Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессионная регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в клетках мезофилла и обкладки листьев амаранта (Amaranthus L.) при солевом стрессе

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Экспрессионная регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в клетках мезофилла и обкладки листьев амаранта (Amaranthus L.) при солевом стрессе"

Лссиль Мундер Мохаммед Сайд Хаба

Экспрессионная регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в клетках мезофилла и обкладки листьев амаранта (ЛтаптОшь Ь.) при солевом стрессе

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ОКТ 2013

Воронеж-2013

005534205

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна

доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии

Соколенко Галина Григорьевна

кандидат биологических наук, доцент, Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I, доцент кафедры ботаники, защиты растений, биохимии и микробиологии

Ведущая организация: Воронежский государственный

университет инженерных технологий

Защита состоится 23 октября 2013 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 333.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и сайте ФГБОУ ВПО «ВГУ»: www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент У^/^С-еЛ^А Брехова Л.И.

Актуальность проблемы. Изучение эффективности механизмов ионного гомеостатирования, считающегося важнейшей детерминантой солеустойчивости растений, является одной из наиболее развивающихся областей физиологии растений. Данные исследования проводятся как на функциональном, так и молекулярно-генетическом уровнях. Характерной особенностью адаптации высших растений к солевому стрессу является недопущение Na+ в особо чувствительные к засолению ткани, такие как апикальные меристемы, листовые пластинки и генеративные органы. Кроме того, необходимо поддерживать градиенты водного потенциала в системе целого растения для обеспечения непрерывного тока воды в восходящем направлении даже в отсутствие транспирации [Балнокин Ю.В., 2012].

Осмотический баланс между цитоплазмой и вакуолью поддерживается за счет биосинтеза осмолитов и накопления ионов калия. Для этого требуются энергизация метаболизма и перестройка углеводного и азотного обмена. Наибольший адаптационный потенциал имеет С4 -тип растений, обладающий более сложной морфофизиологической структурой (Kranz - анатомия листа). Типичный представитель этих растений - амарант - характеризуется высокой продуктивностью и повышенным уровнем засухо- и солеустойчивости. Наличие тканей мезофилла и обкладки позволяет изучить изменение активности малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37) и сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1) в дифференцированных тканях листьев амаранта при воздействии солевого стресса. Особый интерес представляют метаболические пути, с помощью которых осуществляется интеграция мезофилла и обкладки в стрессовых условиях.

Значительный дефицит знаний связан с малоизученностью молекулярных механизмов адаптивной реакции. Важнейшим моментом является регуляция транскрипции и трансляции ферментных систем, с помощью тканеспецифических промоторов и транскрипционных факторов. В связи с этим изучение экспрессионной регуляции МДГ-активности и функционирования СДГ может внести определенный вклад в понимание данных адаптационных механизмов и их тканевой локализации в амаранте.

Цель и задачи. Целью работы являлось изучение экспрессионной регуляции активности сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в клетках мезофилла и обкладки разных сортов Amaranthus L. при солевом стрессе. Задачи:

1. Используя метод разделения мезофилла и обкладки выделить дифференцированные ткани из листьев разных сортов амаранта.

2. Изучить изменение активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в разных тканях амаранта в норме и при засолении.

3. Проанализировать изоферментный состав малатдегидрогеназы в мезофилле и обкладке листьев амаранта в условиях солевого стресса.

4. Исследовать динамику активности сукцинатдегидрогеназной ферментной системы в мезофилле и обкладке амаранта в норме и при засолении.

5. Установить зависимость уровня экспрессии генов цитоплазматической и митохондриальной форм малатдегидрогеназы в листьях амаранта в нормальных и стрессовых условиях.

6. Исследовать изменение экспрессии гена sdha в листьях амаранта, находящегося в условиях солевого стресса.

7. Провести анализ родства генетического материала разных сортов амаранта с использованием в качестве маркеров сателлиты PAWS.

8. Выявить отличие в геномной ДНК сортов амаранта, отличающихся по солеустойчивости на основе микросателлитного анализа с применением праймера к сателлите OPA 17.

Научная новизна. Результаты, полученные в диссертации, развивают фундаментальные представления об адаптивной реакции клеточного метаболизма в растениях С4 -типа к условиям солевого стресса. Установлена доминирующая роль мезофильных тканей в обеспечении солеустойчивости амаранта. Так, в мезофилле листьев амаранта при засолении увеличивается активность сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы, что указывает на интенсификацию энергетического обмена (ЦТК) и анаплеротических реакций. В условиях засоления индуцируется в мезофильной ткани дополнительная изоформа НАД-зависимой малатдегидрогеназы. Впервые показано, что солевой стресс вызывал увеличение в листьях амаранта экспрессии генов митохондриальной (mdh_mt'),

цитоплазматической (тЛг_су0 малатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы (хсИю), обуславливающих интенсификацию функционирования исследуемых ферментных систем. При этом, увеличение экспрессии характерно для генетического материала, кодирующего митохондриальную форму малатдегидрогеназы. Были выявлены отличия в микросателлитном составе генетического материала у разных сортов амаранта, отличающихся по солеустойчивости.

Практическая значимость. Полученные научные данные вносят определенный вклад в разработку механизмов адаптации растений С4 -типа к солевому стрессу. Регуляция транскрипции генов, кодирующих сукцинатдегидрогеназу и малатдегидрогеназу, может быть использована для создания генетически модифицированных сортов растений амаранта с высокой устойчивостью к засолению. Были выявлены два сорта амаранта «Кинельский» и «Рыжик», обладающие повышенной устойчивостью к солевому стрессу. В них обнаружены отличия по микросателлитному составу геномной ДНК, что может служить маркером для их идентификации.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, по физиологии растений, по спецкурсам по энзимологии, биоэнергетике, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ. Положения, выносимые на защиту.

1. Условия солевого стресса вызывают индукцию активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в листьях амаранта. При этом установлено, что в клетках мезофилла наблюдается значительно большее возрастание малатдегидрогеназной активности по сравнению с обкладкой, что может свидетельствовать о более высоком напряжении клеточного метаболизма в мезофилльной ткани.

2. Индукция малатдегидрогеназной активности в листьях амаранта под действием засоления сопряжена со стресс-индуцированными изменениями изоферментного состава исследуемого фермента. В клетках мезофилла обнаруживается синтез дополнительной изоформы НАД-зависимой малатдегидрогеназы.

3. Обнаружено, что солевой стресс вызывает изменения в функционировании сукцинатдегидрогеназы в мезофилльной и обкладочной тканях, заключающиеся в увеличении активности этого маркерного митохондриального фермента, что свидетельствует об интенсификации работы цикла трикарбоновых кислот, обуславливающего энергизацию клетки.

4. При засолении обнаружена интенсификация экспрессии генов mdh mt, mdh cyt и sdha в листьях амаранта. Показана важная роль экспрессионной регуляции генов, обеспечивающих индукцию активности исследуемых ферментов, что необходимо для адаптивной реакции клеточного метаболизма к экстремальным условиям.

5. Выявлены два сорта амаранта «Кинельский» и «Рыжик», характеризующиеся повышенной устойчивостью к солевому стрессу. Методом полиморфизма длины амплифицированных фрагментов установлено, что эти сорта отличаются по микросателлитному составу. С помощью генетического маркера OPA 17 можно идентифицировать сорта «Кинельский» и «Рыжик».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011), 14-ой международной Путинской конференции молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); X международной научно-практической конференции (Воронеж, 2012); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2011, 2012, 2013).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 10 публикациях - 7 статьях и 3 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (172 источника). Иллюстрационный материал включает 5 таблиц и 19 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Основным объектом исследования в работе служили 14-дневные проростки амаранта {АтагапЛив саис1а1их Ь.) сортов «Харьковский», «Воронежский», «Желтый», «Кинельский», «Гигант» и «Рыжик». Растения были выращены гидропонным способом по стандартной методике при 16 часовом световом дне с интенсивностью света 25 Ватт/м2.

Постановка эксперимента. Солевой стресс моделировали инкубацией проростков в растворе 200 мМ ЫаС1. Контролем служили образцы, экспонированные в воде. Первую пробу снимали до начала инкубации, а затем -после 1, 3 и 6 часов экспозиции.

Определение активности Ферментов. Активность МДГ определяли спектрофотометрически на СФ-46 при длине волны 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования или расходования NADH [Епринцев А.Т. и др., 2007].

Активность СДГ определяли методом, основанным на использовании искусственных акцепторов электронов с соответствующим редокс-потенциалом. [Игамбердиев А.У. и др., 1994].

За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, образующего 1 микромоль продукта за 1 мин при 25°С.

Получение мезофилла и обкладки листьев амаранта. Разделение мезофилла и обкладки исследуемых растений проводили на холоду, механически, по методу Клечковского [Епринцев А.Т. и др., 2011].

Электрофоретическое исследование изоферментпого спектра малатдегидрогеназы. Нативный диск-электрофорез в полиакриламидном геле проводили по Девису [Гааль Э. и др., 1982]. Специфическое проявление гелей осуществляли тетразолиевым методом.

Определение содержания белка. Общее количество белка определяли по методу Лоури [Ьо\угу О.Н. [й а!.], 1951].

Выделение суммарной клеточной популяции РНК. Для выделения суммарной клеточной РНК использовался метод гуанидинтиоционат-фенол-хлороформной экстракции с использованием в качестве осадителя LiCI [Chomczynski P. [et al.], 1987].

Обратная транскрипция. Обратная транскрипция РНК осуществлялась с использованием обратной транскриптазы вируса Moloney лейкоза мышей М-MULVRT (Fermentas, Литва) для синтеза первой цепи кДНК согласно рекомендациям производителя с применением олиго-dT праймера.

Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. Для выяснения изменения уровня экспрессии генов проводили ПЦР в реальном времени на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I. Праймеры к гену mdh-mtx: прямой - 5'- ggtatgacccgwgayggatctc -3'; обратный - 5'- traanayctcwgcwgcaaty -3'. Праймеры к гену mtx cyt: прямой - 5'-ttatgcttggtgcagaccag-3'; обратный - 5'-gtgcattataatatgggtgg-3'. Праймеры к гену sdha: прямой - 5'-caaacgggtcacttccaact-3'; обратный - 5'-ccaaaactgtcccacgtctt-3'.

Параметры амплификации: предварительная денатурация 95°С - 5 мин., затем цикл: 95°С - 30 сек., 60°С - 40 сек., 72°С - 30 сек. (детекция), финальная элонгация - 72°С - 10 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации EF-la с ген-специфичными праймерами. При проведении 40 циклов амплификации с суммарной РНК, не прошедшей этапа обратной транскрипции, мы не наблюдали накопления ПЦР-продукта (отрицательный контроль).

Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2~АДС,-метода [Livak K.J. [et al.], 2001] с использованием программного обеспечения Opticon Monitor™ Software (Biorad, США).

Выделение геномной ДНК из амаранта. Геномную ДНК выделяли из семян амаранта с помощью набора «ДНК-Сорб-С» (НИИ Эпидемиологии РАН, Россия).

Проведение полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию [Mullis K.B. [et al.], 1987, Епринцев A.T. и др., 2001] со специфичными праймерами к различным сателлитам проводили с помощью набора реактивов

АшрНЗепсе (Хеликон, Россия) и следующими праймерами на приборе «Терцик» (ДНК-технология, Россия): РадуБ 5 5'-ААСОЛСаООТТСОАСаСС-3\ Рашв 6 5'-ОАОТОТС АААСССААСО А-3', Ра\у5 11 5'-ОААТТСТТСОААААТОТА-3', Ра\у8 17 5'-СТАСАССОАС'ГСООТССО-3', ОРА-17 З'-ОАССОСГГОТ-З', ОРА-20 5'-аТТССОАТСС-3'.

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3 кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы - в трех повторностях. Для определения достоверности результатов применяли метод вариационной статистики. В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. Для построения графиков применяли программы линейной и параболической аппроксимации. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1990].

РАЗДЕЛЕНИЕ ТКАНЕЙ МЕЗОФИЛЛА И ОБКЛАДКИ ИЗ ЛИСТЬЕВ АМАРАНТА

Для всех растений, обладающих С4-типом фотосинтеза, характерна фиксация С02, катализируемая ФЕП-карбоксилазой, которая происходит в цитоплазме клеток мезофилла их листьев [Ермакова И.П. и др., 2005]. Следовательно, ФЕП-карбоксилаза локализована исключительно в мезофилле и может выступать в качестве маркерного фермента данной ткани.

У С4-растений восстановительный пентозофосфатный путь протекает в обкладке. Ключевым ферментом цикла Кальвина является НАДФ+-зависимая глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, которая обеспечивает восстановление 1,3-дифосфоглицериновой кислоты до глицеральдегид-3-фосфата в восстановительной фазе цикла. Данный фермент специфичен для клеток обкладки проводящих пучков С4-растений и может использоваться при их идентификации [Епринцев А.Т. и др., 2011].

Полученные данные, свидетельствующие о степени перекрестного загрязнения между тканевыми фракциями, представлены в таблице 1. Было выявлено, что клетки мезофилла разных сортов амаранта загрязняли обкладочную фракцию на 10-16 %.

Таблица 1.

Распределение активности маркерных ферментов (ФЕП-карбоксилазы и

НАДФ-ГАФДГ -глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) между клетками обкладки и мезофилла листьев амаранта (п=3, р<0.05)

Объект Тип ткани ФЕП-карбоксилаза НАДФ+-ГАФДГ Белок

Е/мл % Е/мл % мг

Амарант, сорт «Рыжик» Мезофилл 11,64 84 0,064 6 12,86

Обкладка 1,98 16 0,99 94 2,95

Амарант, сорт «Кинельский» Мезофилл 10,86 90 0,059 6 11,93

Обкладка 1,15 10 1,09 94 1,98

Амарант, сорт «Харьковский» Мезофилл 9,79 90 0,051 5 10,26

Обкладка 0,98 10 1,18 95 1,77

Амарант, сорт «Воронежский» Мезофилл 10,93 91 0,064 5 11,05

Обкладка 1,15 9 1,21 95 1,83

Перекрестное загрязнение тканей мезофилла составляло не более 6 % клетками обкладки. Показано, что степень перекрестного загрязнения тканей исследуемых объектов в проведённых экспериментах практически не зависела от сорта исследуемого растения.

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ФЕРМЕТОВ ЦИКЛА КРЕБСА В МЕЗОФИЛЛЕ И ОБКЛАДКЕ АМАРАНТА В УСЛОВИЯХ СОЛЕВОГО СТРЕССА

Стресс-индуцированные изменения активности НАД-зависимой оксидоредуктазной малатдегидрогеназы

МДГ-система по многим причинам способна играть важную роль в компенсации влияния разного рода стрессов на клеточный метаболизм эукариотов [Пинейру де Карвалью М.А.А. и др., 1991]. Результаты изучения влияния солевого стресса на активность НАД-МДГ амаранта отражены в рис. 1. Показано, что под действием хлорида натрия в мезофилле амаранта происходила интенсивная активация НАД+-зависимой МДГ на протяжении всего времени экспозиции. На первых этапах действия стрессора её активность возрастала в 3,5 раза по сравнению с контролем уже в конце первого часа засоления. Дальнейшая интенсификация была не столь значительной и составила 150% после трех часового засоления. Однако исследование объекта после шести часовой

экспозиции показало резкое увеличение активности НАД+-зависимой МДГ, которая выросла более чем в 16 раз.

В обкладке соль также вызывала увеличение ферментативной активности НАД+-зависимой МДГ, однако в первые несколько часов экспозиции показатели активности данной МДГ были сходны в контрольных и опытных образцах, к 3 часам было замечено лишь незначительное возрастание, а пик приходился на более позднее время и составлял восьмикратное увеличение по сравнению с контрольными значениями.

Бремя экспозиции, час

200 мМоль №С1

Рис.1. Динамика

активности НАД-МДГ в листьях амаранта в условиях солевого стресса в мезофилле.

• контроль ___

Активацию данного фермента в мезофилле изучаемых растений в условиях солевого стресса можно связать с двумя аспектами адаптивного ответа клеток на засоление. Во-первых, с необходимостью дополнительного притока энергии для компенсации негативного влияния соли [Семихатова O.A. и др., 1993], а во-вторых, с интенсивным синтезом осмолитов, имеющим место при засолении [Delauney A.J. et al., 1993]. Предполагается, таким образом, что хлорид натрия индуцирует работу МДГ в цикле Кребса и мобилизует синтетическую способность данного фермента.

Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в листьях амаранта в условиях солевого стресса

Исследование действия солевого стресса на активность сукцинатдегидрогеназы имеет сходный характер с таковым показателем для малатдегидрогеназы (табл. 2). Так, в условиях засоления происходит увеличение активности СДГ в листьях всех исследуемых сортов амаранта. Начиная с первого

часа экспозиции растений в 200мМ растворе хлорида натрия, наблюдается интенсификация работы сукцинатдегидрогеназы. Максимального значения активность достигает на 6 час эксперимента. Аналогично результатам исследования активности МДГ, самое большое увеличение скорости функционирования СДГ наблюдалось у сорта «Воронежский», где данный показатель достигает значения 0,41 Е/г.с.м., что в 4,1 раза больше контрольного варианта.

Таблица 2.

Активность сукцинатдегидрогеназы в листьях амаранта в условиях солевого стресса (п =3, р < 0.05)

Условия опыта Активность в разных сортах амаранта, Е/г.с.м.

Воронежский Кинельский Желтый Рыжик

Контроль 0,10 0,13 0,12 0,14

1 час засоления 0,13 0,10 0,13 0,12

3 часа засоления 0,35 0,25 0,18 0,18

6 часов засоления 0,41 0,29 0,27 0,36

Возможно, что хлорид натрия индуцирует работу МДГ и СДГ в цикле Кребса и мобилизует синтетическую способность данных ферментов. Поддержание активности ферментов, а, следовательно, и всего ЦТК, на первых этапах действия стрессора в модифицированных условиях на высоком уровне, по нашему мнению, обусловлено необходимостью синтеза маната для конструктивного метаболизма и для поддержания осмотического баланса клетки. Дальнейшее резкое увеличение активности исследуемых энзимов под действием стрессора в тканях изучаемых растений может быть связанно с явлением "солевого дыхания".

ИНДУЦИРОВАННЫЕ СОЛЬЮ ИЗМЕНЕНИЯ В ИЗОФЕРМЕНТНОМ СОСТАВЕ НАД-ЗАВИСИМОЙ ОКСИДОРЕДУКТАЗНОЙ МДГ Существует два возможных механизма регуляции ферментативной активности: во-первых, изменение в функционировании уже существующих молекул фермента, а во-вторых - перестройка его изоферментного спектра и синтез дополнительных форм de novo. Оба этих механизма имеют место в реализации приспособительной реакции МДГ-системы, что обсуждается в литературе, по крайней мере, для НАД-МДГ [Faleiro А.С. [et al.], 2003].

Известно, что НАД^-зависимая МДГ растительных клеток представлена широким спектром множественных молекулярных форм [Ра1еио А.С. е! а1., 2003]. Нами были исследованы изоферментный спектр зеленых листьев НАД-МДГ представителя аспартатного типа С4- растений - амаранта. В контроле в тканях присутствовали 2 изоформы фермента, одна из которых (Яг= 0,6) была обнаружена как в мезофилле, так и в обкладке, а вторая (Я,— 0,55) оказалась специфична для мезофилла. В результате действия соли в тканях исследуемого растения происходила лишь незначительная перестройка спектра изоформ данного фермента. Солевой стресс индуцировал появление ещё одной дополнительной молекулярной формы фермента с Я,=0,66 в клетках мезофилла НАД-МДГ (табл.2). В обкладке стресс-индуцированных изменений изоферментного спектра у амаранта не обнаружено (рис.2).

м с о ф и л л об клад к я

К 1с Зс (к К К Зс бс

Рис.2. Изоферментный состав НАД-МДГ в тканях амаранта в нормальных и стрессовых условиях. (К - контроль, 1с, 6с -инкубация опытных растений в 200 мМ ЫаС1 в течение одного и шести часов соответственно).

Полученные данные хорошо коррелируют с динамикой активности НАД+-зависимой МДГ разделённых тканей в нормальных и стрессовых условиях (рис. 2). Выявленные изменения в изоферментном составе данного фермента в тканях исследуемого растения свидетельствуют о том, что наблюдаемая активация МДГ хлоридом натрия в мезофилле зелёных листьев амаранта происходила вследствие синтеза дополнительной изоформы, однако этот эффект имел место только после шести часов экспозиции, где наблюдалось наибольшее увеличение активности. Очевидно, в тканях листьев амаранта из двух возможных механизмов интенсификации ферментативной активности, а именно: синтез дополнительных форм фермента de novo и изменения в функционировании уже существующих

молекул, превалирует последний. Это обстоятельство, скорее всего, негативно сказывается на эффективности адаптивного ответа на засоление в целом и общую солеустойчивость вида.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ЛИСТЬЯХ

АМАРАНТА

Экспрессия генов малатдегидрогеназной и сукцинатдегидрогеназной систем в листьях амаранта при солевом стрессе

Для оценки количественных показателей интенсивности работы генов, кодирующих цитозольную и митохондриальную формы МДГ, использовали метод ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя Sybr Green I. Результаты, полученные с помощью ПЦР в реальном времени для генов митохондриальной малатдегидрогеназы, показывают наличие корреляции экспрессии изучаемого гена с малатдегидрогеназной активностью. В опытах по влиянию засоления на уровень экспрессии гена митохондриальной mdh было показано, что воздействие стрессового фактора индуцирует изменения в работе генетического аппарата растительной клетки, приводящие к увеличению количества мРНК митохондриальной МДГ в клетках.

Анализ полученных для цитоплазматического гена малатдегидрогеназы так же показал корреляцию экспрессии с ферментативной активностью. Так, наибольший уровень экспрессии цитоплазматического гена mdh cyt наблюдался после 6-ти часового воздействия стрессора, что совпадает с максимальным пиком активности НАД-МДГ. Результаты изменения уровня экспрессии гена сукцинатдегидрогеназы в листьях амаранта сортов «Воронежский» и «Желтый» в условиях солевого стресса свидетельствуют, что величина данного критерия увеличивается при экспозиции растений в 200 мМ растворе хлорида натрия. К шестому часу засоления интенсивность транскрипции исследуемого гена возрастает более чем в 3 раза, что четко соотносится с данными по изменению активности СДГ в условиях солевого стресса (табл. 3).

Полученные данные подтверждают тот факт, что засоление может проявлять своё действие через различные механизмы, одним из которых является изменение

экспрессии генетического аппарата клетки, которое осуществляется посредством различных мессенджеров.

Таблица 3.

Зависимость уровня экспрессии генов малатдегидрогеназы (в относительных единицах) у обычного (Воронежский) и солеустойчивого (Кинельский) сортов амаранта в норме и при засолении

Время засоления, ч. Сорт 0 1 3 6

Воронежский тс1}%_т1х 1+0,05 1,05+0,05 1,86±0,09 2,4±0,12

т$х_су1 1±0,05 1,11+0,06 2,81+0,14 3,11+0,16

Кинельский тМтОс 1±0,05 1,33±0,06 1,49±0,07 1,46+0,07

тМсу! 1+0,05 0,782±0,04 0,98±0,05 0,98+0,05

Таблица 4. Зависимость уровня экспрессии гена сукцинатдегидрогеназы (в относительных единицах) у обычного (Воронежский) и солеустойчивого (Кинельский) сортов амаранта в норме и при засолении

Время засоления, ч. Сорт 0 1 3 6

Воронежский 1±0,05 1,3+0,06 1,9+0,09 3,9+0,2

Кинельский 1+0,05 1,05+0,05 0,98+0,05 1+0,05

Установлено, что митохондриальная форма МДГ является солезависимым ферментом. Интенсивность функционирования митохондриальной МДГ регулируется на уровне транскрипции гена, кодирующего данную форму фермента. Высокие концентрации транскрипта гена митохондриальной МДГ чётко коррелируют с увеличением активности исследуемого фермента (табл. 4).

Установлено, что сукцинатдегидрогеназа и митохондриальная форма МДГ являются солезависимыми ферментами в листьях всех исследуемых сортов амаранта. Интенсивность функционирования данных ферментов регулируется на уровне транскрипции соответствующих генов, кодирующих исследуемые энзимы. Увеличение концентрации транскриптов генов митохондриальной МДГ и СДГ чётко коррелирует с интенсификацией их функционирования в условиях солевого стресса.

Особенности структуры генетического материала у сортов амаранта с различной устойчивостью к солевому стрессу

Для исследования вариабельности генома разных организмов, а также разных сортов одного вида растений, может быть также использован метод анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) [Perry M.D. et al., 1998]. В нашей работе было выяснено отличие набора сателлит у разных сортов амаранта, отличающихся по уровню солеустойчивости.

Проведенный ПЦР-анализ геномной ДНК растений с праймерами Paws 5, показал, что все исследуемые сорта амаранта имеют три ПЦР-продукта сходной длины: 300, 450 и 650 п.н. (рис. ЗА), что свидетельствует о присутствии сателлиты Paws 5 в геноме всех исследуемых образцов. Результаты амплификации геномных ДНК растений с праймерами Paws 6 представлены на рисунке ЗБ. Полученные данные по генотипированию ДНК семян амаранта с праймерами Paws 6 показывают, что данный маркер может быть использован при идентификации сорта «Рыжик».

А) Б)

Рис.3. Анализ продуктов ПЦР-реакции ДНК сортов амаранта с праймерами PAWS 5 (А) и PAWS 6 (Б). 1 - сорт «Воронежский», 2 - сорт «Желтый», 3 - сорт «Рыжик», 4 — сорт «Гигант», 5 - сорт «Кинельский», М - маркеры длины ДНК, п.н.

В ходе амплификации образуется только один продукт реакции с длиной около 2000 п.н., отличающий его от остальных исследуемых сортовых образов. Интересно отметить, что данный ДНК маркер для солеустойчивого сорта амаранта «Рыжик» в геноме проявляется в виде одной копии сателлиты.

Установлено, что во всех исследуемых образцах семян амаранта обнаруживаются продукты амплификации с данными праймерами. Сходство в результатах амплификации наблюдается у следующих сортов: «Желтый», «Рыжик» и «Кинельский». При амплификации ДНК этих семян обнаружены ПЦР-продукты с длинами 300, 450, 800, 1200 и 2500 п.н.

А) Б)

1 2 3 4 5 м 1 2 3 4 5

М

Рис. 4. Анализ продуктов ПЦР-реакции ДНК сортов амаранта с праймерами PAWS 11 (А) и PAWS 17 (Б). Обозначения: см. рисунок 3.

Для сорта «Воронежский», характеризующегося низкой солеустойчивостью, обнаружено присутствие четырех продуктов амплификации с длинами 300, 450, 600 и 800 п.н. Данный набор ампликонов отличает растения этого сорта от остальных исследуемых образцов ДНК семян амаранта и это может служить отличительной характеристикой при генотипировании (рис. 4А). Кроме того, индивидуальный набор продуктов амплификации с маркером Paws 11 характерен и для сорта «Гигант», характеризующего низкой устойчивостью к солевому стрессу. Аналитический электрофорез показал наличие пяти полос при амплификации ДНК исследуемого сорта. Размеры продуктов амплификации соответствуют следующим значениям: 300, 450, 600, 800 и 1200 п.н. На основании анализа продуктов амплификации ДНК семян разных сортов амаранта с праймером Paws 11 можно заключить, что этот маркер является индикаторным при генотипировании сортов амаранта и может быть использован для идентификации сортов «Воронежский» и «Гигант» по характерным наборам ампликонов для каждого их них.

Анализ полученных электрофореграмм свидетельствует, что в геноме изученных образцов сортов амаранта наблюдается неоднородность продуктов

амплификации (рис. 4Б). Установлено, что генетический маркер OPA 17 является специфичным для солеустойчивых сортов «Рыжик» и «Кинельский» поскольку в семенах данных образцов обнаружены характерные ПЦР-продукты. Соответственно, маркер OPA 17 является индикаторным при генотипировании сортов амаранта и может быть использован для идентификации сортов «Рыжик» и «Кинельский» по характерным наборам ампликонов для каждого их них.

Маркер OPA 20 можно использовать для идентификации сортов «Рыжик», «Желтый» и «Гигант». В ходе амплификации сорта «Желтый» образуются специфические продукты с длинами: 200, 350, 600, 850 и 1000 п.н. А для сорта «Гигант» характерно наличие небольшого числа ампликонов, специфичных для него - 200, 350 и 550 п.н.

А) Б)

М 12345 1 2 3 4 SM

юоо

500 100

Рис. 6. Анализ продуктов ПЦР-реакции ДНК сортов амаранта с праймерами OPA 17 (А) и OPA 20 (Б). Обозначения: см. рисунок 1.

Кроме того, праймер OPA 20 не является специфическим для сортов «Воронежский» и «Кинельский», так как на электрофореграмме отсутствуют продукты амплификации с ним. Для образцов ДНК сорта «Кинельский» на электрофореграмме характерно наличие четырех продуктов с длинами: 300, 500, 850, 1200 и 2000 п.н.

Заключение

Использование в нашей работе в качестве объекта исследования амаранта, являющегося представителем С4-типа растений, открыло возможность для проведения исследований по экспрессионной регуляции сукцинатдегидрогеназной и малатдегидрогеназной ферментных систем в условиях солевого стресса. Кроме

того, применение дифференциального центрифугирования позволило получить отдельно клетки тканей мезофилла и обкладки и провести изучение пространственной организации функционирования данных ферментных комплексов в экстремальных условиях.

Полученные результаты указывают на то, что функционирование НАД+-МДГ в мезофилле более изменчиво в стрессовых условиях по сравнению с обкладкой. Можно предположить, что на самых первых стадиях засоления основную тяжесть давления солевого стресса принимают на себя клетки мезофилла, имеющие более лабильный по сравнению с обкладкой метаболизм [Епринцев А.Т. и др., 2011]. Ферментные системы обкладки более консервативны и в том случае, если стрессовое воздействие нарастает, и ионы соли проникают в кранц-клетки, которые, вероятно, испытывают значительно большее напряжение по сравнению с мезофиллом.

Наблюдаемый рост активности данного фермента в тканях мезофилла амаранта в условиях солевого стресса мы связываем с двумя аспектами адаптивного ответа клеток на засоление. Во-первых, с необходимостью дополнительного притока энергии для компенсации негативного влияние соли [Добровольский В.В., 2001], а во-вторых, с интенсивным синтезом осмолитов [Косулина Л.Г. и др., 1993]. За счет биосинтеза в цитоплазме нетоксичных низкомолекулярных органических соединений - осмолитов, а также накопления ионов калия поддерживается осмотический баланс между цитоплазмой и вакуолью. Благодаря накоплению ионов и биосинтезу осмолитов водный потенциал в клетках листьев растений при засолении почвы может сильно снижаться [Нобел П., 1973].

Обнаруженная стресс-индуцированная изоформа НАД+-зависимой МДГ локализована в мезофилле. По-видимому, формы, имеющие митохондриальную локализацию, катализируют реакцию ЦТК и выполняют энергетическую функцию. Цитоплазматические формы МДГ, функционирующие в стрессовых условиях, скорее всего, отвечают за интенсификацию метаболизма малата, в частности, усиление синтеза оксалоацетата - важнейшего осмолита. Способность к стресс-индуцированному синтезу изозимов исследуемого фермента влияет на успешность адаптации в целом и коррелирует с общей солеустойчивостью ткани.

Ранее были обнаружены тканеепецифичеекие особенности изоферментного состава НАД-зависимой оксидоредуктазной МДГ клеток мезофилла и обкладки кукурузы в условиях солевого стресса [Епринцев А.Т. и др., 2007]. При этом происходил синтез изозимов НАД-МДГ de novo, что обеспечивало трансформацию клеточного метаболизма на изменение внешних факторов. При этом стресс-индуцированные изменения функционирования МДГ кукурузы затрагивали как цитозольные так и митохондриальные формы фермента.

Результаты исследования экспрессии митохондриального и цитоплазматического генов малатдегидрогеназы коррелируют с увеличением ферментативной активности данного фермента в клетках мезофилла и обкладки амаранта. Анализ экспрессионной регуляции генов mdh_mt и mdhcyt свидетельствует, что в мезофильной ткани осуществляется синтез de novo цитоплазматической формы исследуемого фермента.

Исследование на солеустойчивость нескольких сортов амаранта позволило выявить два сорта «Кинельский» и «Рыжик», обладающие повышенной устойчивостью к солевому стрессу. Для них характерен стабильный уровень экспрессии генов mdh_cyt и sdha в опытных и контрольных растениях.

Несомненный интерес, на наш взгляд, представляют данные по изучению особенностей генетического материала солеустойчивых сортов амаранта по сравнению с растениями, имеющими обычную реакцию на засоление. С помощью метода полиморфизма длины амплифицированных фрагментов проанализирован микросателлитный состав геномной ДНК семи сортов амаранта. Установлено, что сорта «Кинельский» и «Рыжик» отличаются по микросателлитному составу и солеустойчивости от других исследованных сортов. Показана возможность применения генетических маркеров OPA 17 для идентификации сортов амаранта «Кинельский» и «Рыжик», обладающих высокой устойчивостью к функционированию в условиях солевого стресса, по характерному для них набору продуктов амплификации.

Полученные данные позволили разработать гипотетическую схему адаптивной реакции клеточного метаболизма мезофилла и обкладки амаранта с непосредственным участием МДГ и СДГ к условиям солевого стресса. Отмечается важная роль экспрессионной регуляции генов mdhjnt, mdhcyt и sdha,

обуславливающих индукцию активности ферментов, что обеспечивает энергизацию метаболизма и синтез осмолитов (рис. 7 и 8).

МЕЮФПЛЛ

иормп

' ПН1/1-0'/

/ пигн-них / тШа

/

\_

¡малат | /

\ /

мдг|

мдг

синтеч пнтермедиэтов

[ <"ДГ цтк

ч. МНТ0ЗДНЗ|>11Я

стресс

т!Ш-су1

пши-т 1х )

Рис. 7. Гипотетическая схема адаптивной реакции клеток мезофилла листьев амаранта в условиях солевого стресса.

ОБКЛАДКА

МИТОХОНДРИЯ

Рис. 8. Гипотетическая схема адаптивной реакции клеток обкладки листьев амаранта в условиях солевого стресса.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что функционирование НАД+-МДГ и СДГ более интенсивно в стрессовых условиях по

сравнению с контрольными растениями. Установлено, что сукцинатдегидрогеназа и митохондриальная форма МДГ являются солезависимыми ферментами в листьях всех исследуемых сортов амаранта. Интенсивность функционирования данных ферментов регулируется на уровне транскрипции соответствующих генов, кодирующих изучаемые энзимы. В условиях солевого стресса в листьях амаранта осуществляются различные механизмы клеточной адаптивной реакции, одним из которых является изменение экспрессии генетического аппарата клетки, осуществляемое посредством различных транскрипционных факторов.

ВЫВОДЫ

1. Использование метода дифференциального центрифугирования позволяет осуществлять эффективное разделение тканей мезофилла и обкладки в листьях амаранта. При применении данного способа перекрестное загрязнение разделяемых тканей не превышает статистически значимых величин при использовании в качестве маркерных ферментов мезофилла (ФЕП-карбоксилаза) и клеток обкладки (НАДФ+-зависимая глицеральдегидфосфатдегидрогеназа).

2. Обнаружено, что под влиянием солевого стресса (ЫаС1, 200 мМ) наблюдалось индуцирование активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в листьях амаранта. При этом выявлено изменение изоферментного состава исследуемого энзима. Показано, что в клетках мезофилла наблюдается более сильное увеличение малатдегидрогеназной активности по сравнению с обкладкой. Характерно, что при засолении в клетках мезофилла наблюдается синтез дополнительной формы малатдегидрогеназы с IV = 0,66.

3. Установлено, что стресс-индуцированные изменения функционирования сукцинатдегидрогеназы в мезофилле и обкладке амаранта под действием засоления заключаются в значительном увеличении активности этого маркерного митохондриального фермента. Увеличение активности СДГ свидетельствует об интенсификации функционирования цикла трикарбоновых кислот, обуславливая энергизацию клетки, что необходимо для адаптации к солевому стрессу.

4. Выявлено, что при засолении наблюдается интенсификация экспрессии генов митохондриальных малатдегидрогеназы (тМ_т1) и сукцинатдегидрогеназы (бМо) во всех исследованных сортах амаранта, что обуславливает интенсификацию функционирования цикла Кребса и повышение энергетического статуса клетки, необходимого для ионного гомеостаза и солеустойчивости.

5. Были выявлены два сорта амаранта «Кинельский» и «Рыжик», обладающие повышенной устойчивостью к солевому стрессу. Для них характерен стабильный уровень экспрессии генов mdh cyt и sdha в опытных и контрольных растениях, что свидетельствует о значительном уровне их солеустойчивости на генетическом уровне.

6. С помощью метода полиморфизма длины амплифицированных фрагментов проанализирован микросателлитный состав геномной ДНК семи сортов амаранта. Установлено, что солеустойчивые сорта «Кинельский» и «Рыжик» отличаются по микросателлитному составу от других изученных сортов.

7. Показана возможность применения генетического маркера OPA 17 для идентификации сортов амаранта «Кинельский» и «Рыжик», обладающих высокой устойчивостью к функционированию в условиях солевого стресса, по характерному для них набору продуктов амплификации.

8. Полученные данные позволили разработать гипотетическую схему адаптивной реакции клеточного метаболизма мезофилла и обкладки амаранта с непосредственным участием МДГ и СДГ к условиям солевого стресса. Отмечается важная роль экспрессионной регуляции генов mdhjnt, mdhcyt и sdha, обуславливающих индукцию активности ферментов, что обеспечивает энергизацию метаболизма и синтез осмолитов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федорина О.С. Функционирование НАД+- и НАДФ-зависимых малик энзимов в мезофилле и обкладке С4-растений в условиях солевого стресса / О.С. Федорина, Ассиль Мундер Хаба, А.Т. Епринцев // «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». - Воронеж. - ВГУ. - 2011. - Вып. 13. - С. 197-203.

2. Влияние солевого стресса на функционирование НАД- и НАДФ-зависимых малик-энзимов в дифференцированных тканях С4-растений / А.Т. Епринцев [и др.] // VII Съезд общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции». - 4-10 июня 2011г. Нижний Новгород. - С.241.

3. Активность и изоферментный состав изоцитратлизы в семенах амаранта разных сортов / A.B. Сальников [и др.] // Пущинский научный центр российской академии наук. Пущинский государственный университет (секция биофизика клетки, органов и систем). - Пущино. - 2011. — С.89.

4. Ассиль Мундер Хаба. Распространение изоцитратлиазы и ее физиологическая роль / Ассиль Мундер Хаба, A.B. Сальников, А.Т. Епринцев // «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». - Воронеж. - ВГУ. - 2012. — Вып. 14. -С.22-28.

5. Изоферментный состав изоцитратлиазы на разных этапах онтогенеза амаранта / A.B. Сальников [и др.] // «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». - Воронеж. - ВГУ. - 2012. -.Вып. 14. - С.178-184.

6. Ионообменная хроматография - необходимый этап для разделения изоферментов глиоксилатного цикла / A.B. Сальников [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж. - ВГУ. - 2012. - Вып. 6. - С.989-997.

7. Сальников A.B. Получение ферментативных препаратов из амаранта / A.B. Сальников, Хаба Ассиль Мундер, А.Т. Епринцев // Актуальные проблемы профессионального образования : подходы и перспективы. «Материалы Х-ой международной, научно-практической конференции». «Научная книга». - 30-31 марта 2012г. - Воронеж. - С.383.

8.Ассиль Мундер Хаба. Изоферментный состав и экспрессия генов малатдегидрогеназной системы амаранта сорта «Харьковский» при засолении / Ассиль Мундер Хаба, О.С. Федорина, А.Т. Епринцев // «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». Воронеж. - 2013. - Вып.15. - С.35-44.

9. Экспрессионная регуляция генов малатдегидрогеназы в амаранте сорта «Харьковский» при засолении / А. М. Хаба [и др.] // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2013. - № 2. - С.88-90.

10. Изоферменты изоцитратлиазы и их роль у организмов разного уровня организации / А.Т. Епринцев [и др.] // Успехи современной биологии. - 2013. - Том 133, № 6. - С.564-580.

Статьи № 6, № 9, № 10 опубликованы в печатных изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Подписано в печать 17.09.13. Формат 60х84 '/[,.■ Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 906.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфичсекого центра Воронежскою государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ассиль Мундер Мохаммед Саид Хаба, Воронеж

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

Экспрессионная регуляция функционирования сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в клетках мезофилла и обкладки листьев амаранта (Amaranthus L.) при солевом стрессе

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.05 - Физиология и биохимия растений

04201362274

На правах рукописи

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Епринцев А.Т.

ВОРОНЕЖ 2013 г.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ТЕРМИНОВ

АДФ - аденозиндифосфат; АЛГ - алкогольдегидрогеназа; АТФ - аденозинтрифосфат;

ВПФП - восстановительный пентозофосфатный путь;

ГЦ - глиоксилатный цикл;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДХФИФ - дихлорфенолиндофенол;

ИЦЛ - изоцитратлиаза;

ЛДГ - лактатдегидрогеназа;

НАД4 - никотинамидадениндинуклеотид;

ОА - оксалоацетат;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СДГ - сукцинатдегидрогеназа;

СДГА - флавопротеин;

СДГВ - железо-серный белок;

СДГС и С/ЦТ) - субъединицы СиБ сукцинатдегидрогеназы, соответственно;

СУР - сукцинат-убихинон оксидоредуктаза;

ФАД - флавинадениннуклеотид;

Фдк - фитохром дальний красный;

Фк - фитохром красный;

ФМН - флавинмононуклеотид;

ФМС - феназинметасульфат;

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот;

ЭТЦ - электронтранспортная цепь;

вТР - гуанозинтрифосфат.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................11

1.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта............11

1.1.1. Особенности метаболических процессов у амаранта.......................11

1.1.2. Морфо-физиологические характеристики амаранта.........................13

1.1.3. Биохимический состав амаранта................................................16

1.1.4. Общая характеристика растений рода АтагапЖш.........................20

1.1.4.1. Краткая характеристика качественных свойств некоторых сортов

амаранта............................................................................22

1.2. Физиолого-биохимические аспекты адаптации организмов

к воздействию стрессовых факторов............................................23

1.2.1. Общие представления о стрессе.................................................23

1.2.2. Ионный гомеостаз и солеустойчивость растений...........................24

1.2.2.1. Ответная реакция клеточного метаболизма растений

на солевой стресс................................................................24

1.2.2.2. Биосинтез осмолитов как приспособительная реакция

к условиям солевого стресса..................................................31

1.2.3. Стратегия адаптации растений к условиям солевого стресса............35

1.3. Роль ферментов в осуществлении адаптивной реакции клеточного метаболизма растений к неблагоприятным факторам среды...............43

1.3.1. Особенности функционирования малатдегидрогеназы в норме

и в стрессовых условиях........................................................43

1.3.1.1. Общая характеристика малатдегидрогеназной ферментной системы............................................................................44

1.3.1.2. Физико-химические свойства малатдегидрогеназы......................46

1.3.1.3. Изоферментный состав малатдегидрогеназной ферментной системы............................................................................51

1.3.1.4. Молекулярная биология малатдегидрогеназы.............................53

1.3.1.5. Действие стрессоров различной природы на функционирование

малатдегидрогеназы...........................................................54

1.3.2. Общая характеристика сукцинатдегидрогеназной ферментной

системы.............................................................................56

1.3.2.1. Функциональная роль сукцинатдегидрогеназы..........................57

1.3.2.2. Физико-химические свойства сукцинатдегидрогеназы.................57

1.3.2.3. Молекулярные аспекты регуляции функционирования сукцинатдегидрогеназы........................................................62

1.3.2.4. Метаболитная регуляция сукцинатдегидрогеназы......................64

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...................................67

2.1. Объекты и методы.................................................................67

2.1.1. Объект исследования............................................................67

2.1.2. Методы исследования...........................................................67

2.1.2.1. Постановка эксперимента....................................................67

2.1.3. Определение активности ферментов.........................................67

2.1.4. Получение мезофилла и обкладки листьев амаранта.....................69

2.1.5. Электрофоретическое исследование изоферментного спектра малатдегидрогеназы.............................................................69

2.1.6. Определение содержания белка...............................................70

2.1.7. Выделение суммарной клеточной популяции РНК........................70

2.1.8. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы...70

2.1.9. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот.............................................................71

2.1.10. Обратная транскрипция........................................................71

2.1.11. Подбор специфических праймеров для генов малатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы............................................72

2.1.12. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени....73

2.1.13. Выделение геномной ДНК из амаранта....................................73

2.1.14. Проведение полимеразной цепной реакции...............................74

2.1.15. Статистическая обработка данных..........................................75

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................................76

2.3.1. Разделение тканей мезофилла и обкладки из листьев амаранта.........76

2.3.2. Динамика активности ферментов цикла Кребса в мезофилле

и обкладке амаранта в условиях солевого стресса...........................78

2.3.2.1. Стресс-индуцированные изменения активности НАД-зависимой оксид оредуктазной малатдегидрогеназы.............78

2.3.2.2. Динамика активности сукцинатдегидрогеназы в листьях

амаранта в условиях солевого стресса.......................................82

2.3.3. Индуцированные солью изменения в изоферментном составе НАД-зависимой оксидоредуктазной МДГ..................................83

2.3.4. Экспрессия генов малатдегидрогеназной и сукцинатдегидро-геназной систем в листьях амаранта..........................................87

2.3.4.1. Экспрессия генов малатдегидрогеназной системы в листьях амаранта сорта «Харьковский»...............................................87

2.3.4.2. Экспрессия генов сукцинатдегидрогеназной и малатдегидрогеназной систем в амаранте при засолении............ 90

2.3.5. Особенности структуры геномов сортов амаранта

с различной устойчивостью к солевому стрессу............................96

2.3.5.1. Анализ геномов разных сортов амаранта..................................96

2.3.5.2. Выделение геномной ДНК из семян амаранта............................98

2.3.6. Генотипирование сортов амаранта с праймерами PAWS 5..............99

2.3.7. Генотипирование сортов амаранта с праймерами PAWS 6.............100

2.3.8. Генотипирование сортов амаранта с праймерами PAWS 11............102

2.3.9. Генотипирование сортов амаранта с праймерами PAWS 17............104

2.3.10. Генотипирование сортов амаранта с праймерами OPA 17............105

2.3.11. Генотипирование сортов амаранта с праймерами OPA 20............107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................110

ВЫВОДЫ................................................................................116

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ..........................118

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование эффективности механизмов ионного гомеостатирования, считающегося важнейшей детерминантой солеустойчивости растений, является одной из наиболее развивающихся областей физиологии растений. Данные исследования проводятся как на функциональном, так и молекулярно-генетическом уровнях [2]. Характерной особенностью адаптации высших растений к солевому стрессу является недопущение Na+ в особо чувствительные к засолению ткани, такие как апикальные меристемы, листовые пластинки и генеративные органы. Кроме того, необходимо поддерживать градиенты водного потенциала в системе целого растения для обеспечения непрерывного тока воды в восходящем направлении даже в отсутствие транспирации [2].

Осмотический баланс между цитоплазмой и вакуолью поддерживается за счет биосинтеза осмолитов и накопления ионов калия. Для этого требуются энергизация метаболизма и перестройка углеводного и азотного обмена. Наибольший адаптационный потенциал имеет С4 -тип растений, обладающий более сложной морфофизиологической структурой (Kranz -анатомия листа). Типичный представитель этих растений - амарант -характеризуется высокой продуктивностью и повышенным уровнем засухо-и солеустойчивости. Наличие дифференциальных тканей мезофилла и обкладки позволяет изучить изменение активности малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37) и сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1) в дифференцированных тканях листьев амаранта при воздействии солевого стресса. Особый интерес представляют метаболические пути, с помощью которых осуществляется интеграция мезофилла и обкладки в стрессовых условиях.

Значительный дефицит знаний связан с малоизученностью молекулярных механизмов адаптивной реакции. Важнейшими моментом является регуляция транскрипции и трансляции ферментных систем, с помощью тканеспецифических промоторов и транскрипционных факторов.

В связи с этим изучена экспрессиониая регуляция МДГ-активности, и функционирование СДГ может внести определенный вклад в понимание этих адаптационных механизмов и их тканевой локализации в амаранте.

Цель и задачи. Целью работы являлось изучение экспрессионной регуляции активности сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в клетках мезофилла и обкладки разных сортов Amaranthus L. при солевом стрессе.

Задачи:

1. Используя метод дифференциации мезофилла и обкладки выделить дифференцированные ткани из листьев разных сортов амаранта.

2. Изучить изменение активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в разных тканях амаранта в норме и при засолении.

3. Проанализировать изоферментный состав малатдегидрогеназы в мезофилле и обкладке листьев амаранта в условиях солевого стресса.

4. Исследовать динамику активности сукцинатдегидрогеназной ферментной системы в мезофилле и обкладке амаранта в норме и при засолении.

5. Установить зависимость уровня экспрессии генов цитоплазматической и митохондриальной форм малатдегидрогеназы в листьях амаранта в нормальных и стрессовых условиях.

6. Исследовать изменение экспрессии гена sdha в листьях амаранта, находящегося в условиях солевого стресса.

7. Провести анализ родства генетического материала разных сортов амаранта с использованием в качестве маркеров сателлиты PAWS.

8. Выявить отличие в геномной ДНК сортов амаранта, отличающихся по солеустойчивости на основе микросателлитного анализа с применением сателлиты OPA 1.

Научная новизна. Результаты, полученные в диссертации, развивают фундаментальные представления об адаптивной реакции клеточного метаболизма в растениях С4 -типа к условиям солевого стресса. Установлена доминирующая роль мезофильных тканей в обеспечении солеустойчивости амаранта. Так, в мезофилле листьев амаранта при засолении увеличивается активность сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы, что указывает на интенсификацию энергетического обмена (ЦТК) и анаплеротических реакций. В условиях засоления индуцируется в мезофильной ткани дополнительная изоформа НАД-зависимой малатдегидрогеназы. Впервые показано, что солевой стресс вызывал увеличение в листьях амаранта экспрессии генов mdhjnt, mdh_cyt и sdha, обуславливающих интенсификацию функционирования исследуемых ферментных систем. При этом увеличение экспрессии характерно для генетического материала, кодирующего митохондриальную форму малатдегидрогеназы. Были выявлены отличия в микросателлитном составе генетического материала у разных сортов амаранта, отличающихся по солеустойчивости.

Практическая значимость. Полученные научные материалы вносят определенный вклад в разработку механизмов адаптации растений С4 -типа к солевому стрессу. Регуляция транскрипции генов, кодирующих сукцинатдегидрогеназу и малатдегидрогеназу, может быть использована для создания генетически модифицированных сортов растений амаранта с высокой устойчивостью к засолению. Были выявлены два сорта амаранта «Кинельский» и «Рыжик», обладающие повышенной устойчивостью к солевому стрессу. В них обнаружены отличия по микросателлитному составу геномной ДНК, что может служить маркером для их идентификации.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, физиологии растений, спецкурсам по энзимологии, биоэнергетике, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Условия солевого стресса вызывают индукцию активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы в листьях амаранта. При этом установлено, что в клетках мезофилла наблюдается значительно большее возрастание малатдегидрогеназной активности по сравнению с обкладкой, что может свидетельствовать о более высоком напряжении клеточного метаболизма в мезофилльной ткани.

2. Индукция малатдегидрогеназной активности в листьях амаранта под действием засоления сопряжена со стресс-индуцированными изменениями изоферментного состава исследуемого фермента. В клетках мезофилла обнаруживается синтез дополнительной изоформы НАД-зависимой малатдегидрогеназы.

3. Обнаружено, что солевой стресс вызывает изменения в функционировании сукцинатдегидрогеназы в мезофилльной и обкладочной тканях, заключающиеся в увеличении активности этого маркерного фермента, что свидетельствует об интенсификации работы цикла трикарбоновых кислот, обуславливающего энергизацию клетки.

4. При засолении обнаружена интенсификация экспрессии генов тс1к_т1, тдк_су1 и БсИъа в листьях амаранта. Показана важная роль экспрессионной регуляции генов, обеспечивающих индукцию активности исследуемых ферментов, что необходимо для адаптивной реакции клеточного метаболизма к экстремальным условиям.

5. Выявлены два сорта амаранта «Кинельский» и «Рыжик», характеризующиеся повышенной устойчивостью к солевому стрессу. Методом полиморфизма длины амплифицированных фрагментов установлено, что эти сорта отличаются по микросателлитному составу. С помощью генетического маркера OPA 17 можно идентифицировать сорта «Кинельский» и «Рыжик».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международная научная школа «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011), 14-ой международной Пущинской конференции молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2011); IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011); X международной научно-практической конференции (Воронеж, 2012); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2011,2012, 2013).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 7 статьях и 5 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (172 источника). Иллюстрационный материал включает 5 таблиц и 19 рисунков.

и

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфо-физиологические и биохимические свойства амаранта 1.1.1. Особенности метаболических процессов у амаранта

Основной особенностью метаболизма амаранта является ассимиляция СОг по С4-типу фотосинтеза. На сегодняшний момент к С4- растениям относят организмы, обладающие следующими свойствами.

С4-фотосинтез характерен только покрытосеменным растениям, у которых есть фотосинтезирующие клетки двух типов: клетки обкладки и клетки мезофилла (на сегодняшний день у всех видов растений, относящихся к С4- типу, обнаруживается кранц - анатомия, т. е. показано наличие явно отличающихся друг от друга фотосинтезирующих клеток двух типов, расположенных концентрическими кругами) [90; 99].

Первичными интермедиатами фотосинтеза выступают С4-дикарбоновые кислоты - оксалоацетат, малат и аспартат [120; 126].

С4- кислоты служат источником углекислого газа для ВПФП фотосинтеза, который функционирует в клетках обкладки проводящих пучков. Этот шунтирующий механизм создает высокую концентрацию С02, обеспечивающую эффективную работу цикла Кальвина. При этом практически полностью подавляется фотодыхание.

Следовательно, С4- фотосинтез выполняет роль челночного механизма, обеспечивающего перенос СО2 из атмосферы в ВПФП, протекающий в клетках обкладки проводящих пучков. Этот механизм создает относительно высокую концентрацию СОг в клетках обкладки, значительно превышающую обычную концентрацию С02, кот�