Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изоферменты изоцитратлиазы из амаранта: физико-химические свойства, регуляция, идентификация генов icl1 и icl2 и их экспрессия

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изоферменты изоцитратлиазы из амаранта: физико-химические свойства, регуляция, идентификация генов icl1 и icl2 и их экспрессия"

На правах рукописи

Сальников Алексей Владимирович

ИЗОФЕРМЕН'ГЫ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ ИЗ АМАРАНТА: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, РЕГУЛЯЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ iclx И ich И ИХ ЭКСПРЕССИЯ

Специальность 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 9 ш ¿№

Воронеж 2013

005544367

005544367

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный рудоводитель:

доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппопепты:

Ведущая организация:

Ершова Антонина Николаевна,

доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный педагогический университет, кафедра биологии растений и животных, заведующая

Гойкалова Ольга Юрьевна,

кандидат биологических наук, Воронежский государственный университет инженерных технологий, кафедра биохимии и биотехнологии, доцент

ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Защита состоится «ДЗ » декабря 2013 года в -У^ часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59. Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан «21» ноября 2013 года

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Грабович М. Ю.

Введение

Актуальность проблемы. Одним из приоритетных направлений развития физиологии и биохимии растений является исследование регуляции метаболических процессов, происходящих в растительном организме. Особый интерес вызывает функционирование важнейшего этапа глюконеогенеза -глиоксилатного цикла, а также изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1.) - ключевого фермента в процессе трансформации липидов в доступные для организма формы углеводов.

Изоцитратлиаза имеет широкое распространение в природе и функционирует в различные физиологические периоды жизни у многих организмов. Этот фермент считается большинством авторов маркерным ферментом глиоксилатного цикла [Епринцев и др., 2008], физиологическая роль которого для растений - участие в глюконеогенезе, обеспечивающим растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества. Изоцитратлиаза, как правило, является матриксным ферментом глиоксисом, однако, в работах А. У. Игамбердиева (1990) сообщалось о наличии второй изоформы, локализованной вне глиоксисом - внеглиоксисомальной формы. Известно также, что активность изоцитратлиазы увеличивается при старении растения, что даёт возможность преобразовывать липиды клеточных мембран в транспортные формы органических веществ. Таким образом, изоцитратлиаза в растениях представлена двумя формами, имеющими глиоксисомальную и внеглиоксисомальную локализации.

В последнее время появились сообщения о полифункциональности данного изоферментного комплекса. Функционирование изоцитратлиазной системы позволяет метаболизировать двухуглеродные соединения и использовать их как строительный материал. В растительном организме в процессе фотодыхательного метаболизма образуется глиоксилат и, благодаря синтазной реакции ИЦЛ, он может использоваться как в катаболических, так и в анаболических реакциях [Игамбердиев, 1992].

Амарант, являющийся нетрадиционной сельскохозяйственной продовольственной культурой, относится к С4-растениям и обладает способностью накапливать большие количества белка, аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов [Железное и др., 2009]. Для него характерна очень большая засухоустойчивость и при этом он очень хорошо реагирует на полив, что позволяет выращивать его в районах, непригодных для традиционных зерновых и зернобобовых культур. Эти особенности делают амарант перспективной культурой, которая может занять свою нишу в сельском хозяйстве. Поэтому исследование в онтогенезе характеристик изоферментов изоцитратлиазы, которая регулируют процессы мобилизации запасных жиров, особенно, при смене типов питания, представляет значительный научный интерес.

Исследование отдельных звеньев метаболических процессов, связанных с трансформацией липидов в углеводы, является актуальной задачей не только биохимии, но и молекулярной биологии.

Цель н задачи исследования. Целью данной работы являлось очистка изоферментов изоцитратлиазы из проростков амаранта, исследование их физико-химических и регуляторных характеристик, идентификация генов /с/, и /с12 и их экспрессия.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику активности и изоферментный состав изоцитратлиазы в онтогенезе амаранта разных сортов.

2. Изучить субклеточную локализацию изоферментов ИЦЛ.

3. Очистить изоцитратлиазу из проростков амаранта и стареющих листьев до электрофоретически гомогенного состояния.

4. Определить молекулярные массы и субъединичное строение полученных изоферментов изоцитратлиазы.

5. Изучить кинетические и регуляторные характеристики полученных ферментативных препаратов.

6. Подобрать праймеры для идентификации генов изоцитратлиазы, провести ОТ-ПЦР анализ кДНК из проростков амаранта и осуществить секвенироваиие полученных ампликонов.

7. Исследовать экспрессию генов изоцитратлиазы в проростках амаранта.

8. Разработать гипотетическую схему участия изоферментов ИЦЛ в различных метаболических процессах.

Научная новизна. Научные положения данной работы расширяют и дополняют современные представления о механизмах переключения метаболических процессов в растительной клетке при участии изоферментов, обеспечивая ей нормальное развитие.

Изоферментный состав ИЦЛ в амаранте представлен двумя формами фермента, которые различаются не только по электрофоретической подвижности и субклеточной локализации, но и по кинетическим и регуляторным свойствам. При старении листа наблюдается появление изоцитратлиазной активности, которая свидетельствует, видимо, о функционировании глиоксилатного цикла.

Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из проростков амаранта разных сортов позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики. Сравнительный анализ свойств выделенных изоформ указывает на их значительное отличие друг от друга.

Подбор праймеров для ИЦЛ на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов, а также последующее секвенироваиие полученного в ходе ПЦР продуктов показали, что полученные изоформы исследуемого фермента являются изоферментами, то есть

имеют различную генетическую детерминированность и, следовательно, функциональную значимость.

Практическая значимость. Выделение и получение в гомогенном состоянии препаратов изоферментов изоцитратлиазы из амаранта открывает перспективы их использования в научно-исследовательских работах для изучения кинетики ферментативной реакции, субъединичного строения фермента, термодинамических параметров реакций. Электрофоретически гомогенные препараты изоферментов ИЦЛ могут служить маркерами при проведении иммуноферментного анализа тканей организмов в стрессовых условиях [Волвенкин и др., 1999; Попов и др., 2000].

Применение препаратов изоферментов ИЦЛ позволит создать биосенсор для определения количества глиоксилата и изоцитрата в растительных и животных экстрактах.

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете ВГУ, при чтении лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии, различных спецкурсов. Кроме того, они находят применение при проведении практимумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изоцитратлиазная активность обнаруживается в проростках всех исследованных сортов амаранта: «Рыжик», «Кинельский», «Гигант», «Воронежский», «Желтый». Динамика активности и изоферментный состав изоцитратлиазы свидетельствует о важной роли энзима в функционировании глиоксилатного цикла, являющегося этапом глюконеогенеза, и фотодыхателыюго метаболизма в зеленых листьях, обуславливающего сериновый путь образования аминокислот.

2. Субклеточная локализация изоформ изоцитратлиазы в амаранте связана с глиоксисомально-пероксисомальной фракцией, а также с цитоплазмой клетки.

3. С помощью модифицированной схемы многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты из амаранта сортов «Рыжик» и «Кинельский». Получение гомогенной ИЦЛ1 и ИЦЛ2 позволило установить физико-химические и регуляторные характеристики этих энзимов. Значительные отличия свойств (рН, Км и др.) изоферментов изоцитратлиазы обуславливают их участие в разных физиолого-биохимических процессах.

4. Данные по определению нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-продуктов указывают, что изучаемые изоформы ИЦЛ являются изоферментами, т.е. генетически детерминированными белками. Профиль экспрессии генов /с/; и к12, осуществленный с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени, свидетельствует о корреляции с динамикой изоцитратлиазной активности в прорастающих семенах амаранта.

5. Разработана гипотетическая схема роли изоферментов изоцитратлиазы в регуляции метаболических процессов в амаранте. ИЦЛ] обеспечивает протекание глиоксилатного цикла, важнейшего этапа глюконеогенеза. ИЦЛт функционирует в процессе ацидоза, т.е. закислении, необходимом для эффективной мобилизации запасных жиров, и, кроме того, в фотодыхательном метаболизме зеленых листьев.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 14-ой и 15-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2010; 2011), на 7-й съезде Общества физиологов растений России международной научной школе «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Н. Новгород, 2011), на 10-й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы» (Воронеж, 2012), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2009,2010,2011,2012,2013)

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 13 публикациях - 9 статьях и 4 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (237 источников). Иллюстрационный материал включает 29 рисунков, 3 таблицы.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Объектами исследования в данной экспериментальной работе являлись прорастающие семена амаранта Amaranthus caudatus L. сортов «Рыжик», «Кинельский», «Гигант», «Воронежский», «Желтый», выращенные гидропонным способом при температуре 25°С и стареющие листья сорта «Рыжик», выращенного на опытном поле ВГАУ.

Определение активности изоцитратлиазы. Активность ИЦЛ (К.Ф. 4.1.3.1) определяли спектрофотометрическим методом на СФ-2000 (Россия) при длине волны 324 нм [Kornberg, Krebs, 1957].

Выделение н очистка фермента. Для очистки изоцитратлиазы из проростков амаранта разных сортов была использована следующая схема:

1. Гомогенизация материала. 2. Высаливание сульфатом аммония (NH^SOi. 3. Гель-фильтрация на сефадексе G-25. 4. Хроматография на ионообменнике ДЭАЭ-целлюлозе. Исследования проводились с использованием линейного градиента KCl (50- 150 мМ).

Определение содержания белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури [Lowry et al., 1951].

Содержание белка в высокоочищенных препаратах определяли по поглощению при 280 и 260 нм.

Электрофоретические исследования белков. Электрофоретическое исследование проводили по методу Девиса [Davis, 1994]. Растворы мелко- и крупнопористого гелей готовили, согласно рекомендациям Мауэра [Мауэр, 1971]. При определении гомогенности ферментов использовали методику окрашивания с нитратом серебра. Специфическое проявление изоцитратлиазы осуществляли при помощи модифицированного реагента Шиффа [Reeves, Volk, 1972].

Субклеточная локализация. Субклеточную локализацию определили с помощью дифференциального центрифугирования [Волвенкин и др., 1999].

Определение молекулярной массы нативного Фермента. Для исследования четвертичной структуры и определения молекулярной массы фермент пропускали через колонку с сефадексом G-150 [Детерман, 1970]

Определение молекулярной массы субъединии Ферментов. Для определения молекулярной массы ИЦЛ методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия пользовались детергенной системой, описанной Лэмли [Laemmli, 1970].

Выделение суммарной клеточной популяции РНК. Суммарную клеточную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [Chomczynski, Sacchi, 1987] Окрашивание геля производилось 0,1% водным раствором бромистого этидия.

Обратная транскрипция. Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы RevertAid M-MuLV (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям фирмы-производителя. В качестве затравочного использовался олиго-(с1Т)2о праймер. Для предотвращения деградации матриц РНК в реакционную смесь вносилось 20 ед. ингибитора РНКаз IRNasine [Okayama, 1987.].

Подбор праймеров. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из разных организмов. Поиск гомологичных последовательностей в геномах нематоды, прокариот и растений проводился с использованием базы данных NCBI (США, http://www.ncbi.hlm.nih.gov/). Для этого проводили выравнивание последовательностей с помощью программы AliBee - Multiple alignment Release 2.0 (http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html) с целью выявления наиболее консервативных участков.

Проведение полимеразной цепной реакции. Последующую полимеразную цепную реакцию [Епринцев и др., 2001] с ген-специфичными вырожденными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон,

Россия). Реакция ПЦР проводилась на приборах «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия).

Секвеиипование ПЦР-пподукта. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL («Beckman Coulter», США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом в ВНТК «Генной активности» ИБФМ РАН.

Проведение ПЦР в реальном времени. Для выяснения изменения уровня экспрессии генов icli и icl2 амаранта, проводили ПЦР-РВ на приборе DNA Engine® Thermal Cycler «Chromo4» (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I [Tzachi, 2003]. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов ИЦЛ с использованием программного обеспечения Primer3 [Rozen, Skaletsky, 2000]. Праймеры для ПЦР-РВ анализа были следующими: прямой - 5-TGYGGNCAYATGGGNGG-3'; обратный - 5'-DCTRCARTTRTANGC-3'.

Статистическая обработка данных. Опыты проводились в трех повторностях. Аналитическое определение для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. В таблицах приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента [Лакин, 1990; Чернышев, Стариков, 1998].

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ В ПРОРОСТКАХ АМАРАНТА

Изучение динамики активности изоцитратлиазы в проростках семян амаранта Amaranthus caudatus L. сортов «Рыжик», «Кинельский», «Гигант», «Воронежский», «Желтый» в течение 10 дней показало, что наблюдается ее индукция с первых дней прорастания, достигающая максимального значения уже на 3 сутки (рис.1 А). Активность ИЦЛ свидетельствует о функционировании глиоксилатного цикла, который обеспечивает конверсию запасных липидов в растворимые формы углеводов. К 10 суткам величина активности ИЦЛ снижалась, что говорит о снижении уровня запасных жиров в проростках семян. В условиях гетеротрофного питания в масличных растениях важную роль играет глюконеогенез, обеспечивающий мобилизацию запасных липидов. Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает корреляцию ее величины от этапа онтогенеза амаранта. В ходе исследования динамики активности изоцитратлиазы в онтогенезе амаранта сорта «Рыжик» было установлено, что активность фермента резко возрастала на 3 сутки, что связано с активизацией глиоксилатного цикла при прорастании, а так же гидролизом запасных веществ. Однако, к 8 суткам, когда запас питательных веществ уменьшался, величина активности ИЦЛ постепенно снижалась. В стареющих же

г

листьях происходило увеличение активности изоцитретлиазы. что связано с реутилизацией липидо-мембранных комплексов, для которой необходимо включение процессов глюконеогенеза (рис. IЬ).

<у*«м

Рис.1. Динамики акжвности изоцитретлиазы в проростках семян амаранга разных сорю» (А) и в ohioichck- амаранта copia «Рыжик»(Ь)

НЮФЕРМЕИТИЫЙ СОСТАВ НЦЛ

С помощью злектрофореза в 7.5% ПААГ с последующим специфическим окрашиванием на активноегь был проанализирован изоферментный состав и юннтратлиазы в семенах амаранта сортов «Рыжик», «Кннельский» и в стареющих листьях амаранга сорта «Рыжик». В семенах Зх-днсвных пророечков амараша было обнаружено по две и «»формы фермента с различной злеггрофорстической подвижное! МО (R, 0.27 и 0,31) (рис.3). В стареющих листьях амаранта бы.ю показано присутствие только одной формы фермеша (рис. 2). Причем значение et' мектрофорстичсской подвижности (0.27) совпадало с величиной R, меллсннодвижущсйся формы в проростках.

На нашей кафедре при работе с другими объектами были получены аналогичные результаты. Так. в семенах сои и щитках кукурузы так же обнаружены две нзоформы изошпраглиазы с различным значением R(: 0.28 и 0,44 для сои (Епринцеа и др.. 2010]; 0.25 и 0,29 для кукурузы [Епринцеа. Маслова, 2009]. В зеленых листьях данных объектов выявлено лишь но одной белковой полосе, причём значения их )лек1рофоретичсеких полвнжностей совпадали с мелленнодвнжущими формами в семенах. В корнях активность фермента была низкая.

г—~ чМр* |'ие. 2. Электрофоре грамма ИЦЛ. Специфическое

проявление 11Щ1 из Зх дневных проростков (I) и стареющих листьев (2) амаранта сорта «Рыжик»: Р -белковая полоса. F - фронт красителя.

»—1Н

I 2

СУБКЛЕТОЧНАЯ . ЮКЛ. ПК МШИ ШЦ

В проростках амзранга сорта «Кинедьский» субклеточную локалигацию изоцитратлназы определяли метолом дифференциального иентриф) гирования, в ходе которого выделили цитоплазматическую. глиоксисомальную. митохондриальную фракции. Как видно иг рисунка 3. активность ИЦЛ распределилась по фракциям неравномерно. Наибольшая активность фермента сосредоточена преимущественно в осадке, содержащем грубую фракцию микротелси.

Рис.3. Распределение активности Н11Л между фракциями, полученными п результате дифференциального центрифугирования.

Для изоцитратлназы и» проростков амаранта сорта «Рыжик» субклеточная локализация, определенная метолом дифференциального центрифугирования, носит аналогичный характер, отличаются только значения удельной аюивности фермента. Полученные данные позволяют предположить, что исследуемый фермент имеет преимущественно две изоформы. одна из которых имеет глноксисомальнуто локализацию, а вторая находится в цитоплазме.

ОЧИСТКА ИЮЦИГРАТЛНЛ1Ы

В ходе чстырйхстаднйной очистки изоцитратлиазм из 3-х-лневных проростков семян амаранта сортов «Кинсльский» и «Рыжик» были получены гомогенные препараты двух изоформ ИЦЛ. а из стареющих листьев сорта «Рыжик» - ферментативный препарат одной формы фермента. Из сорта «Кинсльский» удельная активность для первой изоформы ИЦЛ составила 0.7 К/мг белка, при этом степень очистки составила 35.3 раза: выход 5.3 %. Для второй изоформы удельная активность составила 3.1 ГУмг белка, а степень очистки 164.2 раз: выход 6.7 %. В ходе злюцнн получили 2 пика изоцитратлиазной активности, причем максимальная для одной из форм наблюдалась при концентрации 66 мМ КС!, а для второй - при 110 мМ хлорида калия.

Из проростков амарата сорта «Рыжик» также были получены ферментные препараты двух изоформ ИЦЛ Удельная активность для ИЦЛ| составила 3.4 Е/мг

белка, степень очисти 17,6 и выходом 10.7 Для вюрой и (оформи ИШЬ удельная активность составит 3.5 Е/мг белки, а степень очистки 18.6 рак выход 10,1%. В холе 1.1юцнн изоцитратлиазы тоже получили 2 пика ферментной иктивности. причём максимальная ».иония олной tu форм наблюдалась мри концентрации 62 мМ KCI, а второй - при 95 мМ KCI.

В результате очистки |'к>цитратлначы ит стареющих листьев амаранта copra «Рыжик» был получен фср*еншый iipciiapai олной июформы ИЦЛ с удельной активностью 1.7 |-Умг белка, при пом степень очистки составила 21.8 ра й; выход 5.4*. При очистке ИЦЛ бил I пик злюнин ферментативной активности при концентрации pací вора 66.4 мМ КО.

Результаты очисток представлены в табл. I.

Таблица 1

Очнстк'1 ПК. I hi ямармша (n=3,Р<0,05)

Объект Изо форма ИЦЛ Удельная активность. Е/мг Степень очистки Выход. %

llpopociKH амараига сорта «Рыжик» ИЦЛ, 3.51 18,57 10.10

ИЦЛ: 3.35 17.63 10.70

Проростки амаранта сорта «Кинельский» ИЦЛ, 3.07 164.20 6,70

ИШЬ 0.66 35.30 5.30

Стареющие листья амаранта copra «Рыжик» HIUli 1.74 21.75 5.40

Применение 4х стадийной очистки позволило получить препарана исследуемых июформ фермента в гомогенном сосюяиии. Для освобождения фермогтных препаратов ст ннзкомолскулярных веществ применяли гель-(фильтрацию на колонке с ссфадсксом 0-25. Наибольший вклад в получение высокоочинкнных июформ нюширатлиаты внесло применение ионообменной хромато1|>афин на ДОАЭ-целлюлоэе. При ионообменной хроматографии на Д')Д')-целлюлозе (|кгрмен1 десорбировали линейным градиентом концентраций от 50 мМ до 150 мМ КС1 в среде элюировапия.

ИССЛЕДОВАНИЯ НА гомогенность и активность очищенных препаратов ИЦЛ

Электрофорез в 7.5% 11ААГ с последующей окраской геля нитратом серебра показал гомогенность полученных из проростов амараига сорта «Кинельский» ферментативных препаратов, о чём свидетельствует наличие только одной белковой полосы в каждой пробе (рнс.4). Полосы после специфическою

проявления на активность ИЦЛ и окрашивания на белок совпадают и имеют для первой (|>ормы иг проростков ЯГ 0.31 и ИГ 0.27 - для второй.

Таким обра (ом было установлено. что в проростках амаранта присутствуют 2 формы фермента ИЦЛ( с КГ 0.31 и ИШЬ с КГ 0,27. поэтому можно утверждать, что полученные ферментативные препараты гомогенны.

l'nc.4. Электрофоре! на гомогенность (I) и специфичность (2) изошпратлиаэы из проростков амаранта copia «Кннельский». Р| - ИЦЛ; с Rf 0.27; Р: - ИЦЛ, с Rf 0.31 : F - фронт красители.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА И СУБЪЕДИНИЧНОЕ СТРОЕНИЕ ИЮЦИТРАТЛНЛШ

Для изучения четвертичной структуры белковой молекулы ИЦЛ нснотьюиалн методы гель-хроматот-рафии и электрофореза в присутствии денатурирующего агента - додецилсульфата натрия В результате гель-

хроматографии на колонке в-150 была определена молеку лярная масса двух форм изоцитратлиазы. Величина VI, натнвной молекулы ИЦЛ| из проростков амаранта сорта «Кинсльский» составила 134 кДа. значение М, ИЦЛ} - 165 кДа.

С помощью додецилсульфата натрия нативную молекулу ИЦЛ денатурировали, что обеспечило образование субъсдиииц белка. Результаты - электрофореза приведены на рис.5. Олектрофоретичсскис исследования позволили определить молекулярную массу каждой субъединицы, которая составила 32±2 кДа для ИЦЛ, и 39*1 кДа для ИЦЛ2 (и» проростков амаранта). Сопоставление с данными, полученными с помощью гель-хроматографии позволяет заключить, что обе формы изучаемого фермента состоят из 4-х субьеднниц. т. с. являются гэмотетра мерами.

1*нс.5. Определение молекулярной массы субъсдиниц ИЦЛ методом Рх-Ыа электрофореза:

I- ИЦП,: Н-ИЦЛ:; М - маркерные белки:

I- целлюла за(94,6 кДа); 2- бычий сывороточный альбумин (66.2 кДа); 3-яичиый альбумин (45 кДа); 4- карбоангидраза (31 кДа); 5- ингибитор трипсина (21.5 кДа); 6-

I M II

ли (оним( 14.4 кЛа): Р, - ИЦЛ, и Р:- ИЦЛ:(32 кДа и 39 кДа).

КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ИД

При изучении каталитических свойств двух изоформ ИЦЛ. выделенных из проростков амаранта, показано, что кинетика реакций подчиняете« уравнению Михазлиса-Мснтсна. Как видно из данных, приведённых на рисунке 6. значение К„ 1Ю изоцитрату лля ИЦЛ| из проростков амаранта сорта «Кннельский» составило 61.3 цМ.алля ИЦЛ;-81.4 мМ.

m 1

Рис. 6. Значение К„ но изоцитрату дли ИЦЛ| (А) и для ИЦЛ;(Б) hi проростков

амаранта сорта «Кинельский».

Дзя июиитратлиазы из проростков амаранта сорта «Рыжик» значение константы Михазлиса определяли по методу Лайнуивера-Нсрка. Полученная К„ для ИЦЛ, равна 45.5 (рис.7А). а для ИЦЛ; равна 62.6 |iM (рис.7Б).Получснныс результаты 1ю)в0.1яют заключить. что выделенные и очищенные до гомогенного состояния изоформы ИЦЛ обладают различным сродством к субстрату, а именно. ИЦЛ, обладает большим сродством к изоцитрату. чем ИЦЛ;.

Полученные результаты коррелируют с данными по другим объектам исследования. Так значение К„ по изоцитрату для Pinns pinea составляет 33 и M (Pinzauti cl al.. I982J. для £ coli при pH 6.8 и 7.3 • 0.018 и 0.062 мМ (Robertson. Reeves. 1986] соответственно, для полсолнечника - 0.032 мМ (Зсмлянухин и др.. 1984].

Рис.7. Значение К, но изоцитрату лля III Uli (А) и для HIUh(B) из проростков амаранта сорта «Рыжик».

определение рН-оптимума июцнтрлт.шлш 1П проростков амаранта Изучение влиянии концентрации ионов водорода на активность ИЦЛ из проростков амаранта проводили в трис-HCI 6>фсрс. в качестве субстрата использовали изошпрят. Исследования показали. что зависимость активности ИЦЛ от концентрации ионов водорода имеет ко локолооб разный характер (рис. 8А и 8Б). При этом оптимальное значение pH. при котором наблюдалась максимальная активность фермойia. для ИЦЛ, равно 7,5, а для ИШЬ - 6.0.

W

0.12

S0.08 1 0.06 2 0.04 £ 0.02 < 0

5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 1-1ЩЛ; 2-ИЦЛj

5.5 6 6,5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 1-1ЩЛ, 2-11ЦЛ) Р"

Рис. 8. Зависимость активности ИЦЛ, и ИЦЛ; от рН среды в пророет ках амараи га сортов «Кинельский» (А) и «Рыжик» (Б)

Полученные нами результаты согласуются с литературными данными. Оптимум рН для изоциграт.шазы. выделенной из различных источников, как правило, равен 7.5. Так. максимум активности июцитратлиазы семядолей 1мрмм находится в облает рН 7.0 - 7.5 и зависит от природы используемого буфера [Умксшпт е1 а1., 1980). При изучении рН оптимума июцигратлиазы из куколок махаона наибольшую активность изоиитратлиаза проявляла в интервале рН 7.4 -7,7. Для июцитратлиазы из шитка кукурузы показано, что максимальная активность наблюдается при рН 7.4 - 7.5 по лиазной реакции и при рН 7.0-7,1 по синтазной реакции (Еприинсв. Попов. 1999]. Изоиитратлиаза из £ соЧ имет оптимум рН 7,3 |Ма1ш)ап « а!.. 2005).

РЕГУ.ШТОРНЫЕ СВОЙСТВА lilt!

Регуляториое влияние ноиив металле» на шоформы шиширатлиазы из проростков амаранга

Результаты исследований по изучению влияния ионов металлов на ак!нвность изоформ июцитратлиазы из проростков амаранта представлены на рисунке 9. Было выявлено, что ионы К* в концентрации 5 мМ оказывали незначительное ннгибируюшее действие на обе формы фермента из проростков амаранта сорта «Кинельекнй». Ионы Мп"* значительно тормозили активность только первой формы ИЦЛ (в 5 раз), на вторую оказывали существенное влияние, в 2 раза увеличивая се активность. Кроме того, установлено, что ионы Mg * активировали почти в 2 раза только одну форму - ИЦЛ„ ИЦЛ; они значительно

ингибировали (рис. 9Л). Т.е. ИЦЛ| является Mg-зависнмым ферментом, тогда как ИЦЛ: активировалась ионами Мп , т. о. данная форма фермента являлась Мп-зависимой. Изучено влияние ионов металлов на активность июформ изоинтратлиазы и» проростков амаранта сорта «Рыжик». В холе проведенного исследования было выявлено, что ионы Са?*: Fe:": Cu;Zn;* окатывали шннбируюшее действие на обе формы фермента. Покатано, также активирующее .действие ионов Mg:* на ИЦЛ|. и анало! нчное влияние ионов Мп"* на ИЦЛ; (рис.ЧВ). При этом ионы Mg"' окатывали ишибнрующее влияние на активность ИЦЛ;. а ионы Мп3' - на ИЦЛ|.

S "

а 0.Н

0.1

0.05 О

Koinp Mutt KCI M|C1i

hjk

' kotn? C«ci. MnCI; KCI m«C1; f«C!; CaSO,

-пцл, «-liai.

■ - ИЦЛ,; B - ИЦЛ». Рис.9. Влияние ионов металлов на активность итоформ изоцитрттлиазы иг проростков амаранта сортов «Кииельский» (Л) и «Рыжик» (К).

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ IIЮЦИТРАТЛИА1Ы

Выделение суммарной клеточной иопу.тмиин PIIK

В результате применения оптимизированной методики выде.'кння с использованием фенол-хлороформной экстракции было проведено выделение суммарной кдеючной РНК из семян амаранта. В холе работы в качестве хаотропного агента был использован гуаннлин-изотиоинанат. Применение данного соединения позволило получить высокоочншенные препараты не деградированной РНК из растительных клеток, что было установлено путем проведения аналитического злектрофореза в lit агарозном геле (рис. 10).

— JSSpTHK

— liSpTHK

Рис. 10. Электрофорез суммарной клеточной РНК из семян амаранта, в агарозном геле в присутствии бромистого тгидия.

Обращай iранскрннцнм

Для синтеза первой цепи комплементарной ДИК использовхтась рекомбинантная обратная транскриптам вируса Moloney лейком мышей M-MuLv. Данный фермент состоит только из одной субъединицы и «роявляет 5'—3" праймер-зависимую поли ме разную активность, эффективную только в отношении матриц PIIK |Piques el. al.. 2009]. В качестве затравочного праймера использовался влинНЛ-)» праймер.

Применение данного праймера позволяет избирательно псэсвссти в форм> ДНК только молекулы информационной РНК. представляющих собой транскрншы работающих генов (рис. II). Полученные в ходе обратной транскрипции продукты использовались далее для проведения нолимеразной ценном реакции.

MOO II н

Рис. 11. Продукты обра moi транскрипции суммарной клеючной РНК семян амаранта с использованием ревертазы M-Mulv и олиго-(<П")й1 500 11 " праймера.

Но.1нм1'ра1иаи ценная рсаьзшн

Обращая транскрипция выделенной РНК и последующий ПЦР-аиализ кДНК с вырожденными праймерами для генов нзоцигратлиазы показан) наличие двух полос на гель-электрофорезе (рис. 12). что свидетельствует об экспрессии этих генов.

Анализ банка данных GcneBank показа!, что в геноме амараша июцитратлиаза кодируется двумя генами, расположенными в разных хромосомах.

Полученные результаты показывают, что в геноме амаранта, на стадии прорастания семян экспрессируэотся одновременно два гена нзоцигратлиазы.

Отпситмо • ООО .Коюниппр -Исток-Tlcutv цифром*. с готового ори; ИИ4» MIK1X 1ши Jé l«lî I ol 10 О» »13 г. Гири 100 та tip-г Рсмимэими. M

t-.-nutl: V uafc•• null lu

Рис. 12. Резу льтаты нолимеразной цепной реакции на матрице кДНК. выделенной из проростков амараша сорта «Рыжик» на 3 день прорастания. М - маркеры: I

1 m

-продукты амплификации с вырожденными праймерами.

Определение hvk.icoih.ihoh последовательности продуктов, полученных mcio iom III IP

Так как при проведении ПЦР анализа нами использовались вырожденные нраймеры. подобранные на основе сравнения аминокислотных последовательностей п белковых молекулах ИЦЛ из организмов различных таксономических групп, возникла необходимость достоверно убедиться, что полученные ПЦР-продукты являются участками разных генов кодирующих изонитратлиазу. Дтя этого подученные ПЦР-продукты экстрагировали из геля по методике, описанной в работе Тзаки |Tzachi. 2003].

Очищенные нуклеотилные последовательности ссквсинровали и сравнивали с генетической базой данных. Данные шжазалн. что ампликоны имеют гомологию с мРИК генов изонитритлиазы из A. lhaliana. Так. для ампликоиа с длиной 339 п.н. была установлена гомология с геном íc7| арабилопсиса. которая составила 53% (рис. 13).

...... ■ • Нм, > Н », « « , а*. • М * * « (♦

K1I fit «ГШТСССАвАГАГиТГТООАтеАШГИСЫМ-'СТОАТСТ^иТвЖАГОГШТА *«ti in ■ :иагсАггт»1»гыт»»ет»»т»*'т»иг1тлкгг-1иггмпс»»гч

sell Kit Атк^вдд^АиддстесдАодсАсг^кклгстсистдсддлчсгс«!: *,ii iíii тсжтълАспктсАмлтаьттлгтшж-"твдт.ткттмАтс-лттеде

ich щи отгсп?Лгтт*«етгсс+ст-жт«м~»в*т:—де дидяк.ттг дгтт - д ■•il iii»i ьтгдгт irnrt»rr»TTctî«To»mc'.tf«*Ti:«<*MTe«tii«Tf.frATt»

ICH ■ • ->4i ттсж«мтт«ст1*^«тат1т--т«№01^-тжт1.4г«гттс':ееотт

[17:, ТТГС«Т0ДТТ»ГТГв-МТСГЫ|ТДТс«ТГЖТ1^СДЛв*.Т1САТ»фи|ССТГЬСТСАТв

t im ♦ »im I • »w и -, I • t » -m. •* ,» ♦ ICH i:m ТСГАТСГТОАТ^ I. ; i ,ii.i.iiifcWfcrrTt^^-x^m^4<Tii*-oo»Cdt<iiTq „Ii l»Ml TAfATB АвАВf».T.' П'ТП1ATTOAQfCA^fW-TATWArf АДДСГДСAAftCАС САД S

IM .. ml-niI ., I .„,мм. *-*• m » , ,

11(1 L I ЛТ«ТГП<^ТТАТСТ1аАЫЛйАТДГДДДСД-^А^ДСД'-,СДТГГ|ГИ«ТТ^Д сдгтттзс-«ii nui m<nT»ti!T^TAinrr<rAAArAiiTiAAAirAATrira»«eriAtrAATCT-ic

toi lttcait

Mil I S VI I T A' 'lu

Рис. 13. Схема нуклсотидных последовательностей гена ici, A. lhaliana (nm_113067.3) и ампликона с длиной 339 п.н. с указанием соответствия между нуклеотидами. icii - фрагмент нуклеотндной последовательности гена id/ А. lhaliana (nm_113067.3). sei/1 - нуклеотнлная последовательность ампликона. полученного с вырожденными праймерами для июцитратлиазы. длиной 339 п.н.

Аналш резудыатов сравнения второго продукта ПЦР с вырожденными праймерами для и юцитратлиазы показал, что его гомология с геном ici; A. lhaliana (ab442085.i) меньше, чем для первого амликона. и составляет всего 36% (рис. 14).

Полученные данные свидетельствуют, что в ходе амплификации с вырожденными праймерами были получены ампликоны с мРНК двух генов июцитратлиазы. имеющих гомологию с нуклеотилными последовательностями генов ИЦЛ A. lhaliana. аннотированных в СепсВапк. Следовательно, при прорастании семян амаранта зке пресс ируются два гена, колирующих

изоцитратлиизу, -по указывает на дифференциальную генетическую детерминацию двух июформ исследуемого фермента.

»«11 ij

iii

ми* » • • • « . «• •*» » M » ■ ■» • »•« » »» »

»rtl If» .TTTKTrCiriKCTM™TMUT«ttï«ai(KÎ*M<CC»A»MT«TTO-WT

r*«J C*l> «TCe-»DÎ*mi<CTa»--lttTCWWT

■ >u mil - CicIeTTTT^ÎIoîeWTTiiorr»« ^»««CIÇijJT MTKT

H4t .тметемтмк nutTKTfKfTcu»«»u(*i»r*- -CTUKTtumT

»•M IIMI «тттик»гмч«а îu*A

Щ1 <i»°l - »полмлтсс» fcoc-ге ««c cj^orre ТС Ai.: — -

• •I* |)lli ...... .HMUUI .»gT«mcT«fWB

••«i o»Ti «ткни iMitfTCleirfatifawremwictTuiHituca-CTm

mu 1*111 ailwû^f*m»n«ni*û<.»(*.wt»«tk *.*j I««, «IIIII..............с*—gееттст—rrr

Рис. 14. Схема иуклеотндных последовательностей iciia ich A. lhaHana (AB442085.I) и амнликона с длиной 447 п.н. с указанием соответствия между иуклеотидами. ici j - фрагмент нуклеотндной последовательности гена ici» А. lhaliana (NM_113067.3). seq: - нуклеотидная последовательность ампликона, полученного с вырожденными нраймерами для июцитратлиазы. длиной 447 н.н.

Изменение экспрессии ichub нзоцнтрат.тмазы в про рос i ках семян амаранта сорта «Рыжик»

Для опенки количественных показателей интенсивности работы генов кодирующих изофермешы июцитратлиазы использовали метод ПЦР в реальном времени с использованием и н те р кал и ру ю щс го красителя Sybr Green. Данный метод позволяет оценивать результаты работы гена. т.е. концентрацию мРНК. на основе анализа кДНК |Tzachi. 2003). Для этого суммарную РНК. выделенную из различных органов растения, зксноинрусмых в разные временные периоды, подвергали обратной транскрипции с целью получения кДНК.

11оказа1ю. что на 2-е сутки в проростках амаранта зкспрсссня генов достигла максимального значения, и величина относительных единиц экспрессии составило 1,53 сд. Далее уровень экспрессии постепенно снижался, и к 5-м суткам достиг мшшмилызого -значения с величиной относительных единиц экспрессии равной 0.4 ед.. что в 4 раза меньше, чем значение на 2-е сутки. Затем наблюдалось небольшое повышение уровня экспрессии генов, и к 9-м суткам ее значение снизилось в 2,3 раз по сравнению с максимальным значением и величина относительных единиц экспрессии равна 0.7 ед. (рис. 15).

Кроме того, параллельно проводили измерение активности ИЦЛ в течение всего исследуемого периода (рис. I). Так, динамика активности ИЦЛ в проростках амаранта в течение 10-ти дней имела характерную колоколообразную кривую с

нсршшюй на 2-3-и сутки. Эта ланнмс хорошо коррелировали со значением относительных елинии экспрессии i снов ici.

Изучение динамики активности изоцигратлиазы в проростках амара!гта АпюгашИиа саш1ашт 1_ пяти сортов в течение 10 дней показало, что она индуцируется с первых дней прорастания и достшаст максимального значения уже на 3 сутки. Вотрастание активности ИЦЛ свидетельствует о функционировании глноксилатного никла. К 10 суткам величина активности ИЦЛ постепенно снижалась до минимальных значений.

Анализ изоферментного состава изоцигратлиазы в семенах исследуемою объекта показал, что в Зх-дневных проростках амаранта было обнаружено две ин>||к>рмы фермента с различной злсктрофорстичсской подвижностью 0.27 и 0.31). В холе исследования субклеточной локализации изоформ изоцигратлиазы метолом дифференциальною центрифугирования установили, что наибольшая активность фермента была сосредоточена преимущественно в осадке, солержашем грубую фракцию микротелец. Вы ю выявлено, что изоцитратлиаза из проростков амаранта имеет лве изоформы. одна из которых имеет глиоксисомазьную локализацию, а вторая находится в цитоплазме. Ранее сообщалось о субклеточной локализации и активности ИЦЛ в кукурузе и сое [Г>с1кт. Уо<1кт. 2007; Рпринпев. Маслова. 2009; ({принцев и лр.. 2010]. Согласно полученным данным, предполагается, что активность изонитратлиазы в цитонлазматической фракции связана с погрешностями в методике, в частности с частичным разрушением ор|аноилов в процессе их разрушения. Ко мнению авторов, изоцитратлиаза сосредоточена, главным образом, в глиоксисомальной и пероксисомалыюй

фракциях. Причем, я момент смсыы тми а питания растений изоцитратлиа зная активность обнаруживается как в глиоксисомах (глиоксилатный никл), так и в пероксисомах (фотодыхатс.зьиый метаболизм). Интересно отметить, что профиль экспрессии гсиок. обеспечивающих глиоксисомазьную фхнкцию резко у меньшается, а наблюдается увеличение фотоды хател ьной деятельности пероксисом | Игамберлиев. 1988; Колесников. 19851.

Применение 4-х сталийной схемы очистки позволило получи 1ь изоформы изоцигратлиазы в гомогенном состоянии из проростков амаранта сортов

ч о

£ 2

Риг. 15. Относительный уровень j с) экспрессии генов изонитратлиазы в СУТКИ проростках амаранта.

»АК.ИОЧКННК

«Кинельский» и «Рыжик». Важную роль в получении высокоочишенпого препарата играла ионообменная хроматография на DEAE-цсдпюлозс. Использование линейного |ралиснта КС1 позволяю повысить эффективность очистки и выход фермента. Интересно, что удельная активность для первой июформы ИЦЛ ит проростков амаранта сорта «Кинельский» равнялась 0,7 Е/мг белка, при этом степень очистки составила 35,3 para; выход 5,3*, .тля второй июформы удельная активность составила 3,1 Е/мг белка, а степень очистки 164.2 par; выход 6.7%. Для первой июформы изоиитратлиазы иг проростков амаранта сорта «Рыжик» значение удельной активности 3,4 Е/мг белка, степень очистки 17.6 и выходом 10,7%. Для второй июформы ИЩЬ удельная активность составила 3.5 Е/мг белка, а степень очистки 18.6 par, выход 10,1%. Близкие результаты очистки были получены из сои [Епринцеа и др.. 2010] и кукурузы (Елриниев, Мае.юна. 2009]. Гак параметры препаратов ферментов из сои вьетнамскою сорта «DT-84» составили: удельная активность ИЦЛ, 2.5 Е/мг белка, при этом степень очистки 62,5 раза; выход 9.8%. Вторая изоформа имела удельную активность равную 3.6 Е/мг белка, степень очистки 89 раз и выход 10.9% (Елриниев и др.. 2010].

Результаты исследования физико-химических свойств выделенных нюферментов сведетельствуют об их отличиях. При этом установлено с помощью гель-хроматографии и денатурирующего электрофореза (Ds-Na - электрофореза) различие в величинах молекулярной массы нативных изоформ. Так величина М, нативной молекулы ИЦЛ| из проростков амаранта сорта «Кинельский» составила 134 кДа. значение Мг ИШЬ - 165 кДа. Сопоставляя значения молекулярной массы каждой субъсдиницы. которые составили 32*2 кДа ,гтя ИЦЛ, и 39±1 кДа для ИШЬ. и нативной молекулы можно заключить, что обе формы изучаемого фермента состоят из 4-х субьединиц. т. е. являются гомотетрамерами.

Сравнительное исследование физико-химических и регуляторных свойсгв ИЦЛ показало, что основные характеристики изучаемого фермента из проростков амаранта мало отличаются по своим значениям от ИЦЛ дру гих организмов.

M оле куля рно-биологические методы позволили провести идентификацию генов icli и ici; и исследовать их экспрессию.

Установлено, что в суммарной вытяжке РНК обнаруживается две мРНК генов июциратлиазы. Выявлена их гомология с генами ici, и ici; A. lhaliana.

Из литературных данных известно о наличии как минимум двух генов, кодирующих изоцнтратлназу, у организмов различных таксономических групп. Например, в геноме Saccharomycts cerevisiae два гсиа - icli, находящийся в 5 хромосоме и ici;, локазизованный в хромосоме 16 [Fernandez et al.. 1992]. Ген icl¡ кодирует июцигратлиазу. которая функционирует в глноксилатном цикле и отвечает за образование сукцината и глиоксилата из июцитрата. Геи ici; ответственен за синтез фермента, который находится в мигохонлриалыюм матриксе и обеспечивает работу метилцитратного цикла, катализируя превращение

2-метилцитрата и еукцинл и глиоксилат (Luttik et. ai.. 20001- В геномах растений Glycine max L. | Епринцев и др.. 2010). Zro mays L. [(-'принцев. Маслова. 2009]. Arabidopsis ihaliana |Guo et. al.. 2004) и других так же обнаружены гены июнитратлиазы. расположенные в различных хромосомах.

Изменение уровня экспрессии генов ici в проростках амаранта показало корреляцию с динамикой активности И1Ц1 при прорастании семян амаранта.

Таким обратом, анализ результатов проведённого исследования позволяет заключить, что изонитратлиаза в проростках амаранта представлена двумя изоферментами. существенно различающимися по важнейшим свойствам.

IIa основании результатов, полученных в данной диссертационной работе, ратработаны гипотетические схемы участия нэоферменюв нюцнтратлиазы в регуляции метаболических процессов в прорастающих семенах амаранта, в зеленых листьях и в стареющих листьях (рис. 16).

м< Таам* аараш

д «г 1 1 nttC 1 ЩИ "7 ItMaaipat

\ Лапа. С.» V/

M Шип А

C>K«Mi j Угммы

Ma1'

I .1.U.I * 3

ЯмХ"/

о

■ ■ Гни*

Ом

a i l у шв/щм

Г \ J

VafNMf Mnvi

1'ие. 16. Гипотетическая ехема роди изо ферментов изопитратлиазы в регуляции метаболических процессов в прорастающих семенах (Л), в зеленых листьях (К) и в стареющих листьях амаранта (В).

Обозначения: < ' - активация: ' • транскрипция генетической информации ^ - ишибироваине транскрипции гена

В прорастающих семенах амаранта ИЦЛ1 обеспечивает функционирование глиоксилатного цикла, являющегося этапом глюконеогенеза, т.е. обеспечивает мобилизацию запасных липидов (рис.16А). Кроме того, наблюдается экспрессия гена icl2, обеспечивающего синтез внеглиоксисомальной формы ИЦЛ2. Данный изофермент с помощью синтазной реакции обеспечивает закисление (ацидоз), необходимое для эффективной работы липаз, что очень важно для повышения интенсивности мобилизации запасных липидов [Епринцев, Маслова, 2009].

В зеленых листьях амаранта в условиях автотрофного питания наблюдается полное ингибирование функционирования глиоксилатного цикла, однако, экспрессия гена ich обуславливает образование внеглиоксисомальной формы ИЦЛ2, которая обеспечивает метаболизм двухуглеродных соединений в фотодыхании, в частности, в протекании серинового пути, являющегося важнейшим источником в синтезе серина и глицина (рис.16Б). В стареющих листьях амаранта обнаружена только одна изоформа - ИЦЛЬ которая участвует в функционировании глиоксилатного цикла. Индукция ГЦ в стареющих листьях, по-видимому, обеспечивает реутилизацию липидной фракции клеточных мембран. Глюконеогенез трансформирует липиды в растворимые формы органических веществ, которые выводятся из стареющих листьев (рис. 16В).

ВЫВОДЫ

1. Изучение динамики активности ИЦЛ из проростков амаранта пяти сортов показало, что максимальное значение активности фермента наблюдалось на 3 день прорастания и, вероятно, связано с интенсификацией функционирования глиоксилатного цикла, являющегося необходимым этапом глюконеогенеза при мобилизации запасных жиров.

2. Электрофорез в ПААГ с последующим проявлением на специфичность изоцитратлиазы выявил две молекулярные формы фермента, вероятно участвующие в глиоксилатном цикле и в ацидозе цитоплазмы, необходимом для гидролиза запасных липидов семян.

3. Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы выявило, что одна изоформа имеет глиоксисомальную локализацию, а вторая представлена в цитоплазме.

4. С помощью очистки получены электрофоретически гомогенные препараты ИЦЛ из сорта «Кинельский» и «Рыжик». Удельная активность для первой изоформы из сорта «Кинельский» равнялась 0,7 Е/мг белка, при этом степень очистки составила 35,3 раза; выход 5,3%, для второй изоформы удельная активность составила 3,1 Е/мг белка, а степень очистки 164,2 раз; выход 6,7%. Для первой изоформы изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Рыжик» значение удельной активности 3,4 Е/мг белка, степень очистки 17,6 и выходом

10,7%. Для второй изоформы ИЦЛ; удельная активность составила 3,5 Е/мг белка, а степень очистки 18,6 раз; выход 10,1%.

5. Данные по изучению pH-оптимума показали, что максимальная активность для ИЦЛ1 из проростков семян амаранта обоих сортов - при pH 7,5; для ИЦЛ2 -при pH, равном 6.

6. Для изоформ изоцитратлиазы из проростков амаранта характерна четвертичная структура, так как они представляют собой гомотетрамерные белки, причем масса субъединиц составила 32±2 кДа для И1 (Л) и 39±1 кДа для И! ЦЬ.

7. Выявленные кинетические свойства (Кт) и регуляторные характеристики (рН-оптимум) форм изоцитратлиазы свидетельствуют о высокой степени различия между изоформами ИЦЛ1 и ИЦЛ:, что указывает на их различную генетическую детерминированность.

8. Методом ОТ-ПЦР анализа, с использованием вырожденных праймеров к генам изоцитратлиазы, были идентифицированы две мРНК изоцитратлиазы в семенах амаранта. Кроме того, установлена степень гомологии ампликонов, с генами ich и ich А. thaliana, что может свидетельствовать о наличии двух генов исследуемого фермента в геноме амаранта.

9. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени установлена зависимость уровня экспрессии генов изоцитратлиазы от этапов онтогенеза. Максимальный уровень экспрессии генов icl наблюдался на 2-е сутки, что обусловлено интенсивной мобилизацией запасных липидов через глюконеогенез. Низкий уровень транскрипции исследуемых генов связан с переходом растений к фотосинтетической активности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Регуляция экспрессии изоцитратлиазы в семядолях сои на этапах прорастания семян / Т.В. Лыкова, М.В. Зайчикова, A.B. Сальников [и др.]// Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб науч. работ. -Воронеж, 2010.-Вып. 12.-С. 137-141.

2. Куен Ч. Т. X. Физико-химические и регуляторные свойства изоформ изоцитратлиазы из растений / Ч. Т. X. Куен, М.В. Зайчикова, A.B. Сальников // Биология - наука XXI века: сб. тез. 14-й Междунар. Пущинской шк.-конф. молодых ученых. - Пущино, 2010. - Т. 1. - С. 67.

3. Активность и изоферментный состав изоцитратлиазы в семенах амаранта разных сортов / A.B. Сальников. А.Т. Епринцев, А.М. Хаба [и др.] // Биология -наука XXI века: 15-я Междунар. Путинская школа-конф. молодых ученых, Пущино, 18-22 апр. 2011 г.: сб. тез. - Пущино, 2011. - С. 89.

4. Субклеточная локализация изоферментов изоцитратлиазы, идентификация генов ich и ich и их экспрессия в СЗ- и С4- растениях / А.Т. Епринцев, A.B. Сальников, Ч.Т.Х. Куен [и др.] // Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий: 7-й Съезд О-ва физиологов растений России, 4-10 июля 2011 г. Н. Новгород: Инновации в биологии для развития

биоиндустрии сельскохозяйственной продукции: Междунар. науч. шк.: материалы докл. Ч. 1. - Н. Новгород, 2011. - С. 238-239.

5. Субклеточная локализация изоформ изоцитратлиазы в разных сортах амаранта / A.B. Сальников. A.M. Хаба, Т.В. Лыкова [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион. сб. науч. работ. Выи. 13. -Воронеж, 2011.-С. 147-151.

6. Сальников, А. В. Получение ферментативных препаратов из семян амаранта / A.B. Сальников. А.Т. Епринцев, А. М. Хаба // Актуальные проблемы профессионального образования: подходы и перспективы: материалы 10-й Междунар. науч.-практ. конф. - Воронеж, 2012.

7. Хаба А. М. Распространение изоцитратлиазы и ее физиологическая роль / А. М. Хаба, A.B. Сальников. А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2012. - Вып. 14. - С. 22-29.

8. Изоферментный состав изоцитратлиазы на разных этапах онтогенеза амаранта / A.B. Сальников. A.M. Хаба, И.О. Обоймова [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2012. - Вып. 14. - С. 178-183.

9. Ионообменная хроматография - необходимый этап для разделения изоферментов глноксштатного цикла / A.B. Сальников. J1.A. Мирошниченко, A.M. Хаба [и др.] / Сорбционные и хроматографичеекие процессы. - Воронеж, 2012. - Г. 12, вып. 6.-С. 989-997.

10. Субклеточная локализация изоферментов изоцитратлиазы в растениях / A.B. Сальников. A.M. Хаба, A.C. Махмуд [и др.] // Вестник Воронежского государственного университета. Сер. Химия. Биология. Фармация. - Воронеж, 2013.-№ 1,-С. 162-165.

11. Очистка изоформ изоцитратлиазы из проростков амаранта и определение субъединичного строения / A.B. Сальников. A.M. Хаба, Е.А. Небольсина [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2013. -Вып. 15.-С. 176-181.

12. Экспрессионная регуляция генов малагдегидрогеназы в амаранте сорта «Харьковский» при засолении / А. М. Хаба, О.С. Федорина, A.B. Сгшьников [и др.] // Вестник Воронежского государственного университета. Сер. Химия. Биология. Фармация. - Воронеж, 2013. - № 2. - С. 88-90.

13. Изоферменты изоцитратлиазы и их ро ль у организмов разного уровня организации / А. Т. Епринцев, A.B. Сальников. A.M. Хаба [и др.] // Успехи современной биологии - Москва, 2013. - Т. 133, № 6 - С.531-544.

Работы №9, 10, 12, 13 опубликованы в изданиях, редомендованных перечнем ВАК.

Отпечатано в ООО «Копи-иентр «Исток» Печать цифровая, с готового оригинал- макета. Заказ №17463 от 20.11.2013 г. Тираж НЮ экз. Пр-т Революции. 5S Тел. 473 261-49-90 E-mail: s_Oink@mail.nj

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сальников, Алексей Владимирович, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «Воронежский государственный университет»

На правах рукописи

04201 452797 Сальников Алексей Владимирович

ИЗОФЕРМЕНТЫ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ ИЗ АМАРАНТА: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, РЕГУЛЯЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ

/с/, И 1С¡2 И ИХ ЭКСПРЕССИЯ

Специальность 03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Епринцев А. Т.

Воронеж 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................. 7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................13

1.1. Особенности метаболизма нетрадиционной культуры Амаранта..........13

1.1.1 Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта.......13

1.2. Глюконеогенез........................................................................17

1.2.1. Общая характеристика глюконеогенеза...................................17

1.2.2. Глюконеогенез в растениях...................................................................21

1.2.3. Глюконеогенез у животных...................................................................23

1.3. Глиоксилатный цикл.......................................................................................24

1.3.1. Роль глиоксилатного цикла...................................................................24

1.3.2. Распространение глиоксилатного цикла..............................................27

1.3.2.1. Распространение глиоксилатного цикла у микроорганизмов, низших растений и грибов..........................................................................27

1.3.2.2. Функционирование глиоксилатного цикла у высших растений........................................................................................................29

1.3.2.3. Глиоксилатный цикл в тканях животных....................................31

1.4. Субклеточная локализация изоцитратлиазы...............................................33

1.5. Изоферментный состав изоцитратлиазы......................................................34

1.6. Характеристика изоцитратлиазы..................................................35

1.6.1. Выделение и очистка изоцитратлиазы из различных организмов...35

1.6.2. Молекулярная масса и субъединичное строение........................36

1.6.3. Кинетика изоцитратлиазы.....................................................38

1.6.3.1. Константа Михаэлиса...................................................38

1.6.3.2. Влияние ионов металлов на активность ИЦЛ......................38

1.6.3.3. Синтазная реакция.......................................................40

1.6.3.4. Регуляция изоцитратлиазы.............................................40

1.6.3.5. Оптимум рН изоцитратлиазы..........................................42

1.6.4. Механизм действия изоцитратлиазы.......................................43

1.6.5. Изоферменты...................................................................44

1.7. Молекулярные аспекты регуляции ИЦЛ.....................................................45

1.7.1. Экспрессионная регуляция изоцитратлиазы......................................45

1.7.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ИЦЛ............................47

1.7.3. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы.............................................................................49

1.7.4. Эволюция ферментов глиоксилатного цикла.....................................51

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................54

2.1. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ..........................................................................................54

2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................55

2.2.1. Объекты исследования..........................................................................55

2.2.2. Методы исследования............................................................................55

2.2.2.1. Определение активности изоцитратлиазы...................................55

2.2.2.2. Выделение и очистка фермента........................................56

2.2.2.3. Определение содержания белка.......................................56

2.2.2.4. Электрофоретические исследования белков...............................57

2.2.2.4.1.Определение гомогенности ферментов.........................58

2.2.2.4.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы.....................58

2.2.2.4.3. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов......................................................................58

2.2.2.5. Субклеточная л окал изация..............................................59

2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента.........59

2.2.2.7. Исследование кинетики и регуляции ИЦЛ.........................60

2.2.2.7.1. Определение константы Михаэлиса...........................60

2.2.2.7.2. Определение рН оптимума изоцитратлиазы..................60

Л Л Л П Л тч ТХТТТТ /"А

¿./..¿./.з. гегуляция ИЦЛ......................................................60

2.2.2.8. Идентификация генов /с// и ю12 и их экспрессия..................61

2.2.2.8.1. Выделение суммарной клеточной популяции РНК............61

2.2.2.8.2. Проведение обратной транскрипции...................................61

2.2.2.8.3. Подбор праймеров..................................................................62

2.2.2.8.4. Проведение полимеразной цепной реакции........................62

2.2.2.8.5. Секвенирование ПЦР-продукта...........................................63

2.2.2.8.6. Проведение ПЦР в реальном времени................................63

2.2.2.9. Статистическая обработка данных..............................................64

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................................................65

2.3.1.Динамика активности изоцитратлиазы.....................................65

2.3.1.1. Динамика активности изоцитратлиазы в проростках амаранта..............................................................................65

2.3.1.2. Динамика активности изоцитратлиазы в онтогенезе амаранта сорта «Рыжик»..........................................................66

2.3.2. Изоферментный состав ИЦЛ................................................67

2.3.2.1. Изоферментный состав ИЦЛ в проростках амаранта.............67

2.3.2.2. Изоферментный состав ИЦЛ в стареющих листьях амаранта..............................................................................69

2.3.3. Субклеточная локализация ИЦЛ............................................70

2.3.4. Очистка изоцитратлиазы из исследуемых объектов.....................72

2.3.4.1. Очистка изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Кинельский».......................................................................72

2.3.4.2. Очистка изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Рыжик»..............................................................................74

2.3.4.3. Очистка изоцитратлиазы из стареющих листьев амаранта сорта «Рыжик»..............................................................................76

2.3.5. Исследования на гомогенность и активность очищенных препаратов ИЦЛ........................................................................77

2.3.6. Молекулярная масса и субъединичное строение изоцитратлиазы...79

2.3.7. Кинетические свойства ИЦЛ................................................81

2.3.7.1. Определение константы Михаэлиса ИЦЛ из проростков амаранта сорта «Кинельский»...................................................81

2.3.7.2. Определение константы Михаэлиса ИЦЛ из проростков амаранта сорта «Рыжик».........................................................83

2.3.7.3. Определение рН оптимума изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Кинельский»...................................................85

2.3.7.4. Определение рН оптимума изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Рыжик».........................................................86

2.3.8. Регуляторные свойства ИЦЛ.................................................87

2.3.8.1. Регуляторное влияние ионов металлов на изоформы изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Кинельский»...........87

2.3.8.2. Регуляторное влияние ионов металлов на изоформы изоцитратлиазы из проростков амаранта сорта «Рыжик»..................88

2.3.9. Идентификация генов изоцитратлиазы.....................................90

2.3.9.1. Выделение суммарной клеточной популяции РНК...............90

2.3.9.2. Проведение обратной транскрипции.................................91

2.3.9.3. Проведение полимеразной цепной реакции........................93

2.3.9.4. Определение нуклеотидной последовательности продуктов, полученных методом ПЦР.......................................................94

2.3.9.5. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках семян амаранта сорта «Рыжик».................................................98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................100

ВЫВОДЫ..................................................................................107

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ................................109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АМФ - аденозинмонофосфат

АТФ - аденазинтрифосфат

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ГЦ - глиоксилатный цикл

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - дитиотрейтол

ДЭАЭ - диэтиламиноэтил

ИЦЛ - изоцитратлиаза

кДНК - комплементарная ДНК

МДГ - малатдегидрогенеза

МС - малатсинтаза

НАД1" - никотинамидадениндинуклиотид ОАА - оксалоацетат ПААГ - полиакриламидный гель ПВК - пировиноградная кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени РНК - рибонуклеиновая кислота СФ — спектрофотометр

ТЕМЕД - 1Ч,1\Г,ТчГ,1\Г - тетраметилэтилен диамин

ФЕП — фосфоенолпируват

ЦС - цитратсинтаза

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Введение

Актуальность проблемы. Одним из приоритетных направлений развития физиологии и биохимии растений является исследование регуляции метаболических процессов, происходящих в растительном организме. Особый интерес вызывает функционирование важнейшего этапа глюконеогенеза - глиоксилатного цикла, а также изоцитратлиазы (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1.) - ключевого фермента в процессе трансформации липидов в доступные для организма формы углеводов.

Изоцитратлиаза имеет широкое распространение в природе и функционирует в различные физиологические периоды жизни у многих организмов. Этот фермент считается большинством авторов маркерным ферментом глиоксилатного цикла [13], физиологическая роль которого для растений - участие в глюконеогенезе, обеспечивающим растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества. Изоцитратлиаза, как правило, является матриксным ферментом глиоксисом, однако, в работах А. У. Игамбердиева (1990) сообщалось о наличии второй изоформы, локализованной вне глиоксисом -внеглиоксисомальной формы. Известно так же, что активность изоцитратлиазы увеличивается при старении растения, что даёт возможность преобразовывать липиды клеточнх мембран в транспортные формы органических веществ. Таким образом, изоцитратлиаза в растениях представлена двумя формами, имеющими глиоксисомальную и внеглиоксисомальную локализации [19].

В последнее время появились сообщения о полифункциональности данного изоферментного комплекса. Функционирование изоцитратлиазной системы позволяет метаболизировать двухуглеродные соединения и использовать их как строительный материал. В растительном организме в процессе фотодыхательного метаболизма образуется глиоксилат и, благодаря синтазной реакции ИЦЛ, он может использоваться как в катаболических, так и в анаболических реакциях [24].

В настоящее время имеется много данных по исследованию изоферментного спектра изоцитратлиазы в клетках различных организмов. Применение методов молекулярной биологии позволило идентифицировать у нескольких растений гены, ответственные за синтез изоцитратлиазного комплекса, состоящего из двух изоферментов, выполняющих различные функции [16].

Амарант, являющийся нетрадиционной сельскохозяйственной продовольственной культурой, относится к С4-растениям и обладает способностью накапливать большие количества белка, аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов [1]. Для него характерна очень большая засухоустойчивость и при этом он очень хорошо реагирует на полив, что позволяет выращивать его в районах, непригодных для традиционных зерновых и зернобобовых культур. Эти особенности делают амарант перспективной культурой, которая может занять свою нишу в сельском хозяйстве. Поэтому исследование в онтогенезе характеристик изоферментов изоцитратлиазы, которые регулируют процессы мобилизации запасных жиров, особенно, при смене типов питания, представляет значительный научный интерес.

Исследование отдельных звеньев метаболических процессов, связанных с трансформацией липидов в углеводы, является актуальной задачей не только биохимии, но и молекулярной биологии.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось очистка изоферментов изоцитратлиазы из проростков амаранта, исследование их физико-химических и регуляторных характеристик, идентификация генов 1с1\ и го¡2 и их экспрессия.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику активности и изоферментный состав изоцитратлиазы в онтогенезе амаранта разных сортов.

2. Изучить субклеточную локализацию изоферментов ИЦЛ.

3. Очистить изоцитратлиазу из проростков амаранта и стареющих листьев до электрофоретически гомогенного состояния.

4. Определить молекулярные массы и субъединичное строение полученных изоферментов изоцитратлиазы.

5. Изучить кинетические и регуляторные характеристики полученных ферментативных препаратов.

6. Подобрать праймеры для идентификации генов изоцитратлиазы, провести ОТ-ПЦР анализ кДНК из проростков амаранта и осуществить секвенирование полученных ампликонов.

7. Исследовать экспрессию генов изоцитратлиазы в проростках амаранта.

8. Разработать гипотетическую схему участия изоферментов ИТ ЦТ в различных метаболических процессах.

Научная новизна. Научные положения данной работы расширяют и дополняют современные представления о механизмах переключения метаболических процессов в растительной клетке, при участии изоферментов обеспечивая ей нормальное развитие.

Изоферментный состав ИЦЛ в амаранте представлен двумя формами фермента, которые различаются не только по электрофоретической подвижности и субклеточной локализации, но и по кинетическим и регуляторным свойствам. При старении листа наблюдается появление изоцитратлиазной активности, которая свидетельствует, видимо, о функционировании глиоксилатного цикла.

Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из проростков амаранта разных сортов позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики. Сравнительный анализ свойств выделенных изоформ указывает на их значительное отличие друг от друга.

Подбор праймеров для ИЦЛ на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов, а также

последующее секвенирование полученного в ходе ПЦР продуктов показали, что полученные изоформы исследуемого фермента являются изоферментами, то есть имеют различную генетическую детерминированность и, следовательно, функциональную значимость.

Практическая значимость. Выделение и получение в гомогенном состоянии препаратов изоферментов изоцитратлиазы из амаранта открывает перспективы их использования в научно-исследовательских работах для изучения кинетики ферментативной реакции, субъединичного строения фермента, термодинамических параметров реакций. Электрофоретически гомогенные препараты изоферментов ИЦЛ могут служить маркерами при проведении иммуноферментного анализа тканей организмов в стрессовых условиях [4; 25].

Применение препаратов изоферментов ИЦЛ позволит создать биосенсор для определения количества глиоксилата и изоцитрата в растительных и животных экстрактах.

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете ВГУ, при чтении лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии, различных спецкурсов. Кроме того, они находят применение при проведении практимумов и выполнении курсовых и дипломных работ. Положения, выносимые на защиту.

1. Изоцитратлиазная активность обнаруживается в проростках всех исследованных сортов амаранта: «Рыжик», «Кинельский», «Гигант», «Воронежский», «Желтый». Динамика активности и изоферментный состав изоцитратлиазы свидетельствует о важной роли энзима в функционировании глиоксилатного цикла, являющегося этапом глюконеогенеза, и фотодыхательного метаболизма в зеленых листьях, обуславливающего сериновый путь образования аминокислот.

2. Субклеточная локализация изоформ изоцитратлиазы в амаранте связана с глиоксисомально-пероксисомальной фракцией, а также с цитоплазмой клетки.

3. С помощью модифицированной схемы многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты из амаранта сортов «Рыжик» и «Кинельский». Получение гомогенной ИЦЛ] и ИЦЛ2 позволило установить физико-химические и регуляторные характеристики этих энзимов. Значительные отличия свойств (рН, Км и др.) изоферментов изоцитратлиазы обуславливает их участие в разных физиолого-биохимических процессах.

4. Данные по определению нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-продуктов указывают, что изучаемые изоформы ИЦЛ являются изоферментами, т.е. генетически детерминированными белками. Профиль экспрессии генов ici/ и icl2, осуществленный с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени, свидетельствует о корреляции с динамикой изоцитратлиазной активности в прорастающих семенах амаранта.

5. Разработана гипотетическая схема роли изоферментов изоцитратлиазы в регуляции метаболических процессов в амаранте. ИЦЛ) обеспечивает протекание глиоксилатного цикла, важнейшего этапа глюконеогенеза. ИЦЛ2 функционирует в процессе ацидоза, т.е. закислении, необходимом для эффективной мобилизации запасных жиров, и, кроме того, в фото дыхательном метаболизме зеленых листьев. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и

обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 14-ой и 15-ой международной Пущинской школе-конференции молодых