная концентрация его находится в области величины фермента. Изменение содержания оксалоацетата в митохондриях при созревании ооцитов (табл. 4) свидетельствует о возможном изменении внутриклеточной скорости цитрат-синтазной реакции. Однако, по характеру оно не совпадает с изменением скорости дыхания (Озернюк, 1970), а, следовательно, и скорости ЦТК. Кроме того, при созревании ооцитов и в ходе последующего эмбрионального развития вьюна постоянна мак-стальная скорость цитрат-синтазной реакции (соответствующая активности фермента, измеряемой при насыщающей концентрации субстратов) (табл. 3), несмотря на изменения скорости дыхания (Ней-фах, 1960; Озернюк, 1970). Эти результаты позволили нам сделать вывод о том, что цитрат-синтазная реакция не является показателем скорости ЦТК в раннем эмбриогенезе вьюна. Такое же заключение вытекает из сопоставления скорости цитрат-синтазной реакции и 1ГК в печени развивающегося эмбриона курицы (см. ниже). Из стабильности максимальной скорости цитрат-синтазной реакции при :озревашш ооцитов вьюна, когда скорость глюкояеогенеза резко шижается, следует, что активность фермента не коррелирует и с

скоростью глюконеогенеза. Отсутствие зависимости между активностью цитрдт-синтазы и скоростью глюконеогенеза обнаружено нами 'также в печени развившощегося эмбриона курицы (см.ниже). Кроме того, оно отмечено в печени млекопитающих (Srere, 1971) и рыб (French et al., 1981).

Скорость глюконеогенеза в гепатоцитах развивающегося ' эмбриона курицы

Первоначально, при проведении работы мы учитывали данные по скорости глюконеогенеза в печени развивающегося эмбриона курицы Еолларда и Оливера (Ballard, Oliver, 1963, 1965). Однако этими ■ исследователями не была измерена скорость глюконеогенеза после выклева цыпленка. Между тем мы обнаружили существенные изменения ряда факторов регуляции глюконеогенеза в печени 1-дневного цыпленка. Кроме того, оценка скорости глюконеогенеза в работах Еолларда и Оливера была несовершенна; использовался неэффективный предшественник глюконеогенеза пируват и срезы печени.

Нами была определена скорость синтеза глюкозы из лактата в гепатоцитах, изолированных из эмбрионов разного возраста и I-дневного цыпленка. Как предшественник глюконеогенеза в печени эмбриона (Dickson, 1983) и взрослой курицы (Dickson, Langslow, 1978) лактат имеет преимущество перед пируватом. Хорошая проницаемость изолированных гепатоцитов для метаболитов и относительно высокая скорость образования глюкозы в них позволила нам оценить скорость глюконеогенеза без применения изотопных индикаторов. Кривая изменения скорости образования глюкозы при инкубации гепа-TOCJ1TOB без лактата (рис. I) соответствует скорости синтеза глюкозы из эндогенных субстратов, Tait как прироста глюкозы за счет второго возможного ее источника - расщепления гликогена не происходит. Прямым доказательством этого утверкдения является неиз-мещость содержания гликогена в ходе инкубации (Ермолаева, 1987). Скорость образования глюкозы из лактата (за вычетом скорости из эндогенных субстратов) наибольшая .в гепатовдтах ïô-IV^HeBuux эмбрионов. Она резко снижается в гепатоцитах предвыклевних эмбрионов (рис. I). /

Таким образом, полученные нами данные по скорости синтеза глюкозы в изолированных гепатоцитах развивающегося эмбриона курицы в целом совпадают с данными Болларда и Оливера (Ballard, Oliver, 1965).Различие между нашими результатами и результатами этих авторов проявляется в степени снижения скорости процесса к

Рис. I.

1

5

J

Скорость образования глюкозы при инкубации изолированных геиатоцитов развивающегося эмбриона курицы. в течение одного часа из э1Щогенних предшественников (I) и 10 мМ лактата (2) По оси абсцисс - дни развития; по оси ординат -прирост.глюкозы, тлолъ/мкг .ДНК. В - выкл'ёв

п IV и 1! 20 ' 7

и

выклеву. Обнаруженное нами существенное уменьшение скорости процесса к этому моменту объясняется, по-видимому, использованием как более эффективного предшественника глюконеогенеза, так и. изолированных гепатоцитов, отличающихся от срезов печени хорошей проницаемостью для метаболитов.

Небольшое дальнейшее' снижение скорости глюконеогенеза мы набдюдали в гепатецитах 1-дневного цыпленка (рис. I).

Роль нолифушщионалыюсти глюкозо-6-фосфатазы в регуляции

глюконеогенеза в печени развивающегося эмбриона курицы

При исследовании роли глюкозо-6-фосфатазн (КФ 3.1/3.9) в регуляции глюконеогенеза в печени развивающегося эмбриона курицы мы показали, что этот фермент обладает не только фосфогидролазной, но и фосфотрансферазной активностью.

Согласно нашим данным, изменение активности глюкозо-6-фосфат фосфогидролазы, измеренной как в гомогенате печени (Ермолаева!, 1983), так и в изолированных микросомах (рис. 2), не коррелирует со скоростью глюконеогенеза в отличие от активности фермента печени взрослой курицы (O'Neill, Langslow, 1978), а также печени млекопитающих гак взрослых (Hordlie, Jorgenson, 1981)* так и на эмбриональных и неонататьных стадиях их развития (Jones, Ashton, 1976; Goldsmith, Stetten, 1979). Мы полагаем, что такая особенность изменения фосфогидролазной активности глюкозс-6-фосфатазы в пече-

Рис. 2.

Изменение активности глюкозо-6ч$осфатазы в изолированных микросомах печени развивающегося эмбриона курицы.

Активность глюкозо-6-фосфат фосфогидролазы (I)., карба-МИЛ-ф0СфаТ-ГЛЮК030 фосф»-трансфюразы (2) и пирофюс-фат-глюкозо фосфотрансфера-зы (3).

По оси абсцисс - дни развития; по оси ординат -активность фермента. В - выклев

ни развивающегося эмбриона курицы связана с динамикой содержания гликогена и поддержанием изменяющегося в* ходе развития уровня глюкозы в крови эмбриона. Так, повышению активности фермента к концу инкубации соответствует резкое уменьшение содержания в печени гликогена и высокая концентрация глюкозы в крови эмбриона (Лейбсон, 1962; Langslow, 1975; Кривопишин и др., 1976). То есть повышение фюсфогидролазной активности фермента в конце эмбриогенеза (при снижении скорости образования глюкозо-6-фюсфата за счет глюконеогенеза) вызвано, по-видимому, необходимостью гидролиза глюкозо-6-фосфата, генерируемого гликогенолизом, скорость которого значительно возрастает. Активность карбами^-фюсфат- и пирофос-фат-глюкозо фосфотрансферазы ниже активности глюкозо-6-фосфат фосфогидролазы и не изменяется в ходе развития эмбриона (рис. 2).

Не только активность, но и степень латентиостп как фосфю-трансфераз, так и фосфогидролазы в печени развивающегося эмбриона курицы не коррелирует со скоростью глюконеогенеза. Она одинакова в печени эмбриона при максимальной и минимальной скорости процесса (Ермолаева, 1983). В то не время такого рода корреляция отмечена в печени неонатальной (Goldsmith., Stetten, 1979) и взрослой крысы (Hordlie, Jorgenson, 1981).

Таким образом, полученные-наш результаты свидетельствуют о том, что фосфотрансферазная и фосфогндролазная активность глюкозо-

мЕ/мг белна

150

100

50

—-С-

J-1_I-1_I_I_I_I_I_I_L-

12

W

20 В 1

6-фосфатазы не играет существенной роли в контроле глюконеогенеза в печени развивающегося эмбриона курицы.

Контроль сопряжения глюконеогенеза с гликолизом в печени курицц в эмбриональном и раннем постэмбриональном развитии

Адониловая система. Определение содержания адениловых нук-леотидов в печени развивающегося эмбриона курицы показало, что величины отношений (АТФ):(ДЦФ), (АТФ):(АДФ+АМФ) изменяются, достигая максимальных значений к 17-му дню развития. К концу эмбриогенеза величины этих отношений снижаются и сохраняются примерно на том же уровне в печени 1-дневного цыпленка (табл. 5).

Таблица 5

Содержание адениловых нуклеотидов и отношение (АТФ):(АДФ), (АТФ);(АДФ+АМФ) в печени развивающегося зародыша курицу

Нуклеотид, Отношение

Развитие, мкмоль/г сырого веса

дни АТФ АДФ АМФ (АТФ) (АИФ) (АТФ) 1МФ+АМФ)

Эмбриональное

10 0,70+0,07 0,90+0,10 2,30+0,20 0,78 0,22

12 0,90+0,10 1,00+0,10 2,40+0,20 0,90 .0,26

13 0,35+0,05 0,70+0,07 2,90+0,30 0,50 0,10

15 0,45+0,05 0,70+0,07 2,30+0,40 0,65 0,15

16 1,00+0,05 1,20+0,05 2,40+0,20 0,83 0,28

17 1,50+0,10 1,20+0,15 2,50+0,20 1,25 0,40

18 1,20+0,10 1,25+0,10 2,65+0,20 0,96 0,31

20 0,54+0,05 0,70+0,06 2,00+0,20 0,77 0,20

Постэмбрио-

налыюе

I 0,45+0,04 0,80+0,06 2,20+0,20 0,56 0,15

Таким образом, изменение относительного содержания АТФ в печени эмбриона курицы коррелирует со скоростью глюконеогенеза.

Отношение (АТФ):(АДФ) в печени эмбриона курицы, также как в ооцитах и яйцах вьюна (см. выше) и других исследованных объектах (Veech et al., 1970; Garber, Hanson, 1971; Великий, 1986), коррелирует с величиной фосфатного потенциала (табл. 5,6). Изые-

*

нение величины фосфатного потенциала, так же как отношения (АТФ):(АДФ), соответствует скорости глюконеогенеза. Особенно отчетливо эта зависимость выявляется при сопоставлении скорости глюконеогенеза с измеренной величиной фосфатного потенциала (табл. G).

Следует отметить, что величины фосфатного потенциала в пе^ чени эмбриона курицы на разных стадиях развития, рассчитанные с использованием объединенной константы равновесия глицеральдегщь 3-фосфатдегидрогеназной, фосфоглицераткиназной и лактатдегидроге-* казной реакций, равной 53-10 (Veech et. al., 1970), близки к измеренным . Это свидетельствует о равновесии между участниками вы-* ¡неупомянутых реакций в печени эмбриона курицы. аналогично ооцитам и яйцам вьюна (см. выше), а таете печени крысы (Veech ot al., 1970; Stubbs et al., 1972).

Соотношение между окисленной и восстановленной космами НАД в цитоплазме и митохондшях. Отношение (НАД+):(НАдН) в цитоплазме печени развивающегося эмбриона курицы нами было определено на основании содержания метаболитов реакций, катализируемых как лактатдегидрогеназой, так и глицерол-3-фосфатдегидрогеназой.

Величины цитоплазматического отношения (НАД+):(НАДН), рассчитанные по этим реакциям в печени эмбрионов разного возраста и 1-дневного цыпленка, различаются в 2-3 раза, хотя характер изменения этого отношения одинаков. Оно практически не изменяется в ходе развития эмбриона, но снижается в два раза в первый день после выклева (табл. 6).

Таким образом, на величинах отношения (НАД+) ;(НАДН) в цито>-плазме печени развивающегося эмбриона курицу не отражается изменение скорости глюконеогенеза. Неизмешюсть этого отношения при разной скорости глюконеогенеза отмечена также в печени других животных, у которых ФЕП-КК преимущественно локализована в митохондриях: голубя (Kaminsky et al., 1982) И морской свинки (Garber, Hanson, 1971; Faulkner, Jones, 1976).

Двукратное снижение отношения (НАД+) :(НАДН) в цитоплазме печени 1-дневного цыпленка является следствием аналогичного увеличения внутриклеточного содержания лакгата и глицерол-3-фосфата (табл. 7), которое, однако, может быть связано не столько с изме-* нением скорости глюконеогенеза, сколько с началом активных движений цыпленка. Следует отметить, что налш данные, свидетельствующие о двукратном увеличении содержания лактата в печени выклюнувшегося цыпленка, подтверждены другими исследователями (Garcia

Таблица 6

Цитоплазматическоеи митохондриальное (НАД+):(НАДН) и (АТФ)/(АДФ)•(НР042-) в печени развивающегося эмбриона курицы

Развитие, дни Цитоплазматическое (НАД+):(НАДН), рассчитанное из отношения ¿Митохондриальное (НАД ):(НАДН), рассчитанное из отношения (АТФ)ДАДФ) •(НРО^-)

. (гогсуват) ( дкоксиацетонаос:.'гт ) ( -кетоглутасат) • (ira измеренное рассчитанное

(лактат) (глицерол-3-фо сфат) (глутамат)

Эмбриональное

10 565 - - 118+10 -

12 620 1851+166 9,0 136+13 109+11

' . 16 . 714 - 12,8 126+11 -

Г7 • - 1532+150 - 189+13 170+15

18 564 . - - 145+16 -

' 20 - I35I+I08 - 117+10 137+16

21 535 - 11,8 - -

Состзмбриональное

I 241 . 624+60 5,6 94+10 120+12

Таблица.7

Содержание некоторых метаболитов в печени развивающегося эмбриона курицы,

нмоль/г сырого веса

Метаболиты

Развитие, дни

эмбриональное

постэмбриональное

12

16-17

20-21

Пируват Лакгат

Диоксиацетонфосфат

Глицерол-3-фосфат

З-фосфоглицерат

Глицеральдегид-З-фосфат

(3-(5ос^оглпцеглт) (Г л;щеральдегэд-3-фосфат)

Р±

Глутаглат 3-оксибутират

39+4 622+55

11000+100

1100+200

23+1,0 335+35 8+0,7 48+2,0 300+20 0,9 333

11000+100 2000+400 4000+100 1600+100

23+2,0 290+20 8+0,8 58+6 222+12 0,9 247

11000+100 2000+300 2500+100 1700+100

19+2,0 320+40 9+0,6' 74+6 230+13 1,0 230

.11000+100 2100+400 •'2400+200 1500+100

17+3 634+33 10+1 178+18 130+10 1,1 118

10000+100 2500+200 2400+100 1600+200

го

о

Дродолгевие табл. 7

Развитие, дни

Метаболиты

эмбриональное

постэмбриональное

10.. 12 16-17 20-21 I

- 70+3,0 59+8,0 50+8,0 21+2,0

- ' 1-7 1,5 1,3 0,5

¡00+200 1600+200 1600+200 2100+200 2200+200

- .28 32 31 13

- 0,20 0,29 0,34 0,17

- 0,017 0,020 0,015 0,007

' - 0,0025 0,0034 0,0032 0,0016

5+0,7 12+2,0 11+2,0 11+2,0 13+3,0

25+4,0 46+6,0 41+6,0 49+7,0 51+7,0

0,20 0,26 0,27 0,22 0,25

оС -кетоглутарат о1 -кетоглутарат (митохондрии) Малат

Оксалоацетат (цитоплазма)

Оксалоацетат (митохондрии)

(Рксалоапетат) (щт0ш1азш) (Малат)

(Оксалоаггетат) (ШХ0Х0ВДЕШ1) (Малат)

Ацетил-КоА

КоА ■

(Ацетил-КоА):(КоА)

et al., 1986).

Отношение окисленной к восстановленной форме НАД. в митохондриях печени эмбриона курицы нами было рассчитано по соотношению метаболитов - участников глутшлатдегидрогеназной реакции. Использовать для этой цели 3-оксибутиратдегидрогепазную реакцию мы не смогли в связи с трудностью определения, ацетоацетата из-за его быстрого декарбоксилирования в печени эмбриона курицы.

' В изменении соотношения (НАД1") :(НАД11) в митохондриях печени развивающегося эмбриона курицы (табл. 6) прослеживается тенденция прямой корреляции его со скоростью глюконеогенеза, которая отмечена в печени голубя (Kaminsky et al., 1982) и морской евши® (Garber, Hanson, 1971). .

Соотношение между штоплазматическим отношением (НАД"1"): (НАДЮ и Фосфатным потенциалом. Из величин цитоплазматичесг.ого соотношения между окисленной и восстановленной формами НАД и фосфатного потенциала в печени развивающегося эмбриона курицы (табл. 6) еле- • дует, что между этики показателями отсутствует корреляция. Наши результаты согласуются с данными других авторов, полученных при исследовании этих показателей, при разной скорости, глюконеогенеза В печени голубя (Kandnsky et al., 1982) И морской СВИНКИ (Faulk- . пег, Jones, 1976).

Таким образом, наши данные в сочетании с литературными-свидетельствуют о том,что постулат Кребса (Veech et al., 1970; Krebs, 1973) о коррелятом цитоплазматического отношения (НАД+):(НАДН) и фосфатного потенциала несправедлив для объектов, у которых ФЕП-КК локализована в основном в митохондриях.

Пиоуваткиназа. При исследовании роли ПК в регуляции сопряжения глюконеогенеза с гликолизом мы обнаружили, что активность фермента существенно увеличивается в первые "дни постэмбрионального развития, с началом активного питания (рис. 3), когда скорость гликолиза резко возрастает,- а глюконеогенеза, естественно, снижается. Это указывает, по-видимому, на то, что на данной стадии развития увеличивается количество фермента. В то же время известно, что ПК взрослых кур, представленная М2-изозимом, не индуцируется углеводной диетой (Gevers, 1967; Pearce, 1977).

Исследование кинетических параметров ПК печени курицы ранних стадий развития, проведенное нами на изолированном ферменте печени 1-дневного цыпленка, указывало на-наличие только Mg-изозима (рис. 4). Отсутствие L-изозима ПК в печени эмбрионов и цыплят разного возраста било также доказано позднее в нашей

Рис. 3. Изменение активности пируватмшазы (1) и величины г (2) в печени курицы в онтогенезе.

г = У(1.5 мГЛ ФЕЛ)

и(0,4 мМ ФШ) Достоверность различия величины г: 12-16-дневные эмбрионы Р>0,05; 12-20-дневные эмбрионы Р< 0,01; 16-20-дневше эмбрионы Р>0,2; 20-дневный эмбри-0Н-1-ДН0В1ШЙ цыпленок Р< 0,01; I-10-дневный цыпленок Р< 0,05

Рис. 4. Зависимость скорости реакции, катализируемой частично очищенной лируваткиназой из печени . 1-дневного цыпленка от концентрации ФЕЛ.

1 - без преинкубации, Щ]о 5(ФЕП)=0,4 11 =3»

2 - инкубация с I мМ фрута030-1,6-бисф0сфат0м;

3 - инкубация с I мМ АТФ •

лаборатории путем использования метода электрофокусировки (Абрамова и др., 1989).

Кроме того, паки установлено, что ПК контролирует изменение соотношения мелзду глюконеогенезом и гликолизом в печени развивающихся цыплят посредством изменения соотношешш между двумя формами фермента, различающимися кинетически, по сродству к субстрату ФЕП. Показателем изменения соотношения между этими формами фермента является изменение величины коэффициента г (рио. 3). Величина г снижается в печени I- и IO-дневных ыцплят. Это свидетельствует об увеличении доли формы фермента с высоким сродством к субстрату. В печени 10-дневных цыплят оно, вероятно, вызвано активным питанием. В печени 1-дневных пцплят оно, по-видимому, связано с самим процессом выклева. ■ .

Роль пируватдегидрогеназы в сопряжении глюконеогенеза с липогенезом и ЦТК в печени курицы в эмбриональном и постэмбриональном развитии

При определении активности ПДГ в печени эмбрионов и цыплят в условиях, выявляющих активную форму фермента: без преинкубаций с MgCi2, мы обнаружили, что она увеличивается в первый и последующие дни после выклева. К 9-му дню постэмбрионального развития активность ПДГ превосходит активность эмбрионального фермента в 6-7 раз (табл. 8).

Активацию фермента в присутствии 20.мМ MgCi2 нам удалось обнаружить только в печени эмбрионов при стабилизации ДЦГ-комплек-са куриной сывороткой (табл. 8).

Существенное повышение активности ПДГа к 9-му дшо постэм-брионаяьного развития, по нашему мнению, обусловлено.увеличением количества фермента путем синтеза его de novo, а не активацией фермента за счет дефосфорилирования, так как активность ДЦГа к . этому времени развития в 3 раза превосходит сумму активной и. неактивной форм эмбрионального фермента (табл. 8).

Изменения активности ЦЦГ после выклева цыплят согласуются о изменениями скорости глюконеогенеза (см. выше)* ЦТК (Ермолаева^ Сурмава, 1988) и липогенеза (Goodridge, 1968, 1973).

Значение активности цитрат-синтазы в сопряжении глюконеогенеза с ЦТК в печени развивающегося эмбриона курицы

Так же как в ооцитах и зародышах вьюна, в печени развивающегося эмбриона курицы мы не обнаружили зависимости, с одной сторо-

Таблица 8

Активность ЦЦГ в печени курицы в эмбриональном и иостэмбриональном развитии, мЕ/г сырого веса

Активность фермента

Развитие, До активации После активации в присутствии

дни 2-КГ* М Kgci2 2- КУ 0, на 10"* М MgClp + синая сыворотка, 2-2,0 мг белка I мл среды

Эмбриональное

12 70+6 70+6 135+10

16 70+6 • 77+6 155+12

20 86+7 • 83+7 180+15

Ностзмбриокаль-ное

I 123+9 125+9 130+10

9 520+40 370+28 320+25

21 580+45 220+18 370+30

56 96+8 - 52+4

нн, между активностью цитрат-синтазн, а с другой - скоростью глюконеогенеза, а также скоростью дыхания и, следовательно, скоростью ЦТК. Активность цитрат-синтазы стабильна в печени эмбриона в ходе ого развития и 1-дневного цыпленка (рис. 5), несмотря на изменение скорости глюконеогенеза (см. выше) и скорости дыхания (Romanoff, 1967; Головачев, Надальяк, 1975).

Определение динамики содержания субстратов цитрат-синтазы (табл. 7)-позволило нам установить, что в печени эмбриона курицы аналогично ооцитам и яйцам вьюна внутриклеточную скорость цитрат-синтазной реакции может регулировать только оксалоацетат. Однако, изменение содержания оксалоацетата в митохондриях печени эмбриона курицы в ходе его развития указывает на то, что и внутриклеточная скорость цитрат-синтазной реакции, как и максимальная, не соответствует скорости дыхания и, следовательно,■скорости ЦТК.

Рис. 5.

Активность цитрат-синтазы (I). сукцинатдегидрогена-зы (2) и е^-кетоглутарат-дегидрогеназы (3) в поче-ии развивающегося эмбриона курицы.

По оси ординат - активность ферментов, по оси абсцисс -дни развития, В - вцклев.

Достоверность различия активности с( -кетоглутарат-дегвдрогсназы: 14-21-дневные эмбриош Р< 0,001: 21-дневный эмбрион-Х-дневньш цыпленок Р< 0,001

Активность {¿.-кетоглутаратдегидрогеназк - показатель

скорости ЦТК в печени развивающегося эмбриона курицы

По нашим данным, в печени эмбриона курицы со скоростью дыхания (и скоросты« ЦТК) не коррелирует также активность сукцинат-дегидрогоназы, но коррелирует активность о', -кетоглутаратдогидро-геназы. Активность последнего фермента (рис. 5), как и скорость дыхания, снижается к концу инкубации. После вкклева - в печени 1-дневного цыпленка мы наблюдали заметное повышение активности сА. -кетоглутаратдегидрогеназы.

Детально вопрос о соотношении активности о'.-кетоглутарат-дегидрогеназы и скорости ЦТК рассмотрен в главе 12 диссертации и в статье (Ермолаева, Сурмава, 1988).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основным результатом настоящей работы является установление наличия специфических особенностей регуляции глюконеогенеза и сопряжения его с гликолизом, липогенезом и ЦТК на разных стадиях раннего развития.

При исследовании роли пируваткиназы в контроле координирования глюконеогенеза и гликолиза в печени курицы в эмбриональном и постэмбриональном развитии нами обнаружено, что па ранних стадиях постэмбрионального развития, с началом активного питания,

увеличивается активность (по-видимому, количество) фермента. Так как в печени цыплят (и эмбрионов курицы) содержится только изозим ппруватюшазы, эти результаты свидетельствуют об увеличении активности (количества) (^-изозима ппруватюшазы. В то же время известно, что' пируваткиназа взрослых кур, которая представлена также исключительно Г^-изозимом, не индуцируется углеводной диетой.

В работе показано, что пируватдегидрогеназа в печени курицы в раннем постэмбриоиальном развитии и в раннем эмбриогенезе вьюна контролирует изменения соотношения между глюконеогенезом, липоге-незом н ЦТК по средством изменения активности дефосфорилированной формы фермента. Паши данные в сочетании с данными других авторов об изменении общей активности фермента в печени развивающейся крысы позволяют сделать вывод, что на ранних стадиях развития реализуется механизм регуляции активности пируватдегидрогеназы, заключающийся в изменении количества фермента и не'функционирующий у взрослых животных. Полученные наш результаты свидетельствуют и о возможности реализации в специализированном глюкогенном органе -печени на ранних стадиях онтогенеза механизма регуляции активности пируватдегидрогеназы, характерного для взрослых животных и основанного на обратимом фосфоршшровании-дефосфорилнровании. Такой механизм регуляции активности пируватдегидрогеназы не обнаружен нами в раннем эмбриогенезе вьюна.

Нами установлено, что в ооцитах и ранних зародышах вьюна, в отличие от печени, изменение скорости глюконеогенеза и соотношения его с ЦТК не контролируется изменениями активности пируваткар-боксилазы.

Использованные в работе.объекты позволили выявить особенное- . ти регуляции глюконеогенеза на ранних стадиях развития, обусловленные внутриклеточной локализацией ФЕП-карбоксшшназы. Они проявляются в разном характере изменения отношения между окисленной и восстановленной формами НЛД и содержания оксалоацетата в цитоплазме и митохондриях при изменении соотношения глюконеогенез/гли-колиз.

На основании наших результатов и результатов других авторов по величинам фосфатного потенциала и отношения (НДЦ+):(НАДН) в цитоплазме при изменении скорости глюконеогенеза Hai.ni сформулировано положение о корреляции этих показателей в объектах с пито-зольной локализацией ФЕП-карбоксигашазн и отсутствии таковой в объектах, у которых этот фермент локализован в основном в митохондриях.

выводы

1. Обнаружена прямая зависимость между изменением величин отношений (АТФ):(АДФ), (АТФ) :(АД5ч-АМФ) и скоростью глюконеогене-за в ооцитах, в яйцах вьюна и в печени развивающегося эмбриона курицы.

2. Показано, что "измеренные" (путем непосредственного определения содержания А'Ы, АДФ и рз.) и "рассчитанные" (на основании содержания лактата, пирувата, гллцеральдегид-3-фосфата и З-фоссХ-о-глилерата) величины фосфатного потенциала, т.е. отношения (АТФ)/(АДФ).(ПР042-), в ооцитах, в яйцах вьюна и в печени развивающегося эмбриона курицы близки. Тем самым установлено, что компоненты глицеральдегид-3-с(,осфатдеищрогеназпой, фосфоглицератки-назной и лактатдегидрогеназной реакций в этих объектах находятся

в равновесии. Обнаружена прямая корреляция между изменением величины фосфатного потенциала и скорости глюконеогенеза при созревании ооцитов вьюна и в печени развивающегося эмбриона курицу.

3. Показано, что уменьшение величины фосфатного потенциала при созревании ооцитов вьюна (при резком снижении скорости глюконеогенеза) коррелирует с уменьшением цитонлазматического отношения (НАД+):(НАДН). Не обнаружено корреляции между величинами фосфатного потенциала и цитонлазматического отношения (НАД):(НАДН) при измене!ши скорости глюконеогенеза в печеш развивающегося эмбриона курииы.

4. Установлено, что пируваткиназа в печени развивающейся курицы, представленная М^-изозимом, участвует в контроле соотношения между глюконеогенезом и гликолизом посредством изменения соотношения между двумя кинетическими формами фермента, различающимися по сродству к субстрату ФЕП, и путем увеличения общей активности фермента.

5. Показано, что в печени развивающегося эмбриона курицы глюкозо-6-фосфатаза обладает не только фосфогвдролазной, но и фосфотрансферазной активностью. Изменение фосфогидролазной активности фермента не коррелирует со скоростью глюконеогенеза. Повышение активности глюкозо-6-фосфат фосфогидролазы к концу инкубации коррелирует с резким снижением в печени содержания гликогена. Активность карбамил-фосфат-глюкозо фосфотрансферазы и пирофосфат-глюкозо фосфотрансферазы, а также доля латентной формы этих ферментов постоянны в ходе развития эмбриона.

6. Установлено, что пируватдегидрогеназа в печени развиваю-

щихся цыплят, а таете в раннем эмбриогенезе вьюна контролирует изменение соотношения между глюконеогеиезом и сопряженными с ним процессами посредством изменения активности ЦДГа (дефосфорилиро-ванной формы фермента).

7. Активность пируваткарбоксилазы при созревании ооцитов и в ходе раннего эмбриогенеза вьюна постоянна, т.е. не коррелирует со скоростью глюконеогенеза. Фермент ооцитов и зародышей вьюна активируется ацетил-КоА: величина [a)q ;3(ацетл_я0д) составляет 1,2'1'0~ M при pli 7,0; фермент ингибируется при соотношении (АТФ) : (АЦФ) ниже I.

8. Активность цитрат-синтазы стабильна в ходе раннего эмбриогенеза вьюна и в печени развивающегося эмбриона курицы, несмотря на изменение скорости глюконеогенеза и ЦТК.

9. На примере печет развивающегося эмбриона курицы установлено, что показателем скорости ЦТК может служить активность oi. -кетоглутаратдегидрогеназы.

10. Изменению скорости глюконеогенеза при созревании ооцитов вьюна соответствует изменение содержания, оксалоацетата как в цитоплазме, так и в митохондриях. Изменение скорости глюконеогенеза в печени эмбриона курицы в ходе его развития сопровождается изменением содержания оксалоацетата только в митохондриях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУШКОВАНШХ ПО ТЫЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ермолаева Ji.Il., Мильман J1.0. Особенности генерирования ИАДФ-Н в ооцитах и зародышах вьюна Misgurnus fossilis // йурн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1973. - Т. 9, № 6. - С. 558-563.

2. Мильман JI.C., Юровмцкий Ю.Г., Ермолаева Д.П. Сравнительные аспекты регуляции глюконеогенеза у микроорганизмов и позвоночных животных // Проблемы регуляции обмена веществ у микроорганизмов. Лущило. — 1973. - 0. 109-127.

3. Ермолаева 1.П., Мильман Л.С. Соотношение окисленных и восстановленных форм НАД и 11АДФ в ооцитах и зародышах вьюна // Биохимия. - 1974. - Т. 39, вып. 2. - С. 314-318.

4. Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Зависимость нейду отношением (НАД) :(НАДН) и адениловон системой в цитоплазме ооцитов и зародышей вьюна-'// Онтогенез. - 1974. - Т. 5, № 5. - С. 505-507.

5. Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Активность пируваткарбоксилазы в ооцитах и зародышах вьюна Misgurnus fossilis // Физиология и биохимия низших позвоночных. Ленинград: Наука. - 1974. -

39-43.

6. Yermolaeva L.P., Milman L.S. Redox state of nicotinamide-adenine nucleotide and phosphorylated state of adenine nucleotide in oocytes and embryos of the loach ^Misgurnus fossilis L.) // Wil-chelm Roux"Archly. - 1974. - V. 174. - P. 297-301.

7. Ермолаева JI.П., Юровицкий Ю.Г., Мильман Л.С. Контроль переключения глюконеогеиеза на гликолиз в раннем эмбриогенезе вьюна // Тезисы докл. Ш Всесоюзн. биохим. съезда. Рига. - 1974. -Т. I. - С. 57.

8. Ермолаева Л.Б., Юровицкий Ю.Г., Мильман Л.С. Глюконеоге-нез и его контроль в эмбриональном развитии и при дюТхЪеренциров-ке // Труды Л1 Всесоюзного симп. "Механизмы контроля раннего эмбрионального развития", Москва. - 1974. - С. 41-45.

9. Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Особенности контроля пиру-ватдегидрогеназы в ооцитах и зародышах вьюна // Онтогенез. -

1975. - Т. 6, ie 5. - С. 523-526.

10. Ермолаева Л.П. Отношение (НАД+) :(ШЩ1) в митохондриях ■'оцитов и яиц вьюна Misgurnus fossilis // Онтогенез. - 1976. -Т. 7, № 3. - С. 293-296.

11. Ермолаева Л.II., Мильман Л.С. Активность пируваткарбокси-лазы в ооцитах и зародышах вьюна и ее зависимость от величины "заряда энергии" // Митохондрии. Транспорт электронов и преобразование энергии. Москва: Паука. - 1976. - С. 173-176.

12. Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Особенности активности са-теллитных ферментов глюконеогенеза в ооцитах и зародышах вьюна // Биохимия. - 1976. - Т. 41, вып. 5. - С. 874-880.

13. Ермолаева Л.П., Юровицкий Ю.Г. Особенности глюконеогенеза в оогенезе и раннем эмбриональном развитии вьюна // Тезисы докл. Ш Всесоюзной конф. "Экологическая физиология рыб". Киев. -

1976. - С. I9I-I92.

14. Юровицкий В.Г., Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Регуляция глюконеогенеза как метаболической системы // Успехи бкологич. химии. - 1976. - Т. 17. - С. 217-233.

15. Ермолаева Л.П. Активность пируватдегидрогеназы.в эмбриональной и лостнатальной печени курицы // Биохимия. - 1977. -

Т. 42, вып. 6.'- С.. 1006-1009.

16. Xeriaolaeva L.P. The role of enzymes of pyruvate and citrate metabolism in control of gluconeogenesis in oocytes and embryos of the loach, Misgurnus fossilis L. // Wilchelm Roux'Ar-chiv. - 1S77- - V. 181. - P. 321-33117. Мильман Л.О., Юровицкий Ю.Г., Ермолаева Л.П. Контроль

углеводного обмена на различных стадиях оогенеза // Современные проблемы оогенеза. Москва: Наука. - 1977. - С. 249-266.

18. Ермолаева Л.П. Факторы регуляции глюконеогенеза в печени куриных эмбрионов // Биохимия. - 1978. - Т. 43, вып. 7. -

С. 1335-1341.

19. Ермолаева Л.П., Юровицкий 10,Г., Мильман Л.С, Независимость отношения (НАД+):(НАДН) от адениловой системы в цитоплазме печени развивающегося зародыша курицы // Онтогенез. - 1979. -

Т. 10, вып. 1Ь 4. - С. 413-416.

20. Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Регуляция глюконеогенеза в печени развивающегося зародыша курицы // Тезисы научн. сообщ. 1У Всесоюзного биохим. съезда. Москва: Наука. - 1979, - Т. 2. -С. 182.

21. Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Регуляция глюконеогенеза в эмбриональном развитии // Тезисы докл. Всесоюзного симп, "Ре-гуляторные системы обмена веществ в раннем эмбриогенезе". Киев; Наукова Думка. - 1979. - С. 14-16.

22. Ермолаева Л.П. Соотношение между двумя кинетическими формами пируваткиназы в печени курицы в онтогенезе // Биохимия. -1981. - Т. 46, вып. 2.-С. 230-233.

23. Ермолаева Л.П. Соотношение между (НАД+):(НАДН) и "фосфатным потенциалом" в цитоплазме печени развивающегося эмбриона курицы // Биохимия. - 1981. - Т. 46, вып. 6. - С. 1127-1132.

24. Ермолаева Л.П. Соотношение между двумя формами пируваткиназы в печени курицы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии // Тезисы дом. У1 Всесоюзного совещ. эмбриологов. Москва: Наука. - 1981. - С. 58.

25. Юровицкий Ю.Г., Ермолаева Л.П., Мильман Л.С. Взаимодействие путей обмена гликогена и глюконеогенеза в печени развивающегося куриного эмбриона // Тезисы докл. У1 Всесоюзного симп. биохим. обществ СССР и ГДР "Регуляция процессов обмена веществ и энергии". Таллинн. - 1981. - С. 207.

26. Ермолаева Л.П. Роль полифункциональной глюкозо-6-фосфатазы в углеводном обмене печени развиванцегося эмбриона курицы // Онтогенез. - 1983. - Т. 14, № 5. - С. 503-509.

27. Ермолаева Л.П. Регуляция соотношения между глюконеоге-незом и гликолизом в печени курицы в эмбриональном и неонаталь-ном развитии // Тезисы докл. Всесоюзного симп. "Метаболическая регуляция физиологического состояния". .Пущино, - 1984. - С. 1819. -

28. MilmanL.S., Yermolaeva L.P. Control of gluconeogenesis in embryonic and perinatal chicken liver //Abstracts Symp. "Adaptation und Reifung in der Perinatalperiode". Leipzig. - 1984. -

s. 529. Ермолаева Л .П., Мильман Л.С. Система сателлитных ферментов глюконеогенеза в оогенезе и.раннем эмбриогенезе вьюна // Тезисы докл. У1 Всесоюзной конференции "Экологическая физиология и биохимия рыб". Вильнюс. - 1985. - С. 304-305.

30. Milman L.S., Yermolaeva L.P. , Yurowitzky Y.G. Control of carbohydrate metabolism in chicken liver in perinatal period. 2.Hepatologisches Symp. Jena. - 1986. - S. 133-14J.

31. Ермолаева Ji.II. Полифункциональность глюкозо-6-фосфатазы в печени развивающегося эмбриона курицы // Тезисы докл. У Всесоюзного биохим. съезда. Москва: Наука. - 1986. - Т. 2. - С. 191.

32. Ермолаева Л .П., Мильман Л .С. Изменение окислительно-восстановительного потенциала при созревании ооцитов вьюна // Тезисы докл. конф. "Энергетический обмен рыб". Москва. - 1986. -С. 18.

33. Ермолаева Л.П. Регуляция глюконеогенеза в онтогенезе // Монография. Москва: Наука. - 1987. - С. I-I68.

34. Ермолаева Л.П. Скорость глюконеогенеза в геиатоцитах развивающегося зародыша курицу // Онтогенез. - 1987. - Т. 18, №4. - С. 430-433.

35. Ермолаева Л.П., Мильман Ji.C., Юровицкий Ю.Г. Регуляция направления потока метаболитов по гликолитической цепи в раннем онтогенезе рыб // Тезисы докл. I Всесоюзн. симп. "Экологическая биохимия рыб". Ярославль. - 1987. - С. 68-69.

36. Ермолаева Л.П., Сурмава М.К. Активность о(-кетоглу-таратдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы в печени развивающегося зародыша курицы * Связь со скоростью цикла трикарбоновых кислот // Онтогенез. - 1988. - Т. 19, № 6. - С. 640-644.

37. Milman L.S., Yurowltzky Y.G., Yermolaeva L.P. Control of carbohydrate metabolism of different stages of oogenesis // Oocyte growth and maturation. N.Y., L.: Consult. Bureau. - 1988. -P. 410-431. "

Л-33694 or H .12. C9r. 3.1646p. T.IQO. Тип. iS/О''Зпанио",